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Introduo microbiologia clnica e ao

tratamento das doenas infecciosas

Eurico de Aguiar

2009

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Dedicatria

Aos meus pais, Jefferson e Iracema, que foram fundamentais para que pudesse me tornar o cidado que sou.

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Currculo resumido

Eurico de Aguiar mdico e especialista em Patologia Clnica pelo Conselho Federal de Medicina.

Ex-estagirio da Seo de Vrus do Instituto Evandro Chagas, Belm, Par. Especialista em Percia Mdica pela Fundao Unimed/Universidade Gama Filho. Ps-graduado em Microbiologia Clnica e Sanitria pela Universidade de Sevilha,

Espanha. Responsvel pelo Setor de Bacteriologia do Laboratrio de Patologia Clnica do

Hospital Regional da Asa Sul, Braslia, Distrito Federal (1988-2007). Ex-coordenador de Patologia Clnica e ex-coordenador de Controle de Infeco

Hospitalar da Secretaria de Sade do Distrito Federal. Ex-presidente da Comisso Central de Controle de Infeco Hospitalar do Distrito

Federal. Docente fundador do Curso de Medicina da Escola Superior de Cincias da Sade

do Governo do Distrito Federal. Diretor da Coordenao de Laboratrio de Anlises Clnicas do Departamento

Mdico da Cmara dos Deputados (2002-2008).

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NDICE

Prefcio.................................................................................................................5

Coleta, transporte e semeadura de material ....................................................6

Exames diretos ..................................................................................................17

Meios de cultura ................................................................................................20

Identificao preliminar de culturas bacterianas e de fungos.......................22

Taxonomia microbiana .....................................................................................24

Identificao e teste de sensibilidade por equipamento automatizado ........26

Identificao manual dos microrganismos mais isolados ..............................32

Teste de sensibilidade manual ..........................................................................52

Resultados que merecem reavaliao .............................................................55

Avaliao da qualidade do ar interno ..............................................................56

Resistncia bacteriana .......................................................................................60

Principais grupos de antimicrobianos ..............................................................63

Consideraes importantes sobre alguns antimicrobianos ........................... 73

Princpios gerais de uso de antimicrobianos ...................................................76

Septicemia............................................................................................................82

Agentes antimicrobianos como incio de terapia emprica .............................89

Dosagens de alguns antimicrobianos de maior uso .........................................90

Bibliografia recomendada ..................................................................................92

Alguns links de maior interesse .........................................................................96

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Prefcio

Durante vrios anos procurei adotar uma metodologia que viesse facilitar o desenvolvimento dos trabalhos microbiolgicos em um laboratrio clnico. A bibliografia sobre o assunto extensa, complexa e aplica, muitas vezes, procedimentos no acessveis maioria dos laboratrios do nosso pas.

Preocupado com essa questo, procurei utilizar prticas que pudessem ser adotadas por diferentes tipos de condies de trabalho.

Reconheo que, ao menos em Braslia, as condies que dispomos nos laboratrios da rede pblica so bastante razoveis, se comparadas com outras cidades e regies do pas.

Trabalhamos com sistemas automatizados de realizao de hemoculturas, alm de sistemas automatizados de identificao e testes de sensibilidade bacteriana por microdiluio em caldo, com determinao de concentrao inibitria mnima.

Isso, no entanto, no impede que laboratrios com condies mais simples no possam tambm desenvolver um trabalho de qualidade.

De 1988 at 2007 trabalhei no Hospital Regional da Asa Sul, hospital pblico de nvel tercirio dotado de 360 leitos e de clientela constituda principalmente por gestantes e crianas.

Alm de responsvel pelo setor de microbiologia do laboratrio de patologia clnica, participei ainda como membro efetivo da comisso de controle de infeco hospitalar. possvel constatar que temos considervel aproximao com outras reas e especialidades, como as atividades desenvolvidas pelos infectologistas, assim como pelos clnicos e cirurgies que lidam com doenas infecciosas.

Em conseqncia, surgiu a idia de desenvolver um texto que tambm abordasse um pouco de um setor de tanta relevncia na prtica clnica e cirrgica e que tem interface com o nosso trabalho dirio, apesar de que, por muito tempo, os livros de texto separaram indevidamente as informaes relativas microbiologia das relativas s doenas infecciosas.

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Coleta, transporte e semeadura de material

Como em todo exame de laboratrio, as trs etapas do processo (pr, per e ps-analtico) so importantes para que o produto, ou seja o resultado do exame seja adequado e compatvel com as expectativas dos nossos clientes, mdicos e pacientes.

Para que a primeira etapa seja realizada de forma correta temos primeiramente de abordar a coleta, o transporte e a semeadura das amostras.

Passos principais a serem seguidos para uma adequada coleta de amostras para exame microbiolgico:

1. O material deve ser representativo do local da infeco, devendo-se evitar a contaminao com outras amostras de stios adjacentes.

2. Seguir os tempos timos estabelecidos para obter a maior chance de recuperao dos microrganismos envolvidos, especialmente em relao s hemoculturas e outros materiais de maior importncia clnica e diagnstica.

3. Entregar a amostra ao laboratrio no menor tempo possvel. O ideal um intervalo de, no mximo, 30 minutos entre a coleta e a semeadura da amostra.

4. Obter uma quantidade suficiente da amostra para poder realizar os testes solicitados pelo mdico assistente.

5. Utilizar sempre o material mais adequado para a coleta e semeadura de cada tipo de amostra.

6. Quando necessrio, utilizar o meio de transporte mais indicado para as espcies mais provveis de serem isoladas.

7. Obter as amostras, preferencialmente, antes do uso de antimicrobianos. 8. Exames diretos devem ser realizados juntamente com as culturas, para melhor

interpretao dos resultados. 9. Cada amostra deve ser sempre bem identificada. 10. O pessoal tcnico deve ser imeditamente informado da entrega da amostra.

Desenvolvimento:

Sempre que possvel devemos evitar a contaminao da amostra com a microbiota normal do organismo, de forma a assegurar que seja representativa da infeco.

Amostra colhida de um local com flora normal abundante (pele, membranas mucosas, fezes, etc.) pode interferir com a interpretao dos resultados de cultura e dificultar o encontro do agente responsvel pelo quadro clnico.

Devemos ainda colher a amostra do stio anatmico mais adequado para o tipo de infeco, usando a tcnica mais adequada e os meios apropriados, evitando-se a contaminao com a microbiota adjacente ao stio da infeco.

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Alm disso, a amostra deve ser colhida antes do incio da terapia antimicrobiana, j que se essa regra no for seguida h riscos de um resultado falso negativo provocado pela ao in vitro dos medicamentos.

Lembrar sempre das caractersticas biolgicas dos microrganismos mais provveis de serem isolados de acordo com a suspeita clnica e o quadro apresentado pelo paciente.

Assim se suspeitamos de uma infeco por anaerbios, deveremos colher a amostra em um recipiente adequado que atenda as condies de sobrevida dos germes envolvidos. Ou ainda quando h suspeita de um material conter bactrias do gnero Neisseria ou Haemophilus, que por no resistirem a baixas temperaturas e necessitarem de microaerofilia para se desenvolver, requerem cuidados especiais na hora de colher, transportar, semear e incubar.

Devemos lembrar tambm da importncia de se colher volumes adequados de cada amostra. Isso particularmente importante no caso das hemoculturas, em que a relao sangue/meio de cultura deve ser rigorosa.

O momento ideal da coleta tambm outro ponto importante de ser lembrado. Nunca esquecer a identificao correta de cada amostra e pedido mdico, que deve

incluir o nome do paciente, n da etiqueta, n do pronturio, unidade de internao, data e hora da coleta, exames solicitados, indicao clnica, doena de base, informaes sobre o uso de antimicrobianos e identificao legvel do mdico requisitante.

A amostra deve, sempre, ser coletada em um recipiente adequado, que alm de permitir a sobrevida dos micrbios, impea vazamentos ou contaminao da equipe de sade.

Cada material dever ser imediatamente encaminhado ao laboratrio para ser processado.

Consideraes sobre biossegurana:

-Toda amostra deve ser considerada como potencialmente patognica. -A equipe de sade deve utilizar equipamento de proteo individual adequado, como

luvas, mscara, culos de proteo e avental ou jaleco longo de mangas compridas. -Antes de manusear cada amostra verificar se h vazamentos ou respingos. Se houver,

fazer descontaminao com lcool a 70% ou outro germicida equivalente, como o hipoclorito de sdio a 0,5%.

-Evitar a formao de aerossis, especialmente ao trabalhar com semeadura de material. -Utilizar ainda equipamento de proteo coletiva como cabine de segurana biolgica,

chuveiro de emergncia, lava-olhos, extintor de incndio, microincinerador de ala metlica ou uso de ala estril descartvel.

-Trabalhar em cabine de segurana biolgica de risco biolgico de acordo com os agentes envolvidos no trabalho dirio.

-H quatro nveis de segurana biolgica. O laboratrio de microbiologia do HRAS trabalha com segurana de nvel 3, j que lida no s com os agentes patognicos de nvel moderado, como ainda com agentes causadores de infeces sistmicas mais graves e letais (como o M. tuberculosis). Todas as barreiras de proteo individual devem ser utilizadas e toda manipulao deve ser feita em cabine de segurana biolgica. O acesso ao laboratrio deve ser controlado, assim como deve haver um sistema de ventilao especial.

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-A cabine de segurana biolgica deve ser dotada de filtro HEPA(filtro com eficincia de 99,99% para partculas de at 0,3 micra de dimetro), e com abertura frontal, que protege o operador, o material e o meio ambiente.

-Dentro do laboratrio ser proibido guardar alimentos ou lquidos -como gua, sucos e refrigerantes-, fazer refeies ou aplicar cosmticos.

-No ser permitido o uso de pipetagem com a boca. -Estabelecer um plano de gerenciamento de resduos slidos, contemplando os passos

de gerao, segregao, acondicionamento, coleta, armazenamento, transporte, tratamento e descarte.

-Todo material contaminado deve ser descontaminado antes de ser descartado. -Ter um plano previamente estabelecido de como agir em casos de acidentes

envolvendo agentes infecciosos. -Limpar e desinfetar todas as superfcies de trabalho no incio e no trmino da jornada,

e sempre que houver risco de contaminao. -Lavar as mos imediatamente aps contato com alguma amostra, aps remover as

luvas e ao final do turno de trabalho. -Manter organizadas todas as reas de trabalho.

Critrios para rejeio de amostras consideradas inadequadas para cultura:

Qualquer amostra recebida em formol ou outro tipo de germicida. Coleta de escarro ou de urina de 24 horas. Amostras recebidas em recipientes apresentando vazamentos. Amostras recolhidas de sondas de Foley. Amostras recebidas em duplicata (exceto hemoculturas), em um perodo de 24 horas. Amostras de secreo uretral colhidas em swab de algodo (o algodo txico para o

gonococo). Amostras recebidas sem identificao adequada e/ou sem pedido mdico. Amostras de urina recebidas sem condies adequadas de transporte,ou seja, em recipiente

sem gelo

Coleta, transporte e semeadura de amostras para cultura:

Hemocultura:

O sangue deve ser coletado antes de se iniciar a terapia antimicrobiana. Se isso no for possvel, coletar a amostra imediatamente antes da prxima dose do antimicrobiano.

