1) Comente sobre a aplicação industrial da biotecnologia?

A biotecnologia é a aplicação industrial de microrganismos e de sistemas biológicos na produção de bens e serviços. Aplicação da biotecnologia na indústria de alimentos.

Produção de pães, Iogurte, Queijos, Álcool e Vinagre.

Além da produção de bens de consumo, os microrganismos são também utilizados em processos de tratamento de resíduos e efluentes urbanos e industriais, na recuperação de metais, tais como cobre, chumbo e urânio, ou em processos de biorremediação de solos contaminados. Os principais produtos da Biotecnologia podem ser agrupados de acordo com o seu uso, em produtos da indústria farmacêutica (antibióticos, hormônios, vacinas, vitaminas e proteínas terapêuticas humanas), da indústria de alimentos (aminoácidos, flavorizantes, polissacarídeos e gomas xantana) e da indústria química (etanol, acetona, butanol, glicerol, ácido láctico, ácido cítrico, poliésteres, inseticidas microbianos).

2) Quais os principais microrganismos utilizados nos processos biotecnológicos?

Procarióticos: Bactérias.

Morfologia e estrutura das bactérias: Parede celular rígida: peptideoglicano

Exemplos: Bactérias acéticas, bactérias láticas e cianobactérias

Eucarióticos: Protistas (algas, fungos, protozoários e bolores)

Fungos e algas; Fungos: S. cerevisiae: bebidas alcoólicas.

3) Descreva o processo de propagação de um inoculo para dar início a um processo fermentativo.

Esta primeira etapa é conhecida como upstream. Esta etapa consiste na preparação do microrganismo com nutrientes adequados, conforme fonte de carbono, nitrogênio e oxigênio para o crescimento do MO.

Nesta etapa o mosto é preparado tem-se o ajuste do °BRIX, é necessário colocar os nutrientes necessários para o MO, logo este irá iniciar o crescimento, mas é necessário ter o cuidado de colocar o nutrientes na quantidade correta, demais causa a morte do MO.

Curva de crescimento microbiano

Fase lag (A): esta fase de crescimento ocorre quando as células são transferidas de um meio para outro ou de um ambiente para outro. Esta é a fase de ajuste e representa o período necessário para adaptação das células ao novo ambiente. As células nesta fase aumentam no volume total em quase duas ou quatro vezes, mas não se dividem. Tais células estão sintetizando DNA, novas proteínas e enzimas, que são um pré-requisito para divisão.

Fase exponencial ou log (B): nesta fase, as células estão se dividindo a uma taxa geométrica constante até atingir um máximo de crescimento. Os componentes

celulares como RNA, proteínas, peso seco e polímeros da parede celular estão também aumentando a uma taxa constante. Como as células na fase exponencial estão se dividindo a uma taxa máxima, elas são muito menores em diâmetro que as células na fase Lag. A fase de crescimento exponencial normalmente chega ao final devido à depleção de nutrientes essenciais, diminuição de oxigênio em cultura aeróbia ou acúmulo de produtos tóxicos.

Fase estacionária (C): durante esta fase, há rápido decréscimo na taxa de divisão celular. Eventualmente, o número total de células em divisão será igual ao número de células mortas, resultando na verdadeira população celular estacionária. A energia necessária para manter as células na fase estacionária é denominada energia de manutenção e é obtida a partir da degradação de produtos de armazenamento celular, ou seja, glicogênio, amido e lipídeos.

Fase de morte ou declínio (D): quando as condições se tornam fortemente impróprias para o crescimento, as células se reproduzem mais lentamente e as células mortas aumentam em números elevados. Nesta fase o meio se encontra deficiente em nutrientes e rico em toxinas produzidas pelos próprios micro-organismos.

4) O que é cultura pura?

Quando microrganismos crescem em meios de laboratórios, dá-se a eles o nome de culturas.

Cultura pura: condição artificial, obtida em laboratório, onde apenas uma espécie esta se multiplicando no meio de cultura. Obtida após uma sequência de procedimentos laboratoriais.

5) Faça o fluxograma de um processo fermentativo industrial genérico e explique todas as fases.

