RESUMO DE MICROSCOPIA

FACULDADE DE AGRONOMIA ELISEU MACIEL

DEPARTAMENTO DE FITOSSANIDADE.

DISCIPLINA DE FITOPATOLOGIA

MicroscopiaApostila de Microscopia 03/2005

MICROSCOPIANLG.Introduo: A histria do microscpio ptico comea na antiguidade clssica com a lente de aumento simples, e apresenta um renascimento no sculo XVII. Desde ento sua tecnologia foi aperfeioada at atingir, no comeo do sculo XX, as limitaes impostas pela luz visvel.

O microscpio o instrumento bsico para o estudo da clula. A inveno do microscpio atribuda a Antoine Leeuwenhoek e Robert Hooke no sc. XVII.

J no sculo XIX, Schleiden e Schwann, com base nas observaes microscpicas at a efetuadas, elaboram a teoria segundo a qual todos os seres vivos so constitudos por clulas. Desde ento sua tecnologia foi aperfeioada at atingir, no comeo do sculo XX, as limitaes impostas pela luz visvel. Atualmente existem tcnicas de microscopia que no utilizam a luz visvel (Ultravioleta, raios X, microscpio eletrnico, microscpio acstico, microscpio de tunelamento e de fora atmica) e que permitem em alguns casos atingir resolues da ordem atmica.

Fig.1. Microscpio simples ou lente de aumento usada por Antoine von Leeuwenhoek

Fig. 2. Microscpio inventado pelo britnico Robert Hooke por volta de 1670.

Fig. 3. Microscpios compostos desenvolvidos durante os sculos XVII e XVIII.

Fig. 4. Microscpios do final do sculo XIX

Fig. 5. Microscpio moderno.Atualmente existem tcnicas de microscopia que no utilizam a luz visvel, como a luz ultravioleta, raios X, microscpio eletrnico (MET e MEV), microscpio acstico, microscpio de tunelamento e de fora atmica que permitem em alguns casos atingir resolues da ordem atmica; no entanto, o microscpio ptico continua sendo o instrumento mais prtico e simples para observaes de estruturas na faixa entre 1 cm e 1 micron, faixa de grande interesse na biologia, mineralogia, microeletrnica e outros campos. O microscpio ao mesmo tempo, um instrumento mecnico e ptico de preciso. Cuidados e manutenes constantes so necessrias para o mximo de eficincia e confiabilidade seja alcanada.

As unidades de medida utilizadas em microscopia so o micrometro (m), para a microscopia ptica, e o nanmetro (m) e o angstrom (), para a microscopia eletrnica. A sua relao com a unidade fundamental do sistema mtrico, o metro (m) e com o milmetro (mm) a seguinte:

1 m = 10-3 mm (0,001 mm) = 10-6 m

1 m = 10-3 m = 10-6 mm (0,000001 mm) = 10-9 m

1 = 10-1 m = 10-4 m = 10-7 mm (0,0000001 mm) = 10-10

Fig. 6. Tamanho relativo de clulas e de outros componentes.Tabela 1. Poder de resoluo: Tamanho de clulas e de seus componentes, desenhados em escala logartmica, indicando a faixa de objetos que podem ser propriamente visualizados a olho nu e atravs de microscpios ptico e eletrnico.tomoMolculasProtenasVrus/RibossomoBactriaCl AnimalCl Vegetal

0.1nm1nm10nm100nm1um10um100um1mm1cm

Microscpio Eletrnico

Microscpioptico

Olho Nu

Conceitos e Fundamentos:

A menor dimenso percebida pelo olho humano a vista desarmada de 10-2 mm. Os microscpios pticos so divididos em simples e composto.

Microscpio simples: Composto de uma lente biconvexa com distncia focal muito curta, mantida prxima do olho. A capacidade de ampliao de 300 X.

Microscpio composto: um instrumento ptico no qual se v dupla ampliao. Uma lente da primeira imagem ampliada do objeto, a qual vista e novamente ampliada por uma segunda lente.

Distncia focal: distncia que separa o foco do centro da lente. A distncia focal depende de seu raio de curvatura e de seu ndice de refrao (n).