Fazer antissepsia do local da puno venosa, inicialmente com lcool a 70% e depois com soluo iodada a 1% (ou com soluo de clorohexidina), utilizando movimentos circulares de dentro para fora. Deixar secar a rea por 1 a 2 minutos, antes da puno. Aps a coleta, retirar a soluo de iodo com lcool a 70%, para evitar a irritao da pele.

As bacteremias podem ser transitrias (durante um procedimento cirrgico; presena de infeco grave como meningite, pneumonia, osteomielite, etc.), intermitentes

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(presena de abscesso no drenado) e contnuas (endocardite bacteriana, infeco associada a cateter, septicemia, etc.). Ao menos duas hemoculturas, devem ser colhidas em um espao de 24 horas, com um intervalo de 30 a 60 minutos entre elas. Com isso mais de 90% dos episdios bacteriemicos costumam ser detectados.

O volume de sangue recolhido deve ser de 1/10 do volume do frasco, no sentido de minimizar a ao de fatores do hospedeiro que podem afetar o resultado dos exames (anticorpos, complemento, leuccitos,etc.). Para adultos colhe-se em torno de 20 ml de sangue por dia, e para crianas entre 1 e 5 ml. Logo aps a coleta, os frascos de hemocultura devero invertidos 2 a 3 vezes para uma adequada homogenizao e em seguida encaminhados ao laboratrio, para serem colocados em estufa a 35C.

Nunca colocar os frascos de hemocultura em geladeira, porque isso poder impedir o crescimento de bactrias como as Neisserias e os Haemophilus. A coleta de mais de um frasco tambm til para a interpretao dos resultados das culturas. Bactrias consideradas geralmente como contaminantes (S. epidermidis, S. viridans, espcies do gnero Corynebacterium, do gnero Bacillus e do gnero Propionibacterium) podem ser valorizadas se forem isoladas em mais de uma amostra de um mesmo paciente.

O nmero mximo aceitvel de frascos de at 4 por dia para um mesmo paciente, mas como o custo desse material elevado, deve-se procurar evitar a solicitao desse tipo de pedidos sempre que possvel.

No se deve colher amostras a partir de um cateter intravascular porque essa prtica aumenta o nmero de isolamentos de bactrias presumidamente contaminantes.

O HRAS utiliza um equipamento automatizado para a realizao de hemoculturas (Bact-Alert) que se baseia na deteco colorimtrica de CO2 produzido pelo metabolismo microbiano. A estufa possui ainda movimento de rotao dos frascos. A cada 10 minutos o equipamento faz uma leitura de todos os frascos. Se em algum deles tiver havido crescimento suficiente para mudana de cor do fundo do frasco, o aparelho emite um sinal sonoro e seu monitor alerta para a existncia de um recipiente com crescimento microbiano. Cada frasco costuma se positivar geralmente em 24 a 48 horas de incubao, exceto nos casos de crescimento de leveduras ou bactrias anaerbicas onde esse tempo pode ser mais elevado.

Durante o ano de 2006 o laboratrio recebeu 1976 frascos de hemoculturas de pacientes oriundos, principalmente, do Berario, UTI neonatal, UTI Peditrica e Cirurgia Peditrica.

Dessas 314 foram positivas (15,9% do total), sendo 195 (62,1%) constituda pelo grupo dos cocos gram positivos, 82 (26,1%) pelo dos bacilos gram negativos, 32 (10,2%) por leveduras e o restante por bactrias fastidiosas (H. influenzae e N. meningitidis) e bacilos gram positivos(Corynebacterium spp.).

Entre os cocos gram positivos houve predomnio de estafilococos coagulase negativos(65,6% do grupo), especialmente o S. epidermidis, sendo a maioria resistente oxacilina.

A caracterstica maior dessas cepas a grande produo de uma substncia mucide que, ao infectar implantes biomdicos como cateteres intravasculares, aumenta consideravelmente de seu potencial patognico.

Entre os bacilos gram negativos predominaram as cepas de Klebsiella pneumoniae e Serratia marcescens(68,3% do grupo).

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Entre as leveduras a espcie mais isolada foi a Candida guillermondii(43,7% do grupo).

Ao longo dos anos, tem-se verificado um aumento gradual na incidncia de hemoculturas positivas com isolamento de leveduras, o que pode estar relacionado a diversos fatores, como maior tempo de internao dos pacientes imunodeprimidos, uso maior de associaes de antibiticos, maior nascimentos de prematuros, maior utlizao de procedimentos de risco, uso mais elevado de nutrio parenteral, entre outros.

LCR:

O LCR coletado geralmente por meio de puno lombar, entre L3 e L4, aps prvia antissepsia do local a ser puncionado. O material recolhido em dois frascos estreis e imediatamente semeado em meio de agar chocolate. Deve ser em seguida encaminhado ao laboratrio. Lembrar ainda que no se deve manter esses materiais em geladeira ou a baixas temperaturas, por afetar bactrias como o meningococo e o Haemophilus influenzae, comumente envolvidas em quadros de meningite bacteriana.

No laboratrio ser feita bacterioscopia e pesquisa de antgeno bacteriano quando a bacterioscopia for sugestiva de meningite (glicose baixa, proteina elevada, aumento de polimorfonucleares, etc.). Nos casos de suspeita de infeco por micobactria ou por fungos (Cryptococcus neoformans) poder ser feita uma pesquisa de BAAR ou de leveduras (mtodo da tinta nanquim), aps prvia centrifugao do material (3000 rpm por 30 minutos), desprezando o sobrenadante e utilizando apenas o sedimento para a anlise.

Lquidos orgnicos:

Materiais nobres como liquido pleural, lquido peritoneal, liquido pericardico, lquido sinovial e liquido asctico devem ser colhidos, aps antissepsia prvia, por aspirao de seringa com agulha em um volume de 5 a 10 ml.

Aps entrega imediata ao laboratrio, o material deve ser utilizado parte para a inoculao dos meios de cultura e parte para a realizao de exames diretos.

Alm do uso de meios tradicionais como o agar sangue, agar MacConkey e o agar chocolate, pode-se inocular parte do material em um frasco normalmente utilizado para hemocultura, que ser depois incubado.

Para os exames diretos recomenda-se (nos casos de material fluido) centrifugao da amostra (3000 rpm por 30 minutos), sendo descartado o sobrenadante e o esfregao realizado a partir do sedimento. Poder ser feito Gram, Zihel e pesquisa de fungos, de acordo com o pedido mdico e a suspeita clnica.

Secrees do trato respiratrio:

a)secreo de nasofaringe nos casos de suspeita de coqueluche, colher o material com swab (previamente umedecido em gua ou salina estril) e inocular logo em seguida em meio de Regan-Lowe agar (composto de agar carvo com 10% de sangue de cavalo, alm de cefalexina) e depois incubar em estufa. Nos casos de pesquisa de portadores de S. aureus (como MRSA), colher o material com swab e semear em agar manitol sal. A

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secreo de nasofaringe no indicada para a pesquisa de agente etiolgico de sinusite bacteriana.

b)Secreo de orofaringe colher a amostra com o uso de um abaixador de lngua e de um swab. Introduzir o swab entre os pilares das amigdalas e atrs da vula, sem tocar a lngua e as bochechas. Procurar colher o material das reas de hiperemia, prximas aos pontos de supurao. Para a pesquisa de Streptococcus beta-hemoltico do grupo A (S. pyogenes) devemos semear o material em um meio seletivo, onde a chance de isolamento dessa bactria maior, como em agar sangue com trimetoprim e em caldo Todd-Hewitt. Nos casos de suspeita de epiglotite, em que o agente costuma ser o H. influenzae, devemos semear o material em agar chocolate suplementado (com fatores V e X) ou usando a tcnica do satelitismo, com uma estria de estafilococo (com as placas incubadas em atmosfera de 5% de CO2). Nos casos de suspeita de difteria colher o material a partir da placa suspeita, e fazer duas lminas. Uma para a colorao de Gram e a outra para a de Lffler (azul de metileno), em que se procura visualizar granulaes metacromticas de espcies de Corynebacterium.

c)Escarro, lavado broncoalveolar e aspirado traqueal o escarro (que no considerado um material ideal em casos de pneumonia) deve ser colhido pela manh, aps uma tosse profunda, antes de se alimentar e aps lavar a boca com gua. Uma maneira de avaliarmos se a amostra foi adequadamente colhida relao de polimorfonucleares e clulas epiteliais, em campo de 400x. Mais de 10 polimorfonucleares/campo e menos de 10 clulas epiteliais/campo a relao esperada nesses casos. As bactrias que se procura isolar a partir do escarro dependem do tipo de paciente. Se a infeco for comunitria procuramos isolar o Streptococcus pneumoniae, o Staphylococcus aureus e o Haemophilus influenzae, principalmente. J se for de origem hospitalar, so as enterobactrias (Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, etc.) e os bacilos gram negativos no fermentadores (Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., etc.) os mais envolvidos com essas infeces. Em conseqncia deveremos semear esses materiais em agar sangue, agar chocolate, agar MacConkey e em um caldo como o tioglicolato ou o tripticase soja. O aspirado traqueal obtido em pacientes intubados, atravs da sonda de aspirao. Os resultados podem refletir apenas colonizao, sendo sua interpretao, muitas vezes, difcil. No caso de lavado broncoalveolar (considerado o mtodo mais adequado para investigao microbiolgica do trato respiratrio inferior) necessria a realizao de contagem de colonias (usando a tcnica da ala calibrada de 0,01 ml onde o n de colonias encontradas na placa de agar sangue deve ser multiplicado por 100). Em consequncia, o tempo entre a coleta da amostra e a semeadura do material deve ser mnimo (at 30 minutos). A presena de mais de 10 mil UFC/ml de uma determinada espcie sugestiva de ter significado clnico.

Urina: Pelo menos quatro tipos de amostras de urina podem ser coletadas para cultura. Em se tratando de neonatos ou crianas de baixa idade pode-se utilizar a puno suprapbica. Este procedimento requer que a bexiga esteja cheia e que antes se faa uma antissepsia da pele. A bexiga puncionada acima da snfese pubiana e cerca de 5 a 10 ml

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de urina so coletados. A amostra deve ser imediatamente encaminhada ao laboratrio e logo em seguida semeada nos meios convencionais (agar sangue e agar MacConkey).Aqui qualquer contagem de colnias significativa, portanto devemos utilizar nesses casos uma ala calibrada de at 0,1 ml. Em crianas maiores, mas ainda sem controle esfincteriano, pode-se utilizar saco coletor. Deve ser feita uma prvia higienizao do perneo, coxas e ndegas com gua e sabo neutro. Caso no haja mico, o saco coletor dever ser trocado a cada 30 minutos, repetindo-se a higienizao do perneo.

