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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E CULTURA – MEC UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO - PRPPG PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ALIMENTOS E NUTRIÇÃO -
MESTRADO
ALINE MARIA DOURADO RODRIGUES
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS EM MEL PRODUZIDO NO PIAUÍ, BRASIL
TERESINA, PI 2014
ALINE MARIA DOURADO RODRIGUES
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS EM MEL PRODUZIDO NO PIAUÍ, BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Piauí, como requisito para obtenção do grau de Mestre em Alimentos e Nutrição. Área: Qualidade de Alimentos. Orientadora: Profª. Dra. Maria Marlucia Gomes Pereira. Co-orientadora: Profª. Dra. Maria José dos Santos Soares
TERESINA, PI 2014
FICHA CATALOGRÁFICA
Bibliotecária Denise Veras CRB 3/962
Rodrigues, Aline Maria Dourado
R696i Isolamento e identificação de leveduras em mel produzido no
Piauí, Brasil / Aline Maria Dourado Rodrigues – Teresina :
UFPI, 2014.
47 f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Piauí,
2014.
Orientador: Profª. DrªMaria Marlucia Gomes Pereira.
1. Apicultura 2. Leveduras (Fungos) 3. Identificação morfofisiológica
CDD 664.001579
ALINE MARIA DOURADO RODRIGUES
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS EM MEL PRODUZIDO NO PIAUÍ, BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Piauí, como requisito para obtenção do grau de Mestre em Alimentos e Nutrição. Área: Qualidade de Alimentos. Orientadora: Profª. Dra. Maria Marlucia Gomes Pereira. Co-orientadora: Profª. Dra. Maria José dos Santos Soares
BANCA EXAMINADORA
Maria Marlucia Gomes Pereira – (Orientadora/Presidente) Universidade Federal do Piauí – UFPI
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro - UFRRJ
Liline Maria Soares Martins – (2º Examinador) Universidade Federal do Piauí – UFPI
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo dom da vida e por ter me dado força para
concretização desse sonho, me revitalizando em todos os momentos difíceis.
À Universidade Federal do Piauí, por meio do Programa de Pós-
graduação em Alimentos e Nutrição, pela oportunidade de me tornar Mestre.
Aos professores que me acolheram e compartilharam conhecimento.
À minha orientadora, Profa. Dra. Maria Marlucia Gomes Pereira, pela
amizade, ensinamentos, empenho, paciência e credibilidade.
À minha co-orientadora Profa. Dra. Maria José dos Santos Soares pela
amizade, por ceder gentilmente o laboratório para execução das análises,
extrema ajuda nas análises de biologia molecular e pela contribuição
significativa na elaboração deste trabalho, obrigada por tudo.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela bolsa de estudos concedida.
Ao Prof. Dr. Francisco de Assis Baroni, por ajudar contribuindo com
ensinamentos valiosos para meus conhecimentos sobre morfologia e
identificação de leveduras e pela disponibilidade em participar como membro
desta banca examinadora.
À Profª. Dra. Liline Maria Soares Martins, pela boa vontade em ajudar
nas minhas análises de biologia molecular e por participar como membro desta
banca examinadora.
À Prof. Drª. Maria Christina Sanches Muratori, pela amizade,
acolhimento e ensinamentos.
À Cooperativa Mista de Apicultores de Simplício Mendes, Piauí
(COMAPI) e à Central de Cooperativa, Casa Apis na microrregião de Picos, PI
(CASA APIS), por conceder as amostras para a realização deste trabalho.
Aos colegas do mestrado pela convivência solidária e momentos de
alegria.
Aos funcionários do Núcleo de Estudos, Pesquisas e Processamento
dos Alimentos (NUEPPA) pelo convívio e trocas de conhecimentos, como o
Prof. Zeomar, à colega Lusmarina, Sr. Francisco, Sr. Antônio, Sr. Amintas, a
Nara e Prof. Dr. Manoel Henrique. E em especial, ao George, por sempre
mostrar boa vontade em ajudar no Laboratório de Controle Microbiológico dos
Alimentos.
À Universidad Nacional de Río Cuarto – Argentina pela oportunidade
de realizar estágio no qual aprendi muito para a realização deste trabalho. Em
especial, à Adriana Torres, Maria Marta, Lilia Cavaglieri e Carina Maricel
Pereyra, pelo acolhimento.
Aos amigos do NUEPPA por todos os momentos de trabalho em fins
de semana e feriados, amizade e pelos momentos de alegria, em especial, à
Carla, Cristiane, Juliana, Julliet, Raizza e Verbena.
Aos meus novos amigos Andrezza, Cecília, Diego, Dácia, José
Humberto (Joaquim), José Jones, Leidiane, Vanessa e Thiago, do Laboratório
de Microbiologia do Laboratório de Sanidade Animal (Lasan) pelo convívio e
trocas de conhecimentos.
À profa. Dra. Maria do Socorro Pires e Cruz pela disponibilidade de
utilizar os equipamentos de seu laboratório de biologia molecular e pela
contribuição tirando dúvidas e dando valiosas sugestões.
Aos meus pais Elisabeth Dourado e Ribamar Venâncio Rodrigues pelo
amor incondicional e por me apoiarem em todos os momentos difíceis que
passei durante a graduação.
À minha irmã Anália Dourado pelo amor, carinho e amizade.
Às minhas grandes amigas Aline Marques Monte e Ione Maria da Silva
pela amizade, companheirismo e pelos momentos em que me fizeram rir
quando me sentia triste e estressada.
E a todos que direta ou indiretamente torceram por mim, o meu muito
obrigada!
“Talvez não tenha conseguido
fazer o melhor, mas lutei para
que o melhor fosse feito. Não sou
o que deveria ser, mas Graças a
Deus, não sou o que era antes”.
Martin Luther King
RESUMO
O mel possui um perfil microbiológico característico em função da sua rica
composição físico-química, com um alto grau de resistência à proliferação de
micro-organismos. No entanto, a presença de leveduras osmotolerantes podem
promover a fermentação deste produto. Dessa forma, este estudo objetivou
isolar e identificar leveduras a partir da micobiota presente no mel produzido no
Estado do Piauí. Para isso, foram analisadas 97 amostras de méis florais de
Appis mellifera adquiridas em duas cooperativas de mel do Piauí, sendo 50
amostras adquiridas em um entreposto de mel da microrregião de Picos e 47
da microrregião de Simplício Mendes. As análises realizadas foram atividade
de água (Aa), contagem total de micro-organismos e identificação
morfofisiológica e bioquímica. A atividade de água dos méis apresentou valores
de 0,49 e 0,55, os valores médios para a contagem de leveduras foram 2,2 e
2,09 UFC.g-1 em log10(x+1). Foram isoladas sete leveduras que de acordo com
a identificação morfofisiológica e bioquímica foram classificadas como Pichia
anômala (2), Kloeckera apiculata (2), Zygosaccharomyces bailii (1),
Kazachstania exígua (1) e Brettanomyces bruxellensis (1). Conclui-se que a
qualidade do mel de abelhas Apis mellifera produzido pelas cooperativas
pesquisadas mostrou-se satisfatória quanto à baixa incidência de leveduras,
demonstrando a busca pela excelência no beneficiamento dos produtos
apícolas.
Palavras-chave: Apicultura. Leveduras (Fungos). Identificação morfofisiológica.
