RENATA PROENÇA FERREIRA

INVESTIGAÇÃO DE ADESÃO PLAQUETÁRIA NA

ANEMIA FALCIFORME E O PAPEL DOS

NUCLEOTÍDEOS CÍCLICOS NESTA ADESÃO

CAMPINAS

2009

RENATA PROENÇA FERREIRA

INVESTIGAÇÃO DE ADESÃO PLAQUETÁRIA NA

ANEMIA FALCIFORME E O PAPEL DOS

NUCLEOTÍDEOS CÍCLICOS NESTA ADESÃO

Dissertação de Mestrado apresentada à Pós-

Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas para obtenção do

título de Mestre em Clínica Médica, área de

concentração em Ciências Básicas.

Orientadora: Dra. Nicola Amanda Conran Zorzetto

Co-Orientador: Prof. Dr. Fernando Ferreira Costa

CAMPINAS

2009

iii

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS DA UNICAMP

Bibliotecário: Sandra Lúcia Pereira – CRB-8ª / 6044

Ferreira, Renata Proença F413i “Investigação de adesão plaquetária na anemia falciforme e o papel

dos nucleotídeos cíclicos nesta adesão” / Renata Proença Ferreira. Campinas, SP : [s.n.], 2009.

Orientadores : Nicola Amanda Conran Zorzetto, Fernando Ferreira

Costa Dissertação ( Mestrado ) Universidade Estadual de Campinas.

Faculdade de Ciências Médicas. 1. Plaquetas (Sangue). 2. Anemia falciforme. 3. Citometria

de fluxo. I. Zorzetto, Nicola Amanda Conran. II. Costa, Fernando Ferreira. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.

Título em inglês : “Investigation of platelet adhesion in sickle cell disease and the role of cyclic nucleotides in this adhesion” Keywords: • Platelets (blood) • Sickle cell disease • Flow cytometry Titulação: Mestre em Clínica Médica Área de concentração: Ciências Básicas Banca examinadora: Profª. Drª. Nicola Amanda Conran Zorzetto Profº. Drº. Joyce Maria Annicchino-Bizzacchi Profª. Drª. Maria Stella Figueiredo Data da defesa: 28-08-2009

iv

v

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer à Dra. Nicola por me aceitar como sua aluna, sua experiência

e profissionalismo contribuíram para a minha formação, tanto profissional como pessoal.

Ela é uma pessoa muito humana e generosa, que nunca mediu esforços para conseguir

recursos e apoio nas horas que mais precisei. Tenho muito que agradecê-la. Meus

agradecimentos ao prof. Dr. Fernando que me recebeu em seu laboratório como estagiária,

e a toda equipe de alunos que apostaram e acreditaram no meu trabalho. À Flávia Pinho,

pois ela foi a primeira pessoa que tive contato no laboratório e que se tornou uma grande

amiga. Obrigada por tudo! À Carol e à Dri que me ensinaram como trabalhar numa sala de

cultura, pois a cultura de células foi o meu primeiro aprendizado no laboratório, muito

obrigada! À Dul que sempre me ajudou com os documentos para que eu conseguisse

transporte e bolsa de estudos, sempre muito prestativa para minha permanência no

laboratório. Muito obrigada! À minha grande amiga Ana Flávia, pois há muitos anos nossos

caminhos estão se cruzando. É com grande prazer que declaro o meu amor por essa amiga

que sempre esteve ao meu lado nas horas mais felizes e mais tristes da minha vida. Muito

obrigada, Ana! Também gostaria de agradecer às funcionárias Lena e Simone que sempre

trouxeram alegria e quitutes maravilhosos ao laboratório! Obrigada! Muito obrigada à

Camila, Lediana, Andréia, Sheley, Venina, Flávia, Flávia Boca, Vanessa, Renatinha,

Juliana, Regiane, Fernanda, Diana, Emília, Ucha, Tatiana, Carlinha, Marcos André,

Gabriela, Daniela, Denise e Anderson, que, direta ou indiretamente, me apoiaram.

Agradeço à minha família pela paciência e apoio, em especial ao meu noivo, pais e irmãos,

vocês foram imprescindíveis. Amo todos vocês.

vii

RESUMO

Anemia falciforme (AF) é uma doença causada por uma mutação de ponto, que

resulta na formação de hemoglobina S (HbS). A polimerização de HbS desoxigenada

resulta na deformação, enrijecimento e fragilização das células vermelhas, anemia

hemolítica e eventos vasos-oclusivos, principal causa de morbidade nos pacientes com AF.

A adesão anormal das células brancas e vermelhas ao endotélio diminui o fluxo de sangue

na circulação micro-vascular, principal fator envolvido na vaso-oclusão. O objetivo deste

trabalho foi comparar as propriedades adesivas de plaquetas de indivíduos sadios (AA) com

as plaquetas de pacientes com AF (SS) e em terapia com hidroxiuréia (HU), e quais

moléculas de adesão e sinalização estão envolvidas nesta adesão. A adesão basal de

plaquetas ao fibrinogênio (FB) do grupo de pacientes SS foi significativamente maior em

relação às plaquetas AA, entretanto, as plaquetas de pacientes SSHU mostraram uma

adesão similar às plaquetas AA. As plaquetas AA, SS e SSHU quando estimuladas com

trombina (TB), apresentaram uma adesão significativamente maior em relação às suas

adesões basais. Por outro lado, não houve diferenças significativas entre as adesões basais

das plaquetas AA, SS e SSHU ao colágeno como ligante. A citometria de fluxo foi utilizada

para comparar a expressão e ativação das principais moléculas de adesão nestas plaquetas, e

identificou-se um aumento de expressão da integrina αIIbß3 na sua conformação de ativação,

na superfície das plaquetas SS, em relação às plaquetas AA e SSHU. A molécula P-

selectina (CD62P) foi encontrada com maior expressão também na superfície das plaquetas

SS. Ensaios de adesão utilizando anticorpos específicos para as moléculas de adesão

indicaram um possível papel para a integrina αIIbß3 na adesão de plaquetas ao FB. O AMPc

é um importante inibidor de ativação plaquetária, e os níveis intraplaquetários de adenosina

manofosfato cíclica (AMPc) das plaquetas SS foram significativamente menores em

relação às plaquetas AA e SSHU. A co-incubação das plaquetas com TB reduziu

significativamente os níveis de AMPc nas plaquetas AA, e SSHU, e nas plaquetas SS essa

redução não foi significativa. Além disso, foi interessante notar que os níveis de

hemoglobina fetal (HbF) em pacientes SS e SSHU apresentaram uma significativa

correlação com os níveis de AMPc. Em relação aos níveis intraplaquetários de guanosina

monofosfato cíclica (GMPc), importante inibidor de agregação plaquetária, das plaquetas

ix

AA, SS e SSHU não houve diferenças estatisticamente significativas, entretanto

com estímulo de trombina houve um aumento significativo de GMPc nas plaquetas AA. A

incubação das plaquetas com o cilostazol (inibidor específico da fosfodiesterase 3A,

PDE3A) levou a uma redução da adesão de plaquetas SS, e sugere-se que as plaquetas SS

possuem a atividade de fosforilação da PDE3A aumentada, e esteja relacionada com a

degradação de AMPc nessas plaquetas. Além disso, dados indicam que as vias de

sinalização dependentes de PKA, PKG e PKC não estão envolvidas na adesão alterada das

plaquetas SS. A atividade funcional nos ensaios com agregação plaquetária de pacientes

com AF está alterada, mas será necessário que novos experimentos sejam realizados para

maiores conclusões. Os resultados sugerem que as plaquetas de pacientes AF circulam num

estado ativado e que elas possuem maior capacidade de aderirem às proteínas que podem

ser encontradas na matriz extracelular (MEC) e na superfície da parede vascular. Esta

adesão aumentada está associada com os níveis diminuídos de AMPc intraplaquetários e

ativação da integrina αIIbß3. Estas mesmas alterações parecem ser revertidas nos pacientes

em uso de HU. Resultados sugerem que as plaquetas podem ter um papel importante no

processo de vaso-oclusão. Quando estão ativadas, estas plaquetas servem como fonte

importante para mediadores inflamatórios que, por sua vez, podem levar à exacerbação da

inflamação e ativação celular no local.

xi

ABSTRACT

Sickle cell disease (SCD) is caused by a point mutation that results in the formation

of Hemoglobin S (HbS). The polymerization of deoxygenated HbS causes deformation of

red cells, which then adopt a sickle shape and become rigid and fragile. Hemolytic anemia

and vaso-occlusive events are the main cause of morbidity in SCD; abnormal adhesion of

white and red cells to the endothelium decreases the blood flow in the microcirculation and

appears to be the main factor involved in vaso-occlusion. The objective of this study was to

compare the adhesive properties of platelets from healthy individuals (AA platelets) with

those of platelets from SCD patients (SS platelets) and from patients on HU therapy (SSHU

platelets), as well as the adhesion molecules and signaling pathways that may be involved

in this adhesion. The basal adhesion of SS platelets to fibrinogen (FB) was significantly

higher than that of AA platelets; in contrast, SSHU platelets demonstrated a similar

adhesion to that of AA platelets. Platelets from AA, SS and SSHU individuals, when

stimulated with thrombin (TB), all presented significantly higher adhesions when compared

with their basal adhesions. In contrast, there were no significant differences between the

adhesions of AA, SS and SSHU platelets when collagen was used as a ligand. Flow

cytometry was utilized to compare the expression and activation of the main adhesion

molecules on AA, SS and SSHU platelets and identified a significantly higher expression of

the αIIbβ3 integrin in its activated conformation on the surface of the SS platelets, in relation

to the AA and SSHU. Expression of the P-selectin adhesion molecule (CD62P) was also

found to be increased on the surface of SSHU platelets. Adhesion assays utilizing specific

antibodies for the activated αIIbβ3 and P-selectin indicated a possible role for the αIIbβ3

integrin in the adhesion of platelets to FB. The cyclic nucleotide, cyclic adenosine

monophosphate (cAMP) is an important inhibitor of platelet aggregation. Intraplatelet

levels of cAMP were found to be significantly lower in SS platelets compared to AA and

SSHU platelets. Co-incubation of platelets with TB significantly reduced levels of cAMP in

the AA and SSHU platelets, but in SS platelets this decrease was not significant.

