MINISTÉRIO DA SAÚDE FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ … · À Laurinha, por estar sempre presente. Por entender a minha ausência e estar sempre disposta a momentos de descontração para

MINISTÉRIO DA SAÚDE

FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ

CENTRO DE PESQUISAS RENÉ RACHOU

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

EFEITO DA TEMPERATURA NA INFECÇÃO DE RHODNIUS PROLIXUS POR TRYPANOSOMA CRUZI E TRYPANOSOMA RANGELI.

por

Juliana de Oliveira Rodrigues

BELO HORIZONTE

FEVEREIRO / 2013

DISSERTAÇÃO MDIP-CPqRR J.O. RODRIGUES 2013

II






por


Dissertação apresentada com vistas à obtenção do Título de Mestre em Ciências na área de concentração Doenças Infecciosas e Parasitárias

Orientação: Dra. Alessandra Aparecida Guarneri

BELO HORIZONTE

FEVEREIRO / 2013

III

Catalogação-na-fonte Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ Biblioteca do CPqRR Segemar Oliveira Magalhães CRB/6 1975 R696e 2013

Rodrigues, Juliana de Oliveira.

Efeito da temperatura na infecção de Rhodnius prolixus por Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli / Juliana de Oliveira Rodrigues. – Belo Horizonte, 2013.

XVIII, 83 f.: il.; 210 x 297mm. Bibliografia: f. 79 - 101 Dissertação (mestrado) – Dissertação para

obtenção do título de Mestre em Ciências pelo Programa de Pós - Graduação em Ciências da Saúde do Centro de Pesquisas René Rachou. Área de concentração: Doenças Infecciosas e Parasitárias.

1. Doença de Chagas/transmissão 2. Trypanosoma

cruzi/parasitologia 3. Trypanosoma rangeli/parasitologia 4. Interações Hospedeiro-Parasita/fisiologia I. Título. II. Guarneri, Alessandra Aparecida (Orientação).

CDD – 22. ed. – 616.936 3

IV






por


Banca Examinadora:

Profa. Dra. Alessandra Aparecida Guarneri (Presidente)

Prof. Dr. Rodrigo Pinto Soares

Profa. Dra. Andrea Mara Macedo

Dissertação defendida e aprovada em: 28/02/2013

V

Aos meus pais e ao meu irmão.

A todos aqueles que de alguma maneira contribuíram para a minha formação pessoal e profissional.

VI

“Todo o futuro da nossa espécie, todo o governo das sociedades, toda a

prosperidade moral e material das nações dependem da ciência, como a vida do

homem depende do ar. Ora, a ciência é toda observação, toda exatidão, toda

verificação experimental. Perceber os fenômenos, discernir as relações, comparar as

analogias e as dessemelhanças, classificar as realidades, e induzir as leis, eis a

ciência; eis, portanto, o alvo que a educação deve ter em mira.”

Rui Barbosa

VII

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Alessandra Guarneri, por ter acreditado no meu potencial e confiado a mim esse trabalho. Pela oportunidade de aprendizado e orientação que me proporcionaram um rico conhecimento científico e profissional. Pelos conselhos e amizade construída ao longo desses anos de convivência.

Ao Dr. Marcelo Gustavo Lorenzo, pela colaboração e disponibilidade para enriquecedoras discussões científicas.

Ao Profo. Dr. Simon Elliot, Sam, pela colaboração nesse projeto.

Ao Profo. Dr. Olindo Assis, pelo auxílio na técnica de Citometria de Fluxo.

À Dra. Liléia Diotaiuti por ter me recebido no laboratório de Triatomíneos.

À Dra. Juliana Alves da Silva, Ju, que caiu do céu como um anjo e contribuiu imensamente para os experimentos de biologia molecular e análises dos dados. Pela imensurável ajuda e convivência prazerosa.

Aos professores da pós-graduação pelos ensinamentos. De maneira especial ao Dr. João Carlos Pinto Dias pelo exemplo de profissional e pela acolhida sempre carinhosa.

Ao Profo. Dr. Jarbas que me ingressou na carreira científica.

À Rafa Paim, pela disponibilidade em ajudar nos experimentos e escrita. Pelo incentivo e amizade. Pelas risadas e bons momentos vividos nas viagens a congressos.

À minha pequena grande amiga Robertinha! Pela imensurável ajuda. Pela alegria contagiante mesmo nos dias mais difíceis. Pela paciência e conselhos. Pelos inúmeros bons momentos vividos no cotidiano e viagens. Pela compreensão, carinho e palavras de incentivo.

À Fellet, Thessinha, Lelê e Lu que dividiram comigo momentos de aflições e angustias, mas, sobretudo de felicidade! Pela amizade sincera!

Ao New, por estar sempre disposto a ajudar com um sorriso no rosto.

Ao João Victor, pelo ajuda nas formatações. Pela amizade, carinho e sábios conselhos.

Ao Luis, pelas palavras de força e estímulo.

VIII

À Fabi, que entrou na minha vida por acaso e conquistou minha amizade com seu jeito alegre e admirável de viver! Pela amizade sólida e verdadeira. Pelas boas risadas e momentos únicos!

À Gabizinha, anjinho que trouxe outro anjo para a minha vida!

À Ana Lu, amiga confidente que conquistou minha admiração e carinho. Por entender minhas inquietudes e saber acalmar meu coração. Por estar sempre ao meu lado mesmo com a distância física.

À Laurinha, por estar sempre presente. Por entender a minha ausência e estar sempre disposta a momentos de descontração para aliviar o estresse. Por todos os conselhos, incentivo e força.

À Raquelita e a Elisuda pelos momentos diários de descontração e boas risadas!

À Gina, pela recepção tão carinhosa na minha chegada ao laboratório.

Aos demais colegas do laboratório, simplesmente pelo agradável convívio. Em especial ao João Paulo, José Manuel, Marinely e Ivana.

Ao Thi, pelo amor sem medidas. Pela compreensão e paciência nos períodos de estresse. Por entender o meu momento e abdicar de datas festivas para estar ao meu lado. Pela cumplicidade e por cada gesto e demonstração de amor e carinho!

Ao meu irmão, Xand, alicerce da minha vida! Pela amizade e carinho que traz uma leveza a mais para minha vida!

À minha mãe, meu verdadeiro exemplo de vida, fé e coragem. Pelo amor incondicional. Por acreditar em mim sempre. Ao meu pai, meu exemplo de superação e força. Por não terem medido esforços para a minha formação, abrindo mão dos próprios sonhos em prol dos meus!

A Deus, meu motivo de força que nunca me deixou desistir dos meus objetivos e sonhos. Por iluminar o meu caminho e me amparar nos momentos mais difíceis.

Muito obrigado!

IX

Agradeço às instituições financeiras que apoiaram diretamente esse trabalho:

Ao Centro de Pesquisas René Rachou / FIOCRUZ, pela oportunidade de

realizar esse trabalho;

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde do Centro de

Pesquisas René Rachou;

A Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais – FAPEMIG,

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq;

Ao INCT, Institutos Nacionais de Ciência e Tecnologia.

Agradeço também a Biblioteca do CPqRR, pela catalogação e normalização

da dissertação.

X

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ XII

LISTA DE TABELAS .............................................................................................. XIV

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ............................................................ XV

RESUMO ................................................................................................................ XVI

ABSTRACT ........................................................................................................... XVII

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 22

2.1 Objetivo Geral .................................................................................................. 22

2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 22

3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 24

3.1 Triatomíneos .................................................................................................... 24

3.2 Associações entre triatomíneos e o Trypanosoma cruzi.................................. 27

3.3 Associações entre triatomíneos e Trypanosoma rangeli ................................. 30

3.4 O papel da temperatura no desenvolvimento de insetos e nas interações com seus parasitos ........................................................................................................ 34

4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 38

4.1 – Triatomíneos ................................................................................................. 38

4.2 – Parasitos ....................................................................................................... 38

4.3 – Avaliação do crescimento dos parasitos em meio de cultura, submetidos a diferentes temperaturas. ........................................................................................ 39

4.3.1 - Reagentes e Soluções ............................................................................ 39

4.3.2 – Marcação dos Parasitos ......................................................................... 40

4.3.3 – Ensaio Biológico ..................................................................................... 40

4.4 – Avaliação do desenvolvimento de insetos infectados submetidos a diferentes temperaturas .......................................................................................................... 42

4.4.1 - Infecção por Trypanosoma cruzi ............................................................. 42

4.4.2 - Infecção por Trypanosoma rangeli .......................................................... 42

XI

4.5 – Quantificação do Trypanosoma cruzi no trato intestinal de Rhodnius prolixus, em insetos submetidos a diferentes temperaturas ................................................ 43

4.5.1 - Infecção por Trypanosoma cruzi e ensaio biológico ............................... 43

4.5.2 – Extrações de DNA .................................................................................. 45

4.5.3 – PCR quantitativo em Tempo Real .......................................................... 45

4.6 – Análises Estatísticas ..................................................................................... 47

5 RESULTADOS ....................................................................................................... 49

5.1 - Avaliação do crescimento dos parasitos em meio de cultura, submetidos a diferentes temperaturas ......................................................................................... 49

5.2 – Avaliação do desenvolvimento de insetos infectados submetidos a diferentes temperaturas .......................................................................................................... 52

5.2.1 Insetos infectados por Trypanosoma cruzi ................................................ 52

5.2.2 Insetos infectados por Trypanosoma rangeli ............................................. 56

5.3 – Quantificação do Trypanosoma cruzi no trato intestinal de Rhodnius. prolixus, em insetos submetidos a diferentes temperaturas .................................. 62

7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 77

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 79

XII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Ciclo biológico de Rhodnius prolixus representando o desenvolvimento

do tipo paurometábolo dos triatomíneos (Foto: Newmar Pinto Marliére). Legenda: NI,

ninfa de primeiro estádio; NII, ninfa de segundo estádio; NIII, ninfa de terceiro

estádio; NIV, ninfa de quarto estádio e NV, ninfa de quinto estádio.......................24

Figura 2 – Ciclo Biológico do T. cruzi no triatomíneo (hospedeiro invertebrado).

(Adaptado de Garcia et al., 2007) .............................................................................28

Figura 3 – Ciclo biológico do T. rangeli no triatomíneo (hospedeiro invertebrado).

(Adaptado de Grisard e Steindel, 2003).....................................................................32

Figura 4 – Caixas de temperatura controladas, mantidas em estufa BOD, onde

foram realizados os ensaios.......................................................................................41

Figura 5 – Esquema do tubo digestivo de um triatomíneo. As setas indicam cada

porção do tudo digestivo (Adaptado de Garcia et al., 2007)......................................43

Figura 6 – Crescimento de epimastigotas de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma

rangeli em cultura, mantidos em diferentes temperaturas. As barras de erro

representam a média de duas repetições..................................................................50

Figura 7 – Mortalidade de epimastigotas de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma

rangeli em cultura, mantidos em diferentes temperaturas. Foram incluídos os dados

de células coradas com PI e com FDA+PI, indicativo de células mortas ou em

processo de morte celular. As barras de erro representam a média de duas

repetições..................................................................................................................51

Figura 8 – Efeito da infecção por Trypanosoma cruzi no período necessário para

alcançar o terceiro estádio de ninfas de Rhodnius prolixus mantidas em diferentes

temperaturas. Os valores de p indicados em cada gráfico representam a

significância estatística das comparações entre os tratamentos (Log-Rank)............53

Figura 9 – Efeito da infecção por Trypanosoma cruzi nas taxas de mortalidade de

ninfas de Rhodnius prolixus mantidas a diferentes temperaturas. Os valores de p

indicados em cada gráfico representam a significância estatística das comparações

entre os tratamentos (Log-Rank)................................................................................55

XIII

Figura 10 – Efeito da infecção por Trypanosoma rangeli T1 no período necessário

para alcançar o quinto estádio de ninfas de Rhodnius prolixus mantidas em

diferentes temperaturas. Os valores de p indicados em cada gráfico representam a

significância estatística das comparações entre os tratamentos (Log-Rank)...........58

Figura 11 – Efeito da infecção por Trypanosoma rangeli T2 no período necessário

para alcançar o quinto estádio de ninfas de Rhodnius prolixus mantidas em

diferentes temperaturas. Os valores de p indicados em cada gráfico representam a

significância estatística das comparações entre os tratamentos (Log-Rank)...........59

Figura 12 - Quantificação através de contagem em câmara de Neubauer do número

de parasitos de Trypanosoma cruzi no trato intestinal de Rhodnius prolixus............63

Figura 13 - Quantificação por qPCR do número de parasitos de Trypanosoma cruzi

no trato intestinal de Rhodnius prolixus, 15 dias após a infecção dos insetos..........64


no trato intestinal de Rhodnius prolixus, 30 dias após a infecção dos insetos..........65


no trato intestinal de Rhodnius prolixus, 60 dias após a infecção dos insetos........66

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Sequências dos iniciadores específicos para T. cruzi utilizados para

amplificação dos produtos de DNA por PCR em tempo real (Cummings e Tarleton,

2003)..........................................................................................................................46

Tabela 2 – Efeito da infecção por Trypanosoma cruzi no fitness de ninfas de Rhodnius prolixus.......................................................................................................54

Tabela 3 – Efeitos da infecção por Trypanosoma rangeli no fitness de ninfas de Rhodnius prolixus.......................................................................................................60

Tabela 4 – Taxa de infecção de ninfas de Rhodnius prolixus 30 dias pós-infecção......................................................................................................................61

XV

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AR – Ampola Retal

BOD – Biochemical Oxygen Demand

°C – Grau Celsius

CEUA – Comitê de Ética no Uso de Animais

CO2 – Dióxido de Carbono

CPqRR – Centro de Pesquisas René Rachou

DNA – Ácido desoxiribonucléico

FDA – Diacetato de Fluoresceina

FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz

IMA – Intestino Médio Anterior

IMP – Intestino Médio Posterior

Kg - kilograma

LATEC – Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas

LIT – Liver Infusion Tryptose

mg – miligramas

nM – Nanomolar

Na2HPO4 – Sódio fosfato

pb – Pares de Bases

PBS – Phosphate Buffered Saline

PI – Iodeto de Propídeo

qPCR – PCR quantitativo em Tempo Real

T1- Tratamento 1

T2 – Tratamento 2

WHO - World Health Organization

L – Microlitro

XVI

RESUMO

A temperatura ambiental afeta diversos processos bioquímicos, fisiológicos e

comportamentais, especialmente em animais ectotérmicos. Mudanças nesse

parâmetro podem alterar o fitness de insetos vetores e sua distribuição no

ambiente, modificando consequentemente, a dinâmica de transmissão de

doenças. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da temperatura

no desenvolvimento da infecção de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma

rangeli em Rhodnius prolixus. Os ensaios com T. rangeli foram desenvolvidos

com parasitos submetidos a dois tratamentos. T. rangeli T1 foram obtidos

através de passagens em LIT por três meses. T. rangeli T2 foram mantidos

em LIT por um mês após uma passagem triatomíneo-camundongo.