ABSTRACT
Honey has a characteristic microbiological profile depending on their rich physical and chemical composition with a high degree of resistance to proliferation of microorganisms. However the presence of osmotolerantes yeast can promote the fermentation of this product. Thus, this study aimed to isolate and identify yeasts from the mycobiota present in honey produced in the state of Piauí. For this, 97 samples of floral honeys from Appis melífera acquired in two cooperative honey Piauí were analyzed, 50 samples acquired in a warehouse of honey from Picos and 47 of Simplicio Mendes micro. The analyzes were water activity (Aw), total count of microorganisms and morphophysiological and biochemical identification. The water activity of the honeys showed values of 0.49 and 0.55, the average for the yeast count values were 2.2 and 2.09 CFU g-1 log10 (x +1). Seven yeasts isolated according to morphophysiological and biochemical were classified Pichia anômala (2), Kloeckera apiculata (2), Zygosaccharomyces bailii (1), Kazachstania exígua (1) e Brettanomyces bruxellensis (1). It is concluded that the quality of the honey bee Apis mellifera produced by cooperatives surveyed showed up satisfactory as to the low incidence of yeast, demonstrating the pursuit of excellence in the processing of bee products. Keywords: Apiculture. Yeasts (Fungi). Morphophysiological identification.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Produção mundial de mel entre 2007 e
2011........................................................................................................ 18
Tabela 2. Meios de cultivo utilizados para identificação de
leveduras................................................................................................ 33
Tabela 3. Média e desvio-padrão da atividade de água dos méis de
abelha Apis mellífera obtidos de cooperativas do semiárido
piauiense.................................................................................................. 35
Tabela 4. Resultado da contagem total de micro-organismos em méis
de abelha Apis mellífera obtidos de cooperativas do semiárido
piauiense.................................................................................................... 36
Tabela 5. Frequência das espécies de leveduras isoladas a partir de
méis de abelha Apis mellífera obtidos de cooperativas do semiárido
piauiense..................................................................................................... 37
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Produção de mel na região Nordeste, entre 2007 a
2011...................................................................................................... 19
Figura 2. Características microscópicas de Brettanomyces
bruxellensis.............................................................................................. 38
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
a.C Antes de Cristo
Aa Atividade de Água
AMA Agar Malte Acético
BPA’s Boas Práticas Apícolas
Cz Agar Czapek
DNA Ácido Desoxirribonucléico
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
g Grama
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
MEA Agar Extrato de Malte
ml Mililitro
MY10-12 Agar Extrato de Levedura, NaCl 10% e Glicose 12%
MY-50G Agar Extrato de Malte, Extrato de Levedura, Glicose 50%
ng Nanograma
nm Nanômetro
NUEPPA Núcleo de Estudos, Pesquisa e Processamento de Alimentos
PCR Reação em cadeia de polimerase
SC Saccharomyces cerevisiae
TBE Tris/Borato/EDTA
UFC Unidade Formadora de Colônia
UV Ultravioleta
YPD Agar/Caldo Extrato de Levedura Peptona Dextrose
μl Microlitro
μM Micrometro
% Percentual
°C Graus Celsius
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................... 13
2 OBJETIVOS........................................................................................... 15
2.1 Geral.................................................................................................... 15
2.2 Específico............................................................................................ 15
3. REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................. 16
3.1 Contexto da Apicultura Brasil, Nordeste e Piauí ................................. 16
3.2 Mel: conceito e características............................................................ 20
3.2.1 Composição e classificação do mel.................................................. 20
3.2.2 Processamento do mel..................................................................... 22
3.3 Atividade de água e sua importância no mel....................................... 23
3.4 Micro-organismos do mel.................................................................... 25
3.5 Leveduras............................................................................................ 27
3.5.1 Características gerais....................................................................... 27
3.5.2 Importância das leveduras na indústria............................................ 29
4. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................... 32
4.1. Coleta das amostras........................................................................... 32
4.2 Determinação da atividade de água.................................................... 32
4.3 Análise microbiológica......................................................................... 32
4.3.1. Contagem total de micro-organismos e isolamento de leveduras
a partir do ágar YPD ................................................................................. 32
4.3.2 Identificação morfofisiológica e bioquímica das leveduras............... 33
4.4 Análise Estatística............................................................................... 34
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................ 35
6. CONCLUSÕES..................................................................................... 39
9. REFERÊNCIAS..................................................................................... 40
ANEXO A - Chave de identificação de leveduras................................. 47
13
1 INTRODUÇAO
A apicultura constitui-se uma atividade em que se consegue obter bons
resultados econômicos e vem despertando interesse de muitos criadores em
várias instituições do Brasil, além de importante para o setor agropecuário em
nível nacional (PEREIRA et al., 2003; EVANGELISTA RODRIGUES et al.,
2005). Em adição aos aspectos econômicos, a apicultura brasileira reúne
alguns requisitos que também a credencia como uma atividade de elevado
potencial de inclusão social, atendendo às características econômicas, sociais
e ambientais, ou seja, do desenvolvimento sustentável (MOREIRA, 1996).
O semi-árido nordestino brasileiro se caracteriza por períodos de
chuvas curtos e irregulares, grandes áreas com solos de baixa fertilidade e
pouca profundidade, mas em sua maioria cobertos de matas silvestres
caracterizadas pela intensidade de floradas naturais. No entanto, esta região
mostra-se promissora para o desenvolvimento de projetos apícolas, pois possui
segmentos contínuos de terras compostos em grande parte pelo ecossistema
da caatinga, responsável por expressiva produção melífera, tornando a região
uma das maiores produtoras do País. Essas condições proporcionam um pasto
apícola sem agrotóxicos, prestando-se à produção de um mel livre de
contaminações químicas. O Piauí e o Ceará, estados da região Nordeste do
Brasil que são favorecidos por seus recursos naturais e tem se destacado na
produção de mel (RIBEIRO, 1998; VILELA; ALCOFORADO FILHO, 2000;
SODRÉ, 2005; SOUZA, 2007).
A apicultura no Estado do Piauí tem apresentado um aumento
crescente e o interesse dos consumidores por mel, leva à valorização desta
atividade, possibilitando a geração de emprego e renda. O estado destaca-se
pelo elevado potencial apícola, apresentando um produto de boa qualidade,
ressaltando-se seu valor nutricional e os caracteres sensoriais como aroma e
sabor, características muito valorizadas pelo mercado (VILELA, 2000).
O mel é resultado da desidratação e transformação do néctar (CRANE,
1983), sendo que se constitui, basicamente, de uma mistura complexa de
açúcares altamente concentrada e contém também, além dos açúcares em
solução, ácidos orgânicos, enzimas, vitaminas, flavonóides, minerais e uma
14
variedade de compostos orgânicos que contribuem para suas características
sensoriais e nutricionais (SERRANO, 1994).
Quando comparado com outros produtos de origem animal, o mel
apresenta uma baixa microbiota. Além de não ser um alimento estéril e está
susceptível a contaminações pela manipulação inadequada (AL-HIND, 2005).
A microbiota do mel é muito variável e advém de micro-organismos
originários de fontes primárias, introduzidos pelas próprias abelhas, e por
fontes secundárias advindas da forma inadequada de higiene durante o manejo
das colmeias e da manipulação do mel. O perfil microbiológico presente no mel
consiste de micro-organismos comuns, como bactérias do gênero Bacillus,
presentes no estado esporulado, fungos filamentosos dos gêneros Penicillium,
Mucor e leveduras do gênero Saccharomyces, que podem influenciar
negativamente na sua qualidade final à medida que se multiplicam em méis
expostos à ação de fatores externos, tais como condições de manipulação,
contaminação por esporos bacterianos, armazenamento em alta temperatura e
alta umidade relativa (SNOWDON; CLIVER, 1996; SODRÉ, 2005).
De modo geral, a qualidade microbiológica do mel está diretamente
relacionada à extração e ao beneficiamento. Fatores como a utilização de
procedimentos adequados para higiene dos equipamentos e instalações, a
observação da incidência de ventos, a ausência de insetos e animais
domésticos no local de beneficiamento, são alguns dos atributos que interferem
na qualidade microbiológica do mel.