Foco: o ponto onde convergem os raios paralelos a um eixo, aps atravessarem uma lente.

ndice de refrao n: definido como a razo entre a velocidade da luz no vcuo e a no meio em questo. Quanto mais diferentes os ndices de refrao dentro e fora da lente, maior o desvio da luz.Os microscpios pticos pertencem a duas classes fundamentalmente, em relao posio do feixe luminoso:

1. Microscpio de luz transmitida ou transparncia: Em que o feixe luminoso

atravessa o objeto para depois alcanar a objetiva

2. Microscpio de luz transferencial: Em que os feixes luminosos incidem

sobre o objeto sendo por este refletido para depois ento atingir a objetiva.

Partes do microscpio:a) Mecnica :

Base ou p - estativo - canho ou tubo - controle macro e micromtrico - revlver ou tambor - charriot - platina ou mesa.

b) tica:

Primas - refletores - filtros - diafragma - condensador - objetivas - oculares - polarizadores - espelhos.

Condensador Tipos de objetivas:

Acromticas / Plan-acromtica / Apocromticas / Semi--apocromticas / Plan - apocromticas / Monocromticas.

As objetivas Plan-apocromticas so as mais altas classes de objetiva de pesquisa e fotomicrografia.

40 = aumento da objetiva -

0.65 = abertura numrica160 = comprimento do tubo

0.17 = espessura da lamnula

Aberraes: As aberraes pticas so defeitos na imagens causadas pela

diferena entre o comportamento de uma lente real e uma lente ideal. A lente ideal tem pontos focais bem definidos; ao incidir um feixe de luz com raios paralelos ao eixo ptico, estes raios sero todos desviados para um mesmo ponto, conhecido como ponto focal, independente da cor do raio ou da altura.

Lente ideal

As Aberraes so refraes desiguais que sofrem os raios luminosos que atravessam um sistema de lentes. Quanto mais acentuadas forem as superfcies curvas das lentes, maiores sero as aberraes. Os instrumentos de alta qualidade como o microscpio costuma ser projetados de forma a minimizar estas aberraes. No entanto, erros na montagem, m regulagem ou combinaes de objetiva e ocular incompatveis podem gerar aberraes.

Aberrao cromtica - Ocorre quando o ndice de refrao do material no o mesmo para todas as cores. Isto faz com que o raio de luz azul seja desviado em um ngulo diferente do que o raio de luz vermelho, logo a distncia focal depender da cor. Um instrumento com Aberrao cromtica, produzir imagem com cores borradas e as bordas coloridas. Acromatismo o nome dado para o processo de correo desta aberrao.

Aberrao de esfrica - a diferena entre os raios de luz que entram com alturas (ngulos) diferentes na lente. A luz que entra pelo centro da lente focalizada no foco paraxial (prximo do eixo), mas luz que entra pela borda no faz foco neste ponto, produzindo um halo que faz com que a imagem perca nitidez. O nome Aberrao esfrica imprprio, pois esta aberrao pode ocorrer em lentes que no tenham superfcies esfricas. Este o motivo pelo as objetivas de maior aumento tm a especificada a espessura da lamnula com a qual devem trabalhar: a aberrao causada pela lamnula compensada no projeto da objetiva. A correo da Aberrao de esfericidade denominada de Aplanetismo.

Aberrao de Curvatura de campo A imagem de um objeto que fica em um plano (p.ex., lamnula) deveria ficar tambm em um plano, mas nem sempre isto ocorre. Muitas vezes a superfcie da imagem curva, e como esperamos uma superfcie plana o resultado que apenas obtemos o foco no centro do campo. Em microfotografia muito importante que o campo esteja perfeitamente plano.

Curvatura de campo Aberrao de distoro Uma imagem perfeita o aumento uniforme em todo campo. Se uma regio na borda do campo de viso tem uma ampliao diferente da do centro, isto causa uma distoro na imagem. O termo distoro refere-se troca da representao geomtrica de um objeto no plano da imagem. Por exemplo, um retngulo pode aparecer como uma figura geomtrica curvada para dentro (almofadinha) ou curvada para fora (barril).