Interestingly, levels of fetal hemoglobin (HbF) in SCD patients (both SS and SSHU) were

found to correlate significantly with levels of platelet AMPc. With regard to intraplatelet

levels of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), there were no significant differences

xiii

found between AA, SS and SSHU platelets, however following a TB stimulus AA platelets

demonstrated a significant increase in intracellular cGMP. Phosphodiesterase 3A (PDE3A)

is the main cyclic nucleotide hydrolyzing enzyme in platelets. Incubation of SS platelets,

but not AA or SSHU platelets, with cilostazol (specific inhibitor of PDE3A) resulted in a

significant reduction in their adhesion to FB, suggesting that PDE3A activity in SS platelets

may be activated and that augmentation of cAMP is capable of reverting increased SS

platelet adhesion. Additional experiments indicate that Protein kinase A (PKA), PKG and

PKC dependent signaling pathways are not involved in the altered adhesion of SS platelets.

The functional activity of SS platelets was found to be altered in platelet aggregation

assays, however further experiments are required to draw conclusions from these data.

Results of this study suggest that platelets from SCD individuals circulate in an activated

state and that they present a greater ability to adhere to proteins that may be encountered on

the vessel wall. This augmented adhesion is associated with decreased levels of intraplatelet

cAMP and activation of the αIIbβ3 integrin. These alterations appear to be reversed in

patients on HU therapy. Results suggest that platelets may have an important role in the

vaso-occlusive process.When activated these cells are an important source of inflammatory

mediators that may, in turn, result in an exacerbation of cellular activation at the vaso-

occlusive site.

xv

LISTA DE ABREVIATURAS

AA – plaquetas de controles

AC – adenilato ciclase

ADP – adenosina difosfato

AF – anemia falciforme

AKT – serina/treonina quinase

AMPc – adenosina monofosfato cíclico

ATP – adenosina trifosfato

CEP – comitê de ética e pesquisa

Col – colágeno

CV – células vermelhas

FB – fibrinogênio

GC – guanilato ciclase

GMPc – guanosina monofosfato cíclico

GTP – guanosina trifosfato

HbF – hemoglobina fetal

HbS – hemoglobina S

HU – hidroxiuréia

IL-6 – interleucina 6

IL-8 – interleucina 8

MEC – matriz extracelular

NO – óxido nítrico

PAR-1 – receptor 1 de ativação de protease

PDE – fosfodiesterase

PGE1 – prostaglandina 1

PGE2 – prostaglandina 2

PI3K – fosfatidil-inositol-3-quinase

PKA – proteína quinase A

PKC - proteína quinase C

PKG - proteína quinase G

xvii

PSGL-1 – ligante 1 para a glicoproteína p-selectina

RANTES – quimiocina secretada e expressa por células T normais

ROS – espécies reativas ao oxigênio

SS – plaquetas de pacientes

SSHU – plaquetas de pacientes com HU

TA – temperatura ambiente

TB – trombina

TCLE – termo de consentimento livre e esclarecido

TNF-α - fator de necrose tumoral α

vWF – fator de von Willebrant

xix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Aspectos clínicos dos controles AA, pacientes SS e pacientes SSHU que

participaram deste estudo. .................................................................................................... 66 

Tabela 2: Expressão das moléculas de adesão na superfície das plaquetas dos

controles (AA), pacientes (SS) e pacientes em terapia com hidroxiuréia (SSHU). ............. 73 

xxi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Fisiopatologia da Anemia Falciforme (Adaptado do: Steinberg; Trends

Pharm Sci, 2006). A síntese de hemoglobina S é resultado de uma mutação de

ponto, que quando desoxigenada forma polímeros no interior das hemácias,

deformando-a e tornando-a rígida as (formato de foice). As hemácias, neutrófilos e

reticulócitos participam do processo de vaso-oclusão, além da hemólise

intravascular de hemácias, são eventos que caracterizam a anemia falciforme. .................. 39 

Figura 2: Esquema das moléculas de adesão de plaquetas e seus respectivos

anticorpos como ligantes. GPIb/IX/V (CD42b/CD42a) presente em plaquetas; a

integrina α2β1 (GPIa/IIa; CD49b/CD29), ligante para o colágeno; a integrina αIIbß3

(GPIIb/IIIa; CD41a/CD61), ligante para o fibrinogênio e a molécula de adesão P-

selectina. ............................................................................................................................... 43 

Figura 3: Adesão plaqueta/endotélio. Superfície do endotélio ativado expressa a P-

selectina. Os receptores de superfície de plaqueta GPIbα e PSGL-1 interagem com

a P-selectina endotelial e mediam o rolamento de plaquetas. Adesão firme é

mediada pelas integrinas αvβ3 e αIIbβ3 .(Adaptado do: J. Clin. Invest. Meinrad

Gawaz, et al., 2005). ............................................................................................................. 43 

Figura 4: Regulação dos níveis intraplaquetários de AMPc via trombina. A

trombina (TB) regula os níveis de AMPc impedindo a síntese de ATP, e

consequentemente, acelerando a degradação do AMPc para 5’AMP via PDE3A. A

TB liga-se ao receptor de ativação plaquetária 1 (PAR-1), e a adenilato ciclase

(AC) é inibida através do acoplamento direto de PAR-1 à Gi, ou indiretamente pela

liberação de ADP. O ADP liga-se ao receptor P2Y, o qual se acopla à proteína Gi2, que inibe a AC e diminui o AMPc. Os efeitos da TB em diminuir o AMPc são

sinérgicos, porque TB bloqueia a formação de AMPc através da inibição da AC

via PDE3A. A outra via é pela fosforilação/ativação da via AKT/PI3K, onde AKT

pode diretamente ativar a PDE3A, proporcionando um mecanismo adicional que

regula o AMPc (adaptado do: HEMOSTASIS, THROMBOSIS, AND

VASCULAR BIOLOGY. Zhang e Colman, 2007). ............................................................. 46

xxiii

 Figura 5: Esquema do ensaio de ELISA para AMPc, de acordo com o fabricante

(Amershan Biosciense). ........................................................................................................ 61 

xxv

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1: Adesão basal das plaquetas de indivíduos controles (AA), pacientes AF

(SS) e pacientes AF em terapia com HU (SSHU), 37ºC, 15 min. (A) adesão basal

das plaquetas ao FB (50 µg/ml), *p

 Gráfico 7: Adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao FB, na presença ou ausência

do inibidor específico de PDE3A (cilostazol), DMSO e estimulada com TB. (A)

ensaio de adesão ao FB (50 µg/ml) basal, DMSO(0.001 % v/v) e cilostazol (1.6

µM); e com TB (50 mU/ml, 15 min, 37°C) com plaquetas AA; (B) plaquetas SS;

(C) plaquetas SSHU; *p

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS ......................................................................................................... vii

RESUMO .............................................................................................................................. ix

ABSTRACT ........................................................................................................................ xiii

LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................... xvii

LISTA DE TABELAS ........................................................................................................ xxi

LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................... xxiii

LISTA DE GRÁFICOS .................................................................................................... xxvii

SUMÁRIO ......................................................................................................................... xxxi

1 – INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 37

1.1- Processo de vaso-oclusão na anemia falciforme ....................................................... 37

1.2- Hemoglobina Fetal .................................................................................................... 38

1.3- Hidroxiuréia .............................................................................................................. 38

1.4- Anemia falciforme como uma doença inflamatória crônica ..................................... 39

1.5- Plaquetas ................................................................................................................... 40

1.6- Adesão das plaquetas ao endotélio ............................................................................ 41

1.7- Nucleotídeos cíclicos e adesão plaquetária ............................................................... 44

2 – OBJETIVOS ................................................................................................................... 49

2.1- Objetivos Gerais ........................................................................................................ 49

2.2- Objetivos Específicos ................................................................................................ 49

3- CASUÍSTICA E ASPECTOS ÉTICOS ........................................................................... 53

3.1- Aspectos éticos da pesquisa ...................................................................................... 53

4- METODOLOGIA ............................................................................................................ 57

4.1- Separação de Plaquetas ............................................................................................. 57

4.2- Ensaio de Adesão Estático ........................................................................................ 57

4.3- Uso de drogas e/ou anticorpos em ensaios de adesão ............................................... 58

4.4- Citometria de Fluxo ................................................................................................... 59

4.5- Extração e mensuração dos Nucleotídeos Cíclicos (AMPc e GMPc) ....................... 60

4.6- Ensaio de Agregação Plaquetária .............................................................................. 61

xxxi

4.7- Análise Estatística ..................................................................................................... 62

5 – RESULTADOS .............................................................................................................. 65

5.1- Aspectos clínicos dos indivíduos controles e pacientes que participaram do

estudo ................................................................................................................................ 65

5.2- Adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao FB in vitro. .............................................. 67

5.3- Adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao Col in vitro............................................... 67

5.4- Trombina induz um aumento na adesão de plaquetas ao FB e ao Col. ..................... 67

5.5- Avaliação da expressão e função de moléculas de adesão na superfície de

plaquetas AA SS SSHU, utilizando a técnica de citometria de fluxo. ............................. 70

5.6- Efeitos dos anticorpos anti-moléculas de adesão na adesão de plaquetas ao

FB ..................................................................................................................................... 71

5.7- Níveis intraplaquetários de AMPc em plaquetas AA, SS e SSHU ........................... 71

5.8- Efeito da trombina nos níveis intraplaquetários de AMPc em plaquetas

AA, SS e SSHU ................................................................................................................ 72

5.9- Correlação dos níveis de HbF em pacientes SS e SSHU com os níveis

intraplaquetários de AMPc ............................................................................................... 76

5.10- Níveis intraplaquetários de GMPc em plaquetas AA, SS e SSHU ......................... 76

5.11- Efeito do inibidor da PDE3A, cilostazol, na adesão de plaquetas AA, SS e

SSHU ao FB ..................................................................................................................... 76

5.12- Efeito dos inibidores das proteínas quinases PKA, PKG e PKC na adesão

de plaquetas AA, SS e SSHU ........................................................................................... 80

5.13- Agregação plaquetária e padronizações necessárias ............................................... 82

5.14- Comparação da agregação das plaquetas AA, SS e SSHU com os

agonistas plaquetário ADP, Col e TB ............................................................................... 84

6 – DISCUSSÃO .................................................................................................................. 89

7 – CONCLUSÃO ................................................................................................................ 97

8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 101

9 – APÊNDICES ................................................................................................................ 111

9.1- Artigo submetido em 25 de agosto de 2009 – HAEMATOLOGICA ..................... 111

xxxiii

Introdução

1 – INTRODUÇÃO

A anemia falciforme é conseqüência de uma mutação de ponto envolvendo a troca

do ácido glutâmico pela valina, na sexta posição da cadeia polipeptídica da β-globina e que

resulta na síntese de uma hemoglobina anômala, a hemoglobina S (HbS) (STUART e

NAGEL, 2004). A HbS quando desoxigenada forma polímeros e causa deformação,

enrijecimento e fragilização das células vermelhas, quando essas atravessam a

microvasculatura. Além disso, a hemólise intravascular que resulta em anemia, eventos

vasos-oclusivos, causa um aumento na susceptibilidade à infecção (FIGURA 1), que

caracterizam a AF. Vários fatores contribuem para a vaso-oclusão, principal causa de

morbidade em pacientes com AF. A adesão anormal das células brancas e vermelhas ao

endotélio desencadeia uma diminuição do fluxo de sangue na microcirculação, e é um dos

principais fatores envolvidos na vaso-oclusão (FADLON et al., 1998; ROSSE et al., 2000).

