OBTENÇÃO DE BIOCATALISADOR PARA ESOLUÇÃOtpqb.eq.ufrj.br/download/obtencao-de-biocatalisador-para-resolucao-cinetica-de...Aos meus queridos pais, Jorge e Rosa, por sempre estarem

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Programa de Pós-Graduação de Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos

Escola de Química

Tese de Doutorado

OBTENÇÃO DE BIOCATALISADOR PARA RESOLUÇÃO

CINÉTICA DE DERIVADOS DE MIO-INOSITOL

Evelin Andrade Manoel

RIO DE JANEIRO

MAIO/2014




TESE SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS DA ESCOLA DE

QUÍMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO, COMO PARTE DOS

REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM

CIENCIAS.

Orientadores:

Maria Alice Zarur Coelho, D.Sc.

Denise Maria Guimarães Freire, D.Sc.

RIO DE JANEIRO

MAIO/2014




TESE SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS DA ESCOLA DE

QUÍMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO, COMO PARTE DOS

REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM

CIÊNCIAS.

Aprovada por:

Orientador (es)

Banca Examinadora:

RIO DE JANEIRO

MAIO/2014

MANOEL, EVELIN ANDRADE



[Rio de Janeiro] – 2014.

180p. 29,7 cm

Tese (Doutorado) -Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ,

Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e

Bioquímicos – EQ, 2014.

Orientador: Profa. Dra. Maria Alice Zarur Coelho

Profa. Dra. Denise Maria Guimarães Freire

1.Biocatálise. 2. myo-inositol. 3. Lipase. 4. Biorreator. 5. Substâncias

bioativas–I. Título

II. Universidade Federal do Rio de Janeiro-EQ.

III- Série

Dedicatória,

Aos meus queridos pais, Jorge e Rosa, por sempre estarem do meu lado.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente gostaria de agradecer a Deus, por ter me concedido saúde e perseverança para realizar o trabalho.

Aos meus pais, Jorge e Rosa, irmã, Erika, cunhado Alex e ao meu sobrinho lindo Isaac, que chegou as nossas

vidas para mostrar que o mundo pode ser muito melhor. Obrigada pelo amor, carinho, compreensão, apoio e

principalmente paciência incondicional, uma vez que me ausentei muito nesta trajetória de tese.

Às minha queridas orientadoras, Profa. Maria Alice Zarur Coelho e Profa. Denise Maria Guimarães Freire, pela

orientação dedicada, pelas oportunidades, idéias e estímulo que me proporcionaram. Pelos apoios e sugestões

não só na vida profissional, como na pessoal, que me atentei com todo carinho. Por tudo que aprendi, e ainda,

pelo que vou aprender sou muito grata a vocês.

Ao Prof. Alessandro Bolis Costa Simas (NPPN) pela colaboração neste trabalho, pela livre entrada e

permanência em seu laboratório e, sobretudo, pela livre utilização de seus reagentes e colunas para o HPLC. A

sua contribuição foi muito além do que uma simples colaboração.

Ao prof. Rodrigo Octávio Sousa, pela colaboração e pela livre entrada e permanência em seu laboratório. Muito

obrigada!

À Suema Branco, minha querida irmã, obrigada pela grandiosa amizade e carinho todos estes 10 anos. Obrigada

pela compreensão e paciência.

A Jaqueline Nascimento, pela amizade e companheirismo, não somente na bancada, mas na vida. Obrigada por

sempre estar a disposição, inclusive em um dos momentos mais importantes da minha vida, durante meu período

de concurso público me dando caronas, cafés, almoços etc, rsrs. Nunca vou esquecer isso. Você faz parte desta

vitória!

Aos amigos mais que queridos da família LaBiM, Laboratório de Biotecnologia Microbiana, por permitir que eu

fizesse parte desta grande família.

Aos amigos do Laboratório de Microbiologia Molecular e de Proteínas, o LaMMP, que além da colaboração,

fizeram do ambiente de trabalho um lugar mais divertido e familiar.

Aos meus queridos companheiros Marcelo, em especial pela paciência, pelo carinho, pela alegria nos tempos

vagos; Jaqueline Nascimento, pela eterna amizade, ombro e apoio de sempre; Joab Sampaio, pela amizade e

ombro sempre que necessário; Erika Aguilheiras, Mateus Godoy, Carolina Guimarães e aos meninos Arthur e

Bruno, pelo enorme carinho, sou grata pela amizade de vocês. À querida amiga Lívia, a ―Liv‖, como eu gosto de

chamar. Obrigada pela amizade e consideração em todos os momentos. Ao Bruno César, Roberta Branco e a

eterna Valéria Soares, saudades Valzinha!!. Val, muito obrigada pela mão amiga, pelos conselhos profissionais e

pessoais, pelas risadas na bancadas.

Aos meus queridos amigos do BOSS group. Muito obrigada pelo carinho de vocês!

À profa. Melissa Gutarra, a eterna Mel, amiga e profissional admirável. Agradeço pelo enorme carinho e

amizade de sempre.

À Aline Fernandes, pelas ajudas na concessão de materiais e por sempre estar disposta a ajudar.

Aos professores do laboratório LaMMP, Rodrigo, Bianca e Marcia pela livre entrada e permanência em seu

laboratório durante todo o período do curso.

Aos amigos do laboratório BIOSE (EQ-UFRJ), em especial ao amigo Bernardo, pelas dicas no ramo

profissional, as amigas Roberta e Tatiana por serem tão queridas.

Aos verdadeiros amigos que estiveram presentes nos bons e maus momentos em toda a minha vida e, como não

poderia deixar de ser, também nestes últimos três anos. A Secretaria da Escola de Química, principalmente

Roselee, por sempre estar alegre e pronta a ajudar a nós, alunos da pós-graduação e coordenação do curso de

pós-graduação.

Ao CNPq pela bolsa de doutorado concedida nos dois primeiros anos de estudo, a qual foi muito importante para

realização de trabalhos, idas e vindas a congressos e cursos importantes para a minha carreira.

À FAPERJ, pela bolsa nota 10 concedida posteriormente.

A todas as demais pessoas que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho.

Muito Obrigada!!!

E não há outro lugar onde eu gostaria de estar, amar o ciência só me

faz sonhar... Manoel, E.A.

Resumo da Tese de doutorado apresentada a Escola de Química da Universidade Federal do

Rio de Janeiro (EQ/UFRJ) como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de

Doutor em Ciências (D.Sc.)

Manoel, Evelin Andrade. OBTENÇÃO DE BIOCATALISADOR PARA RESOLUÇÃO

CINÉTICA DE DERIVADOS DE MIO-INOSITOL. Rio de Janeiro, 2014. Programa de

Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de Química,

Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Nos últimos anos, grandes esforços têm sido feitos para o desenvolvimento de processos

eficientes na elaboração de compostos enantiomericamente puros, principalmente para as

indústrias farmacêuticas. O interesse na obtenção de derivados de mio-inositol

enantiomericamente puros, deve-se, principalmente, à síntese de novas drogas e à importância

da sinalização celular como segundo mensageiro. Lipases vem sendo aplicadas nas resoluções

enantiosseletivas por serem altamente regio-, quimio-, diastero- e enantiosseletivas. Com isso,

esta tese teve como objetivo principal o estudo de um novo biocatalisador home-made tão

eficiente quanto as suas respectivas versões comerciais para resolução de diferentes derivados

farmacológicos de mio-inositol. Para isso, lipases produzidas pelos laboratórios de pesquisa

da UFRJ (LaBiM e BIOSE) e lipases liofilizadas comerciais foram imobilizadas em diferentes

suportes home-made (tipo casca-núcleo: PS-co-DVB/PS-co-DVB e PMMA-co-DVB/

PMMA-co-DVB) e comercial (para fins comparativos: Accurel MP 1000). Posteriormente, os

biocatalisadores imobilizados foram utilizados na resolução cinética de diferentes derivados

farmacológicos previamente sintetizados no Lab. Roderick Barnes, NPPN-UFRJ, tais como:

(±)-1,4,5,6-tetra-O-benzil-mio-inositol (rac-1); (±)-1,4,5,6-tetra-O-alil-mio-inositol (rac-2);

(±)-1,3,4-tri-O-benzil-mio-inositol (rac-3) e (±)-3,6-O-dibenzil-1,2-O-isopropilideno-mio-

inositol. As influências do solvente, agente acilante, água, utilização de diferentes suportes de

imobilização e reatores foram estudadas no desempenho do biocatalisador. Dentre as lipases

utilizadas, destacou-se a lipase B de Candida antarctica na resolução dos derivados rac-3 e

rac-4. Planejamentos experimentais foram realizados com a Novozym 435 utilizando acetato

de vinila em hexano em modo de batelada simples. Através do modelo matemático

construído, as condições ótimas para a reação de acetilação de rac-3 foram estabelecidas para

o biocatalisador comercial imobilizado. O produto L-1-O-acetil-2,3-O-ciclohexilideno-mio-

inositol (L-5) foi obtido com 49,7 ±0,2% de conversão e eep maior que 99%. Este sistema

permitiu o aumento da produtividade em 15 vezes, comparando-se com as condições não

otimizadas. Por outro lado, a abordagem utilizando o sistema de fluxo contínuo mostrou ser

muito eficiente para Novozym 435 na resolução de rac-3, levando um aumento em 531 vezes

(3.188mgproduto/mgenzima.h) na produtividade em relação ao sistema BSTR

(0.006mgproduto/mgenzima.h). Testes em maiores volumes foram feitos com a condição

otimizada obtendo alta conversão (50±1%) e alta pureza óptica (eep maior que 99%). O reuso

do biocatalisador foi feito em até 7 ciclos sem que houvesse queda na conversão (49% ± 0.7)

e eep. Após estudar as condições reacionais ótimas de Novozym 435 na resolução cinética de

rac-3 e rac-4, as versões home-made e comercial (LIPB e CALB, respectivamente) foram

imobilizadas nos suportes supramencionados e comparadas com Novozym 435. LIPB

imobilizada mostrou melhor desempenho quando comparadas com CALB comercial após

imobilizada nos mesmos suportes e desempenho similar a Novozym 435, uma das lipases

mais utilizadas no setor industrial. O processo permitiu a produção de L-5 em diferentes

escalas de produção, importante intermediário farmacológico no combate a doenças de

Chagas.

Abstract of doctor thesis presented to Escola de Química of Universidade Federal do Rio de

Janeiro (EQ/UFRJ) as partial fulfillment of the requiriments for the degree of Doctor of

Science (D.sc.)

Manoel, Evelin Andrade. ATTAINMENT OF BIOCATALYSTS TO KINETIC

RESOLUTION OF MIO-INOSITOL DERIVATIVES. Rio de Janeiro, 2014. Programa de

Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de Química,

Universidade Federal do Rio de Janeiro.

In recent years, great efforts have been made to develop efficient processes in the preparation

of enantiomerically pure compounds, particularly for the pharmaceutical industries. There are

great interest in obtaining derivatives of myo-inositol enantiomerically pure mainly in the

synthesis of new drugs due to importance of cellular signaling as a second messenger. Lipases

has been used due to the regio-, chemo-, diastereo- and enantioselectivity. Thus, this thesis

aimed the study of a new home-made biocatalyst as efficient as its respective commercial

form to the kinetic resolution of myo-inositol derivatives. For this, lipases produced by

differents research groups at UFRJ (LaBIM and BIOSE) and commercial lyophilized lipases

were immobilized on different supports home-made (core-shell particles: PS-co-DVB/PS-co-

DVB and PMMA-co-DVB / PMMA-co-DVB) and commercial (for comparative purposes:

Accurel MP 1000). Subsequently, the immobilized biocatalysts were used for kinetic

resolution of different myo-inositol derivatives previously synthesized in Lab Roderick

Barnes, NPPN-UFRJ such as (±) -1,4,5,6-tetra-O-benzyl-myo-inositol (rac-1); (±) -1,4,5,6-

tetra-O-allyl-myo-inositol (rac-2); (±) -1,3,4-tri-O-benzyl-myo-inositol (rac-3) and (±) -3,6-O-

dibenzyl-1 ,2-O-isopropylidene-myo-inositol. The influence of solvent, acyl donor, water,

immobilization on different supports and reactors will be studied in the performance of the

biocatalyst. Among the lipases used, the best performance was the lipase B from Candida

antarctica in the kinetic resolution of rac-3 and rac-4. Response surface method to the

optimization of kinetic resolution of (±)-1,3,6-tri- O-benzyl-myo-inositol by Novozym 435

(immobilized lipase B from Candida antarctica) with vinyl acetate in hexane was applied on

batch mode. Through the constructed mathematical model, optimum condition for this

enzymatic condition was established. L-1-O-acetyl-2,3- tri-O-benzyl-myo-inositol was

obtained with a 49,7 ±0,2% conversion and eep higher than 99%. This system allowed the

productivity increase 15 times compared with non-optimized conditions. Moreover, the

approach using continuous flow system proved to be very effective for the resolution of

Novozym 435 rac-3, with productivity of 531 times higher (3.188mgproduct/mgenzyme h)

than of the optimized condition for the corresponding batch process

(0.006mgproduct/mgenzyme h). The feasibility of enzyme recycle was demonstrated without

loss of conversion and eep values up to the seventh recycle. Tests were made in larger

volumes with the optimized conditions obtaining high conversion (50 ± 1%) and high optical

purity (greater than 99% eep). The reuse of the biocatalyst was made within 7 cycles without

any decrease in conversion (49% ± 0.7) and eep. After the study of the optimal reaction

conditions of Novozym 435 in the kinetic resolution of rac-3 and rac-4, the lipases home-

made and commercial (LipB and CALB, respectively) were immobilized on different

supports and compared with Novozym 435. LIPB immobilized showed better performance

when compared with comercial CALB after immobilization process on the same support and

similar performance with Novozym 435, the one most used lipase in industrial sector. The

process showed the production of L-5 at different scales of production. This compound is an

important pharmacological intermediate against Chagas' Disease.

ÍNDICE GERAL

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................................ 3

1.1 JUSTIFICATIVA .......................................................................................................................................... 5

2. OBJETIVOS ................................................................................................................................................. 9

2.1- OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................................................... 9

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................................................... 10

3.1- O MIO-INOSITOL..................................................................................................................................... 10 3.1.1 O papel do mio-inositol nas atividades biológicas ............................................................................... 12

3.1.2 Mio-Inositol no tratamento da doença de chagas ............................................................................... 16 3.2 ESTEREOSSELETIVIDADE: CONCEITO, ROTAS PARA OBTENÇÃO DE COMPOSTOS

ENANTIOMERICAMENTE PUROS E CINÉTICA DOS ENANTIÔMEROS ............................................... 16 3.2.1 Rotas para a obtenção de compostos enantiomericamente puros ..................................................... 17

3.2.2 Cinética dos enantiômeros ................................................................................................................... 21 3.3 LIPASES ..................................................................................................................................................... 26

3.3.1 Características das lipases ................................................................................................................... 26

3.3.2 Principais micro-organismos utilizados para lipases ........................................................................... 29

3.3.3 Estrutura proteica de lipases ............................................................................................................... 30

3.3.4 Sítios de ligação do substrato em lipases ............................................................................................ 32

3.3.5 Fenômeno da ativação interfacial em lipases ...................................................................................... 33

3.3.6 Mecanismo cinético ............................................................................................................................. 36

3.3.7 Aplicação das lipases ........................................................................................................................... 39

3.3.8 Aplicação de lipases na síntese de fármacos ....................................................................................... 42

3.3.9 Lipases promissoras para o estudo dos derivados de mio-inositol ...................................................... 47

3.3.10 Fatores que podem influenciar a estereosseletividade das lipases ................................................... 50

Quanto ao Biocatalisador: Tecnologia da Imobilização de Enzimas............................................................. 51

Quanto ao substrato: Influência dos grupamentos substituintes dos substratos......................................... 64

Quanto ao design do processo ...................................................................................................................... 64

4. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................................................... 77

4.1 MATERIAIS ............................................................................................................................................... 77 4.1.1 Biocatalisadores utilizados .................................................................................................................. 77

4.1.2 Substratos utilizados ............................................................................................................................ 77

4.1.3 Suportes utilizados na imobilização por adsorção ............................................................................... 78 4.2. MÉTODOS ................................................................................................................................................ 80

4.2.1 Seleção de lipases e substratos por meio da reação de acetilação realizados em sistema descontínuo

(ou modo de batelada) ................................................................................................................................. 80

4.2.2 Efeito do agente acilante na conversão e na enantiosseletividade ..................................................... 82

4.2.3 Efeito do solvente na conversão e na enantiosseletividade ................................................................. 82

4.2.4 Estudo da resolução cinética dos substratos/lipases selecionadas utilizando o sistema de fluxo

contínuo ........................................................................................................................................................ 83

4.2.6 Teste de estabilidade de estocagem das lipases imobilizadas ............................................................. 96

4.2.7 Desenho Experimental e Análise Estatística para resolução cinética do rac-3 .................................... 96

4.2.8 Testes prévios com aumento de volume .............................................................................................. 98

4.2.9 Estudo do reuso das reações de acetilação dos substratos/lipases selecionadas utilizando o sistema

de batelada simples ...................................................................................................................................... 98

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................................................................... 99

5.1 SELEÇÃO DE SUBSTRATOS E LIPASES HOME-MADE ...................................................................... 99 5.2 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL DA REAÇÃO DE ACETILAÇÃO DE RAC-3 UTILIZANDO A

LIPASE NOVOZYM 435 EM SISTEMA DE BATELADA .......................................................................... 106 5.2.1- Análise estatística dos dados ............................................................................................................ 107

5.2.3 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL DA REAÇÃO DE ACETILAÇÃO DE RAC-3 UTILIZANDO A LIPASE

NOVOZYM 435 EM SISTEMA DE FLUXO CONTÍNUO ................................................................................... 124

5.2.5- Imobilização da lipase B de Candida antarctica expressa em Pichia pastoris (LIPB) por adsorção

hidrofóbica em diferentes suportes ............................................................................................................ 131

5.2.6- Estabilidade dos biocatalisadores ao longo do tempo ..................................................................... 135

5.2.7- Imobilização da lipase CALB em Accurel MP 1000 e comparações com LIPB ................................... 136

5.2.8- Resolução cinética de rac-3 utilizando lipase B de Candida antarctica expressa em Pichia pastoris,

imobilizada sobre diferentes suportes ........................................................................................................ 137

5.2.9- Resolução cinética de rac-4 utilizando lipase B de Candida antarctica expressa em Pichia pastoris,

imobilizada em diferentes suportes ............................................................................................................ 138

6. CONCLUSÕES ............................................................................................................................................. 141

7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ....................................................................................... 142

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................................................... 143

ÍNDICE DE TABELAS

TABELA 1. LIPASES SELECIONADAS PRODUZIDAS PELO LABIM/UFRJ E PELO BIOSE/UFRJ ......................................................... 8

TABELA 2. PRINCIPAIS ÁREAS APLICAÇÕES, PRODUTOS E TIPOS DE REAÇÕES DESEMPENHADAS PELAS LIPASES ................................ 40

TABELA 3. RELAÇÃO DOS TRABALHOS ATUAIS QUE UTILIZAM MÉTODOS E SUPORTES DISTINTOS DURANTE O PROCESSO DE

IMOBILIZAÇÃO. ................................................................................................................................................. 59

TABELA 4. VALOR DE LOG P DE SOLVENTES ORGÂNICOS (ADLERCREUTZ, 2000). ................................................................ 72

TABELA 5. SOLUÇÕES SALINAS SATURADAS ADEQUADAS AO CONTROLE DA ATIVIDADE DE ÁGUA (ADLERCREUTZ, 2000). ............ 74

TABELA 6. DADOS DE CARACTERIZAÇÃO DOS SUPORTES POLIMÉRICOS SELECIONADOS PARA ESTA TESE (BESTETI, ET AL., 2009, 2010)

..................................................................................................................................................................... 79

TABELA 7. VALORES REAIS E CODIFICADOS DAS VARIÁVEIS EMPREGADAS NO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL FRACIONÁRIO. ............ 96

TABELA 8. VALORES REAIS E CODIFICADOS DAS VARIÁVEIS EMPREGADAS NO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL COMPOSTO CENTRAL. . 97

TABELA 9. SELEÇÃO INICIAL DE LIPASES POR CCF PRODUZIDAS PELOS LABORATÓRIOS LABIM E BIOSE (UFRJ) NA RESOLUÇÃO CINÉTICA

DE DERIVADOS DE MIO-INOSITOL. ....................................................................................................................... 101

TABELA 10. RESULTADOS DO SCREENING REALIZADO COM AS DIFERENTES LIPASES NA RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-3 UTILIZANDO

ACETATO DE VINILA COMO SOLVENTE E AGENTE ACILANTE. ...................................................................................... 102

TABELA 11. RESULTADOS DO SCREENING REALIZADO COM AS DIFERENTES LIPASES NA RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-4 UTILIZANDO

ACETATO DE VINILA COMO SOLVENTE E AGENTE ACILANTE. ...................................................................................... 103

TABELA 12. INFLUÊNCIA DA VARIÁVEL TEMPERATURA NA CONVERSÃO EM 48H DE TEMPO REACIONALA ..................................... 109

TABELA 13. MATRIZ DO PLANEJAMENTO FATORIAL FRACIONÁRIO COM OS VALORES REAIS E CODIFICADOS PARA AS VARIÁVEIS

INDEPENDENTES E PARA A VARIÁVEL DE RESPOSTA CONVERSÃO (X%). ....................................................................... 110

TABELA 14. MATRIZ DO PLANEJAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL COM OS VALORES REAIS E CODIFICADOS PARA AS

VARIÁVEIS INDEPENDENTES E PARA A VARIÁVEL DE RESPOSTA CONVERSÃO (X%), TEMPO REACIONAL DE 24HS. .................. 112

TABELA 15. EFEITOS ESTIMADOS PARA A ANÁLISE DA VARIÁVEL DE RESPOSTA CONVERSÃO NA RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-3 (APENAS

COM AS VARIÁVEIS QUE APRESENTARAM EFEITO SIGNIFICATIVO). .............................................................................. 113

TABELA 16. ANÁLISE DE VARIÂNCIA PARA DESENVOLVIMENTO EXPERIMENTAL DA RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-3.A ..................... 114

TABELA 17. RESULTADOS NA CONDIÇÃO ÓTIMA DE RAC-3 (45 °C, 4 MG/ML DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO E 222,8 U DE

ATIVIDADE ENZIMÁTICA) EM SISTEMA DE BATELADA UTILIZANDO ESCALA DE MG E UMA ESCALA MAIOR (100X). ................. 122

TABELA 18. RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-3 EM ACETATE DE ETILA COMO SOLVENTE DA REAÇÃO EM SISTEMA DE FLUXO CONTÍNUO.

