INFLUÊNCIA DA ADMINISTRACAO PRECOCE DE INFLIXIMAB … · LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1: Médias da variação de peso dos animais entre os grupos avaliando o fator colite e o fator

THIAGO DE SÁ OLIVEIRA

INFLUÊNCIA DA ADMINISTRACAO PRECOCE DE INFLIXIMAB NA

CICATRIZAÇÃO DE ANASTOMOSE NO CÓLON ESQUERDO DE RATOS

COM OU SEM COLITE INDUZIDA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências médicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre.

Área de concentração: Medicina

Orientador: Prof. Dr. João Batista de Sousa

BRASÍLIA – DF

2017

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THIAGO DE SÁ OLIVEIRA

INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO PRECOCE DE INFLIXIMAB NA

CICATRIZAÇÃO DE ANASTOMOSE NO CÓLON ESQUERDO DE RATOS

COM OU SEM COLITE INDUZIDA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de

Medicina da Universidade de Brasília como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre

COMISSÃO EXAMINADORA

_____________________________________________ Prof. Dr. João Batista de Sousa

_____________________________________________ Prof. Dr. Paulo Gonçalves de Oliveira

_____________________________________________ Prof. Dr. Hélio Moreira Júnior

Suplente:

_____________________________________________ Profa. Dra. Ivone Kamada

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Aos meus filhos João Pedro e Maria Luiza, pelo amor, carinho e dedicação. À minha esposa Melina, pelo apoio incondicional durante esta empreitada.

Aos meus pais e irmãos por serem terra firme.

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AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. João Batista de Sousa, que incentivou e apoiou meu interesse pelo mestrado, e,

ao abrir as portas do meu retorno à vida acadêmica, reacendeu a chama pelo espírito

cientifico e a busca de respostas a inquietações da alma.

Aos acadêmicos de medicina Pedro Henrique Farias Figueroa e José Moreira Kffuri Filho

pelo apoio e ajuda durante a fase experimental da pesquisa

Aos veterinários e funcionários do laboratório de Cirurgia Experimental da Faculdade de

Medicina da Universidade de Brasília, em especial ao veterinário Rafael Rocha de Andrade

pelo suporte e apoio indispensáveis para a consecução dos experimentos.

À Sra. Tercia Lousa de Castro, pelas várias horas dedicadas à confecção das lâminas de

histopatologia utilizadas neste trabalho.

À Profa. Dra. Fabiana Pirani Carneiro, pela avaliação histopatológica das lâminas

apresentadas nesta dissertação.

Ao amigo Pedro Gonçalves Cerqueira por dedicar horas de apoio a correções e auxilio na

formatação deste trabalho

À colega de especialidade e de trabalho Dra. Silvana Marques e Silva pelo incentivo, por

compartilhar experiências já vividas na empreitada acadêmica e pela gentil cessão de

algumas fotos para compor este trabalho.

Ao amigo Alex Pena Tosta pelo auxílio inestimável na análise estatística.

À equipe do Programa de Pós-Graduação da Faculade de Medicina da Universidade de

Brasília, pela cordialidade e presteza em todas as etapas para a realização deste trabalho.

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“ Para aprender é preciso passar por situações

emocionantes. Para isso é preciso tirar as pessoas de

suas rotinas físicas e mentais. Não aprendemos nada

dentro de nossas "zonas de conforto", sentados todos

os dias, no mesmo lugar, na mesma mesa, fazendo a

mesma coisa, onde tudo é previsível. Na "zona de

aprendizado" há uma dose de desconforto e as

emoções são intensificadas."

Ernest Shacklet

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RESUMO

Objetivo: Avaliar a influência da utilização precoce do INFLIXIMAB sobre a cicatrização de anastomose no cólon esquerdo de ratos em um modelo experimental de colite, comparando a força de ruptura da anastomose e analisar a relação com a cicatrização da parede abdominal. Método: Trinta e dois ratos foram distribuídos em quatro grupos contendo 08 animais cada. Dois grupos (16 animais) foram submeditos a indução de colite por enema de ácido acético com dose de 3 ml por via retal, e dois grupos (16 animais) não sofreram indução de colite. Todos os ratos foram submetidos à laparotomia para exposição do cólon distal com secção do mesmo a cerca de 2,5 a 3,5 cm cranial à reflexão peritoneal e anastomose término-terminal do segmento. Tanto no grupo com colite induzida como no grupo sem colite, metade dos animais (8) receberam infliximab (IFX), 4 no 1 DPO e 4 no 3 DPO; e 8 receberam NaCl a 0,9%. No sétimo DPO foi realizada a pesagem dos animais e a re-laparotomia para colectomia, seguida de eutanásia. Foram avaliados a variação de peso, a força tensil de ruptura da anastomose e da parede abdominal, além de achados histopatológicos nas lâminas de anastomoses. Resultados: Nos animais com colite houve maior perda de peso em relação aos sem colite, mais acentuada nos que receberam IFX no 1o DPO (p=0,007). O IFX piorou a força tênsil de rutura da anastomose nos animais com colite quando administrado no 1o DPO (p=0,001), porém quando administrado no 3o DPO ou com placebo, o IFX melhorou a força de ruptura anastomótica nos animais com colite, sendo esta, maior do que os animais sem colite (p=0,001). Conclusão: O IFX prejudicou a cicatrização das anastomoses no cólon esquerdo de ratos com colite, quando administrado no 1o DPO. Quando administrado no 3o DPO ou com placebo houve uma inversão, com melhora nos valores de força de ruptura da anastomose em relação ao grupo sem colite. Descritores: Anastomose intestinal. Cólon. Infliximab. Colite. Ratos.

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ABSTRACT

Objective: To evaluate the influence of the early use of INFLIXIMAB (IFX) on the anastomosis healing in the left colon of rats in an experimental model of acetic acid colitis induced, comparing the tensile strength of the anastomosis, and to analyze the relationship with the healing of the abdominal wall. Method: Thirty-two rats were divided into four groups containing 08 animals each. Two groups (16 rats) were carried out the induction of colitis by enema of acetic acid with dose of 3 ml, per rectally, with no induction of colitis in the other two groups (16 rats). All the rats were submitted to laparotomy for exposure of the distal colon and sectionated approximately 2.5 to 3.5 cm cranial from the peritoneal reflection and proceeded end-to-end anastomosis. In both groups, with and without colitis, half the animals (8) received infliximab administration, 4 rats in the 1th POD and 4 in the 3th POD, and the other half (8) received NaCl solution0,9% administration. In the 7th POD the animals were weighed and re-laparotomy was performed for colectomy followed by euthanasia. Were evaluated the weight variation, anastomosis and abdominal wall scar rupture tensile strength and histopathological findings by H-E stain. Results: In the animals with colitis, there was greater weight loss in relation to the without colitis group, more pronounced in who received IFX in the 1st POD (p=0.007). The IFX has deteriorated the rupture tensile strength of the anastomosis in the animals with colitis when administered in the 1st POD (p=0.001), but when administered in the 3rd POD or placebo, IFX has improved the anastomotic rupture tensile strength in animals with colitis, this being, greater than the animals without colitis (p=0.001). Conclusion: The Infliximab impaired the healing of anastomoses in the left colon of rats with colitis when administered in the 1st POD. When administered in the 3rd POD or when placebo was given, there was a reversal, with the improvement in the values of the breaking strength of the anastomosis in relation to the group without colitis. Keywords: Intestinal anastomosis. Colon. Infliximab. Colitis. Rats.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Alocação dos animais em grupos de acordo com o dia de eutanásia, indução de colite e droga administrada. ....................................................................................... 21

Figura 2- Fotografia dos animais no alojamento da Faculdade de medicina da Universidade de Brasília. ................................................................................................ 22

Figura 3 - Laparotomia mediana com extensão de 4 cm. ............................................... 24

Figura 4 –A posição do afastador auto-estático e aexposição do cólon distal. ............... 24

Figura 5 - Secção total do cólon a 3,0cm acima da reflexão peritoneal. ........................ 25

Figura 6 - Justaposição das extremidades da alça do cólon. ........................................... 25

Figura 7 - Anastomose colo-colônica término-terminal ................................................. 25

Figura 8 – Processo de reabertura da cavidade abdominal. ............................................ 27

Figura 9 – A: Segmento anastomótico com estruturas aderidas, B: Segmento anastomótico com aderências liberadas. ......................................................................... 28

Figura 10 - Divisão do segmento colônico em três porções com a anastomose. ............ 29

Figura 11 - Aparelho de ensaio para determinação da força de ruptura da anastomose . 29

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Número de repetições em cada célula experimental. ...................................... 31

Tabela 2: Testes de efeitos entre sujeitos (Variável dependente: diferença de peso). .... 32

Tabela 3: Médias marginais estimadas - Fator Colite * Fator Infliximab (Variável dependente: diferença de peso). ...................................................................................... 33

Tabela 4: Comparações por Método Pairwise – Fator Colite (Variável dependente: diferença de peso). .......................................................................................................... 34

Tabela 5: Comparações por Método Pairwise – Fator Infliximab (Variável dependente: diferença de peso). .......................................................................................................... 35

Tabela 6: Teste de efeito entre sujeitos (Variável dependente: FT- Parede ). ................ 38

Tabela 7: Fator Colite (Variável dependente: FT - Parede ). .......................................... 38