No caso de adultos o procedimento mais utilizado a coleta do jato mdio de urina. A mulher deve proceder a uma higiene da rea uretral e perneo com gua e sabo, com gaze estril. Em seguida deve secar a rea lavada com uma gaze seca. Afastar os grandes lbios e em seguida desprezar o primeiro jato de urina (de preferncia da 1 urina da manh)e colher o jato mdio dentro de um recipiente estril de boca larga, sem encher demasiadamente o recipiente (cerca de metade do volume do frasco), sendo desprezado o jato final . Em seguida fechar o frasco hermeticamente e conservar em gelo at a entrega ao laboratrio. Nos casos em que essa entrega no puder ser imediata, a urina pode ser mantida em geladeira (2 a 8C) por at 24 horas. Nos casos de pacientes masculinos a recomendao de que lavem a glande com gua e sabo, e recolham a pele do prepcio antes de urinar. Colher o jato mdio e desprezar o jato final de urina.

No caso de paciente em uso de cateter a recomendao que se puncione a cnula do coletor, aps prvia desinfeco com lcool a 70%. Com seringa e agulha puncionar a cnula e aspirar at 10 ml de urina, transferir em seguida para um frasco esterilizado e encaminhar ao laboratrio. Este material no considerado o mais adequado devido aos riscos de contaminao, porm em casos excepcionais tambm poder ser utilizado. Nunca utilizar urina colhida a partir do saco coletor de paciente cateterizado.

Com relao contagem de colnias, os critrios de Kass, elaborados em 1956, j no so to verdadeiros hoje em dia. Como exemplo, podemos citar o caso da sndrome uretral aguda, em que mulheres com vida sexual ativa podem desenvolver infeco urinria com contagens to baixas como 100 a 10 mil UFC/ml. Um dos motivos para a existncia de infeco com esse nmero baixo de micrbios pode ser o aumento do nmero de mices induzido pela infeco ou o aumento da ingesto de lquidos que leva diluio da amostra de urina. Nesses casos fundamental que o mdico indique a possibilidade desse evento - sndrome uretral aguda - para que o laboratrio possa dar valor a contagens to baixas quanto essas.

Trato genital:

a)feminino a secreo vaginal pode ser um excelente material para a realizao de exame direto, realizado logo aps a coleta da amostra. Primeiro a suspenso de um material recm-colhido feita com cerca de 1 ml de salina estril. Aps agitao uma gota colocada entre lmina e lamnula e com outra parte feito esfregao para colorao de Gram e Giemsa. Com esses trs exames podemos fazer diagnsticos variados, como nas vaginoses, causadas por agentes diversos como a Gardnerella vaginalis (com a presena das clue cells, ou seja clulas epiteliais recobertas de flora cocobacilar), a Candida albicans (presena de leveduras e pseudo-hifas) e o Trichomonas vaginalis (onde o exame direto permite verificar o movimento e a forma do protozorio). No caso de material

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para diagnstico de cervicite por gonococo, a amostra deve ser colhida com swab introduzido 1 a 2 cm no canal endocervical e em seguida feita rotao por alguns segundos. Retirar o swab sem tocar a superfcie da vagina. Colocar o swab em meio de transporte, ou preferencialmente semear diretamente em meio de Thayer-Martin, depois levar ao laboratrio e incubar em estufa com atmosfera de 5% de CO2.

b)Masculino para a pesquisa de gonococo pode-se usar tanto a secreo uretral como o 1 jato de urina. No caso de haver secreo colhida, de preferncia, pela manh, antes de urinar - o swab inserido 2 a 4 cm no interior da uretra e feita uma rotao. Em seguida o material colocado em meio de transporte (meio de Stuart) e semeado da mesma forma que em pacientes do sexo feminino. Em homens a bacterioscopia da secreo uretral pode ser diagnstica, por meio da deteco de diplococos gram negativos intracelulares. Nos casos de ulcera onde se for pesquisar o Haemophilus ducrey, deve-se coletar o material da base da ulcera. Ao Gram vamos encontrar bacilos gram negativos pleomrficos e cocobacilos em cadeias.

Cateter:

O cateter (perifrico, central, arterial, Swan-Ganz, etc.) deve ser retirado do paciente com os mesmos cuidados de antissepsia da pele que precederam a sua colocao, para se evitar a sua contaminao com a microbiota da pele. Aps remoo do cateter com tcnica assptica, cortar os 5 cm da ponta onde estava inserida a veia do paciente, e em seguida coloc-la em um frasco estril e encaminh-lo imediatamente ao laboratrio.

Com a ajuda de uma pina rolar o cateter sobre a superfcie de uma placa mdia de Agar sangue e em seguida coloc-lo em um tubo com caldo (tioglicolato, tripticase soja, etc.). Incubar a placa e o tubo por at 48 horas. Fazer a contagem de colnias na placa de Agar sangue. Segundo a tcnica de Maki, devem ser valorizadas as contagens de colnias iguais ou maiores do que 15 UFC/placa. Se no houver crescimento na placa e houver crescimento no caldo, devemos repicar o caldo para novo Agar sangue e Agar MacConkey, para a identificao desses microrganismos. importante ressaltar que mesmo sem haver isolamento na placa (ou com contagens consideradas baixas) pudemos verificar que havia resultados significativos, ao isolarmos bactrias que normalmente no seriam valorizadas. Um dos motivos para isso poderia ser a existncia de bactrias apenas no interior do cateter e que a simples rolagem no permitiria o seu isolamento.

Fezes:

A amostra utilizada pode ser 1 a 2 g de fezes ou swab retal. De preferncia o material deve ser colhido e imediatamente encaminhado ao laboratrio. Algumas bactrias, como as espcies de Shigella, resistem pouco a variaes bruscas de pH e por esse motivo as amostras devem ser colhidas em meio tamponado (tampo fosfato 0,03M com igual volume de glicerol) ou meio de transporte, como o Cary-Blair. A bacterioscopia das fezes pode auxiliar para a pesquisa do provvel agente causador do quadro diarrico

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(estafilococos, leveduras, etc.). As bactrias habitualmente pesquisadas so a Salmonella, Shigella, E. coli (enteropatogenica, enteroinvasora, etc.), Yersinia enterocoltica e o Campylobacter (pequenos bacilos gram negativos curvos ou em forma de asa de gaivota).

As espcies de Aeromonas (A. hydrophila e A. caviae) e a Plesiomonas shigelloides(bacilos gram negativos oxidase positivos) e a E. coli entero-hemorrgica (O157: H7) so espcies mais raras de serem isoladas, mas que devem ser pesquisadas quando houver indicao clnica. Por exemplo, nos casos de suspeita de sndrome hemoltico uremica, causada pela E. coli O157:H7, devemos procurar utilizar o meio de Agar MacConkey sorbitol (ou procurar identificar cepas de E. coli que no utililizam o sorbitol). Esse meio pode tornar-se ainda mais seletivo se acrescentarmos cefixime e telurito de potssio. A sndrome hemoltico-uremica se caracteriza por um quadro de anemia hemoltica, insuficincia renal aguda e trombocitopenia. A ingesto de hamburgers contaminados tem sido a causa mais comum de eventuais surtos, apesar de outras fontes de contaminao terem sido descritas. J a Aeromonas costuma ser mais facilmente isolada usando meio seletivo como o agar sangue com ampicilina (20 mcg/ml) e ainda o CIN agar, que tambm aumenta a possibilidade de isolamento de Yersinia.

Nos casos de suspeita de clera o material dever ser enviado em meio tamponado para o laboratrio central de sade pblica, onde ser feita a pesquisa do Vibrio cholerae, ou se poder isolar no prprio laboratrio usando-se o agar TCBS (tiosulfato-citrato-sais biliares-sacarose), onde as colonias da bactria aparecem como colonias amarelas, por fermentarem a sacarose. O V. cholerae oxidase positivo e aglutina com o antisoro especfico.

Na coprocultura comum, logo aps a chegada do material ao laboratrio, fazer bacterioscopia e semear em caldo de enriquecimento (GN ou tetrationato), agar sangue de Skirrow - que contem sangue de cavalo, vancomicina, polimixina B e trimetoprim - , agar MacConkey e agar SS. A placa de agar sangue deve ser colocada em microaerofilia (atmosfera contendo 5% de oxignio, 10% de CO2 e 85% de N2) por at 72 horas, a 42C. A espcie mais envolvida com quadros diarreicos o C. jejuni, que hidroliza o hipurato, resistente ao disco de cefalotina e geralmente sensvel ao de cido nalidxico. As crianas abaixo de dois anos de idade so particularmente susceptveis s infeces por Campylobacter.

Cerca de quatro horas aps a semeadura inicial, deve-se repicar o caldo de enriquecimento para outro agar SS, como nova tentativa de se isolar colnias de Salmonella ou de Shigella.

Secrees diversas:

a)de ouvido o ideal a amostra colhida pelo mdico por aspirao atravs do tmpano, ou seja a cultura de secreo de ouvido mdio. Se for necessria a coleta de material do ouvido externo, o prprio pessoal do laboratrio poder realiz-la, desde que utilize o procedimento adequado. Limpar o canal auditivo com antissptico, em seguida lavar com soluo fisiolgica estril. S depois colher o material com swab estril. Fazer esfregao para Gram e semear em um caldo (tioglicolato ou tripticase soja), agar sangue, agar chocolate e agar MacConkey. As bactrias mais freqentemente envolvidas so o Streptococcus pneumoniae, e o Haemophilus

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influenzae. Tambm pode ocorrer a participao de enterobactrias, bacilos gram negativos no fermentadores e do S. aureus.

b)Ocular geralmente a coleta feita com swab de material obtido por esfregao do saco conjuntival do olho afetado, a no ser que o mdico solicite outro tipo de amostra - blefarite: inflamao das margens da plpebra; ceratite: inflamao da crnea - . As bactrias mais freqentemente envolvidas so o S. aureus, o S. pneumoniae, as enterobactrias (especialmente em recm-nascidos) e o Haemophilus influenzae. Lembrar ainda da possibilidade de conjuntivite gonoccica em neonatos. Fazer esfregao para Gram, e semear em agar sangue, agar chocolate, agar MacConkey e caldo (tioglicolato ou tripticase soja).

c)Secreo de ferida operatria colher o material com swab (com meio de Stuart) das bordas da leso, aps lavar a secreo purulenta com salina estril. No laboratrio fazer esfregao para Gram e semear em agar sangue, agar chocolate,agar MacConkey e caldo tioglicolato. Os estafilococos (coagulase positivo e coagulase negativos) so as bactrias mais freqentemente envolvidas, depois as enterobactrias e finalmente os bacilos gram negativos no fermentadores.