................................................................................................................................................................... 125

TABELA 19. RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-3 EM TBME COMO SOLVENTE DA REAÇÃO EM SISTEMA DE FLUXO CONTÍNUO. ............. 127

TABELA 20. RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-3/ACETATO DE VINILA (1:10) EM TBME CATALISADO PELA NOVOZYM 435 A 50OC EM

CONDIÇÕES DE FLUXO CONTÍNUO (TEMPO DE RESIDÊNCIA DE 3MIN) USANDO DIFERENTES AGENTES ACILANTES. ................. 129

TABELA 21. VALORES DE ATIVIDADE HIDROLÍTICA E PARÂMETROS DE IMOBILIZAÇÃO DE LIPB SOBRE DIFERENTES SUPORTES

POLIMÉRICOS. ................................................................................................................................................ 132

TABELA 22. ATIVIDADE DE ESTERIFICAÇÃO DA LIPB IMOBILIZADA SOBRE DIFERENTES SUPORTES POLIMÉRICOS. ........................... 135

TABELA 23. VALORES DE ATIVIDADE HIDROLÍTICA E PARÂMETROS DE IMOBILIZAÇÃO DE CALB E LIPB EM ACCUREL MP 1000. ...... 137

TABELA 24. RESULTADOS DA RESOLUÇÃO ENANTIOSSELETIVA DE RAC-3 PARA AS DIFERENTES VERSÕES DA LIPASE B DE CANDIDA

ANTARCTICA. .................................................................................................................................................. 138

TABELA 25. RESULTADOS DA RESOLUÇÃO ENANTIOSSELETIVA DE RAC-4 PARA AS DIFERENTES VERSÕES DA LIPASE B DE CANDIDA

ANTARCTICA. .................................................................................................................................................. 139

INDICE DE FIGURAS

FIGURA 1. ESTEREOISÔMEROS DO INOSITOL (REPRODUZIDO DE ALMEIDA ET AL., 2003). ....................................................... 10

FIGURA 2. PLANO DE SIMETRIA DO MIO-INOSITOL ILUSTRANDO COMO AS NOMENCLATURAS SÃO FEITAS PARA ESTA MOLÉCULA

(REPRODUZIDO DE POTTER E LAMPE, 1995). ..................................................................................................... 11

FIGURA 3. MECANISMO DE TRANSDUÇÃO CELULAR (REPRODUZIDO POR ALMEIDA ET AL., 2003). ........................................... 12

FIGURA 4. CASCATA DOS FOSFOINOSITÍDEOS (REPRODUZIDO POR ALMEIDA ET AL., 2003). .................................................... 14

FIGURA 5. O MIO-INOSITOL E SEU ANÁLOGO BIOATIVO 6FINS ............................................................................................. 16

FIGURA 6. MÉTODOS PARA OBTENÇÃO DE COMPOSTOS ENANTIOMERICAMENTE PUROS (REPRODUZIDO DE GHANEM ET AL., 2004).

..................................................................................................................................................................... 18

FIGURA 7. OS DOIS TIPOS DE CONVERSÃO ASSIMÉTRICA: A) QUANDO OCORRE EM ESTRUTURAS PROQUIRAL COM DUPLA LIGAÇÃO; B)

DISTINÇÃO ENTRE ÁTOMOS OU GRUPOS ENANTIOTÓPICOS. ....................................................................................... 18

FIGURA 8. RESOLUÇÃO CINÉTICA DINÂMICA DE Α-HIDROXI-ÉSTERES. SUPONDO QUE A CONVERSÃO DO ISÔMERO-R SEJA O MAIS

RÁPIDO, A REAÇÃO FICARÁ MAS LENTA PARA O OUTRO ISÔMERO (S). (MODIFICADO DE GHANEM ET AL., 2004). ............. 19

FIGURA 9. ESQUEMA CONSIDERADO PARA SISTEMAS DO TIPO MICHAELIANO, ASSUMINDO QUE A REAÇÃO É IRREVERSÍVEL E QUE OS

PRODUTOS GERADOS NÃO INTERFEREM NA REAÇÃO. ................................................................................................ 22

FIGURA 10. EFEITO DA ENANTIOSSELETIVIDADE ENZIMÁTICA DEMONSTRADA COMO A RELAÇÃO ENTRE A RAZÃO ENANTIOMÉRICA (E) E

O EXCESSO ENANTIOMÉRICO DO PRODUTO (EEP) (REPRODUZIDO POR STRAATHOF E JONGEJAN, 1997). ............................. 24

FIGURA 11. REAÇÃO DE HIDRÓLISE CATALISADA POR LIPASES. UM TRIACILGLICEROL PODE SER HIDROLISADO PARA FORMAR GLICEROL E

ÁCIDOS GRAXOS OU, NA DIREÇÃO REVERSA, EM AMBIENTES COM BAIXO TEOR DE ÁGUA, PODE SER FORMADO O ÉSTER (REAÇÃO

DE SÍNTESE). .................................................................................................................................................... 26

FIGURA 12. REAÇÕES CATALISADAS POR LIPASE. ............................................................................................................... 28

FIGURA 13. MODELO ESTRUTURAL DE Α/Β HIDROLASES. OXIÂNION: RESÍDUOS QUE ESTABILIZAM O OXIÂNION, NU: RESÍDUO

NUCLEOFILICO QUE É A SERINA PARA LIPASES, PROTEASES E ESTERASES. Α -HÉLICES ESTÃO REPRESENTADAS POR RETÂNGULOS, Β-

HÉLICES POR SETAS. (REPRODUZIDO DE BORNSCHEUER E KAZLAUSKAS, 2006B). ................................................... 31

FIGURA 14. MODELO PROPOSTO PARA OS SÍTIOS DE LIGAÇÃO DO SUBSTRATO À TRÊS LIPASES SINTETICAMENTE ÚTEIS. O RESÍDUO

CATALÍTICO SER ENCONTRA-SE NA PARTE INFERIOR DA CAVIDADE COM A SUA CATALÍTICA HIS À ESQUERDA. EMBORA OS

DETALHES DA CAVIDADE SE DIFEREM PARA CADA LIPASE, CADA CAVIDADE CONTÉM UMA GRANDE BOLSA HIDROFÓBICA

(CINZENTO CLARO) E UM MENOR BOLSO (CINZA MÉDIO), CONHECIDOS COMO "BOLSOS ESTEREOSELETIVOS”. AS REGIÕES QUE SE

LIGAM AO GRUPAMENTO ACILA DO ÉSTER DIFERE SIGNIFICATIVAMENTE ENTRE AS TRÊS ESTRUTURAS. PARA CRL, O

GRUPAMENTO ACILA LIGA-SE NUM TÚNEL (REPRESENTADO POR CINZA ESCURO ONDE ESTÁ ESCRITO TUNNEL MOUTH). NA CALB

E PCL, O GRUPAMENTO SE LIGA NO ENORME BOLSO HIDROFÓBICO DA CAVIDADE (REPRODUZIDO DE BORNSCHEUER E

KASLAUSKAS, 2006B). ................................................................................................................................... 32

FIGURA 15. CONFORMAÇÕES TAMPA FECHADA (AZUL) E TAMPA ABERTA (AMARELO) EM VÁRIAS LIPASES. REPRODUZIDO DE ALOULOU

ET AL., (2006). ................................................................................................................................................ 34

FIGURA 16. ESQUEMA ILUSTRANDO O FUNCIONAMENTO DA CATAPULTA ELETROSTÁTICA. O SÍTIO ATIVO COM POTENCIAL NEGATIVO

FORÇA, ATRAVÉS DE REPULSÃO ELETROSTÁTICA, A SAÍDA DO ÁCIDO CARBOXÍLICO FORMADO, QUE TAMBÉM POSSUI CARGA

NEGATIVA. MODIFICADO DE PETERSEN ET AL., (2001) POR ALMEIDA, (2005). ............................................................ 35

FIGURA 17 – MECANISMO CINÉTICO (PING PONG BI BI) DE REAÇÕES COM MÚLTIPLOS PRODUTOS E SUBSTRATOS CATALISADAS POR

LIPASES (E: ENZIMA; ES: ÉSTER; AL: ÁLCOOL; AC: ÁCIDO; W: ÁGUA; I = 1,2,...,I; J=1,2,...,J) (REPRODUZIDO DE PAIVA,

BALCÃO E MALCATA, 2000). ......................................................................................................................... 37

FIGURA 18. ESQUEMA DA REAÇÃO DE HIDRÓLISE DE LIGAÇÕES ÉSTER CATALISADA POR ESTERASES E LIPASES. ONDE TD1 E TD2

REPRESENTAM O PRIMEIRO E O SEGUNDO INTERMEDIÁRIOS TETRAÉDRICOS. (MODIFICADO A PARTIR DE BORNSCHEUER E

KAZSLAUSKAS, 2006B E SIMAS ET AL., 2011). ................................................................................................. 38

FIGURA 19. MERCADO MUNDIAL DE TECNOLOGIA QUIRAL POR SEGMENTOS: SÍNTESE QUIRAL, ANÁLISE QUIRAL E RESOLUÇÃO QUIRAL

(REPRODUZIDO DE DEWAN, 2012). ................................................................................................................... 43

FIGURA 20. REAÇÃO ENANTIOSSELETIVA DE (±)-9 CATALISADA PELA LIPASE DE PSEUDOMONAS FLUORESCENS, UTILIZANDO ACETATO DE

VINILA COMO AGENTE ACILANTE EM 75H A TEMPERATURA AMBIENTE (MODIFICADO DE EVANS ET AL., 1992). ................. 45

FIGURA 21. RESOLUÇÃO CINÉTICA DE (±)-2,3,4,9-TETRAHIDRO-1H-CARBAZOL-3-OL CATALISADO POR CALB UTILIZANDO ACETATO DE

VINILA EM THF A 250RPM (REPRODUZIDO POR BUSTO ET AL., 2012). ..................................................................... 45

FIGURA 22. RESOLUÇÃO RACÊMICA DE (1) CATALISADO POR CALB APÓS 120H DE REAÇÃO (REPRODUZIDO DE PARKER ET AL.,

2012). ........................................................................................................................................................... 46

FIGURA 23. SÍNTESE DE (R)-1 E APERFEIÇOAMENTO DA ENANTIOSSELETIVIDADE UTILIZANDO LIPASE DE PSEUDOMONAS CEPACIA

(MODIFICADO POR KAWANO ET AL., 2012). ....................................................................................................... 47

FIGURA 24. ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DA LIPASE B DE CANDIDA ANTARCTICA (CALB) EM SUA FORMA ABERTA (A) E FECHADA (B).

REGIÃO DA TAMPA HIDROFÓBICA (EM AZUL) REPRESENTA OS DOBRAMENTOS DA HÉLICE (Α5, COMPARTIMENTO SUPERIOR EM

(A) E Α10, COMPARTIMENTO INFERIOR EM (A) ). (REPRODUZIDO POR GANJALIKHANY ET AL., 2012). .......................... 48

FIGURA 25. MÉTODOS GERAIS DE IMOBILIZAÇÃO DE BIOCATALISADOR: 1-ADSORÇÃO FÍSICA; 2-LIGAÇÃO COVALENTE: A- DERIVADOS

MONOMÉRICOS MULTIPONTUAIS, B- DERIVADO MONOMÉRICO UNIPONTUAL, C- DERIVADO BIMOLECULAR MULTIPONTUAL (O

CÍRCULO PREENCHIDO DE AMARELO REPRESENTA O SÍTIO ATIVO); 3-CROSS-LINKING; 4- ENTRELAÇAMENTO EM MATRIX

POLIMÉRICA; 5- ENCAPSULAMENTO EM GEL; 6- LIGAÇÃO METÁLICA, 7-LIGAÇÃO POR PONTES DISSULFETO, 8-9: REATOR DE

MEMBRANA- 8- ENZIMA IMOBILIZADA NA CAMADA EXTERNA DA MEMBRANA (ITEM 8-MODIFICADO A PARTIR DE LAU ET AL.

2010); 9- MEMBRANA CONTÉM BIOCATALISADORES IMOBILIZADOS EM SEU INTERIOR (ITEM 9-MODIFICADO A PARTIR DE

NAGY, 2012). ................................................................................................................................................ 58

FIGURA 26. HIPERATIVAÇÃO DE LIPASES SOBRE SUPERFÍCIES ALTAMENTE HIDROFÓBICAS (MODIFICADO DE PALOMO ET AL., 2002).

..................................................................................................................................................................... 61

FIGURA 27. ENANTIOMERO RÁPIDO (A) E ENANTIOMERO LENTO (B)- MODELO DE SÍTIO ATIVO POR LIPASES (REPRODUZIDO DE

KAZLAUSKAS ET AL., 1991). ............................................................................................................................ 64

FIGURA 28. RESOLUÇÃO CINÉTICA DE AMINAS RACÊMICAS RAC -1A-C POR ACETILAÇÃO DO ACETATO DE ETILA CATALISADO POR CALB

SOB VARIADOS MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃO (MODIFICADO DE BOROS ET AL., 2013). .................................................. 66

FIGURA 29. RESOLUÇÃO CINÉTICA GLOBAL E PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DO ENANTIÔMERO S EM SISTEMA DE FLUXO CONTÍNUO

(MODIFICADO DE TAMBORINI ET AL., 2012). ..................................................................................................... 67

FIGURA 30. EXEMPLOS DE AGENTES ACILANTES PARA ACILAÇÕES IRREVERSÍVEIS A PARTIR DE ÁLCOOIS (A-B-D:REPRODUZIDO DE

BORNSCHEUER E KAZLAUSKAS, 2006B; C- REPRODUZIDO DE SIMON ET AL., 2012). ........................................... 69

FIGURA 31. SÍNTESE DE OLIGOSSACARÍDEOS ARTIFICIAIS UTILIZANDO A LIPASE PS-30 E ACETATO DE VINILA DURANTE 11H DE TEMPO

REACIONAL (MODIFICADO DE BERKOWITZ ET AL., [1994] POR BORNSCHEUER E KAZLAUSKAS, 2006B). ................ 69

FIGURA 32. EFEITO DA ATIVIDADE DE ÁGUA NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE LIPASES DE ORIGENS DIVERSAS: RHIZOPUS ARRHIZUS ( )

; CANDIDA RUGOSA ( ); PSEUDOMONAS SP. ( ) (REPRODUZIDO DE WEHTJE E ADLERCREUTZ, 1997). ............... 75

FIGURA 33. DERIVADOS DE MIO-INOSITOL UTILIZADOS NA RESOLUÇÃO CINÉTICA POR LIPASES. ................................................... 77

FIGURA 34. SÍNTESE DE POTENCIAIS SUBSTRATOS PARA LIPASES ........................................................................................... 78

FIGURA 35- MICROGRAFIA ÓPTICA E MICROGRAFIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DOS SUPORTES PMMA-CO-DVB/ PMMA-CO-DVB

25% E PS-CO-DVB/PS-CO-DVB 25%. (REPRODUZIDO DE BESTETI ET AL., 2011). .................................................... 80

FIGURA 36. FOTO DA APARELHAGEM UTILIZADA NO SISTEMA OPERACIONAL EMPREGADO NAS REAÇÕES DE ACETILAÇÃO DOS DERIVADOS

RACÊMICOS. ..................................................................................................................................................... 81

FIGURA 37. REATOR ASIA SYSTEM, SISTEMA EM FLUXO CONTÍNUO DA EMPRESA SYRRIS MOSTRANDO A COLUNA UTILIZADA PARA AS

REAÇÕES: A) DETALHE DA BOMBA DO EQUIPAMENTO; B) COLUNA TERMOESTATIZADA. .................................................. 83

FIGURA 38. COLUNA DE LEITO FIXO UTILIZADA NO SISTEMA DE FLUXO CONTÍNUO ADQUIRIDO PELA EMPRESA SYRRIS, ONDE A) DETALHE

DO LÚMEN DA COLUNA ONDE O BIOCATALISADOR É COLOCADO; B) SETAS REPRESENTANDO A ALTURA QUE O BIOCATALISADOR

PREENCHE A COLUNA, EM CENTÍMETROS (CM), PARA CÁLCULO DO VOLUME DA COLUNA. ................................................ 84

FIGURA 39. CROMATOGRAMA REFERENTE AO PADRÃO DO SUBSTRATO (RAC-3) POR CLAE EM FASE REVERSA COM TR DE 8,178MIN

(REPRODUZIDO DE MANOEL, 2011). ................................................................................................................. 87

FIGURA 40 CROMATOGRAMA REFERENTE A MISTURA DO PADRÃO RACÊMICO (RAC-3) DO PRODUTO ANALISADOS POR CLAE EM FASE

REVERSA. O TR DE 12,456MIN É REFERENTE AO PRIMEIRO MONOACETILADO, O TR =13,296MIN É REFERENTE AO SEGUNDO. O

TR =21,797MIN É REFERENTE AO DIACETILADO E O TR = 38,745MIN AO TRIACETILADO. O TR DE 8,325MIN É REFERENTE AO

SUBSTRATO (REPRODUZIDO DE MANOEL, 2011). ................................................................................................. 88

FIGURA 41. CURVA DE CALIBRAÇÃO CALCULADA A PARTIR DA CURVA PADRÃO PARA O RAC-3 (REPRODUZIDO DE MANOEL, 2011). 88

FIGURA 42. CURVA DE CALIBRAÇÃO CALCULADA A PARTIR DA CURVA PADRÃO PARA O RAC-4 (REPRODUZIDO DE MANOEL, 2011)..

..................................................................................................................................................................... 89

FIGURA 43. CROMATOGRAMA EM SISTEMA DE FASE REVERSA (SHIMADZU C-18) DO PADRÃO DIOL. ........................................... 89

FIGURA 44. CROMATOGRAMA EM SISTEMA DE FASE REVERSA (SHIMADZU C-18) DA MISTURA SINTÉTICA DOS PADRÕES: DIOL; OS DOIS

POSSÍVEIS MONOÉSTERES E O DIÉSTER, VISUALIZADOS DA ESQUERDA PARA A DIREITA (MODIFICADO DE CUNHA 2011). ...... 90

FIGURA 45 – CROMATOGRAMA EM SISTEMA QUIRAL (CHIRACEL OD-H) DO PADRÃO DO PRODUTO (D)-ISÔMERO E (L)-ISÔMERO DO

(±)- 1,3,4-TRI-O-BENZIL-MIO-INOSITOL (RAC-3). REPRODUZIDO DE MANOEL, 2011. ................................................... 91

FIGURA 46. CROMATOGRAMA EM SISTEMA DE QUIRAL (CHIRACEL-OD-H) DO (D)-ISÔMERO E (L)-ISÔMERO DO RAC-4.