Tabela 8: Fator Infliximab (Variável dependente: FT - Parede ). ................................... 39

Tabela 9: Teste de efeito entre sujeitos (Variável dependente: FT- Anastomose). ........ 42

Tabela 10: Estimativas (Variável dependente: FT- Anastomose). ................................. 42

Tabela 11: Comparações por Método Pairwise - 1º e 3º DPO (Variável dependente: FT- Anastomose). .................................................................................................................. 43

Tabela 12: Comparações por Método Pairwise (Variável dependente: FT- Anastomose).......................................................................................................................................... 44

Tabela 13: Força de ruptura (N) da anastomose ............................................................. 45

Tabela 14: Mediana da intensidade de achados histológicos .......................................... 48

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LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1: Médias da variação de peso dos animais entre os grupos avaliando o fator colite e o fator IFX no início do experimento e no dia eutanásia. .................................. 33

Gráfico 2: Mediana e valores intervalares da variação de peso dos animais entre os grupos considerando o fator colite e o fator IFX no início do experimento e no dia eutanásia. ......................................................................................................................... 33

Gráfico 3: Mediana e valores intervalares de peso dos animais entre os grupos considerando o fator colite no início do experimento e no dia eutanásia. ...................... 37

Gráfico 4: Mediana e valores intervalares da variação de peso dos animais entre os grupos considerando o fator Infliximab no início do experimento e no dia eutanásia. .. 37

Gráfico 5: Mediana e valores intervalares da força tênsil de ruptura da cicatriz da parede abdominal expressa em Newtons (N) entre os grupos considerando o fator colite e o fator Infliximab no dia eutanásia. ................................................................................... 40

Gráfico 6: Mediana e valores intervalares da força tênsil de ruptura da cicatriz da parede abdominal expressa em Newtons (N) entre os grupos considerando o Fator colite no dia eutanásia. ......................................................................................................................... 41

Gráfico 8: Mediana e valores intervalares da força tênsil de ruptura da anastomose expressa em Newtons (N) entre os grupos considerando o fator colite e o fator Infliximab no dia eutanásia. ............................................................................................ 46

Gráfico 9: Mediana e valores intervalares da força tênsil de ruptura da anastomose expressa em Newtons (N) entre os grupos considerando o fator colite. ......................... 46

Gráfico 10: Mediana e valores intervalares da força tênsil de ruptura da anastomose expressa em Newtons (N) entre os grupos considerando o Fator Infliximab no dia eutanásia. ......................................................................................................................... 47

Gráfico 11: Médias da Força tênsil de ruptura da anastomose expressa em Newtons (N) entre os grupos considerando o fator colite e o fator Infliximab no dia eutanásia. ........ 47

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LISTA DE ABREVIATURAS A – Ausente.

ABNT - Associação Brasileira de Normas e Técnicas.

CE - Corpo estranho.

CEUA - Comitê de Ética no Uso Animal.

cDNA - Ácido desoxirribonucleico complementar.

cIFX1- Grupo com colite que recebeu Infliximab no 1º DPO.

cIFX3- Grupo com colite que recebeu Infliximab no 3º DPO.

cSAL - Grupo com colite que recebeu Salina.

cm – Centímetro.

COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal.

CT - Ciclo limiar.

D2 - Receptor da dopamina 2.

DNA - Ácido desoxirribolucleico.

DPO - Dia pós-operatório.

g – Grama.

°C - Grau Celcius.

HCL - Ácido Clorídrico.

H2O2 - Água oxigenada.

HE - Hematoxilina-eosina.

HP – Hidroxiprolina.

IFX - Infliximab

IL – Interleucina.

Kg – Kilograma.

LPS – Lipopolissacarídeo.

min – Minuto.

ml – Mililitro.

mm – Milímetro.

MMP - Matrix metaloproteinase.

mg – Miligrama.

µg – Micrograma.

µl – Microlitro.

N – Newton.

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NaCl - Cloreto de sódio.

P – Presente.

scIFX1- Grupo sem colite que recebeu Infliximab no 1º DPO.

scIFX3- Grupo sem colite que recebeu Infliximab no 3º DPO.

scSAL- Grupo sem colite que recebeu Salina.

TGI - Trato gastrointestinal.

TNF-alfa - Fator de necrose tumoral alfa.

TNF-beta – Fator de necrose tumoral beta.

UnB – Universidade de Brasília

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 14

2 OBJETIVO .................................................................................................................. 19

3 MATERIAL E MÉTODO ........................................................................................... 19

3.1 ANIMAL DE EXPERIMENTAÇÃO ................................................................... 20

3.2 ALOCAÇÃO DOS ANIMAIS EM GRUPOS ..................................................... 20

3.3 PRÉ-OPERATÓRIO ............................................................................................ 21

3.4 INDUÇÃO DA COLITE ..................................................................................... 22

3.4 ANESTESIA E TÉCNICA OPERATÓRIA ......................................................... 23

3.5 ADMINISTRAÇÃO DO INFLIXIMAB E DA SALINA .................................... 26

3.6 PÓS-OPERATÓRIO ............................................................................................ 26

3.7 REOPERAÇÃO E ANÁLISE OPERATÓRIA .................................................... 27

3.8 ESTUDO DA FORÇA DE RUPTURA DA PAREDE ABDOMINAL E DA ANASTOMOSE COLÔNICA ................................................................................... 29

3.9 ESTUDO HISTOPATOLÓGICO ........................................................................ 30

3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................. 30

4. RESULTADOS .......................................................................................................... 32

4.1 MORTES .............................................................................................................. 32

4.2 VARIÁVEL RESPOSTA: DIFERENÇA DE PESO (DIFERENÇA ENTRE O PESO FINAL E O PESO INICIAL DOS ANIMAIS) ............................................... 32

4.3 VARIÁVEL RESPOSTA: ANÁLISE DA FORÇA TÊNSIL DE RUPTURA NA PAREDE ABDOMINAL............................................................................................ 38

4.4 VARIÁVEL RESPOSTA: ANÁLISE DA FORÇA TÊNSIL DE RUPTURA DA ANASTOMOSE ......................................................................................................... 42

4.5 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ....................................................................... 48

4.6 AVALIAÇÃO CLÍNICA DOS ANIMAIS COM E SEM COLITE TRATADOS COM INFLIXIMAB OU PLACEBO ......................................................................... 48

5 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 49

6. CONCLUSÃO ............................................................................................................ 54

14

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 55

1 INTRODUÇÃO

O processo de cicatrização propriamente dito, começa com a hemostasia

(SOUSA; OLIVEIRA, 1999; TOGNINI et al., 2000). Segue-se a resposta inflamatória,

durante a qual os macrófagos e os polimorfonucleares migram da circulação para o sítio

da ferida em resposta ao aumento dos níveis de citocinas. Posteriormente, ocorre a

proliferação de fibroblastos, a síntese do colágeno, o remodelamento do tecido

conjuntivo e a aquisição da resistência da ferida (GOLDMAN, 2004).

Desde 1997 alguns autores já descreviam os principais eventos biológicos da

cicatrização, que podem ser divididos em três fazes bastante distintas, mas também

muito complexas e que se sobrepõe uma à outra. São a inflamação, a fibroblástica ou

proliferativa, e remodelagem do colágeno (STEED, 1997; CLARK et al., 2000; HÖER

et al., 2002).

O termo inflamação pode ser definido como uma reação da microcirculação,

induzida por algum tipo de lesão aos tecidos, com a consequente movimentação de

vários elementos intravasculares, como fluidos, células e moléculas para o espaço extra

vascular. A agressão tecidual estimula a liberação de substâncias químicas no local

afetado, denominadas de mediadores químicos da inflamação que podem ter origem

plasmática ou tecidual (SIQUEIRA JR & DANTAS, 2000).

Logo após a resposta inflamatória normal que é caracterizada pelo aumento da

permeabilidade capilar, aumento dos neutrófilos periféricos, migração de monócitos,

transformação em macrófagos, fagocitose (LEIBOVICH & ROSS, 1976), ocorre a

liberação local de citocinas, como as interleucinas 1 e 6 (Il-1 e Il-6), o fator de necrose

tumoral-alfa (TNF-alfa) e fatores de crescimento alfa-plaquetários, como o fator de

crescimento transformante-beta (TGF-beta), de enzimas, de mediadores químicos, como

a serotonina e síntese do colágeno (SIQUEIRA JR & DANTAS, 2000).

O TGF-beta é uma proteína que atua na cicatrização estimulando a angiogênese

e está relacionada ao desenvolvimento de fibrose na cicatriz. (SIQUEIRA JR &

DANTAS, 2000).

Em seguida, já na fase proliferativa, as células endoteliais e os fibroblastos

representam um papel importante, migrando dos tecidos circunjacentes e de vênulas

intactas próximas à anastomose. Os fibroblastos então, desenvolvem uma grande

capacidade de formar colágeno. Este tecido conjuntivo frouxo é rico em capilares,

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leucócitos e em matriz extracelular formada por fibras finas de colágeno (tipo III) e

proteínas estruturais não fibrosas como o ácido hialurônico, as glicosaminoglicanas e as

proteoglicanas (REGAN et al., 1993; SIQUEIRA JR & DANTAS, 2000; REYS, 2004).

Durante a fase proliferativa, o colágeno da ferida é submetido tanto a

colagenólise quanto a síntese, com predominância da última na cicatrização normal

(JIBORN et al., 1980).