1.1- Processo de vaso-oclusão na anemia falciforme

A vaso-oclusão é um processo que envolve várias etapas. Eventos vasos-oclusivos

são iniciados pela adesão anormal de células vermelhas e brancas ao endotélio vascular e

interações heterogêneas. Essas interações podem ser mediadas, principalmente, pela

ativação das vias de sinalização dessas células e pelo aumento da atividade e expressão das

moléculas de adesão na superfície das células endoteliais, vermelhas e leucócitos

(HILLERY et al., 2000; STUART e NAGEL, 2004; ASSIS et al., 2005; GAMBERO et al.,

2007; CANALLI et al., 2008). Em paralelo à adesão das células vermelhas e leucócitos ao

endotélio, a hemostase catiônica anormal das hemácias ocasiona desidratação e a formação

de hemácias irreversivelmente falcizadas. O tônus vasomotor anormal favorece a

vasoconstrição, devido à diminuição da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) e

endotelina-1. Estes acontecimentos levam ao prolongamento do tempo de trânsito do

eritrócito na microvasculatura e, consequentemente, à polimerização da HbS devido à

desoxigenação das hemácias e o eventual bloqueio do vaso. O aumento da concentração

intracelular de HbS, a diminuição do pH sanguíneo, a liberação de espécies reativas ao

oxigênio (ROS), e a ativação da cascata de coagulação com geração secundária de

trombina, também contribuem para o processo de vaso-oclusão (HEAD et al., 1997)). O

NO é um gás solúvel com meia vida de alguns segundos, tornou-se uma substância de

Introdução 37

grande interesse devido principalmente aos seus efeitos benéficos na manutenção do tônus

muscular e prevenção da agregação plaquetária (através do aumento do GMPc e diminuição

do Ca2+ intraplaquetário) (NATHAN, 1992).

1.2- Hemoglobina Fetal

O aumento significativo dos níveis de hemoglobina fetal (HbF) nas células

vermelhas (CV) normalmente proporciona uma melhora clínica para os pacientes com AF,

pois existem pacientes que apresentam níveis aumentados de HbF (ROSSE et al., 2000). A

hemoglobina fetal é uma molécula formada pela combinação de 2 cadeias α-globínicas e 2

cadeias γ-globínicas, substituindo as cadeias β-globínicas. Esta combinação inibe a

polimerização da hemoglobina e, conseqüentemente, a falcização das CV, reduzindo os

sintomas da AF (SERJEANT & SERJEANT, 2001). A cadeia γ-globínica é produzida em

altos níveis em células eritróides durante a fase embrionária, porém, após o nascimento

ocorre o “switching” (ou seja, a produção predominante passa a ser de cadeias β-

globínicas). Sendo assim, são necessários novos estudos com drogas capazes de reverter

esse efeito “gene switching”, por terapia gênica, para aumentar os níveis de HbF nas CV

reduzindo os sintomas da doença.

1.3- Hidroxiuréia

A hidroxiuréia (HU) promove a produção de HbF indiretamente (ROSSE et al.,

2000) e é a única droga disponível no momento, clinicamente comprovada, que diminui a

frequência de crises de vaso-oclusão e a necessidade de transfusões sanguíneas

(CHARECHE et al., 1995). Postula-se que a HU previne a formação da ribonucleotidase,

inibindo a síntese de DNA e, consequentemente, aumenta a produção de HbF (ROSSE et

al., 2000). Porém, alguns estudos têm mostrado que a HU pode exercer seu efeito através

de outros mecanismos. Um desses mecanismos seria o aumento da produção de NO através

da L-arginina (MORRIS et al., 2001). Gladwin e colaboradores (2002) demonstraram que a

terapia com HU promove a formação intracelular e intraeritrocítica de NO e sugerem que é

esse aumento de NO que eleva os níveis de HbF. Produtos da reação de oxidação do NO

(nitrato, nitrito e hemoglobina nitrosilada) foram medidos em alguns pacientes e os níveis

obtidos encontraram-se bastante elevados após a ingestão de HU (COKIC et al., 2003),

Introdução 38

levando a acreditar que alguns dos efeitos e benefícios da HU possam ser mediados pela

liberação intravascular de NO.

Vaso-oclusão

Hemólise intravascular

Figura 1: Fisiopatologia da Anemia Falciforme (Adaptado do: Steinberg; Trends

Pharm Sci, 2006). A síntese de hemoglobina S é resultado de uma mutação de ponto, que

quando desoxigenada forma polímeros no interior das hemácias, deformando-a e tornando-

a rígida as (formato de foice). As hemácias, neutrófilos e reticulócitos participam do

processo de vaso-oclusão, além da hemólise intravascular de hemácias, são eventos que

caracterizam a anemia falciforme.

1.4- Anemia falciforme como uma doença inflamatória crônica

Atualmente, pesquisadores possuem uma visão mais holística da anemia falciforme.

A obstrução e lesão do endotélio e dos tecidos desencadeiam uma resposta inflamatória

que, por sua vez, leva a um estado inflamatório crônico em pacientes com AF,

caracterizado por alterações significativas no repertório de citocinas inflamatórias e fatores

de crescimento. Tais citocinas, como a interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), fator-α

de necrose tumoral (TNF- α) e o fator estimulador de colônia de macrófago-granulócito

Introdução 39

(GM-CSF) são encontrados em níveis elevados nos pacientes com AF (DUITS et al., 1996;

CROIZAT, et al., 1999; CONRAN et al., 2004; LANARO et al., 2008). Níveis aumentados

dessas citocinas geram enormes consequências para a fisiopatologia da doença, como por

exemplo, a ativação dos leucócitos e mudança na produção e migração das células brancas

da medula óssea (PLATT, 2000).

Em condições fisiológicas normais, enzimas antioxidantes (NADPH oxidase e

xantina oxidase) e a formação ROS são resultados de uma atividade basal sem causar lesão

tecidual. Na AF, devido à resposta inflamatória associada à disfunção/ativação endotelial e,

consequentemente, ativação de células vermelhas, leucócitos e plaquetas, há um aumento

do stress oxidativo que contribuiu para a formação de espécies reativas ao oxigênio (ROS),

(WOOD e GRANGER, 2007).

1.5- Plaquetas

As plaquetas são produzidas por um processo de proliferação e diferenciação celular

dos megacariócitos, que ocorre durante a Megacariocitopoese no interior da medula óssea

(LOURENÇO et al., 2001). São pequenos fragmentos discóides que têm cerca de 2 µm de

diâmetro, anucleados, originárias do citoplasma dos megacariócitos que circulam na

corrente sangüínea (RUGGERI, 2002). Na sua membrana plasmática localizam-se

receptores como complexos de glicoproteínas, da família das integrinas, com domínios

extracelulares, transmembrana e citoplasmático que permitem a sua ativação para o meio

intraplaquetário durante a agregação, com a mudança da sua forma discóide para projeções

da membrana plasmática e liberação do conteúdo dos grânulos intraplaquetários. Existem 2

tipos de grânulos no interior das plaquetas: os grânulos alfa que contêm fibrinogênio,

fibronectina, fatores V e VIII e fatores de crescimento (fator de crescimento derivado de

plaquetas, PDGF, e o fator β transformador do crescimento, TGF-β); e os corpúsculos

eletro densos ou grânulos densos, que armazenam adenosina difosfato (ADP), adenosina

trifosfato (ATP), cálcio ionizado, histamina, serotonina e adrenalina (ROBBINS et al.,

1996). A ativação plaquetária (receptores de membrana) é um processo fisiológico

fundamental para a manutenção da função hemostática plaquetária (KULKARNI, 2000).

Em condições normais, cerca de 1012 plaquetas percorrem um fluxo de 1000 m2 na

superfície do endotélio sem aderência ou agregação. Quando ocorre uma desestabilização

Introdução 40

da integridade desse fluxo sanguíneo (lesão tecidual), as plaquetas são ativadas através dos

seus receptores de membrana (moléculas de adesão) que promovem a adesão às células

endoteliais, através das integrinas e das selectinas, e também pelas proteínas adesivas do

fator de von Willebrand (vFW) que é secretado pelas células endoteliais, e pelo

fibrinogênio encontrado no plasma sanguíneo e na matriz extracelular (MEC). As plaquetas

desempenham um importante papel na patogênese dos eventos vasculares agudos, como no

infarto do miocárdio e no acidente vascular cerebral (AVC). Quando as plaquetas estão

ativadas, a adesão ao endotélio pode ocorrer além da agregação, como nas tromboses

(LEVI, 2005). O aumento da ativação plaquetária em pacientes AF já foi investigado

(WUN et al., 1998 e 1999; TOMER et al., 2001). Pesquisadores evidenciaram que alguns

fatores estejam correlacionados com esta ativação, como: o aumento dos níveis de ß-

tromboglobulina no plasma sanguíneo (MEHTA, 1980; ADAMIDES et al., 1990),

diminuição na secreção de ADP/ATP (BUERLING-HARBURY et al., 1989) e eliminação

de tromboxano A2 pela urina (KURANSTIN-MILLS et al., 1992). A circulação e a

agregação de plaquetas na AF são significativamente anormais, mesmo durante os quadros

de estabilidade clínica dos pacientes, como a ausência de crises de vaso-oclusão. Existem

algumas terapias antiplaquetárias usadas na AF, como o efeito da aspirina (com ou sem

dipiridamol), que diminuem as crises álgidas (CHAPLIN et al., 1980; OSAMO et al.,

1981).