(REPRODUZIDO DE CUNHA, 2011). .................................................................................................................... 92

FIGURA 47- DERIVADOS DE MIO-INOSITOL UTILIZADOS NA RESOLUÇÃO CINÉTICA POR LIPASES. ................................................ 100

FIGURA 48. RESOLUÇÃO CINÉTICA ENZIMÁTICA DO RACEMATO RAC-3 CATALISADA POR DIFERENTES LIPASES HOME-MADE EM ACETATO

DE VINILA. ..................................................................................................................................................... 102

FIGURA 49. RESOLUÇÃO CINÉTICA ENZIMÁTICA DO RACEMATO RAC-4 CATALISADA POR DIFERENTES LIPASES HOME-MADE EM ACETATO

DE VINILA. ..................................................................................................................................................... 103

FIGURA 50. CROMATOGRAMA EM SISTEMA DE CLAE EM FASE REVERSA (SHIMADZU C-18) DA REAÇÃO DE ACETILAÇÃO DO RAC-3

CATALISADO PELA LIPB EM SUA FORMA LIOFILIZADA EM ACETATO DE VINILA APÓS 24 HORAS DE REAÇÃO. OS PICOS NOS

TEMPOS DE 8,102 E 12,04 SÃO SUBSTRATO E PRODUTO FORMADO, RESPECTIVAMENTE............................................... 105

FIGURA 51. CROMATOGRAMA EM SISTEMA DE CLAE EM FASE REVERSA (SHIMADZU C-18) DA REAÇÃO DE ACETILAÇÃO DO RAC-4

CATALISADO PELA LIPB EM SUA FORMA LIOFILIZADA EM ACETATO DE VINILA APÓS 24 HORAS DE REAÇÃO. OS PICOS NOS

TEMPOS DE 9,323 E 15,425 SÃO SUBSTRATO E PRODUTO FORMADO, RESPECTIVAMENTE............................................. 105

FIGURA 52. GRÁFICO DE PARETO APÓS O PLANEJAMENTO FATORIAL FRACIONÁRIO MOSTRANDO AS VARIÁVEIS SIGNIFICATIVAS PARA A

VARIÁVEL CONVERSÃO (X%), APÓS O TRACEJADO VERMELHO (* P-LEVEL < 0,1). ......................................................... 108

FIGURA 53. GRÁFICO DA PROBABILIDADE NORMAL DOS RESÍDUOS GERADO APÓS O DCCR DA ANÁLISE DA RESOLUÇÃO CINÉTICA DE

RAC-3. .......................................................................................................................................................... 115

FIGURA 54. GRÁFICO DA HOMOGENEIDADE DA VARIÂNCIA-VALORES OBSERVADOS X RESÍDUOS GERADO APÓS O DCCR DA ANÁLISE DA

RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-3. ........................................................................................................................ 115

FIGURA 55. GRÁFICO DE SHAPIRO E KOMOGOROV COM P= 0,9844 E P>0,20, RESPECTIVAMENTE. ......................................... 116

FIGURA 56. SUPERFÍCIE DE RESPOSTA (ESQUERDA) E GRÁFICO DE CONTORNO (DIREITA) NA INTERAÇÃO ENTRE AS VARIÁVEIS

TEMPERATURA E ATIVIDADE ENZIMÁTICA PARA A VARIÁVEL DE RESPOSTA CONVERSÃO (X%). O VALOR DA CONCENTRAÇÃO DO

SUBSTRATO FOI FIXADA EM 4MG/ML. ................................................................................................................. 117

FIGURA 57. SUPERFÍCIE DE RESPOSTA (ESQUERDA) E GRÁFICO DE CONTORNO (DIREITA) NA INTERAÇÃO ENTRE AS VARIÁVEIS

CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO E ATIVIDADE ENZIMÁTICA, PARA A VARIÁVEL DE RESPOSTA CONVERSÃO (X%). O VALOR DA

TEMPERATURA FOI FIXADA EM 40º C. ................................................................................................................. 118

FIGURA 58. CROMATOGRAMA DA REAÇÃO DE ACETILAÇÃO DO RAC-3 COM A NOVOZYM 435 EM ACETATO DE VINILA E HEXANO. ... 119

FIGURA 59. CROMATOGRAMA DO PRODUTO L-(-)-2 OBTIDO NA REAÇÃO DE ACETILAÇÃO DO RAC-3 COM A NOVOZYM 435 EM

HEXANO. ....................................................................................................................................................... 119

FIGURA 60. CURVA DE PROGRESSO DA RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-3 EM HEXANO CATALISADA PELA NOVOZYM 435 NAS CONDIÇÕES

ÓTIMAS ENCONTRADAS NO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL: 45 °C, 4 MG/ML DE SUBSTRATO E 222,8U DE ATIVIDADE

ENZIMÁTICA. .................................................................................................................................................. 119

FIGURA 61. GRÁFICO DE CONTORNO PARA A VARIÁVEL DE RESPOSTA CONVERSÃO (X%) USANDO 220U DA LIPASE NOVOZYM 435.

VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO FORAM FIXADAS (A) 4 MG/ML, (B) 8,5 MG/ML, AND (C) 14 MG/ML. .......... 120

FIGURA 62. PRODUTIVIDADE E EVOLUÇÃO DA CONVERSÃO NA RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-3 NAS CONDIÇÕES ÓTIMAS NÃO

OTIMIZADAS (MANOEL, 2011) E NAS CONDIÇÕES OTIMIZADAS (45 °C, 4 MG/ML DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO E 222,8

U DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA). .......................................................................................................................... 121

FIGURA 63. ESTABILIDADE OPERACIONAL NA RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-3 POR NOVOZYM 435 SOB AS CONDIÇÕES CONCEBIDAS

PARA: 4 MG / ML DE SUBSTRATO, 222,8 U DE ENZIMA, A 45 ° C DE TEMPERATURA EM SISTEMA DE BATELADA. ............... 123

FIGURA 64. RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-3 UTILIZANDO A LIPASE NOVOZYM 435: (A) SISTEMA EM BATELADA (B) SISTEMA DE FLUXO

CONTÍNUO EM LEITO FIXO. ................................................................................................................................ 124

FIGURA 65. RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-3 UTILIZANDO A LIPASE NOVOZYM 435, ACETATO DE VINILA COMO AGENTE ACILANTE E

ACETATO DE ETILA COMO SOLVENTE. ................................................................................................................... 125

FIGURA 66. RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-3 UTILIZANDO A LIPASE NOVOZYM 435, ACETATO DE VINILA COMO AGENTE ACILANTE

ACETATO DE ETILA COMO SOLVENTE. ................................................................................................................... 126

FIGURA 67. INTEGRIDADE DO REACTOR DE LEITO FIXO DEPOIS DE NOVE CICLOS NA RESOLUÇÃO CINÉTICA DE RAC-3 UTILIZANDO A

NOVOZYM 435 COMO BIOCATALISADOR, NAS MELHORES CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS: TBME COMO SOLVENTE, ACETATO DE

VINILA, COMO DOADOR DE ACILA (PROPORÇÃO 1:10), A 50◦C. TEMPO DE RESIDÊNCIA: 3MIN. ...................................... 130

FIGURA 68. CINÉTICA DE IMOBILIZAÇÃO DA LIPB SOBRE OS SUPORTES ACCUREL MP 1000, PS-CO-DVB/PS-CO-DVB 25%, PMMA-

CO-DVB/PMMA-CO-DVB 25%. ATIVIDADE INICIAL DE 350U. ............................................................................. 134

FIGURA 69. CURVA DE ESTABILIDADE DA LIPB IMOBILIZADA SOBRE OS SUPORTES ACCUREL MP 1000, PS-CO-DVB/PS-CO-DVB

25% E PMMA-CO-DVB/ PMMA-CO-DVB 25%, ESTOCADA A 4 ºC. ..................................................................... 136

FIGURA 70. RESOLUÇÃO ENANTIOSSELTICA DE RAC-3 CATALISADA POR CALB COMERCIAL E LIPB (HOME-MADE) IMOBILIZADAS EM

DIFERENTES SUPORTES. .................................................................................................................................... 137

FIGURA 71. RESOLUÇÃO ENANTIOSSELTICA DE RAC-4 CATALISADA POR CALB COMERCIAL E LIPB (HOME-MADE) IMOBILIZADAS EM

DIFERENTES SUPORTES. .................................................................................................................................... 139

ÍNDICE DE ABREVIAÇÕES

CALB – lipase comercial fração B de Candida antarctica

LIPB- lipase B de Candida antarctica expressa em Pichia pastoris

E - razão enantiomérica.

eep - excesso enantiomérico do produto.

ees - excesso enantiomérico do substrato.

p-NFL – p-nitro fenil laurato.

rac-1 - 1,4,5,6-tetra-O-benzil-mio-inositol

rac-2 - 1,4,5,6-tetra-O-alil-mio-inositol

rac-3 - 1,3,4-tri-O-benzil-mio-inositol

rac-4 - (±)-3,6-O-dibenzil-1,2-O-isopropilideno-mio-inositol

Ins – Nomenclatura utilizada para identificação do mio-inositol de configuração D.

Px- Números de fosforilações presentes na estrutura do mio-inositol

g- grama

3

Capítulo I – INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO

O desenvolvimento de processos para a fabricação de compostos ativos e/ou

intermediários farmacêuticos muitas vezes envolve sínteses químicas complexas que podem

resultar em problemas, como a instabilidade da molécula nas condições de reação e/ou

formação de misturas racêmicas, quando a molécula de interesse é um dos enantiômeros. O

emprego de enzimas em etapas intermediárias da síntese de substâncias bioativas tem sido

utilizado para contornar estes problemas (JAEGER e REETZ, 1998; SCHULZE e

WUBBOLTZ, 1999; BEVILÁQUA et al., 2005).

Com a intensificação das ações dos órgãos de vigilância sobre as substâncias

racêmicas bioativas, principalmente as rigorosas inspeções praticadas pelo FDA ("Food and

Drug Administration") a partir de 1992, a maioria das companhias farmacêuticas foi obrigada

a desenvolver enantiômeros na sua forma estereoisomericamente pura (FABER e

FRANSSEN, 1993). O mercado de enantiômeros puros ocupa mais de dois terços do total e

vem crescendo em uma média anual de aproximadamente 7%, enquanto as substâncias

racêmicas vêm perdendo mercado numa média de 30% ao ano.

Durante os últimos anos, grandes esforços têm sido feitos para estabelecer rotas

enzimáticas na preparação de compostos enantiomericamente puros devido à sua importância

nas indústrias alimentícia, agrícola e principalmente, para a indústria farmacêutica. A maioria

das substâncias biologicamente ativas (fármacos, herbicidas, fungicidas, inseticidas,

aromatizantes e fragrâncias) são moléculas quirais (ZWINGENBERGER e WENDT, 1996;

NAIK et al., 2010). Em geral, apenas um dos enantiômeros possui a atividade biológica

desejada. O antípoda ótico pode não apresentar atividade alguma ou mesmo produzir efeitos

indesejáveis. O caso de maior repercussão foi o da talidomida, substância amplamente

receitada nos anos 60 contra os enjôos em gestantes e que causou o nascimento de milhares de

bebês com deformações congênitas. Posteriormente, descobriu-se que o efeito teratogênico da

talidomida era proveniente do emprego do enantiômero de configuração absoluta (S),

enquanto seu antípoda era desprovido de ação teratogênica em humanos

(ZWINGENBERGER e WENDT, 1997; LIMA, 2001).

A síntese de moléculas biologicamente ativas se tornou um desafio maior para o

mercado farmacêutico devido ao aumento da exigência de segurança e qualidade nos

produtos, a procura por processos industriais ambientalmente corretos e também devido a

enorme demanda por estes compostos obtidos em estratégias economicamente atrativas

(NESTL, NEBEL e HAUER, 2011; SOLANO, et al., 2012). Em 2002, por exemplo, a venda

4


de um determinado isômero em sua forma pura atingiu cerca de U$159 bilhões (ROUHI,

2003; GARCIA-URDIALES et al., 2011).

Dentre os muitos substratos que carecem de resolução quiral, encontra-se o mio-

inositol, um ciclocitol aquiral. A literatura mostra o interesse considerável na síntese de

derivados de mio-inositol (POTTER e LAMPE, 1995; ALMEIDA et al., 2003). Um dos

obstáculos para trabalhos de síntese orgânica e química medicinal relacionados aos inositóis é

a dificuldade de síntese destas substâncias (POTTER e LAMPE, 1995). Devido à sua

disponibilidade, boa parte dos estudos realizados nesta área fez uso do próprio mio-inositol

para a construção de derivados quirais desta substância. As rotas baseadas no uso do mio-

inositol têm como vantagem o uso de reações simples e disponibilidade de protocolos

estabelecidos. Entretanto, existe a necessidade de resolução óptica dos intermediários

racêmicos sintetizados quimicamente (POTTER e LAMPE, 1995; SURESHAN et al.,

2003a,b).

Lipases têm sido utilizadas com sucesso em reações que incluem resolução cinética de

álcoois racêmicos, ácidos, ésteres ou aminas, assim como dessimetrização de compostos pro-

quirais (ADER et al., 1992; CHEN e FANG, 1997; BERNSMANN et al., 2000; GOTOR-

FERNANDEZ, BUSTO e GOTOR, 2006; NAIK et al., 2010). Estes biocatalisadores

constituem uma classe de enzimas de grande interesse na pesquisa da biocatálise aplicada à

química orgânica devido às suas propriedades de especificidade e seletividade química,

posicional e estérica. A boa estabilidade das lipases na presença de solventes orgânicos

propicia sua utilização em etapas intermediárias de processos químicos convencionais e na

catálise de reações químicas envolvendo substratos insolúveis em meio aquoso (GOTOR et

al., 2006).

A variedade de sistemas reacionais e enzimas disponíveis para biocatálise e

biotransformações aumentou quase exponencialmente nos últimos 10 anos. Novas estratégias

como evolução dirigida, mutagênese (WATSON, 2012), engenharia metabólica, engenharia

genética, imobilização de enzimas etc. estão em desenvolvimento principalmente para tornar

o biocatalisador mais enantiosseletivo e a tecnologia mais econômica (MAGNUSSON et al.,

2005a; MAGNUSSON et al., 2005b; MARTON et al., 2010; BARBOSA et al., 2011; DÍAZ-

RODRÍGUEZ e DAVIS, 2011; BRUSTAD e ARNOLD, 2011; BOMMARIUS, BLUM e

ABRAHAMSON, 2011). Além destas estratégias, o estudo da variação de doadores de acila e

de solvente em reações de transesterificação também são empregados na otimização de

reações mostrando bons resultados na literatura (REETZ et al., 2002; LIU et al., 2009),

principalmente por serem técnicas que apresentam menor custo, maior flexibilidade e

5


facilidade na execução. Outras tecnologias vem sendo destacadas em biocatálise como a

irradiação de micro-ondas e estratégias que visam a eliminação parcial ou total de solventes

tóxicos ao ser humano e ao meio ambiente, por meio dos solventes não clássicos, como o uso

dos líquidos iônicos e fluidos supercríticos, em diferentes processos reacionais (LAU et al.,

2000; BERGLUND, 2001; TURNER, 2003; BORNSCHEUER e KZLAUSKAS, 2006a;

JAIN et al., 2005; ZHAO et al., 2009, 2010).

Dentro desta abordagem, o emprego de lipases em etapas intermediárias da síntese de

derivados de mio-inositol pode ser considerado uma alternativa atrativa para a obtenção de

derivados enantiomericamente puros ou enriquecidos.

1.1 JUSTIFICATIVA

O interesse na obtenção de derivados de mio-inositois enantiomericamente puros se

justifica pela sua grande versatilidade em síntese química, principalmente na síntese de

substancias bioativas e desempenhando papéis importantes como segundo mensageiro em

sistemas de contração muscular, metabolismo, secreção, entre outros (ALMEIDA et al.,

2003).

Estudos preliminares demonstraram a necessidade de uma maior pesquisa na área uma

vez que os inositóis polifosforilados são biologicamente importantes, mas poucos disponíveis

na natureza. Os conhecimentos sobre o sistema de fosfoinositídeos continuam a progredir

rapidamente; entretanto, muitos fatores ainda permanecem obscuros, como por exemplo, a

importância fisiológica da transformação do Ins(1,4,5)P3 (mio-inositol-1,4,5-trifosfato) em

diversos compostos fosforilados e a função destes metabólitos intermediários. Poucos

análogos dos inositóis polifosforilados sintetizados têm apresentado efeito significativo na

cascata dos fosfoinositídeos. Portanto, a síntese destes compostos é de fundamental

importância para que se possa conhecer melhor a cascata dos fosfoinositídeos e, talvez,

possibilitar a descoberta de algum composto com propriedades farmacológicas a partir destes

conhecimentos.

O mio-inositol é um componente essencial para o crescimento do agente etiológico da

doença de chagas, o Tripanossoma cruzi, participando da formação de lipídeos complexos

derivados do fosfatidil-inositol. O 1-D-6-desóxi-6-flúor-mio-inositol (Figura 5, pag. 10), um

análogo fluoretado de mio-inositol, é um forte inibidor da síntese de mio-inositol e,

conseqüentemente, inibe o crescimento do T. cruzi. Além disso, esta substância é altamente

6


seletiva contra o parasita, não interferindo sobre o crescimento de células de mamíferos

(EINICKER-LAMAS et al., 1999; OLIVEIRA et al., 2000).

Um dos racematos selecionados para a tese, (±)-1,3,4-tri- O-benzil-mio-inositol (rac-

3), é um substrato intermediário da síntese de D-2,4,5 tri-O-benzil-mio-inositol, uma estrutura

análoga ao D-1,4,5 tri-benzil-mio-inositol. Este composto é bem conhecido e descrito na

literatura por desempenhar um papel fundamental na mobilização de cálcio intracelular.

Como muitas células de mamíferos possuem receptores para D-1,4,5 tri-benzil-mio-inositol, o

estudo destes compostos, derivados de mio-inositol, são de extrema importância para um

melhor entendimento dos processos de sinalização celular (DESAI et al., 1994; MILLS e

POTTER, 2002).

Nos últimos anos, inúmeros artigos podem ser encontrados na literatura envolvendo a

síntese e/ou os estudos biológicos, bioquímicos, farmacológicos e imunológicos. dos inositóis

fosfatos, evidenciando que a pesquisa científica nesta área continua sendo promissora e de

grande relevância. Cunha et al., (2010) e Simas et al., (2011) testaram novos derivados de

mio-inositol utilizados pela primeira vez na resolução cinética catalisadas por lipases.

Recentemente, outros trabalhos de seleção de lipases, modelagem molecular e cinética de

resolução com derivados de mio-inositol foram publicados por nosso grupo de pesquisa e

relatam a obtenção bem sucedida de enantiômeros puros (CUNHA et al., 2011; MANOEL,

2011; MANOEL et al., 2012a; CUNHA et al., 2012). Entretanto ainda persiste a necessidade

do emprego de outros derivados como materiais de partida em resoluções cinéticas, os quais

precisam ser explorados para um maior compreensão do estudo em resolução de mio-

inositóis.

Dentro deste contexto, pretendeu-se dar continuidade ao conhecimento da resolução

cinética de diferentes racematos derivados de mio-inositol produzidos previamente por síntese

química, utilizando-os como substratos. Portanto, o trabalho aqui apresentado vem contribuir

principalmente para os estudos da biocatálise, no que diz respeito ao aumento da

enantiosseletividade de produtos de interesse farmacêutico a partir do estudo de fatores que

podem influenciar o processo reacional. Fatores como aqueles relacionados com o substrato

(tipo de grupo substituinte), com a enzima (liofilizada ou imobilizada) e condições reacionais

(tipo de solvente, agente acilante, temperatura e o uso de diferentes reatores). O efeito das

variáveis no processo foi determinado por meio de planejamentos experimentais, criando a

perspectiva de realização de um processo otimizado para futuro escalonamento.

No ponto de vista dos biocatalisadores, a literatura demonstra um grande potencial

biotecnológico para as lipases de Candida antarctica, Pyrococcus furiosus, Rhizomucor

7


miehei e de Yarrowia lipolytica (LARSEN et al., 2008, ROTTICCI-MULDER et al., 2001;

MARCHETTI, MIGUEL e ERRAZU, 2007; HA et al., 2007; RODRIGUEZ e

FERNANDEZ-LAFUENTE, 2010). Todavia, versões destas lipases produzidas pelos grupos

LaBiM/UFRJ, LaMMP/UFRJ e pelo BIOSE/UFRJ (via micro-organismos isolados ou de

forma heteróloga), têm se tornado promissoras. Estas são lipase de Candida antarctica

expressa em Pichia pastoris, Pyrococcus furiosus expressa em E.coli, Rhizomucor miehei e

lipase de Yarrowia lipolytica. Tais biocatalisadores são excelentes na síntese de inúmeras

moléculas com importâncias biotecnológicas distintas (Tabela 1), justificando o uso destes

neste trabalho.

Assim, nesta tese, investigou também a eficácia das lipases próprias (Tabela 1)

comparativamente às suas versões comerciais nas reações de hidrólise e esterificação de

derivados de mio-inositol.

O estudo ainda tem a finalidade de possibilitar o desenvolvimento de bioprodutos

nacionais em substituição aos atualmente importados e de elevado custo, viabilizando e

ampliando a utilização destes em diversos segmentos industriais.

8


Tabela 1. Lipases selecionadas produzidas pelo LaBiM/UFRJ e pelo BIOSE/UFRJ

Lipases Reação catalisada Aplicações

biotecnológicas Citação

LIPB-Lipase B de Candida

antarctica expressa em

Pichia pastoris

Hidrólise Biodiesel

Farmacêutica

GUTARRA et al., 2011.

CASTRO et al., 2009

(Pedido de Patente ao INPI:

PI0905122-8

Depositada 17/12/2009).

Lipase de Pyrococcus

furiosus expressa em E.coli ------------- -------------

BRANCO et al., 2010;

BRANCO, 2012.

Lipase de Rhizomucor

miehei (fermentado em

torta de babaçu)

------------- -------------

Ainda não há referencia.

Lipase vegetal de Jatropha

curcas L.

Acidólise e

hidrólise

Industria alimentícia e

produção de biodiesel

SOUZA, et al., 2009.

SOUZA, et al., 2010.

Lipase de Yarrowia

lypolitica

hidrólise de

triacilgliceróis,

esterificação,

transesterificação e

interesterificação

Produção de Biodiesel;

Biorremediação,

produção de

biossurfactante, na

indústria de alimentos;

detergentes; Cosméticos

e Oleoquímica; indústria

farmacêutica gerando

compostos com alta

pureza optica

MARTINS, 2012; FONTES,

2012; OSÓRIO et al., 2001;

ISO et al.,, 2001; GÜVENÇ

et al., 2002; AKIN et al.,

2003; UNDURRAGA et

al., 2001; OKAZAKI et

al.,1997; MARCHETTI et

al., 2007; HA et al., 2007;

SHARMA et al., 2001.

9

Capítulo II – OBJETIVOS

2. OBJETIVOS

Esta tese tem como foco principal o estudo de um novo biocatalisador com potencial

tecnológico na resolução cinética de derivados de mio-inositol. A pesquisa visa a obtenção de

produtos-alvo de relevância à indústria farmacêutica.

2.1- OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Selecionar biocatalisadores produzidos pelo nosso grupo de pesquisa (Home-made), a

fim de se encontrar aqueles capazes de catalisar a reação com substratos selecionados.

Selecionar biocatalisadores comerciais que sejam produzidos pelos mesmos micro-

organismos, daqueles produzidos pelo nosso grupo de pesquisa, através da otimização

das condições de reação, por meio de planejamento de experimentos, a fim de

posterior comparação com as lipases home-made.

Otimização das condições operacionais em reatores de batelada simples e em reatores

de coluna de Leito Fixo com o melhor par lipase imobilizada/substrato.