Normalmente o colágeno do tipo I é predominante em relação ao colágeno do

tipo III e a matriz de colágeno vai sendo remodelada, por meio de aumento e

estabilização de suas ligações transversais, tornando-se desta forma, mais resistente.

Qualquer alteração que venha a ocorrer em uma das fases, pode resultar em um retardo

ou uma falha na cicatrização da anastomose (SIQUEIRA JR & DANTAS, 2000; REYS,

2004).

O colágeno se apresenta como uma glicoproteína composta por uma tripla hélice

de cadeias polipetídicas e é constituído basicamente pelos seguintes aminoácidos:

glicina, alanina, lisina, prolina, hidroxilisina e hidroxiprolina. A enzima prolil-

hidroxilase transforma a prolina em hidroxiprolina, que passa a ser um aminoácido

exclusivo do colágeno, e é indispensável para a estabilidade da tripla hélice de proteína

(PROCKOP & KIVIRIKKO, 1995). A concentração de hidroxiprolina no tecido

cicatricial possibilita estimar o conteúdo de colágeno na área da anastomose.

Múltiplos fatores podem atuar sobre as diferentes fases da cicatrização de

anastomoses do tubo digestivo, sendo de especial interesse aqueles que alteram o

conteúdo de colágeno, por interferirem no equilíbrio entre a lise e a síntese desta

proteína (OLIVEIRA, 1989), como a infecção, que aumenta a produção de colagenase e

inibe a cicatrização (HAAN, et al., 1974; CLARK et al., 2000; CAHILL et al., 2004).

Por meio da ação de vários fatores sintetizados por macrófagos, plaquetas,

células endoteliais e linfócitos T é que se desencadeia uma sequência organizada e

complexa de eventos celulares e bioquímicos que resultam na reparação do tecido

(CLARK, 1996; STEED, 1997).

As citocinas exercem a sua função sobre diferentes tipos celulares, propriedade

esta denominada de pleiotropismo. Elas são as proteínas responsáveis pela modulação

de diferentes tipos celulares e possuem várias funções, dentre elas: mediação da

resposta imunológica adaptativa e da inflamação, regulação da ativação do crescimento

e da diferenciação de linfócitos e de outras células. Elas podem ter vários efeitos

diferentes sobre o mesmo tipo celular e alguns, inclusive, ocorrendo simultaneamente.

16

Esses efeitos dependem da interação de citocinas com receptores de superfície na célula

alvo (SIQUEIRA JR & DANTAS, 2000).

O Fator de Necrose Tumoral – alfa (TNF-alfa) é uma citocina comumente

presente na inflamação, podendo interferir na cicatrização tecidual. Foi assim

denominada devido a sua atividade em provocar necrose tumoral in vivo, quando

injetado em ratos portadores de tumores (MAURY, 1986; MOONEY et al., 1990;

SALOMON et al., 1991; BAKER et al., 2006).

O TNF-alfa é expresso em várias células, mas principalmente em macrófagos

como resposta imunológica a outras citocinas, a bactérias, vírus, prasitas e ao estímulo

de outras citocinas. Acredita-se que o TNF-afa desempenhe papel importante na

atividade antitumoral, imunomodulação, caquexia, choque séptico, hematopoiese,

replicação viral e inflamação (SIQUEIRA JR & DANTAS, 2000; ISHIMURA et al.,

2002; DWINELL et al., 2003; BAKER et al., 2006; BIOMYX TECHNOLOGY, 2007).

O papel do TNF-alfa no processo cicatricial ainda não está totalmente

esclarecido (BETTINGER et al., 1994; STREIT et al., 2006). Citocinas pró

inflamatórias como o TNF-alfa, demonstram respostas sinérgicas ou antagônicas em

relação à cicatrização (interferindo na fase inflamatória e na fase de deposição do

colágeno), dependendo da sua concentração (BAKER et al., 2006).

A deiscência de anastomose é uma complicação potencial da cirurgia colorretal e

tem incidência variável, podendo ocorrer em até 35% (trinta e cinco por cento) dos

casos (FIELDING et al., 1980; HENDRIKS & MASTBOOM, 1990). Está associada ao

aumento da morbimortalidade, da estada hospitalar e dos custos totais do tratamento

(GOLUB et al.,1997; SARABEYOGLU et al., 2003; NURSAL et al., 2004). São fatores

que afetam a cicatrização e a integridade intestinal: o suprimento sanguíneo, a tensão na

linha de anastomose, a magnitude da inflamação, a presença de contaminação fecal, o

estado nutricional do paciente e a utilização de drogas (DE SOUSA et al., 1991; DE

OLIVEIRA et al., 1994; THORNTON; BARBUL, 1997; BUCKMIRE et al., 1998; KUZU

et al., 1998; TURKCAPAR et al., 1998; SAKALLIOGLU et al., 2004; DE HANN et al.,

1974). Após a introdução da terapia biológica no tratamento das doenças inflamatórias

intestinais, relata-se que a ação anti-TNF destes medicamentos, pode influenciar

oprocesso cicatricial, sendo que os dados de literatura são bastante controversos em

relação as drogas que modulam esta citocina, alguns estudos apontando piora da

cicatrização em anastomoses e outros relatam efeito benéfico da droga em feridas

crônicas (TURSI at al., 2013; STREIT et al., 2006)

17

Modelos experimentais de colite têm sido largamente utilizados por vários

autores para estudar a patogênese e tratamento das Dll. A colite induzida por enema de

ácido acético em animais de pequeno porte é um método simples, barato e reproduzível,

apresentando similaridades com Dll em humanos quanto a aspectos histológicos e

metabólicos relacionados ao ácido araquidônico.

Frostberg e colaboradores (2014) em um estudo com o objetivo de determinar os

efeitos da utilização de droga anti-TNF em dose única, 7 dias antes da avaliação da

força tênsil da anastomose intestinal em coelhos, concluíram não haver diferença

estatística, para aquela metodologia empregada em uma pequena amostra. Os animais

foram sacrificados no quarto dia de pós-operatório.

O INFLIXIMAB tem demostrado grande eficácia clínica na indução e

manutenção da remissão sustentada, avaliada através da cicatrização de mucosa em

portadores de doenças inflamatórias intestinais (DII), e seu uso tem sido largamente

ampliado para os portadores destas moléstias.

O INFLIXIMAB é um anticorpo monoclonal quimérico, humano-murino, da

classe IgG1, que se liga com alta afinidade a formas solúveis e transmembranais de

TNF-alfa, mas não à linfotoxina (TNF-beta). O INFLIXIMAB inibe a atividade

funcional do TNF-alfa em vários tipos de bioensaios in vitro (KNIGHT et al., 1993;

SIEGEL et al, 1995). In vivo, o INFLIXIMAB forma rapidamente complexos estáveis

com o TNF-alfa, um processo paralelo à perda da bioatividade do TNF-alfa (SIEGEL et

al, 1995; SCALLON et al., 1995).

O INFLIXIMAB é eficaz na indução e manutenção da terapia da doença de

Crohn fistulizante ativa e um dos compostos biológicos aprovados para seu tratamento,

mas com limitações no tocante à imunogenicidade (desenvolvimento de anticorpos anti-

infliximab) que pode ocorrer em alguns casos, devido a sua fração murina. Também há

relatos de reações de hipersensibilidade imediata ou tardia e fenômenos auto-imunes,

levando a perda de sua eficácia ou mesmo impossibilitando a continuidade do

tratamento (SANDBORN, 2003; DANESE et al., 2006; SANDBORN, 2006).

Em humanos, o uso do INFLIXIMAB no tratamento da doença de Crohn,

aumenta em quatro vezes o risco de infecções por micro-organismos oportunistas

(ABREU, 2006) e tem uma taxa de mortalidade de 1% (um por cento), na maioria das

vezes, devido a infecções (COLOMBEL, et al., 2004).

Desta forma, a utilização do INFLIXIMAB torna-se de grande interesse clínico

para utilização nos pacientes portadores de doença inflamatória intestinal. Estes

18

pacientes estão sujeitos a tratamentos cirúrgicos com anastomoses de forma eletiva ou

de urgência, podendo ou não estar fazendo uso do INFLIXIMAB.

Devido ao mecanismo de antagonismo da ação do TNF-alfa, e

consequentemente, ao fato de interferir na cascata de inflamação, a hipótese da

influência de seus efeitos antiinflamatórios no processo de cicatrização de anastomose,

parece ganhar relevância, ainda mais na potencialidade de desfechos clínicos

desfavoráveis para aqueles portadores desta enfermidade, submetidos a tratamento

operatório.

São vários os parâmetros de avaliação da cicatrização de anastomoses intestinais

que podem ser estabelecidos. A medida da resistência tênsil é realizada por meio da

aplicação de uma força mecânica em direção longitudinal à anastomose. Atinge

cinquenta por cento do valor daquela do cólon livre de injúria após dez dias de pós-

operatório (JIBORN et al., 1978) e não é sensível para a determinação de alterações

precoces da cicatrização (BRASKEN, 1991).

A determinação de fatores prejudiciais à cicatrização, assume então, grande

relevância clínica, uma vez que pode contribuir para a diminuição dos riscos de

deiscências de anastomoses e, por consequencia, da morbi-mortalidade associada a estas

operações.

