Universidade Federal de PelotasCentro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec

Graduação em BiotecnologiaDisciplina de BIOPROCESSOS

Profa. Dra. Patrícia S. Diaz

Técnicas de Preservação de Microrganismos

Introdução

Os microrganismos são fontes de uma infinidade de compostos úteis ao ser humano, a outros animais e às plantas, como antibióticos, enzimas, vitaminas, biosurfactantes, entre outros. Portanto, é de extrema importância conservar essas linhagens de microrganismos úteis por um longo tempo.

A preservação dos microrganismos de interesse industrial ou de pesquisa se realiza para:

1) Prevenir contra a contaminação;2) Prevenir contra a perda da viabilidade;3) Prevenir contra a mutação (perda das características fisiológicas).

Como ocorre: A conservação se dá devido ao baixo número de gerações filhas dos microrganismos conservados, não havendo grande variação da célula-mãe.

Objetivo: Preservar uma linhagem é conservar o estado inicial do microrganismo evitando mutações indesejáveis, preservação da vitalidade das células e do número de células viáveis.

Fundamento

A conservação de microrganismos está baseada na transição reversível entre um estado vital ativo (biose) e um estado inativo (anabiose) ou um estado de atividade baixa (hipobiose).

Os estudos nessa área mostram que os métodos mais eficientes são aqueles que fazem a transição para o estado anabiótico, pois o estado hipobiótico tem uma aplicação mais limitada.

Abaixo estão os métodos de conservação divididos com relação ao estado fisiológico da célula obtido:

Anabiose: secagem, congelamento a baixas temperaturas e liofilização.

Hipobiose: repique contínuo, estoque em água estéril ou solução fisiológica, resfriamento em temperaturas entre 4 a 8ºC.

A reativação do microrganismo ocorre pela recolocação das condições favoráveis ao seu desenvolvimento.

Anabiose

O termo anabiose envolve a habilidade da célula parar reversivelmente ou diminuir extremamente sua atividade, chegando a um estado em que:

• não há ou há pouco metabolismo,• há a conservação das estruturas celulares por longos períodos,• não há grandes quantidades de água livre presente,• aumento da resistência a fatores extremos e,• as células são hábeis a restaurar seu estado vital após o período de conservação.

Dependendo da forma como se atinge a anabiose ela pode ser dividida em quatro formas: a) Anidrobiose ou xerobiose: atingida através da evaporação da água. b) Criobiose: quando ocorre congelamento. c) Osmobiose: quando a água é extraída através da pressão osmótica fora da célula. d) Anoxibiose: atingida através do cultivo em meios livres de oxigênio.

Exemplo: amostras de gelo retiradas de 85 metros de profundidade em geleiras na Antártica e na Groenlândia podem conter espécies de microrganismos como actinomicetos, Nocadiopsis, Streptococcus albicans, Micrococcus roseus, M. abus, e Sarcina lutea de 2200 anos atrás.

Escolha do método de preservação

A escolha do método a ser utilizado deve considerar:

1) Tamanho estimado do acervo: tempo operacional exigido anteriormente e posterior à manipulação; espaço disponível para armazenamento

2) Importância do acervo: conseqüência de sua eventual perda; culturas com potencial biotecnológico preservação por mais de um método

3) Necessidade de acesso e uso da cultura: réplicas em quantidades adequadas; facilidade de reativação; preservação adequada para embalagem de envio e condições de transporte

4) Disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e financeiros

Métodos de preservação

Divididos em relação ao tempo de estocagem desejado

Curto prazo

repique contínuo

Médio prazo

preservação em óleo mineralpreservação em águacongelamento a -20°Csecagem em sílica, solo ou papel de filtro

Longo prazo

liofilizaçãocongelamento a -80°Ccriopreservação em nitrogênio líquido

Fatores que afetam a conservação dos microrganismos

A conservação de microrganismos depende da manipulação de alguns fatores ambientais de forma a retardar o crescimento. Eles são:

1) Método de cultivo:

a) Temperatura: influencia a eficiência do método.

Baixas temperaturas retardam as reações químicas, a ação das enzimas, e atrasam ou inibem o crescimento dos microrganismos. Quanto mais baixa a temperatura mais lenta serão as reações químicas, as ações enzimáticas e o crescimento microbiano.

b) Composição do meio: afeta a resistência da célula.