Obtenção de produtos-alvo de relevância industrial que será dada pela imobilização da

enzima selecionada sobre suportes comerciais Accurel MP1000 e sobre os suportes

produzidos pelo LMSCP (COPPE/UFRJ) - PS-DVB/PS-DVB e PMMA-

DVB/PMMA-DVB visando obter um biocatalisador eficiente e inédito, tanto do ponto

de vista da enzima quanto do suporte.

Aplicação do biocatalisador selecionado na resolução cinética dos

intermediários/substratos do 6FIns, buscando o melhor par enzima

imobilizada/substrato.

Verificar o potencial de reuso do biocatalisador em cada condição de reação em

pequena e grande escala (escala de g). Análise da perda da atividade esterásica (ou

atividade hidrolítica) ao longo das reações de reuso e/ ou perda de proteína que pode

ser dessorvida do suporte.

10

Capítulo II – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1- O MIO-INOSITOL

Inositóis são ciclitóis ou ciclo-hexanóis e, portanto, moléculas com esqueleto ciclo-

hexano, onde cada carbono encontra-se ligado a um grupo hidroxila. A orientação espacial

diferenciada das hidroxilas gera estereoisômeros, sendo nove os isômeros conhecidos. Os

isômeros mio-, neo-, D-quiro-, L-quiro- e scilo-inositol são de ocorrência natural, enquanto

cis-, epi-, allo- e muco-inositol são isômeros sintéticos não-naturais (Figura 1) (POTTER e

LAMPE, 1995; ALMEIDA et al., 2003).

Figura 1. Estereoisômeros do inositol (Reproduzido de ALMEIDA et al., 2003).

11


Dos estereoisômeros do inositol, o mio-inositol é o mais abundante na natureza, sendo

produzido a partir da glicose. A molécula pode ser encontrada na sua forma livre e

combinada, principalmente, como inositóis fosfato. O mio-inositol possui somente uma

hidroxila na posição axial em C2 e um plano de simetria passando por C2 e C5, sendo

considerado um composto meso (estereoisômero que tem um número igual de grupos

identicamente ligados, sendo aquiral).

A incorporação de um substituinte em C1 (enantiotópico para C3) e/ou C4

(enantiotópico para C6) levam a um par de enantiômeros (Figura 1). Logo apesar desta

configuração (meso), seus derivados normalmente apresentam atividade óptica. Em

contrapartida a incorporação de um substituinte em C2 ou C5 resulta em um composto

aquiral, logo opticamente inativo (retenção do plano de simetria) (POTTER e LAMPE, 1995).

Quanto às regras de nomenclatura, os seis carbonos do anel de mio-inositol são

numerados da seguinte forma: conta-se a partir da 5ª posição substituída vizinha ao átomo de

carbono ligado ao grupo hidroxila axial. Caso a numeração se dê no sentido anti-horário, o

enantiômero obtido é o D-mio-inositol (por exemplo, D-1,4-IP2) (Figura 2), sendo L-mio-

inositol (por exemplo, L-1,4-IP2) aquele obtido pela numeração no sentido horário (IUPAC-

IUB, 1975 e 1989). O símbolo Ins é utilizado para o mio-inositol com configuração D

(ALMEIDA et al, 2003). Caso seja de configuração L, esta deve ser previamente mencionada.

A terminação Px em itálico indica o número de fosforilações presentes no inositol.

Figura 2. Plano de simetria do mio-inositol ilustrando como as nomenclaturas são feitas para esta molécula

(Reproduzido de POTTER e LAMPE, 1995).

12


3.1.1 O papel do mio-inositol nas atividades biológicas

Os Inositóis apresentam participação na cascata dos fosfoinositídeos. O entendimento

desta cascata é indispensável a compreensão de como se dá a atividade biológica dos

compostos derivados dos inositóis.

As comunicações entre células nos organismos superiores são necessárias para o

controle do desenvolvimento celular, de suas organizações em tecidos e órgãos, de seus

crescimentos e de suas multiplicações necessárias também à coordenação de suas atividades.

O mecanismo de transdução de sinal é responsável por esta transmissão de

informações que hormônios e outros sinalizadores químicos, por exemplo, podem transportar

da superfície celular ao seu interior.

No sistema de comunicação celular, a primeira transmissão de sinal é dada por um

―primeiro mensageiro‖ (hormônio, fator de crescimento, etc.). Este é secretado e circula no

meio extracelular. O primeiro mensageiro é captado na superfície da célula por receptores que

lhe são específicos. A ocupação dos receptores, inseridos na membrana celular, dá início a

eventos complexos na membrana plasmática e no interior da célula até a liberação do segundo

mensageiro, ocasionando diversas respostas em nível celular (ALMEIDA et al, 2003). O

mecanismo de transdução celular está apresentado na Figura 3.

Figura 3. Mecanismo de transdução celular (Reproduzido por ALMEIDA et al., 2003).

13


O primeiro contato do primeiro mensageiro ao receptor ativa a proteína G. Esta

constitui uma família de proteínas que está ligada ao nucleotídeo guanina, sendo acopladas

aos canais iônicos, ou a outras enzimas, controlando a liberação de novos mensageiros

intracelulares. Os novos mensageiros intracelulares são conhecidos como ―segundo

mensageiros‖ (mensageiros secundários) que constituem a última ligação da cadeia de

comunicação intracelular antes da resposta fisiológica sendo ponto de grande interesse para a

compreensão dos mecanismos de transdução do sinal.

A partir de uma estimulação induzida por um agonista, ao nível do receptor na

membrana, uma proteína G ativa a fosfolipase C (PLC), a qual catalisa a hidrólise da ligação

fosfodiéster do PI(4,5) P2, liberando no meio intracelular dois novos segundos mensageiros: o

mio-inositol 1,4,5-trifosfato [Ins(1,4,5)P3] e o sn-1,2-diacilglicerol. Este fica na membrana

plasmática e age ativando a proteína quinase C- PKC, responsável pelo estímulo de

numerosas proteínas intracelulares (NISHIZUKA, 1988; WOOTEN e WRENN 1984). A

liberação dos dois mensageiros supradescritos dispara a cascata de fosfoinositídeos, uma série

de reações seqüenciais (Figura 4).

O mio-inositol-1,4,5-trifosfato (Ins(1,4,5)P3) é um mediador na liberação de Ca2+

intracelular do retículo endoplasmático para o citoplasma. Ele ativa um receptor situado na

membrana externa do retículo endoplasmático ligado ao canal de cálcio. Esta ativação

provoca a abertura do canal de cálcio e, assim, a liberação de Ca2+

para o citoplasma. Sabe-se

que a capacidade dos inositóis fosfatos de provocar a liberação do cálcio depende do número

e da posição dos grupos fosfatos na molécula, e que a presença de um grupo fosfato na

posição C1 é indispensável para fazer a ligação com o receptor. Estudos de relação estrutura-

atividade indicam que a presença de grupos fosfatos vicinais nas posições C4 e C5 do mio-

inositol se mostra essencial para a liberação de Ca2+

(IRVINE et al., 1984; KOZIKOWSKI et

al., 1990).

Sabe-se também que a posição C2 no mio-inositol (hidroxila axial) tem um papel

particular, pois esta posição é importante para o reconhecimento dos inositóis fosfatos por

diferentes enzimas (BAKER et al., 1989).

Ins(1,4,5)P3, mediador na liberação Ca2+

, é amplamente encontrado em células

eucarióticas (KOZIKOWSKI et al., 1990) e responsável pela regulação de numerosos

processos celulares, como a secreção, o metabolismo e a proliferação (ALMEIDA et al.,,

2003). Entretanto, o seu papel continua a ser elucidado (KOZIKOWSKI et al., 1990). Além

disso, não se sabe qual é a importância fisiológica da transformação do Ins(1,4,5)P3 em

14


diversos compostos fosforilados. Especula-se que eles tanto podem ser apenas metabólitos

intermediários, quanto também possuir atividade biológica própria (ALMEIDA et al., 2003).

Atualmente, sabe-se que existem duas vias para o metabolismo do Ins(1,4,5)P3. A

primeira via se inicia com uma desfosforilação específica, resultando em inositol 1,4-

bifosfato. Este bifosfato é seqüencialmente desfosforilado, principalmente via inositol 4-

fosfato até o inositol livre. Esta via, provavelmente, serve para finalizar o sinal do

Ins(1,4,5)P3. A segunda via começa com uma fosforilação específica do D-mio-inositol 1,4,5-

trifosfato, gerando o inositol 1,3,4,5-tetraquisfosfato. Algumas pesquisas sugerem que esse

inositol 1,3,4,5-tetraquisfosfato pode ter uma função própria como segundo mensageiro,

afetando o influxo de cálcio na célula do meio extracelular. O tetraquisfosfato é metabolizado

a um segundo trifosfato, o inositol 1,3,4-trifosfato, e os dois bifosfatos posteriores, os

inositóis 1,3- e 3,4-bifosfatos, são degradados a inositóis monofosfatos. Os monofosfatos são

convertidos em inositol livre, como no início do ciclo (Figura 4) (POTTER e LAMPE, 1995;

ALMEIDA et al., 2003).

Figura 4. Cascata dos fosfoinositídeos (Reproduzido por ALMEIDA et al., 2003).

A participação em processos celulares por parte de derivados do mio-inositol,

efetivamente como segundos mensageiros, despertou grande interesse no sentido de se obter

sinteticamente essas moléculas e de estudar a melhor forma para obtenção das mesmas.

15


Todavia, como o enantiômero D é o mensageiro natural, os derivados de mio-inositol

sintetizados devem ser eficientemente resolvidos ou obtidos a partir de materiais de partida

quirais (POTTER e LAMPE, 1995).

Os análogos do mio-inositol 1,4,5-trifosfato constituem o objetivo principal dos

pesquisadores. O mio-inositol 1,4,5-tritiofosfato é um análogo fosforotioato agonista do

Ins(1,4,5)P3 pela mobilização do Ca2+

intracelular em uma grande variedade de sistemas. Este

derivado é resistente à desfosforilação catalisada pela 5-fosfatase, sendo o mais poderoso

inibidor já descrito desta enzima. Outros derivados halogenados e os mono- e ditiofosfatos

foram sintetizados e testados com o objetivo de melhorar a interação com as enzimas da

cascata, mas eles não trouxeram vantagens suplementares (ALMEIDA et al., 2003).

Estudos têm demonstrado que o mio-inositol, o isômero mais abundante no cérebro, e

os inositóis fosfatos podem representar uma via para o tratamento de diversas patologias

como Alzheimer e Síndrome de Down (SHIMOHAMA et al., 1998, HUANG et al., 1999,

apud ALMEIDA et al., 2003; MCLAURIN et al., 2000). Além disso, os análogos de D-3-

desoxi-mio-inositol são inibidores do crescimento de células v-sis-transformada NIH 3T3. Os

compostos mais ativos são D-3-desoxi-3-cloro-mio-inositol, D-3-desoxi-3-azido-mio-inositol

e D-3-desoxi-3-flúor-mio-inositol. O 5-desoxi e o 5-desoxi-5-flúor-D-mio-inositol associam-

se, respectivamente, 4 e 5 vezes mais facilmente a PI-sintetase que o mio-inositol natural, mas

não são transformados pela PI-sintetase no fosfatidil-inositol correspondente (ALMEIDA et

al., 2003).

Um dos obstáculos para trabalhos de Síntese Orgânica/Química Medicinal voltados

para inositóis é a dificuldade de síntese destas substâncias. Processos de etapas múltiplas

estão envolvidos (SURESHAN et al., 2003a,b; POTTER e LAMPE, 1995). A elaboração de

inositóis quirais não racêmicos pode ser realizada ou partir do abundante mio-inositol ou pelo

emprego de substâncias naturais quirais (e enantiopuras) (POTTER e LAMPE, 1995).

Aparentemente, a não ser em casos muito específicos, estas duas estratégias mostram-se

equiparáveis quanto à praticidade. As rotas baseadas no uso do mio-inositol têm como

vantagem o uso de reações mais simples e maior disponibilidade de protocolos estabelecidos

(SURESHAN et al., 2003a,b). Há, porém, nesta opção, a necessidade de resolução óptica de

intermediários racêmicos (POTTER e LAMPE, 1995).

16


3.1.2 Mio-Inositol no tratamento da doença de chagas

Avanços no conhecimento das vias metabólicas do Trypanosoma cruzi têm permitido

identificar moléculas alvo para o desenvolvimento de fármacos mais eficientes e seguros para

o tratamento da doença de Chagas.

O mio-inositol é um componente essencial para o crescimento do T. cruzi,

participando da formação de lipídeos complexos derivados do fosfatidil-inositol. Estas

moléculas contendo mio-inositol estão presentes na superfície das células destes protozoários

flagelados em todos os estágios de sua vida e sua rota biossintética tem sido considerada um

potencial alvo terapêutico (EINICKER-LAMAS et al., 1999; OLIVEIRA et al., 2000). O 1-D-

6-desóxi-6-flúor-mio-inositol (6-FIns) (Figura 5), um análogo fluoretado de mio-inositol, é

um forte inibidor da síntese de mio-inositol e, conseqüentemente, inibe o crescimento do

Trypanosoma cruzi (OLIVEIRA et al., 2000). Além disto, esta substância é altamente seletiva

contra o parasita, não interferindo sobre o crescimento de células de mamíferos.

Figura 5. O mio-inositol e seu análogo bioativo 6Fins

3.2 ESTEREOSSELETIVIDADE: CONCEITO, ROTAS PARA

OBTENÇÃO DE COMPOSTOS ENANTIOMERICAMENTE PUROS E

CINÉTICA DOS ENANTIÔMEROS

A quiralidade é uma propriedade geométrica e diz se uma molécula que não pode ser

sobreposta à sua imagem especular é quiral, enquanto uma molécula aquiral é aquela em que

sua imagem especular pode ser sobreposta à original sem a quebra e formação de ligações.

Assim, compostos que apresentam centro assimétrico irão apresentar-se na forma de

17


estereoisômeros. Este elemento de simetria, frequentemente, é o carbono tetraédrico no qual

estão ligados quatro diferentes grupamentos, ou seja, carbono quiral.

Os estereoisômeros são divididos em diastereoisômeros, cujas moléculas possuem

diferentes arranjos espaciais de seus ligantes, porém não são imagens especulares

sobreponíveis umas das outras, e enantiômeros, nos quais a molécula apresenta a geometria e

a disposição espacial de seus átomos igual à imagem especular do seu par complementar,

sendo que somente compostos quirais apresentam esta característica (MARCH, 1992;

CAREY e SUNDBERG, 2007).

Os enantiômeros têm propriedades físicas e químicas idênticas, além da mesma

solubilidade. Entretanto exibem diferentes comportamentos quirais fisiológicos e

bioquímicos. Frequentemente os enantiômeros causam respostas fisiológicas diferentes uma

vez que os receptores biológicos são quirais. Por exemplo, o odor dos enantiomeros R e S da

carvona, enquanto o primeiro isômero tem o odor de hortelã, o segundo tem o odor de óleo da

semente de cominho. A resposta fisiológica e a possibilidade de distintas funções na

farmacodinâmica, farmacocinética e atividades toxicológicas fazem o estudo dos

enantiômeros ser de suma importância (ANOVÁ e HUTTA, 2003; CAREY e SUNDBERG,

2007).

3.2.1 Rotas para a obtenção de compostos enantiomericamente puros

A preparação de compostos enantiomericamente puros para processos farmacológicos,

agroquímicos, entre outros, requer um número robusto de métodos disponíveis para a

preparação de um composto. Os métodos utilizados para a obtenção de compostos

enantiomericamente puros podem ser divididos em três categorias (GHANEM et al., 2004;

ANTHONSEN, 2005; AHMED et al., 2012):

i. Transformação química de produtos enantiomericamente puros (―Chiral pool‖

synthesis).

ii. Síntese assimétrica (a partir de substratos proquirais)

iii. Resolução de racematos

A escolha do método a ser utilizado vai depender do tipo do material de partida utilizado

(Figura 6).

18


Figura 6. Métodos para obtenção de compostos enantiomericamente puros (Reproduzido de GHANEM et al.,

2004).

O método por meio da transformação química de substâncias enantiopuras de

interesse, conhecido como ―chiral pool‖, está relacionado a estratégia de se obter o aumento

da eficiência da síntese quiral a partir de substratos enantiomericamente puros. O termo

―chiral pool‖ refere a uma rota sintética de produtos naturais enantiomericamente puros (e

seus derivados) de forma econômica. Substratos tais como aminoácidos e acido láctico podem

ser transformados em produtos sintéticos quirais por rotas de síntese química. Por exemplo,

no processo de produção de L-acido ascórbico (vitamina C) a partir da D-glicose, o isômero L

da vitamina C é obtido, contudo a conversão ocorre com seis etapas (AGER, 2006).

Outra categoria seria aquela que inclui o método realizado com os substratos

proquirais. Nesta síntese, dois tipos podem ser distinguidos, como apresentados na Figura 7.

Figura 7. Os dois tipos de conversão assimétrica: a) quando ocorre em estruturas proquiral com dupla ligação; b)

Distinção entre átomos ou grupos enantiotópicos.

19


Este método visa à obtenção de compostos quirais por síntese química ou por meio de

biocatalisadores. Desta maneira, a conversão é chamada de síntese assimétrica e se pode obter

até 100% de conversão do produto (diferente da resolução cinética que veremos a seguir).

Pelo fato de somente a metade do material de partida ser convertido à produto (50%) na

resolução cinética faz com que esta técnica seja considerada, por alguns autores, desvantajosa,

frente a síntese assimétrica (FABER, 2001).

Uma alternativa para o aumento da conversão em reações enantiosseletivas é a

racemização simultânea do material de partida, conhecida como resolução cinética dinâmica

(WARD, 1995; STECHER e FABER, 1997; FABER, 2001; REETZ et al., 2002;

PELLISSIER, 2003; SCHNELL et al., 2003). A combinação da acilação enantiosseletiva,

catalisada por lipase, com a racemização do substrato catalisada por rutênio (Ru) resulta numa

resolução cinética dinâmica de α-hidroxi-ésteres com rendimento teórico de 100% e alto

excesso enantiomérico (Figura 8) (GHANEM et al. 2004).

Figura 8. Resolução cinética dinâmica de α-hidroxi-ésteres. Supondo que a conversão do isômero-R seja o mais

rápido, a reação ficará mas lenta para o outro isômero (S). (Modificado de GHANEM et al., 2004).

A síntese assimétrica é geralmente catalisada por oxidoredutases e liases, enquanto a

resolução cinética é feita exclusivamente pelas hidrolases (STRAATHOF et al., 2002).

Na terceira categoria, encontra-se a fonte dos mais importantes racematos e será

melhor discutida na seção abaixo.

Resolução de racematos

Apesar do progresso impressionante na síntese assimétrica, o método de produção

dominante para se obter um único enantiómero na síntese industrial consiste na resolução de

racematos. Diferente da síntese assimétrica que se inicia com um substrato aquiral, a

resolução dos racematos se inicia com uma mistura de dois enantiômeros, onde apenas um

deles deve ser convertido, preferencialmente, por um (bio)catalisador (no caso o

biocatalisador pode ser enzima ou o próprio micro-organismo), sendo este considerado então

20


enantiosseletivo (máxima conversão teórica do produto em 50%) (FABER, 2000,

STRAATHOF et al., 2002 e FABER, 2011).

Nos processos em batelada, quando há reações em equilíbrio, a reação precisa ser

interrompida antes que o enantiômero mais lento comece a ser convertido. A finalidade é

manter o enantiômero desejado na sua forma enantiomericamente pura. (CHEN et al., 1987).

A resolução dos enantiômeros pode ser dividida em três técnicas de separação, que

consistem em a) cristalização: cristalização preferencial direta e cristalização de sais

diastereoméricos; b) cromatografia e c) resolução cinética (Figura 6, pag. 12). Apesar da

técnica clássica ser a cristalização, a técnica mais utilizada, até o presente momento, é a

resolução cinética, catalisada por enzimas (FABER, 2001; SARIC et al., 2011). O sucesso do

método é dependente do fato de os dois enantiômeros reagirem com velocidades

diferenciadas. Então um dos enantiomeros é transformado em produto de forma mais rápida

que o outro (FABER, 2001; GHANEM et al., 2004).

Resolução de racematos derivados de mio-inositol, exemplos de cristalização e

cromatografia

As resoluções ópticas dos intermediários racêmicos normalmente são realizadas

empregando agentes de resolução quiral, que dependem da conversão destes intermediários

em diastereoisômeros, que são separados por cristalização ou cromatografia como já discutido

anteriormente. Um dos primeiros métodos disponíveis foi o procedimento de Shvets

(STEPANOV e SHVETS, 1979), que empregava ortoésteres de D-manose na resolução dos

derivados. Garegg e colaboradores (1985) separaram os enantiômeros de (±)-4-O-benzil-mio-

inositol utilizando o (S)-ácido O-acetil-mandélico como agente de resolução quiral, o

emprego desse auxiliar de quiralidade funciona bem para derivados de mio-inositol,

originando ésteres diastereoisoméricos facilmente separados por cromatografia.

Wewers e colaboradores (2005) conseguiram obter, por meio de duas etapas de

cristalização, os dois enantiômeros do derivado tetra-O-benzil-mio-inositol utilizando o

isômero D da cânfora. Ozaki e colaboradores (1986, 1987) foram os primeiros a utilizar como

agente de quiralidade derivados do L-mentol. Os autores sintetizaram o derivado D-mio-

inositol 1,4,5-tris(fosfato) opticamente ativo usando o cloreto do ácido mentoxiacético na

resolução. Entretanto, as desvantagens da utilização de agentes de quiralidade são:

possibilidade de migração do grupo na molécula; hidrólise do grupo na etapa de cristalização;

21


número maior de etapas, com perda do rendimento total; e pouca regiosseletividade quando

realizada em dióis e polióis (WHITESELL e REYNOLDS, 1983).