Observa-se, portanto, e a partir do descrito, a grande importância de se estudar a

aplicação e os efeitos do anticorpo monoclonal INFLIXIMAB na cicatrização das

anastomoses.

Assim delineamos o presente estudo, para testar a hipótese de que o uso de

medicação anti-TNF, durante as etapas iniciais do processo cicatricial, influencia

distintamente a cicatrização tecidual, quando comparadas a etapas um pouco mais

tardias.

19

2 OBJETIVO Estudar os possíveis efeitos da administração precoce do INFLIXIMAB sobre a

cicatrização de anastomose no cólon esquerdo de ratos em um modelo experimental de

colite e na ausência dela. Avaliação clínica e histopatológica.

2.1 OBJETIVO ESPECÍFICO:

Comparar os resultados da influência do infliximab na cicatrização da

anastomose com a cicatrização da parede abdominal, testando a hipótese de que a

inflamação local (colite) desempenhe ação biológica distinta dala do sítio onde ela não

se faz presente.

2.1 OBJETIVO ESPECÍFICO

Comparar os resultados encontrados na avaliação da anastomose com aqueles encontrados no estudo da cicatriz da parede abdominal, afim de testar a hipótese de que a inflamação local possui efeitos distintos daqueles onde esta não ocorre.

3 MATERIAL E MÉTODO

O estudo foi executado e acompanhado nas instalações do Laboratório de

Cirurgia Experimental da Área de Clínica Cirúrgica da Faculdade de Medicina da

Universidade de Brasília (UnB) e com a colaboração do Laboratório de Patologia da

Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília (UnB).

O projeto de pesquisa foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética no Uso

Animal (CEUA) do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília (UnB),

número de protocolo UnBDOC 60540/2016 (Anexo 1). Os procedimentos

experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes do Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA). A declaração de conflito de interesses está

apresentada no anexo 2

20

Para a redação e a formatação do trabalho, foram utilizadas as normas da

Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT NBR 14724:2011).

3.1 ANIMAL DE EXPERIMENTAÇÃO

Foram utilizados 32 ratos, Rattus norvergicus, linhagem Wistar, machos e

sadios, adquiridos do biotério da Universidade Federal de Campinas (UNICAMP),

mantidos por três semanas, no período pré-operatório, em gaiolas no alojamento de

animais do Laboratório de Cirurgia Experimental da Universidade de Brasília, sendo

fornecida dieta padrão e água à vontade, em regime de 12 horas de luz e 12 horas de

escuridão e que pesaram em média 336,19g (+/- 9,04g) no dia da primeira operação.

3.2 ALOCAÇÃO DOS ANIMAIS EM GRUPOS

Os animais foram distribuidos por locação casual probabilística, imediatamente

antes do procedimento operatório, sem que o operador soubesse a qual grupo pertencia

cada animal. Separados em blocos, em dois grupos de 16 animais cada, para indução ou

não de colite (C= colite 16 animais / SC = sem colite 16 animais). Posteriormente, foi

realizada nova randomização, separando os grupos que receberam INFLIXIMAB (IFX

= receberam INFLIXIMAB) e salina (SAL= receberam Solução salina 0,9%), Para os

grupos que receberam INFLIXIMAB, houve nova divisão em 2 subgrupos de acordo

com o momento pós operatório, sejam eles 1o ou 3o dia pós-operatório). Todos os

animais foram mortos no 7o dia de pós-operatório, conforme esquema a seguir, após re-

laparotomia.

21

Figura 1 - Alocação dos animais em grupos de acordo com indução de colite ou não, droga administrada e momento da adminisração.

3.3 PRÉ-OPERATÓRIO

No tempo correspondente ao período pré-operatório, os animais foram mantidos

por três semanas confinados em gaiolas com oito animais cada, em regime de 12 horas

de luz artificial e 12 horas de escuridão (figura 2). Receberam dieta padrão e água à

vontade. Não houve jejum pré-operatório. Os animais foram pesados em balança

eletrônica imediatamente antes do início de cada procedimento operatório. No 3o dia

anterior ao procedimento operatório, os animais dos grupos com colite induzida (cIFX e

cSAL) foram submetidos ao enema de ácido acético conforme protocolo abaixo.

32 RATOS

COLITE INDUZIDA (c) 16 animais

SEM COLITE (sc) 16 animais

INFLIXIMAB (cIFX)

8 animais

SOL. SALINA (cSAL) 8 animais

SOL. SALINA (scSAL) 8 animais

1o DPO (cIFX1)

4 Animais

3oDPO (cIFX3)

4 Animais

INFLIXIMAB (scIFX)

8 animais

1o DPO

(scIFX1) 4 Animais

3o DPO (scIFX3)

4 Animais

22

3.4 INDUÇÃO DA COLITE

A indução da colite foi realizada pela técnica publicada por Yamada et al. (1992)

e Tannahill et al. (1995). Cada animal sem anestesia era contido, e um cateter de 8mm

introduzido pelo ânus até 6,0cm da margem anal e submetidos à administração

intracolônica, por enema, de uma solução de ácido acético a 7% e com volume de 3 ml

e segurados de ponta-cabeça por 15 segundos. Não houve jejum ou preparo anteriores à

indução da colite, retornando os animais para suas respectivas gaiolas após o

procedimento.

Figura 2- Fotografia dos animais no alojamento da Faculdade de medicina da

Universidade de Brasília.

23

3.4 ANESTESIA E TÉCNICA OPERATÓRIA

Foi realizada a anestesia geral. Inicialmente o animal era colocado em uma

câmara de indução onde havia um chumaço de algodão embebido em isoflurano. Após

relaxamento e perda da consciência, eram anestesiados com cloridrato de xilasina na

dose de 10 mg/Kg e cloridrato de cetamina na dose de 75 mg/Kg por via intramuscular.

No período trans-operatório, eram administradas doses adicionais dos anestésicos,

quando necessário.

Os 32 animais foram imobilizados sobre as placas de madeira com a fixação dos

seus membros. Realizada tricotomia da parede abdominal anterior e anti-sepsia com

iodopovidine.

A laparotomia mediana com 4 cm de extensão foi iniciada a 1 cm acima da

genitália externa dos animais.

Foi procedida exposição do cólon distal, secção do mesmo a cerca de 2,5 a 3,5

cm cranialmente à reflexão peritoneal e anastomose término-terminal do segmento, em

plano único transmural, com pontos contínuos de fio de polipropileno 6.0 com agulha

cilíndrica.

A síntese da parede abdominal foi realizada em dois planos contínuos com fio de

polipropileno 5-0.

A analgesia pós-operatória foi realizada com a administração de tramadol na

dose de 1 mg/Kg via subcutânea no primeiro dia pós-operatório e dispensada solução

analgésica com dipirona na concentração de 500mg/5ml de água colocadas em

bebedouro.

Foi utilizado material e instrumental cirúrgico limpo não estéril. Todos os

procedimentos operatórios foram realizados pelo mesmo cirurgião, e consistiram de:

a) Laparotomia mediana com 4 cm de extensão, iniciada a 1 cm acima da genitália

externa dos animais (Figura 3);

24

Figura 3 - Laparotomia mediana com extensão de 4 cm.

b) A posição do afastador auto-estático e a exposição do cólon distal (figura 4);

Figura 4 –A posição do afastador auto-estático e a exposição do cólon distal.

c) Malaxação divergente caso o segmento intestinal a ser operado apresentasse

conteúdo fecal;

d) Secção do cólon esquerdo, aproximadamente 3,0 cm. acima da reflexão

peritoneal, sem causar lesão dos ramos arteriais terminais (figura 5).

25

Figura 5 - Secção total do cólon a 3,0 cm acima da reflexão peritoneal.

e) Justaposição das extremidades da alça do cólon (figura 6) e anastomose colo-colônica

término-terminal, em plano único transmural, com pontos contínuos de fio de

polipropileno 6.0 (Ethicon ®) com agulha cilíndrica (figura 7); figura 6 -

Justaposição das extremidades da alça do cólon.

Figura 7 - Anastomose colo-colônica término-terminal

26

f) Síntese da parede abdominal com sutura em dois planos contínuos com fio de

Polipropileno 5-0 (Ethicon®). O primeiro plano era constituído de peritônio,

musculatura e aponeurose e o segundo, do tecido subcutâneo e pele.

3.5 ADMINISTRAÇÃO DO INFLIXIMAB E DA SALINA

O INFLIXIMAB foi administrado para os grupos correspondentes, na dose de 5

mg/Kg de peso, por via intraperitoneal, dose única, 24 horas após o procedimento

operatório para os grupos cIFX1 e scIFX1, e 72 horas após a operação para os grupos

medicação cIFX3 e scIFX3. A administração da solução fisiológica foi realizada após

24 horas do procedimento para os grupos controle (SAL). Todos os animais do grupo

controle receberam volumes equivalentes (1,5 ml) de solução de NaCl 0,9%, pela

mesma via de aplicação.

3.6 PÓS-OPERATÓRIO

Imediatamente após a realização da intervenção cirúrgica, os animais eram

devolvidos às gaiolas, nos mesmos grupos separados previamente e receberam água

com solução analgésica de dipirona e dieta padrão à vontade. A analgesia pós-operatória

foi realizada com tramadol 1 mg/Kg via subcutânea, dose única no 1o DPO

Foram avaliados como parâmetros para seguimento clínico, os seguintes sinais:

apatia, eriçamento de pêlos, diarréia, distensão abdominal, complicações da ferida

operatória como hematomas e sinais de infecção do sítio cirúrgico. Estes parâmetros

foram graduados por uma escala pré-estabelecida que varia de acordo com o descrito a

seguir:

0 – Ausentes;

1 - Presença leve;

2 - Presença moderada;

3 - Presença marcante e

4 - Presença intensa.