Material com suspeita clnica de infeco por anaerbios:

Geralmente as infeces por anaerbios esto relacionadas s infeces prximas as membranas mucosas (boca, anus), com microbiota mista, aps mordedura humana ou de animal, infeces com odor ftido, com produo de gs e infeces associadas a tumores ou a reas com vascularizao deficiente, como em pacientes diabticos apresentando necrose de extremidades. Um material cujo exame microscpico (Gram) apresentou microbiota abundante e que depois a cultura para aerbios foi negativa tambm sugestiva de ser causada por anaerbios.

As amostras devem ser coletadas com agulha e seringa, sem ar (ou usar meio de transporte para anaerbios). Logo em seguida encaminhadas ao laboratrio. Fazer inoculao em frasco de hemocultura (frasco anaerbio), em caldo tioglicolato e esfregao para Gram. Tambm semear em meios slidos para anaerbios, como o agar sangue anaerbico, que deve ser incubado por 72 horas em jarra com atmosfera de anaerobiose.

A bacterioscopia pode fornecer informaes bastante teis: bacilos gram positivos com esporos, sugerem espcies do gnero Clostridium; bacilos gram negativos fusiformes sugerem bactrias do gnero Fusobacterium; vrios tipos bacterianos podem ser encontrados nas infeces mistas como peritonites, em que h associao de anaerbios estritos como os Bacterides e facultativos como as diferentes espcies de enterobactrias.

Material com suspeita de infeco por micobactrias de crescimento rpido(MCR):

cada vez mais frequente o encontro de algumas MCR em infeces hospitalares - como Mycobacterium abscessus, M. massiliense, M. chelonae, M. bolletii e M. fortuitum - decorrentes de procedimentos invasivos como injees, sesses de mesoterapia, sesses de acupuntura, cirurgias oculares (transplantes de crnea, cirurgias refrativas, etc.) e cirurgias plsticas estticas (lipoaspirao, prteses de mama, etc.).

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Essas infeces so associadas, principalmente, materiais utilizados em videocirurgias e que so reutilizados aps desinfeco qumica.Os componentes do grupo MCR so muito resistentes aos antimicrobianos e a vrios desinfetantes, especialmente o glutaraldedo. No entanto, costumam responder ao tratamento com associao de antimicrobianos, como ciprofloxacina mais claritromicina por um perodo mnimo de seis meses.

As MCR podem crescer em meios comuns, como agar sangue, agar Mueller-Hinton e agar Sabouraud. Caracterizam-se por formarem colonias visveis em trs a sete dias de incubao em temperatura ambiente (vedar a placa para evitar desidratao). Para diagnstico, coletar secreo ou fragmento de tecido e fazer pesquisa para BAAR (material concentrado por centrifugao), alm de cultura para micobactrias usando, de preferncia, meio slido e meio lquido.

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Exames diretos

Os exames diretos constituem alguns dos mtodos mais rpidos e eficientes de diagnstico disponveis em microbiologia. Alm de poder servir de guia teraputico para se iniciar uma antibioticoterapia emprica com maior racionalidade, como em uma meningite bacteriana em que a bacterioscopia do LCR ajuda a definir o provvel agente etiolgico e o mais adequado grupo de antimicrobianos a ser empregado no tratamento, alguns exames diretos chegam a diagnosticar a doena apresentada pelo paciente, como o caso da pesquisa de BAAR de linfa no caso de uma suspeita de hansenase.

Algumas tcnicas de exames diretos de amostras no coradas:

1. Montagem com salina. Material: soluo aquosa de salina estril (0,85%), lamina de microscopia e lamnula. Tcnica: dispersar uma pequena quantidade da amostra em uma gota de salina sobre uma lamina. Colocar lamnula e examinar ao microscpio com aumento de 40X, fechando o diafragma para diminuir a passagem da luz transmitida. Objetivo: verificar a presena de fungos, protozorios, etc.

2. Preparao com tinta nanquim. Material: tinta nanquim, lmina de microscopia e lamnula. Tcnica: aps centrifugado o LCR, uma gota do sedimento colocada ao lado de uma gota de tinta. Misturar as duas gotas e colocar lamnula. Fazer emulso fina, seno nada poder ser visto. Fazer leitura ao microscpio com aumento de 40X. Objetivo: pesquisa de leveduras de Cryptococcus neoformans, cuja caracterstica a presena de grande halo ao redor da levedura devido sua capsula.

3. Montagem com KOH. Material: soluo aquosa de KOH a 10%, lamina de microscopia e lamnula. Tcnica: aps ser feito raspado (de pele, couro cabeludo, unha, etc.) o material suspenso em uma gota de soluo de KOH a 10%, sobre uma lamina. Em seguida colocar lamnula e aquecer um pouco sobre uma chama de bico de Bunsen, para acelerar o processo de clarificao. Deixar a lamina por cerca de 15 a 30 minutos temperatura ambiente, antes de levar ao microscpio . Fazer leituras com objetivas de 10 e de 40X. Objetivo: pesquisar a presena de fungos (hifas, esporos, leveduras, etc.) em material que contem queratina.

4. Pesquisa em campo escuro. Material: microscpio com condensador de campo escuro, lmina, lamnula, e salina. Tcnica: Colher secreo serosa do paciente (leso tipo cancro duro da sfilis) e colocar sobre a lamina. Colocar laminula e examinar imediatamente depois em microscpio dotado de condensador de campo escuro (aumentos de 40 e de 100X). Objetivo: pesquisar a presena de espiroquetas, por meio de seu movimento e sua morfologia espiralar caracterstica.

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Algumas tcnicas de exames diretos de amostras coradas:

1. Leffler. Composio: Azul de metileno 0,3 g lcool etlico 95% - 30 ml gua destilada 100ml Tcnica: aps fixar o esfregao pelo calor, deixar o corante agir por um minuto e em

seguida lavar a lamina com gua corrente e deixar secar. Objetivo: procurar bacilos gram positivos pleomrficos que apresentem granulaes

metacromticas (azul-escuras). Podem ocorrer ainda em outros microrganismos, como nas bactrias do gnero Propionibacterium e nos actinomicetos. Assim um resultado conclusivo s poder ser dado por meio de cultura para bacilo diftrico.

2. Gram. Composio: a) Cristal violeta 2,0 g lcool etlico 95% - 20 ml Oxalato de amonio 0,8 g gua destilada 100 ml b) Iodeto de potssio 2,0 g Cristais de iodo 1,0 g gua destilada 100 ml c) Acetona 50 ml lcool etlico 95% - 50 ml d)Safranina O 2,5 g lcool etlico 95% - 10 ml gua destilada 90 ml Tcnica: aps fixar o esfregao pelo calor, colocar o corante inicial (cristal violeta) por 1 minuto. Depois lavar com gua corrente e colocar soluo de iodo por mais um minuto. Descorar rapidamente (cinco segundos) e depois lavar com gua corrente. Deixar o contracorante (safranina) agir por 30 segundos. Lavar com gua corrente e deixar secar. Objetivo: descrever as principais bactrias por meio de sua morfologia e por sua capacidade de reter a associao cristal violeta-iodo, ou seja, em gram positivas (coradas em purpura) ou gram negativas (coradas em vermelho).

3. Ziehl-Neelsen. Composio: a)Cristais de fenol 2,5 ml

lcool etlico 95% - 5 ml Fucsina bsica 0,5 g gua destilada 100 ml

b)cido clordrico concentrado 3,0 ml

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lcool etlico 70% - 100 ml c)Azul de metileno 0,5 g

cido actico glacial 0,5 ml gua destilada 100 ml

Tcnica: aps fixar o esfregao pelo calor, colocar o corante de fucsina e aquecer a lamina at a emisso dos primeiros vapores. Deixar agir por cinco minutos. Lavar com gua corrente e em seguida descorar com soluo de lcool-cido. Lavar novamente com gua corrente e em seguida colocar soluo de azul de metileno. Deixar agir por um minuto e depois lavar com gua. Deixar secar. Ler toda a lamina com aumento de 100X. Objetivo: detectar a presena de BAAR, que se cora em vermelho.

4. Wright-Giemsa. Composio: Corante de Wright em p 9,0 g Corante de Giemsa em p 1,0 g Glicerina 90 ml lcool metlico absoluto 2910 ml Misturar em frasco mbar e deixar estabilizar por um ms antes de usar. Tcnica: usar metodologia semelhante a utilizada em hematologia. Objetivo: importante na pesquisa de protozorios (Leishmania) e fungos (Histoplasma), ou ainda na pesquisa de incluses intracelulares (Chlamydia).

5. Soluo de lactofenol. Composio: Cristais de fenol 20,0 g cido lctico 20,0 g Glicerol 40 ml gua destilada 20 ml Dissolver o cido lctico e glicerol em gua destilada. Depois acrescentar azul de algodo (0,05 g). Deixar a suspenso repousar por dois dias e, em seguida, filtrar em papel. Tcnica: uma gota do corante sobre uma preparao de pesquisa de fungos. Colocar lamnula em ngulo de 45, para evitar a formao de bolhas. Fazer leitura com objetiva de 10 e de 40X. Objetivo: ver as estruturas coradas de fungos filamentosos (miclios e rgos de reproduo).

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Meios de cultura

Os meios de cultura utilizados em microbiologia podem ser de vrios tipos: a-Meios slidos: geralmente utilizados para obter colnias isoladas, como o agar sangue

e o agar MacConkey. b-Meios lquidos: geralmente utilizados para facilitar o desenvolvimento microbiano,

porm sem propiciar a obteno de colnias isoladas, como o caldo tioglicolato ou o caldo tripticase soja.

c-Meios de transporte: servem apenas para a manuteno da viabilidade das bactrias entre a coleta de material e a semeadura nos meios adequados. Exemplos: meio de Stuart (secrees) e meio de Cary-Blair (fezes).

d-Meios no seletivos: so meios com suplemento que facilitam o crescimento microbiano, como o agar sangue e o agar chocolate.

e-Meios seletivos: meios que contm substncias inibidoras do crescimento de alguns grupos de bactrias, como o agar MacConkey que inibe o crescimento de cocos gram positivos, sendo til para o crescimento de bacilos gram negativos.

f-Meios diferenciais: meios usados como prova bioqumica, ou seja para avaliar se o microrganismo possui uma enzima responsvel por uma determinada via de atividade metablica. Exemplo: agar DNAse para verificar se a bactria possui a enzima desoxirribonuclease, que degrada o DNA.

g-Meio base: geralmente so meios utilizados como base qual adicionamos suplementos para obtermos um produto como o agar sangue, em que podemos usar como meio base o agar tripticase soja ou o agar Columbia.