Resolução de racematos: Derivados de mio-inositol catalisados por lipases

O uso de lipases na resolução cinética de derivados quirais de mio-inositol tem sido

um método muito atraente e empregado por diversos autores. Os intermediários racêmicos

podem ser hidrolisados ou esterificados de forma enantiosseletiva e separados por

cristalização ou cromatografia.

Ling e Ozaki (1994) utilizaram a lipase de Pseudomonas sp. (lipase CES) na resolução

cinética de 2,3-O-ciclohexilideno-mio-inositol em 1,4-dioxano utilizando anidrido acético

como agente acilante. A reação foi regiosseletiva e enantiosseletiva acetilando apenas o grupo

hidroxila da posição C-1 do L-isômero produzindo o L-1-Oacetil- 2,3-O-ciclohexilideno-mio-

inositol com 49% de conversão e 98% de excesso enantiomérico.

Chung e colaboradores (1998) obtiveram o produto monoacetilado L-4-O-acetil-

1,2:5,6-O-diisopropilideno-mio-inositol com 48% de conversão e 84% de excesso

enantiomérico, a partir da resolução cinética do diol 1,2:5,6-O-diisopropilideno-mio-inositol

catalisada pela lipase de Candida rugosa com anidrido acético em éter dietílico.

As principais vantagens do uso deste método são: alta especificidade e seletividade

química, posicional e estéreo apresentada pelas lipases, diminuição do número de etapas

necessárias na resolução, alto rendimento e condições suaves das reações evitando a formação

de subprodutos.

3.2.2 Cinética dos enantiômeros

Com o objetivo do reconhecimento quiral por enzimas, alguns modelos descrevem o

mecanismo de enantiosseletividade da reação enzimática pela capacidade da enzima de reagir

com diferentes taxas, com os dois enantiômeros, que se constituem em ―substratos

alternativos‖, tendo formação preferencial de um enantiômero do produto em relação ao outro

(FABER, 2000; STRAATHOF et al., 2002; FABER, 2011). Estes modelos usados no

tratamento quantitativo dos dados bioquímicos e acompanhados pela química sintética,

podem gerar predições úteis.

Chen e colaboradores (1982) foram os primeiros a encontrar relações úteis entre a

extensão de conversão do substrato racêmico (c), a pureza óptica expressa como o excesso

enantiomérico (ee) do produto ou do substrato remanescente, e a razão enantiomérica no

22


estudo de resoluções de racematos (E). O parâmetro razão enantiomérica, como proposto

pelos autores tem um significado mais amplo do que a simples aplicação de misturas de

enantiômeros. Este parâmetro pode ser aplicado a qualquer reação enzimática com substratos

alternativos, enantiômeros ou não (OSTREICHER et al., 2001).

Para que o processo de resolução seja eficiente, é necessário que as constantes de

especificidade das reações para os enantiômeros sejam diferentes. Quanto maior a diferença,

maior o poder da resolução. Diversos processos como farmacêuticos, geoquímicos e

alimentícios requerem uma alta pureza óptica (eep maior que 98%) (STRAATHOF e

JONGEJAN, 1997). Logo esta abordagem é de grande interesse para estes segmentos.

Admitindo que A é o enantiômero que reage mais rapidamente e B é o enantiômero

que reage mais lentamente, e que ambos competem pelo mesmo sitio ativo da enzima, o

seguinte esquema (Figura 9) pode ser considerado para sistemas do tipo Michaeliano,

assumindo que a reação é virtualmente irreversível e que os produtos gerados não interferem

na reação:

Figura 9. Esquema considerado para sistemas do tipo Michaeliano, assumindo que a reação é irreversível e que

os produtos gerados não interferem na reação.

No estado estacionário, a razão entre as duas equações de velocidade é dada por:

B

A

K

K

V

V

v

v

A

B

B

A

B

A (Eq. 1)

onde VA, KA e VB, KB são velocidade máxima e constante de Michaelis dos substratos

A e B, respectivamente. A equação 1 pode ser integrada em função do tempo:

EKV

KV

BB

AA

BB

AA 0

0

ln

ln (Eq. 2)

onde, Ao, A, Bo, B, são as áreas dos cromatogramas dos substratos no início e no final

da reação, respectivamente.

A razão enantiomérica (E), parâmetro cinético que informa a especificidade da enzima

para os substratos alternativos, é a relação entre as duas eficiências catalíticas, Vmax/KM. Esta

23


equação pode ser desenvolvida em termos de conversão (c ou X) e excesso enantiomérico do

substrato (ee(S)). Uma vez que a conversão do racemato é a soma das conversões dos

enantiômeros:

00

1BA

BAc

(Eq. 3)

E o excesso enantiomérico é a diferença das frações molares dos enantiômeros da

mistura com relação ao substrato, dado por:

BA

ABSee

(Eq. 4)

Logo, torna-se possível calcularmos a razão enantiomérica, substituindo as equações 3

e 4 na equação 2:

EKV

KV

Seec

Seec

BB

AA

11ln

11ln (Eq. 5)

Sendo assim, conclui-se que o parâmetro E, um parâmetro qualitativo e quantitativo

(COSTA e AMORIM, 1999), é dependente da razão das constantes de especificidade

(Vmax/KM) e é independente da concentração dos substratos. Este parâmetro nos mostra

quantas vezes um enantiômero é melhor substrato que o outro para a enzima utilizada

(STRAATHOF e JONGEJAN, 1997).

Quando o catalisador é altamente seletivo, 50% de conversão do produto desejado será

obtido enquanto 50% do substrato não reagido, na sua forma enantiopura, permanecerá até o

fim da reação.

Em experimentos de resolução cinética usando enzimas hidrolíticas, pode-se ainda

relacionar a extensão da conversão (c ou X) e do excesso enantiomérico do produto (ee(P)) ao

valor da razão enantiomérica (E). Esta relação pode ser obtida convertendo a equação 2 na

equação 6:

EKV

KV

Peec

Peec

BB

AA

11ln

11ln (Eq. 6)

onde o excesso enantiomérico com relação ao produto é dado por:

24


QP

QPPee

(Eq. 7)

No caso da Equação 6, o curso do processo de resolução cinética é diferente (Figura

10).

Figura 10. Efeito da enantiosseletividade enzimática demonstrada como a relação entre a razão enantiomérica

(E) e o excesso enantiomérico do produto (eep) (Reproduzido por Straathof e Jongejan, 1997).

Inicialmente, o ee(p) = (E-1)/(E+1), ao atingir 50% de conversão, diminui rapidamente

conduzindo ao produto racêmico (ee(p) = 0%) quando a conversão da reação atinge 100%.

O produto enantiopuro, valor de ee(p) maior que 98%, somente pode ser obtido

quando a razão enantiomérica for maior que 100 (STRAATHOF e JONGEJAN, 1997).

Embora E igual a 100 seja tão efetivo quanto E igual a ∞, existe uma diferença significativa

entre E igual a 100 e E igual a 10. Entretanto, mesmo para valores de enantiosseletividade

muito baixos, como E igual a 5, a reação ainda pode ser explorada para obter substrato com

alto grau de pureza (ee(s) maior que 98%) (STRAATHOF e JONGEJAN, 1997). Valores de E

menores que 15 tornam a análise inviável do ponto de vista dos propósitos mais práticos.

Valores entre 15-30 são considerados valores moderados a bons. Entretanto apesar de valores

de E maiores que 100 sejam excelentes, valores de E maior que 200 não podem ser

determinados com precisão devido a imprecisões emergidas dos métodos das determinações

do excesso enantiomérico (ex. RMN, CLAE ou CG). Neste escopo, uma simples mudança na

25


variação do excesso enatiomérico causa uma mudança significativa no valor numérico de E

(SIH et al., 1982; FABER, 1997).

Embora a qualidade do produto da resolução de um racemato seja caracterizada pelo

excesso enantiomérico, a razão enantiomérica (E) é um parâmetro de grande importância,

uma vez que a enzima apresentará uma eficiência catalítica própria para cada substrato. Um

valor elevado de E, para um determinado par enzima-substrato, é essencial para a constatação

do sucesso da resolução enantiomérica (E).

Freqüentemente, quando não existe uma enzima apropriada para uma dada reação,

então a reação deve ser explorada para se obter o substrato remanescente enantiopuro ao invés

do produto enantiopuro (STRAATHOF e JONGEJAN, 1997).

26


3.3 LIPASES

3.3.1 Características das lipases

As lipases (glicerol éster hidrolases - E.C. 3.1.1.3) compreendem um grupo de

enzimas hidrolíticas que atuam, geralmente, na interface água/lipídeo catalisando a hidrólise

de ligações éster carboxílicas presentes em triacilgliceróis (TG) resultando na formação de

diacilgliceróis (DG), monoacilgliceróis (MG), ácidos graxos (AG) e glicerol (Figura 13)

(JAEGER et al., 1994; SHARMA et al., 2001). Entretanto, as lipases também podem catalisar

a reação de síntese de mono, di ou triacilglicerol a partir de ácidos graxos e glicerol em

condições em que a água é restrita no meio reacional (SAXENA et al., 1999).

Figura 11. Reação de hidrólise catalisada por lipases. Um triacilglicerol pode ser hidrolisado para formar glicerol

e ácidos graxos ou, na direção reversa, em ambientes com baixo teor de água, pode ser formado o éster (reação

de síntese).

Os principais substratos das lipases são os triglicerídeos de cadeia longa (com mais de

dez átomos de carbono), enquanto as enzimas que hidrolisam triacilgliceróis compostos de

ácidos graxos de cadeia curta (menos de dez átomos de carbono) são reconhecidas como as

esterases-carboxil éster hidrolases (E.C. 3.1.1.1) (JAEGER, DIJKSTRA e REETZ, 1999;

27


NINI et al., 2001; SHARMA et al., 2001; BORNSCHEUER, 2002; CASTRO-OCHOA et al.,

2005). Como produto da reação das hidrolases, há a liberação de ácidos graxos e glicerol

(Figura 11) (JAEGER, RANSAC e DIJKSTRA, 1994; JAEGER; DIJKSTRA; REETZ, 1999).

Além dos substratos citados, as lipases também catalisam uma vasta quantidade de

ésteres não lipídicos (substratos não naturais), sendo ativas não apenas em meio aquoso mas

também em solventes orgânicos, permitindo a transformação em compostos não solúveis em

água enquanto mantêm sua alta regio-, quimio e enantiosseletividade, além de não

requisitarem cofatores para realização da catálise enzimática. Esta é uma das características

que tornam as lipases catalisadores ideais para a síntese orgânica (BORNSCHEUER e

KAZLAUSKAS 2006; PRIEGO et al., 2009; de CARVALHO et al., 2011).

A facilidade com que estas enzimas aceitam uma gama de substratos não naturais e de

tamanhos diversos sugere que a espinha dorsal polipeptídica seja flexível, podendo adotar

diferentes conformações. Como consequência, a baixa barreira de energia que é necessário

para que ocorram as mudanças conformacionais dificulta a modelagem e a previsão de

interações estereoquímicas para este grupo de biocatalisadores (COSTA e AMORIN, 1999).

As lipases são amplamente encontradas na natureza, principalmente devido à sua

importante função no metabolismo de lipídeos. Estas podem ser obtidas a partir de fontes

animais (lipase pancreática, por exemplo), vegetais (extraída de soja, do centeio e do algodão,

por exemplo) e microbiana. Esta última, do ponto de vista econômico e industrial, é a fonte

mais utilizada para obtenção destas enzimas. Isso devido à relativa facilidade de produção

(beneficiada pelo rápida taxa de crescimento), maior variedade das espécies microbianas

disponíveis para sintetizá-las, alto rendimento de conversão de substrato em produto, grande

versatilidade e maior simplicidade na manipulação ambiental e genética, além da utilização de

meios de baixo custo e mais estáveis que suas correspondentes de plantas e animais

(BALCÃO et al., 1996; PANDEY et al., 1999a,b; HASAN et al., 2006; ILLANES, 1994;

FREIRE e CASTILHO, 2010). Dos micro-organismos utilizados, os fungos são

especialmente valorizados porque as enzimas por eles produzidas normalmente são

extracelulares, o que facilita a sua recuperação do meio de fermentação e também porque a

maioria dos fungos não é nociva à saúde humana, (GRAS - Generally Regarded as Save),

JAEGER, RANSAC e DIJKSTRA, 1994).

Os processos fermentativos vêm sendo os principais meios utilizados na produção de

lipases. Isso porque estes apresentam maior facilidade de controle, maior capacidade

produtiva e custo de obtenção reduzido (BALCÃO et al., 1996; PANDEY et al., 1999a).

28


As lipases catalisam uma série de diferentes reações. Os processos básicos que

fundamentam o mecanismo catalítico (hidrólise e síntese de ésteres) podem ser associados

pela enzima para resultar em reações de acidólise, alcoólise e transesterificação, dependendo

dos reagentes de partida empregados e do solvente utilizado. Além de água e álcool, outros

compostos podem ser utilizados como nucleófilos em reações catalisadas por estas enzimas.

Desta forma, as lipases podem catalisar outras reações como aminólise, tiotransesterificação,

lactonização e peroxidação, em solventes orgânicos, com elevada seletividade (KRIEGER et

al., 2004, CASTRO et al., 2004). A Figura 12 ilustra as principais reações catalisadas por

lipases.

Figura 12. Reações catalisadas por lipase.

Em relação ao pH, segundo Langone (1998) lipases podem apresentar alta atividade

em faixas bem amplas, (pH entre 5 e 9, com um máximo situado entre 6 e 8). As lipases de

29


cepas do gênero Pseudomonas apresentam atividade máxima em pH entre 6,0 e 9,0 (HAKI e

RAKSHIT, 2003). Conforme encontrado em muitos trabalhos acadêmicos, a maioria das

lipases bacterianas mostra uma tendência de maior estabilidade em pH básico. Todavia, esse

comportamento pode ser diferente conforme se altere a espécie microbiana. São exemplos de

lipases estáveis em ampla faixa de pH a lipase de Bacillus megaterium, estável em pH de 4 a

12, e a lipase de Staphylococcus epidermidis, estável entre pH entre 2 e 10 (SIMONS et al.,

1998; RUIZ et al., 2002).

Na área industrial existem muitos processos que ocorrem em temperaturas em torno de

50º C. Uma vez que a termostabilidade é uma característica requerida para as enzimas

utilizadas no ramo industrial, faz-se necessário o seu estudo. A estabilidade pode variar

dependendo da espécie, gênero e até entre isoformas produzidas por uma mesma cepa. A

maioria das lipases apresenta temperatura de atividade ótima na faixa entre 30 e 40o

C, outras

apresentam atividade ótima em temperaturas mais elevadas, entre 40 e 70°C. Algumas lipases

apresentam atividade acima de 70oC, como as de Bacillus thermoleovorans e Bacillus

thermocatenulatus (CHO, YOO e KIM, 2000; QUYEN, SCHMIDT-DANNERT e SCHIMD,

2003). Rathi et al., (2000) mencionam ainda a atividade ótima para a lipase de Pseudomonas

sp. de 90 oC.

3.3.2 Principais micro-organismos utilizados para lipases

Fungos de diversos gêneros demonstraram ser bons produtores de lipases e as suas

enzimas têm sido estudadas sob o ponto de vista acadêmico e industrial. Por exemplo, lipases

de Aspergillus niger, A. oryzae, Mucor javanicus, Rhizopus niveus, R. oryzae, Penicillium

camembertii, P. roqueforti e da levedura Candida rugosa são comercializadas atualmente pela

Amano (Amano Europe Enzyme Ltd. UK) para processamento de óleos, gorduras e queijos,

para a determinação de triglicerídeos, como aditivos em preparações digestivas e para síntese

quiral (http://www.amano-enzyme.co.jp/).

Dentre as bactérias produtoras de lipases comercialmente estão disponíveis as enzimas

de Pseudomonas sp., P. fluorescens, Bulkholderia (Pseudomonas) cepacia e Arthrobacter sp.

para a aplicação em síntese quiral. O rápido crescimento celular, em relação aos fungos é uma

das vantagens citadas das fontes bacterianas como produtoras destas enzimas (JAEGER,

DIJKSTRA e REETZ, 1999). Apesar de lipases produzidas por vegetais terem sido

purificadas e estudadas quanto às suas características bioquímicas e quanto o seu potencial em

biotransformação de lipídeos, estas são pouco exploradas em escala industrial. Dentre as

enzimas lipolíticas vegetais estudadas estão as triacilglicerol lipases, as acil-hidrolases não

http://www.amano-enzyme.co.jp/

30


específicas como as fosfolipases A1, A2 e B, as glicolipases, as sulfolipases e

monoacilglicerol lipases, além das fosfolipases C e D (MUKHERJEE, 1994). Entre as

espécies estudadas estão Ricinus communis, Vernonia, Pinus, Brassica napus, Cuphea

racemosa (HELLYER, CHANDLER e BOSLEY, 1999), Euphorbia characias e E. wulfenii

(PALOCCI, FIORILLO e MONACHE, 2003; CAVALCANTI et al., 2007).

Lipases humanas têm sido largamente estudadas devido às implicações que sua

estimulação ou inibição têm sobre a saúde humana, como problemas associados com a

obesidade. São elas lipases gástrica, pancreática, a estimulada por sais biliares que ajudam na

digestão e assimilação de lipídeos da dieta, e as lipases hepática e endotelial, as quais atuam

no metabolismo de lipoproteínas. (MILED et al., 2000, ROUSSEL et al., 2002, VAGANAY

et al., 1998).

O interesse na medicina está principalmente na inativação da atividade lipolítica para

controlar a infecção de micro-organismos, na inibição da lipase digestiva para controle da

obesidade, na estimulação da lipase metabólica para diminuir a lipidemia ou no uso de lipase

pancreática suplementar para controle da fibrose cística (MUKHERJEE, 2003). Dentre outras

lipases animais estudadas, pode-se destacar a lipase pancreática canina (STEINER e

WILLIAMS, 2002); as lipases ácidas lisossomais humana e de rato (GROENER et al., 2000);

a fosfolipase pancreática de peru (BEN SALAH et al., 2003) e as pancreáticas de esquilo

(Spermophilus tridecemlineatus) (SQUIRE et al., 2003), gato (Felis catus) (STEINER,

WILSON e WILLIAMS, 2003) e bovina (YAQOOB, NABI e MASSOM-YASINZAI, 1999).

3.3.3 Estrutura proteica de lipases

Até o momento, as lipases microbianas caracterizadas apresentam massa molar entre

19 e 60 kDa e apresentam uma estrutura terciária comum com um dobramento de α/β

hidrolase (Figura 13). Embora lipases difiram significativamente nas suas sequências de

aminoácidos, 11 lipases, cujas estruturas foram resolvidas, mostraram semelhantes estruturas

3-D (CAMBILLAU e TILBEURGH, 1993; CYGLER, SCHRAG e ERGAN, 1992;

DEREWENDA et al., 1994a,b; DODSON, LAWSON e WINKLER, 1992; RANSAC et al.,

1996; BORNSCHEUER e KAZLAUSKAS, 2006b). O dobramento α/β hidrolase consiste em

uma estrutura que possui um núcleo formado por uma folha β central, consistindo de oito

diferentes fitas β (β1-β8), conectadas com seis α hélices (A-F) (POUDEROYEN et al., 2001).

As fitas β têm orientação para a esquerda.

31


Apesar das lipases apresentarem baixa homologia na seqüência de aminoácidos

(estrutura primária), estas enzimas apresentam uma alta similaridade em sua arquitetura

tridimensional (estruturas secundária e terciária). Assim como as outras hidrolases, as lipases

também possuem uma tríade catalítica, em seu sítio ativo formada por três resíduos: um

nucleófilo (serina), um ácido (aspartato ou glutamato) e um aceptor/doador de próton

(histidina) que ocorrem, necessariamente, nesta ordem na sequência primária (JAEGER,

DIJKSTRA e REETZ, 1999).

O nucleófilo catalítico, serina é responsável pela catálise e está unido por ligações de

hidrogênio a um resíduo de histidina; o resíduo carboxilado ligado ao mesmo resíduo de

histidina poderá ser um aspartato ou glutamato (EGGERT et al., 2001; JAEGER e REETZ,

1998; SCHRAG et al., 1991; EGLOFF et al., 1995; JAEGER, RANSAC e DIKSTRA, 1994;

JAEGER, DIJKSTRA e REETZ, 1999). A serina catalítica está localizada no C-terminal da

fita β5, faz parte de um pentapeptídeo altamente conservado GXSXG, onde G= glicina; S=

serina; X1= histidina e X2= ácido glutâmico ou aspártico (JAEGER e REETZ, 1998).

Figura 13. Modelo estrutural de α/β hidrolases. Oxiânion: resíduos que estabilizam o oxiânion, Nu: resíduo

nucleofilico que é a serina para lipases, proteases e esterases. α -hélices estão representadas por retângulos, β-

hélices por setas. (Reproduzido de BORNSCHEUER e KAZLAUSKAS, 2006b).

Além da região que compõe o sítio ativo, para a ligação do substrato, existe uma

estrutura anfipática móvel que cobre o sítio ativo catalítico na estrutura da maioria das lipases,

chamada região de tampa hidrofóbica ou lid, que está envolvida na seletividade de lipases

(SECUNDO et al., 2006). Em lipases, esta estrutura está presente na posição β8, que

prolonga-se sobre o conjunto central de fitas β e sobre o sítio catalítico, sendo chamada de

tampa hidrofóbica. Segundo Ghanem (2007), a provável função da tampa hidrofóbica é na

interação com a interface lipídeo-água, no fenômeno de ativação interfacial, onde esta

32


estrutura sofre uma mudança conformacional, expondo o sítio ativo e favorecendo a ligação

com o substrato.