A fermentação é a etapa principal e envolve grande necessidade de controle de todos os fatores que influenciam a qualidade do vinho, controlando a temperatura, a pressão, se as bactérias que realizam a fermentação são adequadas, a correta quantidade delas e se estão devidamente alimentadas; além disso, a higiene do material que recebe o mosto de uvas deve ser estritamente verificada;

A temperatura deve estar sempre de acordo com os padrões de crescimento das bactérias, pois uma temperatura muito alta ou baixa pode acelerar o crescimento da população de leveduras em quantias indesejáveis ou até matar as bactérias já existentes.

A maioria das leveduras normalmente utilizadas se desenvolvem bem em temperaturas de 25º, mas acima dos 30º as bactérias podem morrer. Geralmente um termostato controla a temperatura automaticamente.

À medida que o processo ocorre, os açúcares da uva são convertidos em álcool, e há variação na densidade e na temperatura, ficando mais leve e diminuindo sua temperatura.

Antes da fermentação tem a preparação do inoculo onde é fornecido uma quantidade pequena de glicose para a levedura para que ela cresça, esse processo também é conhecido como pé de cuba.

Em paralelo é feito o preparo do mosto, no caso o suco de uva, este mosto é medido o ° BRIX e se necessário é feito a chaptalização.

Estas duas etapas, preparação do inoculo e do mosto são conhecidas como upstream. Após o mosto e o pé de cuba são misturados em um fermentador (Dorna).

6) O que são operações de ‘’upstream’’ e ‘’downstream’’? Exemplifique.

Upstream – envolve as etapas antes do processo fermentativo, no caso é o preparo no inoculo (pé de cuba) e o preparo do mosto.

Downstream – envolve as etapas posteriores do processo fermentativo, separação do produto e purificação.

O grau de purificação depende do destino do produto, no caso do produto for para uso farmacêutico, exige uma purificação de alta resolução.

downstream

upstream

7) Diferencie micro-organismos autotróficos e heterotróficos quanto aos processos de obtenção de energia?

8) Quais os macro e micronutrientes utilizados no cultivo de MO?

Componentes básicos:

MACRONUTRIENTES: Fonte de carbono, nitrogênio, oxigênio e fósforo.

Fonte de carbono orgânica: glicose, frutose, amido.Fonte de carbono inorgânico: CO2

Fonte de nitrogênio orgânico: Cevada, farinha de aveia.Fonte de nitrogênio inorgânico: NO2 e NO3.

MICRONUTRIENTES: K, Ca, Fe, Mn, Mg, Zn, Cl, Co, Cu, Mb e Se.

Nutrição dos microrganismos• Os microrganismos necessitam de um ambiente propício com todos os constituintes físicos e químicos necessários para seu crescimento.

• As substâncias ou elementos retirados do ambiente são utilizados como blocos para a construção da célula.Requeridos em grande quantidades.

Requeridos em pequenas quantidades.

9) Diferencie subtratos diretamente fermentescíveis de substratos indiretamente fermentescíveis. Exemplifique e indique formas de disponibilizar as matérias-primas ricas em amido e celulose para o micro-organismo utilizar como fonte de energia.

O amido e a celulose são ambos polímeros de carboidratos, e para obtermos quebrarmos este polímero e obtermos a glicose é necessário fazer uma hidrólise. Os amidos podem ser hidrolisados por via química (ácidos, calor e pressão) ou por via enzimática. A celulose é hidrolisada por via ácida e enzimática.

10) Como podem ser classificados os processos fermentativos quanto à condução dos processos? Compare os tipos de processos apresentando vantagens e desvantagens.

Formas de condução de um processo fermentativo.

Descontínuo

Com um inóculo por tanque. Com recirculação de células.

Descontínuo alimentado

Sem recirculação de células. Com recirculação de células.

Semi-contínuo

o Sem recirculação de células.o Com recirculação de células.

Contínuo

Fermentação descontínua ou fermentação em batelada;

Processo fermentativo caracterizado pela inoculação e incubação de microrganismos, de tal forma, a permitir que a fermentação ocorra sob condições ótimas. Neste tipo de produção, nada é adicionado, exceto oxigênio (processo aeróbio), ácido ou base (controle de pH) ou antiespumante.