27

3.7 REOPERAÇÃO E ANÁLISE OPERATÓRIA

A reoperação foi realizada no 7o DPO. Os animais foram pesados e anestesiados

conforme técnica descrita para primeira operação. Ressecada uma área retangular de 4

cm por 6 cm da parede abdominal contendo a cicatriz mediana na sua porção central.

Inventariada a cavidade abdominal sendopesquisada a presença de sinais de peritonite,

abscesso e deiscência de anastomose. (Figura 8).

Figura 8 – Processo de reabertura da cavidade abdominal.

Foi considerado íleo paralítico a presença de distensão de alças do cólon

proximal e distal à anastomose; e foi considerada obstrução intestinal, a presença de

distensão de alças de cólon somente no segmento proximal à anastomose. Também

foram considerados sinais de peritonite a presença de secreção purulenta ou escurecida

livre na cavidade, eritema e edema de alças de cólon de delgado e cólon.

Um segmento colônico de 4 cm de comprimento, contendo a anastomose na sua

porção central, foi removido em conjunto com as estruturas a ele aderidas (figura 10).

28

A B

Figura 9 – A: Segmento anastomótico com estruturas aderidas, B: Segmento anastomótico com aderências liberadas.

A peça anatômica retirada do animal foi aberta pela borda anti-mesentérica e

dividida em três segmentos longitudinais (figura 11). O segmento da direita foi então

fixado em cartolina, ficando exposta a superfície mucosa, e conservado em formol

tamponado a 10% (dez por cento), para posterior análise histopatológica. (Porção A). O

segmento central foi encaminhado para análise da força de ruptura da anastomose.

(Porção B). A parte restante (Porção C) poi congelada à -80º C para construção de

biorepositório.

A eutanásia foi realizada com a secção dos vasos da base, após coleta de sangue

intra-ventricular, sendo o sangue separado em soro e plasma por centrifugação e

congelados a (-80o) a fim de se montar uma soroteca como biorepositório para análises

futuras.

29

Figura 10 - Divisão do segmento colônico em três porções com a anastomose.

3.8 ESTUDO DA FORÇA DE RUPTURA DA PAREDE ABDOMINAL E DA ANASTOMOSE COLONICA

O estudo da força de ruptura da anastomose foi realizado por aparelho de ensaio

digital denominado Versa Test (Mecmesin Versa Test, United Kingdom) acoplado a um

dinamômetro digital AGF (Mecmesin Versa Test, United Kingdom - figura 11).

Um pequeno fragmento retangular de tecido foi fixado nas suas duas extremidades

pela pinça superior do dinamômetro e a pinça inferior do Versa Test, com a região

anastomótica equidistante e paralela às pinças.

A velocidade utilizada durante o teste foi de 30 mm/min (TOGNINI et al.,

2000). O valor de ruptura foi expresso em newton (N).

Figura 11 - Aparelho de ensaio para determinação da força de ruptura da anastomose

30

3.9 ESTUDO HISTOPATOLÓGICO

Neste estudo, todas as peças foram tratadas e fixadas em formol a 10% (dez por

cento), incluídas em parafina, processadas conforme a rotina do Laboratório de

Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília (UNB) e coradas pelo

método hematoxilina-eosina (HE).

Um patologista experiente, sem saber de que grupo de animais provinha o

material a ser analisado, procedeu à análise por microscopia óptica. Foram avaliados os

seguintes indicadores:

-Fibroblastos;

- Mononucleares;

- Polimorfonucleares;

- Colágeno

Os indicadores de acima foram quantificados em: ausentes (0) leve (+);

moderado (++); intenso (+++).

3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A avaliação dos resultados se deu pela análise das seguintes variáveis: Médias

da variação de peso entre os grupos no dia do procedimento e no 7o DPO. Comparação

entre as médias da força de ruptura da anastomose expressa em newtons (N) entre os

grupos. Análise comparativa entre as medias da força de ruptura da parede abdominal

expressa em newntos (N). Avaliação descritiva das lâminas de histopatologia,

considerando-se a intensidade da presença de mononucleares, polimorfonucleares,

fibroblastos e colágeno, tabulados de maneira cega, por único patologista experiente em

avaliação dos fenômenos de cicatrização.

Foi realizado análise estatística do experimento do tipo fatorial com dois fatores:

- Fator Colite (com colite; sem colite);

- Fator Infliximab (Infliximab no 1º DPO, Infliximab no 3º DPO, Placebo).

Testes estatisticos segundo ANOVA realizados utilizando o SPSS (Special Package

for Social Sciences) versão17.0.

31

a) Análise da diferença de peso entre o peso inicial e o peso final dos animais.

As suposições de normalidade e homocedasticidade foram satisfeitas de acordo com o

Teste de Shapiro-Wilk e o Teste de Levene para variâncias constantes;

b) Análise da força tênsil de ruptura da parede abdominal (teste t de student)

c) Análise da força tênsil de ruptura da anastomose (teste t de student)

d) Análise das associações com comparações da parede abdominal e das

anastomoses; (análise descritiva)

Todas as probabilidades menores a 5% (p< 0,05) foram consideradas

significantes.

Tabela 1: Número de repetições em cada célula experimental.

Fator Infliximab Total

Infliximab no 1º DPO


Placebo

Fator Colite

Grupo com Colite

3 4 8 15

Grupo sem Colite

4 4 7 15

Total 7 8 15 30

Apesar de o número de replicações não serem iguais (dados não balanceados)

entre as parcelas de estudo o que poderia ocasionar dificuldades na estimação dos

parâmetros da ANOVA, os dados da Tabela 2 estão distribuídos de forma

aproximadamente proporcional, o que de acordo com Montgomery (2009) é o suficiente

para que as análises possam ser conduzidas normalmente.

32

4. RESULTADOS

4.1 MORTES

Houve um óbito de animal alocado no grupo de estudo colite, tratado com

INFLIXIMAB no 1o DPO (cIFX1), cuja necrópsia revelou obstrução intestinal, sem

evidências de deiscência de anastomose. Outra morte ocorreu na fase pré-operatória,

durante indução anestésica de animal pertencente ao grupo sem colite que recebeu

placebo (scSAL), o qual foi excluído do estudo.

4.2 VARIÁVEL RESPOSTA: DIFERENÇA DE PESO (DIFERENÇA ENTRE O PESO FINAL E O PESO INICIAL DOS ANIMAIS)

Tabela 2: Testes de efeitos entre sujeitos (Variável dependente: diferença de peso).

Origem Tipo III Soma

dos Quadrados

gl Quadrado

Médio

F Sig. Eta parcial

quadrado

Modelo corrigido 13883,901a 5 2776,780 104,390 ,000 ,956

Intercepto 23169,069 1 23169,069 871,019 ,000 ,973

Fator_Colite 4577,915 1 4577,915 172,102 ,000 ,878

Fator_Infliximab 9450,114 2 4725,057 177,634 ,000 ,937

Fator_Colite *

Fator_Infliximab

1408,022 2 704,011 26,467 ,000 ,688

Erro 638,399 24 26,600

Total 30809,000 30

Total corrigido 14522,300 29 Observação: a. R Quadrado = ,956 (R Quadrado Ajustado = ,947).

33

Tabela 3: Médias marginais estimadas - Fator Colite * Fator Infliximab (Variável dependente: diferença de peso).

Fator Colite Fator Infliximab Média Erro Intervalo de Confiança 95%

Limite

inferior

Limite

superior

Grupo com Colite Infliximab no 1º

DPO

-63,667 2,978 -69,812 -57,521

Infliximab no 3º

DPO

-52,000 2,579 -57,322 -46,678

Placebo -12,125 1,823 -15,888 -8,362

Grupo sem Colite Infliximab no 1º

DPO

-37,500 2,579 -42,822 -32,178

Infliximab no 3º

DPO

-9,500 2,579 -14,822 -4,178

Placebo -2,143 1,949 -6,166 1,880

Gráfico 1: Médias da variação de peso dos animais entre os grupos avaliando o fator colite e o fator IFX no início do experimento e no dia eutanásia.

34

Tabela 4: Comparações por Método Pairwise – Fator Colite (Variável dependente: diferença de peso).

Fator Colite

(I) Fator Infliximab

(J) Fator Infliximab

Diferença média (I-J)

Erro Sig.b 95% Intervalo de Confiança para Diferençab

Limite inferior

Limite superior

Grupo com Colite



-11,667* 3,939 ,007 -19,797 -3,537

Placebo -51,542* 3,492 ,000 -58,748 -44,335



11,667* 3,939 ,007 3,537 19,797

Placebo -39,875* 3,158 ,000 -46,393 -33,357

Placebo Infliximab no 1º DPO

51,542* 3,492 ,000 44,335 58,748


39,875* 3,158 ,000 33,357 46,393

Grupo sem Colite



-28,000* 3,647 ,000 -35,527 -20,473

Placebo -35,357* 3,233 ,000 -42,029 -28,685



28,000* 3,647 ,000 20,473 35,527

Placebo -7,357* 3,233 ,032 -14,029 -,685


35,357* 3,233 ,000 28,685 42,029


7,357* 3,233 ,032 ,685 14,029

Observações: Baseado em médias marginais estimadas;

* A diferença média é significativa no nível - 05.

b. Ajustamento para diversas comparações: Diferença menos significativa (equivalente a

nenhum ajustamento).

