UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

NOVAS ABORDAGENS DA PESQUISA EM CACAU NA BUSCA DE SOLUÇÕES INOVADORAS PARA PRAGAS E AGREGAÇÃO

DE VALOR AOS SUBPRODUTOS

Fábio Neves dos Santos

Laboratório ThoMSon de Espectrometria de Massas

Brasília, 09 de março de 2017.

1

2

Sumário de apresentação

I – Identificação de fitopatógenos do cacau para

inspeção fitossanitária

II – Metabolômica de clones do cacau infectados por

Moniliophthora perniciosa (vassoura de bruxa)

III – Aproveitamento e uso sustentável do mel de cacau

em novos produtos

3

Laboratório ThoMSon de Espectrometria de Massas

4

Novas metodologias em espectrometria de massas

5

6

7

8

Local do estudo – Centro de Pesquisas do Cacau, Ilhéus - Bahia

9

Novas metodologias analíticas por

espectrometria de massas para diferenciar as

principais espécies de fitopatógenos do

cacau

10

11

Moniliophthora roreri causador da moniliase do cacau

Identificação

Morfologia

forma, cor, cheiro ...colorações de microscopia

Testes Bioquímicos

Molecularspecific-PCRs, RT-PCRsSNP, MLST, RFLP, VNTR, PFGE…

Testes imunologicos

Anticorpos mono- ou policlonais, aglutinação, teste ELISA...

Atividade metabolica

12

1988 MALDI - TOF

1988 MALDI - TOF

Matrix-assisted laser desorption/ionization

MALDI-MS

1988 MALDI - TOF

13

E.coli4

36

4.0

6

53

80

.64

62

54

.64

63

15

.49

50

96

.01

71

57

.65

72

73

.87

64

10

.90

78

70

.62

83

68

.99

0

1000

2000

3000

4000

5000Inte

ns.

[a.u

.]

4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000

m/z

Proteina

Ribossomalm/z

RL36 4364,33

RS32 5095,82

RL34 5380,39

RL33meth. 6255,39

RL32 6315,19

RL30 6410,60

RL35 7157,74

RL29 7273,45

RL31 7871,06

RS21 8368,76

Modo Positivo

Faixa de massa 4-10 kDa

14

Perfil de peptídeos/proteínas de E. Coli por MALDI-TOF-MS

15

Jacyr Pasternak – Chefe da Comissão Hospitalar do Albert Einstein

“Finalmente sentimo-nos em tempo de fornecer um resultado de

maneira tempestiva útil - porque pouco adianta explicar para o

clínico que nossa bactéria cuidadosamente cultivada é tal

depois que o doente faleceu”.

CLASSIFICAÇÃO DE FITOPATÓGENOS DO CACAUEIRO

Patógenos (espécies)

Patógenos (gêneros)

Doenças Cacaueiro

TheobromaCacao L.

Vassourade bruxa

Moniliophthora

perniciosa

roreri

Podridãoparda

Phytophthora

P. capsici

P. palmivora

P. citrophthora

P. hevea

Murcha deCeratocystis

Ceratocystis

cacaofunesta

fimbriata

paradoxa16

17

Moniliophthora perniciosa

• Fruto

• Caule

• Ilhéus

Ceratocystis cacaofunesta

• Caule

• Pecíolo/folha

• Ilhéus

• Santo Amaro

• Belmonte

• Mutuípe

• Uruçuca

Ceratocystis paradoxa

• Pecíolo/folha de coqueiro

• Una - Bahia

• Itacaré -Bahia

Ceratocystis fimbriata

• Caule de Eucalipto

• Pecíolo/folha de Eucalipto

• Caule seringueira

• Pecíolo/folha de seringueira

Hospedeiros, tecidos vegetais e localidades de coleta dos isolados dos fitopatógenos