1.6- Adesão das plaquetas ao endotélio

A adesão das plaquetas ao endotélio é mediada pela exposição de moléculas

subendoteliais (colágeno) da MEC, e pelas moléculas de adesão das células endoteliais

(selectinas), que contribuem para a adesão plaquetária. O mecanismo da adesão das

plaquetas envolve o sequestro celular no local da lesão endotelial através da interação de

quatro receptores sinérgicos: a glicoproteína GPIb/IX/V (CD42b/CD42a) presente em

plaquetas; a integrina α2β1 (GPIa/IIa; CD49b/CD29), ligante para o colágeno; a integrina

αIIbß3 (GPIIb/IIIa; CD41a/CD61), ligante para o fibrinogênio e a integrina α5β1 (GPIc/IIIa;

CD51/CD61), ligante para a fibronectina (RUGGERI, 2002). A interação entre a GPIb

(subunidade do complexo GPIb/IX/V) e o vFW pode levar ao sequestro transitório de

plaquetas e adesão ao endotélio (FIGURA 2). Essa interação é amplificada pela ativação

Introdução 41

dos receptores da integrina αIIbβ3 das plaquetas e a ligação com o colágeno e estruturas

subendoteliais, resultando na formação de um agregado plaquetário estável, e ligações

irreversíveis com o fibrinogênio e vFW (KULKARNI et al., 2000). Os determinantes

moleculares que promovem a interação entre plaquetas e endotélio não são completamente

conhecidos (GAWAZ, et al., 2005). O contato inicial das plaquetas com o endotélio

durante o fluxo sanguíneo é mediado pelas selectinas presentes em plaquetas e células

endoteliais. As selectinas são moléculas de adesão celular Ca+2-dependentes com domínios

de reconhecimento para carboidratos (CRD), que pertencem ao grupo das lectinas

(KIERSZENBAUM, 2004). A P-selectina (CD62P), encontrada em plaquetas e células

endoteliais, é rapidamente expressa na superfície endotelial como mediadora da circulação

de plaquetas nas arteríolas e vênulas durante os processos inflamatórios (FRENETTE et al.,

1995, 1998) e é expressa na superfície da plaqueta após a sua ativação.

A PSGL-1 (ligante 1 para a glicoproteína P-selectina) ativa plaquetas ou células

endoteliais (KHARGHAN et al., 2006), foi primeiramente identificada em leucócitos

(KANSAS, 1996). A interação entre a P-selectina e PSGL-1 ou GPIb/IX/V é reversível e

insuficiente para estabilizar a adesão (GAWAZ et al., 2005), (FIGURA 3). Deficiências ou

inibidores de P-selectina diminuem a formação do tampão hemostático (PALABRICA et

al., 1992; SUBRAMANIAM et al., 1996). A rápida conversão para estabilizar a adesão

requer um contato adicional entre plaquetas e o endotélio. As integrinas αIIbβ3 (KASIRER-

FRIEDE et al., 2002; ARY et al., 2003) e α2β1 (NIESWANDT e WATSON, 2003; KAHN,

2004;) são as principais mediadoras de receptores de superfície que estabilizam a adesão

em células hematopoéticas (RUGGERI, 2002), (FIGURA 3). Estudos in vitro com a

integrina αIIbβ3 demonstraram uma adesão das plaquetas ao endotélio muito eficiente

(GAWAZ et al., 1997; Bombeli et al., 1998), e in vivo esta adesão é inibida com o

anticorpo anti-αIIbβ3 MAb (MASSBERG, 1999).

Introdução 42

Introdução 43

Figura 2: Esquema das moléculas de adesão de plaquetas e seus respectivos anticorpos

como ligantes. GPIb/IX/V (CD42b/CD42a) presente em plaquetas; a integrina α2β1 (GPIa/IIa; CD49b/CD29), ligante para o colágeno; a integrina αIIbß3 (GPIIb/IIIa;

CD41a/CD61), ligante para o fibrinogênio e a molécula de adesão P-selectina.

Figura 3: Adesão plaqueta/endotélio. Superfície do endotélio ativado expressa a P-

selectina. Os receptores de superfície de plaqueta GPIbα e PSGL-1 interagem com a P-

selectina endotelial e mediam o rolamento de plaquetas. Adesão firme é mediada pelas

integrinas αvβ3 e αIIbβ3 .(Adaptado do: J. Clin. Invest. Meinrad Gawaz, et al., 2005).

αα22ββ

ααIIIIbbββ33

ααIIIIbbββ33

ααIIIIbbββ

PP--sseelleeccttiinnaa

ααIIIIbbββ33

GGPPIIbb--IIXX--VV

MMeemmbbrraannaa PPllaassmmááttiiccaa

1.7- Nucleotídeos cíclicos e adesão plaquetária

Muitos antagonistas fisiológicos de função das plaquetas atuam pela ativação das

enzimas adenilato ciclase (AC) e guanilato ciclase (GC) (STEER e SALZMAN, 1980),

que, por sua vez, produzem aumento dos níveis intraplaquetários de nucleotídeos cíclicos

(NC), adenosina monofosfato cíclico (AMPc) e guanosina monofosfato cíclico (GMPc),

respectivamente (SCHWARZ et al., 2001). A elevação dos níveis de NC no interior das

plaquetas interfere na ativação da via de sinalização, e efetivamente bloqueia o complexo

intraplaquetário da rede de sinalização, rearranjo de citoesqueleto, ativação do receptor para

o fibrinogênio, liberação de grânulos plaquetários e a expressão de moléculas pró-

inflamatórias (BENETT et al., 1999; CALDERWOOD et al., 2000). Níveis de AMPc são

aumentados pela síntese de adenosina trifosfato (ATP) catalisado pela enzima de membrana

AC. O GMPc por sua vez é produzido a partir da guanosina trifosfato (GTP), pela enzima

citoplasmática GC das plaquetas. O NO media seus efeitos pela ativação da GC e,

consequentemente, eleva os níveis de GMPc. Os níveis dos NC são diminuídos por

degradação, através da hidrólise dos mesmos por enzimas fosfodiesterases (PDEs)

(SCHWARZ et al., 2001; ZHANG e COLMAN, 2007). Os principais alvos moleculares

dos NC em plaquetas são as proteínas quinases dependentes de NC, que mediam seus

efeitos através da fosforilação de substratos específicos (EIGENTHALER et al., 1992).

Aumento da concentração de AMPc e/ou GMPc em plaquetas, leva a uma inibição dos

níveis de Ca2+ intraplaquetário (SCHWARZ et al., 2001). O AMPc controla múltiplas vias

de sinalização em plaquetas, e atua como um regulador na ativação plaquetária (ZHANG e

COLMAN, 2007). Além disso, a ativação plaquetária estimulada por trombina (agonista

plaquetário) diminui os níveis intraplaquetários de AMPc via receptor de proteína Gi

(SIMONDS et al., 1989). Zhang e Colman (2007) demonstraram em estudos in vitro que a

Introdução 44

trombina pode inibir diretamente a AC através da proteína Gi, que se acopla ao receptor de

ativação plaquetária (PAR-1), ou inibir indiretamente através da secreção de ADP dos

grânulos densos das plaquetas. Para tanto, sugere-se que a via de sinalização onde TB

regula AMPc pela fosforilação/ativação da PI3/Akt (WOULFE, et al., 2004), esteja

envolvida na fosforilação/ativação da PDE3A induzida por trombina, responsável pela

hidrólise e degradação de AMPc (FIGURA 4).

O papel dos NC na adesão plaquetária ainda não está bem definido. O AMPc

geralmente é descrito como um inibidor de agregação plaquetária. A prostaglandina 2

(PGE2), por exemplo, estimula a produção de AMPc e inibe a adesão das plaquetas ao

endotélio em coelhos. Por outro lado, a adesão das plaquetas ao colágeno não é afetada pela

prostaglandina E1 (PGE1); e o forskolin (ativadores de AC) aumenta a adesão de plaquetas

ao colágeno. Possivelmente, o AMPc inibe efeitos secundários como o aumento dos níveis

intraplaquetário de Ca2+ citoplasmáticos induzidos por ADP, tromboxano A2 ou serotonina,

e não é a resposta principal ao colágeno (SCHWARZ et al., 2001). O GMPc aparenta ter

um papel inibidor na adesão plaquetária. A estimulação de GC por NO bloqueia a

agregação plaquetária e, possivelmente, este efeito acontece pela inibição das

fosfodiesterases de AMPc dependente de GMPc que proporciona o aumento dos níveis de

AMPc e, conseqüentemente, inibição pela PKA (POLANOWSKA-GRABOWSKA et al.,

1994).

Introdução 45

Figura 4: Regulação dos níveis intraplaquetários de AMPc via trombina. A trombina

(TB) regula os níveis de AMPc impedindo a síntese de ATP, e consequentemente,

acelerando a degradação do AMPc para 5’AMP via PDE3A. A TB liga-se ao receptor de

ativação plaquetária 1 (PAR-1), e a adenilato ciclase (AC) é inibida através do acoplamento

direto de PAR-1 à Gi, ou indiretamente pela liberação de ADP. O ADP liga-se ao receptor

P2Y, o qual se acopla à proteína Gi2, que inibe a AC e diminui o AMPc. Os efeitos da TB

em diminuir o AMPc são sinérgicos, porque TB bloqueia a formação de AMPc através da

inibição da AC via PDE3A. A outra via é pela fosforilação/ativação da via AKT/PI3K,

onde AKT pode diretamente ativar a PDE3A, proporcionando um mecanismo adicional que

regula o AMPc (adaptado do: HEMOSTASIS, THROMBOSIS, AND VASCULAR

BIOLOGY. Zhang e Colman, 2007).

Introdução 46

Objetivos

2 – OBJETIVOS

2.1- Objetivos Gerais

Investigação das propriedades adesivas e agregantes de plaquetas em pacientes com

anemia falciforme e em terapia com hidroxiuréia, e elucidação do papel dos nucleotídeos

cíclicos e outras vias de sinalização, como principais mediadores dos processos de vaso-

oclusão e adesão plaquetária.

2.2- Objetivos Específicos

2.2.1- Comparação das propriedades adesivas basais das plaquetas aos ligantes

fibrinogênio e colágeno, entre indivíduos saudáveis (AA), pacientes com

anemia falciforme (SS) e em terapia com hidroxiuréia (SSHU), utilizando-se

ensaio de adesão estático.

2.2.2- Avaliação da adesão plaquetária ao fibrinogênio após o estímulo com

trombina (agonista plaquetário).

2.2.3- Avaliação da adesão plaquetária ao fibrinogênio com inibidores de proteínas

quinase (KT5720 e H-89, inibidores de PKA; inibidor de PKG e o Ro-31-

8220, inibidor de PKC), um inibidor da fosfodiesterase 3A (cilostazol), e

com anticorpos específicos para P-selectina (CD62P) e integrina αIIbß3

(PAC-1), com plaquetas de AA, SS e SSHU, utilizando-se ensaio de adesão

estático.

2.2.4- Avaliação da expressão das moléculas de adesão na membrana plasmática

das plaquetas de indivíduos AA, SS e SSHU, utilizando-se a técnica de

citometria de fluxo.