35

Tabela 5: Comparações por Método Pairwise – Fator Infliximab (Variável dependente:

diferença de peso).

Fator Infliximab

(I) Fator Colite

(J) Fator Colite


Erro Erro

Sig.b 95% Intervalo de Confiança para Diferençab

Limite inferior

Limite superior


Grupo com Colite

Grupo sem Colite

-26,167* 3,939 ,000 -34,297 -18,037

Grupo sem Colite

Grupo com Colite

26,167* 3,939 ,000 18,037 34,297


Grupo com Colite

Grupo sem Colite

-42,500* 3,647 ,000 -50,027 -34,973

Grupo sem Colite

Grupo com Colite

42,500* 3,647 ,000 34,973 50,027

Placebo Grupo com Colite

Grupo sem Colite

-9,982* 2,669 ,001 -15,491 -4,473

Grupo sem Colite

Grupo com Colite

9,982* 2,669 ,001 4,473 15,491

36

Gráfico 2: Mediana e valores intervalares da variação de peso dos animais entre os grupos considerando o fator colite e o fator IFX no início do experimento e no dia eutanásia.

Ao analisar as variáveis resposta Colite e uso de INFLIXIMAB, houve interação

entre estes fatores. Quando este fenômeno ocorre, é necessário fazer a correlação entre

todos os cruzamentos das variáveis respostas, sempre com a fixaçao de um dos fatores e

proceder a comparação entre estas, diminuindo assim o viés de análise.

No grupo cIFX1 houve a maior variação negativa de peso (-63,7g). Este valor

foi estatisticamente significativo quando comparado com todos os grupos de animais

com colite: cIFX3 (-52g) (p=0,007) e cSAL (-12,1g) (p=0,001). Resultados

estatisticamente significativos também foram encontrados na análise da comparação

entre os grupos sem colite: scIFX1 (-37,5g), scIFX3 (-9,5g) e scSAL (-2,1g) (p=0,001).

Quando comparamos todas as interações entre os grupos, observamos que tanto o fator

colite quanto o uso do INFLIXIMAB acarretam variações negativas para os grupos

estudados. Tanto nos grupos com colite e sem colite, a perda de peso foi maior nos

animais que receberam a droga quando comparados com placebo, sendo esta perda mais

expressiva quando a droga é administrada no 1o DPO (p=0,001). O grupo com colite foi

o que mais variou negativamente de peso quando comparado com o grupo sem colite.

37

Gráfico 3: Mediana e valores intervalares de peso dos animais entre os grupos considerando o fator colite no início do experimento e no dia eutanásia.

Gráfico 4: Mediana e valores intervalares da variação de peso dos animais entre os grupos considerando o fator Infliximab no início do experimento e no dia eutanásia.

38

4.3 VARIÁVEL RESPOSTA: ANÁLISE DA FORÇA TÊNSIL DE RUPTURA NA PAREDE ABDOMINAL

Tabela 6: Teste de efeito entre sujeitos (Variável dependente: FT- Parede). Origem Tipo III Soma

dos Quadrados

gl Quadrado

Médio

F Sig. Eta parcial

quadrado


Intercepto 1503,821 1 1503,821 245,394 ,000 ,911

Fator_Infliximab 37,051 2 18,526 3,023 ,067 ,201

Fator_Colite 194,760 1 194,760 31,781 ,000 ,570

Fator_Infliximab *

Fator_Colite

37,343 2 18,672 3,047 ,066 ,202

Erro 147,077 24 6,128

Total 2260,426 30

Total corrigido 370,705 29

Observação:

a. R Quadrado = ,603 (R Quadrado Ajustado = ,521).

Tabela 7: Fator Colite (Variável dependente: FT - Parede).

Fator Colite Média Erro Padrão Intervalo de Confiança 95%

Limite inferior Limite superior

Grupo com Colite 4,809 ,694 3,376 6,243

Grupo sem Colite 10,217 ,662 8,851 11,582

39

Tabela 8: Fator Infliximab (Variável dependente: FT - Parede).

Fator Infliximab Média Erro

Padrão

Intervalo de Confiança 95%

Limite

inferior

Limite

superior

Infliximab no 1º

DPO

5,891 ,945 3,940 7,842

Infliximab no 3º

DPO

7,953 ,875 6,146 9,759

Placebo 8,695 ,641 7,373 10,017

Em relação a força de ruptura da cicatriz da parede abdominal, não houve

interção entre os fatores colite e uso de Infliximab. Não houve diferença estatística entre

a força de ruptura nos animais sem colite (scIFX1, scIFX3 e scSAL), independente do

uso de drogas. Para o grupo de animais com colite, aqueles que receberam a droga no 1o

DPO, apresentaram uma difrença significativa: cIFX1 (1,6N) X cIFX3 (5,61N)

(p=0,001). Não observamos diferença quando comparados o grupo cIFX3 com o cSAL

(p=0,066)

40

Gráfico 5: Mediana e valores intervalares da força tênsil de ruptura da cicatriz da parede abdominal expressa em Newtons (N) entre os grupos considerando o fator colite e o fator Infliximab no dia eutanásia.

41

Gráfico 6: Mediana e valores intervalares da força tênsil de ruptura da cicatriz da parede abdominal expressa em Newtons (N) entre os grupos considerando o Fator colite no dia eutanásia.

Gráfico 7: Médias da Força tênsil de ruptura da cicatriz da parede abdominal expressa

em Newtons (N) entre os grupos considerando o fator colite e o fator Infliximab no dia

eutanásia.

42

4.4 VARIÁVEL RESPOSTA: ANÁLISE DA FORÇA TÊNSIL DE RUPTURA DA ANASTOMOSE

Tabela 9: Teste de efeito entre sujeitos (Variável dependente: FT- Anastomose). Origem Tipo III Soma

dos Quadrados gl Quadrado

Médio F Sig. Eta parcial

quadrado


Intercepto 45,121 1 45,121 170,243 ,000 ,876

Fator_Colite ,130 1 ,130 ,490 ,491 ,020

Fator_Infliximab 1,081 2 ,541 2,040 ,152 ,145

Fator_Colite * Fator_Infliximab

11,016 2 5,508 20,782 ,000 ,634

Erro 6,361 24 ,265

Total 69,666 30

Total corrigido 19,303 29

Observação: a. R Quadrado = ,670 (R Quadrado Ajustado = ,602).

Tabela 10: Estimativas (Variável dependente: FT- Anastomose). Fator Colite Fator Infliximab Média Erro Intervalo de Confiança 95%

Limite inferior Limite superior

Grupo com Colite Infliximab no 1º DPO ,553 ,297 -,060 1,167

Infliximab no 3º DPO 1,730 ,257 1,199 2,261

Placebo 1,411 ,182 1,036 1,787

Grupo sem Colite Infliximab no 1º DPO 2,640 ,257 2,109 3,171

Infliximab no 3º DPO ,625 ,257 ,094 1,156

Placebo ,849 ,195 ,447 1,250

43

Tabela 11: Comparações por Método Pairwise - 1º e 3º DPO (Variável dependente: FT- Anastomose).

Fator Colite

(I) Fator Infliximab

(J) Fator Infliximab


Erro Erro


Limite inferior

Limite superior

Grupo com Colite



-1,177* ,393 ,006 -1,988 -,365

Placebo -,858* ,349 ,021 -1,577 -,139



1,177* ,393 ,006 ,365 1,988

Placebo ,319 ,315 ,322 -,332 ,969


,858* ,349 ,021 ,139 1,577


-,319 ,315 ,322 -,969 ,332

Grupo sem Colite



2,015* ,364 ,000 1,264 2,766

Placebo 1,791* ,323 ,000 1,125 2,457



-2,015* ,364 ,000 -2,766 -1,264

Placebo -,224 ,323 ,495 -,890 ,442


-1,791* ,323 ,000 -2,457 -1,125


,224 ,323 ,495 -,442 ,890

Baseado em médias marginais estimadas;


44

Tabela 12: Comparações por Método Pairwise (Variável dependente: FT- Anastomose). Fator Infliximab

(I) Fator Colite

(J) Fator Colite


Erro Erro


Limite inferior

Limite superior


Grupo com Colite

Grupo sem Colite

-2,087* ,393 ,000 -2,898 -1,275

Grupo sem Colite

Grupo com Colite

2,087* ,393 ,000 1,275 2,898


Grupo com Colite

Grupo sem Colite

1,105* ,364 ,006 ,354 1,856

Grupo sem Colite

Grupo com Colite

-1,105* ,364 ,006 -1,856 -,354

Placebo Grupo com Colite

Grupo sem Colite

,563* ,266 ,045 ,013 1,113

Grupo sem Colite

Grupo com Colite

-,563* ,266 ,045 -1,113 -,013

Baseado em médias marginais estimadas;


b. Ajustamento para diversas comparações: Diferença menos significativa

(equivalente a nenhum ajustamento).