Assim, devido à importância do mel como alimento e o quanto este
representa para o Estado do Piauí, como produto de exportação, torna-se
importante a sua caracterização microbiológica. Trabalhos recentes
caracterizaram a micobiota do mel do Piauí relativa aos fungos filamentosos.
Esta pesquisa direcionou a caracterização da micobiota no tocante a
identificação de leveduras, por serem estes micro-organismos de grande
relevância para a qualidade do mel e os principais agentes fermentadores. O
isolamento e identificação dos micro-organismos presentes no mel asseguram
e orientam na prevenção de possíveis contaminações que podem ocasionar
prejuízos econômicos e de saúde pública.
15
2 OBJETIVOS
2.2 Objetivo geral
Isolar e identificar leveduras no mel produzido no Estado do Piauí.
2.3 Objetivos específicos
Realizar contagem total de micro-organismos em meio YPD nas
amostras de méis
Determinar a atividade de água das amostras
Isolar e identificar as leveduras presentes no mel a partir de técnicas
morfofisiológicas e bioquímicas
16
3 REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 Contexto da Apicultura Brasil, Nordeste e Piauí
Com relação ao histórico da apicultura, alguns historiadores descrevem
que o uso das colmeias silvestres se deu dez mil anos antes de Cristo, quando
se começou a controlar as abelhas. Na pré-história, o alimento ingerido era
uma mistura de mel, pólen e cera, pois não se sabia separar suas substâncias,
sendo escasso e difícil encontrar um enxame. Somente em 400 a.C. é que
começaram a armazenar em potes, sendo que os egípcios foram os primeiros
na sua criação. Algumas civilizações antigas as consideravam sagradas e em
alguns países símbolo de riqueza, aparecendo em brasões, moedas coroas
(FERNANDES, 2009).
A apicultura brasileira se iniciou com enxames trazidos pelos
imigrantes com a colonização. Contudo, somente com a introdução de abelhas
africanas em meados de 1956 é que se deu a revolução da apicultura no Brasil
com o cruzamento das duas populações, produzindo um híbrido, conhecido
hoje, de abelhas africanizadas. Certamente que ocorreram problemas até que
se chegasse ao estágio de desenvolvimento atual, dada a agressividade
dessas abelhas e a inabilidade dos apicultores em lidar com a nova realidade
(SOARES, 2004).
O Brasil possui um grande potencial econômico para os apicultores em
função de características da atividade, tais como: necessidade de pequenas
áreas, ciclo curto, exigência de pequenos valores de capital inicial e de
recursos para o custeio de manutenção, fatos estes que são vantagens
competitivas em relação a outras criações de animais de maior porte. Dessa
forma, pode contribuir para a geração de emprego, melhoria na renda das
famílias e na condição de vida dos pequenos proprietários (SOUZA, 2007).
A diversidade da flora brasileira contribuiu para que a apicultura se
desenvolvesse em várias regiões do País. Porém, o avanço significativo da
atividade ocorreu principalmente na última década, quando a exploração da
apicultura de maneira intensa, envolvendo vários setores da sociedade;
17
começou a apresentar resultados. A região nordeste do país, que na década
passada produzia menos de 12,0% da produção brasileira, atualmente é
responsável por mais de 38,0% da produção (IBGE, 2011).
Apenas no início da década de 1980 a apicultura brasileira começou a
espalhar-se como atividade agropecuária e a conquistar adeptos em todo o
país, aumentando o número de apicultores e a produção brasileira de mel.
Porém, somente nos anos 90, a apicultura popularizou-se entre os pequenos
produtores que passaram a ver a vocação da atividade para a exploração da
mão-de-obra familiar. Isto levou ao crescimento da produção de mel e o Brasil
passou a ocupar a quinta posição mundial, tornando-se exportador de mel a
partir de 2002 (FREITAS, 2006).
A produção do mel brasileiro representava, até um passado bem
recente, cerca de 5% do mercado internacional, sendo praticamente, toda
produção destinada para o mercado interno (PAULA NETO; ALMEIDA NETO,
2005). É fato que somente a partir do ano de 2000 o produto “mel brasileiro”
tornou-se efetivamente conhecido no mercado internacional, pois no período de
2000 a 2003 a China (maior produtora mundial deste produto) perdeu espaço
no mercado internacional por usar o clorofenil (composto mesoiônico com largo
espectro de atividade biológica) para controlar enfermidade na colmeia, o que
não é o caso da apicultura brasileira. Já a Argentina, segundo país exportador,
sofreu redução na sua participação no mercado internacional em função de
medidas de anti-dumping, que são procedimentos que visam eliminar a
concorrência e aumentar as cotas de mercado, adotadas pelos Estados
Unidos. Esta situação proporcionou oportunidade de mercado aos demais
produtores e exportadores de mel natural, sendo o Brasil uns dos maiores
beneficiados por este cenário de demanda no mercado mundial neste período
(PINATTI et al., 2006; PAULA, 2008).
A produção mundial de mel em toneladas entre 2007 e 2011 (tabela 1)
demonstra que a produção em 2011 teve um grande aumento em comparação
com os anos anteriores e ainda mostra que a China foi o maior produtor, com
431.000 T, seguida pela Turquia, Ucrânia, Estados Unidos e Rússia. Neste
mesmo ano, o Brasil apresentou uma produção de 41.604 T proporcionando o
18
11° lugar no ranking mundial da produção de mel natural, segundo dados da
Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO (2013).
Tabela 1. Produção de mundial de mel entre 2007 e 2011 em toneladas.
País 2007 2008 2009 2010 2011 % em
2011
China 354.000 400.000 402.000 401.000 431.000 41,4%
Turquia 81.000 81.364 82.003 81.115 94.245 9,0%
Ucrânia 73.935 74.900 74.100 80.042 70.300 6,7%
EUA 67.700 74.293 66.413 70.900 67.294 6,5%
Rússia 67.286 72.000 62.000 60.000 60.010 5,8%
Índia 55.459 57.440 56.071 59.000 60.000 5,8%
Argentina 53.655 55.271 55.000 55.684 59.000 5,7%
México 51.000 55.000 53.598 51.535 57.783 5,5%
Etiópia 47.000 42.000 46.000 47.000 53.675 5,2%
Irã 42.180 41.000 39.661 41.525 47.000 4,5%
Brasil 34.747 37.792 38.974 38.017 41.604 4,0%
Total 927.962 991.060 975.820 985.818 1.041.911 -
Fonte: Food and Agriculture Organization of the United Nations (2013).
No cenário apícola mundial o Brasil é reconhecido pelo domínio da
metodologia de controle e manejo das abelhas africanizadas. A rusticidade e
resistência destas abelhas a doenças dispensam o uso de medicamentos para
tratamento, pelos apicultores brasileiros. Adicionalmente, a diversidade da flora
natural livre de contaminação pelo uso de agrotóxicos, reporta ao país uma
grande vantagem competitiva em relação aos seus concorrentes (PAULA,
2008).
A produção de mel de abelha registrada no ano de 2011 foi de 41,578
mil toneladas, sendo 9,4% maior do que aquela registrada no ano anterior. Em
termos estaduais, cabe assinalar o Rio Grande do Sul, que representava 16,8%
da produção nacional de mel, seguido pelo Paraná (12,5%) e pelo Piauí
19
(12,3%). Em termos municipais, destacavam-se Araripina (PE), Limoeiro do
Norte (CE) e Picos (PI). Neste ano, as 20 maiores produções municipais
representam apenas 17,7% do total produzido no Brasil (IBGE, 2011).