3.3.4 Sítios de ligação do substrato em lipases

Estudos utilizando as técnicas de cristalografia de raios-X mostraram que estruturas

em estado de transição análogas, ligadas ao sítio ativo de lipases, têm identificado distintos

sítios de ligação para a porção álcool e para a porção ácido (oriundos de esteres). O sítio de

ligação da porção álcool é similar para todas as lipases. O sítio ativo é representado por duas

cavidades de diferentes tamanhos, uma grande bolsa hidrofóbica, que está aberta para o

solvente, e uma pequena bolsa que está em direção a base da cavidade. Sabe-se que a forma

desta bolsa define a estereosseletividade de lipases em relação a álcoois secundários. O sítio

de ligação para a porção ácido varia consideravelmente entre as lipases. Para CRL (lipase de

Candida rugosa) o grupo acila se liga em um túnel de comprimento suficiente para acomodar

uma cadeia de pelo menos 18 átomos de carbono. RML (lipase de Rhizomucor miehei) e

CALB (lipase de Candida antarctica), possuem uma região com um espaço menor. Em todas

as três estruturas o carbono α da cadeia acila se liga imediatamente abaixo da grande região

hidrofóbica do sítio de ligação de álcool (Figura 14) (BORNSCHEUER e KAZLAUSKAS,

2006b).

Figura 14. Modelo proposto para os sítios de ligação do substrato à três lipases sinteticamente úteis. O resíduo

catalítico Ser encontra-se na parte inferior da cavidade com a sua catalítica His à esquerda. Embora os detalhes

da cavidade se diferem para cada lipase, cada cavidade contém uma grande bolsa hidrofóbica (cinzento claro) e

um menor bolso (cinza médio), conhecidos como "bolsos estereoseletivos‖. As regiões que se ligam ao

grupamento acila do éster difere significativamente entre as três estruturas. Para CRL, o grupamento acila liga-se

num túnel (representado por cinza escuro onde está escrito tunnel mouth). Na CALB e PCL, o grupamento se

liga no enorme bolso hidrofóbico da cavidade (Reproduzido de BORNSCHEUER e KASLAUSKAS, 2006b).

33


3.3.5 Fenômeno da ativação interfacial em lipases

Em 1958, Sarda e Desnuelle propuseram definir lipases a partir de suas características

cinéticas, utilizando como critério a propriedade de ativação na presença de substratos

insolúveis em água e emulsionados, ou seja, na presença de uma interface lipídeo/água. Os

autores estudaram as diferenças na atividade das esterases e das lipases. Estes observaram que

a lipase pancreática de porco sofria um aumento da atividade enzimática quando o limite de

solubilidade dos substratos era ultrapassado (esse aumento não foi observado para as

esterases). A atividade das esterases era função da concentração do substrato de acordo com o

modelo clássico de Michaelis e Menten, no qual a velocidade máxima ocorria antes do limite

de solubilidade do substrato ser atingido e da formação de agregados e/ou interfaces.

Enquanto a atividade lipásica se caracterizou por manter-se constante até que a concentração

micelar crítica (CMC) do substrato no sistema fosse alcançado, e aumentando a partir desse

ponto. A este fenômeno de aumento de atividade enzimática quando há formação de

interfaces, chamou-se de ativação interfacial (COSTA e AMORIM, 1999; SARDA e

DESNUELLE, 1958).

Os aspectos básicos sobre os mecanismos de catálise, incluindo o processo de ativação

interfacial foram elucidados a partir da resolução da estrutura tridimensional de várias

enzimas. Métodos de purificação, seqüenciamento, expressão genética, clonagem,

cristalização e cristalografia de raio-X foram empregados permitindo obter a resolução da

estrutura tridimensional de algumas lipases como Rhizomucor miehei, Pseudomonas glumae,

Pseudomonas cepacia, lipase de pâncreas humano, lipase gástrica humana e de cão, Candida

rugosa e Geotrichum candidum em sua forma inativa e ativada interfacialmente utilizando

inibidor para a formação de complexo com o sítio ativo (BRZOZOWSKI et al., 1991;

BRZOZOWSKI et al., 2000; GROCHULSKI et al., 1994 e ROUSSEL et al., 2002) (Figura

15). Na forma inativa, o sítio ativo está totalmente oculto sob um curto segmento helicóide,

formado por um ou mais loops-tampa lid ou aba flap. Na forma ativada, a tampa é deslocada

para fora do sítio ativo, deixando-o totalmente acessível ao solvente e substrato. Nesse

movimento, o lado hidrofóbico fica totalmente exposto, expandindo consideravelmente a

superfície não polar do sítio ativo (COSTA e AMORIM, 1999).

34


Figura 15. Conformações tampa fechada (azul) e tampa aberta (amarelo) em várias lipases. Reproduzido de

Aloulou et al., (2006).

A diferença estrutural entre as duas conformações de lipase, tampa fechada e tampa

aberta, varia de um simples movimento para trás da tampa até um modelo mais complexo de

múltiplas alças com uma profunda mudança na estrutura secundária e terciária da lipase. As

lipases de Rhizomucor miehei e Thermomyces lanuginosa apresentam uma única tampa

helicoidal. Nas lipases de pâncreas humano e de Candida rugosa foi encontrado um modelo

mais complexo de múltiplas alças (SVENDSEN, 2000; ALOULOU et al., 2006).

Do ponto de vista estrutural, existem evidências que sugerem que a lid pode propiciar

a atividade catalítica e determina seletividade de algumas lipases (SECUNDO et al., 2006).

As lipases de Geotrichum candidum (SCHRAG et al., 1991), Thermomyces (Humicola)

lanuginosa e R. miehei (BRADY et al., 1990; OLLIS et al., 1992; CAJAL et al., 2000 a,b) são

exemplos de lipases que apresentam a tampa em suas estruturas e sofrem ativação interfacial.

Entretanto, em outros casos, a existência da lid não implica necessariamente em ativação

interfacial. Este é o caso das lipases de P. aeruginosa, Burkholderia glumae e C. antarctica B

(JAEGER e REETZ, 1998a, JAEGER, RANSAC e DIJKSTRA, 1994), que possuem a lid

mas não sofrem necessariamente ativação interfacial. Por outro lado, as cutinases, que são as

menores lipases de estrutura conhecida (19 kDa), não apresentam a tampa catalítica e não

precisam da interface para exercer sua atividade hidrolítica (CYGLER e SCHRAG, 1997;

YAO e KOLLER, 1994). Portanto, nem o critério de ativação interfacial, nem o da existência

da tampa são suficientes para a caracterização de uma lipase. Por isto, a caracterização de

lipases com base no conceito de ativação interfacial foi substituída pela definição de que

lipases são carboxilesterases capazes de catalisar a hidrólise de acilgliceróis de cadeia longa

(VERGER, 1997; FREIRE e CASTILHO, 2010). O fato de a maioria das lipases conhecidas

35


ser ativada na interface orgânico-aquosa proporcionou o desenvolvimento de diversas

metodologias de estudo da ativação interfacial (FREIRE e CASTILHO, 2010).

O fenômeno de ativação interfacial ocorre quando a tampa hidrofóbica encontra outra

molécula hidrofóbica na interface. Esta então se move, sofrendo uma mudança

conformacional, expondo o seu sítio ativo e permitindo a catálise da reação (ALOULOU et

al., 2006). A mudança conformacional durante o processo de ativação pode ser alterada de

acordo com a lipase utilizada. Por exemplo, nas lipases de Rhizomucor miehei a espinha

dorsal da enzima é deslocada 7Å expandindo 750Å a área hidrofóbica da superfície da enzima

(DEREWENDA et al., 1992). Entretanto outras lipases sofrem alterações conformacionais

mais complexas, como o caso da lipase do pâncreas humano, onde a mudança ocorre na

estrutura secundária e terciária.

Petersen e colaboradores (2001) demonstraram por meio de um estudo que a superfície

das lipases apresenta diversos resíduos apolares. Este caráter apolar aumenta ainda mais

quando estas sofrem ativação interfacial. Os autores descreveram ainda que os resíduos em

volta do sítio ativo das lipases apresentam caráter eletrostático negativo nos valores de pH

ótimos, que são tipicamente próximos de 8.

O potencial negativo caracterizado no sitio ativo das lipases e esterases também pode

atuar repelindo o ácido carboxílico formado após a reação de hidrólise de um éster, forçando

então o produto para fora do sítio ativo da enzima, deixando-o livre para outras reações. Este

mecanismo foi descrito por Petersen e colaboradores (2001) e foi chamado de mecanismo da

catapulta eletrostática. O esquema se encontra na Figura 16.

Figura 16. Esquema ilustrando o funcionamento da catapulta eletrostática. O sítio ativo com potencial negativo

força, através de repulsão eletrostática, a saída do ácido carboxílico formado, que também possui carga negativa.

Modificado de Petersen et al., (2001) por Almeida, (2005).

36


Em algumas lipases, a própria estrutura do sítio ativo é afetada pela mudança

conformacional na presença de seu substrato. Em lipase pancreática humana, por exemplo,

ambos o lid e a fita β5 se adaptaram totalmente para a diferente conformação na presença de

fosfolipídios e sais biliares. O movimento de abertura da tampa cria uma região eletrofílica

próxima do resíduo serina do sítio ativo (cavidade do oxiânion), que é responsável pela

estabilização das cargas negativas do intermediário tetraédrico do estado de transição formado

durante a hidrólise do éster. As lipases que não possuem uma tampa helicoidal, como por

exemplo, a lipase de Pseudomonas aeruginosa, apresentam a cavidade do oxiânion pré-

formado. A abertura da tampa helicoidal gera uma grande superfície hidrofóbica em torno do

sítio ativo. A face interna da tampa da lipase tem sido a principal responsável pelo

reconhecimento e interação da lipase com a interface água-lipídeo (ALOULOU et al., 2006).

Dependendo da lipase, a localização topológica da tampa hidrofóbica se encontra de

maneira variada. Além disso, o tamanho e complexidade geralmente aumentam com o

aumento da molécula protéica (JAEGER, DIJKSTRA e REETZ 1999).

3.3.6 Mecanismo cinético

O mecanismo cinético aceito para descrever a ação das lipases é o Ping Pong Bi Bi,

independente do tipo de reação catalisada (hidrólise, esterificação ou interesterificação). Este

mecanismo consiste de duas etapas principais:

Entrada do primeiro substrato e o ataque nucleofílico sobre a ligação éster do

substrato pelo átomo de oxigênio do grupo hidroxil do resíduo serina do sítio

ativo após a abertura da tampa (resultando na formação de complexo

enzimático acilado e desprendimento de espécie álcool do substrato original-

Intermediário tetraédrico)

Entrada do segundo substrato formando o segundo intermediário tetraédrico;

hidrólise do complexo enzimático acilado, resultando na formação do produto

e regeneração da enzima (JAEGER, DIJKSTRA e REETZ 1999; PAIVA,

BALCÃO e MALCATA, 2000).

37


O mecanismo Ping Pong Bi Bi envolve substratos e produtos múltiplos. Usando a

notação de Cleland, este mecanismo pode ser representado de forma esquemática como na

Figura 17.

Figura 17 – Mecanismo cinético (Ping Pong Bi Bi) de reações com múltiplos produtos e substratos catalisadas

por lipases (E: enzima; Es: éster; Al: álcool; Ac: ácido; W: água; i = 1,2,...,I; j=1,2,...,J) (Reproduzido de

PAIVA, BALCÃO e MALCATA, 2000).

Segundo o mecanismo Ping Pong Bi Bi, a taxa de hidrólise (r) de um éster gerando um

ácido e um álcool, considerando a inibição pelo substrato e pelo produto, pode ser

genericamente descrita através da Equação 8 (PAIVA, BALCÃO e MALCATA, 2000).

AcAlK

vAcW

K

vKAlEs

KK

vKWEsv

AcK

vKAl

K

vKWKvEsKv

K

AcAlWEsvv

r

eq

f

Acii

rEsm

Esiieq

fAcm

r

eq

fAlm

eq

fAcm

EsmrWmr

eq

rf

max,

,

max,,

,

max,,

max,

max,,max,,

,max,,max,

max,max,

(Eq.8)

onde, Ac: ácido; Al: álcool; Es: éster; W: água; os subscritos f e r denotam o sentido

direto (hidrólise) e reverso (síntese) das reações, respectivamente; e max,f; max,r; Keq; Km,Ac;

Km,Es; Ki,Es; Km,W; Km,Al e Ki,Ac são parâmetros globais relativos às taxas máximas, constante

de equilíbrio, constantes de Michaelis-Menten e constantes de inibição, respectivamente, que

podem ser ajustados independentemente a partir de dados de concentração de produtos e

reagentes.

Quando água está presente em grande excesso no meio reacional (concentração de

água permanece constante), a equação genérica que descreve o mecanismo Ping Pong Bi Bi

pode ser simplificada em uma expressão bem mais simples, semelhante a expressão de taxa de

reação de Michaelis-Menten, representada pela Equação 9 (PAIVA, BALCÃO e MALCATA,

2000):

Es Al W Ac E E.Es F.Al F F.W E.Ac E

K1 K-1 K2 K-2 K3 K-3 K4 K-4

38


EsK

Esvr

aparentem

aparente

,

max,

(Eq.9)

onde, max,aparente definida como max,f[W]/(Km,W + [W]) denota a taxa máxima

aparente da reação no sentido direto (hidrólise) e Km, aparente definido como Km,Es[W]/(Km,W +

[W]) denota uma constante de Michaëlis-Menten aparente.

A Figura 18 apresenta de forma esquemática as etapas de hidrólise catalisada por

lipases e os estados transientes formados (Modificado a partir de BORNSCHEUER e

KAZSLAUSKAS, 2006b e SIMAS et al., 2011).

Figura 18. Esquema da reação de hidrólise de ligações éster catalisada por esterases e lipases. Onde Td1 e Td2

representam o primeiro e o segundo intermediários tetraédricos. (Modificado a partir de BORNSCHEUER e

KAZSLAUSKAS, 2006b e SIMAS et al., 2011).

A participação dos resíduos de aminoácidos da tríade catalítica da lipase é de extrema

importância para que uma determinada reação ocorra. A primeira etapa que precisa ocorrer é a

ativação do grupo hidroxila do resíduo de aminoácido serina a partir da ligação hidrogênio

com a histidina vizinha. Como consequência da reação, o resíduo de aminoácido serina libera

um próton, que é aceito no anel imidazólico da histidina (2ª etapa). Após este processo ocorre

39


a interação do terceiro resíduo de aminoácido, o aspartato (ou glutamato), o qual estabiliza a

carga positiva formada na histidina. Com isso, haverá um ataque nucleofílico ao átomo de

carbono da carbonila do primeiro substrato. Se considerarmos uma reação de hidrólise, por

exemplo, o ataque nucleofílico será do carbono da carbonila de um éster, quebrando a ligação

π do grupo C=O, resultando na formação do complexo do primeiro intermediário tetraédrico.

O complexo do primeiro intermediário tetraédrico formado é estabilizado por ligações

hidrogênio com os grupos amida dos resíduos da cavidade do oxiânion. O intermediário

tetraédrico é desfeito, pelo retorno da ligação π (C=O) e conseqüente quebra da ligação éster.

O primeiro produto, álcool, produzido na reação de clivagem é liberado.

Após a liberação do primeiro produto ocorrerá a formação do intermediário covalente

(enzima acilada), onde o componente ácido do substrato encontra-se esterificado com o

resíduo serina da enzima. O segundo substrato, molécula de água ou álcool, que se aproxima é

ativada pelo resíduo histidina vizinho e o íon hidroxila resultante promove o ataque

nucleofílico ao átomo de carbono da carbonila formando o complexo do segundo

intermediário tetraédrico. O retorno da ligação π (C=O), desfaz o complexo do segundo

intermediário tetraédrico e finalmente ocorre a liberação do segundo produto, ácido

carboxílico ou éster, e da enzima livre.

3.3.7 Aplicação das lipases

Lipases são as enzimas comumente mais empregadas em biotecnologia e representa

atualmente cerca de 5% do mercado mundial de enzimas. Certamente, este percentual tende a

crescer de forma constante devido às suas aplicações em diversas áreas industriais, incluindo

aplicações em síntese orgânica, resolução de compostos racêmicos, energia e alimentos. Fato

no qual torna cada vez mais proeminente o interesse industrial por esses biocatalisadores

(CHOWDARY, RAMESH e PRAPULLA, 2001; LEAL et al., 2002; BARON, 2003;

CAMAROTA e FREIRE, 2006; TAN et al., 2010; RIBEIRO et al. 2011; YENIAD, NAIK e

HEISE, 2011; KAPPOR e GUPTA, 2012; SOLANO et al., 2012; GOSWAMI, BASU e DE,

2013; SOUMANOU, PÉRIGNON e VILLENEUVE, 2013, CUNHA et al., 2014).

Há inúmeras razões para o interesse nessas enzimas, como por exemplo, a capacidade de

atuarem em meios heterogêneos e poderem catalisar reações diversas como hidrólise,

esterificação (CHOWDARY, RAMESH e PRAPULLA, 2001), transesterificação, acilação

regioseletiva de mentóis e pentóis, síntese de peptídeos (ZHANG et al. 2001) etc. Além disso

podem ser empregadas sob condições suaves de reação apresentando alta químiosseletidade,

40


regiosseletividade e enantiosseletividade, capacidade de aceitarem um grande número de

substratos não naturais (SNELLMAN, SULLIVAN e COLWELL, 2002; KAPPOR e

GUPTA, 2012), não necessitarem de cofatores (BORNSCHEUER e KAZLAUSKAS, 2006b)

etc.

As condições mais sustentáveis oferecidas pelo uso de tecnologias biocatalíticas frente aos

processos químicos (como o reuso do biocatalisador, uso de materiais biodegradáveis, de alta

economia (economia de átomos, alta seletividade etc.), condições brandas (em relação à

temperatura, pressão e pH) fazem com que estes biocatalisadores sejam uma alternativa

interessante. Devido a estes e a outros fatores, estas enzimas possuem um alto potencial de

utilização sendo utilizadas em diferentes setores industriais. Algumas áreas deste setor estão

citadas na Tabela 2.

Tabela 2. Principais áreas aplicações, produtos e tipos de reações desempenhadas pelas lipases

Tipos de reações Áreas de

aplicação

Aplicações Produtos Referências

Hidrólise

Alimentos

(latícinios)

Hidrólise da

gordura

do leite

Agentes

flavorizantes

para

queijos e

derivados.

VILLENEUVE et

al., 2000;

HASAN et al.,,

2006;

BARROS et al.,

2010.

Química

(Processamento

do Óleo)

Hidrólise de óleos

e gorduras

Ácidos graxos,

diglicerídeos e

monoglicerídeos

(emulsificantes,

reagentes para

análise de

lipídios)

OSÓRIO et al.,

2001;

UNDURRAGA,

MARKOVITS e

ERAZO,

2001; HASAN et

al., 2006;

VILLENEUVE et

al., 2000; SILVA

et al., 2003.

Química

(Detergente)

Remover

manchas

de óleo

Detergentes para

lavanderias e

uso

SHARMA,

CHISTI e

BANERJEE,

2001; KIRK,

BORCHERT e

FUGLSANG,

2002a; HASAN

41


doméstico SHAH e

HAMEED, 2006.

Tratamento de

efluentes

Hidrólise de

lipídeos,

proteases,

celulases,

matérias

orgânicas etc.

Ácidos graxos,

triglicerídeos

CAMMAROTA e

FREIRE, 2006;

DAMASCENO,

et al. 2012;

SILVA, et al.

2013;

CAMMAROTA,

et al. 2013.

Esterificação

Química

Fina

Síntese de ésteres Intermediários

quirais

ésteres,

emulsificantes

BUCALÁ et al.,

2006;

FERNANDES et

al., 2004;

ROMERO et al.,

2005;

TRUBIANO,

BORIO

e FERREIRA,

2004;

FERNANDES et

al.,

2006; FORESTI e

FERREIRA,

2006;

HASAN, SHAH e

HAMEED, 2006;

YENIAD, NAIK

e HEISE, 2011;

MANOEL et al.

2012a;

CUNHA et al.

2014.

Química

Alimentos

Esterificação ou

transesterificação

Óleos ou

gorduras.

Flavorizantes e

aromatizantes.

HASAN, SHAH e

HAMEED, 2006

42


O alto custo na preparação destas enzimas pode ser considerado como uma das

principais desvantagens desta tecnologia. Contudo, com os avanços de outras tecnologias,

como a da engenharia de imobilização de enzimas, surgem alternativas que permitem reciclos

cada vez eficientes destes biocatalisadores e aumentam a atividade enzimática, o que resulta

em melhor relação custo-benefício para um determinado processo (DÍAZ-RODRÍGUEZ e

DAVIS, 2011; BRUSTAD e ALNOLD, 2011; BOMMARIUS, BLUM e ABRAHAMSON,

2011).

3.3.8 Aplicação de lipases na síntese de fármacos

A importância da quiralidade tem aumentado nas últimas décadas e é hoje o foco

central das indústrias farmacêutica e de química fina, especialmente no desenvolvimento de

novas moléculas bioativas. O valor de mercado para tecnologia quiral atingiu cerca de 2,7

Química

Farmacêutica

Síntese de

intermediários de

medicamentos

preparação

de intermediários

homoquirais

substâncias

antiinflamatórias

como

naproxeno,

ibuprofeno,

cetoprofen,

suprofen.

Intermediários

para substâncias

anti- asmáticas.