Existem dois conceitos que se opõe sobre a propagação no meio: um meio rico em nutrientes ou um meio pobre. Meio pobre: recomenda-se para evitar o crescimento acelerado e geração de mutantes indesejáveis. É um sinal para o metabolismo da célula reorganizar a estocagem de energia.Meio rico: é recomendado por causa da percentagem de células viáveis ser maior em relação ao meio pobre.

Atividade de água (aw)

A atividade de água afeta diretamente o crescimento de microrganismos. Fungos requerem uma atividade de água mínima de 0,70 para crescerem, sendo que esporulação é observada também em aw=0,62. As bactérias necessitam de um pouco mais de água livre para se desenvolverem, com um aw=0,82 mínimo necessário.

Tabela: Valores de atividade de água mínimos para o desenvolvimento de determinados microrganismos.

c) pH: afeta a resistência da célula

É bem conhecido que o pH do meio de cultivo influencia a propagação celular: há um pH ótimo para toda cultura e o crescimento da célula pode ser inibido se este fator não for adequado. Embora algumas células tenham o crescimento ótimo em pH 4,2, a recuperação das células após a liofilização é mínima. Já em pH 5,4, a sobrevivência aumenta para 10 a 25%.

d) Aeração durante o cultivo: afeta a resistência a conservação.Como exemplo, as espécies de Saccharomyces cerevisiae cultivadas em condições aeróbicas são mais resistentes ao choque hipo e hipertônico. A propagação anaeróbica reduz a resistência ao congelamento devido a organização estrutural da membrana citoplasmática e celular.

2) Idade da cultura: afeta a viabilidade de recuperação pós-estocagem.

Alguns pesquisadores indicam o inicio da fase estacionária de crescimento como fase ideal. Dados confirmam que os microrganismos são mais resistentes ao congelamento ou desidratação no fim do crescimento logarítmico ou no inicio da fase estacionária.

3) Condição fisiológica:

As propriedades e características internas das células podem perder ou ser influenciado pelo processo de conservação. Diferentes grupos de microrganismos apresentam diferentes resistências. As culturas produtoras de esporos possuem melhores resultados de viabilidade em todos os métodos de conservação, isto se deve pelas pequenas quantidades de água presente nos esporos, uma forma de preservação natural. Os microrganismos não esporulados não possuem a mesma eficiência. E sabe-se que os procariotos são mais resistentes que os eucariotos, bem como, as Gram positivas mais resistentes que as Gram negativas.

4) Concentração de cultura até o momento da conservação:

Com relação ao tamanho da amostra de células para estocagem, recomenda-se a concentração inicial de 108 – 1010 células/mL.

Métodos de Conservação de Microrganismos

1) Conservação a curto prazo (Repique)

Para a conservação de microrganismos por um curto período de tempo existe a técnica de repicagem contínua. Consiste na transferência de células para uma placa de Petri com meio sólido. Pode ser feito em tubos de ensaio com meio inclinado.

Período: de 30 dias a até alguns anos em alguns casos. Em média leveduras são conservadas de 1 a 3 meses e bactérias podem variar de 5 a 12 meses.

Temperatura de armazenamento: de 3 a 5ºC. De acordo com alguns pesquisadores, o aumento de temperatura acima de 5ºC pode gerar uma perda rápida da viabilidade celular. Geralmente em geladeira.

Um grande número de transferências (repiques) pode gerar mutações espontâneas e contaminação, levando a perda do microrganismo.

Repique contínuo:

Vantagens

• baixo custo,• não requer equipamentos especializados, • o manuseio é simples.

Desvantagens

• riscos de contaminação e possível perda da linhagem, • perda de características morfológicas, fisiológicas ou patogenicidade,• seleção de células atípicas (variantes ou mutantes), • supervisão especializada, • mão-de-obra,• espaço relativamente grande para a armazenamento.

2) Conservação a médio prazo

Para a conservação em médio prazo existem algumas técnicas que visam atingir a hipobiose do microrganismo. Dentre essa técnicas está a preservação em óleo mineral, em água estéril e alguns tipos de secagem.

2.1) Preservação em óleo mineral

Esse método consiste na aplicação de uma camada de óleo mineral estéril de 1 cm de altura sobre uma cultura de microrganismos em estado sólido ou líquido. O óleo também previne a desidratação do meio de cultura.

Hipobiose: ocorre devido a limitação de oxigênio disponível pela camada de óleo, causando uma diminuição no crescimento e no metabolismo. Redução em 10% do O2 consumido em poucas horas.

Os óleos devem ser viscosos e com densidade relativa de 0,8 a 0,9 (20ºC), para que não sejam mais densos que a água e parem no fundo da cultura líquida. Os mais recomendados são a parafina e a vaselina.