Inicialmente, o crescimento dos parasitos em meio de cultura submetidos a

diferentes temperarturas (21, 24, 27 e 30°C) foi avaliado. O crescimento do T.

cruzi foi termodependente, com um aumento de 28 vezes da população

mantida em 30°C ao final de sete dias. A mortalidade ficou abaixo dos 10%,

exceto para os parasitos mantidos a 21°C, onde esse valor ficou próximo aos

20%. Para os dois tratamentos de T. rangeli, o crescimento máximo foi

observado a 27°C. Entretanto, as populações de T. rangeli T2 cresceram

mais do que as de T. rangeli T1 e apresentaram taxas de mortalidade mais

baixas, em torno de 5%. O próximo objetivo foi avaliar diferentes parâmetros

fisiológicos de R. prolixus infectados pelos parasitos e submetidos às mesmas

condições de temperaturas. A infecção por T. cruzi prolongou o período

intermudas em todas as temperaturas e reduziu o número de insetos

aparentemente saudáveis em 20%. A virulência do parasito foi dependente da

temperatura e do estado nutricional dos insetos. T. rangeli T1 foi mais

virulento do que T. rangeli T2, particularmente nas temperaturas mais baixas.

Finalmente, o crescimento do T. cruzi no inseto foi quantificado por qPCR e

câmara de Neubauer. Os resultados, ainda preliminares, corroboraram com

os dados do crescimento do parasito em LIT. De maneira geral, os resultados

sugerem que os dois parasitos podem ser patogênicos ao vetor na natureza,

dependendo das condições a que são submetidos.

XVII

ABSTRACT

Environmental temperature affects many biochemical, physiological and behavioural

processes, especially in ectotherm animals. Changes in temperature can influence

the fitness of insect vectors and modify their distribution in the environment, altering

the dynamics for disease transmission. The aim of the present study was to evaluate

the effects of temperature on the development of Trypanosoma cruzi and

Trypanosoma rangeli in Rhodnius prolixus during infection. Assays using T. rangeli

were developed with parasites which have undergone two different treatments. T.

rangeli T1 were kept in LIT medium for more than three months with weekly

passages. T. rangeli T2 were cultured in LIT medium for only one month after a

cyclical transmission in mice and triatomines. Initially, the growth of the parasites in

culture medium under different temperartures (21, 24, 27 and 30 ° C) was evaluated.

Growth of T. cruzi epimastigotes was temperature dependent, with a 28 times

increase in population size of the culture maintained at 30°C for seven days. The

mortality rate was below 10% on average, except for the parasite culture kept at

21°C in which this value was near 20%. For both T. rangeli T1 and T2 treatments the

largest population growth was observed, at 27°C. However, populations of T. rangeli

T2 presented growth rates higher than T. rangeli T1 and mortality rates were also

lower, at around 5%. The next objective was to assess various physiological

parameters of R. prolixus infected by parasites and subjected to the same

temperature conditions. T. cruzi Infection delayed moulting times at all temperatures

and reduced the number of apparently healthy insects in 20%. Parasite virulence was

dependent on temperature and nutritional status of the insects. T. rangeli T1 was

more virulent than T. rangeli T2, particularly at lower temperatures. Finally, the

growth of T. cruzi in the insect was quantified by qPCR and parasite counts using a

Neubauer chamber. The results, although preliminary, seem to corroborate the data

for parasite growth from LIT medium culture. Overall, the results suggest that the two

parasites may be pathogenic to the vector in nature, depending on the conditions

which they are subjected.

XVIII

INTRODUÇÃO

19

1 INTRODUÇÃO

A distribuição espacial e a abundância da maioria dos seres vivos são

resultantes de interações entre parâmetros bióticos e abióticos dentro de um

ecossistema (Blanford e Thomas, 2000). A temperatura ambiental é um fator abiótico

que apresenta um efeito direto na sobrevivência de diferentes animais,

principalmente os ectotérmicos. Em insetos, as variáveis climáticas podem promover

alterações na fisiologia (Li, et al., 2011; Amarasekare e Savage, 2012), no

comportamento (Martin et al., 2011; Ipekdal e Caglar, 2012) e no tamanho do corpo

(Reiskind e Zarrabi, 2012). Para os insetos hematófagos a temperatura também

apresenta um papel fundamental como estímulo para a localização de seus

hospedeiros (Abdullah, 1961).

Sabe-se também que a temperatura ambiental pode influenciar a interação

entre hospedeiros e seus parasitos, tanto na habilidade do parasito em colonizar o

seu vetor quanto do vetor em se defender dos parasitos (Thomas e Blandford,

2003). Mudanças na temperatura podem alterar o fitness de insetos vetores,

modificando sua distribuição no ambiente e, consequentemente, alterando a

dinâmica de transmissão de doenças (Moore et al., 2002). Além disso, muitos

estudos vêm demonstrando que a capacidade de um agente patogênico matar o seu

hospedeiro depende fundamentalmente da temperatura corporal do hospedeiro, e de

como esta varia com as condições ambientais externas (Blanford e Thomas, 1999;

Inglis et al., 1997; Thomas e Blanford, 2003 ).

Os triatomíneos (Hemiptera: Reduviidae) são insetos de hábitos noturnos e

hematófagos, que necessitam de sangue em todas as suas fases de

desenvolvimento. São primariamente insetos silvestres, vivendo em seus ambientes

naturais associados a animais de sangue quente (Lent e Wygodzinsky, 1979).

Algumas espécies, no entanto, podem colonizar ambientes humanos, e deste modo,

o homem e seus animais domésticos tornam-se sua fonte de alimentação (Schofield,

1994).

Além disso, os triatomíneos também são vetores de protozoários parasitos,

como o Trypanosoma cruzi e o Trypanosoma rangeli. O T. cruzi é o agente

20

etiológico da doença de Chagas, e não tem sido relacionado como patogênico aos

seus hospedeiros invertebrados. O T. rangeli, embora compartilhe os mesmos

hospedeiros com o T. cruzi, não causa doença ao homem. Entretanto, este parasito

promove diferentes níveis de patogenicidade para o inseto vetor, principalmente às

espécies de gênero Rhodnius (Brecher e Wigglesworth, 1944; Friend e Smith, 1967;

D'Alessandro 1976; Eichler e Schaub, 1998; Ferreira et al, 2010). A principal

diferença no ciclo biológico dessas duas espécies, é que o T. cruzi se desenvolve

exclusivamente no interior do trato intestinal dos triatomíneos, enquanto que o T.

rangeli pode também invadir a hemocele e colonizar as suas glândulas salivares.

A influência da temperatura ambiental vem sendo amplamente estudada para

os triatomíneos (Okasha, 1964, Di Luciano, 1983, Lazzari, 1991, Guarneri et al.,

2003). Diversos estudos mostram que a temperatura pode afetar diferentes

parâmetros biológicos dessas espécies, tais como oviposição, fecundidade,

maturidade sexual, dispersão e seleção de esconderijos (Clark, 1935, Lehane et al.,

1992, Lazzari, 1991, Schofield et al., 1992, Lorenzo e Lazzari, 1999, Botto-Mahan,

2006). Embora exista uma grande quantidade de estudos associando os fatores

climáticos e seus efeitos sobre os processos fisiológicos e comportamentais nas

diferentes fases de desenvolvimento dos triatomíneos, até o momento pouco se

sabe sobre o papel das condições abióticas na capacidade vetorial dessas espécies

considerando os efeitos da interação entre hospedeiros e patógenos. Diante disso, o

estudo das relações parasito-hospedeiro-fatores abióticos se torna essencial para

um entendimento mais amplo dos fenômenos de interação entre as espécies.

21

OBJETIVOS

22

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar os efeitos da temperatura ambiental no desenvolvimento da infecção de

Trypanosoma rangeli e Trypanosoma cruzi em Rhodnius prolixus.

2.2 Objetivos Específicos

1. Avaliar se a temperatura ambiental afeta o desenvolvimento dos parasitos em

meio de cultura;

2. Avaliar parâmetros de desenvolvimento, como período intermudas, mortalidade e

ecdise, em insetos infectados submetidos a diferentes temperaturas;

3. Avaliar quantitativamente o crescimento do T. cruzi nas diferentes porções do

trato intestinal em insetos submetidos a diferentes temperaturas e em diferentes

momentos da infecção.

23

REVISÃO DA LITERATURA

24

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Triatomíneos

Os triatomíneos são classificados como insetos pertencentes à família

Reduviidae, subfamília Triatominae (Hemiptera, Heteroptera), definida por seu hábito

hematófago que está presente em todas as espécies desse grupo. Os triatomíneos

são paurometábolos, apresentando cinco fases ninfais e a fase adulta, sendo o

repasto sanguíneo fundamental em todos os estágios evolutivos (Figura 1).

Figura 1 - Ciclo biológico de Rhodnius prolixus representando o desenvolvimento do

tipo paurometábolo dos triatomíneos (Foto: Newmar Pinto Marliére). Legenda: NI,

ninfa de primeiro estádio; NII, ninfa de segundo estádio; NIII, ninfa de terceiro

estádio; NIV, ninfa de quarto estádio e NV, ninfa de quinto estádio.

Atualmente são reconhecidas 140 espécies de triatomíneos, divididas em

cinco tribos e 15 gêneros, sendo a maioria delas encontradas na América Latina

(Schofield e Galvão, 2009). Desse total, 61 espécies estão presentes no Brasil

(Galvão et al., 2003).

Os triatomíneos são primitivamente insetos silvestres, característica esta

mantida ainda hoje pela maioria das espécies encontradas nos focos naturais, onde

vivem associadas a uma grande variedade de animais silvestres (Sherlock, 1979).

Seu habitat primário é o interior de abrigos, tocas e ninhos de animais de sangue

quente em ocos de árvores, palmeiras, fendas de rochas, entre outros (Lent e

Wygodzinsky, 1979). Esses micro-ambientes normalmente protegem os insetos das

25

variações extremas de temperatura e umidade relativa além de permitir o fácil

acesso a fonte alimentar. Alimentam-se de uma série de hospedeiros, dentre eles,

aves, marsupiais, edentados, roedores, primatas e morcegos de várias espécies,

além de vertebrados ectotérmicos (Lent e Wygodzinsky, 1979). Os triatomíneos são

capazes de subsistir com alimentações sanguíneas abundantes e ocasionais, uma

vez que, entre os repastos, podem permanecer por longos períodos de tempo sem

desidratar-se e, aparentemente, sem sofrer danos fisiológicos (Friend e Smith,

1985).

Seu aparato bucal está adaptado para a penetração na pele do hospedeiro,

para o encontro de vasos sanguíneos apropriados e para a alimentação rápida.

Além disso, na saliva desses insetos estão presentes substâncias anticoagulantes,

anestésicas e vasodilatadoras que auxiliam na ingestão do sangue (Hellmann e

Hawkins, 1964, Ribeiro et al., 2004, Araujo et al., 2009).

Assim como os demais insetos hematófagos, os triatomíneos apresentam

uma maquinaria sensorial bem desenvolvida para localizar e escolher seus

hospedeiros (Guerenstein e Lazzari, 2009). Os triatomíneos têm em suas antenas

uma diversidade de pêlos sensoriais denominados sensilas. Essas estruturas estão

distribuídas ao longo da antena e são capazes de detectar diferentes estímulos

mecânicos, químicos, térmicos ou de umidade (Guerenstein e Lazzari, 2009). O

calor, a umidade e odores liberados pelos hospedeiros (ex. CO2, ácido lático) estão

diretamente envolvidos no processo de busca do hospedeiro pelos triatomíneos

(Barrozo et al., 2003; Lazzari e Núñez, 1989; Lehane, 2005).

Os triatomíneos são insetos de hábito noturno e desenvolvem a maioria das

suas atividades como a busca por alimento, parceiros sexuais e refúgio durante o

período da noite (Núñez, 1987, Lorenzo e Lazzari, 1993). Apresentam dois picos de

atividade, sendo um no início da escotofase, relacionado com a busca por

hospedeiro, e outro no início da fotofase, relacionado com a volta ao abrigo (Lazzari,

1992, Lorenzo e Lazzari, 1996, Guarneri et al., 2003). Além disso, apresentam

fototaxia negativa (Reisenman et al., 1998, Reisenman e Lazzari, 2006),

permanecendo na maior parte do tempo escondidos em seus abrigos em estado de

akinesis e agregados aos seus coespecíficos (Guerenstein e Lazzari, 2009; Lazzari,

1992; Lorenzo e Lazzari, 1996, Bodin et al., 2009).

