Mtodos de Purificao de Baixa Resoluo Precipitao Separao por
membranas Extrao em sistemas de duas fases lquidas
Slide 2
Processos de Separao por Membranas Os processos mais empregados
para purificao de bioprodutos so os que utilizam a diferena de
presso como fora motriz; Em razo da natureza e do tipo de solutos e
da presena ou no de partculas em suspenso, existem diferentes
membranas com diferentes tamanhos e distribuio de poros
caracterizando 4 processos: Microfiltrao; Ultrafiltrao;
Nanofiltrao. Osmove inversa.
Slide 3
Principais caractersticas dos processos que utilizam diferena
de presso como fora motriz
Slide 4
Faixas de tamanho de poros das membranas
Slide 5
Slide 6
Microfiltrao similar a uma filtrao clssica que utiliza
membranas sintticas como barreira seletiva Emprega membranas
microporosas, isotrpicas ou anisotrpicas, com tamanho de poros
entre 0,05 a 5 m empregada para reter partculas em suspenso, tanto
no ar quanto em misturas aquosas So membranas totalmente permeveis
aos compostos solveis, independentemente do valor de suas massas
molares Aplicao: filtrao estril, tanto de lquidos quanto de
gases
Slide 7
Ultrafiltrao Emprega membranas microporosas anisotrpicas, com
dimetros de poros entre 1 e 500 nm. Capaz de reter macromolculas em
soluo, e permevel a todos os solutos de baixa massa molar Bastante
utilizada na purificao quanto na concentrao de protenas e
enzimas
Slide 8
Osmose Inversa Utiliza membranas anisotrpicas densas, portanto,
so permeveis apenas ao solvente, em geral, gua, retendo,
praticamente, todas as molculas solveis e materiais em suspenso;
Alta presso faz a gua atravessar a membrana no sentido da soluo
mais concentrada para a menos concentrada.
Slide 9
Mtodos de Purificao de Baixa Resoluo Precipitao Separao por
membranas Extrao em sistemas de duas fases lquidas
Slide 10
Extrao em sistemas de duas fases aquosas Utilizada na purificao
de antibiticos e cidos orgnicos; Consiste na separao da
molcula-alvo e impurezas baseada em suas diferentes solubilidades
nas fases lquidas
Slide 11
Sistemas de duas fases aquosas so formados pela reunio de
determinados polmeros, polieletrlitos, ou polmeros em combinao com
solutos de baixa massa molar formando quatro grupos: 2 polmeros
no-inicos. Polieletrlito e um polmero no-inico; 2 polieletrlitos
Polmero no-inico e um composto de baixa massa molecular Extrao em
sistemas de duas fases aquosas
Slide 12
Sistemas formados por polietilenoglicol e um sal so
intensamente empregados por apresentarem rpida separao das fases,
baixo custo e elevada seletividade na separao de molculas com base
na solubilidade Extrao em sistemas de duas fases aquosas
Slide 13
Duas solues aquosas imiscveis; Molcula-alvo P apresenta maior
solubilidade na fase de topo em relao fase de fundo; Maior grau de
pureza da molcula-alvo se os contaminantes apresentarem
solubilidade maior na fase de fundo
Slide 14
Diagrama de Equilbrio em sistemas de duas fases aquosas (SDFA)
Curva de equilbrio de um sistema PEG/fosfato Reta TMB: linha de
amarrao (tie-line)
Slide 15
Curvas de equilbrio do sistema PEG/fosfato de potssio em funo
dos parmetros massa molecular e pH do meio
Slide 16
Coeficiente de Partio (K) Grandeza adimensional que representa
a relao entre as concentraes da molcula de interesse na fase de
topo e na fase de fundo no equilbrio: K= C Ti C Fi C Ti =
Concentrao de soluto i na fase de topo (g/L); C Fi = Concentrao de
soluto i na fase de fundo (g/L); Utilizado para avaliao da extenso
das separaes nos sistemas de duas fases aquosas; Ocorrncia de
purificao: coeficientes distintos para a molcula de interesse e
para as demais molculas.