2.2.5- Quantificação dos níveis intraplaquetários de GMPc e AMPc por ELISA, de

plaquetas de AA, SS e SSHU (com e sem estímulo de trombina).

2.2.6- Avaliação e comparação da função plaquetária com agonistas (ADP,

colágeno e trombina) de plaquetas AA, SS e SSHU, utilizando-se ensaio de

agregação plaquetária.

Objetivos 49

Casuística e Aspectos Éticos

3- CASUÍSTICA E ASPECTOS ÉTICOS

Médicos responsáveis pelos pacientes: prof. Dr. Fernando Ferreira Costa,

profaDra. Sara T.O. Saad e Dra. Fabíola Traina.

Foram selecionados pacientes com AF homozigotos para a HbS diagnosticados pelo

Hemocentro da UNICAMP, utilizando os métodos de eletroforese de hemoglobina e

cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) (VARIANTTM; Bio-Rad Laboratoryes,

Hercules, CA, EUA). Foram coletados aproximadamente 12 ml de sangue periférico, para a

separação das plaquetas, de um grupo de voluntários sadios (masculinos e femininos) e

pacientes com AF (masculinos e femininos). O grupo de pacientes foi composto por 2

grupos de pacientes com e sem terapia com HU, com idades entre 18-65 anos. O grupo de

voluntários sadios foi composto por alunos/funcionários da UNICAMP, que estiveram sem

uso de aspirina (ácido acetilsalisílico) por pelo menos 10 dias e não receberam nenhuma

compensação financeira. Os dois grupos de pacientes também estiveram sem uso de

aspirina por pelo menos 10 dias. Os grupos de pacientes apresentavam-se em fase estável,

ausência de crises de dores, infecção e transfusões prévias por pelo menos 3 meses

anteriores à data da coleta das amostras. O início do tratamento do grupo de pacientes em

terapia com HU (20-30 mg/Kg/dia) foi decidido pelo médico responsável de acordo com os

seguintes critérios de inclusão: crises de vaso-oclusão com frequência superior à 3 vezes

pelo período de um ano, e/ou repetidos episódios de síndrome torácica aguda. Foram

coletadas apenas amostras de pacientes que estavam em uso de HU há pelo menos 3 meses.

Os indivíduos (voluntários sadios e pacientes) assinaram o Termo de Consentimento Livre

e Esclarecido (TCLE) e seus dados clínicos estão na TABELA I (pág. 38).

3.1- Aspectos éticos da pesquisa

Este estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da

Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da UNICAMP – CEP em 25/03/2007 e homologado

na Reunião ordinária do CEP/FCM, (registro inicial no CEP 5/12/2006 e aprovado em

4/4/2007). O Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) assinado por todos os

participantes desse estudo, também foi aprovado pelo conselho citado.

Casuística e Aspectos Éticos 53

Metodologia

4- METODOLOGIA

4.1- Separação de Plaquetas

A separação de plaquetas foi realizada coletando-se sangue periférico (12 ml) em

tubo contendo K2 EDTA (7.2 mg), de indivíduos normais e pacientes com AF.

Centrifugou-se por 15 minutos à 200g (21ºC), para separação do plasma rico em plaquetas

(PRP). Ao PRP foi adicionado um tampão de lavagem (140 mM NaCl / 0.5 mM KCl / 12

mM citrato de sódio / 10 mM glicose / 12.5 mM sacarose, pH 6) na proporção 5/7, com

delicada homogeneização. Centrifugou-se novamente por 12 minutos à 800 g (21ºC). O

sobrenadante foi descartado e o pellet de plaquetas ressuspendido, gentilmente, com 500 µl

de solução de Krebs (118 mM NaCl / 25 mM NaHCO3 / 1.2 mM KH2PO4 /1.7 mM MgSO4 /

5.6 mM glicose, pH 7.4). A concentração de plaquetas foi ajustada para 1,2 x 108

plaquetas/ml (Cell-Dyn® 1600, Mountain View, CA, USA). A reposição do cálcio foi

realizada com uma solução de 1 mM CaCl2 antes da realização dos experimento

4.2- Ensaio de Adesão Estático

O ensaio de adesão estático foi realizado de acordo com Bellavite, et al. (1994),

com algumas adaptações. A concentração padronizada de fibrinogênio (FB) como ligante

foi de 50 µg/ml, e a de colágeno (Col) como ligante, foi de 10 µg/ml (50 µl/poço). Placas

com 96 poços foram preparadas por coating individual com 50 μg/ml de fibrinogênio

(Calbiochem, La Jolla, CA, USA) ou 10 μg/ml de colágeno tipo I humano (SIGMA, St.

Louis, MO, USA), e foram incubadas over night (aproximadamente 18 h) à 4oC. Os poços

foram lavados duas vezes com 200 µl/poço de solução de Krebs e os sítios inespecíficos

foram bloqueados com 100µl/poço de uma solução de Krebs com 1% de BSA (LGCBio,

nacional) por 60 minutos à 37oC. As placas foram lavadas novamente como descritas

anteriormente, e os ensaios de adesão foram realizados em triplicata; adicionando-se 50

μl/poço da suspensão de plaquetas (1,2 x 108 plaquetas/ml) incubadas por 15 minutos à

37oC. Para cada amostra foi preparada uma curva padrão em placas não tratadas com FB

e/ou Col, em duplicata com diluições a partir da concentração original (1,2 x 108

plaquetas/ml); 5%, 10%, 20% 50% e 100%. Para todos os experimentos foi realizada uma

adesão basal (ausência de drogas) para cada amostra de controles e paciente. Após a

incubação, as plaquetas não aderentes foram desprezadas lavando-se a placa mais duas

Metodologia 57

vezes como descrito anteriormente. Foram adicionados 50 μl/poço de tampão de Krebs na

placa do ensaio, e 150 μl/poço do substrato da fosfatase ácida (0.1 M tampão citrato; pH

5.4; 5 mM p-fosfato de nitrofenila e 0.1% de Triton X-100, Sigma), nas placas do ensaio e

da curva padrão, e incubou-se por 1 h a temperatura ambiente (TA). Ao final da incubação,

a reação foi interrompida adicionando-se 100 μl/poço de NaOH (2N). O resultado foi

obtido no leitor de ELISA com comprimento de onda de 405 nm (Multisscan MS,

Labsystems, EUA), e a adesão foi calculada em porcentagem de plaquetas aderidas a partir

da comparação das absorbâncias dos poços com uma curva padrão, formada por diluições

da suspensão original de plaquetas.

4.3- Uso de drogas e/ou anticorpos em ensaios de adesão

Foram realizados diversos experimentos de ensaio de adesão com diferentes drogas.

A trombina foi utilizada na concentração de 50 mU/ml (Sigma, St. Louis, MO, USA),

inibidores de proteínas quinases e anticorpos específicos também foram utilizados.

Os inibidores da proteína quinase A (PKA), o KT5720 (Calbiochem, La Jolla, CA,

USA) e o H-89, Dihydrochloride, (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) foram solubilizados

em DMSO (dimetilsulfóxido, Merk, KGaA, Darmstadt, Germany) e mantidos numa

concentração estoque 2 mM (KT5720) e 10 mM (H-89) e armazenados à -20°C. Na

padronização dos ensaios de adesão foram utilizados a seguintes concentrações: 0.5 µM, 1

µM e 3 µM. A concentração escolhida de KT5720 foi de 3 µM; e a concentração escolhida

de H-89 foi de 1 µM (ISHIKURA, et al., 2005).

O inibidor da proteína quinase G, o PKG (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) foi

solubilizado com água de injeção (estéril) e mantido numa concentração estoque de 1 mM e

armazenados à -20°C. Na padronização dos ensaios de adesão foram utilizadas as seguintes

concentrações: 1 µM (concentração escolhida como padrão) e 10 µM de PKG.

O inibidor da proteína quinase C, o Ro-31-8220 (Calbiochem, La Jolla, CA, USA)

foi solubilizado com água de injeção (estéril) e mantido numa concentração estoque de 5

mM e armazenado à -20°C. Na padronização dos ensaios de adesão foram utilizadas as

seguintes concentrações: 1 µM e 5 µM (concentração escolhida como padrão) de Ro-31-

8220 (AMOR, et al., 2005).

Metodologia 58

O Cilostazol [6-(4-[1-cyclohexyl-1H-tetrazol-5-y]butoxy)-3,4-dihydro-2(1H)-

quinolinone, OPC-13013], (Sigma, St. Louis, MO, USA) é um inibidor específico da

fosfodiesterase 3A (PDE3A), é um vasodilatador, inibe a ativação e agregação plaquetária,

e trombose (DALAINAS, 2007). Foi solubilizado em DMSO e mantido na concentração

estoque de 10 mM e armazenado à -20°C. Na padronização dos ensaios de adesão foram

utilizadas as seguintes concentrações: 0.16 µM, 1.6 µM (concentrações escolhidas como

padrões)e 16.6 µM.

A Vinpocetina é um inibidor específico da PDE1 que foi solubilizado em etanol

absoluto (95%), e a concentração utilizada nos ensaios de adesão foi de 50 µM

(ALMEIDA, et al., 2008).

Todos os ensaios de adesão de plaquetas, as quais foram incubadas com drogas

solubilizadas com DMSO (KT5720, H-89 e cilostazol), foram comparados com uma adesão

basal de plaquetas incubadas apenas com DMSO na proporção de 0.001 % v/v.

Realizou-se o ensaio de adesão ao FB com anticorpos específicos para as seguintes

moléculas: o CD62P (clone AK6, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) que reconhece a

molécula P-selectina das plaquetas ligando-se a ela, e o PAC-1 (Becton Dickinson, San

Jose, CA, USA) que reconhece a integrina αIIbß3 na sua conformação de alta afinidade,

ligando-se a ela e impedindo-a de ligar-se ao FB. As concentrações padronizadas dos

anticorpos foram: 2 µg/ml do PAC-1 (concentração estoque 25 µg/ml) e de 2 µg/ml do

CD62P (concentração estoque 50 µg/ml) do CD62P.