26

A ação antrópica sobre a vegetação das Américas Central e do Sul permitiu a

dispersão dos triatomíneos para novos ambientes. A colonização de novos ecótopos

por triatomíneos silvestres depende de uma série de fatores, dentre eles sua

constituição genética, que confere mecanismos fisiológicos que possibilitam a

adaptação a um novo contexto ambiental, como temperatura, umidade e fontes

alimentares provavelmente diferentes dos seus ecótopos naturais (Aragão e Dias

1956, Forattini, 1980, Burgos et al., 1994, Curto de Casas et al., 1994, Schofield,

2000). Dessa maneira, algumas espécies são capazes de invadir e colonizar

ambientes peridomésticos como galinheiros e currais, e domicílios humanos, onde o

homem e seus animais domésticos, tais como o gato, cachorro, rato e coelho,

passam a funcionar como fontes de alimentação (Schofield, 1994).

Além das lesões ocasionadas pela picada e a espoliação sanguínea que

causam ao hospedeiro, os triatomíneos podem também transmitir parasitos, como o

T. cruzi e o T. rangeli. A doença de Chagas, causada pelo T. cruzi e também

conhecida como tripanossomíase americana, é uma doença humana tropical

endêmica em grandes áreas da América do Sul e Central. Entre as doenças

parasitárias, é classificada como uma das mais importantes da América Latina em

termos de impacto social e econômico (DNDi América Latina, 2010). É transmitida

aos seres humanos principalmente através das fezes de triatomíneos infectados que

são liberadas durante o repasto sanguíneo e entram em contato com a injúria

causada pela picada. Outras formas de transmissão incluem a via congênita, a

transfusional, a ingestão acidental de T. cruzi, além de outras de menor relevância

epidemiológica (Dias, 1979; Schofield, 1994). Estima-se que 10 milhões de pessoas

estão infectadas em todo o mundo, principalmente na América Latina onde a doença

é endêmica, e mais de 25 milhões de pessoas se encontram em áreas de

transmissão (WHO, 2012).

As taxas de infecção natural de triatomíneos por T. cruzi variam muito entre

espécies e de acordo com a sua proximidade de contato com os reservatórios de

parasitos. Entre a maioria dos triatomíneos domésticos, não mais do que 5% são

infectados (ver revisão Coura e Borges-Pereira, 2010).

O R. prolixus é um dos vetores mais eficientes na transmissão do T. cruzi

(Borges-Pereira et al., 1988). Assume-se que essa espécie evoluiu de uma forma

27

ancestral de Rhodniini da região Amazônica, tornando-se altamente adaptado ao

habitat doméstico e peridoméstico, em diversos países da América Central e do Sul,

sobretudo na Venezuela e Colômbia, onde continua a ser um importante vetor

doméstico de T. cruzi (Schofield e Galvão, 2009). Isto se deve a alta susceptibilidade

desse triatomíneo à infecção pelo T. cruzi e a sua elevada capacidade reprodutiva,

podendo chegar a três gerações por ano. A espécie também possui uma alta

capacidade de disseminação e domiciliação além de apresentar taxas de infecção

que podem ser superiores a 30% (Peñalver, 1958; Dorn et al., 2001; Monroy et al.,

2003).

Assim como pode ocorrer em outras espécies de triatomíneos do gênero

Rhodnius, o R. prolixus pode manter infecções mistas de T. cruzi e T. rangeli que

podem ser igualmente transmitidas aos hospedeiros mamíferos, inclusive o homem.

Este fato tem importância médica e epidemiológica, uma vez que a infecção humana

pelo T. rangeli ocasiona reações sorológicas cruzadas com o T. cruzi, dificultando o

diagnóstico da doença de Chagas (Hudson et al., 1988).

Apesar de não ser encontrado no Brasil, R. prolixus é amplamente utilizado

como modelo experimental uma vez que vários processos fisiológicos de insetos

foram inicialmente estudados na espécie (Wigglesworth, 1934, 1936, 1940).

3.2 Associações entre triatomíneos e o Trypanosoma cruzi

O T. cruzi pertence à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae. É um

protozoário heteroxênico que infecta triatomíneos e mamíferos nas Américas. Este

parasito apresenta alta plasticidade controlada geneticamente, o que lhe confere

adaptação para cerca de 40 espécies de triatomíneos e para mais de 1.000 espécies

de mamíferos, cumprindo diversas exigências metabólicas em seu complexo ciclo de

vida (Teixeira et al., 2009). Entretanto, ao longo da história evolutiva entre

hospedeiros e tripanosomas, ambos vêm desenvolvendo mecanismos estratégicos

para facilitar o desenvolvimento do parasito, no caso dos tripanosomas, ou

interromper seu desenvolvimento, no caso dos hospedeiros (Gaunt e Miles, 2000;

Azambuja, 2005; Garcia, 2007).

28

O T. cruzi tem um ciclo evolutivo complexo que apresenta formas

morfológicas e funcionais distintas, alternando entre as fases de divisão e fases não

replicativas. Entre as formas de divisão estão as epimastigotas, presentes no

intestino do vetor e também observadas durante a fase logarítmica de crescimento

em culturas axênicas, e amastigotas, encontradas em células de mamíferos. Já as

formas não replicativas incluem tripomastigotas metacíclicos encontrados nas fezes

e na urina do vetor e na fase estacionária de crescimento em culturas axênicas do

parasito, e tripomastigotas encontrados na corrente sanguínea de mamíferos e em

fase líquida de cultura de parasitos em célula (Hoare e Wallace, 1966; Tyler e

Engman, 2001).

No hospedeiro invertebrado o ciclo do parasito inicia-se quando o triatomíneo

ingere formas tripomastigotas durante o repasto sanguíneo em mamíferos

infectados. O parasito se diferencia e divide sob a forma epimastigota no intestino

médio posterior do inseto (Ferreira et al., 2011) e se diferencia na ampola retal em

formas tripomastigotas metacíclicas que serão liberadas juntamente com as fezes e

poderão ser transmitidas a outros mamíferos no próximo repasto (Figura 2). No

hospedeiro mamífero, as formas tripomastigotas são capazes de invadir diferentes

tipos celulares onde se diferenciam em formas amastigotas que se dividem e vão

gerar os tripomastigotas sanguíneos, que entram na circulação e são as formas

infectantes para o triatomíneo (Brener, 1973; Zeledon, 1987; Garcia e Azambuja,

1991).

Figura 2 – Ciclo Biológico do T. cruzi no triatomíneo (hospedeiro invertebrado)

(Adaptado de Garcia et al., 2007).

29

A presença do T. cruzi no intestino do hospedeiro invertebrado desencadeia

uma série de reações imunológicas que irão interagir com o parasito, interferir na

sua capacidade de colonização e afetar a sua sobrevivência. Fatores como

temperatura, pH e estado nutricional do vetor também podem interferir nessa

interação. Além disso, substâncias produzidas pelo inseto como, por exemplo,

componentes da saliva, lisozimas, defensinas, lectinas e aglutininas estão também

envolvidas na resposta imunológica do vetor à presença do T. cruzi (ver revisão

Garcia et al., 2010). Embora a maioria das bactérias presentes ao longo do intestino

dos triatomíneos seja considerada comensal (Schaub 2009), algumas espécies

apresentam atividade tripanolítica, podendo provocar a lise de determinadas cepas

do parasito (Azambuja et al., 2004).

O intestino médio anterior de R. prolixus produz um fator hemolítico, que afeta

o desenvolvimento do T. cruzi (Azambuja et al., 1983). Além disso, as glândulas

salivares de T. infestans produzem uma proteína, denominada de trialisina, que tem

a capacidade de lisar tripomastigotas de T. cruzi (Amino et al., 2002). Além dos

fatores presentes no lúmen e tecidos intestinais do vetor, um período de jejum muito

prolongado dos insetos pode levar a uma escassez nutricional dos parasitos e

culminar na eliminação da infecção (Schaub et al., 1989). O T. cruzi presente no

intestino do vetor parece competir por nutrientes, uma vez que em situações de

jejum, a resistência dos insetos é reduzida (Schaub, 1989). Um dos nutrientes

provenientes do sangue ingerido e sabidamente utilizado pelo T. cruzi é o heme, que

não é produzido pelo parasito e precisa ser adquirido de seus hospedeiros (Salzman

e cols., 1982; Lombardo e cols., 2003).

Embora exista uma intensa colonização do intestino do vetor por diferentes

cepas de T. cruzi, a literatura sugere que este parasito não é patogênico ao seu

hospedeiro invertebrado (Eichler e Schaub, 2002). Estudos de microscopia

eletrônica revelaram que a infecção do T. infestans pelo T. cruzi não afeta a

produção das membranas perimicrovilares que se formam após a alimentação

(Billingsley e Downe, 1983) ou as microvilosidades do intestino posterior, sendo que

aparentemente, os parasitos permanecem aderidos ao epitélio intestinal pelos

flagelos (Kollien et al., 1998). A análise do desenvolvimento dos simbiontes Nocardia

30

sp. e Rhodococcus rhodnii no intestino de Triatoma infestans e R. prolixus,

respectivamente, na presença do T. cruzi, mostrou que o parasito não afeta as taxas

de crescimento dessas bactérias (Eichler e Schaub, 2002).

Estudos prévios não demonstraram uma influência do parasito no

desenvolvimento do vetor (Juarez, 1970; Zeledón, 1970; Santos e Lacombe, 1985;

Schaub 1978, 1988), entretando, Lima et al., (1992) mostraram uma diminuição no

número de ovos postos por fêmeas de Panstrongylus megistus infectadas pelo T.

cruzi. Um estudo experimental com Mepraia spinolai infectados através de repetidas

alimentações em camundongos infectados por T. cruzi demonstrou que os insetos

tiveram um prolongamento no tempo de muda e apresentaram uma redução em

diferentes variáveis relacionadas ao tamanho do corpo, inclusive no tamanho das

gônadas (Botto-Mahan et al., 2008).

Alterações comportamentais também têm sido observadas em triatomíneos

infectados por T. cruzi. Botto-Mahan et al. (2006) demonstraram que Mepraia

spinolai infectados pelo T. cruzi respondem mais rapidamente a sinais da presença

de potenciais hospedeiros quando comparados a insetos não infectados. Além

disso, M. spinolai infectados picam mais vezes e defecam mais rapidamente que

insetos não infectados, o que poderia implicar em um aumento nas chances de

transmissão do parasito ao hospedeiro vertebrado (Botto-Mahan et al., 2006).

Rodrigues et al. (2008) avaliaram o comportamento de fototaxia negativa de

ninfas de R. prolixus infectadas por T. cruzi e não encontraram diferenças em

relação aos insetos controle. Entretanto, a atividade locomotora de ninfas infectadas

foi reduzida na escotofase (Marliére et al., 2011), período em que os triatomíneos

saem dos abrigos à procura de fontes de alimentação ou parceiros sexuais.

3.3 Associações entre triatomíneos e Trypanosoma rangeli

O Trypanosoma rangeli é também um parasito heteroxênico que compartilha

com o T. cruzi os mesmos hospedeiros invertebrados e vertebrados, incluindo o

homem e animais domésticos. Apesar de não ser patogênico ao homem, o parasito

é capaz de induzir uma resposta imune humoral com elevados títulos de anticorpos,

os quais determinam uma elevada reatividade cruzada com antígenos do T. cruzi,

31

dificultando o diagnóstico sorológico da doença de Chagas, especialmente em sua

fase crônica (Schotelius, 1987; Grisard et al., 1999). Ao analisar formas

epimastigotas de cultura do T. rangeli, Afchain e colaboradores (1979) verificaram

que este compartilha cerca de 60% de sua constituição antigênica solúvel com o T.

cruzi, o que explicaria a reatividade sorológica cruzada e os consequentes

resultados falso-positivos que incorrem em um elevado custo sócio-econômico.

Estes dados foram confirmados em um estudo que utilizou diferentes cepas e

formas do T. rangeli e soros de pacientes apresentando distintas formas clínicas da

doença de Chagas (Moraes et al., 2008).

Pouco se sabe a respeito do curso da infecção no hospedeiro vertebrado,

sendo que vários estudos demonstram que a taxa de infectividade de diferentes

cepas deste parasito frente a linhagens celulares distintas (fagocíticas e não

fagocíticas) é sempre muito baixa e os parasitos tendem a desaparecer ao longo do

tempo de interação, sugerindo a ausência de multiplicação intracelular,

especialmente observada em macrófagos (Molyneaux, 1973; Osorio et al., 1995;

Tanoura et al., 1999; Eger-Mangrich et al., 2001).

Nos hospedeiros invertebrados, o ciclo inicia-se quando formas

tripomastigotas são ingeridas durante o repasto sanguíneo em um hospedeiro

mamífero infectado. Quando atingem o intestino médio anterior, os parasitos se

diferenciam em formas epimastigotas e tornam-se capazes de se multiplicar

colonizando todo o trato intestinal do inseto (Ferreira et al., 2011). As formas

epimastigotas podem cruzar o epitélio intestinal e atingir a hemocele. Uma vez na

hemolinfa, os parasitos continuam se dividindo, migram e invadem as glândulas

salivares, onde se diferenciam em tripomastigotas metacíclicos, formas infectantes

que podem ser transmitidas para os hospedeiros vertebrados durante o repasto

sanguíneo do vetor (D'Alessandro, 1976; D'Alessandro-Bacigalupo e Saraiva,1992).

32

Figura 3 – Ciclo biológico do T. rangeli no triatomíneo (hospedeiro invertebrado)

(Adaptado de Grisard e Steindel, 2003).

A presença do parasito no trato intestinal do vetor pode persistir ao longo de

toda a vida do inseto. Entretanto, diferentemente da forma clássica de transmissão

do T. cruzi, as formas encontradas nas fezes do vetor não parecem ser infectivas

(Rentifo et al., 1950; D’Alessandro, 1976; Tobie, 1964; Hecker et al., 1990).

Em infecções naturais, a porcentagem de insetos que apresentam parasitos

ao longo do trato intestinal e também na hemolinfa e glândulas salivares é variável,

ficando entre 2 e 50% (Añez et al., 1987; Groot, 1954; Hecker et al., 1990;

Marinkelle, 1968; Tobie, 1965, 1970; Ferreira et al., 2010). Ainda não se sabe os

fatores envolvidos no desenvolvimento de infecções completas por T. rangeli.