Descontínuo simples – “batelada” - Sem recirculação de células

Vantagens:

-Fácil operação;

-Menor risco de contaminação;

-Construção e instrumentação simples e barata;

-Processo adequado para curtos períodos de tempo;

-Versatilidade de usos;

Desvantagens:

-Esgotamento do meio de cultivo e acúmulo de compostos tóxicos ou degradação do produto;

-Menor produtividade volumétrica;

-Preparo do reator entre uma batelada e outra reduz tempo útil e aumenta custos.

Descontínuo com recirculação de células

Há o reaproveitamento como inóculo, o microrganismo da batelada anterior (comum em destilarias de álcool):

• Sedimentação no fermentador (cervejarias)

• Centrifugação do meio fermentado Tendência em aumentar o número de contaminantes a cada nova batelada Leite de lêvedo (suspensão altamente concentrada) com água e ácido sulfúrico 2 a 3 h sob agitação: elimina contaminantes e células que já se apresentem em fase de degeneração.

Processo Semicontínuo sem recírculos de células.

Semicontínuo com recirculação de células

Quando o meio é retirado do fermentador na operação 2, pode-se centrifugá-lo e reaproveitar as células adicionando-as junto ao novo meio na operação 3.

Semicontínuo – Vantagens: a)Possibilidade de operar o biorreator por longos períodos de tempo (meses) sem que seja necessário preparar um novo inóculo;

b)Possibilidade de, uma vez conhecidas as melhores condições de operação, conseguir produtividade significativamente maior do que a obtida em processo descontínuo

Descontínuo alimentado – Batelada alimentada (fed-batch)

Fermentação descontínua continuamente alimentada com nutrientes

Vantagens: -Controle de oferta de substratos às células:

1)Permite alta concentração de substratos indutores;

2)Impede o efeito de repressão catabólica (presença de alta concentração de substrato inibe a síntese de compostos de interesse – ocorre muito com enzimas e antibióticos);

3)Mantém baixa concentração de substratos inibitórios para formação de produto (ácido cítrico) -Permite obtenção de alta concentração celular

Desvantagens:

-Maior risco de contaminação

-Maior necessidade de controle do processo (adição nutrientes)

Contínuo

Bioprocessos Mais utilizados em bancada para desenvolvimento de processos, não são muito usados industrialmente. São mais usados no tratamento de resíduos onde não há preocupação com contaminação !

Contínuo

Vantagens

- Maior produtividade volumétrica

- Controle da velocidade de crescimento e manutenção da atividade metabólica celular por longos períodos de tempo;

- Menor perda de tempo útil.

11) Como podem ser classificados os processos fermentativos em estado sólido e submerso? Apresente características de cada um.

Classificação referente ao modo de cultivo (quantidade de água no meio).

Biorreatores para fermentação submersa e fermentação semi-sólida.

Fermentação submersa;

MO é introduzido em um meio sólido na forma de inoculo Utiliza meio fermentativo líquido, com nutrientes solúveis. Fermentadores com controle de agitação e aeração, medidores de pH, T e

concentração de oxigênio dissolvido.

Fermentação semi sólida; aproveitamento de resíduos.

Cultura de MO sobre ou dentro de partículas em matriz sólida, onde o conteúdo de líquido ligado a ela está a um nível de atividade de água que assegure o crescimento e metabolismo das células e não exceda a máxima capacidade de ligação da água com a matriz sólida.

O termo fermentação em estado sólido, ou fermentação semi-sólida, ou fermentação em meio semi-sólido aplica-se ao processo de crescimento de microrganismos sobre substratos sólidos sem a presença de água livre. A água presente nesses sistemas encontra-se ligada à fase sólida, formando uma fina camada na superfície das partículas (Raimbault, 1998).

A FSS, também, apresenta as seguintes características:

• A fase sólida atua como fonte de carbono, nitrogênio e demais componentes, além de servir como suporte para o crescimento das células microbianas.

• O ar, necessário ao desenvolvimento microbiano, deve atravessar os espaços vazios do meio a pressões relativamente baixas. O substrato não deve apresentar aglomeração das suas partículas individuais.