45

Na avaliação da força tensil de ruptura da anastomose, houve interação entre os

fatores colite e uso de INFLIXIMAB. Por esta razão, a mesma diretriz utilizada para a

análise de variância para a diferença de peso foi utilizada, sempre com a fixação de um

dos fatores para análise cruzada entre os grupos.

Quando comparados os com colite, houve diferença estatisticamente

significativa entre os grupos cIFX1 (0,55N) X cIFX3 (1,73N) (p=0,006) e entre os

grupos cIFX1 (0,55N) e cSAL (1,41) (p=0,02). Não houve diferença entre os grupos

cIFX3 (1,73N) e cSAL (1,41N) (p=0,322)

Nos grupos sem colite observamos: scIFX1 (2,64N) X scIFX3 (0,63N)

(p=0,001) e entre scIFX1 (2,64) e scSAL (0,85) (p=0,001). Também não houve

significância quando comparados scIFX3 e scSAL (p=0,495)

Ao analisarmos o uso do INFLIXIMAB no 1o DPO, 3o DPO e placebo, e

utilizamos como variável resposta a presença ou não de colite, obtivemos os seguintes

resutados:

Tabela 13: Força de ruptura (N) da anastomose INFLIXIMAB

1o DPO

INFLIXIMAB

3O DPO

Placebo

Colite 0,55 1,73 1,41

Sem Colite 2,64 0,63 0,85

p Valor 0,001 0,006 0,045

46

Gráfico 8: Mediana e valores intervalares da força tênsil de ruptura da anastomose expressa em Newtons (N) entre os grupos considerando o fator colite e o fator Infliximab no dia eutanásia.

Gráfico 9: Mediana e valores intervalares da força tênsil de ruptura da anastomose expressa em Newtons (N) entre os grupos considerando o fator colite.

47

Gráfico 10: Mediana e valores intervalares da força tênsil de ruptura da anastomose expressa em Newtons (N) entre os grupos considerando o Fator Infliximab no dia eutanásia.

Gráfico 11: Médias da Força tênsil de ruptura da anastomose expressa em Newtons (N) entre os grupos considerando o fator colite e o fator Infliximab no dia eutanásia.

48

4.5 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA

Neste estudo, será apresentada tabela descritiva com a mediana das

gradações de intensidade da presença de mononucleares, polimorfonucleares,

fibroblastos e colágeno descritos pelo patologista.

Tabela 14: Mediana da intensidade de achados histológicos Mononucleares Polimorfonucleares Fibroblastos Colágeno cIFX1 ++ ++ +++ ++ cIFX3 ++ ++ +++ ++ cSAL ++ ++ +++ ++ scIFX1 ++ ++ +++ ++ scIFX3 ++ ++ +++ ++ scSAL ++ ++ +++ ++

Os indicadores utilizados acima foram quantificados em: ausentes (0) leve (+);

moderado (++); intenso (+++).

Não foram observadas diferenças quanto a intensidade da presença de

mononucleares, polimorfonucleares, fibroblastos ou colágeno entre os grupos de estudo.

4.6 AVALIAÇÃO CLÍNICA DOS ANIMAIS COM E SEM COLITE TRATADOS COM INFLIXIMAB OU PLACEBO 4.6.1 Desenvolvimento clínico

Não houve diferença estatística entre os grupos na avaliação diária dos

parâmetros clínicos de apatia, eriçamento, perda de pêlos, diarréia e distensão

abdominal, nos animais submetidos à eutanásia.

4.6.2 Achados intra-operatórios

Não houve diferença estatística entre os grupos em relação à deiscência de

anastomose. Não houve casos de deiscência de anastomose livre, com presença de fezes

na cavidade abdominal à re-operação. Não houve casos de deiscência nos animais

controles.

A avaliação da cavidade abdominal realizada à re-operação foi semelhante entre

os grupos em relação à presença de peritonite, íleo paralítico, obstrução intestinal e

abscesso intracavitário, não havendo diferenças.

49

5 DISCUSSÃO

Não houve diferença entre os subgrupos em relação aos parâmetros clínicos,

incidência de deiscência de anastomose e achados intra-operatórios de peritonite,

abscesso, obstrução ou íleo paralítico.

Apesar dos dados de literatura serem controversos, e alguns autores apontarem

que a influência do IFX na cicatrização de feridas não é significativa (LOPES 2008),

neste modelo experimental, foi observado que o uso de INFLIXIMAB, administrado 24

horas após o trauma operatório na vigência de colite induzida, apresentou um efeito

negativo, com diminuição da força de ruptura de anastomose, e maior variação negativa

na perda de peso. Porém, após 72 horas de trauma, ainda em vigência de colite, notamos

uma inversão dos resultados de cicatrização, passando o IFX a apresentar resultados

positivos, com aumento da força tênsil quando comparados com o grupo sem colite

induzida, tanto quando receberam IFX no 3o DPO, quanto quando receberam salina.

Quando avaliamos a força de ruptura da cicatriz da parede abdominal, verificou-

se que no grupo sem colite induzida, não houve interferência do uso da droga tanto no

1o DPO quanto no 3o DPO, e estes dois não diferiam do grupo que recebeu salina. No

grupo com colite induzida, houve uma piora da cicatrização em relação ao grupo sem

colite, sem significância estatística, a exceção daqueles que receberam IFX no 1o DPO,

sendo a piora da cicatrização significativa neste grupo.

Notamos que o fator colite melhorou a cicatrização da anastomose, a exceção

daquele grupo que recebeu IFX no 1o DPO, no qual houve uma piora.

O IFX quando administrado no 3o DPO, apresentou comportamento semelhante

ao placebo, não influenciando a cicatrização seja da parede ou da anastomose, na

vigência ou não de colite, o que nos leva a crer, que ocorre um efeito biológico distinto

quando o anti-TNF é administrado na fase inflamatória inicial da cicatrização.

Não foram observadas diferenças entre os parâmetros histopatológicos avaliados

no 7o DPO entre todos os grupos.

As pesquisas e experiências sobre a cicatrização de anastomoses têm sido

realizadas nos ratos, pois acredita-se que o modelo básico da reparação tecidual e a

composição da microflora fecal deste animal sejam bastante semelhantes aos do ser

humano (SIEMONSMA et al., 2003; CAKMAK et al., 2009; HERRMANN et al.,

1964). Os ratos apresentam praticidade para experimentos com grande número de

animais com similaridade genética e fisiológica (HERRMANN et al., 1964). Outras

50

vantagens na sua utilização consistem na fácil padronização quanto à raça, sexo e peso

dos animais; na resistência às infecções, o que dispensa a utilização de técnicas

assépticas; no baixo custo de aquisição e na sua fácil manutenção em biotério

(SIRIMARCO et al., 2001).

A colite induzida por ácido acético em modelo animal com ratos, há várias

décadas têm sido utilizada para estudo de doenças inflamatórias, devido a similaridade

em relação ao padrão inflamatório histológico e de derivados eicoisanóides. O ácido

acético permite, rapidamente, o estudo do processo inflamatório, pois apenas 12 horas

após a indução já́ é possível que sejam observadas as alterações inflamatórias. (El-

Medany 2006).

Normalmente, a região mais vulnerável do trato gastrointestinal (TGI) à

deiscência de anastomoses, é a região do cólon (YARIMKAYA et al., 2003). A

presença de alta taxa de mortalidade e a incidência de morbidade grave associadas à

deiscência justificam a necessidade de avaliação adicional de métodos que diminuam a

sua incidência (HOEPPNER et al., 2010) e dos efeitos deletérios de drogas sobre a

cicatrização dos tecidos.

A ocorrência de deiscência é particularmente alta quando a anastomose é

realizada no cólon distal, com elevada morbimortalidade quando comparada a

anastomoses realizadas em outras porções do TGI (JIBORN et al., 1980). A anastomose

colo retal baixa está associada a uma maior incidência de complicações pela carga fecal

e dificuldade técnica associadas (CAKMAK et al., 2009).

Segundo TRUBIAN (2004), anastomoses colônicas perdem 72 a 95% da força

de ruptura nos primeiros três dias de pós-operatório. Após duas semanas, a resistência é

semelhante aos controles não operados. HERRMANN et al. (1964) estudaram a

evolução normal da cicatrização de anastomoses do cólon esquerdo de ratos, desde 3

horas até 1 ano de pós-operatório. Eles determinaram que a resistência tênsil não se

altera desde 3 horas até 4 a 5 dias. Após este período ocorre um ganho rápido na

resistência e, por volta do sétimo dia, o seu valor iguala-se ao do intestino não operado.

O colágeno é a principal proteína da matriz extracelular e o constituinte

predominante da cicatriz final (INAN et al., 2006). No TGI, está localizado

principalmente na camada submucosa (LORD et al., 1977). Ele é importante em todas

as fases da cicatrização e é crítico para a força e integridade tecidual. Entretanto, a força

anastomótica final nem sempre está relacionada à concentração absoluta de colágeno: a

estrutura e o arranjo da matriz de colágeno podem ser mais importantes (AYDIN et al.,

51

2006). É provável que o ganho da resistência mecânica esteja diretamente relacionado à

qualidade do colágeno (LEITE et al., 1993).