Pequenas alterações nos resíduos de açúcar das glicoproteínas de superfície

presentes nos trypanosomatídeos poderiam contribuir para o aumento ou diminuição

da porcentagem de parasitos que conseguem penetrar o epitélio intestinal e alcançar

a hemocele e as glândulas salivares (Rudin et al.,1989).

Uma importante descoberta sobre a interação do T. rangeli com o hospedeiro

invertebrado foi a influência que a infecção pelo parasito tem sobre as populações

33

de simbiontes do intestino de R. prolixus (Eichler e Schaub, 2002). A diminuição no

número de simbiontes ocasionada pela presença do T. rangeli pode levar a uma

série de efeitos deletérios ao vetor, que incluem o retardo do desenvolvimento ninfal

(Brecher e Wigglesworth, 1944; Lake e Friend, 1967), aumento nas taxas de

mortalidade (Harrington, 1960), distúrbios na digestão e excreção (Brecher e

Wigglesworth, 1944; Eichler e Schaub, 1998) e reduções do sistema traqueal

(Eichler e Schaub, 1998).

Uma vez na hemolinfa, o T. rangeli é reconhecido pelo sistema de defesa do

inseto e inicia-se uma série de eventos celulares e humorais que irão atuar como

fatores limitantes para o desenvolvimento do parasito, incluindo a produção de

lisozimas de atividade tripanolítica, ativação do sistema pró-fenoloxidase, fagocitose

e microagregação de hemócitos, aglutinação e produção de ânions superóxido (ver

revisão Garcia et al., 2010). Sabe-se que a resposta imune do inseto é voltada

preferencialmente formas curtas do parasito enquanto que formas longas seriam

responsáveis pela manutenção da infecção bem como, pela invasão das glândulas

salivares (Mello et al., 1995, 1999; Gomes et al., 1999, 2003). Deste modo, estas

formas epimastigotas longas do T. rangeli estariam funcionando como o escape do

parasito frente às respostas imunológicas do inseto. A presença do parasito na

hemolinfa pode afetar a sobrevivência do inseto bem como prolongar o seu

desenvolvimento. Além disso, insetos que apresentam infecções massivas na

hemolinfa podem exibir alterações morfológicas (Grewal, 1957; Tobie, 1961; Añez,

1984). Outra característica marcante em insetos que apresentam altas taxas de

infecção é a elevada mortalidade durante o processo de muda, além daqueles que

não conseguem sair da antiga cutícula (Añez, 1984). Recentemente, Ferreira et al.

(2010) demonstraram que a infecção pelo T. rangeli leva a um aumento na

quantidade de lipídeos e de corpos gordurosos na hemolinfa de R. prolixus e que a

sua presença exclusivamente na hemolinfa é suficiente para provocar alterações no

desenvolvimento dos insetos, inclusive prolongando o período entre mudas.

O último estágio de desenvolvimento do T. rangeli no hospedeiro invertebrado

ocorre no interior das glândulas salivares. Os mecanismos de invasão utilizados

pelos epimastigotas para penetrar nas glândulas salivares do hospedeiro

invertebrado ainda estão pouco esclarecidos. Sabe-se que lectinas e carboidratos

presentes na superfície do parasito estão envolvidos neste processo (Basseri et al.,

34

2002). Uma redução significativa das proteínas estocadas nas glândulas salivares

de R. prolixus, incluindo aquelas com funções anti-hemostáticas como as

nitroforinas, foi observada durante a infecção pelo T. rangeli (Paim et al., 2013). Esta

redução afeta o comportamento alimentar do inseto, levando a um aumento

significativo no número de picadas e reduzindo a sua habilidade de ingerir sangue

de hospedeiros vertebrados, consequentemente, aumentando as chances de

transmissão do T. rangeli (Garcia et al.,1994). Um estudo recente também

demonstrou que a infecção pelo T. rangeli promove a inibição da atividade de uma

tirosina fosfatase levando a uma redução da atividade da enzima responsável pela

produção de óxido nítrico, o que poderia contribuir para o aumento no tempo de

ingestão sanguínea pelo vetor (Gazos-Lopes et al., 2012).

A infecção por T. rangeli também promove alterações comportamentais no

inseto vetor. Ninfas de R. prolixus infectadas pelo parasito apresentaram uma

redução no comportamento de fototaxia negativa, permanecendo mais tempo

expostas à luz do que os insetos controle (Ferreira et al., 2011). A infecção também

alterou a atividade locomotora dos insetos que foi maior do que a exibida pelos

insetos do grupo controle durante a escotofase e a fotofase (Marliére et al., 2011). A

avaliação do comportamento de utilização de refúgios mostrou que insetos

infectados apresentaram uma movimentação mais intensa na presença de estímulos

provenientes de um hospedeiro vertebrado e se mantiveram fora do abrigo após a

retirada do estímulo, mesmo durante a fase de iluminação (Marliére et al., 2010).

3.4 O papel da temperatura no desenvolvimento de insetos e nas interações com seus parasitos

As associações parasito-hospedeiro são elementos não aparentes dentro de

uma comunidade ecológica e afetam as relações de competição intra e

interespecíficas, a distribuição e abundância de espécies e a própria composição da

comunidade (Horwitz e Wilcox, 2005; Thomas et al., 2005). Sendo assim, os

parasitos e seus hospedeiros não podem ser considerados isoladamente nem serem

separados da comunidade da qual fazem parte, sendo necessário incluir também

nos estudos de interação as propriedades do ambiente onde habitam (Thrall et al.,

2007).

35

A maioria dos estudos evolutivos sobre mudanças adaptativas na resistência

ou suscetibilidade de hospedeiros e/ou virulência de parasitos normalmente não

consideram os fatores bióticos e abióticos como tendo algum papel nas interações

parasito-hospedeiro (Bull, 1994; Frank, 1996; Kraaijeveld et al., 1998; Dieckmann et

al., 2002). Como resultado, o efeito de fatores extrínsecos na resistência ou

virulência durante uma interação tem recebido pouca atenção. Entretanto, diversos

estudos vêm demonstrando que a suscetibilidade do hospedeiro e a virulência do

parasito são dependentes de condições abióticas (ex. Ferguson e Read, 2002; Elliot

et al., 2002) e que uma condição chave parece ser a temperatura ambiental

(Thomas e Blanford, 2003).

Já está bem estabelecido que a temperatura afeta processos bioquímicos,

fisiológicos e comportamentais em animais e existem muitos trabalhos explorando a

sensibilidade térmica dos organismos e os fatores que influenciam a evolução das

curvas de performance térmicas (ver revisão Thomas e Blanford, 2003). Em insetos

que vivem nos trópicos, a curva de sobrevivência populacional tem a forma de um U

invertido, com a sobrevivência declinando profundamente nas temperaturas

máximas e mínimas e se mantendo constante nas temperaturas intermediárias

(Amarasekare e Sifuentes, 2012). Assim como para os demais insetos, diversos

autores têm avaliado os efeitos da temperatura sobre o desenvolvimento de vetores

como Aedes aegypti (Yang et al., 2009), Anopheles gambiae (Bayoh e Lindsay,

2004), Culex tarsalis (Dodson et al., 2012), Aedes albopictus (Reiskind et al., 2012) e

Pediculus sp. (Gallardo et al., 2009).

Os efeitos dos fatores climáticos sobre a fisiologia e o comportamento dos

triatomíneos vêm sendo estudados, dada a sua importância na distribuição desses

insetos e a sua potencial influência na capacidade dos triatomíneos de colonizar

domicílios humanos (Schofield e Patterson, 1977; Salvatella et al., 1991). A

temperatura ambiental afeta diferentes parâmetros biológicos dos triatomíneos,

como a eclosão de ovos (Clark, 1935; Guarneri et al., 2003), a fecundidade e a

maturidade sexual (Ehrenfield et al., 1998; Jörg, 1960), a dispersão de adultos

(Lehane et al., 1992) e a seleção de esconderijos (Lorenzo e Lazzari, 1999). Por

outro lado, os triatomíneos são capazes de perceber gradientes térmicos

(Wigglesworth e Gillet, 1934; Lazzari e Núñez, 1989) e de escolher a temperatura

preferida de acordo com o seu estado fisiológico (Di Luciano, 1983; Lazzari, 1991;

36

Canals et al., 1997; Pires et al., 2002; Schilman e Lazzari, 2004; Guarneri et al.,

2003).

Com relação às interações hospedeiro-parasito, existe uma gama de

possíveis influências da temperatura que incluem efeitos sobre os períodos de

infecção latente (Blanford e Thomas, 1999), expressão de doença latente (Mohamed

et al., 1985), cura do hospedeiro e mortalidade do parasito (Carruthers et al., 1992;

Kobayashi et al., 1981; Sigsgaard, 2000), replicação do parasito (Kobayashi et

al.,1981) e virulência do parasito e/ou resistência do hospedeiro (Blanford e Thomas,

1999; Arthurs e Thomas, 2000; Menti et al., 2000; Elliot et al., 2002; Blanford et al.,

2003).

As mudanças no comportamento ou na fisiologia dos insetos causadas pela

infecção e moduladas pela temperatura podem promover uma transmissão mais

eficiente do parasito ao seu hospedeiro definitivo, provavelmente aumentando o

fitness destes parasitos e possivelmente diminuindo o fitness do vetor. Tais

mudanças no comportamento do vetor podem ter potenciais implicações

epidemiológicas (Moore, 2002).

Embora exista um grande número de trabalhos publicados sobre os efeitos da

presença do parasito no desenvolvimento, fisiologia e comportamento de seus

hospedeiros, e sabendo-se que a temperatura é um fator crítico para a sobrevivência

de animais ectotérmicos, é de fundamental importância compreender o papel da

temperatura nas interações vetor/parasito. Dentro desse contexto, torna-se relevante

compreender a dinâmica de interação entre triatomíneos e tripanosomas bem como

compreender como essa relação ocorre na natureza. Espera-se que os resultados

obtidos neste trabalho possam contribuir para o desenvolvimento de estratégias e

ferramentas de controle desses vetores.

37

MATERIAIS E MÉTODOS

38

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 – Triatomíneos

Os exemplares da espécie R. prolixus utilizados neste trabalho são

provenientes do insetário do Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da

Doença de Chagas (LATEC), de uma colônia iniciada a partir de insetos coletados

em Honduras. Os insetos foram mantidos em condições semi-controladas de

temperatura (26 ± 1°C) e umidade relativa (65 ± 10%) e em ciclo de iluminação

natural.

Os triatomíneos foram criados em frascos de plástico ou acrílico cilíndricos,

fechados com tecido de algodão, forrados com papel filtro para absorção de

umidade e contendo uma tira de cartolina no centro do pote dobrada em sanfona

para permitir uma maior superfície de contato para o inseto e facilitar a alimentação.

Os insetos foram alimentados semanalmente em galinhas ou camundongos

Swiss anestesiados (Thionembutal a 2%), ou sangue de coelho citratado obtido do

Cecal (Centro de Criação de Animais de Laboratório da Fundação Oswaldo Cruz,

FIOCRUZ – RJ).

Todos os protocolos que utilizaram animais seguiram as normas da FIOCRUZ

para a experimentação animal e foram aprovadas pelo Comitê de Ética na Utilização

de Animais (CEUA-FIOCRUZ-MG) sob o número L-058/08.

4.2 – Parasitos

Neste estudo utilizou-se a cepa CL de T. cruzi, multiclonal, isolada a partir do

vetor Triatoma infestans naturalmente infectado (Brener e Chiari, 1963) e a cepa

CHOACHI de T. rangeli, isolada das glândulas salivares de Rhodnius prolixus

naturalmente infectado, originado no Estado de Cundinamarca, Colômbia

(Schotelius,1987).

Epimastigotas de T. cruzi (cepa CL) e de T. rangeli (cepa CHOACHI) foram

cultivados através de duas passagens semanais em meio LIT (Liver Infusion

39

Tryptose) acrescido de 15% de soro fetal bovino e antibiótico na concentração de

100 unidades de penicilina e 100µg de estreptomicina por mL. Os parasitos foram

cultivados em tubos cilíndricos de vidro em volume final de 3mL e mantidos em

estufa BOD à temperatura de 27°C.

A cepa de T. rangeli foi mantida através de dois diferentes tratamentos. No

primeiro (T1), os parasitos foram mantidos exclusivamente em meio LIT por um

período superior a 90 dias. No segundo tratamento (T2), os parasitos foram

mantidos em meio LIT por 30 dias, após terem sido submetidos a uma passagem

em triatomíneos, transmitidos destes para camundongos e recuperados por

hemocultura. Os dois tratamentos foram utilizados para todos os experimentos

desenvolvidos com esta espécie.

4.3 – Avaliação do crescimento dos parasitos em meio de cultura, submetidos a diferentes temperaturas.

4.3.1 - Reagentes e Soluções

A solução estoque de Diacetato de Fluoresceína (FDA – F7378, Sigma) foi

obtida através da diluição do corante em acetona (1mg/mL) e conservada a -20°C. O

FDA é um corante vital, não polar, capaz de penetrar a membrana íntegra de células

viáveis, se difundindo passivamente. No citoplasma celular, o FDA é hidrolisado por

esterases produzindo a fluoresceína, componente que exibe fluorescência verde

quando excitado por luz azul (488nm). No ensaio, foi utilizado como marcador de

células vivas.

A solução estoque de Iodeto de Propídeo (PI – P4170, Sigma) foi obtida

através da diluição do corante em água para injeção estéril (1mg/mL), protegida da

luz e conservada a -20°C. O PI penetra em células em processo de apoptose e se

liga ao DNA de dupla fita da célula. O corante tem espectro de absorção entre 287 e

488nm e quando excitado a 630nm emite cor vermelha. No ensaio, foi utilizado

como marcador de células mortas ou em processo de morte.

40

Para a quantificação dos parasitos foi utilizada uma quantidade fixa e

conhecida de microesferas fluorescentes (FlowCountTM Fluorospheres Beckman

Coulter, PN7508092-E, LOT 7548025, concentração de 986/µL).