18

Phytophthora palmivora

• Fruto de cacau

• Fruto de mamão

• Itabuna

• Eunapolis

• Gandu

• Mutuipe

• Una

Phytophthora capsici

• Fruto de cacau

• Pecíolo/folha de seringueira

• Pau Brasil

• Camacan

• Ituberá

• Una

• Gonguji

Phytophthora heveae

• Pecíolo/folha de seringueira

• Rizosfera de seringueira

• Una

• Uruçuca

• ituberá

Phytophthora citrophthora

• Fruto de cacau

• Pecíolo/folha de seringueira

• juçari

• Ituberá

• Belmonte

• Santo Amaro

• Gandú

Hospedeiros, tecidos vegetais e localidades de coleta dos isolados dos fitopatógenos

Vortex

Adicionar 50 μL TFA 80% (30 min a 1000 rpm)

50 μL água + 100 μL ACN

Depositar um 1,0 µL do sobrenadante na placa MALDI +

1,0 μL de CHCACentrifugar 2 min a 13.000xg

Centrifugar por 2 min a 13.000xg. Retirar etanol

residual e secar 10 min

300µL água900µL etanol

•Extração de peptídeos/proteínas

Microrganismo isolado

19

4878

2032

2857

31523413 5173 6206 6618 7903

0

1

2

3

4

5

x104

7234

6093361530462376 6777

0.0

0.5

1.0

1.5

5328

2086

6380

7016

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

m/z

Moniliophthora perniciosa

Ceratocystis cacaofunesta

Phytophthora palmivora

x104

x104

Inte

nsid

ade

Perfis de peptídeos/proteínas de Moniliophthora perniciosa,Ceratocystis cacaofunesta e Phytophthora palmivora (diferentesgêneros).

20

6271

3698

5318

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0x10

4

5877

6371

61773693 5343

1

2

3

4

62973695

82424114

5642

0.0

0.5

1.0

1.5

6174

4853 58903802 5266 88956855 93297604 8085

0

2

4

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

m/z

6374

x104

x104

x104

P. palmivora

P. heveae

P. citrophthora

P. capcisi

Inte

nsid

ade

Perfis de peptídeos/proteínas das espécies Phytophthora

21

6173

37886998 101937576

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

x104

6174

4852 592852658900

808740413691 93297372

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

6172

3693 6999 81897408

0

1

2

3

4

5

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

m/z

x104

x104

6998

P. capsici 1454

P. capsici 1442

P. capsici 1597

Inte

nsi

dad

ePerfis de peptídeos/proteínas de Phytophthora coletados deseringueira (1454, 1597) e cacau (1442)

22

6273

3695

61401

2

3x104

62663698

6143

0.5

1.0

1.5

2.0

53526277

2085

0.25

0.50

0.75

5326

20876379

0.00.51.01.52.0

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

m/z

x104

x104

x104

0.0

0.0

6374

6376

6379

P. palmivora 1662

P. palmivora 1629

P. palmivora 262

P. palmivora 250

Inte

nsi

dad

ePerfis de peptídeos/proteínas de Phytophthora coletados de mamão (250, 262) e cacau (1629, 1662)

23

Perfis de peptídeos/proteínas de Phytophthora coletados de folhas (989) e rizosfera (1170, 1144) de seringueira

24

58796372

6180534636941

2

3

5202

3827765061813701 58781

2

3

50944588 63745879

525036896183

4281

0.0

0.5

1.0

1.5

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

m/z

x104

x104

x104

P. heveae 1170

P. heveae 989

P. heveae 1144

Inte

nsi

dad

e

2857

4877

23192646

62075171 6914

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

x105

4878

2032

2857

31523413 5173 6206 6618 6916 7903

0

1

2

3

4

5

x104

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

m/z

2783M. perniciosa (caule)

M. perniciosa (fruto)

Inte

nsid

ade

Perfis de peptídeos/proteínas de Moniliophthora perniciosacoletado de caule e fruto de cacau.

25

Perfil de peptídeos/proteínas dos fitopatógenos

26

M . perniciosa

C. Cacaofunesta

C. Paradoxa

C. fimbriata

P. palmivora

P. citrophthora

P . heveae

P. capsici

27

PERSPECTIVA: BIBLIOTECA DE FITOPATÓGENOS DO CACAUEIRO

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

Os resultados obtidos na caracterização de fitopatógenos do

cacau mostram importante avanço na contribuição científica

para diferenciação das pragas usando a técnica MALDI-

TOF/MS, sobretudo a discriminação de isolados de uma mesma

espécie coletado de diferentes hospedeiros.