Aberrao de distoro

Tipos de oculares

Ramsdem - Formadas por duas lentes plano-convexas, cujas faces convexas esto voltadas uma contra a outra denominada de oculares positivas. Hyugens - Formadas por duas lentes plano-convexas, cujas convexidades esto voltadas para o lado da objetiva ou, as partes planas voltadas para o olho do observador (oculares negativas).

As oculares so especificadas por:

Letra especificando o tipo , seguido de

Aumento

Dimetro do campo de viso

O dimetro costuma ser representado pelo "Nmero de Campo" , que o produto do campo de viso pelo aumento da objetiva , e representa o dimetro da imagem do campo visto (em mm).

Por exemplo:

P10x 13,4 uma Plan-acromtica (P) de 10x e nmero de campo 13,4 .

De acordo com a posio da ocular em funo da imagem intermediria , a ocular pode ser:

Positiva: a imagem intermediria formada FORA da ocular.

A ocular positiva permite o uso de acessrios no plano da imagem intermediria como gratculos ( escala graduada para medir dimenses no objeto )

Negativa : a imagem formada DENTRO da ocular

Compensao - Destina - se a compensar desigualdades de aumento para as diversas cores. Condensador - A funo do condensador a de fornecer luz. provido de um sistema de lentes que concentram os raios e joga o maior nmero possvel de feixes luminosos pela lente frontal da objetiva.

Tipos de condensadores. Os mais usados so: condensador de campo claro e de campo escuro. Tipos de microscopias Microscopia de campo claro - Permite iluminar rapidamente grandes campos claros, quando os trabalhos so executados com aumentos pequenos.

Microscopia de campo escuro - Os objetos aparecem luminosos em fundo escuro. O microscpio de fundo escuro baseia-se no princpio de que a luz dispersa pela superfcie dos materiais que possuem diferentes ndices de refrao. Consiste num microscpio comum cujo condensador substitudo por outro que apenas ilumina o objeto obliquamente. Graas ao efeito de Tyndall, os objeto aparecem brilhantes em conseqncia da disperso da luz, enquanto que o fundo permanece escuro.

Microscopia de campo claro Microscopia de campo escuro Microscopia de Contraste fase - Empregada para objetos no corados, que tenham ndice de refrao ligeiramente diferente daquele do fundo em que se encontram.

Microscopia de contraste de fase: o microscpio tico modificado, permitindo maior contraste entre materiais de espessuras ou densidades diferentes. Um condensador especial e a objetiva controlam a iluminao de maneira que essas diferenas sejam acentuadas, pela incidncia da luz atravs de vrias direes, e em diferentes partes da clula. O resultado, uma imagem com graus variveis de luminosidade, coletivamente chamados contrastes. Por este mtodo, os materiais mais densos aparecem claros, enquanto partes das clulas que tm densidade prxima da gua aparecem escuras. A vantagem de poder mostra estruturas celulares sem matar a clula.

Microscopia de contraste fase

Microscopia Interferencial Nomarsky - Os objetos aparecem sem halo, transparentes e de aspectos tridimensional. A vantagem sobre o contraste fase o de poder utilizar objetos mais grossos, como exemplo: nematide.

Microscopia Interferencial Nomarsky Microscopia de Fluorescncia - Os objetos corados aparecem luminosos com iluminao U.V. (objetos tais como lquidos e slidos absorvem a U.V).

A Microscopia de fluorescncia usa a tcnica na qual um espcime corado com corante fluorescente, que absorve a energia da luz com comprimentos de onda curtos, como aqueles da luz azul. O corante ento libera ou emite luz de um comprimento de onda maior, como da luz verde. Um procedimento laboratorial comum, usando este princpio, chamado de tcnica do anticorpo fluorescente ou imunofluorescncia. Para o teste de anticorpo fluorescente, o corante fluorescente ligado a um anticorpo conhecido que reage especificamente com certos microrganismos. Este complexo anticorpo-corante misturado com microrganismos desconhecidos e examinado por meio de um microscpio. Se o anticorpo se ligar a quaisquer microrganismos na amostra, estes ficaro fluorescentes, e assim, sero identificados.

Microscopia de fluorescncia

Microscopia Ultravioleta - Produz aumentos 2 X superior. As imagens so visualizadas numa emulso fotogrfica em tela de TV.

Microscopia Ultravioleta.