4.3.2 – Marcação dos Parasitos

Três diferentes procedimentos de marcação foram utilizados para cada

amostra: FDA (7 µg/mL), PI (25 µg/mL) e FDA + PI (nas mesmas concentrações).

Uma amostra sem marcação foi utilizada como controle. Um volume final de 220µl,

contendo 50µl de cultura, os corantes, 20µl de fluorosferas e PBS estéril (0.15 M

NaCl em 0.01 M de sódio fosfato (Na2HPO4), pH 7,2) foram analizados em um

citômetro de fluxo (modelo FACScan, Becton Dickinson). As análises foram

realizadas utilizando-se o programa FlowJo7.6.

4.3.3 – Ensaio Biológico

Para avaliar o crescimento dos parasitos em meio de cultura, garrafas de

cultura de 25cm2 receberam uma concentração inicial de 1x106 parasitos/mL em um

volume final de 8mL de meio LIT por garrafa. As garrafas foram imediatamente

transferidas para caixas com temperatura controlada e mantidas nas mesmas

condições durante sete dias (Figura 4). As temperaturas testadas foram de 21, 24,

27 e 30°C. Para cada nível de temperatura foram testadas simultaneamente duas

garrafas.

Diariamente uma amostra de 50L de cada garrafa foi coletada, marcada com

os corantes fluorescentes, e o número de células vivas e mortas foi contado no

citômetro de fluxo. Uma vez que o citômetro de fluxo somente conta número de

eventos sem correlacioná-los com volume, o número de parasitos foi estimado

através da sua comparação com uma quantidade conhecida de fluorosferas.

41

Figura 4 – Caixas de temperatura controladas, mantidas em estufa BOD, onde

foram realizados os ensaios.

42

4.4 – Avaliação do desenvolvimento de insetos infectados submetidos a diferentes temperaturas

4.4.1 - Infecção por Trypanosoma cruzi

Ninfas de segundo estádio com aproximadamente sete dias de jejum foram

alimentadas em alimentador artificial contendo sangue de coelho inativado (56°C,

30min), e uma suspensão de epimastigotas de cultura de T. cruzi numa

concentração de 1 x 107 parasitos/mL. Insetos alimentados apenas com sangue

foram utilizados como controle. Um dia após a alimentação, os insetos foram

transferidos para placas de Petri contendo papel de filtro como substrato (grupo

infectado, n=126 e grupo controle, n=132; máximo oito insetos por placa). As placas

foram mantidas em câmaras com temperaturas de 21, 24, 27 e 30°C (Figura 4).

Neste ensaio foram avaliados o tempo de duração do estádio e a mortalidade

dos insetos durante um período de 90 dias após a ocorrência da ecdise. No final do

ensaio, os insetos sobreviventes foram examinados para a presença de parasitos.

4.4.2 - Infecção por Trypanosoma rangeli

A infecção dos insetos por T. rangeli foi realizada de acordo com Ferreira et

al. (2010). Ninfas de quarto estádio com sete dias de jejum foram inoculadas com

1µL de PBS estéril contendo 50 epimastigotas de cultura (5x104 par/mL). O inóculo

foi realizado diretamente na cavidade celomática do inseto utilizando-se uma seringa

Hamilton de 50µL com uma agulha acoplada (13 × 3,30 G, ½''). Um dia após o

inóculo, as ninfas foram alimentadas em camundongos anestesiados e 24 horas

após, transferidas para placas de Petri contendo papel de filtro como substrato

(n=120 para T1 e 80 para T2, máximo de seis ninfas por placa). Para cada uma das

temperaturas, insetos inoculados com o mesmo volume de PBS estéril foram

utilizados como controle (n=120 para T1 e 76 para T2, máximo de seis ninfas por

placa). As placas foram mantidas em câmaras com temperaturas de 21, 24, 27 e

30°C (Figura 4). Para os dois tratamentos de T. rangeli foram avaliados o tempo de

duração do estádio e a mortalidade dos insetos durante um período de 30 dias após

43

a ocorrência da ecdise. No final do ensaio, os insetos sobreviventes foram

examinados para a presença de parasitos na hemolinfa e nas glândulas salivares.

Para o exame da positividade da hemolinfa foi feito um corte com o auxílio de

uma tesoura fina no tarso do primeiro par de patas de cada ninfa e uma pequena

gota foi coletada diretamente em lâmina e visualizada em microscópio. Para o

exame das glândulas, a cabeça de cada ninfa foi retirada com o auxílio de pinças

finas e as glândulas foram transferidas para lâminas contendo solução salina 0,9%.

Uma lamínula foi colocada sobre o material para a visualização em microscópio em

aumento de 400x.

4.5 – Quantificação do Trypanosoma cruzi no trato intestinal de Rhodnius prolixus, em insetos submetidos a diferentes temperaturas

4.5.1 - Infecção por Trypanosoma cruzi e ensaio biológico

Camundongos B6.129S7-IFN knockout (KO) obtidos do Biotério Central do

CPqRR foram infectados via intraperitoneal com 5.000 epimastigostas de T. cruzi.

No sétimo dia pós-infecção, a parasitemia foi contada segundo a metodologia

descrita por Brener (1962).

Ninfas de quinto estádio foram individualmente pesadas e individualizadas em

frascos plásticos (3,5 x 2cm), contendo papel de filtro como substrato e cobertos

com tecido de forma a permitir a alimentação dos insetos.

Para a alimentação das ninfas, o camundongo foi anestesiado

intraperitonealmente com uma mistura de ketamina a 150 mg/kg (Cristalia; Brasil) e

xilazina 10 mg/kg (Bayer; Brasil) e a cada ninfa foi permitido ingerir o equivalente a

30mg de sangue. Após a alimentação, as ninfas foram mantidas em câmaras com

temperaturas controladas de 21, 24, 27 e 30°C (Figura 4). No dia seguinte à

infecção, os insetos foram retirados das câmaras, alimentados em alimentador

artificial contendo sangue de coelho citratado para realizarem a alimentação

completa. Em seguida foram transferidos novamente para as câmaras com

temperatura controlada até a realização dos ensaios. Os insetos que permaneceram

44

nas câmaras por períodos superiores a 30 dias receberam uma segunda

alimentação no 45º dia pós-infecção.

A avaliação do número de parasitos foi realizada nos dias 15, 30 e 60 após a

infecção. Para cada período e temperatura testados, quatro insetos foram

individualmente dissecados e seus intestinos médio anterior, médio posterior e

ampola retal (Figura 5) transferidos para tubos cônicos contendo 20L de PBS

estéril. Durante o processo de dissecação as amostras foram mantidas em gelo e

posteriormente estocadas a -20ºC até a extração do DNA.

Para cada temperatura avaliada, amostras de dois ou mais insetos foram

também utilizadas para contagem em câmara de Neubauer. Para isso, as amostras

foram homogeneizadas e 5l de cada uma das partes dissecadas, diluídas em 45l

de PBS e 10l do material diluído utilizados para contagem.

Figura 5 – Esquema do tubo digestivo de um triatomíneo. As setas indicam cada

porção do tudo digestivo (Adaptado de Garcia et al., 2007).

45

4.5.2 – Extrações de DNA

As amostras obtidas no item 4.5.1 (de intestino médio anterior, intestino médio

posterior e ampola retal de insetos individuais) foram submetidas à extração de DNA

utilizando-se o Kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega) seguindo-se o

protocolo sugerido pelo fabricante para extração de DNA de amostras de sangue,

que se baseia em quatro etapas. Primeiramente uma solução de lise celular foi

utilizada para lisar a membrana das células, seguindo-se uma segunda solução de

lise para romper o núcleo das células. Na terceira etapa foi utilizada uma solução de

precipitação de proteínas. Para melhor visualização do pellet de DNA, 4µl de

glicogênio (40mg/mL, Invitrogen) foram adicionados a cada amostra e em seguida

uma solução de isopropanol foi utilizada para precipitar o DNA obtido. Uma solução

de álcool a 70% foi utilizada para lavar o DNA e eliminar qualquer material

inespecífico. Após esse procedimento de lavagem foi feita uma centrifugação e o

sobrenadante foi descartado. O pellet de DNA obtido foi ressuspenso em água ultra

pura (Gibco) e quantificado em um aparelho Nanodrop (Thermo Scientific). Para

essa quantificação, foram utilizados 2µL do total obtido.

Amostras de DNA foram também extraídas de parasitos mantidos em meio de

cultura e também de sangue de camundongos IFN-KO não infectados e infectados

com T. cruzi para serem utilizadas como controle positivo da reação de PCR. Além

disso, amostras de intestinos de insetos não infectados e sangue de camundongo

IFN-KO foram utilizados para controle negativo da reação. Novamente, o Kit Wizard

Genomic DNA purification foi utilizado, seguindo-se neste processo o protocolo

sugerido para amostras de cultura de células e para amostras de sangue.

4.5.3 – PCR quantitativo em Tempo Real

Os produtos obtidos nas extrações de DNA foram submetidos à análise por

PCR em tempo real (qPCR) para se obter uma quantificação molecular do número

de parasitos. Para as reações de qPCR foram utilizados iniciadores específicos para

amplificar um fragmento de 182pb de T. cruzi (TCZ) (Cummings e Tarleton, 2003), e

as reações foram realizadas em um equipamento ABI Prism 7500 Sequence

46

Detection System (Applied Biosystems). As sequências dos iniciadores utilizados

para a amplificação de DNA específico para o T. cruzi estão listadas na tabela 1.

Tabela 1 – Sequências dos iniciadores específicos para T. cruzi utilizados para

amplificação dos produtos de DNA por PCR em tempo real (Cummings e Tarleton,

2003).

Iniciadores Sequências

TCZ – F 5’ GCTCTTGCCCACAMGGGTGC 3’

Onde M = A ou C

TCZ – R 5’ CCAAGCAGCGGATAGTTCAGG 3’

As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando-se o Power

SYBR Green PCR Master Mix Kit (Applied Biosystems) de acordo com as

recomendações do fabricante. A análise dos resultados foi feita pelo ABIPRISM

7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Cada reação foi realizada

em triplicata, contendo 2µl do DNA molde, 300nM de cada iniciador, 12,5µl do Power

SYBR Green PCR Master Mix em um volume final de 25µl. As condições de

amplificação foram: desnaturação inicial a 95°C por 10 minutos, 40 ciclos de

desnaturação a 95°C por 15 segundos, ligação dos iniciadores e extensão a 60°C por

1 minuto. Durante as reações, foram feitas análises das curvas de dissociação dos

amplificados de cada amostra a fim de verificar se as qPCRs estavam gerando mais

de um produto.

Um controle negativo (sem adição de DNA) foi incluído para o conjunto de

iniciadores e utilizado para confirmar a ausência de DNA genômico inespecífico e

para verificar se houve formação de dímeros de iniciadores ou de qualquer

contaminação nas reações.

47

Uma curva padrão foi gerada como descrito por Caldas et al. (2012),

utilizando-se 8 diluições seriadas em água (1:10). Para isso, foi preparada uma

mistura de amostras de DNA extraídos de sangue de camundongo B6.129S7 INF-

KO não infectado e de parasitos de meio de cultura, de forma que a concentração

inicial fosse equivalente a 5.106 parasitos/100µl de sangue .

4.6 – Análises Estatísticas

As análises do crescimento dos parasitos em meio de cultura foram focadas

nos efeitos da temperatura nas taxas de crescimento e foram realizadas no

programa (R) pelo colaborador do estudo, Dr. S.L. Elliot. O primeiro passo foi

determinar as taxas de crescimento (ou seja, as curvas de regressão) para cada

replicata (garrafa) em cada tratamento de temperatura. Para isso, os tamanhos das

populações de parasitos vivos foram log-transformados (ou seja, logarítimo do

número de parasitos + 1) e modelos de efeitos mistos lineares foram utilizados para

a análise de medidas repetidas (ou seja, dias 1, 2, 3, etc). Esta análise gerou oito

curvas de crescimento para cada um dos três parasitos testados (duas repetições de

quatro temperaturas). Estas foram submetidas a análises de regressão para avaliar

possíveis efeitos da temperatura nas taxas de crescimento.

O efeito da infecção na duração do período intermudas e na sobrevivência

dos insetos mantidos nas diferentes temperaturas, foi analisado através da

comparação de curvas de sobrevivência, utilizando-se o Teste Log-Rank. As taxas

de sobrevivência, ecdise e defeitos na muda foram analisadas através do teste Z de

proporções para amostras independentes. A infecção das glândulas salivares entre

insetos submetidos a diferentes temperaturas foi avaliada através do teste Qui-

quadrado, comparando-se os pares através de bipartição. Para todas as análises o

nível de significância considerado foi de p<0,05.

48

RESULTADOS

49

5 RESULTADOS

5.1 - Avaliação do crescimento dos parasitos em meio de cultura, submetidos a diferentes temperaturas

O crescimento in vitro da população de T. cruzi aumentou com o aumento da

temperatura de 21-30°C (Figura 6A; p<0,0001 para o efeito da temperatura), com as

maiores populações sendo obtidas na temperatura de 30ºC (386 x 103 parasitos). Os

parasitos mantidos nas temperaturas de 21 e 24°C não mostraram um aumento

expressivo no crescimento ao longo dos sete dias de acompanhamento. O melhor

ajuste da regressão da curva de crescimento versus temperatura (Figura 6B) não foi

curvado, indicando que o pico de crescimento deve ter ocorrido a 30°C ou mais. De

modo geral, o perfil de crescimento do T. cruzi foi maior (entre 6-60 vezes) que o

encontrado para o T. rangeli quando os parasitos foram submetidos às mesmas

condições (Figura 6A, C e E).