Temperatura de armazenamento: de 4°C a 20°CPeríodo: 1 a 7 anos para bactérias e leveduras.

Preservação em óleo mineral

Vantagens• menor custo de equipamento,• evita contaminação por ácaros.

Desvantagens• necessidade de mais transferências até que a cultura revigore,• requer espaço para armazenamento.

2.2) Conservação em água estéril – Método de Castellani

Esse método pode ser feito em água estéril ou solução salina. A solução salina é utilizada para a preservação de microrganismos sensíveis a baixas pressões osmóticas de soluções hipotônicas.

Uma suspensão de células ou um bloco de ágar (aproximadamente 5 mm x 10 mm) contendo o microrganismo é adicionado a uma solução de água estéril (10 a 15 mL) e conservado a baixas temperaturas ou temperatura ambiente.

Hipobiose: atingida pela diminuição do metabolismo e formação de estado latente da célula devido à falta de fontes nutritivas.

Temperatura de armazenamento: 12 a 24°C.Período: 1 a 2 anos.

Preservação em água estéril

Vantagens• boa taxa de viabilidade,• evita contaminação por ácaros.

Desvantagens• limitado a organismos que aderem ao ágar (Castellani),• dificuldade da retirada dos cubos na reativação (Castellani),• crescimento durante a estocagem,• requer espaço para armazenamento,• riscos de contaminação.

Geladeira ou temperatura

ambiente

2.3) Congelamento

O congelamento comum consiste na utilização de freezers comuns que atingem temperaturas de 4 a 20ºC negativos. Não há necessidade de equipamentos caros nem de preparos da amostra. A desvantagem seria a danificação de algumas células durante o congelamento.

Anabiose: atingida pela diminuição do metabolismo e formação de estado latente da célula devido à falta de fontes nutritivas.

Temperatura de armazenamento: de -4°C a -20°C.Período: de 1 a 2 anos.

Vantagem• períodos de conservação superior ao método de repique contínuo,• baixo custo.

Desvantagem• a maioria dos organismos não sobrevive em função dos danos causados pela formação de cristais de gelo e a da flutuação de eletrólitos nessa temperatura.

OBS: É importante observar que o freezer do tipo “frost-free” (livre de gelo) não deve ser utilizado, pois neles ocorrem flutuações de temperatura que destroem os microrganismos.

2.4) Secagem

A técnica consiste em uma suspensão do microrganismo que é derramada sobre um suporte sólido (areia, lama, solo, carvão ativado, grãos de trigo, esferas de vidro, grânulos gelatinosos ou sintéticos, papel-filtro). Esses suportes são bons devido a grande superfície e a capacidade de absorver parte da umidade para então serem secos à temperatura ambiente ou em aquecimento de 36-40ºC. A secagem também pode ser feita na presença de algum composto hidrofílico como a sílica-gel e o pentóxido de fósforo (P2O5).

Anabiose: atingida pela diminuição do metabolismo por dessecação e conservação em geladeira.

Temperatura de armazenamento: em torno de 4°CPeríodo: 5 anos ou mais

Secagem

Vantagens• simples e de baixo custo,• não requer equipamento especial,• ácaros não sobrevivem,• longo período de preservação,• modificações fisiológicas e morfológicas reduzidas.

Desvantagem

• método limitado a bactérias e fungos filamentosos esporulados,• dificuldade de perceber contaminações.

2.4.1) Secagem em solo estéril

Amostras de solo podem ser usadas como meio de armazenamento se tiverem sido previamente autoclavadas e dessecadas.

O solo esterilizado é seco e transferido para tubos de ensaio estéreis (aproximadamente 5 g), é realizada a inoculação de 1 mL da suspensão do organismo sendo estocada em refrigerador.

Entre os tipos de solo que têm sido utilizados para a preservação de microrganismos estão a turfa e a argila. Também se pode utilizar uma combinação de solo e areia na proporção de 1:1, atingindo-se resultados satisfatórios. São obtidos resultados mais satisfatórios quando o solo possui de 20 a 25% de capacidade de retenção de água.

2.4.2) Secagem em sílica gel

Esse método consiste em pequenos frascos de vidro com tampas metálicas que são parcialmente preenchidos com sílica-gel purificada, de malha 6-22 mesh, previamente esterilizada, seca e resfriada.

A suspensão de esporos é misturada com 5% de leite desnatado é adicionada à sílica gel em quantidade suficiente para umedecer ¾ da sílica gel dos frascos. Os frascos são então colocados por 20 minutos em banho frio, para evitar efeitos do desprendimento de calor. Após, os frascos são guardados a temperatura ambiente.