A anastomose é mais fraca no 3° e 4° DPO pelo baixo conteúdo de colágeno

decorrente da alta atividade da colagenase induzida pela injúria tecidual na fase inicial

da cicatrização (JIBORN et al., 1980). Tanto granulócitos tanto monócitos que estão

presentes na área anastomótica após 3 e 24 horas de pós-operatório, respectivamente,

têm grande atividade colagenolítica (MASTBOOM et al., 1991). Já foi demonstrado

uma perda substancial da capacidade tecidual de segurar a sutura nos primeiros dias de

pós-operatório em todos os segmentos do TGI, provavelmente pela degradação do

colágeno tecidual. Este fator pode ser importante no desenvolvimento da deiscência de

anastomose (HOGSTROM; HAGLUND, 1985).

A resistência máxima é atingida entre o 8° e 10° DPO, época na qual o

rompimento ocorre proximal ou distal à anastomose.

A fase de remodelação é caracterizada pela proliferação de células musculares

lisas e redução da quantidade de macrófagos e fibroblastos (THOMPSON et al., 2006).

Ocorre alteração na composição da matriz extracelular. Durante esta fase, o colágeno

tipo III é o tipo predominante. Ele aparece após 48 a 72 horas de pós-operatório e tem

seu pico entre 5 e 7 dias. Com a evolução da cicatrização, ocorre a degradação do

colágeno tipo III e o aumento da síntese do colágeno tipo I. Este processo ocorre pela

ação das MMP. A quantidade total de colágeno atinge valores máximos entre 2 e 3

semanas após a injúria (LI et al.,2007).

O TNFα é produzido predominantemente por neutrófilos, células endoteliais

vasculares e macrófagos (BAKER et al., 2006). É um mediador inflamatório ativo na

síntese de colágeno e também provê substrato metabólico para a cicatrização de feridas

na fase inflamatória (LOPES et al., 2008). Produzido precocemente no local da

anastomose, diminui rapidamente e quase desaparece 24 horas após a operação no

processo cicatricial normal (ISHIMURA et al., 2002). Níveis aumentados após este

período correlacionam-se com o retardo da cicatrização (ISHIMURA et al., 2002;

BUCK et al., 1996; KANELLOS et al., 2008; ZACHARAKIS et al., 2008). O

tratamento com TNFα inibe a cicatrização durante a fase inflamatória por diminuir a

produção de tecido de granulação (RAPALA et al, 1991). Estudos prévios

demonstraram que o TNF α inibe a expressão gênica do colágeno e aumenta a atividade

colagenolítica, levando a um prejuízo à cicatrização (BUCK et al., 1996; AHRENDT et

al., 1996).

52

Em culturas de fibroblastos da pele humana, o TNFα causou inibição da

produção de colágeno de modo dose dependente e diminuição do RNAm do colágeno.

Além disso, aumentou a degradação do colágeno por aumentar a produção de

colagenase pelos fibroblastos da pele (MAUVIEL et al., 1988). AGREN et al. (2011)

não encontraram impacto importante do bloqueio da sinalização do TNF α sobre a

resistência tênsil de anastomoses do cólon esquerdo de ratos. Outros autores

demonstraram relação entre o aumento do TNFα e o prejuízo na cicatrização de

anastomoses no 7° DPO em camundongos na presença de sepse (ISHIMURA et al.,

2002).

Diversos estudos avaliaram as variações dos níveis de citocinas no período pós-

operatório e sua relação com a ocorrência de complicações. BAKER at al. (2006)

realizaram dosagens de citocinas no fluido do dreno abdominal de pacientes submetidos

a operações colorretais eletivas e demonstraram que os níveis de IL6 tiveram pico no 1°

DPO, com posterior decréscimo até o 7° DPO. Os valores de TNFα foram baixos no 1°

e 3° DPO, com aumento gradativo até o 7° DPO. A IL1 β teve pico no 1° DPO, com

posterior queda até o 5° DPO e leve recuperação posterior até o 7° DPO.

HERWING et al. (2002) evidenciaram que aumentos significativos de IL6 e

TNF α no 1° DPO precede sintomas clínicos de peritonite e deiscência de anastomose

colorretal em vários dias, e que os níveis de IL1 aumentaram significativamente no 3°

DPO em pacientes que desenvolveram deiscência.

BERTRAM et al. (2003) também encontraram aumento dos níveis de TNFα um

dia antes do diagnóstico cirúrgico de deiscência, mas não houve diferença significante

em relação ao grupo controle. Estes autores concluíram que após a operação colorretal

eletiva, a quantificação de TNFα e de IL6 no dreno peritoneal não tem utilidade no

diagnóstico de deiscência anastomótica. Já foi descrita uma correlação positiva entre os

níveis de IL1β, IL6 e TNFα e tempo operatório prolongado, maior perda sanguínea e

contaminação bacteriana do fluido do dreno peritoneal (TSUKADA et al., 1993).

É necessário salientar que a detecção da expressão dos genes para citocinas ou

mesmo dos níveis de citocinas em tecidos ou secreções nem sempre se correlaciona com

sua atividade biológica. Elas podem não estar sendo produzidas, ter sido secretadas na

forma inativa ou ainda já podem ter sido degradadas (WHITTE; BARBUL, 1997).

O TNF α, a IL6 podem ser fatores inibitórios do processo de cicatrização de

anastomoses intestinais na presença de fatores adversos (MARTINEAU; SHEK, 2000;

ISHUMURA et al., 2002). ISHIMURA et al. (1998), em um estudo experimental em

53

camundongos, demonstraram, por imuno-histoquímica, que a expressão de IL 6 no

segmento anastomótico é suprimida após a indução da sepse por injeção intraperitoneal

de LPS, sugerindo que a cicatrização está prejudicada por supressão local da reação.

Níveis plasmáticos de IL6 correlacionaram-se com a mortalidade em pacientes sépticos

(VAN DER STAPPEN et al.,1989) e altos níveis de IL6 e TNF α ao fim do período de

infusão bacteriana têm correlação com má evolução clínica (MARTINEAU; SHEK,

2000).

Em nosso desenho, propusemos a avaliação da influência de uma droga anti-

TNF, verificando sua ação quando administrada precocemente após o trauma cirúrgico,

modulando o TNF na fase inflamatória, na presença ou não de inflamação local e

comparando com a administração do fármaco mais tardiamente, já na fase proliferativa,

com o intuito de testar a hipótese de que o uso precoce da droga alteraria a cicatrização

da anastomose.

Quase todas as anastomoses romperam na linha de sutura durante a realização do

teste de força de ruptura. HENDRIKS e MASTBOOM (1990) acreditam que a pressão

de ruptura seja um bom método para estudo da cicatrização de anastomoses somente

quando a ruptura se dá no local da anastomose e o teste for realizado nos primeiros dias

após a cirurgia, quando a resistência anastomótica é baixa e as chances para deiscências

são relativamente altas. Os mesmos autores destacam não ter havido correlação entre

concentração de colágeno e parâmetros mecânicos na cicatrização de anastomoses

intestinais, fatos que corroboram nossos achados histopatológicos, onde não foram

encontradas diferenças entre a quantidade de fibroblastos e colágeno, a despeito dos

resultados de força de ruptura da anastomose.

Como paradigma, utilizamos a força de ruptura da cicatriz da parede abdominal,

tentando demonstrar a diferença entre cicatrização em um sítio exposto a estresse

adicional, representado neste estudo pela colite induzida.

Vale ressaltar que a análise da variável colite induzida, quando associada com

IFX no 3o DPO ou SAL, parece ser fator isolado de melhora na cicatrização, quando

comparados com os grupos que não foram submetidos a colite, recebendo IFX no 3o

DPO ou salina.

Quando foi observada a força de ruptura de cicatriz de parede abdominal, para o

grupo sem colite, não houve influência da droga na cicatrização, independente do

momento em que a droga foi utilizada. Porém, no grupo com colite induzida que

recebeu IFX no 1o DPO, houve uma piora significativa na força de ruptura da parede.

54

Os achados acima descritos, demonstram a necessidade de estudos adicionais,

que visem determinar a expressão tecidual e a atividade molecular do TNF e sua

modulação pelo IFX, na fase inflamatória da cicatrização, afim de confirmar a hipótese

de que a modulação desta citocinas, representa relação direta com a qualidade da

cicatrização em sua fase tardia, após 7 dias do trauma, preenchendo, assim, a lacuna

ainda existente acerca desta controvérsia.

6. CONCLUSÃO

Nas condições em que o estudo foi conduzido, podemos concluir que a

utilização do INFLIXIMAB (IFX) precocemente após anastomose colônicas em ratos,

influenciou negativamente a cicatrização, na presença de colite, quando utilizado no 1o

DPO. Após este período, o grupo com colite induzida, apresentou melhora nos

parâmetros avaliados, mesmo em uso do IFX no 3o DPO quanto com o uso de salina.

O IFX utilizado no 1o DPO, quando associado ao modelo de colite

induzida por ácido acético, piorou a cicatrização da anastomose e da parede abdominal,

podendo a droga em questão possuir efeitos distintos a depender em qual fase da

cicatrização o tecido se encontra, sendo necessários estudos de ação e expressão

tecidual da citocinas para fortalecer estes achados.

55

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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64

ANEXO 1

65

ANEXO 2

DECLARAÇÃO DE CONFLITO DE INTERESSES

O autor afirma e reitera que não houve conflito de interesses (financeiros ou de

qualquer outra natureza) na realização da pesquisa ou na redação desta dissertação. O

estudo não recebeu apoio ou patrocínio financeiro de nenhum laboratório ou empresa

farmacêutica.

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