Em uma comparação entre a produção de mel entre as regiões
brasileiras pode-se observar que a região Sul e Nordeste são as mais
representativas, sendo que em 2011 a região Nordeste com um total de 16.911
toneladas ultrapassou a Sul em volume de produção (Figura 1).
Entre os principais estados produtores de mel do Nordeste no ano de
2011 estão: Piauí, Ceará, Bahia e Pernambuco. Neste mesmo ano o Piauí se
destacou como o maior produtor da região com 5.108 toneladas/ano (IBGE,
2011).
Figura 1. Produção de mel em toneladas no Brasil, no período de 2007 a 2011
Fonte: IBGE (2007, 2008, 2009, 2010, 2011).
A exportação de mel piauiense é significativa, principalmente na
Região do semiárido, destacando os municípios localizados no centro sul do
Estado, como Picos, Simplício Mendes e São Raimundo Nonato.
A apicultura na região semi-árida, principalmente no Estado do Piauí,
tem se consolidado como uma das atividades mais importantes do ponto de
vista econômico, social e ambiental, uma vez que ao empregar mão-de-obra
familiar e proporcionar geração de fluxo de renda, reduzindo a dependência
20
dos produtos agrícolas de subsistência, favorece a fixação do homem no
campo. Além disso, por depender dos recursos naturais, favorece a
preservação da flora nativa, garantindo, também, a preservação de espécies
animais dependentes desta flora (CAMARGO, 2002; 2005).
No entanto, embora na estiagem, o Piauí teve importante produção de
mel em 2011, mas em 2012 sofreu uma queda de 50%, por motivos climáticos.
Porém relativo ao ano de 2012 e 2013 ainda não foram divulgados dados
oficiais. (ANTUNES, 2013).
3.2 Mel: conceito e características
3.2.1 Composição e classificação do mel
A legislação brasileira define mel como o “produto alimentício
produzido pelas abelhas melíferas a partir do néctar das flores ou das
secreções procedentes de partes vivas das plantas ou mesmo de secreções de
insetos sugadores de plantas que ficam sobre partes vivas das mesmas, que
as abelhas recolhem, transformam, combinam com substâncias específicas
próprias, armazenam e deixam maturar nos favos da colmeia” (BRASIL, 2000).
O mel tem como característica o aspecto viscoso, sabor adocicado e
geralmente aroma agradável. Os açúcares são os principais constituintes,
sendo composto basicamente pelos monossacarídeos frutose e glicose, que
perfazem cerca de 70% do total; os dissacarídeos, como sacarose e maltose
somam cerca de 10% (CRANE, 1983; MOREIRA; DE MARIA, 2001,
BOGDANOV, 2011). Ainda conforme Crane (1983) o conteúdo de água, no
qual todos estes açúcares estão dissolvidos, representa 17-20% da
composição do mel.
O açúcar natural que se encontra na seiva das plantas é a sacarose,
constituída por glicose e frutose. Estes açúcares são segregados pelos
nectários da flor sob a forma de néctar: uma solução de açúcar e água. Os
nectários não são simples orifícios da planta que permitem a libertação da
seiva; são órgãos ativos que selecionam na seiva as substâncias que irão ser
21
segregadas, e em algumas espécies, a sacarose é parcial ou mesmo
totalmente decomposta em monossacarídeos antes de ser segregada.
Portanto, o néctar pode ter sacarose pura, uma mistura de sacarose, glicose e
frutose ou apenas glicose e frutose (HOOPER,1976; CRANE, 1983).
O néctar, pela sua constituição, é um substrato ótimo ao
desenvolvimento dos micro-organismos; porém, após se transformar em mel,
adquire condições adversas à multiplicação bacteriana, principalmente relativa
à pressão osmótica e atividade de água (CRANE, 1983).
Ainda em relação aos açúcares, elevadas concentrações de diferentes
tipos de açúcar são responsáveis pelas diversas propriedades físicas e
químicas do mel, tais como: viscosidade, densidade, higroscopicidade,
capacidade de granulação (cristalização). A norma brasileira estabelece um
mínimo de 65% de açúcares redutores (BRASIL, 2000).
O mel também apresenta em sua composição teores de proteínas,
aminoácidos, enzimas, vitaminas, minerais, substâncias bactericidas e
aromáticas, ácidos orgânicos, ácidos fenólicos, flavonóides e grãos de pólen,
bem como outros ingredientes, como a cera de abelhas procedentes do
processo de obtenção do mel, o que confere ao mel características como a cor,
odor e sabor (CODEX STANDARD FOR HONEY, 2001; KOMATSU;
MARCHINI; MORETI, 2002; SOUZA et al., 2008).
É comum encontrar no mel variações na sua composição física e
química e em características sensoriais como sabor e cor, tendo em vista que
vários fatores interferem na sua qualidade, tais como condições climáticas,
estágio de maturação, espécies de abelhas e origem floral (CRANE, 1983;
PÉREZ et al., 2007), assim como o processamento e o armazenamento deste
produto (AZEREDO et al., 2003).
A elaboração do mel resulta de duas modificações principais (reações)
sofridas pelo néctar, uma física pela desidratação (eliminação da água),
através da evaporação na colméia e absorção no papo, a outra reação química
que atua sobre o néctar, transformando a sacarose, através da enzima
invertase, em glicose e frutose; e outras duas reações em escala menor, que
consiste em transformar o amido do néctar, através da enzima amilase em
22
maltose e a enzima glicose-oxidase transforma a glicose em ácido glicônico e
peróxido de hidrogênio (LENGLER, 2000).
O mel pode ser classificado quanto à sua origem em mel floral ou mel
de melato. O mel floral é obtido dos néctares das flores, e ainda pode ser
classificado em: mel unifloral ou monofloral (quando o produto procede
principalmente de flores de uma mesma família, gênero ou espécie e possua
características sensoriais, físico-químicas e microscópicas próprias) ou mel
multifloral ou polifloral (obtido a partir de diferentes origens florais). O mel de
melato é formado principalmente a partir de secreções de partes vivas das
plantas ou de excreções de insetos sugadores de plantas que se encontram
sobre elas (BRASIL, 2000).
3.2.2 Processamento do mel
Quanto ao processamento do mel a sua formação se inicia quando a
abelha suga o néctar da flor e o armazena em sua bolsa melífera, o
depositando, posteriormente, no alvéolo do favo no interior da colmeia. A partir
daí, uma sequência de transformações ocorre, pois esse néctar passa pelo
aparelho digestivo de várias abelhas, as quais o sugam e o depositam
novamente no alvéolo, sucessivamente, implicando na perda de água. Nesse
processo, as enzimas invertase, diástase e glicose oxidase, que são
secretadas pelas glândulas salivares das abelhas, são adicionadas ao néctar e
auxiliam na sua maturação (CANO, 2002; SOUSA, 2007).
Em nível industrial ou artesanal o mel é processado em local
específico, denominado casa do mel, onde existe todo um ambiente propício e
normatizado pela ABNT (NBR15585, 2008), desenvolvido especialmente para
esta prática. O processo de extração do mel é relativamente simples, mas, de
acordo com a literatura, é durante esse procedimento que ocorrem as maiores
contaminações no produto (TOSI et al., 2002).
O beneficiamento do mel começa na colheita e no transporte das
melgueiras. Segundo Pereira et al. (2003), as melgueiras ao chegarem ao
entreposto devem ser depositadas em áreas isoladas do recinto onde ocorrerá
a extração e o beneficiamento do mel, devendo ser colocadas sobre estrados
23
limpos, que impeçam seu contato direto com o solo, transportando apenas os
quadros para o local de desoperculação. Após a desoperculação dos favos, os
quadros são colocados na centrífuga para ser realizada a extração do mel.