2.4.3) Secagem em tiras de papel filtro

A preservação em papel-filtro pode ser feita utilizando tiras de papel de filtro de 0,5 x 2,0 cm previamente esterilizadas. Elas são imersas em suspensão microbiana e postas a secar em ambiente fechado com ventilação forçada ou a vácuo e depois são colocados em frascos estéreis. Após podem ser colocados em geladeira.

3) Conservação a longo prazo

Os métodos de conservação a longo prazo são bastante utilizados em laboratórios que possuem os equipamentos necessários e principalmente nos centros de preservação de culturas. Dentre essas técnicas de preservação estão a liofilização, o congelamento em ultrafreezers e a criopreservação em nitrogênio líquido.

3.1) Liofilização (secagem)

Consiste na dissecação sob vácuo do material congelado através da sublimação. Usualmente, os esporos ou células são suspensos em um colóide que pode ser leite desnatado (10 – 20%), soro bovino, ou solução de lactose, glicose ou sacarose 1%.

O material líquido é congelado em ampolas e então conectado em uma bomba a vácuo acoplada a um sistema coletor de vapores da água. Após a liofilização as ampolas são guardadas a temperatura ambiente ou em refrigerador de 4 a -6ºC.

Anabiose: atingida pela diminuição do metabolismo e formação de estado latente da célula devido à falta de água (removida por sublimação).

Temperatura de armazenamento: ambiente ou refrigerador.Período: 17 a 20 anos.

3 mL

Skim Milk

Cultura pura 0,2 mL

na ampola

Maçarico

Liofilizador

Maçarico

Liofilização em ampolasAmpola estrangulada:

Vantagens:- Maior durabilidade- Menor espaço p/estocagem- Menor custo

Desvantagens:- Dois ciclos de liofilização- Menor resistência a impactos- Menor durabilidade

Liofilização em ampolasFrasco-ampola:

Vantagens:- Apenas um ciclo para liofilização- Menor tempo de liofilização- Maior resistência a impactos

Desvantagens:- Menor durabilidade- Maior custo- Necessidade de equipamento p/fechamento das ampolas

Liofilização

Vantagens• vedação total da amostra,• longa viabilidade,• estabilidade elevada em muitas espécies,• produção em larga escala,• não requer armazenamento especial (somente ao abrigo da luz),• fácil distribuição e transporte.

Desvantagens• muitas espécies não sobrevivem ao processo,• viabilidade ocasionalmente insatisfatória,• mão-de-obra especializada, • requer equipamentos sofisticado.

3.2) Congelamento em ultrafreezer

A cultura deve ser primeiramente cultivada até a metade ou final da fase logarítmica. Após, centrifuga-se o meio de cultivo para recuperar as células. As células precipitadas são ressuspendidas em solução de criopreservante (como glicerol 10% v/v) e estocadas em vials criogênicos ou ampolas. O material é então congelado até -80ºC, numa taxa de resfriamento de 1 a 2ºC por minuto.

Anabiose: atingida pela indução a dormência celular.

Temperatura de armazenamento: -60 a -80°C.Período: 10 a 20 anos

3.3) Congelamento em nitrogênio líquido

O processo consiste na coleta dos microrganismos das culturas em ágar através da adição de crioprotetor (glicerol a 10% v/v) e raspando delicadamente da superfície das culturas. Então se pipeta 5 mL da suspensão para ampolas de vidro esterilizadas e resfria-se a amostra lentamente na razão de 1ºC por minuto até -20º C ou -30ºC através de um freezer comum. Após, é feita uma rápida transferência para o congelador de nitrogênio líquido para resfriar a amostra rapidamente até -196ºC.

Anabiose: atingida pela indução a dormência celular.

Temperatura de armazenamento: -196°CPeríodo: 10 a 20 anos

Congelamento em nitrogênio líquido

Vantagens• condições estáveis por longos períodos,• vedação completa, evitando contaminação,• utilização para esporulados e não esporulados.

Desvantagens• viabilidade ocasionalmente insatisfatória,• requer equipamento sofisticado,• suprimento contínuo de N2,

• boa infra-estrutura – caso de acidentes de vazamento.

Retirada do material mantido em “canisters” (canecas), dentro do botijãode nitrogênio liquido.

Crioprotetores

São aditivos usados durante a conservação de microrganismos a baixas temperaturas.