29

Espera-se que esse trabalho gere impacto científico para a

sociedade brasileira, visto que a instrução normativa IN-47 do

MAPA sobre inspeção fitossanitária do cacau está sendo

revisada atualmente, devido as recentes suspeitas de

contaminação de amêndoas de cacau vindo da África.

Metabolômica de clones resistentes e suscetíveis do

cacaueiro infectados por Moniliophthora perniciosa

(vassoura de bruxa)

Perdas de 70 a 90% da produção

Não existem genótipos totalmente resistentes

30

31

Ciclo de

desenvolvimento

do Moniliophthora

perniciosa no

cacau

L. M. Scarpari et al. J. Exp. Bot. 2005;56:865-877

Published by Oxford University Press [2005]

Fases da infecção do Moniliophthora perniciosa no cacau: genes

ativados, proteínas expressas e os metabólitos???

32

33

Interação planta-patógeno e produção de metabólitos

Metabólitos responsáveis pelos

sintomas

Metabólitos específicos de defesa

Metabólitos de defesa do cacaueiro

Germoplasmascontrastantes

Metabolômica da interação patógeno-

hospedeiro

Theobroma cacao vsMoniliophthora perniciosa

Genótipo resistente (Scavina-6)

controle inoculado

Fase assintomática

Fase sintomática

Genótipo suscetível (Catongo)

controle Inoculado

Fase assintomática

Fase sintomática

Delineamento Experimental

34

35

Delineamento Experimental

Mudas de cacau na casa de vegetação e na camara fria 24 h antes da inoculação

36

Delineamento Experimental

Inoculação de basidiósporos de M. perniciosa e sintomas em cacau

Cacao inoculado com M. perniciosa

Amostra do caule Maceração em nitrogênio liquido

100 mg do caule triturado extraído com 1 mL methanol.

1 µl do extrato analisado por LC-MS

Agilent 6550 Q-TOF/MS

SPE C18 ou cetrifugação/diluíção

Parametros ESI (+) Q-TOF

capillary voltage 3,5 kV

cone voltage 40 V

Cone gas 50 L h-1

desolvation gas 600 L h-1

desolvationtemperature

250 °C

Full MS scan m/z 50-1500

scan time 0.2 s

Preparo de amostra e análise por LC-MS

37

38

A B

Diferenciação estatística dos clones Scavina-6(resistente) e Catongo (suscetível) controle e inoculado(A) e biomarcadores dos clones

39

Metabólitos nas fases de infecção do SCAVINA-6 (resistente) pelo Moniliophthora perniciosa

40

AB

Fase 1: detecção/sinalização Fase 2: Resposta de defesa

Fase 1: detecção/sinalização

B

Fases de infecção do CATONGO (suscetível) infectado pelo Moniliophthora perniciosa

41Fase 1: detecção/sinalização

Fase 2: Resposta de defesa

Fase 3: Morte celular

42

Os resultados obtidos podem levar à melhor compreensão

dos níveis de resistência e suscetibilidade das variedades

de cacaueiro contra Moniliophthora perniciosa e revelar os

principais metabólitos de resistência do cacaueiro.

43

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

Perfil molecular por espectrometria de massas

possibilitou a discriminação das fases de infecção de

clones resistentes e suscetíveis ao Moniliophthora

perniciosa e identificar os principais biomarcadores.

44

Modelo de negócio para agregação de valor:

Aproveitamento e uso sustentável do mel

de cacau

45

Cacau, chocolate, mel de cacau...

46

Mel de cacau

Alimentos

Adoçante (chocolate, alimentos...

bebidas

In natura

Isotônicos

Cervejas especiais

cosméticos

Sabonete liquido

Shampoo

Condicionador

hidratantes

47

Compostos bioativos do mel de cacau

48

49

Modelo de negócio:

Desenvolvimento de novos cosméticos

baseados em mel de cacau

Empresa Start up – S Cosméticos do Bem

50

Agradecimentos

Obrigado!!!