Microscopia eletrnica de varredura (MEV) fornece viso tridimensional da superfcie celular, pois o feixe de eltrons estreito se move para frente e para trs da superfcie dos microrganismos, que esto cobertos com um filme de metal. Os padres de eltrons so detectados por um dispositivo similar a uma cmera de televiso.

Microscopia eletrnica de varredura Microscopia eletrnica transmisso (MET): para visualizar vrus e estruturas diminutas. Existem vrios mtodos de colorao que utilizam metais pesados e radioativos. O mtodo a ser utilizado depende em parte do tipo de microscpio eletrnico disponvel, bem como da finalidade do exame. As tcnicas que utilizam corantes, ou aquelas que cortam os microorganismos em sees finas, so aplicveis microscopia eletrnica de transmisso. Os feixes de eltrons atravessam o espcime e a transmisso destes feixes forma uma imagem como aquelas descritas anteriormente. Os metais pesados podem ser usados como corantes, fazendo com que algumas partes das clulas apaream escuras porque os eltrons no podem atravess-las. O microscpio eletrnico Instrumento eltrico que utiliza eltrons para iluminar um objeto. Como os eltrons tm um comprimento de onda muito menor do que da luz, podemos mostrar objetos muito menores. O comprimento de onda de cerca de 100.000 X menor que as ondas luminosas dos microscpios ticos. A resoluo de 1:40.000.

Microscopia de transmisso eletrnicandice de refrao -

ar = 1.0

lcool = 1.323

gua = 1.333

leo = 1.470

leo de imerso = 1.52 - 1.56

Comprimento de onda de luz - (nm)

Infravermelho

650

Vermelho

620

Alaranjado

589

Amarelo

550

Verde

517

Azul

467

Violeta

423

Ultravioleta

390

Poder de ampliao (Magnitude) - Representa apenas o aumento que um microscpio proporciona, sem levar em considerao o seu poder de resoluo (P.R) e a sua abertura numrica (NA), isto , apenas os aumentos multiplicados da objetiva pela ocular.

P.A = Ocular X Objetiva Ex. 10 Oc X 20 Ob = 200 X

Aumento til - O aumento til de um microscpio o aumento do objeto at que no se perca o objeto em si.

AU = NA X 1000

Abertura Numrica ( NA ) - o ngulo formado com eixo e os raios mais externos, ainda cobertos pela objetiva. Representa a metade do cone de luz que entra na objetiva. A grandeza desse ngulo expressa pelos valores de seno da metade da NA, multiplicado pelo ndice de refrao (n), do meio que preenche o espao existente entre a lente frontal e a lamnula.

A Abertura Numrica influncia:

Resoluo: melhora com aumento de NA

Profundidade de campo: diminui com aumento de NA

Brilho da imagem: aumenta com NA.

Como o seno de qualquer ngulo no pode ser maior que 1 , um valor de NA maior que 1 s pode ser obtido com objetivas de imerso , onde o leo possui ndice de refrao comparvel ao do vidro (em torno de 1,5). Para objetivas a seco o NA menor que 1. Para objetivas de imerso o valor ligeiramente maior que 1, entre 1.2 e 1.5.

.

NA = n. sen (u)Poder de Resoluo - a capacidade de um microscpio distinguir distinta e separadamente dois pontos adjacentes. a medida do tamanho do menor objeto que pode ser visto ao microscpio. Na prtica o poder de resoluo expresso pelo limite de resoluo que a menor distncia que pode existir entre dois pontos, para que apaream individualizados. Em conseqncia, quanto menor for o limite de resoluo da objetiva, maior ser o respectivo poder de resoluo.

Os fatores que governam o (PR) so:

1. Propriedade das lentes (NA).

2. O comprimento de onda de luz usada pela iluminao (().

( 05 . (PR = ____________ PR = _____________ 2.NA NAExemplo:

a) Calcular o PR de um microscpio que apresenta as seguintes caratersticas: objetiva = 40X, NA = 0.75, ocular = 6X, comprimento de onda de luz 540nm (entre o espectro do o verde e amarelo). O que significa o resultado?