WILKINSON e

BACHMANN,

2006;

JAEGER e

EGGERT,

2002; ZHANG et

al.,

2002;

BEVILAQUA et

al., 2004 e 2005

Transesterificação

Biocombustíveis Transesterificação

de óleos vegetais

Biodiesel ABIGOR et al.,

2000; ISO et al.,

2001;

SHIMADA et al.,

2002; ZHANG et

al., 2002;

SALIS et al.,

2003;

HSU et al., 2004;

SOUZA et al.,

2010

CAVALCANTI-

OLIVEIRA et al.,

2011.

43


bilhões de dólares nos EUA em 2007, com uma taxa de crescimento anual de 10,8%

(GHANEM et al., 2010). Em 2008 este valor foi para 4,3 bilhões de dólares, com um aumento

de 3,3% de crescimento no ano seguinte (4,5 bilhões de dólares em 2009). Já em 2011, o

mercado global de tecnologia quiral foi de quase US $ 5,3 bilhões. Estima-se que o mercado

deverá aumentar a uma taxa CAGR de 6,5% de 2011-2016 e alcançará 7,2 bilhões dólares até

o final do período de previsão (Figura 19) (AHMED et al., 2012; DEWAN, 2012).

Figura 19. Mercado mundial de tecnologia quiral por segmentos: Síntese quiral, análise quiral e resolução quiral

(Reproduzido de DEWAN, 2012).

Impulsionado pela importância da quiralidade na eficácia de inúmeros produtos

agroquímicos e farmacêuticos, estabelecida pelas legislações brasileira e de outros países, o

interesse pela produção de um único enantiômero a partir de intermediários quirais tem

aumentado significativamente (SKORIDOU et al., 2004). As exigências são em relação à

separação dos enantiômeros em um racemato, ao estudo dos efeitos biológicos dos

enantiômeros e a comprovação dos efeitos tóxicos e adversos dos enatiômeros e do racemato,

dependendo do composto quiral. A FDA (U.S. Food and Drug Administration, RockVille,

EUA) determina para um dado produto se ele pode ser comercializado como racemato ou

como enantiopuro, baseado em protocolos estabelecidos para a classe ou utilização deste

composto quiral (FDA, 2009). No Brasil, a comercialização de medicamentos quirais é

regulamentada pela ANVISA seguindo normas da RDC (Resolução da Diretoria Colegiada)

que dispõem sobre comercialização e uso de medicamentos (ANVISA, 2012).

44


Ao analisar potenciais fármacos, a pureza enantiomérica faz-se necessária, uma vez

que o antípoda ótico pode não apresentar atividade ou mesmo produzir efeitos indesejáveis no

processo biológico, como o caso discutido anteriormente sobre a Talidomida (vide pag. 19).

Dentre as inúmeras serino-hidrolases que catalisam as biotransformações, as lipases

são as mais empregadas na síntese orgânica de processos industriais de substâncias quirais

pelas grandes companhias farmacêuticas, tais como Pfizer, Schering-Plough, GlaxoSmithkline

Pharmaceuticals, Bristol-Myers Squibb, DSM, Tanabe Pharmaceutical, Celltech Group etc.

As lipases mais empregadas são produzidas por: Candida rugosa (também conhecida como

Candida cylindracea); Candida antarctica , uma das enzimas de maior versatilidade no

campo da biotransformação com destaque em duas diferentes isoformas, CALA e CALB;

Pseudomonas fluorescens, uma das mais empregadas na resolução de compostos racêmicos;

lipase pancreática (suína) provavelmente a mais econômica do mercado; Pseudomonas

cepacia, biocatalisador que tem se mostrado bem seletivo; Serratia marcescens, menos

utilizada e conhecida, porém igualmente utilizada por algumas companhias na preparação de

intermediários quiral (SOLANO et al., 2012).

A lipase de Candida rugosa foi utilizada como catalisador na síntese dos seguintes

anti-flamatórios não esteroidais (AINEs ou no inglês NSAIDs): ácido (S)-2-arilpropionico e o

(S)-ibuprofeno (ácido(S)-2-4-isobutilfenil propanóico), isômeros ativos produzidos. A

companhia americana Pfizer desenvolveu um processo industrial do (S)-ibuprofeno a partir da

hidrólise enantiosseletiva do correspondente racêmico metoxi-metil ester pela lipase

mencionada em sua forma imobilizada em reator de membrana. O isômero ativo é produzido

em escala de kg com 90% de rendimento e eep igual a 99% (SHELDON, 1993).

A empresa americana Celltech Group utilizou a lipase de Pseudomonas fluorescens

(SOLANO et al., 2012) na síntese de (1S, 4R)-1-acetoxi-4-(trifenilmetoximetil)-ciclopent-2-

en- (composto (+)-3 da Figura 20), um intermediário necessário na síntese do nucleosideo

similar ao Carbovir, um antiviral usado no tratamento da AIDS (EVANS et al., 1992). Os

autores utilizaram acetato de vinila como agente acilante na reação de alcoólise por 75h, em

temperatura ambiente (22% de conversão e eep maior que 95%).

45


Figura 20. Reação enantiosseletiva de (±)-9 catalisada pela lipase de Pseudomonas fluorescens, utilizando

acetato de vinila como agente acilante em 75h a temperatura ambiente (Modificado de EVANS et al., 1992).

Busto et al., (2012) utilizaram as lipases CALB, CAL-A e PSC (Pseudomonas cepacia

atual Burkholderia cepacia) na resolução cinética de (±)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol-3-ol,

um intermediário da síntese de Ramatroban, substância ativa com potencial farmacológico,

que é comercializado no Japão para tratamento de rinite alérgica e asma. CALB, mostrou-se

ser a lipase mais promissora catalisando a conversão de 50% do racemato supra-citado com

alto excesso enantiomérco e razão enantiomérica (eep de 99% e E maior que 200). Os autores

obtiveram em 8 horas o isômero R, que foi posteriormente usado na síntese do Ramatroban,

como ilustrado na Figura 21.

Figura 21. Resolução cinética de (±)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol-3-ol catalisado por CALB utilizando acetato

de vinila em THF a 250rpm (Reproduzido por BUSTO et al., 2012).

46


CALB tem sido empregada na desimetrização do composto proquiral dietil3-(3’, 4’-

diclorofenil) glutarato para obter (S)-3-(3,4-diclorofenil)-5-etoxi-5- acido oxopentanoico, um

intermediário quiral na síntese do antagonista dos receptores de taquicinina, NK 1 e NK2,

compostos utilizados no tratamento contra asma, artrite e enxaqueca (HOMANN et al., 2001).

Os autores obtiveram 80% de conversão e alto excesso enantiomérico (maior que 99%). A

empresa Schering-Plough tem realizado este processo com um aumento de escala (produção

de 200 kg) obtendo os mesmos rendimentos que os autores (SOLANO et al., 2012).

A resolução racêmica de 1-Ciclopropil-2-metoxietanamina (1) foi estudada por

PARKER et al., (2012) igualmente utilizando a CALB (Figura 22). Os autores utilizaram

caprato de etila (2) como agente acilante e TBME como solvente da reação. Após 120h de

reação, o isômero (S)-1- Ciclopropil -2- metoxietanamina (3) foi obtido com 35% (91,3% de

eep). Este intermediário é necessário para a síntese de um factor de libertação do hormônio

corticotropina-1, receptor antagonista, mediador de resposta ao stress celular (BORSODY e

WEISS, 1996).

Figura 22. Resolução racêmica de (1) catalisado por CALB após 120h de reação (Reproduzido de PARKER et

al., 2012).

β-hidroxinitrilas quirais são comumente utilizados como intermediários utilizados em

síntese orgânica. O isômero (R)-3-hidroxipentanitrila, por exemplo, é um importante

intermediário na síntese do imunossupressivo inosina 5´monofosfao dehidrogenase, no qual

um excesso enantiomérico maior que 99% é requerido. A lipase de Pseudomonas cepacia tem

sido empregada no melhoramento da atividade óptica do isômero ativo de interesse. Kawano

et al., (2012) realizaram a síntese de (R)-3-hidroxipentanitrila através de uma redutase todavia

um eep de 81,5% foi obtido. Posteriormente a lipase de Pseudomonas cepacia foi utilizada na

hidrólise enantiosseletiva (Figura 23) resultando na máxima enaniosseletividade requerida

para o processo (99% de eep).

47


Figura 23. Síntese de (R)-1 e aperfeiçoamento da enantiosseletividade utilizando lipase de Pseudomonas cepacia

(Modificado por KAWANO et al., 2012).

Recentemente, Fernandez-Alvaro et al. (2014) utilizaram CALB na hidrólise

enantiosseletiva de compostos tetrahydropyrazolo[1,5-α]pirimidina (THPPs). Os produtos

enantiomericamente puro são importantes agentes terapêuticos contra tuberculose, hepatite C

e osteoporose. Os autores obtiveram altos valores de conversão e de excesso enantiomérico

para os derivados utilizados (51% e >93%, respectivamente).

3.3.9 Lipases promissoras para o estudo dos derivados de mio-inositol

Lipases de Candida antarctica

Nos últimos anos, a lipase comercial de Candida antarctica fração B demonstrou ser o

melhor biocatalisador para as reações de acetilação para alguns derivados de mio-inositol

(SIMAS et al., 2011; CUNHA et al., 2011; CUNHA et al., 2012). Por este motivo, este

biocatalisador será melhor descrito.

A lipase B de Candida antarctica (CALB) é dentre diversas enzimas, uma das mais

utilizadas em biocatálise (KIRK e WURTZ, 2002; BORNSCHEUER e KAZLAUSKAS,

2006b; DUNN, WELLS e WILLIAMS, 2010; BOROS et al. 2013). A CALB é altamente

regiosseletiva na síntese de monoésteres de hidratos de carbono e enantiosseletiva na

resolução de inúmeros compostos como aminas, ácidos e álcoois (KOTIK et al., 2005).

CALB apresenta diversas aplicações como a síntese de ésteres constituintes de flavors

e fragrâncias (LARIOS et al., 2004), resolução de compostos nitrogenados utilizados na

produção de fármacos e manufaturados no setor industrial (GOTOR-FERNANDEZ et al.,

48


2006b). C. antarctica é considerada uma levedura extremófila, pois está adaptada a

temperaturas baixas, e inúmeros pesquisadores buscam o aumento da estabilidade térmica de

sua lipase (SIDDIQUI e CAVICCHIOLI, 2005). CALB se encontra disponível no mercado na

forma livre ou imobilizada (imobilização por adsorção). A lipase comercial de C. antarctica,

denominada Novozym 435, corresponde a CALB imobilizada em resina acrílica macroporosa

(DU et al., 2004).

CALB tem uma massa molecular de 33 kDa e a enzima disponível comercialmente

contém 16-51% em peso de proteína. É uma lipase constituída por 317 aminoácidos, três

pontes dissulfeto e pela tríade catalítica Ser 105- His 224- Asp 187. Sua estrutura terciária

com dobramento de α/β hidrolase apresenta uma tampa hidrofóbica (lid) curta e flexível que é

responsável pelas conformações aberta e fechada. Simulação por dinâmica molecular vem

mostrando um potencial para a região do sítio catalítico devido a flexibilidade e a poucas

alterações conformacionais da posição α5, presente na lid. Apesar de CALB ser conhecida por

não apresentar ativação interfacial, alguns autores relatam a possibilidade da lipase sofrer

algum tipo de ativação. Este fenômeno pode ser explicado pela conformação da enzima:

atuação da posição α5 da lid (141-147: AGPLDAL)) e a posição α10 (280-

288:PAAAAIVAG), que funciona como um elemento de ativação (Figura 24). Estes dois

dobramentos da lid constroem um estreito sítio ativo hidrofóbico com os clássicos resíduos de

aminoácidos supracitados (UPPENBERG et al., 1994; WEBER et al., 1995b; UPPENBERG

et al., 1995; SKJOT et al., 2009, FERRARIO, et al., 2011; GANJALIKHANY et al., 2012).

Figura 24. Estrutura tridimensional da lipase B de Candida antarctica (CALB) em sua forma aberta (A) e

fechada (B). Região da tampa hidrofóbica (em azul) representa os dobramentos da hélice (α5, compartimento

superior em (A) e α10, compartimento inferior em (A) ). (Reproduzido por GANJALIKHANY et al., 2012).

49


A lipase de CALB é uma proteína recombinante expressa em fungo do gênero

Aspergillus (HOEGH et al., 1995). A lipase possui alta atividade e elevada

enantiosselectividade para uma vasta gama de álcoois. Sua enantioseletividade geralmente é

baixa para ácidos carboxílicos (ANDERSON et al., 1998).

Lipase B de Candida antarctica expressa em Pichia pastoris (LIPB)

Os Laboratórios de Biologia Molecular (CEL-UnB) e Laboratório de Biotecnologia

Microbiana (IQ-UFRJ), coordenados pelos professores Fernando Araripe Torres e Denise

Maria Guimarães Freire, recentemente clonaram, expressaram e produziram com sucesso o

gene LIPB, referente a lipase B de Candida antarctica em P. pastoris. Apesar da lipase

comercial CALB (Candida antarctica fração B) ser glicosilada, esta glicosilação não é

necessária para manter a atividade hidrolítica da lipase (BLANK et al., 2006). A glicosilação

é uma das mais comuns modificações pós-traducionais de proteínas em sistemas biológicos,

afetando não somente as propriedades das proteínas em seus vários níveis, mas também a

interação entre a proteína com o sistema biológico (SOLÁ et al., 2007). Assim como a CALB,

a lipase LIPB, produzida pelo grupo, possui uma proteína glicosilada no resíduo Asn 74

(GUTARRA et al., 2011). O vetor de expressão utilizado foi o pPGKΔ3_PRO_LIPB, que

utiliza o promotor constitutivo da enzima fosfogliceratoquinase de P. pastoris, da via

glicolitica. Assim a expressão não precisa de indutor e a produção da enzima é associada ao

crescimento celular (ARRUDA, 2008).

A levedura Pichia pastoris foi selecionada como plataforma de expressão, pois sendo

um micro-organismo eucarioto, é capaz de realizar modificações pós traducionais na enzima,

as quais não são possíveis em sistemas de expressão bacterianos. Além disso, a levedura

Pichia pastoris possui uma alta capacidade de secreção de proteínas (GELLISSEN et al.,

2000). A proteína secretada por P. pastoris pode ser purificada a partir do sobrenadante do

meio de cultura e então caracterizada.

Os resultados obtidos, com a caracterização preliminar deste biocatalisador,

principalmente por sua seletividade e termoestabilidade, foram patenteados em cooperação

com a PETROBRÁS e apontam para a potencialidade de sua aplicação em diversos processos

biotecnológicos (CASTRO et al., 2009). Contudo, por se tratar de um produto com alta

densidade tecnológica e valor agregado, possivelmente sua melhor utilização (relação

custo/benefício) se dará em processos envolvendo produtos finais, igualmente com elevado

valor agregado, como intermediários de fármacos e/ou química fina.

50


3.3.10 Fatores que podem influenciar a estereosseletividade das lipases

O processo da biocatálise depende de diversos fatores que podem influenciar a

enantiosseletividade da reação. Para que ocorra a biotransformação com eficiência, alguns

fatores devem ser avaliados (ANTHONSEN et al., 2005; BORNSCHEUER e

KAZLAUSKAS, 2006b):

1) Biocatalisador: enzima livre ou imobilizada, ou até mesmo a utilização da própria

célula do micro-organismo (whole cell). Novos biocatalisadores têm sido estudados

por meio da engenharia genética com o objetivo do aumento da enantiosseletividade

para um determinado processo específico. A purificação de enzimas a partir de um

meio bruto também é utilizada para esta finalidade (ANTHONSEN et al., 2005;

BORNSCHEUER e KAZLAUSKAS, 2006b; LUETZ, GIVER e LALONDE, 2008;

BOTTCHER e BORNSCHEUER, 2010; KOURIST, BRUNDIEK e

BORNSCHEUER, 2010; BOMMARIUS, BLUM, e ABRAHAMSON, 2011).

Geralmente, como primeira etapa quando não se tem a idéia do biocatalisador a ser

empregado, uma seleção (screening) dos catalisadores é realizada (QUARTEY et al.,

1996), com uma posterior escolha do mais enantiosseletivo e produtivo.

2) Substrato: O procedimento mais utilizado na química orgânica é a utilização de

substratos ligeiramente modificados com grupos de proteção, que são facilamente

removidos ou manipulados no meio da reação.

3) Meio reacional: A literatura apresenta muitos trabalhos que mostram o estudo do

aumento da enantiosseletividade com a alteração deste fator. O estudo de diferentes

meios reacionais envolve, dentre inúmeros fatores, otimização de solventes, análises

da atividade de água e diferentes agentes acilantes utilizados nas reações de

transesterificação e alcoólise (CHEN e SIH, 1989; FABER, OTTOLINA e RIVA,

1993, MANOEL et al., 2012a).

O sucesso da reação enzimática dependerá dos estudos destes e de outros fatores. Por isso

alguns pontos relevantes serão mencionados sobre os tópicos supramencionados.

51


Quanto ao Biocatalisador: Tecnologia da Imobilização de Enzimas

Breve Histórico

O processo de imobilização tem sido realizado no início do século passado quando

Nelson e Griffin (1916) observaram pela primeira vez o fenômeno da imobilização por meio

do aprisionamento da invertase em carvão ativo. A base para as tecnologias atuais teve início

em 1960s com um aumento considerado no número de publicações (TOSA et al., 1966).

Entretanto somente em 1971, motivado pela importância nos processos industriais, que o

conceito de enzima imobilizada foi estabilizado como sendo ―enzimas ligados a suportes

insolúveis confinados a espaços físicos definidos‖ -na primeira conferência de Engenharia

Enzimática em Henniker (USA) por Katschalski-Katzir (HARTMEIER, 1988 apud CASTRO

et al. 2008; GUISÁN, 2006)-na qual são mantidas suas atividades catalíticas em processos de

operação contínuo ou descontínuo, com a possibilidade de reutilização das mesmas

(FREEMAN e LILLY 1998).

Importância Industrial

Os setores acadêmicos e industriais têm se dedicado ardualmente à obtenção de

melhores biocatalisadores como alta enantiosseletividade e estabilidade frente a diferentes

condições reacionais, quer seja a aplicação, pequena ou em larga escala (HARTMANN e

JUNG 2010).

Uma enzima pode ser considerada útil para uma determinada reação em sua forma

livre (em suspensão ou liofilizada), todavia a instabilidade do biocatalisador muitas vezes é

prejudicada pelas condições de processos aplicados (como efeito de solvente que podem

desnaturar a enzima, efeitos mecânicos, custo da produção, difícil recuperação do

biocatalisador etc.). A tecnologia de imobilização, ou ―aprisionamento‖ do biocatalisador, é

empregada como ferramenta para melhorar as propriedades da enzima, como o aumento da

atividade catalítica e/ou enantiosseletividade (BAGI e SIMON 1999; BORNSCHEUER e

KAZLAUSKAS, 2006b; GUISÁN, J. M. 2006; BAI et al. 2006b, DESAI et al. 2006;

MATEO et al., 2007; PALOMO et al. 2007; KOSZELEWSKI et al. 2007; PAULA et al.

2007; CABALLERO et al. 2009a; LEE et al. 2009; HARTMANN e JUNG 2010; LU et al.

2010; ZOU et al. 2010; RUFINO et al. 2010; HE et al. 2010; XU et al. 2011; WANG et al.

2011; CALGAROTO et al. 2011; HERNÁNDEZ et al. 2011; RODRIGUES et al. 2011;

MENDES et al. 2012).

Novos métodos de imobilização surgem constantemente sendo o principal objetivo o

reuso do biocatalisador e a possibilidade da realização em processos contínuos. A viabilidade

52


do biocatalisador para sua aplicação industrial dependerá do seu custo, do suporte e do

método de imobilização a ser empregado. Como resultado, a enzima imobilizada apresenta

uma série de vantagens como a recuperação do biocatalisador no meio reacional para sua

possível reutilização, a possibilidade do aumento da atividade enzimática, do aumento da

enantiosseletividade e estabilidade térmica (GUISÁN, J. M. 2006; LU et al. 2010, ZOU et al.

2010, RUFINO et al. 2010, HE et al. 2010; XU et al. 2011; WANG et al. 2011;

CALGAROTO et al. 2011; HERNÁNDEZ et al. 2011; RODRIGUES et al. 2011; MENDES

et al. 2012).

Atualmente, diferentes estratégias como técnicas da engenharia genética, evolução

sítio dirigida, modificação química sítio-dirigida de proteínas, uso de líquidos iônicos como

suporte de imobilização e como solvente, nanotecnologia (através de inovadores

nanomateriais para imobilização de enzimas) etc. tem sido descritas e utilizadas por diferentes

autores para aumentar a performance dos derivados enzimáticos imobilizados (WANG et al.

2009; XU et al. 2009; GODOY et al. 2010; LEE et al. 2012; BUCKO et al. 2012; LIMA et al.

2013).

Vantagens da técnica de imobilização

Como já relatado anteriormente, o uso de enzimas imobilizadas tem sido utilizado e

estudado extensivamente por facilitar o desenvolvimento de processos, principalmente em

escala comercial (TISCHER e KASCHE, 1999, HARTMANN e JUNG 2010). Este processo

oferece vantagens importantes nos setores industriais. As principais vantagens apontadas por

diversos autores (FREIRE, 1988; KATCHALSKI-KATZIR, 1993; BENJAMIN e PANDEY,

1998; VILLENEUVE et al., 2000; MATEO et al., 2007) são:

Facilidade de recuperação do biocatalisador e separação de produtos. As técnicas

empregadas na separação do biocatalisador imobilizado do meio reacional são

operações unitárias simples, como filtração, centrifugação ou decantação, facilitando a

aplicação de enzimas imobilizadas em biocatálise, principalmente quando o

biocatalisador apresentar alto custo, pois estes poderão ser reutilizados.