Os dois tratamentos de T. rangeli também cresceram mais em temperaturas

mais altas, mas nestes casos, os melhores ajustes de regressão foram funções

quadráticas, indicando que as curvas tiveram seus picos de crescimento em 27°C

para os dois tratamentos (Figuras 6C-F; p<0,01 para ambos os tratamentos). O T.

rangeli T1 (parasitos que foram mantidos exclusivamente em meio LIT) apresentou

as menores taxas de crescimento, não ultrapassando 60 x 103 parasitos em

nenhuma das temperaturas a que foi submetido (Figura 6C). Entre as temperaturas

avaliadas, o perfil de crescimento do parasito foi menor em 21 e 30ºC (Figura 6C). A

maior população alcançada para o T. rangeli T2 (parasitos mantidos em meio LIT

por 30 dias, após terem sido submetidos a uma passagem em triatomíneos e

camundongos e posteriormente recuperados por hemocultura) foi obtida em 27°C

(120 x 103 parasitos). Para as temperaturas de 24 e 30°C o crescimento foi

semelhante e aproximou-se de 100 x 103 parasitos no sétimo dia. Assim como para

todos os outros parasitos estudados, a temperatura de 21°C foi a que apresentou as

menores taxas de crescimento.

As taxas de mortalidade de T. cruzi ficaram abaixo de 10%, com exceção dos

parasitos mantidos em 21°C que apresentaram valores acima dos 20% (Figura 7A).

Para o T. rangeli T1, as taxas de mortalidade ficaram entre 10 e 40%, a temperatura

de 27°C mostrando as mortalidades mais baixas (Figura 7B). As taxas de

50

mortalidade para o T. rangeli T2 foram consistentemente mais baixas do que 10%,

independentemente da temperatura a que foram expostos (Figura 7C).

Trypanosoma cruzi

1 2 3 4 5 6 7

Log

(par

asito

+ 1

) (m

édia

+ e

.p.)

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

21°C24°C27°C30°C

21 24 27 30

Incl

inaç

ão (

méd

ia +

e.p

.)

3600

3700

3800

3900

4000

4100

4200

4300

Trypanosoma rangeli T1

1 2 3 4 5 6 7

Log

(par

asito

+ 1

) (m

édia

+ e

.p.)

2500

3000

3500

4000

4500

5000

Trypanosoma rangeli T2

Dias1 2 3 4 5 6 7

Log

(par

asito

+ 1

) (m

édia

+ e

.p.)

2500

3000

3500

4000

4500

5000

Temperatura (°C)

21 24 27 30

Incl

inaç

ão (

méd

ia +

e.p

.)

3650

3700

3750

3800

3850

3900

3950

4000

21 24 27 30

Incl

inaç

ão (

méd

ia +

e.p

.)

3100

3150

3200

3250

3300

3350

3400

3450

A

C

B

D

F

E

Figura 6 - Crescimento de epimastigotas de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma

rangeli em cultura, mantidos em diferentes temperaturas. As barras representam o

erro da média de duas repetições.

51

1 2 3 4 5 6 7

Mor

talid

ade

(%,

méd

ia +

e.p

.)

0

10

20

30

40

50

21°C24°C 27°C 30°C

A

B

1 2 3 4 5 6 7

Mor

talid

ade

(méd

ia +

e.p

.)

0

10

20

30

40

50

Dias

1 2 3 4 5 6 70

10

20

30

40

50

Trypanosoma rangeli T1 Trypanosoma rangeli T2C

Trypanosoma cruzi

Dias

Dias

Figura 7 - Mortalidade de epimastigotas de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma

rangeli em cultura, mantidos em diferentes temperaturas. Foram incluídos os dados

de células coradas com PI e com FDA+PI, indicativo de células mortas ou em

processo de morte celular. As barras representam o erro da média de duas

repetições.

52

5.2 – Avaliação do desenvolvimento de insetos infectados submetidos a diferentes temperaturas

5.2.1 Insetos infectados por Trypanosoma cruzi

O objetivo desse experimento foi avaliar se o período intermudas e as taxas

de mortalidade de insetos infectados e saudáveis variavam com a temperatura.

Como esperado, independentemente da presença da infecção, a temperatura afetou

o período intermudas em todos os tratamentos, uma vez que o tempo para alcançar

o terceiro estádio foi reduzido conforme a temperatura foi aumentada (Figura 8, Log-

Rank; p=0,00001 para os dois tratamentos). Independentemente da temperatura a

que os insetos foram expostos, a infecção pelo T. cruzi prolongou o tempo

necessário para as ninfas atingirem o terceiro estádio (Figura 2; Log-Rank, p<0,0002

para todos os tratamentos). Os tempos médios para as ninfas do grupo controle

alcançarem o terceiro estádio foram de 32,1+8,3, 23,2+9,5, 17,8+8,9 e 13,3+3,2 dias

para as temperaturas de 21, 24, 27 e 30°C, respectivamente. Para os insetos

infectados, o tempo médio para a ocorrência da ecdise foi de 43,5+9,2, 30,0+7,7,

23,6+6,3 e 23,3+10,4 dias para as temperaturas de 21, 24, 27 e 30°C,

respectivamente. Além de prolongar o tempo de muda para o terceiro estádio, a

infecção pelo T. cruzi também diminuiu o sucesso de ecdise dos insetos mantidos a

21°C (Teste Z, p=0,002) e 30°C (Teste Z, p=0,007) (Tabela 2). A porcentagem de

mudas com defeito foi baixa em todas as temperaturas e tratamentos testados,

ficando em torno dos 10% (Tabela 2).

As taxas de mortalidade foram inicialmente avaliadas ao final de trinta dias

após a primeira muda de cada grupo e dentro desse período não foram observadas

diferenças significativas entre insetos infectados e saudáveis nas temperaturas

avaliadas, exceto para os insetos infectados mantidos a 24°C, que apresentaram

uma taxa de mortalidade 20% maior do que os insetos do grupo controle mantidos

na mesma temperatura (Tabela 2; Teste Z, p=0,008).

Com objetivo de avaliar o efeito global da infecção, os insetos que ao longo

do experimento morreram, não mudaram ou apresentaram defeitos na ecdise foram

somados e comparados entre os tratamentos. De modo geral, a infecção por T. cruzi

promoveu um decréscimo de 20% na população, sendo as comparações

53

estatisticamente significativas para os grupos mantidos a 21, 24 e 30°C (Tabela 2;

Teste Z, p=0,01 para 21 e 24°C, p=0,03 para 30°C).

Para avaliar a interação da infecção com a temperatura e o jejum, a

mortalidade das ninfas foi acompanhada por um período de 60 dias além daquele

avaliado inicialmente (Figura 9). Independentemente da infecção, no final dos 90

dias de acompanhamento, praticamente todos os insetos mantidos a 27 e 30ºC já

haviam morrido, enquanto cerca da metade daqueles mantidos em 21 e 24°C

permaneceram vivos (Figura 9). A comparação deste parâmetro ao longo do tempo

entre os tratamentos mostrou um aumento na mortalidade em insetos infectados

mantidos em 24°C (Figura 9B; Log-Rank, p=0,02) e 27°C (Figura 9D; Log-Rank,

p=0,0001).

21°C

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Ecd

ise

(%)

0

20

40

60

80

100 24°C

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0

20

40

60

80

100

27°C

Dias

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Ecd

ise

(%

)

0

20

40

60

80

100 ControleInfectado

30°C

Dias

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500

20

40

60

80

100

p=0,0004 p=0,001

p=0,005 p=0,0001

A B

DC

Figura 8 – Efeito da infecção por Trypanosoma cruzi no período necessário para

alcançar o terceiro estádio de ninfas de Rhodnius prolixus mantidas em diferentes

temperaturas. Os valores de p indicados em cada gráfico representam a

significância estatística das comparações entre os tratamentos (Log-Rank).

54

Tabela 2 - Efeito da infecção por Trypanosoma cruzi no fitness de ninfas de Rhodnius prolixus

Temperatura (ºC)

Status Taxa de

Mortalidade (%) Teste Z Não mudaram (%) Teste Z Defeito na muda

(%) Teste Z

Taxa de mortalidade acumulada

(%)

Teste Z

21 Controle 25,0

n.s. 6,2

p=0,001 12,5

n.s 43,7

0,01

Infectado 25,0 34,4 9,4 68,8

24 Controle 3,1

p=0,007

12,5

n.s

0

n.s

15,6 0,01

Infectado 23,5 11,7 2,9 38,1

27

Controle 6,4

n.s

6,4

n.s

3,2

n.s

16,0 n.s.

Infectado 18,2 6,1 3,0 27,3

30

Controle 9,7

n.s

0

p=0,007

0

n.s

9,7 0,03

Infectado 6,1 18,2 3,0 27,3

55

21°C

Controle Infectado

Mor

talid

ade

acu

mu

lada

(%

)

0

20

40

60

80

100

30 dias60 dias90 dias

24°C

Controle Infectado0

20

40

60

80

100

27°C

Controle Infectado

Mor

talid

ade

acu

mul

ada

(%)

0

20

40

60

80

100 30°C

Controle Infectado0

20

40

60

80

100

p=0,02

p=0,0001

A B

C D

Figura 9 - Efeito da infecção por Trypanosoma cruzi nas taxas de mortalidade

de ninfas de Rhodnius prolixus mantidas a diferentes temperaturas. Os valores

de p indicados em cada gráfico representam a significância estatística das

comparações entre os tratamentos (Log-Rank).

56

5.2.2 Insetos infectados por Trypanosoma rangeli

De maneira geral, o período intermudas observado para os dois

diferentes tratamentos testados com o T. rangeli foi similar ao perfil encontrado

para os insetos infectados com o T. cruzi, ou seja, o período intermudas foi

mais curto para os insetos mantidos nas temperaturas mais altas,

independentemente da presença do parasito (Figuras 10 e 11; Log-Rank,

p=0,00001 para todos os tratamentos).

O tempo necessário para os insetos mudarem para o 5° estádio variou

entre 11 e 57 dias para o grupo infectado pelo T. rangeli T1 e entre 11 e 37

dias para o seu respectivo grupo controle (Figura 10). Para os insetos

infectados pelo T. rangeli T2 esses valores variaram entre 13 e 55 dias e para

os respectivos controles entre 12 e 51 dias (Figura 11). Em geral, ambos os

tratamentos de T. rangeli promoveram um atraso no período intermudas. Para

o grupo infectado com T. rangeli T1, este atraso foi dependente da

temperatura, sendo evidente somente nos insetos infectados mantidos nas

temperaturas de 21 e 24°C (Figura 10, Log Rank, p=0,00001 para 21 e 24°C).

As taxas de eclosão de insetos infectados também foram afetadas nas

temperaturas baixas (Tabela 3, teste Z, p=0,04 para insetos mantidos a 21°C

and p=0,01 para insetos mantidos a 24°C). A exposição às diferentes

temperaturas não promoveu alterações morfológicas nos insetos dos grupos

controle. Entretanto, a frequência dessas alterações foi aumentada nos insetos

infectados mantidos a 27°C (Tabela 3, teste Z, p=0,001). Um aumento nas

taxas de mortalidade de insetos infectados pelo T. rangeli foi induzido pelas

temperaturas mais baixas. A proporção de insetos infectados encontrados

mortos no final do período de avaliação chegou a 30% na temperatura de 21°C,

enquanto apenas 3,3% das ninfas haviam morrido no correspondente grupo

controle (Tabela 3, teste Z, p=0,003). Na temperatura de 24°C esse valor foi de

50% para os insetos infectados e de 6,6% para os insetos do grupo controle

(Tabela 3, teste Z, p=0,0001). Os efeitos cumulativos da infecção foram de

mais de 25% nos insetos mantidos a 21, 24 e 27°C, alcançando 60% naqueles

mantidos a 24°C (Tabela 3, teste Z, p<0,001 para todos os tratamentos). No

final do experimento, os insetos infectados pelo T. rangeli tiveram sua

57

hemolinfa e glândulas salivares examinadas para a presença do parasito. Não

foi observada infecção nas glândulas salivares de nenhum inseto,

independentemente da temperatura a que foi submetido. Em relação à infecção

da hemolinfa, ninfas mantidas a 30°C apresentaram uma redução nas taxas de

infecção quando comparadas com aquelas mantidas nas demais temperaturas

(Tabela 4, 2 partição, p=0,006).

Para os insetos infectados pelo T. rangeli T2, o prolongamento do

período intermudas foi independente da temperatura, ocorrendo em todos os

grupos infectados (Figura 11, Log Rank, p=0,00001 para insetos mantidos a

21°C; p=0,0002 para insetos mantidos a 24°C; p=0,00005 para insetos

mantidos a 27°C; p=0,00002 para insetos mantidos a 30°C). Apesar de

prolongar o processo de muda, o T. rangeli T2 não afetou as taxas de

mortalidade nem de ecdise, ou produziu alterações morfológicas significativas

nos insetos. A única exceção a essa tendência foi observada para insetos

infectados mantidos a 21°C, que apresentaram uma diminuição na taxa de

ecdise em relação ao grupo controle (Tabela 3, teste Z, p=0,03). Entretanto,

quando os efeitos patogênicos foram somados e comparados entre os grupos,

um aumento significativo dos efeitos da infecção foi observado nos insetos

infectados mantidos a 24 e 30°C (Tabela 3, teste Z, p=0,02 para ambos os

grupos). Trinta dias após a muda para o quinto estádio, todas as ninfas

infectadas apresentaram parasitos na sua hemolinfa (Tabela 4). Entretanto, a

infecção nas glândulas salivares foi reduzida nos insetos mantidos a 21 e 30°C

(Tabela 4, 2 partição, p=0,008).

58

21°C

0 10 20 30 40 50 60

Ecd

ise

(%)

0

20

40

60

80

100 24°C

0 10 20 30 40 50 600

20

40

60

80

100

27°C

Dias

0 10 20 30 40 50 60

Ecd

ise

(%

)

0

20

40

60

80

100

ControleInfectado

30°C

Dias

0 10 20 30 40 50 600

20

40

60

80

100

p<0.00001 p<0,00001

A

DC

B

Figura 10 – Efeito da infecção por Trypanosoma rangeli T1 no período

necessário para alcançar o quinto estádio de ninfas de Rhodnius prolixus

mantidas em diferentes temperaturas. Os valores de p indicados em cada

gráfico representam a significância estatística das comparações entre os

tratamentos (Log-Rank).