Alguns dos meios mais usados em microbiologia: a-Agar sangue: meio no seletivo que possibilita o crescimento de diversos grupos

microbianos e permite verificar a presena de hemlise. Composio: meio base agar tripticase soja com 5% de sangue de carneiro (adicionados quando o meio estiver em torno de 50C). Distribuir 20 a 25 ml em placas de 90 mm.

b-Agar chocolate: meio no seletivo que possibilita, alm do que se obtem com o uso do agar sangue, isolar ainda cepas de Haemophilus e de Neisseria. Composio: agar GC ou agar Mueller-Hinton com 5% de sangue de carneiro (adicionados com temperatura em torno de 80C). Depois de achocolatado, o meio resfriado at 50C quando ento adicionado o suplemento VX (10 ml de suplemento/litro de meio).Distribuir de forma semelhante a do agar sangue.

c-Agar MacConkey: meio seletivo usado para isolamento de bacilos gram negativos e para verificar a capacidade de fermentao da lactose. Lactose negativas so as colonias transparentes. Lactose positivas as colonias de cor rosa.

d-Agar SS1: meio seletivo e diferencial usado para o isolamento de Salmonella e Shigella. Permite diferenciar as cepas lactose positiva e lactose negativa, alm de permitir visualizar as que produzem H2S.

e-Agar Thayer-Martin: meio seletivo usado para isolamento de cepas de Neisseria gonorrhoeae. Composio: agar chocolate com suplemento VX e suplemento

1 Alguns preferem utilizar o Agar XLD, por permitir mais facilmente identificar colnias de Shigella

e de Salmonella.

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VCNT (vancomicina, colistina, nistatina e trimetoprim), adicionados com o meio com temperatura em torno de 50C.

f-Caldo tioglicolato: usado para o crescimento de vrios grupos de microrganismos, inclusive anaerbios. O meio possui um indicador (resazurina) que torna rosa a parte do meio em contato com o oxignio. Para haver crescimento de anaerbios o material deve ser semeado no fundo do tubo, sem agitar.

g-Caldo Todd-Hewitt: ao meio base adicionada colistina (10 mcg/ml) e cido nalidxico (15 mcg/ml). um meio de enriquecimento para isolamento de estreptococos do grupo A.

h-Caldo tetrationato: caldo de enriquecimento utlizado para o isolamento de Salmonella.

i-Caldo descarboxilase: usado para avaliar a capacidade bacteriana de descarboxilar alguns aminocidos (arginina, lisina e ornitina).

j-Agar sangue anaerbico: agar sangue utilizado para isolamento de anaerbios. Composio: Brucella agar como meio base, acrescido de sangue de carneiro a 5%, mais soluo de hemina e vitamina K.

k-Meios para fungos: geralmente utilizamos um meio com antibiticos, Mycosel, para inibir o crescimento de bactrias contaminantes e um meio sem antibiticos, o agar Sabouraud, que devido ao pH baixo, tambm tem algum efeito inibidor sobre as bactrias. Lembrar que o Cryptococcus neoformans sensvel cicloheximida, portanto cresce apenas no agar Sabouraud.

l-Meios para micobactrias: o tradicional o meio de Lowestein-Jensen sem antibiticos, podendo tambm ser usado com antibiticos (anfotericina B, cido nalidxico e penicilina) para os materiais biolgicos que apresentam contaminao com microbiota normal. No entanto, devido maior rapidez no isolamento de micobactrias, cada vez maior a utilizao de mtodos semi-automatizados, como o do equipamento Bactec 460, que utiliza o princpio da deteco da liberao de CO2 devido ao crescimento microbiano.

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Identificao preliminar de culturas bacterianas, leveduras e fungos filamentosos

Aps crca de 24 a 48 horas de incubao, o microbiologista dever iniciar a interpretao das culturas, o que requer habilidade e experincia. A partir da observao das caractersticas de cada colnia e em que meios se desenvolve, o tcnico partir para a realizao de outros procedimentos necessrios correta identificao preliminar das bactrias envolvidas em cada processo infeccioso.

Assim, se estamos trabalhando com uma secreo traqueal em agar sangue, e se verificarmos a presena de uma colnia achatada, mucide, e com halo de hemlise alfa, pensaremos na possibilidade de se tratar de um pneumococo. A partir da, iremos partir para a realizao da prova da catalase e do Gram (e depois a sensibilidade optoquina) de forma a confirmar a nossa suspeita.

Se ao invs de uma placa de agar sangue, estivssemos trabalhando com uma placa de agar MacConkey, e tivesse havido o crescimento de colonias mucides, lactose positivas, a suspeita agora passaria a ser se tratar de uma colonia de Klebsiella pneumoniae. O procedimento ento seria a realizao de uma prova de oxidase, que deveria ser negativa por se tratar de uma enterobactria. Em seguida passaramos para outras provas de identificao bioqumica, at a identificao definitiva.

A seguir alguns passos para identificao preliminar de alguns tipos de colonias, a partir de diversos tipos de materiais:

1.Colonias brancas ou amarelas, 2 a 3 mm de dimetro, cremosas, com zona de beta-hemlise, suspeitas de serem estafilococos realizar prova da catalase (provavelmente positiva). Se necessrio, fazer Gram. Fazer prova da coagulase, se for estafilococo. Em seguida colocar em painel para cocos gram positivos.

2.Colonias pequenas, puntiformes, com hemlise beta, suspeitas de serem estreptococos realizar prova da catalase (que deve ser negativa). Se necessrio, fazer Gram. Fazer prova da bacitracina. Colocar em painel para cocos gram positivos.

3.Colonias mucides, achatadas, com hemlise alfa, sugestivas de serem pneumococos fazer a prova da catalase(que deve ser negativa) e em seguida a prova de sensibilidade optoquina. Colocar em painel para cocos gram positivos.

4.Colonias acinzentadas, opacas, com ou sem beta-hemlise, suspeitas de serem pertencentes ao grupo das enterobactrias . Fazer Gram e se for um bacilo gram negativo fazer a prova da oxidase. Se for uma enterobactria a oxidase ser negativa. Para identificar a espcie deveremos partir para vrios testes bioqumicos, como os existentes nos painis para bacilos gram negativos.

5.Colonia apresentando vu, com probabilidade de pertencer ao gnero Proteus fazer provas de identificao bioqumica, como a urease e fenilalanina desaminase ou colocar em painel para bacilos gram negativos.

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6.Colonias achatadas, opacas, cinza a esverdeadas, com odor de frutas, sugestiva de pertencerem ao gnero Pseudomonas fazer a prova da oxidase (que deve ser positiva). Em seguida colocar em painel para bacilos gram negativos.

7.Colonias que crescem bem em agar sangue e mal - ou no crescem - em agar MacConkey . Fazer a prova da oxidase (que pode ser positiva ou negativa).Se no Gram verificar-se a presena de cocobacilos gram negativos e a oxidase for negativa, possivelmente as colonias pertencem ao gnero Acinetobacter. Confirmar com o painel para bacilos gram negativos.

8.Colnias que crescem apenas em agar chocolate suplementado com fatores V e X (ou por meio da prova de satelitismo), em atmosfera de CO2. Fazer a prova da oxidase (que deve ser positiva) e o Gram. Se for um cocobacilo gram negativo curto, pleomrfico, deve tratar-se de colnias de Haemophylus. Confirmar com o uso de discos de identificao V e X, em agar no suplementado.

9.Colnias que crescem em agar sangue (em aerobiose) e que ao Gram aparecem como bacilos gram positivos pleomrficos . Verificar se tem esporos (bactrias do gnero Bacillus tem endosporos) ou no. Fazer a prova da catalase (Listeria e Corynebacterium so catalase positivas). Fazer outras provas de identificao para esse grupo de bactrias.

10.Colnias pequenas, translcidas, brilhantes, que crescem bem em agar chocolate, em atmosfera de 5% de C02, e que podem ou no crescer em agar sangue. Fazer a prova da oxidase. Se for positiva, corar pelo Gram. Provavelmente ser um diplococo gram negativo, pertencente ao gnero Neisseria, especialmente se a amostra for de LCR ou de secreo uretral.

11.Leveduras:no teste de produo de tubo germinativo para colonias de leveduras crescidas em agar Sabouraud ou agar sangue, inocular algumas colonias em substrato adequado (como soro humano) por 3 horas a 37C, em tubo de hemlise. Depois levar ao microscpio e verificar a produo de tubos germinativos a partir das leveduras. Caso positivo,a prova ir sugerir tratar-se de Candida albicans, e serve como prova preliminar de identificao dessa espcie de levedura.

12.Fungos: observao inicial das caractersticas macroscpicas das colonias e observao de suas caractersticas microscpicas coradas com soluo de lactofenol, procurando-se identificar as caractersticas taxonmicas dos miclios vegetativos e das estruturas de reproduo.

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Taxonomia microbiana

A necessidade de uma correta identificao de cada espcie bacteriana se prende, principalmente, aos estudos epidemiolgicos e aos de vigilncia sanitria. Antigamente os estudos de taxonomia dependiam dos testes bioqumicos, essencialmente. Com o avano da biotecnologia, atualmente os estudos da sistemtica das bactrias e outros microrganismos esto ligados, predominantemente, aos de biologia molecular.

Sistemtica, ou a cincia de classificao dos organismos vivos inclui a classificao, a nomenclatura e a identificao dos seres.

O objetivo da classificao fazer com que se possa generalizar o conhecimento de um grupo de organismos que tm semelhanas entre si. Exemplo: a Escherichia coli tem semelhana com outras enterobactrias, como a Klebsiella pneumoniae, o Proteus mirabilis e a Salmonella enterica. Todas so bacilos gram negativos, reduzem nitrato a nitrito e so oxidase negativas.

A nomenclatura utilizada pelos microbiologistas tem como idioma o latim, sendo dado a cada organismo um nome duplo, em que o primeiro relativo ao gnero e o segundo espcie. O gnero representado por uma espcie tipo, enquanto a espcie representada por uma determinada cepa que reconhecida em uma coleo de culturas bacterianas e que fica disponvel a todos os microbiologistas, como as cepas ATCC (American Type Culture Collection) e NTCC (National Type Culture Collection).

A ltima reviso do Cdigo Internacional de Nomenclatura Bacteriana foi publicada em 1992, sendo que as emendas so publicadas no International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.

A hierarquia da nomenclatura bacteriana ordem, famlia, tribo, genro e espcie.

A identificao o processo por meio do qual um determinado microrganismo reconhecido como pertencente uma determinada espcie e dessa forma corretamente designado.

A identificao baseada na semelhana molecular das bactrias conhecidas, com relao uma desconhecida. Pode-se citar como exemplo as semelhanas existentes entre percentual de contedo citosina e guanina, a seqncia de aminocidos do RNA ribossomal 16S (o RNA ribossomal permanece mais estvel do que os outros cidos nuclicos das clulas) ou a homologia entre as cadeias de DNA de diferentes bactrias (hibridinizao DNA-DNA).

Como critrios de caracterizao preliminar antes do nvel molecular das bactrias, podemos utilizar algumas caractersticas fenotpicas, como:

a)Morfologia ou seja a morfologia da bactria, em termos de tamanho, forma, arranjo das clulas (se em forma de coco, de bacilo, etc.).