4.4- Citometria de Fluxo

A expressão superficial das moléculas CD41a (subunidade α da integrina αIIbβ3, receptor ao FB), CD49b (subunidade α da integrina α2β1, receptor ao Col), CD42b

(subunidade GPIb do complexo GPIb/IX/V, receptor ao vFW) e CD62P (P-selectina), nas

plaquetas foram determinadas por citometria de fluxo. As plaquetas de indivíduos

saudáveis e pacientes com AF (com e sem HU) foram incubadas com anticorpos anti-

CD41a conjugado FITC (clone PM6/248), anti-CD49b – FITC (clone AK7), anti-CD42b

ficoeritrina (PE) (clone AK2), anti-CD62P – FITC (clone AK6) e PAC-1 – FITC que

reconhece a integrina αIIbβ3 na sua conformação de alta afinidade, todos da Becton

Dickinson, San Jose, CA, USA. Cerca de 4 ml sangue periférico foram coletadas (9NC

Metodologia 59

citrato de sódio 3,2%; 1:10). O PRP foi obtido por centrifugação por 10 minutos à 800 rpm

(21°C). O PRP (5 µl, 1 x 108 PLTs/ml) foi fixado com 200 μl de solução de PBS

(phosphate-buffered saline, pH 7.4) com 1% de paraformaldeído por 10 minutos à TA. Em

seguida, as plaquetas foram lavadas com 2 ml de PBS e centrifugadas por 15 minutos à

1800 rpm (21°C). Desprezou-se o sobrenadante; e as plaquetas foram ressuspendidas em 45

μl de PBS e adicionou-se 5 μl do anticorpo correspondente, e incubado por 20 minutos

protegida da luz em TA. Em seguida, as plaquetas foram novamente lavadas como descrito

anteriormente. Ao final, o sobrenadante foi desprezado e as plaquetas foram ressuspendidas

em 500 μl de PBS, e as amostras foram analisadas à 488nm no FACScalibur (Becton-

Dickinson, San Jose, CA, USA). Foram obtidos 10000 eventos para cada amostra. No

SSC/FSC (side scatter/forward scatter), foram utilizados histogramas para a identificação

das populações de plaquetas. A intensidade da fluorescência de cada plaqueta foi

comparada com plaquetas incubadas com um controle negativo de isotipo IgG1/IgG1 (AbD

SEROTEC, MorphoSys UK Ltd, Endeavour House, Langford Business Park, Langford

Lane, Kidlington, Oxford, OX5 1GE, UK) conjugado com FITC e PE.

4.5- Extração e mensuração dos Nucleotídeos Cíclicos (AMPc e GMPc)

Os nucleotídeos cíclicos foram extraídos das plaquetas, de acordo com o protocolo de

separação de sangue periférico, como foi descrito anteriormente. Antes da extração, uma

solução de 1 mM CaCl2 foi adicionada as plaquetas (1,2 x 108 plaquetas em 250 µl de Krebs)

para repor o cálcio que foi quelado pelo K2 EDTA do tubo de coleta.

As plaquetas foram pré-incubadas com um inibidor inespecífico de fosfodiesterase,

2 mM do 3-isobutil-1-metil-xantina (IBMX, Calbiochem, San Diego, CA, USA) por 15

minutos em TA, a fim de se evitar a degradação dos nucleotídeos cíclicos. Após a

incubação, foram adicionados 11,5 µl de ácido perclórico (78%) para a extração dos NC, e

em seguida as amostras foram centrifugadas à 6000g por 20 minutos em TA. O

sobrenadante, contendo as nucleotidades cíclicas, foi retirado o pH foi neutralizado com

8M de hidróxido de potássio (KOH). As amostras foram armazenadas à -80ºC até o dia do

ensaio.

Metodologia 60

Metodologia 61

A quantificação dos níveis de AMPc e GMPc foi mensurada utilizando-se os kits de

ELISA específicos para AMPc ou GMPc (Amersham Biosciences, Bucks, UK, FIGURA

5), de acordo com o manual do fabricante.

Esquema do ensaio de ELISA para AMPc

Figura 5: Esquema do ensaio de ELISA para AMPc, de acordo com o fabricante

(Amershan Biosciense).

4.6- Ensaio de Agregação Plaquetária

A agregação plaquetária é um ensaio funcional com PRP ou sangue total, pelo

equipamento CHRONO-LOG CORPORATION, Modelo 700 (West Park Road,

Havertown, PA, EUA). Para o ensaio foram coletados cerca de 14 ml de sangue periférico

com o anticoagulante 3,2% citrato de sódio (VACUPLAST, Huangyn, China). As amostras

de sangue periférico foram centrifugadas a 800 rpm por 10 min a 21ºC. O PRP foi obtido e

transferido para um tubo falcon de 15 ml. Em seguida, uma segunda centrifugação foi

realizada de 3000 rpm por 15 min a 21°C, do que sobrou da amostra da qual foi extraído o

PRP, a fim de se obter o PPP (plasma pobre em plaqueta). O PPP também foi transferido

11MM HH22SSOO44 ((OODD 445500 nnmm))

++ TTMMBB

ppooççoo

AAMMPPcc--ppeerrooxxiiddaassee

AAMMPPcc ddaa aammoossttrraa

FFaassee ssóólliiddaa SSuubbssttrraattoo

IInnccuubbaaççããoo

AAmmeerrsshhaamm BBiioosscciieennssee

AAnnttii--IIggGG

AAnnttii--AAMMPPcc

RReeaaggeennttee ddoo KKiitt

Metodologia 62

para outro tubo falcon de 15 ml. A contagem das plaquetas foi realizada no equipamento

Cell Dyn, e as concentrações foram ajustadas para 250.000 plaquetas/ml com o próprio PPP

das amostras correspondentes. Para o ensaio foram utilizadas 250 µl de plaquetas (250.000

plaquetas/ml) por cubeta de vidro, e no interior de cada cubeta foi adicionada uma barra

magnética (ímã) para promover a agitação e propiciar a agregação a partir desta agitação

mecânica. Os agonistas plaquetários utilizados foram: 5 µM de ADP; 1 e 2 µg/ml de

colégeno e 500 mU/ml de trombina. Todo o ensaio foi realizado na temperatura de 37°C,

que corresponde à temperatura corporal humana fisiológica. O resultado foi dado por uma

curva de amplitude de agregação, expresso em porcentagem, dentro de um gráfico

representado pelas coordenadas X e Y.

4.7- Análise Estatística

Os resultados foram expressos pelas médias ± erro da média (SEM) de n de

indivíduos. Os grupos foram comparados através do teste não-paramétrico Mann-Whitney

(pareado), comparação entre 2 grupos, ou pelo teste não-paramétrico ANOVA (pareado e

não-pareado), comparação entre mais de 2 grupos, seguido pelo teste de Dunn’s Multiple

Comparisons. Os testes utilizados não foram relatados nos gráficos e tabelas, a não ser que

tenham sido utilizados outro teste. As análises de correlação através do teste de

Spearman’s. Os cálculos foram efetuados no programa GRAPHPAD INSTAT (GraphPad

Software Inc., San Diego, CA, USA), e valor de p menor ou igual a 0,05 foi considerado

estatisticamente significante.

Resultados

5 – RESULTADOS

5.1- Aspectos clínicos dos indivíduos controles e pacientes que participaram do

estudo

Todos os pacientes que participaram deste estudo foram submetidos a exames

clínicos, e os dados hematológicos como o hemograma e quantificação de HbF, estão

representados na TABELA I.

O grupo de pacientes em terapia com HU apresentou valores significativamente

maiores de hematócrito, hemoglobina, volume corpuscular médio (VCM) e hemoglobina

corpuscular média (HCM), em relação ao grupo de pacientes sem HU (SS). Porém, a

contagem de leucócitos (WBC) foi maior no grupo de pacientes SS em relação aos

pacientes SSHU.

Além disso, os pacientes SSHU apresentaram níveis aumentados de HbF, quando

comparados ao grupo de pacientes SS. Esse resultado mostra que a HU atua de maneira

diretamente ou indiretamente na produção de HbF, e existem vários estudos publicados na

literatura que também já comprovaram esse efeito da HU em pacientes com AF.

Resultados 65

Tabela 1: Aspectos clínicos dos controles AA, pacientes SS e pacientes SSHU que participaram deste estudo.

AA

SS

SSHU

P SS comp. SSHU

Masculino/feminino 20/29 11/25 16/15 Idade (anos) 33 (32.5; 19, 52) 39.8 (39, 20, 65) 36.4 (34, 22, 66) >0.05 Contagem total de células vermelhas (106/µl)

N/D 2.71 (2.66, 1.75, 4.48) 2.67 (2.67, 1.59, 3.53) >0.05

Hematócrito (%) 44 (45, 38, 50) 24.0 (24.4, 17.5, 33.6) 27.1 (27.3, 16.3, 37.4) 0.005 Hemoglobina (g/L) N/D 79.5 (80, 56, 106) 91.5 (90, 55, 141) 0.003 Volume Corpuscular Médio (fl) N/D 89.5 (91.3, 73.9, 105.1) 102.9 (105.0, 78.9, 120.8)

5.2- Adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao FB in vitro.

Observou-se que as plaquetas de pacientes SS (plaquetas SS) apresentaram uma

maior capacidade de aderirem ao FB, proteína plasmática, em relação às plaquetas de

indivíduos controles (plaquetas AA) e de pacientes SSHU (plaquetas SSHU), e este

resultado foi estatisticamente significativo, como representado no GRÁFICO 1A. Por sua

vez, as plaquetas de pacientes SSHU apresentaram uma adesão semelhante às plaquetas

AA, e uma diminuição significativa em relação às plaquetas SS.

5.3- Adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao Col in vitro.

Em contraste ao FB, a adesão basal das plaquetas ao Col, proteína da matriz

extracelular (MEC), não apresentou nenhuma diferença estatisticamente significativa entre

as plaquetas AA, SS e SSHU (GRÁFICO 1B).

5.4- Trombina induz um aumento na adesão de plaquetas ao FB e ao Col.

Foi utilizado um agonista plaquetário, a trombina (50 mU/ml), e realizada uma co-

incubação com as plaquetas. A trombina foi capaz de aumentar significativamente a adesão

das plaquetas AA, SS e SSHU ao FB, quando comparada com suas respectivas adesões

basais (GRÁFICO 2A). Esse efeito da trombina também foi observado para o ensaio de

adesão das plaquetas AA, SS e SSHU ao Col, quando comparada com as respectivas

adesões basais (GRÁFICO 2B).

Esses resultados podem indicar que as plaquetas SS possuem uma capacidade maior

de aderirem ao FB do que ao Col, assim como também podem indicar que, possivelmente, a

função de uma(s) molécula(s) de adesão receptora para fibrinogênio possa estar alterada, e

não do receptor ao colágeno.