59

21°C

0 10 20 30 40 50 60

Ecd

ise

(%

)

0

20

40

60

80

10024°C

0 10 20 30 40 50 600

20

40

60

80

100

27°C

Dias

0 10 20 30 40 50 60

Ecd

ise

(%

)

0

20

40

60

80

100

ControleInfectado

30°C

Dias

0 10 20 30 40 50 600

20

40

60

80

100

p=0,00001 p=0,0002

p=0,00005 p=0,00002

A

DC

B

Figura 11 – Efeito da infecção por Trypanosoma rangeli T2 no período

necessário para alcançar o quinto estádio de ninfas de Rhodnius prolixus

mantidas em diferentes temperaturas. Os valores de p indicados em cada

gráfico representam a significância estatística das comparações entre os

tratamentos (Log-Rank).

60

Tabela 3 - Efeitos da infecção por Trypanosoma rangeli no fitness de ninfas de Rhodnius prolixus.

Tratamento Temperatura (%) Infecção Taxas de

Mortalidade (%) Teste Z Insucesso na

muda (%) Teste Z Mudas com defeito (%) Teste Z

Efeito total (%) Teste Z

T1

21

Controle 3,3

p=0,002

6,6

p=0,04

0

n.s

9,9 p=0,0004

Infectado 30,0 16,6 3,3 49,9

24

Controle 6,6

p<0,0001

3,3

p=0,01

0

n.s

9,9 p<0,0001

Infectado 50,0 13,3 6,6 69,9

27

Controle 6,7

n.s

0

n.s

0

p=0,001

6,7 p=0,002

Infectado 13,3 0 23,3 36,6

30

Controle 16,6

n.s

0

n.s

0

n.s

16,6 n.s.

Infectado 13,3 0 3,3 16,6

T2

21

Controle 5,2

n.s

0

p=0,03

0

n.s

5,2

Infectado 5,0 15,0 0 20,0 n.s.

24

Controle 5,2

n.s

0

n.s

0

n.s

5,2

Infectado 15,0 5,0 10,0 30,0 p=0,02

27

Controle 10,5

n.s

0

n.s

15,8

p=0,04

26,3

Infectado 21,0 0 0 21,0 n.s.

30

Controle 10,5

n.s

0

n.s

10,5

n.s.

21,0

Infectado 31,5 0 21,0 52,5 p=0,02

61

Tabela 4 - Taxa de infecção de ninfas de Rhodnius prolixus 30 dias pós-infecção.

Tratamento Temperatura (°C)

Positividade Hemolinfa (%)

Qui-quadrado Positividade glândulas salivares (%)

Qui-quadrado

T1

21 90,9

p=0,006

0

- 24 86,7 0

27 88,9 0

30 57,1 0

T2

21 100

-

52,6

p=0,008 24 100 76,5

27 100 93,3

30 100 38,5

62

5.3 – Quantificação do Trypanosoma cruzi no trato intestinal de Rhodnius. prolixus, em insetos submetidos a diferentes temperaturas

A quantificação do T. cruzi no trato intestinal de ninfas de R. prolixus foi feita

separadamente nas três porções do intestino (intestino médio anterior - IMA,

intestino médio posterior – IMP, e ampola retal - AR). Uma vez que não existem

trabalhos quantificando parasitos no trato intestinal de triatomíneos pela qPCR, a

técnica teve que ser padronizada para o presente estudo. Para verificar a qualidade

da qPCR, a maioria dos insetos analisados também teve amostras dos conteúdos

intestinais quantificados pela câmara de Neubauer (n=110 amostras). Em mais de

70% das amostras avaliadas, a qPCR deu resultados iguais ou superiores ao

observado na contagem da câmara de Neubauer. Em 30% das amostras, as duas

metodologias foram negativas para a presença do T. cruzi, sendo esses resultados

mais observados nas amostras de intestino médio anterior (Figuras 12, 13, 14 e 15).

Em 35,45% das amostras, a quantificação da qPCR foi maior do que a observada na

contagem da câmara de Neubauer. Entretanto, nos 34,55% restantes das amostras,

a quantidade de parasitos foi maior na câmara de Neubauer. A quantificação do

DNA total na maioria dessas amostras sugere ter havido perda de material durante o

processo de extração.

A avaliação da contagem em câmara de Neubauer não detectou parasitos na

porção do IMA em nenhuma das temperaturas ou períodos avaliados (Figura 12). Já

as quantificações do IMP e da AR foram bastante variáveis entre os insetos

analisados. Para o IMP as maiores quantificações foram observadas nas

temperaturas mais baixas (21 e 24°C) a partir dos 15 dias de infecção. A AR foi a

porção do trato intestinal onde foram encontrados mais parasitos em todos os

períodos avaliados. Contagens superiores a 1.000 par/µl foram encontradas nos

primeiros 15 dias após a infecção, mas apenas naqueles insetos mantidos nas

temperaturas mais altas, ou seja, 27 e 30°C (Figura 12).

63

15 DIAS

Temperatura (°C)

21 24 27 30 21 24 27 30 21 24 27 30

Par

asito

s /

ul

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

Intestino médio anteriorIntestino médio posteriorAmpola retal

30 DIAS

Temperatura (°C)

21 24 27 30 21 24 27 30 21 24 27 30

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

60 DIAS

Temperatura (°C)

21 24 27 30 21 24 27 30 21 24 27 30

Par

asito

s /

ul

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

Figura 12 - Quantificação através de contagem em câmara de Neubauer do número de parasitos de Trypanosoma cruzi no trato

intestinal de Rhodnius prolixus.

64

Da mesma forma que o verificado pela contagem em câmara de Neubauer, a

avaliação pela qPCR não detectou parasitos no IMA nos primeiros 15 dias de

infecção (Figura 13). Entretanto, das 27 amostras de IMA avaliadas nos outros

períodos, 40% foram positivas para a presença do T. cruzi, com quantidades

bastante variáveis entre as amostras (Figuras 14 e 15). A quantificação do número

de parasitos no IMP e AR seguiu o mesmo padrão observado nas contagens em

câmara de Neubauer, ou seja, as maiores quantificações foram obtidas nas

amostras de AR em insetos mantidos nas temperaturas mais altas.

15 dias

Temperatura (°C)

21 24 27 30 21 24 27 30 21 24 27 30

Pa

rasi

tos

/ ul

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

20000

40000

60000

80000



no trato intestinal de Rhodnius prolixus, 15 dias após a infecção dos insetos.

65

30 dias

Temperatura (°C)

21 24 27 30 21 24 27 30 21 24 27 30

Par

asito

s / u

l

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000


30 dias

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

45000

50000

55000




66

2D Graph 1

Temperatura (°C)

21 24 27 30 21 24 27 30 21 24 27 30

Par

asito

s / u

l

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

60 DIAS

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

2200052000

54000




67

DISCUSSÃO

68

6 DISCUSSÃO

Para compreender como a temperatura afeta a virulência de

tripanosomatídeos em hospedeiros invertebrados, primeiramente avaliamos o

crescimento de T. cruzi e T. rangeli em meio de cultura em diferentes temperaturas.

Nessas condições, os parasitos dispunham de nutrientes ad libitum fornecidos pelo

meio de cultura sem a presença da resposta imunológica do inseto. Neste sistema,

aparentemente a única variável que poderia comprometer a sobrevivência dos

parasitos seria a temperatura.

Os resultados mostraram que a temperatura afetou diferentemente as duas

espécies de tripanosomas estudadas. O crescimento da população de parasitos de

T. cruzi foi diretamente relacionado com o aumento da temperatura. De fato, em um

período de sete dias, parasitos mantidos a 30ºC apresentaram um aumento

expressivo (crescimento cerca de 28 vezes) na sua população, alcançando 386 x

103 parasitos, quase duas vezes mais do que o crescimento registrado a 27ºC.

Estudos prévios demostram que epimastigotas de T. cruzi crescem mesmo quando

submetidos à temperaturas de 37°C (Florin-Christensen et al., 1997).

Temperaturas mais baixas, particularmente 21ºC, parecem apresentar um

efeito nocivo sobre esta população de T. cruzi, uma vez que a taxa de mortalidade

observada nessa temperatura foi cerca de 20% no final do ensaio. Já foi

demonstrado que temperaturas baixas afetam o transporte e o processo de

endocitose de vesículas endocíticas, bem como a taxa de transporte de transferrina

para os reservosomos em epimastigostas de T. cruzi (Figueiredo e Soares, 2000). O

bloqueio da endocitose em temperaturas baixas parece não ser especifico para

protozoários, uma vez que tem sido descrito também em outras células eucarióticas

(Dunn et al., 1980; Haylett e Thilo, 1991; Punnonen et al., 1998; Brickman et al.,

1995).

Para o T. rangeli, a sensibilidade à temperatura variou de acordo com o

tratamento a que os parasitos foram submetidos. T. rangeli T1 foram mais sensíveis

às temperaturas extremas, uma vez que praticamente não foi observado

crescimento nas culturas submetidas a 21 e 30ºC. De maneira geral, os parasitos

desse tratamento não cresceram adequadamente em nenhuma das temperaturas

testadas, provavelmente em consequência da alta mortalidade observada durante

69

todo o experimento (entre 15 e 40%). Mesmo quando mantidos na temperatura mais

adequada (27ºC), a população não ultrapassou os 60.000 parasitos.

Apesar de ter crescido cerca de sete vezes menos do que as populações de

T. cruzi, os epimastigotas de T. rangeli T2 foram mais resistentes a baixas

temperaturas, aumentando sua população em até três vezes quando mantidos em

21ºC. A baixa mortalidade dos parasitos observada nessa temperatura reforça essa

ideia. Entretanto, contrariamente ao observado para T. cruzi, os epimastigotas de T.

rangeli T2 também foram sensíveis à 30ºC, mas com uma menor intensidade do que

os parasitos do tratamento 1 (T. rangeli T1).

De maneira geral, o melhor desenvolvimento em meio de cultura observado

para o T. cruzi poderia estar relacionado com a utilização do meio LIT como fonte

nutricional, uma vez que esse meio de cultura foi desenvolvido especialmente para a

espécie (Yager, 1960). Já foi demonstrado que o T. rangeli é maior do que o T. cruzi

em todas as suas formas de desenvolvimento (Herbig-Sandreuter, 1957), o que

poderia levar a uma maior necessidade de nutrientes e limitar seu crescimento no

meio LIT. É importante ressaltar que as populações de T. rangeli T2 sempre se

tornam T. rangeli T1 quando são mantidas em meio LIT por mais de dois meses,

modificando suas características infectivas para o inseto vetor. Estes dados reforçam

a ideia de que o meio LIT não é uma fonte nutricional completa para o T. rangeli,

sendo que os parasitos necessitam de passagens pelos hospedeiros vivos para

crescerem adequadamente. Neste sentido, seria desejável que as cepas de T.

rangeli utilizadas em experimentação fossem regularmente passadas em

triatomíneo-hospedeiro vertebrado para que suas características infectivas sejam

mantidas.

A temperatura tem um relevante papel no desenvolvimento de vários outros

parasitos protozoários. Espécies de Leishmania diferem na sua suscetibilidade ao

estresse por temperatura, o que é refletido na sua habilidade em estabelecer

infecções em diferentes áreas do corpo de mamíferos (Zilberstein, 1994). A

resistência à temperatura em diferentes espécies de Leishmania tem sido

correlacionada com o tropismo do parasito, sendo as espécies viscerais mais

resistentes do que as espécies cutâneas (Callahan et al., 1996). Para o

Trypanosoma brucei, foi demonstrado que a temperatura é importante tanto na

70

regulação do potencial de membrana através da membrana plasmática quanto na

regulação do pH interno (Kuile, 1994). Além disso, foi demonstrado que a redução

da temperatura de 37 para 27ºC além da adição de cis-aconitato são suficientes

para promover a transformação de T. brucei monomórficos sanguíneos para

tripomastigotas procíclicos em meio de cultura (Czichos et al., 1986).

Vários estudos têm demonstrado que a temperatura afeta o desenvolvimento

de muitas interações entre insetos e microorganismos, alterando particularmente as

taxas de replicação ou o nível de virulência dos microorganismos (revisado por

Thomas e Blanford, 2003). Conhecendo-se a dinâmica de desenvolvimento das

duas espécies de Trypanosoma em diferentes regimes de temperatura, o próximo

passo foi avaliar os graus de patologia induzidos por estes parasitos nos seus

hospedeiros invertebrados quando os mesmos foram infectados e submetidos às

mesmas condições de temperatura testadas anteriormente.

Contrariamente aos resultados observados com outras espécies de

triatomíneos (Juarez, 1970; Zeledón et al., 1970; Schaub, 1978, 1988; Lima et al.,

1992), as ninfas de segundo estádio de R. prolixus tiveram seu período de muda

prolongado quando infectadas pelo T. cruzi, independentemente da temperatura a

que foram expostas. Dependendo do regime de temperatura, os insetos infectados

prolongaram o período intermudas em mais de 10 dias em um único estágio de

desenvolvimento. Levando-se em consideração o ciclo de vida completo, seria

possível que insetos infectados prolongassem em mais de um mês o tempo

necessário para alcançar o estádio adulto, o que possivelmente afetaria seu fitness

em relação aos seus coespecíficos saudáveis.

Avaliando outros parâmetros biológicos que poderiam ser afetados pela

infecção pelo T. cruzi, como as taxas de mortalidade e de ecdise, bem como as

alterações morfológicas ocorridas durante a ecdise, ficou claro que os efeitos

isolados de cada um dos parâmetros não foram patogênicos para os insetos,

independentemente da temperatura. De fato, efeitos patogênicos significativos não

foram observados em nenhuma das temperaturas testadas. Entretanto, quando o

número de insetos que sofreram algum tipo de injúria em consequência da infecção

foi somado para cada nível de temperatura, foi possível observar que, exceto para

71

aqueles insetos mantidos em 27°C, a infecção pelo T. cruzi afetou significativamente

a sustentabilidade da população.