0.5 . ( 0.5 . 540

Pr = _______________ = _________________ = 360nm ou 0.36 ( NA 0.75

O resultado significa que 0.36 ( a menor distncia entre dois pontos que o microscpio consegue distinguir.

b) Dispondo de filtros azul (430 nm), verde (540 nm), vermelho (620 nm ) qual filtro usaria para obter o melhor PR ?

0.5 . 430 0.5 . 430

PR = __________________ = ___________________ = 0.28 ( 0.75 0.75

Usaria o azul, haja vista que o PR inversamente proporcional ao comprimento de onda de luz.

c) Dispondo de oculares 6X, 8X, 10X, 15X e 20x. Qual ocular daria o maior aumento til ?

MAGNITUDE = OBJETIVA X OCULAR

MAGNITUDE = 800 X. Que significa apenas multiplicar o valor da objetiva em questo (40X) pela ocular de maior aumento (20X).

AUMENTO TIL = NA X 1000

AU = 0.75 . 1000 = 750X se:

6X . 40 = 240

8X . 40 = 320

10X . 40 = 400

15X . 40 = 600

20X . 40 = 800

Escolheria a ocular de 15X, porque o mximo de aumento da objetiva de 40X dado pelo valor da sua abertura numrica, que igual a 0.75, que corresponde a um aumento til de 750X, por isso no adianta colocar ocular de 20X.

Cuidados e manuteno no trabalho dirio:

Guardar objetivas nas cpsulas quando no em uso;

Cobrir o microscpio.

Proteger o microscpio da umidade : Cuidado com os FUNGOS !

Evitar tocar nas roscas e junes : o suor pode corroer e comprometer as junes .

No tocar nas superfcies pticas!

Evitar mudanas bruscas de temperatura/umidade do ar ( como quando mudando o microscpio de sala) . Estas mudanas podem provocar condensao de umidade no interior do aparelho , em regies difceis de desmontar.

Ao guardar o microscpio por perodos longos:

Guardar em local claro, seco e arejado ;

Preparar um carto embebido com fungicida ;

Guardar componentes delicados (objetivas , oculares , etc) em armrios secadores ;

Antes de guardar , certificar-se da limpeza do aparelho.

Limpeza:Componentes pticos:

Tirar p com pincel de pelo fino, seco e desengordurado;

Evitar impresses digitais; limpar com camura ou seda;

Objetivas: limpar apenas superfcies expostas . A desmontagem de uma objetiva pode causar seu desalinhamento , e deve ser feita apenas em caso de necessidade;

lente posterior : pincel;

lente frontal: pano ou celulose e soluo de limpeza;

leo de imerso: usar solvente como ter , benzol ou Xilol (Ateno! O Xilol apresenta toxicidade!);

NO usar lcool etlico! Ataca a pelcula protetora;

Componentes mecnicos:

Graxas livres de cido (vaselina) e leo ;

Evitar p , vapores e substncias agressivas

Cuidados ao desmontar o microscpio para reparos:

DESLIGAR O APARELHO DA REDE ELTRICA .

Remover peas que no sejam necessrias ao reparo. Cuidado com peas soltas (p. ex. oculares) ao virar o microscpio.

Todo o trabalho de desmontagem , limpeza e remontagem deve ser feito sob uma bancada ( e no na mo ) , com todo o cuidado para evitar a queda de peas. Pode ser usada uma "toalha" de borracha ou outro material antiderrapante . A bancada deve estar limpa e livre de quaisquer objetos que no os necessrios para o trabalho.

O microscpio no deve ser deitado de forma que o peso force os componentes como ajustes de foco ou charriot. Cuidado com posies de equilbrio instvel!

Devem ser usadas SEMPRE as ferramentas adequadas. Uma chave de fenda inadequada , por exemplo , pode danificar a fenda do parafuso impedindo sua retirada.

A seqncia de desmontagem deve ser guardada. Sempre que possvel , retorne os parafusos aos seus orifcios originais logo aps a desmontagem de algum conjunto , para marcar a posio correta destes. As orientaes das lentes NUNCA devem ser invertidas.

Mantenha sempre o mnimo possvel desmontado em cada instante. As peas soltas de um conjunto que no precisaria estar desmontado apenas ajudam a gerar confuso.