Resultados 67

AA SS SSHU0

10

20

30

40

*

##

A

n=21 n=13 n=13

% a

desã

o pl

aque

tária

ao

FB (5

0μ

g/m

l)

AA SS SSHU0

10

20

30

40

n=15 n=11 n=12

B

% a

desã

o pl

aque

tária

ao

Col

(10μ

g/m

l)

Gráfico 1: Adesão basal das plaquetas de indivíduos controles (AA), pacientes AF (SS)

e pacientes AF em terapia com HU (SSHU), 37ºC, 15 min. (A) adesão basal das

plaquetas ao FB (50 µg/ml), *p

0

15

30

45

AA SS SSHU

Trombina(50 mU/ml)

A

P

5.5- Avaliação da expressão e função de moléculas de adesão na superfície de

plaquetas AA SS SSHU, utilizando a técnica de citometria de fluxo.

A expressão das principais moléculas de adesão das plaquetas foi determinada por

citometria de fluxo na superfície de plaquetas de indivíduos controles (AA), pacientes AF

(SS) e pacientes AF em terapia com HU (SSHU). O resultado foi expresso pela

porcentagem média de plaquetas que expressam as moléculas (% positiva ± SEM) e pela

média da intensidade de fluorescência (MIF) para cada amostra de plaquetas adquirida

(TABELA II). Para cada amostra de controle e paciente foi utilizado um controle isotipo

negativo IgG1/IgG1 conjugado FITC/PE.

Como demostrado na TABELA II, as plaquetas SS apresentaram maior marcação

positiva para a molécula P-selectina em comparação às plaquetas AA, e esse aumento foi

estatisticamente significativo (p=0.04). Além disso, a MIF também foi maior em plaquetas

SS em comparação às plaquetas AA. Entretanto, as plaquetas SSHU também apresentaram

um aumento na marcação positiva e da MIF em comparação às plaquetas AA, mas esse

resultado não foi estatisticamente significativo.

A expressão da integrina αIIbß3 através do anticorpo CD41a, que reconhece a

subunidade αIIb, não apresentou diferenças estatisticamente significativas nas plaquetas AA,

SS e SSHU, tanto para a marcação positiva (acima de 96%) e MIF (acima de 400).

O anticorpo PAC-1 que reconhece a integrina αIIbß3 (receptor ao FB) na sua

conformação de alta afinidade, nas plaquetas SS apresentou maior marcação positiva em

comparação às plaquetas AA, e esse aumento foi estatisticamente significativo (p=0.03). O

resultado da ligação desse anticorpo as plaquetas SSHU foi semelhantes às plaquetas AA,

mas não foi estatisticamente significativo quando comparado às plaquetas SS.

A expressão da subunidade GPIb do complexo GPIb/IX/V (receptora para o fator de

vWF) foi avaliada através do anticorpo CD42b, e não apresentou diferenças

estatisticamente significativas nas plaquetas AA, SS e SSHU, tanto para a marcação

positiva e MIF.

A expressão da subunidade α2 da integrina α2ß1 (colágeno como ligante), avaliado

através do anticorpo CD49b também não apresentou nenhuma diferença estatisticamente

significativa nas plaquetas AA, SS e SSHU, tanto para a marcação positiva MIF.

Resultados 70

5.6- Efeitos dos anticorpos anti-moléculas de adesão na adesão de plaquetas ao

FB

Foram realizados ensaios de adesão ao FB na presença de anticorpos específicos

para as seguintes moléculas de adesão: P-selectina (2 µg/ml - CD62-P), e para a integrina

αIIbβ3 na sua conformação de alta afinidade (2 µg/ml - PAC-1). Para cada amostra de

controle e pacientes com e sem HU foi realizado um ensaio basal e com estímulo de

trombina (50 mU/ml). No grupo de controles foi observada uma redução significativa da

adesão das plaquetas na presença do anticorpo PAC-1 incubado com trombina em relação à

sua basal. A adesão estimulada com trombina foi significativamente maior em relação à sua

adesão basal. Também foi observada uma diminuição da adesão com o anticorpo PAC-1

sem trombina em relação à sua basal, mas esse resultado não foi estatisticamente

significativo (GRÁFICO 3A).

No grupo de pacientes SS a adesão com o anticorpo PAC-1 foi significativamente

menor em relação à sua basal. A adesão na presença do PAC-1 e da trombina também foi

significativamente menor em relação à sua basal. A adesão estimulada com trombina

aumentou significativamente quando comparada com sua basal. O anticorpo CD62-P não

interferiu nos resultados de adesão quando comparada com a sua basal e basal estimulada

com trombina (GRÁFICO 3B).

No grupo de pacientes com HU o anticorpo PAC-1 incubado com trombina foi

capaz de diminuir significativamente a adesão em relação à sua basal estimulada com

trombina. A adesão com trombina foi aumentada significativamente em relação à sua basal.

O anticorpo CD62P não foi capaz de interferir na adesão em relação às suas basais com e

sem trombina (GRÁFICO 3C).

5.7- Níveis intraplaquetários de AMPc em plaquetas AA, SS e SSHU

Os níveis de AMPc das plaquetas SS foram significativamente diminuídos em

relação às plaquetas AA, e em relação ao grupo de pacientes SSHU. Plaquetas de pacientes

SSHU apresentaram níveis reduzidos de AMPc em relação ao grupo controle, mas essa

diferença não foi estatisticamente significativa (GRÁFICO 4A).

Resultados 71

Resultados 72

5.8- Efeito da trombina nos níveis intraplaquetários de AMPc em plaquetas

AA, SS e SSHU

Após o estímulo com trombina, observou-se uma redução significativa dos níveis

intracelulares de AMPc em plaquetas AA, e em plaquetas SSHU em relação aos seus níveis

basais (GRÁFICO 4B). No entanto, nas plaquetas SS a trombina não foi capaz de alterar os

já reduzidos níveis de AMPc. Este resultado pode sugerir que a ativação das plaquetas na

circulação de pacientes AF possa ser mediada, em parte, por uma redução dos níveis de

AMPc intraplaquetários.

Tabela 2: Expressão das moléculas de adesão na superfície das plaquetas dos controles (AA), pacientes (SS) e pacientes

em terapia com hidroxiuréia (SSHU).

AA (n≥18) SS (n≥17) SSHU (n≥13)

Anticorpo % Positivo MIF % Positivo MIF % Positivo MIF P

CD42b-FITC 97.2 ± 0.6 758.5 ± 85.6 98.1 ± 0.4 737.8 ± 47.3 95.5 ± 1.6 815.6 ± 81.7

CD62P-FITC 20.2 ± 2.3** 13.9 ± 1.4 * 29.4 ± 3.6** 20.7 ± 2.4 * 29.2 ± 4.6 24.2 ± 6.3 0.04** - 0.03*CD49b-FITC 70.5 ± 4.2 27.4 ± 2.0 70.1 ± 4.6 29.4 ± 2.9 68.5 ± 5.2 26.9 ± 2.0

CD41a-FITC 97.5 ± 0.5 412.9 ± 37.1 98.2 ± 0.4 406.7 ± 37.2 96.6 ± 1.1 447.0 ± 43.9

PAC-1-FITC 11.1 ± 3.7 # 8.6 ± 1.5 27.0 ± 6.3 # 14.4 ± 2.6 11.6 ± 2.6 8.6 ± 1.7 0.03#

TABELA II: CD42b (GPIb), CD62P (P-selectina), CD49b (subunidade α2 da integrina α2β1) e CD41a (subunidade αIIb

da integrina αIIbβ3), PAC-1 liga-se a integrina αIIbβ3 na sua conformação de alta afinidade. A expressão na superfície das

plaquetas foi determinada por citometria de fluxo. Os resultados da expressão das moléculas de adesão estão

representados na média ± desvio padrão (SEM) de porcentagem de plaquetas ligadas ao anticorpo (% positivo) e na

Intensidade Média de Fluorescência (MIF) de anticorpo ligado para cada plaqueta.

Resultados 73

Basal PAC-1 CD62P Basal PAC-1 CD62P0

10

20

30

40

*••

A

AA (n=9)

Trombina (50 mU/ml)

% a

desã

o pl

aque

tária

ao

FB (5

0μ

g/m

l)

Basal PAC-1 CD62P Basal PAC-1 CD62P0

10

20

30

40

Trombina (50 mU/ml)

*

•

B

••

SS (n=7)

% a

desã

o pl

aque

tária

ao

FB (5

0μ

g/m

l)

Basal PAC-1 CD62P Basal PAC-1 CD62P0

10

20

30

40

Trombina (50 mU/ml)

*••

C

SSHU (n=8)

% A

desã

o pl

aque

tária

ao

FB (5

0μ

g/m

l)

Gráfico 3: Ensaio de adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao FB na presença de

anticorpos funcionais para P-selectina e para integrina αIIbβ3. ativada. (A) adesão basal

ao FB (50 µg/ml) de plaquetas AA, CD62P (2 µg/ml), PAC-1 (2 µg/ml) com e sem

trombina (50 mU/ml), 15 min, 37°C; * p

AA SS SSHU0

5

10

15A

**

n=13 n=14 n=15

#A

MPc

(fm

ol/ 1

08 p

laqu

etas

)

0

5

10

15B

p 0.05 p

5.9- Correlação dos níveis de HbF em pacientes SS e SSHU com os níveis

intraplaquetários de AMPc

Houve uma correlação positiva, com valor significativo de p

estímulo de TB. Além disso, a trombina foi capaz de aumentar significativamente a adesão

em relação à basal sem estímulo (GRÁFICO 7A).

No grupo de pacientes SS, o cilostazol (1.6 µM) foi capaz de diminuir

significativamente a adesão em relação à basal e ao DMSO. Com o estímulo com trombina

(50 mU/ml), o cilostazol foi capaz de diminuir significativamente a adesão em relação à sua

basal e ao DMSO (GRÁFICO 7B).

No grupo de pacientes SSHU, o cilostazol (1.6 µM) foi capaz de diminuir

significativamente a adesão em relação à basal, mas não em relação ao DMSO. Além disso,

o DMSO diminuiu significativamente a adesão em relação à basal. Com o estímulo com

trombina (50 mU/ml), o cilostazol foi capaz de diminuir significativamente a adesão em

relação à sua basal e ao DMSO (GRÁFICO 7C).

2.5 5.0 7.5 10.0 12.50

10

20

30 n =  29r=0.461p <  0.02

AMPc (fmol/108 PLT)

% H

bF

Gráfico 5: Correlação dos níveis de HbF (g/dl) e níveis intraplaquetários de AMPc

(fmol/108 PLTs). Amostras de pacientes com AF (SS) e pacientes com AF em terapia com

HU (SSHU) p

AA SS SSHU0

25

50

75

100

n=15 n=20 n=24

AG

MPc

(fm

ol/ 1

08 p

laqu

etas

)

0

25

50

75

100trombina (50 mU/ml)

p0.05

AA (n≥6) SS (n≥11) SSHU (n≥9)

B

GM

Pc (f

mol

/108

plaq

ueta

s/m

l)

Gráfico 6: Níveis intraplaquetários de GMPc (fmol/108 plaquetas) de plaquetas AA,

SS e SSHU. A, níveis basais de GMPc em plaquetas AA, SS e SSHU, e em (B) níveis de

GMPc de plaquetas AA, SSe SSHU após estímulo com trombina (50 mU/ml por 15 min,

37°C).