• O crescimento microbiano ocorre em condições mais próximas às dos habitats naturais.

• O meio apresenta alta heterogeneidade e os substratos não estão completamente acessíveis ao microrganismo

12) Que biorreatores são mais utilizados para a fermentação em estado sólido e submerso? Apresente características de cada um.

Reatores em fase aquosa (fermentação submersa);

Células/ enzimas livres;

Reatores agitados mecanicamente (STR – “Stirred tank reactor) ou reatores de mistura.

Reatores agitados pneumaticamente.

Coluna de bolhas. Reatores “air lift’’.

Reatores de fluxo pistonado.

Reatores agitados mecanimente: agitação mecânica favorece a homogeneização, suspensão de sólidos, dispersão gás-líquido aeração e a transferência de calor e massa.

Reatores agitados pneumaticamente:

Air-lift: Possui duas regiões de escoamento, uma para cima e uma para baixo, estes canais possibilitam a circulação de líquido em grande escala em torno do reator. Aplicação delicada em função da ampliação de escala é mais flexível às mudanças de processo que o STR, mas ele reduz o perigo de contaminação, facilita a limpeza e esterilização porque não tem partes mecânicas móveis.

Biorreatores coluna de ar/bolha;

Ponto de vista construtivo – mais simples cilindro com fundo e tampas abauladas serpentinas de resfriamento internas ou externas entrada de ar pelo fundo.

Exemplo de aplicação: produção de ácido cítrico até antibióticos.

Reatores de fluxo pistonado O fluxo é contínuo e o tempo dentro do reator é curto, por isso é utilizado para reações rápidas.

Altas vazões são empregadas.

Células imobilizadas em suportes.

Usam a estrutura física de confinamento, obrigando as células a permanecerem em uma região particular do biorreator.

Reatores com menor tamanho quando comparado com reator com enzima livre.

Tipos de biorreatores;

Reatores com leito fixo (Reator de leito recheado); impede a movimentação relativa das partículas, células ou enzimas imobilizadas. É um tubo vertical empacotado com partículas de um biocatalizador.

Reatores com leito fluidizado: movimentação intensa de partículas, fluidização por injeção de ar ou recirculação de líquido no interior do reator.

Vantagens:

Alta taxa de transferência e homogeneização;

Baixo atrito;

Não há problemas de entupimento

Boa produtividade volumétrica;

FERMENTAÇÃO SEMI SÓLIDA OU F. EM ESTADO SÓLIDO;

Reatores em fase não aquosa;

Reatores estáticos ( com bandejas);

Reatores com agitação ( tambor rotativo);

Reatores com leito fixo;

Reatores com leito fluiidizado;

Reatores com bandejas; são bastantes limitados no que se refere a condições de transferência de oxigênio e controle de condições ambientais do processo.

Reatores com agitação ( Tambor rotativo);

O reator tipo tambor rotativo apresenta uma melhor transferência de oxigênio e homogeneização do meio através de agitação.

13) Quais as vantagens e desvantagens da fermentação em estado sólido?

Vantagens DesvantagensAceleração taxa reação Dificuldade de dissipar calorVolume reator menor Dificuldade de ampliação de escalaAeração acessível ao MO Maior gasto energético para agitaçãoProduto final concentrado Dificuldade para controle de processoAgitação leve Grande quantidade de inoculoCustos menores Dificuldade de coleta de amostraSubstrato simples Uso limitado de MORecuperação do produto Controle de Temperatura é crítico Menor produção de resíduos Pré tratamento do substrato.

14) Diferencie biorreatores agitados mecanicamente e pneumaticamente?

O Reator Air-lift ( agitado pneumaticamente) é mais flexível às mudanças de processo que o STR.

Pneumaticamente o risco de contaminação é menor, pois a limpeza é facilitada, porque não tem partes mecânicas móveis.

Agitação pneumaticamente – realizado por meio de adição de ar.

Agitação mecanicamente – Auxílio de pás.

15) Qual é a fase da curva de crescimento microbiano em que deve ser realizada a transferência de um biorreator para o outro, durante o preparo do inoculo?Explique essa fase.