Os componentes pticos (lentes , espelhos , prismas) devem ser tratados com o mximo cuidado. Uma vez retirados do conjunto , devem ser colocados sobre uma superfcie macia , longe de ferramentas ou peas que acidentalmente possam risca-los. Evite tocar com os dedos ou ferramentas nas superfcies destes componentes.

Ao trocar a lmpada , NUNCA tocar o bulbo com os dedos . O suor reage com o material do bulbo das lmpadas halgenas.

Anexos:

Caminho da luz atravs do microscpio ptico

Microscopia Contraste de fase

diatomceas

As diatomceas constituem um importante grupo de protistas fitoplantnicos pertencentes classe de algas designada como Bacillariophyceae (bacilariofceos). As diatomceas so organismos unicelulares, com uma teca: uma carapaa ou parede slicatada disposta em vesculas abaixo da membrana plasmtica, e que pode facilmente fossilizar. Existem, contudo, algumas espcies formam cadeias ou colnias simples que podero levar um observador incauto a consider-las como pluricelulares.

Microscpio eletrnico de transmisso.

Microscpio eletrnico de varredura.

Bibliografia Recomendada

ptica Geral:

Meyer-Arendt , J.R. Introduction to Classical & Modern Optics

Prentice-Hall 1989 (3a ed.)

Um livro bsico sobre ptica , com informaes prticas e um enfoque moderno.

Strong, J. Concepts of Classical Optics. W.H.Freeman & Co.San Francisco-1958

Enfoque mais aprofundado na prtica.

O'Shea , D. Elements of Modern Optical Design. John Wiley & Sons - NY -1985 Tratado compreensivo e compreensvel sobre como projetar sistemas pticos, com vrios exemplos.

Bureau of Naval Personal Basic Optics and Optical Instruments Dover NY 1969

Livro de treinamento em ptica da Marinha Americana ; embora no trate de microscpios , traz muita informao desde ptica bsica at instrumentos e fabricao de componentes , de forma simples.

Twyman , F. Prism and Lens Making. Adam Hilger - Bristol - 1988 ( 2a ed.)

Microscopia:

Olliver, C.W. The intelligent use of the Microscope. Chapman & Hall Ltd - London - 1951

Teoria ptica do Microscpio explicada de modo simples, voltado para uso. Altamente recomendado.

Payne, B. O . Microscope Design and Construction. Cooke,Troughton & Simms , LTD. York,England 1954

Stephanides, T. The Microscope -and the practical principles of observation

Faber & Faber LTD London 1947

Orientado s tcnicas de observao.

Benford, J. R. ; Rosenberger, H. E. Microscopes in Kingslake, R. (ed) Applied Optics and Optical Engineering vol IV. Academic Press - NY - 1967

A coleo "Applied Optics..." uma um marco de referncia na rea. TRAJETRIA DA LUZ SEGUNDO TIPOS DE MICROSCOPIAS

EMBED PBrush

EMBED PBrush

EMBED PBrush

Aspecto tridimensional de uma diatomcea observada com MEV (ampliao 5000x).

EMBED AcroExch.Document.7

PAGE 2

_1237747241.pdf

Condenserlens

Ughtsource

a. Bright-fleldmicroscope

Analyzer

Upper Wollastonprism

Objectivefocal-- --plane

ObJectIve

Specimen

Condenser

Condenser__ __focalplane

LowerWollastonprlsm

Polarizer

d.Nomarskidifferentlalinlerferencecontrast

microscope

Jure 2.13

ScaUered(reflecled)6ghl

Speclmen

condenser~ Condenser!ens lensDark.field . Annularstop Ughtsource dlaphragm Ughtsource

b.Dark.fleldmicroscope c.Phase-contrastmie~--BaniarIilter(blocks~ultravioletradialion Fluorochrome-c02. bulallOWSvislble (absorbsshort-w~IIghtthrough) radJallonanelem.1)onger.wavelengtt

Excilerfi/ter(removeslongwavel~ngths)

MercuryaR:lamp

Shortwavelengths

e.Transmitted.llghtfluorescencemicroscope

MercuryaR:Iamp

f. Epifluorescencemicroscope

rr \

Fluorochrome-co.(absorbsshort-Wradialionandemilonger-wavelengti