Uma vez que os triatomíneos vivem primariamente associados a ninhos de

aves e mamíferos, onde o suprimento sanguíneo não é constante, eles se

adaptaram para sobreviver por longos períodos sem alimentação. Sendo assim, nós

decidimos avaliar as taxas de mortalidade por mais 60 dias, para verificar se o

parasito poderia afetar esse parâmetro quando os insetos estão sob estresse

nutricional (Figura 4). A associação entre temperatura e jejum afetou diferentemente

a sobrevivência dos insetos. Temperaturas altas associadas com jejuns prolongados

foram letais para os insetos, independentemente da presença do parasito. Já é bem

conhecido que temperaturas altas promovem um aumento no metabolismo de

insetos (revisado por Brown et al., 2004). Sendo assim, seria esperado um aumento

nas taxas de mortalidade de insetos em jejum submetidos a essas temperaturas,

como já relatado em estudos prévios (Luz et al., 1998). De acordo com os resultados

do crescimento dos parasitos em meio de cultura, seria esperado uma alta

mortalidade nos insetos infectados em decorrência da presença de uma grande

população de parasitos. Entretanto, não foram observadas diferenças nas taxas de

mortalidade entre insetos infectados e saudáveis mantidos a 30°C. Provavelmente, o

estado de jejum dos insetos, com poucos recursos nutricionais disponíves, reduziu o

crescimento da população de T. cruzi. Já foi demonstrado que triatomíneos podem

perder infecções pelo parasito após longos períodos de jejum (Kollien e Schaub,

1998), o que reforça essa ideia. A infecção pelo T. cruzi não alterou as taxas de

mortalidade de insetos mantidos a 21°C, possivelmente em decorrência do baixo

desenvolvimento do parasito nessa temperatura. A virulência do parasito se

expressou nas temperaturas intermediárias (24 e 27°C) quando as taxas de

mortalidade aumentaram nos grupos infectados. Possivelmente nessas

temperaturas, as reservas nutricionais foram suficientes tanto para a sobrevivência

dos insetos quanto para o desenvolvimento dos parasitos, permitindo ainda o

estabelecimento de uma grande população de flagelados, particularmente em 27°C,

o que pode ter levado aos efeitos patogênicos observados.

Os efeitos patogênicos do T. rangeli para R. prolixus foram mais evidentes

naqueles parasitos que foram mantidos em meio LIT por longos períodos antes da

infecção (T1) e especialmente naqueles insetos mantidos em temperaturas mais

72

baixas. Insetos submetidos a esse tratamento somente tiveram um prolongamento

do período intermudas quando mantidos a 21 e 24°C. As taxas de mortalidade e

ausência de ecdise também somente foram aumentadas nessas temperaturas.

Todos esses parâmetros alterados produziram um aumento de mais de quatro vezes

no efeito cumulativo da infecção, sugerindo um elevado desenvolvimento do parasito

nos insetos infectados e mantidos em temperaturas baixas, contrariamente ao baixo

crescimento desses parasitos no meio de cultura. Esses resultados reforçam a ideia

de que o meio LIT não é suficiente para permitir o bom desenvolvimento do T.

rangeli. Como tem sido observado em infecções de rotina no laboratório, no

presente estudo o T. rangeli T1 não conseguiu invadir as glândulas salivares de

ninfas de R. prolixus. Não havendo a possibilidade de colonização das glândulas e

mantendo-se o processo de multiplicação celular, parasitos do tratamento T1

provavelmente promoveram uma infecção massiva na hemocele dos insetos, o que

teria levado a todos os efeitos patogênicos observados. Ferreira et al. (2010)

mostraram que a presença do T. rangeli somente na hemolinfa do inseto já é

suficiente para levar a alterações patológicas. A presença de mudas defeituosas foi

o único parâmetro alterado nos insetos infectados pelo T. rangeli T1 e mantidos

27°C. É interessante mencionar que aqueles insetos mantidos a 24°C apresentaram

uma taxa de mortalidade bastante elevada, sendo que mais de 50% das mortes

ocorreram durante o processo de ecdise (dados não mostrados). Estes resultados

sugerem que o aumento da temperatura em três graus permitiu aos insetos

infectados sobreviverem e mudarem, apesar da infecção, embora a maioria deles

tenha apresentado problemas para completar o processo de maneira correta. Não

foram observados efeitos patogênicos naqueles insetos infectados pelo T. rangeli T1

mantidos a 30°C, provavelmente porque os parasitos não toleram este nível de

temperatura. Essa idéia é suportada pelo baixo grau de desenvolvimento dos

parasitos em LIT na temperatura de 30°C bem como pelas reduzidas taxas de

infecção observadas nos insetos infectados pelo T. rangeli T1 e mantidos a 30°C.

T. rangeli T2 não foi virulento ao hospedeiro invertebrado, uma vez que os

parasitos não aumentaram as taxas de mortalidade dos insetos infectados em

relação aos dos insetos do grupo controle. Os parasitos desse tratamento foram

selecionados através da contínua exposição a ambos hospedeiros vertebrados e

invertebrados. Este tratamento garantiu uma elevada taxa de infecção das glândulas

73

salivares dos insetos, particularmente naqueles mantidos em temperaturas

intermediárias (24 e 27°C). Ensaios preliminares têm demonstrado uma significativa

redução no número de parasitos na hemolinfa quando as glândulas salivares são

colonizadas (dados não mostrados). Uma menor população de parasitos na

hemolinfa poderia responder pela redução dos efeitos patogênicos observados em

insetos infectados por T. rangeli T2. Apesar disso, o período intermudas dos insetos

infectados foi prolongado em todas as temperaturas avaliadas. Adicionalmente,

quando todos os parâmetros de fitness foram somados e o efeito cumulativo da

infecção foi avaliado, os efeitos patogênicos do parasito puderam ser observados,

dependendo da temperatura a que os insetos foram expostos. É importante ressaltar

que apenas um estágio de desenvolvimento foi acompanhado. Da mesma forma que

o sugerido para infecções com T. cruzi, possivelmente, o acúmulo dessas alterações

ao longo da vida do inseto afete significativamente seu fitness em relação aos

insetos saudáveis da colônia.

Sabendo-se como a temperatura afeta o crescimento do parasito e a sua

virulência para o hospedeiro invertebrado, restava ainda investigar o papel do inseto

no desenvolvimento do parasito. A quantificação dos parasitos no trato intestinal de

insetos mantidos em diferentes temperaturas, comparando-se com os dados obtidos

do seu crescimento em meio de cultura, poderia dar uma ideia da relevância das

respostas geradas pelo inseto frente à infecção. Sendo assim, o último objetivo do

presente estudo foi avaliar quantitativamente o crescimento do T. cruzi em R.

prolixus em diferentes momentos da infecção e sob diferentes níveis de temperatura.

Diferentes estudos têm sido realizados a fim de detectar e quantificar o DNA

de T. cruzi pela técnica de qPCR em amostras de sangue e tecido de pacientes

chagásicos, bem como em infecções experimentais (Piron et al., 2007, Qvarnstrom

et al., 2012 e Caldas et al., 2012). Entretanto, não existem estudos quantificando

tripanosomas no trato intestinal de triatomíneos. Sendo assim, a técnica teve que ser

padronizada para as condições avaliadas no presente estudo. A contagem em

câmara de Neubauer foi simultaneamente utilizada para avaliar a qualidade dos

ensaios moleculares, e mostrou que em pelo menos 30% das amostras avaliadas,

os baixos valores encontrados pela qPCR provavelmente não refletiram a

quantidade de parasitos presentes no inseto. Possivelmente, nestes casos, parte do

74

material tenha sido perdido durante o processo inicial de extração do DNA das

amostras.

Uma vez que foram testados três diferentes porções do intestino, quatro

níveis de temperatura e três períodos de infecção, o número de insetos avaliados

por tratamento teve que ser reduzido para que os ensaios fossem concluídos dentro

do prazo do presente estudo. Além disso, a carga parasitária variou enormemente

entre os insetos. Sendo assim, não são possíveis ainda proposições conclusivas a

respeito desse relevante tópico. Um ajuste nos protocolos de extração e repetições

dos ensaios para aumentar o número de indivíduos por amostra possibilitarão uma

comparação mais precisa entre os tratamentos. Entretanto, mesmo com um número

reduzido de exemplares avaliados, alguns relevantes aspectos da interação

puderam ser encontrados. O primeiro deles foi a constatação de que a temperatura

de 21ºC promove uma redução do crescimento dos parasitos, corroborando os

dados obtidos nos ensaios de crescimento em meio de cultura. Além disso, também

foi possível demonstrar que temperaturas mais altas aceleram o desenvolvimento do

ciclo do T. cruzi no inseto, promovendo o aparecimento de parasitos na ampola retal

em infecções mais recentes.

A técnica de qPCR se mostrou mais sensível, quantificando um número maior

de parasitos, do que a contagem em câmara de Neubauer. Além disso, através

desse método foi possível detectar a presença de T. cruzi no intestino médio anterior

em infecções com mais de 15 dias. Provavelmente, estes parasitos não foram

encontrados pela contagem em câmara de Neubauer por estarem aderidos ao

epitélio intestinal. De fato, um exame preliminar de lâminas coradas por Giemsa

mostrou a presença de formas aparentemente teciduais do parasito, o que aumenta

a relevância do encontro (dados não mostrados). Ferreira et al. (2011)

demonstraram que insetos alimentados em camundongos infectados com T. cruzi

diminuíram drasticamente a quantidade de parasitos no intestino médio anterior nas

primeiras 24 horas pós-infecção, sem contudo ser observado um aumento na

quantidade de flagelados no intestino médio posterior, indicando que o T. cruzi não

estaria cruzando rapidamente o IMA. Os dados de quantificação pelas duas técnicas

utilizadas no presente estudo corroboram essa ideia, uma vez que em infecções

com 15 dias nenhum parasito foi encontrado nesta porção do intestino. O encontro

do T. cruzi no IMA em infecções crônicas poderia ser decorrente de uma re-entrada

75

do parasito nesta porção intestinal naqueles insetos com cargas parasitárias

elevadas. De fato, todas as amostras com IMA positivo foram provenientes de

insetos com um número elevado de parasitos no IMP e AR. Novos ensaios serão

desenvolvidos com o objetivo de identificar estes parasitos com técnicas de

microscopia que permitam a determinação da forma e do tipo de aderência no

epitélio intestinal do inseto.

Triatomíneos do gênero Rhodnius vivem em palmeiras em associação com

ninhos de aves e roedores (Teixeira et al., 2001; Abad-Franch et al., 2005; Stehling

Dias et al., 2011), onde podem abrigar o T. cruzi e o T. rangeli em infecções simples

ou mistas (Stehling Dias et al., 2008; Thekisoe et al., 2010). A temperatura média

nesses refúgios fica em torno de 25°C (Heger et al., 2006), a mesma escolhida pela

espécie em estudos utilizando gradientes de temperatura (Schilman e Lazzari,

2004). De acordo com os resultados obtidos no presente estudo, é possível sugerir

que ambos os parasitos podem estar promovendo efeitos patogênicos nos seus

hospedeiros invertebrados, pelo menos nas espécies de Rhodnius, nos seus

ecótopos naturais. As implicações desses efeitos no processo de invasão do peri e

intradomicílio pelos insetos, bem como na própria transmissão dos parasitos precisa

ainda ser melhor investigada. Além disso, o T. cruzi parece ser melhor adapatado à

temperaturas altas do que o T. rangeli, já que o último, independentemente de como

foi mantido antes dos ensaios, mostrou uma queda no número total de parasitos na

temperatura de 30ºC. Estas características poderiam ser relacionadas ao

desenvolvimento dos parasitos em seus hospedeiros invertebrados, já que o T.

rangeli somente completa seu ciclo de desenvolvimento em espécies do gênero

Rhodnius, que normalmente habitam microambientes com temperaturas amenas

(Heger et al., 2006). A capacidade do T. cruzi em se desenvolver numa ampla gama

de temperaturas poderia ter contribuído para sua adaptação a um número maior de

espécies de triatomíneos, distribuídas em ecossistemas com temperaturas mais

elevadas.

76

CONCLUSÕES

77

7 CONCLUSÕES

A temperatura afetou diferentemente o crescimento de T. cruzi e de T. rangeli

em meio de cultura; enquanto o crescimento do T. cruzi foi diretamente

relacionado com o aumento da temperatura, para o T. rangeli as maiores

populações foram obtidas em 27ºC;

A manutenção do T. rangeli através de passagens em camundongos e

triatomíneos (T2) permitiu um melhor crescimento dos parasitos em meio de

cultura;

A infecção por T. cruzi prologou o período intermudas dos insetos infectados;

a virulência do parasito foi dependente da temperatura e do estado nutricional

do inseto;

Os efeitos patogênicos do T. rangeli para R. prolixus foram mais evidentes

naqueles parasitos que foram mantidos em meio LIT por longos períodos

antes da infecção (T1), especialmente naqueles insetos mantidos em

temperaturas mais baixas;

Apesar de não ser virulento para o hospedeiro intermediário, o T. rangeli T2

prolongou o período intermudas e, dependendo da temperatura, promoveu

um aumento significativo no número de insetos com algum tipo de efeito

patogênico;

Embora os dados de quantificação de parasitos sejam ainda preliminares, foi

possível constatar que a quantificação do T. cruzi através da técnica de qPCR

se mostrou mais sensível, detectando um número maior de parasitos, bem

como sua presença no IMA em infecções acima de 15 dias;

Temperaturas mais altas aceleraram o desenvolvimento do T. cruzi dentro do

inseto, promovendo o aparecimento de parasitos na ampola retal em

infecções recentes.

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MINISTÉRIO DA SAÚDE FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ … · À Laurinha, por estar sempre presente. Por entender a minha ausência e estar sempre disposta a momentos de descontração para