Depois de extraído, o mel pode ser retirado da centrífuga por gravidade, sendo
em seguida transportado, depois de filtrado, para o decantador, onde
permanecerá por 48 horas, a fim de que as partículas que não foram retiradas
pela filtragem se desloquem para a porção superior do decantador, que será
retirada durante o envase.
Os procedimentos de extração do mel são:
Recepção das melgueiras
Desoperculação
Centrifugação
Filtragem
Decantação
Envase
Armazenamento
Em cada etapa do processo existe perigo de contaminação,
necessitando de cuidados especiais. Por ser um produto higroscópico, o mel
capta muito facilmente a umidade e, consequentemente, os odores do
ambiente em que está sendo beneficiado (CRANE, 1983; TOSI et al., 2002).
3.3 Atividade de água e sua importância no mel
A atividade de água é um parâmetro que determina a água disponível
no alimento para o metabolismo microbiano; a água ligada às macromoléculas,
por forças físicas, não está livre para agir como solvente ou para participar de
reações químicas e, portanto, não pode ser aproveitada pelos micro-
organismos (DENARDI et al., 2005; FRANCO e LANDGRAF, 2008).
Em um alimento a atividade de água expressa a relação entre a
pressão do vapor de água do alimento e a pressão do vapor da água pura,
medidas à mesma temperatura, graduada em escala de zero a um (MUNGOI,
2008) e mensurada em valores de Aa. É uma unidade proporcional ao
24
conteúdo de água e também de solutos presentes nos alimentos (BOGDANOV,
2011).
A análise da atividade de água (Aa) é um importante fator a ser
utilizado, além da umidade. Está mais relacionada com os micro-organismos no
mel, pelo risco de fermentação, que também pode ser causada pela ação das
leveduras osmotolerantes (ZAMORA; CHIRIFE; ROLDÁN, 2006; ABRAMOVIC
et al., 2008). No trabalho de Zamora, Chirife e Roldán (2006) é feita uma
correlação entre a umidade e a atividade de água no mel e especificado um
limite entre 0,61 e 0,62 de Aa como segurança para evitar o crescimento de
leveduras osmotolerantes.
A atividade de água de méis cristalizados é maior do que de méis
líquidos, o que pode favorecer a fermentação de méis cristalizados (GLEITER
et al., 2005). Quando a cristalização ocorre de maneira indesejada e
incontrolada durante a estocagem, pode levar à formação de um produto
sobrenadante de coloração escura com cristalização não uniforme. A
separação de fases forma uma fase cristalina no fundo e uma fase líquida no
topo, tornando o mel menos atrativo para o consumidor. A camada do topo
contém elevado conteúdo de água, aumentando o risco de degradação do mel
por fermentação (GLEITER et al., 2005; ZAMORA; CHIRIFE; ROLDÁN, 2006).
Para o desenvolvimento dos micro-organismos considera-se a
atividade de água de 0,60 como limitante para multiplicação de qualquer micro-
organismo e, os valores mínimos descritos na literatura para desenvolvimento
de bactérias halofílicas é de 0,75, para fungos filamentosos xerofílicos e
leveduras osmofílicas 0,65 e 0,60, respectivamente. Em condições normais do
mel, a atividade de água varia entre 0,54 e 0,75 (FRANCO; LANDGRAF, 2008).
De acordo com Mendes et al. (2006) os valores considerados críticos
para a atividade de água são os superiores a 0,61, já que em tais condições
ocorre o desenvolvimento de leveduras osmotolerantes que podem promover a
fermentação do mel, e com isso, redução da vida de prateleira, sendo portanto,
um parâmetro importante para avaliar a qualidade do mel.
As condições de armazenamento são de fundamental importância para
a qualidade do mel, uma vez que a alta higroscopicidade do produto é uma
característica importante, já que um ambiente com alta umidade relativa pode
25
resultar em trocas na sua composição, alterando a Aa do produto, favorecendo,
a deterioração por micro-organismos que possam estar presentes no mel
(DENARDI et al., 2005; BOGDANOV, 2011).
3.4 Micro-organismos do mel
A legislação Brasileira vigente (BRASIL, 2000) não apresenta como
exigência de higiene os padrões microbiológicos que faziam parte do
regulamento técnico de identidade e qualidade do mel na portaria 367
(BRASIL, 1997). A fundamentação da retirada destas exigências é baseada
nas próprias características do mel, tais como: baixa atividade de água, alta
concentração de açúcares e baixo pH, o que lhe confere, em tese, uma
proteção natural contra micro-organismos.
O mel é um produto com tipos e níveis mínimos de micro-organismos
que são atribuídos às suas propriedades naturais e ao seu controle na
indústria, geralmente relacionadas a fatores físicos (osmolaridade) e químicos
(concentração de peróxido de hidrogênio e voláteis). A presença de compostos
fenólicos e da enzima glicose oxidase também proporciona uma barreira ao
desenvolvimento dos micro-organismos devido à forte característica oxidante
destes compostos (MOREIRA; DE MARIA, 2001). O mel tem uma microbiota
própria, introduzida pelas abelhas, podendo ser encontradas leveduras,
conídios fúngicos e esporos bacterianos vindos de fontes primárias quando o
néctar está sendo colhido, armazenado e amadurecido. Os conídios fúngicos
também podem contaminar o mel durante o processamento, por estarem no ar
(SNOWDON e CLIVER, 1996; OLAITAN et al., 2007).
Entre os micro-organismos encontrados no mel podem-se relacionar as
leveduras com capacidades fermentativas, até a presença de bactérias
esporuladas como o Clostridium botulinum, que podem causar doenças e
morte para o consumidor. Há a possibilidade de riscos a crianças com menos
de um ano de idade, sendo, portanto não recomendado o consumo por bebês.
Por ser, o Clostridium botulinum, um micro-organismo ambiental, o mel pode
ser contaminado por seus esporos aderidos às pernas das abelhas ou
26
veiculados pelo vento, quando os favos ainda estão no campo (FINOLA et al.,
2007).
Os fungos filamentosos encontrados com frequência no mel pertencem
aos gêneros Penicillium e Mucor relacionados à contaminação inerente ao
pólen. Estes micro-organismos normalmente não alteram o mel que tenha
índices de umidade adequados. Quando ocorre aumento da umidade, os
fungos filamentosos se desenvolvem e podem alterar o produto (GROSSO et
al., 2001).
Amostras de méis com boas práticas apícolas (BPA) e analisadas em
três níveis diferentes de utilização das BPA apresentaram uma contagem de
fungos filamentosos e leveduras com valores superiores a 2,0 ufc/g-1 (log10) em
35%, 75% e 55% das amostras para os tratamentos utilizados. Foi observado
ainda processo de fermentação em 20% das amostras do tratamento dois e
15% das amostras do tratamento três (MOURA, 2010).
Pesquisa realizada analisando os méis de Unidades de Extração de
Produtos Apícolas (UEPA) com boas práticas e sem boas práticas, demonstrou
que as principais espécies de fungos encontradas foram Aspergillus flavus,
seguido do Penicillium citreonigrum, o Penicillium implicatum, Aspergillus niger
(PIRES, 2011). A incidência de Aspergillus flavus no tratamento das UEPA que
utilizam boas práticas deve ser fator preocupante, por ser uma espécie capaz
de produzir aflatoxina (KLICH; PITT, 2002).