Resultados 78

Basa

l

DMSO

Cilos

tBa

sal

DMSO

Cilos

t0

15

30

45

#***

A

Trombina (50 mU/ml)

⊗⊗

⊗⊗⊗

AA (n≥12)

⊗⊗⊗

⊗

% a

desã

o pl

aque

tzár

ia a

o FB

(50μ

g/m

l)

Basa

l

DMSO

Cilos

tBa

sal

DMSO

Cilos

t0

15

30

45

#

##

B

Trombina (50 mU/ml)

**

⊗⊗⊗

SS (n≥6)

⊗⊗⊗

% A

desã

o pl

aque

tária

ao

FB (5

0 m

U/m

l)

Basa

l

DMSO

Cilos

tBa

sal

DMSO

Cilos

t0

15

30

45

Trombina (50 mU/ml)

C*

⊗⊗⊗

#

SSHU (n≥6)

⊗⊗

⊗⊗

% A

desã

o pl

aque

tária

aoF

B (5

0μ

g/m

l)

Gráfico 7: Adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao FB, na presença ou ausência do

inibidor específico de PDE3A (cilostazol), DMSO e estimulada com TB. (A) ensaio de

adesão ao FB (50 µg/ml) basal, DMSO(0.001 % v/v) e cilostazol (1.6 µM); e com TB (50

mU/ml, 15 min, 37°C) com plaquetas AA; (B) plaquetas SS; (C) plaquetas SSHU;

*p

5.12- Efeito dos inibidores das proteínas quinases PKA, PKG e PKC na adesão

de plaquetas AA, SS e SSHU

Foram utilizados inibidores das proteínas quinases (PK) A, G e C nos ensaios de

adesão ao FB, com plaquetas de indivíduos controles (AA), pacientes com AF (SS) e

pacientes com AF em terapia com HU (SSHU). Foram utilizados 2 diferentes inibidores de

PKA, o KT5720 (1 µM) e o H-89 (1 µM) para investigar se a via de sinalização via PKA

está envolvida na adesão de plaquetas de pacientes com AF. Para cada amostra foi realizada

uma adesão com DMSO (0.001 % v/v), solvente dos inibidores, como controle. No grupo

de controles AA e de pacientes SS não houve diferença significativa na adesão das

plaquetas com os inibidores KT5720 e H-89, em relação à adesão com o DMSO

(GRÁFICO 8A).

Os inibidores de PKG (1 µM) e PKC (Ro-31-8220, 5 µM) foram solubilizados com

água estéril, e para cada amostra foi realizada uma adesão basal. No grupo controle AA, o

inibidor de PKG foi capaz de diminuir significativamente a adesão em relação à sua basal, e

o inibidor de PKC. Porém no grupo de pacientes SS, esses inibidores diminuíram a adesão

em relação à sua basal, PKG e PKC, mas essa diminuição não foi estatisticamente

significativa (GRÁFICO 8B).

Resultados 80

DMSO

KT57

20H-

89

DMSO

KT5

720

H-89

0

10

20

30A

AA (n=6) SS (n=8)

% a

desã

o pl

aque

tária

ao

FB (5

0μ

g/m

l)

Basa

lPK

G

RO-31

-8220

Basa

lPK

G

RO-31

-8220

0

5

10

15

20

25

30

35 B

* *

AA (n=10) SS (n=9)

*

% a

desã

o pl

aque

tária

ao

FB (5

0μ

g/m

l)

Gráfico 8: Ensaio de adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao FB na presença de

inibidores de PKA, PKG e PKC. Em (A) ensaio de adesão ao FB (50 µg/ml) com

inibidores de PKA: KT5720 (3 µM) e H-89 (1 µM), 15 min, 37°C, com plaquetas AA e

SS; BASAL=DMSO (B) ensaio de adesão ao FB (50 µg/ml) com inibidores de PKG (1

µM) e PKC (Ro-31-8220, 5 µM), 15 min, 37°C, com plaquetas AA e SS; * p

5.13- Agregação plaquetária e padronizações necessárias

Para a utilização do equipamento CHRONO-LOG Modelo 700 foi necessário

padronizá-lo previamente, porque havia sido comprado recentemente pelo Laboratório de

Hemostasia do Hemocentro II, UNICAMP, SP. Foram utilizados diversos doadores

voluntários (grupo de indivíduos saudáveis) para ajustar os parâmetros do aparelho,

utilizando agonistas plaquetários. A adenosina difosfato (ADP) é um importante agonista

plaquetário que atua em diversas vias de sinalização (AMPc), e foi utilizada nas seguintes

concentrações: 2.5 µM, 5 µM e 10 µM (GRÁFICO 9A), e a concentração de 5 µM foi a

escolhida para os experimentos. O colágeno, importante proteína da matriz extracelular,

intermedia o processo de agregação plaquetária na formação do trombo (coágulo), e foram

utilizadas as seguintes concentrações: 1 µg/ml, 2 µg/ml e 5 µg/ml, e as concentrações de 1

µg/ml e 2 µg/ml foram as escolhidas para os experimentos (GRÁFICO 9B). A trombina,

importante agonista plaquetário que atua na cascata da coagulação convertendo o

fibrinogênio plasmático em fibrina, foi utilizada nas seguintes concentrações: 50 mU/ml,

100 mU/ml, 250 mU/ml, 500 mU/ml e 1 U/ml (GRÁFICO 9C), e a concentração de

500 mU/ml foi a escolhida para os experimentos.

Resultados 82

2.5 uM 5 uM 10 uM 0

20

40

60

80

100

n=16 n=17 n=18

A

% A

mpl

itude

de

Agr

egaç

ão P

laqu

etár

ia c

om A

DP

1 μg/ml 2 μg/ml 5 μg/ml0

20

40

60

80

100

n=15 n=20 n=13

B

% A

mpl

itude

de

agre

gaçã

o pl

aque

tária

Col

50 m

U/ml

100 m

U/ml

250 m

U/ml

500 m

U/ml

1 U/m

l0

20

40

60

80

100

n=6 n=6 n=13 n=15 n=16

C

% A

mpl

itude

de

agre

gaçã

o pl

aque

tária

TB

Gráfico 9: Ensaio de agregação plaquetária com indivíduos saudáveis (AA). (A) após

o estímulo com ADP (2.5 µM; 5 µM e 10 µM; (B) após o estímulo com Col (1 µg/ml, 2

µg/ml e 5 µg/ml; (C) após o estímulo TB (50, 100, 250, 500 e 1 U/ml). Todas as amostras

de doadores foram incubadas por 5 min, 37°C.

Resultados 83

5.14- Comparação da agregação das plaquetas AA, SS e SSHU com os

agonistas plaquetário ADP, Col e TB

Foram coletadas amostras de sangue periférico com anticoagulante citrato de sódio

para preservar o cálcio, importante sinalizador intraplaquetário. O grupo de pacientes

SSHU apresentou uma diminuição da função plaquetária com ADP (5 µM) quando

comparado ao grupo controle (AA), mas esse resultado não foi estatisticamente

significativo. O grupo de pacientes SS também apresentou uma diminuição da agregação

plaquetária em relação ao grupo controle, mas esse resultado não foi estatisticamente

significativo (GRÁFICO 10).

A função plaquetária dos pacientes SSHU com TB (500 mU/ml) apresentou uma

redução significativa em relação ao grupo controle AA. O grupo de pacientes SS também

apresentou uma diminuição da sua função plaquetária com TB, em relação ao grupo

controle AA, mas esse resultado não foi estatisticamente significativo (GRÁFICO 11).

O grupo de pacientes SS apresentou um aumento significativo da sua agregação

plaquetária sob o estímulo do agonista plaquetário Col (1 µg/ml), em relação ao grupo

controle AA (GRÁFICO 12A). Esse mesmo grupo, também apresentou um aumento

significativo da sua função plaquetária ao Col (2 µg/ml), tanto em relação ao grupo

controle AA, quanto ao grupo de pacientes SSHU. A função plaquetária do grupo de

pacientes SSHU foi muito similar ao grupo controle (GRÁFICO 12B).

Resultados 84

AA SS SSHU0

20

40

60

80

100

5 μM

n=14 n=5 n=7

*

% A

mpl

itude

de

agre

gaçã

o pl

aque

tária

AD

P

Gráfico 10: Agregação plaquetária de plaquetas AA, SS e SSHU com ADP (5µM).

Porcentagem de amplitude da agregação plaquetária com o agonista plaquetário ADP (5

µM), * p

AA SS SSHU0

25

50

75

100

125

n=15 n=5 n=2

1 μg/ml

p=0.0037A

% A

mpl

itude

de

agre

gaçã

o pl

aque

tária

Col

AA SS SSHU0

25

50

75

100

125

n=20 n=3 n=6

2 μg/ml

p=0.0011p=0.0238B

% A

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Col

Gráfico 12: Agregação plaquetária de plaquetas AA, SS e SSHU com Col. Porcentagem

de amplitude de agregação plaquetária com o agonista plaquetário (A) Col (1 µg/ml), (B)

col (2 µg/ml); p

Discussão

6 – DISCUSSÃO

A principal função das plaquetas é impedir o sangramento, quando há lesão tecidual

com perda de sangue através da formação de um “tampão hemostático” ou coágulo que

ativa toda a cascata de coagulação. As plaquetas também contribuem para manter a

integridade do endotélio e atuam nos processos inflamatórios (VAN GIL’s et al., 2009). O

aumento da ativação plaquetária já foi descrito em pacientes com AF (TOMER, et al, 2001

e WUN, et al, 1999, 1998), e este aumento contribui para o desequilíbrio hemostático

destes pacientes (VILLAGRA, et al, 2007). O mecanismo e a via de sinalização

responsável por este aumento ainda não estão bem esclarecidos, mas alguns trabalhos

propuseram que esta ativação é resultado de processos pró-inflamatórios e pró-trombóticos,

característicos da micro-circulação da doença (SETTY, et al, 2001; BROWN, et al, 2001),

e também pelo estresse hematopoético da anemia e/ou hemólise intravascular (WUN et al,

1997). As plaquetas, quando ativadas, possuem alta capacidade inflamatória, pois podem