Slide 17
Fatores que influenciam no coeficiente de partio K Interaes
hidrofbicas Cargas superficiais / pH Diferena de potencial eltrico
entre as fases Efeito de salting-out da fase salina Diferenas de
viscosidade Diferenas de densidade Diagramas de fases (ex.:
concentrao de PEG e sal) Massa molecular da biomolcula
Slide 18
Mtodos de Purificao de alta resoluo: Cromatografia
Slide 19
Cromatografia Princpio Geral: Reteno e Liberao da molcula-alvo
A matriz slida capaz de reter a molcula por um determinado perodo
de tempo (tempo de reteno) Eluio do fluido e consequente separao da
molcula-alvo
Slide 20
Cromatografia
Slide 21
Slide 22
Cromatografia de excluso molecular Cromatografia de troca-inica
Cromatografia de interao hidrofbica Cromatografia de afinidade
Slide 23
Cromatografia de excluso molecular Processo: Os solutos de um
meio lquido (protenas, peptdeos, anticorpos) so adsorvidos ou
retidos em um leito de material poroso; As molculas sofrem partio
em virtude das diferenas no tamanho das espcies entre um solvente
(fase mvel) e uma fase estacionria de porosidade definida; A
posterior remoo gradual dos solutos por ao de uma fase lquida mvel
(eluente), resulta na separao das diferentes molculas
Slide 24
Cromatografia de excluso molecular A ordem de recuperao
seletiva das molculas no fluxo eluente tem incio com as maiores
molculas, prosseguindo em direo s menores. Separao por tamanho das
molculas
Slide 25
Cromatografia de excluso molecular Eluio de uma mistura de trs
protenas de massas moleculares diferentes em uma coluna de permeao
em gel, com a formao de faixas distintas medida que a amostra
permeia a coluna
Slide 26
Cromatografia de excluso molecular Aplicaes: Dessalinizao
Determinao de massas moleculares Determinao de tamanho de
poros
Slide 27
Baseia-se na afinidade que componentes de uma amostra tem com
os stios inicos em uma matriz slida, ou seja, existe uma competio
entre ons de interesse e contaminantes pelos grupos carregados da
matriz ou da fase estacionria. As resinas empregadas apresentam
elevada capacidade de adsoro de protenas A fase estacionria,
eletricamente carregada, tem a capacidade de reter solutos que esto
na fase mvel e apresentam cargas de sinais opostos Controle de pH e
fora inica Cromatografia de troca-inica
Slide 28
Matrizes de troca-inica: Trocadores aninicos: contm grupos
positivamente carregados e adsorvem protenas com carga lquida
negativa Trocadores catinicos: contm grupos negativamente
carregados e adsorvem protenas com carga lquida positiva Aps serem
adsorvidos matriz, os solutos podem ser eludos por deslocamento com
outros ons, com a mesma carga da protena adsorvida, porm com maior
fora de interao com a fase estacionria. Cromatografia de
troca-inica
Slide 29
Princpio bsico da cromatografia de troca inica Cromatografia de
troca-inica
Slide 30
Cromatografia de interao hidrofbica Baseia-se na reteno das
molculas pela interao da sua regio hidrofbica com a matriz A
protena colocada em meio com elevada concentrao de sal (expe a
regio hidrofbica, aumentando a interao com a matriz)
Slide 31
Cromatografia de interao hidrofbica Molcula de protena
Slide 32
Cromatografia de interao hidrofbica Modelos de adsoro a: modelo
uniponto; b e c: adsoro uniponto; d: foras hidrofbicas de
intensidades diferentes em razo das irregularidades na superfcie da
matriz.
Slide 33
Tcnica de separao altamente especfica que depende das interaes
entre os pares de materiais biolgico: enzima-substrato,
enzima-inibidor, antgeno-anticorpo. O ligante imobilizado em uma
matriz porosa Cromatografia de Afinidade
Slide 34
Purificao de alta resoluo Alta especificidade Separao de formas
ativas de formas desnaturadas
Slide 35
Purificao de alta resoluo Alta especificidade Separao de formas
nativas de formas desnaturadas
Slide 36
O complexo formado entre o ligante e a protena tem que ser
reversvel; A protena eluda e o ligante regenerado.
Slide 37
Cromatografia Ampliao de Escala Critrios: Manter os mesmos
graus de pureza, rendimento, atividade biolgica e, se possvel,
rendimento, alcanados em escala de bancada; Purificao de miligramas
a gramas de produto; Principal caracterstica: aumento do dimetro da
coluna e a manuteno constante da altura do leito cromatogrfico,
exceto para excluso molecular (ainda deve ser aumentado em 10 % a
altura do leito);
Slide 38
Parmetros que devem ser mantidos constantes: Volume da fase
estacionria; Grau de empacotamento; Altura do leito cromatogrfico;
Velocidade linear de alimentao (vazo volumtrica dividida pela rea
de corte transversal da coluna). Parmetros que devem ter o valor
aumentado: Dimetro da coluna; Fluxo volumtrico; Volume de amostra
Cromatografia Ampliao de Escala Colunas industriais Altura de leito
em torno de 30 cm e dimetro da ordem de 1 m. Maiores volumes de
colunas da ordem de 700 a 2000 L (ex.: purificao do soro de
queijo)