Reduzem os danos durante o congelamento e descongelamento, Conferem estabilidade ao microrganismo contra os efeitos adversos da estocagem, Aumentam a taxa de sobrevivência das células durante o procedimento.

Características dos crioprotetores:

• não seja tóxico,• seja hidrofílico,• não seja reativo com a água facilmente, • previna a hiperconcentração na suspensão,• estabilize as pontes de hidrogênio nos cristais,• previna a formação de cristais grandes, • tenha boa penetração celular (somente para crioprotetores endocelulares).

HUBÁLEK, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology, New York, v. 46, p. 205-229,2003.

• leite desnatado (skim milk) 10%• leite desnatado 10% + inositol 5%• sacarose 7% + peptona 7% • inositol 5% em soro de sangue de cavalo

Exemplos de substâncias utilizadas como crioprotetores

Classificação dos Crioprotetores

Podem ser classificados dependendo do seu grau de penetração na célula:

a) Rápida penetração (geralmente levando cerca de 30 minutos): o metanol, o etileno glicol, o propileno glicol, dimetil formaldeído, metilacetamida e DMSO;

b) Lenta penetração: o glicerol; c) Impenetráveis ou não permeáveis: mono, oligo e polissacarídeos, o

manitol, o sorbitol, a metilcelulose, e o polietileno glicol, que causam crioperservação extracelular quando presentes na concentração de 10-40%.

A permeabilidade desses compostos pela membrana plasmática depende da temperatura e do tipo de célula.

A permeabilidade do criopreservante afeta o mecanismo pelo qual a proteção ocorre. Deste modo outra classificação pode ser realizada:

a) Crioprotetor que penetra parede e membrana celular: DMSO, Glicerol.Deixam a membrana celular mais plástica. Se ligam à água intracelular prevenindo excessiva desidratação, reduzindo a toxicidade de sais, diminuindo o estresse hiperosmótico, e prevenindo a formação de grandes cristais de gelo. Isso acontece devido à formação de uma estrutura cristalina de gelo fina.

b) Crioprotetor que penetra parede mas não a membrana celular (semipermeáveis): mono e dissacarídeos, aminoácidos e polímeros de baixo peso molecular.Induzem uma desidratação parcial antes do congelamento e previnem danos à membrana através da formação de uma camada “almofadada” ao redor dela. Isso evita a ruptura mecânica da membrana pelos cristais de gelo.

c) Crioprotetor que não penetram (não permeáveis): polímeros de alto peso molecular, proteínas e polissacarídeos. Adsorvem a célula do microrganismo formando uma camada mais viscosa, causando a saída parcial de água da célula, e mantendo os cristais em uma estrutura amorfa nas proximidades da célula devido à viscosidade. A adsorção ocorre sem haver interações diretas com a membrana.

Controle de qualidade da preservação Contagem de população viável antes e após preservação

Determinar a taxa de mortalidade do microrganismo específico no protocolo utilizado Aplicável a métodos de médio e longo prazo Imprescindível para garantia de preservação de longo prazo

Pureza

Logo após o processamento do lote

Viabilidade

primeira: até um mês após o processamento segunda: anualmente 0,1 mL0,1 mL0,1 mL0,1 mL

(10-8)(10-6) (10-4)(10-2)9,9 mL água

10-2 10-4

10-8 10-6no de células mL-1 inoculados na ampola = (no de colônias em 0,1 mL = 3 gotas) x 10 x (fator de diluição) UFC/mL

Suspensão de células em crioprotetor

10-3 10-4 10-5

Revitalização dos microrganismos conservados

Os requerimentos para a restauração das culturas após a conservação dependerão do método utilizado e do tipo de microrganismo, sendo que se deve realizar testes para determinar qual o método de revitalização da cepa é mais adequado. No entanto, alguns fatores são comuns às várias culturas.

Deve-se ressuspender a amostra no meio de cultura utilizado no crescimento. A concentração celular do material preservado dependerá da taxa de sobrevivência das células ao processo. A utilização da concentração inadequada de células para a recuperação pode gerar um grande crescimento e excessivo número de gerações de células, aumentando a probabilidade de ocorrência de uma mutação. A adição de água destilada em amostras liofilizadas ou secas em solo para rehidratação pode resultar na destruição de grande parte das células devido ao grande choque osmótico. Deve-se usar o meio de cultivo ou soluções isotônicas para evitar esse problema. Deve-se verificar, após a recuperação da amostra, a pureza da cultura. Geralmente amostras que serão utilizadas em um processo industrial são testadas em pequenos frascos para verificação desse possível problema.