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b)Caractersticas de colorao - como so suas caractersticas microscpicas (se um bacilo gram negativo; se ou no lcool-cido resistente; se tem cpsula, etc.).

c)Motilidade verificada ou por exame direto (microscopia em salina estril) ou por inoculao em meio semi-slido.

d)Presena ou no de esporos que podem ser visualizados ou pela colorao de Gram ou por exame direto. A presena de esporos particularmente til para a identificao de bactrias dos gneros Bacillus(aerbio) e Clostridium(anaerbio).

e)Caractersticas de crescimento como temperatura tima de crescimento; tempo de desenvolvimento das colonias; morfologia das colonias nos meios de cultura (meios no seletivos, seletivos e diferenciais); atmosfera tima de crescimento , como bactrias aerbicas (que requerem O2 para seu desenvolvimento), bactrias facultativas (que crescem tanto na presena como na ausncia de O2) e anaerbicas (com crescimento otimizado na ausncia de O2). Tambm h bactrias que requerem atmosfera de CO2 para se desenvolverem como as dos generos Neisseria e Haemophilus, como ainda as do gnero Campylobacter.

f)Bioqumica por meio de vrios testes bioqumicos possvel identificar as atividades metablicas das bactrias, que por sua vez tem a ver com as caractersticas de cada espcie. Exemplo: a Klebsiella utiliza o citrato como fonte de carbono, enquanto que a Escherichia e a Shigella no possuem essa capacidade metablica.

g)Sorologia caractersticas antignicas ligadas a antgenos de superfcie das bactrias servem para propiciar a formao de soros capazes de levar aglutinao de bactrias em nvel de espcie (como uma sorologia de identificao de espcies de Samonella1 e Shigella) ou at de subespcies, como sorotipos ou sorogrupos. O pneumococo, por exemplo, pode ser identificado em cerca de 90 sorotipos diferentes por meio de diversos antgenos capsulares.

h)Composio qumica pode-se utilizar nesse processo de identificao, tambm chamado de quimiotaxonomia , a cromatografia de lipdeos, fosfolipdeos, cidos miclicos, cidos graxos e hidrolisados de peptidoglicano, ou seja de componentes da parede celular das bactrias. Esses procedimentos mais complexos so restritos a laboratrios de pesquisa, dotados de maiores recursos e tecnologia.

1 Como na tipagem de Salmonella como sendo do grupo A, B, C ou D, por exemplo.

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Identificao e testes de sensibilidade por equipamento automatizado

Os dois fabricantes de equipamentos automatizados mais conhecidos no mercado nacional so a Dade Behring (fabricante do equipamento Walkaway) e a BioMrieux (fabricante dos equipamentos automatizados Vitek).

Pela experincia que obtive com ambos os equipamentos, creio que tm muita semelhana em termos de qualidade e eficincia de trabalho. Cada um tem suas vantagens e limitaes.

Ora um mais interessante por um aspecto, ora o concorrente o por outro. A escolha de cada um devida, principalmente, relao custo-benefcio na hora de se fazer uma aquisio, ou de se fazer um contrato do tipo aluguel ou comodato.

1.O sistema Walkaway permite a realizao simultnea de testes de identificao e de sensibilidade, inclusive com determinao de concentrao inibitria mnima (teste de diluio em caldo). a)Painis para identificao de bacilos gram negativos: geralmente utilizamos o NC33

(para amostras de urina) ou o NC32 (para outros tipos de amostras). Preparo do inoculo (sistema Prompt): usando-se um aplicador descartvel, tocar a superfcie de 4 a 5 colnias grandes (ou 5 a 10 colnias pequenas), semelhantes, bem isoladas, a partir de uma placa de agar sangue ou agar chocolate (placa de agar no inibidor) aps incubao de 18 a 24 horas. Retirar o excesso de material do aplicador e colocar o material em uma garrafa de diluio (gua de inoculo). Agitar a garrafa por alguns segundos. Em seguida colocar o inculo na bandeja transparente, que deve estar nivelada. Colocar a tampa. Bater nas laterais da bandeja para homogenizar. Colocar o RENOK, aspirar e inocular o painel. Colocar leo mineral nos poos sublinhados. Tampar a placa e colocar no Walkaway. O ideal se fazer o teste da oxidase antes de inocular os painis, isto porque na hora de serem identificados os painis, o aparelho solicita o teste da oxidase para os bacilos gram negativos. Testes de identificao: Fermentao de acares (GLU;SUC;RAF;RHA;ARA;INO;ADO;MEL), que quando positiva leva a formao de uma colorao amarela devido queda do pH (detectada pelo indicador vermelho fenol). Uria, que havendo a enzima urease leva formao de amnia, que eleva o pH e produz colorao vermelha (indicador tambm o vermelho fenol). H2S, este gs produzido a partir do tiossulfato de sdio e reage com os ons frricos do meio produzindo um precipitado negro. Indol, o metabolismo do triptofano resulta na formao do indol, que detectado pela adio do reagente de Kovacs, produzindo cor vermelha. Lisina(LIS), Arginina(ARG) e Ornitina(ORN), a descarboxilao desses aminocidos resulta na formao de aminas bsicas detectadas por uma cor prpura, dada pelo indicador prpura de bromocresol. Triptofano desaminase(TDA), a existncia dessa enzima leva produo de cido indolpirvico que reage com o cloreto frrico levando produo de um produto de cor marron escuro.

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Hidrlise da esculina(ESC), que forma um precipitado negro ao reagir com o citrato de amnio frrico do meio. Voges-Proskauer(VP), quando a produo de acetoina detectada pela formao de cor vermelha depois da adio do KOH e da soluo de alfa-naftol. Galactosidase(ONPG), sendo a presena dessa enzima detectada pela produo de uma cor amarela. Utilizao de Citrato(CIT), Malonato(MAL), Acetamida(ACE), e Tartarato(TAR),quando a utilizao desses substratos for a nica fonte de carbono, ela evidenciada pela produo de uma cor azul, devido elevao do pH, tendo como indicador o azul de bromotimol. Oxidao-Fermentao(OF/G) - a oxidao da glicose leva formao de cido e queda do pH, mudando a cor do indicador (azul de bromotimol) para amarelo. Se nenhum cido produzido (no h oxidao) o indicador no sofre mudana de cor. Para avaliar a fermentao da glicose adiciona-se leo mineral ao pocinho, mas a leitura feita da mesma forma que no caso da oxidao (cor amarela). Nitrato(NIT), verifica a habilidade da bactria de reduzir nitrato a nitrito, que verificada aps adio de dois reagentes (cido sulfanlico e alfa-naftilamina), levando produo de cor vermelha. Cetrimide(CET), ou seja avalia a capacidade de crescer em meio com cetrimide. P4, K4, etc., representa a resistncia da bactria em relao concentraes especficas de alguns antimicrobianos. Estes dados tambm participam da identificao bacteriana.

Definio de um nmero de bitipo: todos estes testes levam definio de um nmero cdigo de 8 dgitos correspondente ao bitipo da bactria. Esse nmero comparado com um banco de dados do fabricante, que leva identificao da bactria com probabilidade de at 99,9% de chance de ser exata.

Interpretao dos testes de sensibilidade:

A sensibilidade determinada comparando-se a concentrao inibitria mnima (CIM) de uma determinada bactria em relao ao nvel alcanvel pelo antimicrobiano no sangue, seguindo as normas recomendadas pelo CLSI , EUA. Exemplo: para enterobactrias a cefalotina considerada sensvel se a CIM for menor ou igual a 8,0 mcg/ml; nvel intermedirio se a CIM for igual a 16,0 mcg/ml ; resistente se a CIM for maior ou igual a 32,0 mcg/ml. J para a ciprofloxacina, ainda em relao s enterobactrias, os nveis de sensvel, intermedirio e resistente so de CIM respectivamente menor ou igual a 1,0 ; 2,0 ; e maior ou igual a 4,0. As diferenas entre os dois antimicrobianos esto relacionadas s diferentes concentraes teraputicas encontrveis no sangue e no maior ou menor ao de cada um deles.

b)Painis para identificao de cocos gram positivos: geralmente utilizamos o painel PC 21.

Preparo do inculo: Para estafilococos o procedimento utilizado para preparo do inculo semelhante ao utilizado para os bacilos gram negativos, por meio do sistema

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Prompt (tocar 4 a 5 colnias grandes ou 5 a 10 colnias pequenas, etc.). Ao trabalharmos com estreptococos ou com enterococos, h necessidade de fazermos um procedimento mais padronizado. Colocar a suspenso bacteriana em 3 ml de caldo BHI (ou gua destilada estril ), e deixar incubar por 2 a 4 horas. Deixar no turbidmetro na posio blank, um frasco com caldo BHI sem inculo (ou com gua destilada). Na outra posio, colocar o tubo inoculado, que dever apresentar turbidez compatvel com a leitura na escala entre 006 a 013, que corresponde ao tubo 0,5 da escala de McFarland. Com uma pipeta, passar 100 microlitros do tubo com inculo padronizado para um frasco contendo 25 ml de gua pluoronica. Agitar o frasco e colocar na bandeja. A seguir continuar de forma semelhante utilizada para os painis de gram negativos.

Testes de identificao: Violeta de genciana (CV) os estreptococos crescem na presena do corante, enquanto os estafilococos no. Micrococos (MS) o crescimento em baixas concentraes de bacitracina (0,04 U) utilizado para diferenciar os micrococos (sensveis) dos estafilococos (resistentes). Nitrato (NT) os estafilococos reduzem nitrato a nitrito (cor vermelha), enquanto os estreptococos no reduzem. Novobiocina (NOV) so resistentes novobiocina algumas espcies de estafilococos, como o S. sapropyticus, S. xylosus, S. cohnii e S. sciuri. Glicosidases (PGR,PGT) a presena da enzima detectada pela formao de um produto de cor amarelada . Indoxil fosfatase (IDX) este teste equivalente ao da coagulase. Os estafilococos que tm essa enzima so tambm coagulase positivos, levando formao de um composto de cor azul. Voges-Proskauer (VP) formao de um produto de cor vermelha na reao positiva, de forma semelhante ao que ocorre com os bacilos gram negativos. Optoquina (OPT) o pneumococo sensvel optoquina. Os demais cocos gram positivos no so inibidos pela substncia. Fosfatase (PHO) a reao positiva forma um produto de cor amarela. Bile esculina (BE) a reao positiva forma um precipitado negro. Pirrolidonil-beta-naftilamida (PYR) a reao positiva , que corresponde a presena da enzima pirrolidonase, produz uma cor vermelha aps a adio do reagente de peptidase. Arginina (ARG) a cor vermelha corresponde a reao positiva, ou seja a desidrolizao do aminocido. Uria (URE) a formao de amonia leva a produo de uma cor vermelha. Carbohidratos (RAF, LAC,TRE,MNS, SOR, ARA, RBS, INU, MAN) a fermentao de cada acar leva a formao de cor amarela. NaCl 6,5% (NACL) a tolerncia ao sal uma caracterstica dos estafilococos e enterococos. Bacitracina (BAC) a sensibilidade bacitracina caracterstica do Streptococcus pyogenes (grupo A de Lancefield). Piruvato (PRV) a reao positiva leva a formao de uma cor amarela. Beta-lactamase (BL) a presena de beta-lactamase detectada pela adio de penicilina e iodo ao pocinho BL. Se houver a enzima o iodo liga-se ao anel beta-

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lactamico, formando uma reao incolor. Se no houver a enzima h formao de um produto de colorao preta.