O principal gênero de leveduras observado no mel é o Saccharomyces
que pode causar fermentação em méis que tenham índices de umidade
elevados. Quando ocorre extração do mel de forma adequada, as leveduras
não estão presentes, e caso ocorra contaminação, elas podem ser observadas
em níveis desprezíveis. Leveduras comuns podem ser incorporadas ao mel
pelo pólen, por abelhas ou por manipuladores sem hábitos higiênicos
(GROSSO. et al., 2001). Sendo que, segundo Lengler (2000) os principais
fatores que podem favorecer a fermentação do mel são temperatura alta de
armazenamento, alta umidade do mel e grau de contaminação por leveduras.
Entre as leveduras presentes no mel predominam espécies do gênero
Saccharomyces, tendo sido também detectadas espécies do gênero
27
Zygosaccharomyces, Debaryomyces, Hansenula, Lipomyces e Pichia
(SNOWDON; CLIVER, 1996).
Em méis granulados e com elevados teores de umidade (maior que
21%), de cinzas e de compostos nitrogenados, podem ocorrer fermentações
conduzidas por leveduras, tornando o produto impróprio para consumo. A
concentração de leveduras é proporcional à disponibilidade da água. O gênero
Saccharomyces é o mais frequente no mel. Foram também isoladas leveduras
pertencentes às espécies Zygosaccharomyces rouxii, Hanensula subpeliculosa,
Saccharomyces norbensis, Kluyveromyces vanudenii e Endomycopsis burtonii
(BAHIRU et al., 2006).
Em um estudo que buscava identificar leveduras isoladas do mel,
baseada em técnica molecular para análise de RFLP da região ITS, da região
Trás-os-Montes, Portugal, Carvalho et al. (2005) identificaram nove espécies,
representando seis gêneros. Entre as espécies identificadas se destacam
Candida magnolia (25%), Rhodotorula mucilaginosa (17%), e
Zygosaccharomyces mellis (12.5%). No entanto as espécies de Candida
representaram mais de 45% dos isolados encontrados.
A fermentação do mel resulta do crescimento de leveduras
convertendo o açúcar em álcool, gás carbônico, ácidos orgânicos, e outras
combinações com sabores e odores indesejáveis (SODRÉ, 2005). A
fermentação é geralmente acompanhada pelo escurecimento e cristalização do
mel (FRAZIER e WESTHOFF, 1988).
3.5 Leveduras
3.5.1 Características gerais
As leveduras são organismos pertencentes ao grupo dos fungos,
heterotróficos, unicelulares, que podem estar presentes em diversos habitats,
mas são encontrados comumente em superfícies de tecidos de plantas,
incluindo flores e frutas principalmente em função do teor de açúcares contidos
nestes substratos. Muitas são aeróbias obrigatórias, embora outras sejam
consideradas anaeróbias facultativas. Podem ser esféricas, ovais ou elípticas,
28
ainda apresentar-se bastante alargadas (BAMFORTH, 2005). Possuem
características típicas dos fungos como presença de parede celular rígida e
núcleo organizado com membrana nuclear. Além disso, são aclorofiladas, tem
nutrição heterotrófica pela absorção dos nutrientes, sua reprodução sexuada se
por células especializadas denominadas ascósporos ou basidiósporos e a
assexuada por brotamento ou fissão. Adicionalmente, não apresentam
motilidade celular (FUENTEFRIA, 2007).
Estes micro-organismos pertencem às classes Ascomycetes e
Basidomycetes e aquelas que não apresentam o ciclo sexual definido agrupada
como fungos imperfeitos (FLEET, 2003; KURTZMAN; FELL; BOEKHOUT,
2011).
As leveduras de fissão são alongadas e se reproduzem por divisão
transversal. A célula-mãe se alonga, divide o núcleo, com uma parede
transversal (septo) próximo a uma região celular mediana, separando a célula
mãe em duas células-filhas uninucleadas. Este septo é formado por um
crescimento anular começando na parede e continuando até a divisão. A nova
parede se espessa antes da separação das células-filhas (SRIPIROMRAK,
2006).
A maior parte das leveduras na natureza caracteriza-se por uma forma
de reprodução vegetativa conhecida como brotamento ou gemulação, que
pode ser caracterizada pelo brotamento multilateral e polar. O brotamento polar
pode ocorrer em único polo ou nos dois polos da célula, denominado bipolar. A
reprodução sexual caracteriza-se pela formação de esporos sexuais
designados de ascósporos e basidiósporos. Esta estrutura quando presente
indicam que as leveduras são teleomorfas e a ausência às classifica em
anamorfas ou assexuadas (fungos imperfeitos), também conhecida como
Deuteromycetes (FUGELSANG; EDWARDS, 2007).
Quanto à composição química das leveduras, elas apresentam de 68%
a 83% de água além de substâncias nitrogenadas, carboidratos, lipídios,
vitaminas, minerais entre outros. Assim como qualquer forma de vida, as
leveduras necessitam de fatores físicos e químicos importantes e
indispensáveis para seu crescimento e reprodução. Alguns elementos são
29
basicamente necessários, como água, fontes de carbono e nitrogênio, oxigênio
e minerais (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005).
Em relação às necessidades nutricionais, as leveduras utilizam fonte
de carbono reduzido (mono e dissacarídeos), nitrogênio, minerais e vitaminas
(biotina, ácido pantotênico e tiamina) para o seu desenvolvimento. Os sais de
amônio são prontamente utilizados assim como os compostos de nitrogênio
orgânicos (aminoácidos e úreia). Crescem em ampla faixa de pH entre 1,5 a
9,3, sendo o ótimo entre 4,0 e 4,5. São mesófilas, crescem em temperatura de
25 a 28º C, reproduzem em até 18% de etanol e na presença de 33 a 60% de
sacarose (BAMFORTH, 2005).
De um modo geral as leveduras presentes no mel provêm do néctar
das flores e ou do conteúdo intestinal das abelhas (FRAZIER; WESTHOFF,
1988).
Os produtos com elevada concentração de açúcar que apresentam
atividade de água inferior a 0,85 são excelentes meio de crescimento para
micro-organismos osmotolerantes, em especial para as leveduras, que são os
principais micro-organismos responsáveis pela degradação de alimentos com
estas características.
De acordo com Pitt e Hocking, (2009) as leveduras podem ser
classificadas como as capazes de promover fermentação rápida e aquelas que
promovem fermentação lenta, as não fermentadoras e ainda as osmofílicas.
Como leveduras de fermentação rápida temos as Saccharomyces cerevisae,
Kloeckera apiculata. De fermentação lenta podemos citar as espécies Candida
parapsilosis, Torolopis holmii, Brettanomyces bruxellensis. A principal espécie
não fermentadora é a Rhodotorula mucilaginosa e como espécies osmofílicas
temos a Zygosaccaharomyces bailii, Zygosaccaharomyces rouxii,
Schizosaccharomyces pombe.
3.5.2 Importância das leveduras na indústria
A importância industrial das leveduras vem se estendendo além da
fermentação tradicional. Atualmente, os produtos da biotecnologia a partir de
leveduras afetam muitos setores comerciais importantes, como as indústrias de
30
alimentos, bebidas, biocombustíveis, produtos químicos, enzimas industriais,
produtos farmacêuticos, produtos agrícolas e o ambiente. Tem-se a previsão
de que a produção tradicional de álcool etílico, por indústrias cervejeiras,
vinícolas, indústrias de bebidas destiladas e de combustíveis, e a produção de
biomassa, pela indústria alimentícia, irão continuar a fornecer a maior
quantidade de produtos fermentados do mundo (PRETORIUS; DUTOIT; VAN
RENSBURG, 2003).
O consumo de alimentos fermentados vem aumentando desde a
década de 1970, e inclui alimentos como produtos lácteos (iogurtes, queijos,
soro de leite), salsichas, bebidas fermentadas alcoólicas, vegetais, frutas,
molhos, entre outros (GIRAFFA, 2004).