Identificao de microrganismos: de forma semelhante a utilizada para os bacilos gram negativos, o resultado dos testes de identificao leva a formao de biotipo com cerca de 8 nmeros, que confrontado com um banco de dados criado pelo sistema MicroScan. Os cdigos nesse caso so divididos em duas sees, ou seja nas famlias Streptococcaceae e Micrococcaceae (famlias 1 e 2).

Interpretao dos testes de sensibilidade: de forma semelhante a adotada para os painis de bacilos gram negativos. Aqui o que varia so alguns antimicrobianos, mais especficos para esse grupo de microrganismos, como a ampicilina, eritromicina, clindamicina, oxacilina, vancomicina, etc. H ainda pocinhos para avaliar a existncia ou no de resistncia de nvel elevado (HLR) a aminoglicosdeos (estreptomicina e gentamicina). Isso tem importncia no tratamento de casos de endocardite bacteriana por enterococos, onde a associao de ampicilina ao aminoglicosdeo provoca aumento do ndice de cura, desde que no haja resistncia de nvel elevado a esses antimicrobianos.

Painel de identificao de leveduras: o ideal que a levedura tenha sido isolada a partir do agar dextrose Sabouraud. No devem ser usados meios que contenham sangue. Usar o painel de identificao rpida de leveduras. Preparo do inculo: remover do agar (aps 24 horas de crescimento) uma quantidade de colonias em tubo contendo 3 ml de gua estril, suficiente para alcanar uma turbidez equivalente ao padro de turbidez para leveduras do fabricante. Aps homogenizar o inculo por meio de agitao, adicionar 50 microlitros da suspenso a cada pocinho do painel contendo substrato, e nos poos controle. Agitar lateralmente o painel, tampar e depois coloc-lo no aparelho. A leitura feita aps 4 horas de incubao. Testes de identificao: Substratos de aminocidos (HPR,ILE, PRO,TYR,etc.) a reao positiva produz uma cor prpura, obtida pela presena de uma enzima que faz a hidrlise do aminocido. Utilizao de carbohidratos (SUC,TRE, etc.) a reao positiva produz uma cor amarela relativa queda do pH, pela produo de cidos. Substratos nitrofenil (AGL, BGL, AGL, etc.) a presena da enzima leva a liberao de compostos nitrofenol, levando a um produto de cor amarela. Indoxil fosfatase (IDX) a presena da fosfatase libera o radical indoxil que ligado ao oxignio forma um precipitado azul. Uria (URE) a presena de urease leva a formao de amnia, que eleva o pH produzindo colorao vermelha. Identificao das leveduras: mesmo princpio dos outros painis, com a produo de um biotipo, com vrios dgitos, que comparado com um banco de dados do fabricante do painel.

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2.O VITEK um equipamento automatizado dedicado identificao de bactrias e leveduras, alm de permitir a realizao de testes de sensibilidade, pelo mtodo de microdiluio em caldo. O sistema composto de dois programas informatizados, um que comanda a leitura de cartes e incubadora (VITEK) e outro (bioLIAISON) responsvel pelo banco de dados que circunda o VITEK. O programa inclui anlise, gerenciamento de dados e vrios relatrios relacionados aos pacientes e produtos. O sistema apresenta como principais diferenas com o da Dade Behring a separao de cartes de identificao e de sensibilidade, alm da necessidade de sempre se trabalhar com inculo padronizado segundo a escala de McFarland. Essa padronizao feita com o auxlio de um colormetro, que utiliza quatro faixas de transmitncia: a) Faixa vermelha (80 a 88% de T) que visualmente corresponde a escala 0,5 de McFarland (usada para estafilococos) b) Faixa azul (67 a 77% de T) visualmente corresponde a escala 1,0 de McFarland (usada para enterobactrias e estreptococos). c)Faixa verde (46 a 56% de T) visualmente corresponde a escala 2,0 de McFarland

(usada para bacilos gram negativos no fermentadores e leveduras). c)Faixa amarela (27 a 37% de T) visualmente corresponde ao tubo 3,0 de McFarland

(usada para cartes ANI e NHI).

Os cartes mais comumente empregados na rotina so os de cocos gram positivos (GPI e GPS), bacilos gram negativos (GNI e GNS), alm de leveduras (YBC). H ainda outros menos utilizados como os de identificao de bactrias anaerbicas (ANI) e de bactrias fastidiosas como as dos gneros Hemophilus e Neisseria (NHI).

Identificao dos cartes: cada carto deve ter sua identificao numrica (seis dgitos) anotada no campo adequado para isso.

Os cartes de bacilos gram negativos devem ter o espao redondo existente preenchido da seguinte forma: ( ) - oxidase negativa (enterobactrias e alguns no fermentadores como os do gnero Acinetobacter). ( ) - oxidase positiva (alguns no fermentadores como os do gnero Pseudomonas).

Os cartes de cocos gram positivos devem ter o espaos preenchidos da seguinte forma:

( ) - catalase negativa como no caso de Streptococcus e de Enterococcus. ( ) - catalase positiva como no caso de Staphylococcus.

( ) - coagulase negativa (e se catalase for positiva). ( ) - ou coagulase positiva (e se catalase for positiva).

( ) - se no houver hemlise beta (e se catalase for negativa). ( ) - se houver hemlise beta ( e se catalase for negativa).

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Metodologia bsica de uso do equipamento:

- Para cocos gram positivos: a)No 1 e no 2 tubo de ensaio, adicionar 1,8 ml de salina esterilizada em concentrao de 0,45% de NaCl. b)No 1 tubo, preparar inculo padronizado, compatvel com escala 0,5 (faixa vermelha do colormetro, se for estafilococo)ou escala 1 de Mc Farland (faixa azul, se for estreptococo ou enterococo). Fazer suspenso homognea. c)Adicionar, com pipeta automtica e ponteira estril, 200 microlitros do inculo

padronizado do 1 tubo ao 2 tubo, com salina. Fazer suspenso homognea. d) O primeiro tubo ser utilizado para o carto de identificao (GPI) e o segundo para o teste de sensibilidade (GPS). e) Colocar tubo de aspirao no local adequado de cada carto. Ligar o sistema de vcuo e selador do VITEK 15 minutos antes de us-los. f) Colocar tubos e cartes no setor de aspirao e de produo de vcuo do VITEK. g) Ligar o sistema de produo de vcuo (on). h) Aguardar o trmino da aspirao (ready). i) Inserir os cartes no selador. Ligar o selador (on). Esperar trmino (ready). j) Aps selados colocar os cartes na incubadora do VITEK (antes verificar o prximo horrio da leitora de cartes). As letras de identificao do carto ficam viradas para cima (Ex; GPI). k) Inserir dados do paciente no VITEK (cadastramento de pacientes).

Para bacilos gram negativos: a) No 1 e no 2 tubo de ensaio, adicionar 1,8 ml de salina esterilizada em concentrao de 0,45% de NaCl. b) No 1 tubo, preparar inculo padronizado, compatvel com escala 1 de McFarland (faixa azul do colormetro). No caso de bactrias de crescimento mais lento como os no fermentadores, usar a escala 2 de McFarland (faixa verde). c) Adicionar, com pipeta automtica, 50 microlitros do inculo padronizado do 1 ao 2 tubo, com salina. Fazer suspenso homognea. d) O primeiro tubo ser utilizado para o carto de identificao (GNI) e o segundo para o teste de sensibilidade (GNS). e) Continuar as outras etapas como j descrito anteriormente (tens e at k).

Para leveduras: a) Usar apenas um tubo, com 1,8 ml de salina esterilizada em concentrao de 0,45% de NaCl. b) Preparar inculo compatvel com escala 2 de McFarland (faixa verde). c) Usar carto de leveduras (YBC). Nesse caso no h carto de sensibilidade. d) Continuar como as etapas anteriormente citadas (e a i). d) Incubar o carto por 24 horas a 35C fora do aparelho, antes de se fazer a primeira leitura no VITEK. Inserir dados do paciente . No havendo leitura final, reincubar por mais 24 horas a 35C, antes de fazer a 2 leitura.

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Identificao manual dos microrganismos mais freqentemente isolados

Enterobactrias: De todas as amostras recebidas por um laboratrio diagnstico so as

enterobactrias os microrganismos mais encontrados, especialmente em se tratando de amostras de pacientes com suspeita de infeco urinria.

Esse grupo de bactrias que hoje compreende um considervel nmero de gneros e de espcies representam importante fonte de infeces comunitrias e hospitalares, alm de constituir um grupo de elevada resistncia aos antimicrobianos, especialmente as cepas de origem nosocomial e especialmente as produtoras de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL).

A identificao preliminar desse grupo de bactrias simplificada se nos atentarmos para algumas de suas principais caractersticas, como:

Crescimento de colonias grandes, acinzentadas, com ou sem hemlise, em placas de agar sangue.

Ao Gram, verifica-se a presena de bacilos gram negativos. A glicose fermentada, a reao de citocromo oxidase

negativa e o nitrato reduzido a nitrito.

Entre as enterobactrias h ainda dois grandes subgrupos: as que fermenta lactose e as que no fermentam o carbohidrato. Nisso reside a identificao preliminar de cada subgrupo em meios seletivos, como o agar MacConkey, onde as colonias lactose positivas como a Escherichia coli podem ser vistas como colnias de cor rosa, enquanto colnias que no fermentam a lactose, como a Serratia marcescens, permanecem transparentes.

Uma outra maneira de avaliar subgrupos de enterobactrias consiste na utilizao de meios de triagem bioqumica como o agar Klieger ferro, onde utilizamos um tubo com meio inclinado. A reao no fundo do tubo ocorre em anaerobiose (fermentao) e a parte inclinada feita em aerobiose (oxidao).

Na oxidao a produo de radicais cidos bem menor do que na fermentao. Como no meio h apenas uma pequena quantidade de glicose (1g de glicose e 10 g de lactose para litro de meio) em relao de lactose, a utilizao da lactose o fator determinante para a viragem ou no do indicador (vermelho fenol). Se a enterobactria fermenta a lactose, o fundo e a parte inclinada ficam amarelos devido formao de radicais cidos e mudana do pH do meio.