A ação das leveduras nos alimentos pode levar a aspectos
indesejáveis, como a deterioração detectada pela mudança das propriedades
físicas e sensoriais dos alimentos. Alguns atributos tornam os fungos
potencialmente capazes de causar deterioração em alimentos, tais como:
grande versatilidade para crescer em substratos e condições que outros micro-
organismos não são capazes de utilizar, como por exemplo, atividade de água
(Aa) reduzida; pH reduzido; crescem em ampla faixa de temperatura;
versatilidade metabólica com a utilização de diferentes fontes de carbono,
nitrogênio e energia; capacidade de esporulação e disseminação em diferentes
condições ambientais (SILVA, 2008).
As leveduras encontradas em alimentos podem ser divididas em três
grupos:
Deterioradoras extremófilas, que são osmotolerantes, altamente
fermentativas, resistentes a conservantes e requerem vitaminas para o
seu crescimento (DAVENPORT, 1996; DAVENPORT, 1997;
STRATFORD, 2006). As leveduras desse grupo, que correspondem às
espécies Brettanomyces anomalus, B. bruxellensis, B. naardenensis,
Hanseniaspora uvarum, Saccharomyces bayanus, S. cerevisiae, S.
exiguus, S. pombe, Torulaspora delbrueckii, Zygossaccharomyces bailii,
Z. bisporus, Z.microellipsoides e Z. rouxii, são relatadas com menos
frequência em alimentos deteriorados, no entanto, uma vez presentes,
provocam uma grande deterioração (STRATFORD, 2006).
31
Deterioradoras oportunistas, pois causam deterioração quando ocorre
descuido no processamento ou estocagem do alimento. As leveduras
que pertencem a este grupo incluem, por exemplo, Candida albicans, C.
boidinii, C. glabrata, C. intermedia, C. lambica, C. parapsilosis, C.
pseudointermedia, C. pseudolambica, C. sake, C. tropicalis, C.
lusitaniae, C. krusei, H. uvarum, Pichia anomala, P. guilliermondii, P.
membranifaciens, T. delbrueckii e Lachancea fermentati, e são as mais
envolvidas na deterioração de alimentos (DAVENPORT, 1996;
STRATFORD, 2006).
Não deterioradoras e que, quando presentes no alimento podem
funcionar como micro-organismos indicadores de falta de padrões de
higiene. As leveduras pretas como Aureobasidium pullulans, as rosas,
como espécies de Rhodotorula e Sporobolomyces, além de
Cryptococcus albidus, C. laurentii e C. difluens, compõem esse grupo
(DAVENPORT, 1996; STRATFORD, 2006).
32
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Coleta das amostras
Foram analisadas 97 amostras de méis florais de Appis melifera,
coletadas no período compreendido entre março e maio de 2013. As amostras
foram adquiridas em duas cooperativas de mel do Piauí, sendo 50 amostras
adquiridas em um entreposto de mel da microrregião de Picos (Cooperativa A)
e 47 da microrregião de Simplício Mendes (Cooperativa B).
As amostras foram coletadas assepticamente em frascos esterilizados
com capacidade de 40 gramas. Em seguida foram encaminhadas ao
laboratório de Controle Microbiológico de Alimentos do Núcleo de Estudos,
Pesquisas e Processamento de Alimentos (NUEPPA) do Centro de Ciências
Agrárias da Universidade Federal do Piauí.
4.2 Determinação da atividade de água
A determinação da atividade de água foi efetuada com o auxílio do
determinador de Aa modelo Decagon Pawkit digital (Decagon - EUA)
previamente calibrado, que utiliza a técnica de determinação do ponto de
orvalho em espelho encapsulado para medir a atividade de água de um
produto.
4.3 Análise microbiológica
4.3.1. Contagem total de micro-organismos e isolamento de leveduras a partir
do ágar YPD
De cada amostra foram pesados assepticamente 10 gramas de mel e
adicionados a 90 mL de solução peptonada a 0,1% e glicose 20%, obtendo-se
a diluição inicial de 10-1, e a partir dessa diluição foram preparadas diluições
decimais até 10-3. De cada diluição foram inoculadas alíquotas de 0,1 mL
(duplicata) pelo método de semeadura por espalhamento em superfície no ágar
33
extrato de levedura peptona dextrose (YPD). As placas foram incubadas a 25
°C por até sete dias em estufa microbiológica. Para a obtenção de isolados
puros, cada colônia foi repicada em placas de YPD pelo método de
esgotamento em placas por estrias. Os isolados obtidos a partir de uma única
UFC foram subcultivados em tubos inclinados de ágar extrato de malte (MEA)
para posterior identificação em espécies.
4.3.2 Identificação morfofisiológica e bioquímica das leveduras
A partir de cada isolado puro, obtido nos tubos de MEA, foi feita uma
suspensão em tubos contendo 5 mL de água peptonada a 0,1%, que foi
semeada em duplicata, por meio de estrias e esgotamento em diferentes meios
de cultivos utilizados para a identificação (PITT; HOCKING, 2009). Os
diferentes meios de cultivo utilizados na identificação das leveduras isoladas
estão apresentados na tabela 2.
Tabela 2. Meios de cultivo utilizados para identificação de leveduras
Identificação Função
Agar extrato de malte (MEA) a 25ºC Estudar a morfologia da colônia
Agar extrato de malte (MEA) a 37ºC Determinar o possível crescimento em temperatura corporal e/ou elevadas
Agar Czapek (Cz) a 25ºC Determinar a capacidade de utilização do nitrato como única fonte de nitrogênio
Agar malte acético (AMA) a 25ºC Establecer a resistência a conservantes
Agar extrato de malte, extrato de levedura, glicose 50% (MY-50G)
Determinar o crescimento em baixa atividade de água, em presença de alta concentração de carboidratos
Agar extrato de levedura, NaCl 10%, e glicose 12% (MY10-12)
Determinar o crescimento em baixa atividade de água, na presença de alta concentração de cloreto de sódio
Fonte: Pitt e Hocking (2009).
34
As placas contendo os meios de cultura foram mantidas em atmosfera
controlada, de acordo com a temperatura descrita. O crescimento nas placas
era analisado após três e sete dias de incubação. Foram observadas a
presença de crescimento nos diferentes meios e as características
morfológicas das colônias, como cor, tamanho e aspecto. Para cada colônia foi
preparada uma lâmina a partir da placa de MEA a 25ºC observando-se as
características microscópicas como: tamanho e forma celular, modo de
reprodução, disposição das células (simples, em pares, em cadeias), presença
de pseudomicélio e produção de ascósporos. Cada uma das cepas foi
identificada em gênero e espécie utilizando-se a chave taxonômica, proposta
por Pitt e Hocking (2009).
4.4 Análise Estatística
Os dados da análise de atividade de água foram submetidos a cálculo
de média e desvio padrão. Os resultados das contagens total de micro-
organismos foram transformados em log10(x+1), as variáveis estudadas foram
comparadas pela Analise de Variância pelo teste de F e teste t-Student,
utilizando programas estatísticos do GraphPad Prisma V.3 statistical software
(Califórnia, Estados Unidos). Foram consideradas diferenças significantes
quando p< 0,05. Os demais dados foram submetidos à estatística descritiva
como média e frequências absolutas e relativas.
35
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os valores médios obtidos de atividade de água (Aa) nas amostras de
méis de abelha Apis mellifera obtidos de cooperativas do semiárido piauiense
encontram-se listados na tabela 3.