Se, no entanto, a bactria no fermenta a lactose, apenas a parte inclinada fica amarela (oxidao da glicose) enquanto o fundo permanece vermelho. Se tanto o fundo como a parte inclinada no sofrem modificao, provvel que no se trate de uma enterobactria, mas sim de um bacilo gram negativo no fermentador. O meio permite ainda visualizar a presena de H2S, como costuma ocorrer com bactrias dos gneros Proteus, Salmonella e Citrobacter.

Ao se falar em enterobactrias, logo vem a lembrana as enzimas que mais caracterizam esse grupo bacteriano, como as betalactamases, que ao se ligar ao anel betalactamico hidroliza-o, tornando o antibitico inefetivo.

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Em relao s cepas de enterobactrias produtoras de beta lactamase de espectro estendido (ESBL), como em cepas de K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli e Proteus mirabilis, apesar de poderem ser clinicamente resistentes terapia com penicilinas, cefalosporinas ou aztreonam, in vitro podem apresentar sensibilidade esses antimicrobianos.Tambm tm sido detectadas em outros microrganismos, como Salmonella spp., e em bacilos no fermentadores como a P. aeruginosa.. Tpicamente, as ESBL derivam dos genes TEM-1, TEM-2, TEM-3, CTX-M e SHV-1 por mutaes que alteram a configurao de aminocidos ao redor do stio ativo dessas betalactamases. Atualmente mais de 160 enzimas TEM j foram descritas.

A presena de ESBL amplia o espectro dos antibiticos betalactamicos susceptves hidrlise por essas enzimas. Plasmdeos responsveis pelas ESBL frequentemente carreiam genes responsveis pela resistncia a outras classes de drogas como os aminoglicosdeos.

Em conseqncia, as opes para o tratamento por bactrias desse tipo so bastante limitadas, ficando quase que restritas aos carbapenemicos.

O rastreamento da produo de ESBL (como sensibilidade ao cefpodoxime, ceftazidime e aztreonam) deve ser sempre feito quando testamos enterobactrias.. No sistema MicroScan esta triagem feita com cefpodoxime e ceftazidime.

A confirmao da produo de ESBL por uma determinada cepa bacteriana baseia-se no aumento da sensibilidade quando associamos ao disco de cefalosporina de amplo espectro(cefotaxime, cefatizidime,etc.) um inibidor de beta lactamase como o acido clavulanico. O aumento da sensibilidade (igual ou maior a 5 mm de aumento de diametro do halo dos discos) confirma a produo de ESBL pela cepa.

Entre os fatores de risco identificados para o desenvolvimento de infeces por cepas produtoras de ESBL - segundo estudo brasileiro de 2006 - esto a idade (pacientes jovens),exposio a ventilao mecanica, uso de cateter venoso central e de antimicrobianos (principalmente cefalosporina de 4 gerao ou quinolona),alm de internao prolongada.

H ainda enterobactrias, como Enterobacter spp., Escherichia coli, K. pneumoniae, Citrobacter freundii e Serratia marcescens com resistncia antimicrobiana elevada, sendo o mecanismo mediado cromossomicamente por betalactamases de amplo espectro e devido s enzimas tipo AmpC (betalactamases classe C de Ambler). H resistncia a todos os betalactamicos, exceo dos carbapenemicos.

Nesses casos a deteco pode ser feita por meio de resistncia s cefamicinas, como a cefoxitina.

No h inibio dessas betalactamases por inibidores como clavulanato ou sulbactam, ao contrrio do que ocorre com as cepas produtoras de ESBL.

Carbapenemases so betalactamases com capacidades hidrolticas versteis. Tm habilidade para hidrolisar penicilinas, cefalosporinas, monobactamicos e carbapenemicos.

So membros das classes de betalactamases A, B e D de Ambler. A classe A e D so enzimas que tm mecanismo hidroltico baseado na serina (serina

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betalactamases), enquanto a classe B so metalo-betalactamases que contm zinco no stio ativo das enzimas.

A classe A do grupo das carbapenemases inclui membros das famlias SME, IMI, NMC, GES e KPC. Dessas, as KPC carbapenemases so mais prevalentes e mais frequentemente encontradas em plasmdeos de cepas de Klebsiella pneumoniae.

As metalobetalactamases, pertencentes classe B, incluem as famlias IMP, VIM, SVM e GIM. Hidrolisam todos os betalactamicos exceo do aztreonam e tm sido detectadas primariamente em Pseudomonas aeruginosa e o Acinetobacter spp. importante lembrar ainda que, em todo o mundo, tem sido crescente o encontro dessas enzimas em espcies de enterobactrias. A sensibilidade ao aztreonam e a resistncia aos demais betalactamicos sugere a presena de metalobetalactamase.

As de classe D, consistem de OXAbetalactamases (caracterizadas inicialmente pela elevada atividade hidroltica contra a oxacilina e cloxacilina) e so frequentemente encontradas em cepas de P. aeruginosa e Acinetobacter baumannii.

Nos casos de cepas multiresistentes de Pseudomonas e de Acinetobacter, incluindo os carbapenemicos, costuma-se recorrer s polimixinas (colistina e polimixina B), antibiticos txicos mas ainda eficazes nessas situaes.

Origem das metalobetalactamases:

As metalobetalactamases so produzidas intrnsecamente por alguns microrganismos oportunistas como a Stenotrophomonas maltophilia, o Chryseobacterium mengosepticum e a Aeromonas spp., alm do Bacillus cereus e da Legionella gormanii.

No entanto, a partir da dcada de 1990 tm sido detectados novos genes que codificam metalobetalactamases em bactrias importantes clinicamente, como as espcies mais frequentemente isoladas de bacilos gram negativos.

O primeiro relato de metalobetalactamase adquirida ocorreu em 1994, quando foi isolada uma cepa de Serratia marcescens - no Japo - resistente ao imipenem e s cefalosporinas de espectro ampliado. A enzima, responsvel pela inativao do antibitico, foi denominada IMP-1.

Atuamente s da enzima IMP so conhecidos 24 sub-tipos (IMP-1 a IMP-24).

As metalobetalactamases podem ser inativadas por agentes quelantes como o EDTA (cido etilenodiaminotetractico) ou o MPA (cido 2-mercaptopropinico) que inativam a enzima por meio de sequestrao dos ons zinco.

J existe no mercado uma metodologia de E-Test para deteco dessa betalactamase, com uma extremidade contendo imipenem e a outra contendo imipenem associado ao EDTA.

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Uma diferena superior a trs diluies na atividade encontrada na associao imipenem/EDTA em relao encontrada apenas com o antibitico, considerada como sendo devida presena da metalobetalactamase.

Em casos de septicemia h considervel diferena nas respostas entre bactrias gram positivas, como estafilococos e estreptococos, e as gram negativas, como as enterobactrias.

As gram negativas contm lipopolissacardeos como o principal determinante patognico e seu componente txico, o lipdeo A, quando liberado da parede celular bacteriana e exposto s clulas de defesa induz uma potente resposta com liberao de mediadores inflamatrios o que resulta em estmulo da coagulao, vasodilatao perifrica, choque, hipoperfuso e hipxia.

J as gram positivas tm na liberao de exotoxinas - sendo que algumas atuando ainda como superantgenos - o mecanismo fisiopatolgico mais importante na induo da resposta inflamatria e do eventual choque txico.

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Chave de identificao dos principais gneros de enterobactrias: Lac Gs H2S VP IND CIT Fenil Ure Mot Lis Orn1 Escherichia + + - - + - - - + + +/-

Shigella - - - - - - - - - - -

Edwardsiella - + + - + - - - + + +

Salmonella - + + - - + - - + + +

Citrobacter - + +/- - -/+ + - +/- + - -/+

Klebsiella + ++ - + -/+ + - + - + -

Enterobacter + ++ - + - + - - + +/- +

Serratia - + - + - + - - + + +

Proteus - + + - +/- + + ++ + - -/+

Morganella - + - - + - + ++ + - +

Providencia - -/+ - - + + + +/- + - -

Yersinia - - - - +/- - - +/- - - +

1 + = 90% ou mais de cepas positivas.

= 90% ou mais de cepas negativas +/- = 50 a 90% de cepas positivas -/+ = 50 a 90% de cepas negativas

Salmonella: Estudos recentes de DNA identificaram apenas duas espcies de Salmonella. A espcie Salmonella enterica, a mais importante em infeces humanas, pode ser dividida em seis grupos (A, B, C1,C2, D e E). J a classificao de Kauffmann-White, reconhece cada um dos sorotipos como uma espcie distinta(mais de duas mil), baseadas na identificao sorolgica dos antgenos O (somtico) e H (flagelar). Exemplos de algumas espcies importantes segundo a classificao de Kauffmann-White: Grupo A Salmonella paratyphi A. Grupo B S. schottmuelleri (antes, S. paratyphi B) e S. typhimurium. Grupo C1 S. hirsfeldi (antes, S. paratyphi C), S. choleraesuis e S. virchow. Grupo D S. typhi e S. enteritidis.

Shigella: No Brasil as espcies mais isoladas de quadros diarreicos so a S. flexneri e a S. sonnei.

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Bacilos gram negativos no fermentadores (BGNNF): Os no fermentadores constituem um grupo de microrganismos capazes de causar infeces oportunistas, especialmente em pacientes imunodeprimidos ou pacientes hospitalizados em que barreiras naturais foram transpostas como no caso de pacientes em uso de ventilao mecnica ou que utilizaram associaes de antimicrobianos de largo espectro, desde que essas bactrias no raramente apresentam multiresistncia. Devemos suspeitar da presena desse grupo de bactrias quando estamos frente a uma cepa com as seguintes caractersticas:

Incapacidade de fermentar a glicose, evidenciada pela inalterao da cor do agar Klieger ferro. Nesse caso, tanto a parte inclinada como o fundo do tubo permanecem inalterados. Mesmo que a bactria oxide a glicose na parte inclinada, no h viragem do indicador devido pequena concentrao de glicose no meio, alm do fato de que na oxidao a produo de radicais cidos bem menor do que na fermentao.

Reao de citocromo oxidase positiva (mas que pode ser negativa no caso, por exemplo, de colonias de Acinetobacter).

Dificuldade de crescimento em agar MacConkey. Um bacilo gram negativo que cresce bem no agar sangue e que no cresce (ou cresce mal) no agar MacConkey provavelmente um no fermentador.

Esquema preliminar para identificao de BGNNF:

1.Oxidase + e motilidade + : Pseudomonas, Burkholderia (que pode ser fracamente positiva para oxidase) e Alcaligenes.

2.Oxidase + e motilidade - : Flavobacterium e Moraxella. 3.Oxidase - e motilidade + : Chryseomonas e Stenotrophomonas. 4.Oxidase - e motilidade - : Acinetobacter.

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Esquema para identificao de espcies de Pseudomonas (todas oxidase +):

Pioverdina1 Piocianina ox/glicose arginina 42C gelatina

P. aeruginosa 2 + + + + + V P. fluorescens + - + + - + P. putida + - + + - - P. stutzeri3 - - + - - -

Esquema para identificao d