Tabela 3. Média e desvio-padrão da atividade de água dos méis de abelha
Apis mellifera obtidos de cooperativas do semiárido piauiense, 2013
Cooperativa
Atividade de Água
Menor valor Maior valor Média e Desvio
Padrão
A 0,41 0,61 0,49b±0,03
B 0,32 0,72 0,55a±0,1
Legenda: A – Mel proveniente do entreposto de mel da microrregião de Picos. B –
Mel proveniente do entreposto de mel da microrregião de Simplício Mendes; a, b=Letras iguais não diferem estatisticamente (p<0,05).
Foram observadas diferenças significativas entre as cooperativas “A” e
“B” os valores de Aa das cooperativas analisadas com a Cooperativa “B”
apresentando os maiores valores (p<0,05). No entanto, conforme Franco e
Langraf (2008) os limites de atividade de água entre 0,65-0,60 é limitante para
o crescimento dos micro-organismos, como fungos filamentosos xerofílicos e
leveduras osmofílicas. Portanto, os valores de Aa determinados nos méis das
cooperativas A e B situaram-se abaixo do limite de multiplicação microbiana.
A atividade de água não é um parâmetro regulamentado pela legislação
brasileira, porém esta análise é um importante fator a ser utilizado, pois está
mais relacionada com os micro-organismos no mel, pelo risco de fermentação,
que também pode ser causada pela ação das leveduras osmotolerantes
(ZAMORA; CHIRIFE; ROLDÁN, 2006; ABRAMOVIC et al., 2008).
A relevância desta análise está relacionada ao fato da água ser o
principal componente de muitos alimentos e ter influência sobre sua
estabilidade bioquímica (GLEITER et al., 2005), sendo atualmente uma análise
36
utilizada para a definição de regulamento de segurança com enfoque no
crescimento de micro-organismos indesejáveis, definições de potencial de
riscos alimentares, controle de pontos críticos, normas para alimentos em
conservas e exigências de embalagem (SCOTT et al., 2001).
Os valores de Aa encontrados 0,49 (A) e 0,55 (B) mostraram-se
semelhantes quando comparados aos valores encontrados por Abramovic et al.
(2008) em 150 amostras de mel da Eslovênia com a variação de 0,483 a 0,591;
Moura (2010) analisando méis provenientes de Unidades de Extração de
Produtos Apícolas do Piauí com e sem boas práticas verificou valores de 0,58 a
0,61; Pires (2011) pesquisando a qualidade dos méis piauienses encontrou
valores de 0,68 a 0,76; Kuroishi et al. (2012) apresentou valores superiores ao
encontrado nesta pesquisa, com variação de 0,563 a 0,576 em méis da região
de Itapira-SP.
Os resultados da contagem total de micro-organismos no meio YPD
encontram-se na tabela 4. Foi evidenciado um crescimento considerável de
fungos filamentosos e bactérias no meio indicado para o isolamento de
leveduras, o que demonstra a dificuldade na busca de metodologias para a
pesquisa de leveduras em alimentos. Apesar da baixa atividade de água dos
méis analisados, ainda assim ocorreu uma contagem total de micro-organismos
com valores médios que foi 2,2 UFC.g-1 (Log10) para “A” e 2,09 UFC.g-1 (Log10)
para “B”. Deste total de micro-organismos isolados, apenas sete eram
leveduras.
Tabela 4. Resultado da contagem total de micro-organismos, no meio YPD a
25°C, de méis de abelha Apis mellifera obtidos em cooperativas do semiárido
piauiense, 2013
Cooperativa
Contagem Total de Micro-organismos
Menor valor Maior valor Média e Desvio
Padrão
A 0,47 4,04 2,2a±0,81
B 0,20 3,4 2,09a±0,80
Legenda: A – Mel proveniente do entreposto de mel da microrregião de Picos. B – Mel
proveniente do entreposto de mel da microrregião de Simplício Mendes; a, b=Letras
37
iguais não diferem estatisticamente (P<0,05). UFC.g-1 em log10(x+1)= unidades
formadoras de colônias por grama, em logaritmos da base dez, acrescentados de uma
unidade.
Podemos constatar que a aplicação das boas práticas presente no
beneficiamento dos méis pelas Cooperativas analisadas tem sido determinante
para a qualidade do mel, pois grande parte da produção é destinada ao
comércio exterior. Por outro lado, deve-se atentar para o fato de que outros
micro-organismos osmotolerantes conseguem se multiplicar mesmo em uma
concentração de 20% de glicose no meio, o que requer atenção nas condições
de armazenamento, a fim de evitar riscos à saúde do consumidor.
A identificação morfológica das leveduras isoladas foi realizada através
da chave taxonômica de referência de Pitt e Hocking (2009). A tabela 5
apresenta a identificação e frequência das leveduras isoladas a partir das
amostras de méis.
Tabela 5. Frequência das espécies de leveduras isoladas a partir de méis de
abelha Apis mellífera obtidos de cooperativas do semiárido piauiense, 2013
Espécies
Isolados
N° %
Pichia anomala 2 28,6%
Kloeckera apiculata 2 28,6%
Zygosaccharomyces bailii 1 14,3%
Kazachstania exigua 1 14,3%
Brettanomyces bruxellensis 1 14,3%
Total 7 100%
As espécies de Pichia anomala e Kloeckera apiculata foram as
espécies com maior frequência (28,6%), em seguida vieram
Zygosaccharomyces bailii, Kazachstania exígua e Brettanomyces bruxellensis.
A chave taxonômica de Pitt e Hocking (2009) preconiza os aspectos
38
macroscópicos nos meios de cultura e também do aspecto microscópico da
célula leveduriforme.
A figura 2 mostra as características microscópicas da levedura no meio
MEA a 25 °C para a identificação das espécies.
Figura 2. Características microscópicas de Brettanomyces bruxellensis. Sugestivo de
células vegetativas e reprodução por brotamento. Aumento de 400x.
A chave de identificação de Pitt e Hocking (2009) é um sistema simples
e rápido, que permite a identificação das principais espécies de leveduras
relacionadas à deterioração de alimentos. Entretanto, é um sistema que
relaciona poucas espécies limitando a busca por outras que possam surgir
como contaminantes ocasionais, e desta forma, alguns isolados podem ser
erroneamente classificados.
Devido a estas dificuldades de identificação de leveduras, as técnicas
moleculares são uma opção por possibilitar identificar um amplo número de
espécies, pois estes procedimentos tem gerado um grande número de estudos
sobre a classificação, identificação e ecologia das espécies de leveduras, e por
serem mais confiáveis pelo seu alto nível de especificidade (GUILLAMÓN et
al., 1996; HIERRO, 2004; KURTZMAN; FELL; BOEKHOUT, 2011).
Exemplo de
Brotamento
39
6 CONCLUSÕES
A qualidade do mel de abelhas Apis mellifera produzido pelas
cooperativas piauienses mostrou-se satisfatória quanto à contagem total de
micro-organismos e a presença de leveduras, evidenciando a importância das
boas práticas na produção e beneficiamento do mel.
A atividade de água observada neste trabalho não favorece o
crescimento de micro-organismos osmifílicos, no entanto em condições
favoráveis pode ocorrer o desenvolvimento de micro-organismos que podem
estar presentes no mel. Portanto as condições adequadas de produção,
beneficiamento e armazenamento são fundamentais para evitar crescimento
destes e, por conseguinte alteração do mel e seus derivados.
As leveduras isoladas pertencem às espécies: Pichia anomala,
Kloeckera apiculata, Zygosaccharomyces bailii, Kazachstania exigua e
Brettanomyces bruxellensis.
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ANEXO A – Chave de identificação de leveduras
Pitt e Hocking (2009)
![[E-book] Manual Procedimentos Enfermagem - Guia de Bolso (by Baroni)](https://img.document.onl/doc/110x75/5571fc5549795991699705cf/e-book-manual-procedimentos-enfermagem-guia-de-bolso-by-baroni.jpg)