Biocatalisadores imobilizados podem ainda ser indicados quando um produto final

requerer elevado grau de pureza, pois o procedimento de separação entre a mistura

reacional e o biocatalisador são operações unitárias simples, como mencionado

anteriormente.

53


Processo pode ser operado continuamente. A facilidade em se reter o biocatalisador

permite que processos contínuos sejam implementados, utilizando reatores variados,

como os reatores tubulares (Plug Flow Reactor - PFR) ou reatores tanques de agitação

(Continuous Stirred-Tank Reactor –CSTR) e o controle do processo é facilitado.

Previne a formação de agregados em meio orgânico. A imobilização de enzimas

surge como uma alternativa às enzimas livres, uma vez que estas, quando suspensas

em um solvente orgânico, tendem a se agregar e aderir às paredes do reator,

principalmente se for adicionado água ao sistema.

Manutenção de microambiente com alta atividade de água. O processo de

imobilização permite a manutenção de uma camada de solvatação no microambiente

em torno da enzima capaz de manter uma dinâmica molecular, mínima, essencial à

atividade enzimática em ambientes orgânicos.

Estabilização da enzima. A imobilização da enzima sobre diferentes suportes pode

aumentar a rigidez da estrutura molecular minimizando a ocorrência de desnaturação

por temperatura, pH ou solvente.

Propriedades enzimáticas podem ser alteradas favoravelmente. A interação entre a

enzima e o suporte pode ocasionar mudanças conformacionais na enzima, podendo

gerar alterações desejadas nas propriedades catalíticas, por exemplo, o aumento da

atividade e estereoespecificidade da enzima.

Custos com manejo de materiais são minimizados. O aumento da estabilidade da

enzima imobilizada facilita a sua estocagem e diminui as exigências para sua

manipulação.

Efeitos causados pelos processos de imobilização

O processo de imobilização normalmente modifica as propriedades físico-químicas da

enzima. A interação enzima-suporte pode causar alteração na estabilidade e nas propriedades

cinéticas da enzima imobilizada, seus principais aspectos serão apresentados a seguir

(FREIRE, 1988):

54


Efeitos conformacionais. Efeitos associados às modificações na conformação da

proteína devido às interações entre a enzima e suporte durante o processo de

imobilização covalente.

Efeitos estereoquímicos. A imobilização pode tornar certas regiões da enzima pouco

acessíveis ao substrato, causando um efeito de exclusão. Algumas propriedades do

suporte, tais como: natureza hidrofóbica ou hidrofílica, constante dielétrica e presença

de cargas fixas no suporte podem interferir na performance do biocatalisador. A

minimização desses efeitos pode ser realizada pela utilização de espaçadores capazes

de manter os sítios ativos da enzima mais distantes dos efeitos de exclusão do suporte.

Efeitos de partição. São os efeitos causados pela desigualdade na distribuição das

espécies químicas entre o microambiente e o seio do meio reacional. Esses efeitos

resultam de interações hidrofóbicas, hidrofílicas e eletrostáticas entre o suporte e o

substrato.

Limitações difusionais. Assim como ocorre com a catálise heterogênea, a ação

catalítica de enzimas imobilizadas pode ser dividida em pelo menos cinco etapas:

Difusão externa de substratos. Difusão do substrato do seio da fase

líquida até a superfície do suporte;

Difusão interna de substratos. Transporte do substrato da superfície

do suporte para o domínio da enzima;

Catálise. A catálise propriamente dita da reação química;

Difusão interna de produtos. Transporte do produto do domínio da

enzima para a superfície do suporte;

Difusão externa de produtos. Difusão do produto da superfície do

suporte para o seio do meio reacional.

As interações entre os efeitos supra-citados podem causar alterações das propriedades

enzimáticas. Dependendo do efeito que controla a reação, os parâmetros cinéticos podem ser

diferenciados. Esses parâmetros podem ser classificados em três categorias principais

(FREIRE, 1988):

Parâmetros cinéticos intrínsecos. Parâmetros que refletem o comportamento cinético

verdadeiro da enzima imobilizada. Esses parâmetros só podem ser determinados no

55


macro-ambiente, caso a concentração de substrato e produto seja a mesma do

microambiente. Devido à existência de efeitos conformacionais e estereoquímicos, os

parâmetros cinéticos intrínsecos da enzima imobilizada geralmente são diferentes dos

parâmetros da enzima solúvel.

Parâmetros cinéticos inerentes. Esses parâmetros refletem o comportamento cinético

da enzima na ausência de limitações difusionais e só podem ser determinados quando

o transporte de substratos e produtos ocorrer de forma infinitamente rápida. Essa

condição pode ser alcançada na prática, pelo uso de membranas finas, enzimas com

baixa atividade e agitação suficiente do meio reacional. Os parâmetros cinéticos

inerentes e intrínsecos diferem entre si devido a interação da matriz sólida com os

substratos e os produtos solúveis.

Parâmetros cinéticos efetivos. Parâmetros globais que refletem o comportamento da

enzima imobilizada na presença de efeitos difusionais, de partição, conformacionais e

estereoquímicos. Esses parâmetros são determinados a partir da velocidade da reação

nas condições experimentais normalmente empregadas.

Como relatado, a imobilização de uma enzima pode produzir distorções na estrutura

terciária da enzima com alteração da configuração do sítio ativo e redução da flexibilidade da

proteína, aprisionando-a em sua nova configuração. As enzimas que sofrem grandes

mudanças conformacionais durante a catálise podem ter estas mudanças distorcidas quando

imobilizadas, produzindo enzimas com propriedades catalíticas inteiramente diferentes

(MATEO et al., 2007). Portanto, para que seja possível utilizar a distorção da enzima como

ferramenta, é necessário obter uma grande quantidade de suportes e de protocolos de

imobilização que permitam investigar os diferentes tipos de imobilização, com o objetivo de

se ter o controle das modificações da estrutura terciária da enzima. Assim, a proteína pode ser

imobilizada a partir de diferentes regiões, conferindo diferença em sua rigidez e distorcendo a

enzima de maneiras muito diferentes. Os diferentes microambientes gerados em torno da

enzima durante o processo de imobilização podem alterar as propriedades físicas da enzima.

Desta forma, torna-se possível conseguir uma grande biblioteca de enzimas imobilizadas com

propriedades muito distintas (MATEO et al., 2007).

56


Protocolos de imobilização

A imobilização de enzimas tem sido feita em diferentes suportes inertes. Este processo

vem sendo utilizado para melhorar o desempenho do biocatalisador em relação a: facilidade

de recuperação e purificação de enzimas (via adsorção em suportes hidrofóbicos); ao aumento

da estabilidade térmica e pH; a redução da inativação do biocatalisador etc. Apesar de não

existir um método padrão para ser utilizado, a escolha do método pode ser feita com base em

critérios como a máxima atividade de enzima imobilizada, estabilidade operacional, custo do

suporte, toxidade do reagente de imobilização etc. (MALCATA et al., 1990, BRENA e

BATISTA-VIEIRA, 2006).

O suporte a ser utilizado no processo pode ser orgânico (natural: colágeno, celulose

etc. ou não natural: poliestireno) ou inorgânico (e.g.: sílica) e deve ter uma grande área

superficial, alta capacidade de adsorção enzimática, resistência física e resistência ao ataque

de micro-organismos, caráter hidrofóbico/hidrofílico, baixo custo além da característica

desejável de não apresentar limites difusionais no transporte de substrato e produto

(VILLENEUVE et al. 2000; NASRATUN et al., 2009; MING-MING ZHENG et al., 2013).

Não é possível definir um suporte ideal para todos biocatalisadores. Apesar de muitos

parecerem promissores na literatura, estes requerem ainda mais estudos e otimizações em seus

respectivos processos (CUNHA et al., 2014).

Existe uma grande variedade de materiais disponíveis no mercado para o processo de

imobilização, como por exemplo, SepabeadsR, SpherezymeTM, EupergitR etc. A interação

entre a enzima e o suporte fornecerá um biocatalizador imobilizado com diferentes

propriedades específicas: químicas, bioquímicas, mecânicas e cinética (MALCATA et al.,

1990, NASRATUM et al., 2009, ZHENG et al., 2013, GODOY et al., 2010,

BORNSCHEUER et al., 1994). As características físicas do suporte, como o tamanho do poro

e da partícula, estão relacionados com a capacidade de ligação da enzima ao mesmo. Apesar

de suportes não-porosos apresentarem baixo efeito difusional após a imobilização

(característica desejável), estes apresentam pouca capacidade de imobilização-carga de

enzima. Entretanto suportes porosos são preferíveis por apresentarem alta área superficial,

permitindo que ocorra uma grande quantidade de carga de enzima imobilizada, além do

processo de imobilização garantir a proteção da proteína do ambiente externo (BRENA e

BATISTA-VIEIRA, 2006).

A alteração das propriedades enzimáticas, que irão resultar na melhor performance,

está relacionada com os processos de imobilização que precisarão ser selecionados para tornar

a imobilização mais adequada para um determinado biocatalisador. Em alguns casos, o uso de

57


mais de um protocolo de imobilização pode ser a melhor solução para o aumento da eficiência

do biocatalisador em uma determinada reação (GARCIA-GALAN et al., 2011; SHELDON,

2011; COWAN e FERNANDEZ-LAFUENTE, 2011; RODRIGUES et al., 2011;

HERNANDEZ e FERNANDEZ- LAFUENTE, 2011).

Os métodos de imobilização vem sendo classificados de diversas formas segundo

critérios estipulados por diferentes pesquisadores (BRENA e BATISTA-VIEIRA; 2006;

KRAJEWSKA 2009; MILETIC et al., 2012; BUCKO et al. 2012, MENDES et al. 2012).

Basicamente, os métodos de imobilização podem ser classificados em imobilização por

ligação a superfície, como adsorção física, iônica e metálica; ligação covalente e

confinamento (Incorporação em redes poliméricas; em membranas ou inclusão em

membranas) que podem ser visualizados na Figura 25. Estes diferentes métodos vem sendo

empregados constantemente na literatura.

58


Figura 25. Métodos gerais de imobilização de biocatalisador: 1-Adsorção física; 2-Ligação covalente: A- Derivados monoméricos multipontuais, B- Derivado monomérico

unipontual, C- Derivado bimolecular multipontual (o círculo preenchido de amarelo representa o sítio ativo); 3-Cross-Linking; 4- Entrelaçamento em matrix polimérica; 5-

Encapsulamento em gel; 6- Ligação metálica, 7-Ligação por pontes dissulfeto, 8-9: Reator de membrana- 8- Enzima imobilizada na camada externa da membrana (item 8-

modificado a partir de LAU et al. 2010); 9- Membrana contém biocatalisadores imobilizados em seu interior (item 9-modificado a partir de NAGY, 2012).

59


Um resumo dos trabalhos mais atuais que utilizam diferentes metodologias para imobilização de lipases pode ser visualizado na Tabela 3.

Tabela 3. Relação dos trabalhos atuais que utilizam métodos e suportes distintos durante o processo de imobilização.

Métodos Suportes Biocatalisador Reação Referência

Adsorção física Octil-Sefarose Pseudomonas fluorescens Hidrólise Lima et al. 2013

Adsorção física Metil-Silica Candida rugosa Hidrólise Gao et al. 2009

Adsorção física Butil-agarose/Fenil-agarose/octil-agarose Pinicilium simplicissimum Hidrólise Cunha et al. 2009

Adsorção física Octil-agarose Burkholderia cepacia Hidrólise e alcoólise Kato et al. 2010

Adsorção física Nanopartículas de poli (estireno) Candida antarctica B Hidrólise Milétic et al. 2010

Adsorção física Polímeros de estireno e metil-metacrilato co-polimerados com DVB Candida antarctica B Alcoólise Cunha et al. 2014

Ligação covalente Poli (estireno)-co-divinilbenzeno ativada com glutaraldeído Thermomyces lanuginosus Hidrólise Dizge et al. 2008

Ligação covalente Poli(metacrilato)funcionalizado com grupos epoxi Candida rugosa Hidrólise Vaidya et al. 2008

Ligação covalente Copolímero de metacrilato glicidila e álcool polivinilico lipase de pancreas de porco Hidrólise Kartal et al. 2009

Ligação covalente Copolímero de metacrilato glicidila e dimetacrilato de etilenoglicol Candida antarctica B Hidrólise e esterificação Milétic et al. 2009

Ligação covalente polietileneimina (PEI)- espuma de poliuretano (PUF) Yarrowia lipolytica Hidrólise Cui et al. 2013

Ligação covalente Poli(álcool vinilico-co-etileno Candida rugosa Hidrólise Lima et al. 2013

Ligação covalente (multipontual) suportes glioxil sepabeads Pseudomonas fluorescens Hidrólise Lima et al. 2013

Cross-Linking Particulas de SiO2 Candida rugosa Esterificação Zheng et al. 2013

Encapsulação matriz silica-gel Bacillus sp. ITP-001 Hidrólise Souza et al. 2012

*DVB-Divinilbenzeno

60

Capítulo III – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Como visualizado na Figura 25, as imobilizações podem ser reversíveis ou

irreversíveis. A imobilização reversível pode ser por simples adsorção física, ligações iônicas,

metálicas ou por ligações que envolvam pontes dissulfeto. Nesta tese será focado a

imobilização por adsorção física, como parte dos objetivos da mesma.

Imobilização da enzima por adsorção física

O procedimento de adsorção física é um método que se baseia na imobilização de uma

proteína sobre um suporte sólido por ligações de baixa energia, tais como interações de Van

der Waals, iônicas e ligações hidrogênio. Este é um dos métodos mais utilizados por ser

considerado relativamente simples, econômico e rápido. A técnica consiste na incubação do

suporte em uma solução enzimática ou precipitação da lipase sobre a superfície do suporte

pelo uso de solventes (VILLENEUVE et al. 2000).

Suportes de naturezas distintas vem sendo utilizados para esta proposta, a saber,

polietileno, polipropileno, celite, resina sintética, celulose, octil-agarose, estireno, divinil-

benzeno, sefadex e outros (VILLENEUVE et al., 2000; PALOMO et al., 2002a,b;

AYBASTIER e DEMIR, 2010; HERNANDEZ, GARCIA-GALAN e FERNANDEZ-

LAFUENTE, 2011).

O sucesso e a eficiência da adsorção de uma proteína sobre um determinado suporte

dependerá de diversos parâmetros, como a área superficial do adsorvente, tamanho da

proteína a ser adsorvida e principalmente o tamanho e número dos poros. Portanto o uso de

suportes porosos pode ser considerado vantajoso para a técnica já que a enzima é adsorvida no

interior dos mesmos. A concentração da enzima (em termos de unidade de atividade) também

é outro parâmetro importante na eficiência da adsorção. Isso porque a quantidade de enzima

adsorvida por quantidade do suporte aumenta com a concentração da enzima livre até atingir a

um patamar de saturação (DALLA-VECCHIA et al., 2004).

A adsorção hidrofóbica de lipases sobre suportes porosos, ocorre via ativação

interfacial. Basicamente, a ativação interfacial ocorre quando as enzimas reconhecem estes

suportes como sendo uma interface hidrofóbica/hidrofílica, sofrendo ativação interfacial. Com

isso, tem-se a adsorção da proteína sobre os suportes por meio dos grandes bolsos

hidrofóbicos (formados pela face interna da tampa que recobre o sítio ativo) e da área

hidrofóbica próxima ao sítio da enzima, estabilizando a forma aberta e ativa da lipase (Figura

26) (BASTIDA et al., 1998; PAIVA et al., 2000; PALOMO et al., 2002). A imobilização

permite a fixação da lipase em sua conformação aberta, ou seja, o sitio ativo fica exposto pelo

deslocamento da lid, permitindo a acessibilidade de distintos substratos hidrofóbicos e

61


solúveis (FERNANDEZ-LORENTE et al. 2008; BYZOZOWSKI et al.1991; MATEO et al.,

2007).

Figura 26. Hiperativação de lipases sobre superfícies altamente hidrofóbicas (Modificado de PALOMO et al.,

2002).

Entretanto, se o substrato for muito grande ou hidrofílico, pode ocorrer impedimento

estereoquímico devido à proximidade da superfície do suporte hidrofóbico em relação ao sítio

ativo da lipase, reduzindo a atividade da enzima (MATEO et al., 2007). Geralmente a

adsorção hidrofóbica de lipases sobre suportes porosos ocorre na superfície. Os suportes

porosos possuem superfície interna inerte recoberta por espessas camadas bem definidas e

altamente hidrofóbicas a baixa força iônica (BATISDA et al., 1998; PAIVA et al., 2000;

PALOMO et al., 2002).

Como já supra-mencionado, o mecanismo de ativação interfacial das lipases pode ser

explorada no desenvolvimento de métodos de purificação. Lipases com pequenas diferenças

estruturais podem reconhecer interfaces hidrofóbicas de maneiras diferentes, modificando a

taxa e a força de adsorção. Esta diferença na afinidade por superfícies com graus de

hidrofobicidade distintos pode ser explorada para separar ou enriquecer diferentes isoformas

por adsorção seletiva, variando as condições experimentais como tempo de equilíbrio, pH,

força iônica e temperatura de equilíbrio da solução. Com isso, pode-se obter enzimas

purificadas e imobilizadas de forma eficiente (SABUQUILLO et al., 1998, FERNÁNDEZ-

LORENTE et al., 2001).

Pela técnica de imobilização por adsorção envolver interações fracas, torna-se possível

a dessorção do catalisador sem atividade e, consequentemente, a recuperação e reciclagem do

suporte com o uso de substâncias como detergente, ureia, guanidina, variação do pH, solução

salina, etc. A possibilidade da dessorção da proteína pode ser considerado uma vantagem

desta técnica de imobilização na recuperação de suportes de alto custo. Em contra-partida, a

possibilidade de dessorção pode ser considerado uma das principais desvantagens para a

técnica quando o biocatalisador está sendo utilizado no meio reacional, em sistemas aquosos.

62


Todavia essa dessorção pode ser minimizada em meio orgânico, uma vez que há baixa

afinidade entre enzimas e solventes orgânicos (principalmente os mais apolares) (PALOMO

et al., 2002).

A técnica de adsorção em suportes hidrofóbicos tem sido a mais empregada para

imobilização de enzimas em reatores contínuos e do tipo tanques agitados (SOARES, et al.

2007; SOUZA et al., 2012), a mais adequada para imobilização de lipases para uso em

solventes orgânicos e empregada em diferentes preparações industriais como na preparação da

CALB- Novozym 435 (CALB recombinante expressa em Aspergillus niger e imobilizada em

resina acrílica), comercializada pela Novozymes.

A técnica de adsorção de lipases em suportes hidrofóbicos tem sido bem relatada na

literatura como um fator chave para o melhoramento da enantiosseletividade

(BYZOZOWSKI et al.1991; MATEO et al., 2007; FERNANDEZ-LORENTE et al. 2008;

LIMA et al., 2013), sendo considerada ainda uma estratégia para modificação de

enantiopreferencia de muitas lipases. Palomo e colaboradores (2004) observaram que a

mesma lipase imobilizada sobre diferentes suportes, ou utilizando diferentes protocolos de

imobilização, pode exibir enantiosseletividade muito diferente e, em alguns casos, pode

ocorrer a modificação do enantiômero catalisado pela lipase sob as mesmas condições

experimentais.

Zhang et al. (2012) estudaram a influência das características das superfícies

hidrofóbica/hidrofílica na composição do suporte de imobilização e na atividade de CRL.

Diferentes proporções dos monômeros acetato de vinila (monômero hidrofóbico) e acrilamida

(monômero hidrofílico) foram utilizados na polimerização formando microesferas de Poli

(acetato de vinila–acrilamida). Quando as características das superfícies

hidrofóbica/hidrofílica das microesferas foram modificadas pela mudança na proporção de

acetato de vinila-acrilamida de 50:50 para 86:24, a eficiência de imobilização mudou de 45%

para 92% e a atividade da enzima imobilizada aumentou de 202,5 para 598,0 U/g. O processo

de imobilização resultou ainda em uma maior atividade específica (4.65 U/mg lipase) se

comparado com a enzima livre (3.00 U/mg lipase).

Zheng et al. (2013) confeccionaram um suporte por cross linking (Hyper-Cross-

Linked Polymer- Coated Silica com posterior imobilizacao de Candida rugosa (CRL) por

adsorção para síntese biocatalítica de ésteres fitoesteróis (composto ativo natural com

propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes, anti-cancerígenas etc.). A lipase imobilizada

(CRL-HPCS) mostrou uma estabilidade térmica e condições de reutilização do biocatalisador

superiores do que aquelas apresentadas pela enzima na sua forma livre (CRL). Alem disso, foi

63


possivel observar um alto valor de conversao do produto linolenato de fitostanila (95.6%) se

comparado com a lipase imobilizada em polímero de sílica (46,5%) (MING-MING ZHENG

et al. 2013).

A influência de lipases imobilizadas em suportes distintos submetidos a diferentes

processos de imobilização, tais como adsorção e ligação covalente, tem sido estudada na

hidrólise enantiosseletiva de (R,S) -2-hidroxi-4-fenilbutirato ester etílico [HPBET] (LIMA et

al. 2013, FERNANDEZ-LORENTE et al. 2008, PALOMO et al. 2005). O comportamento

frente a diferentes suportes, mesmo utilizando o mesmo método de imobilização, pode alterar

a especificidade, atividade e estabilidade do biocatalisador. Lipase B de Candida Antarctica

(CALB), lipase from Thermomyces lanuginose and lipase de Bacillus thermocatenulatus,

imobilizadas por ativação interfacial em quatro diferentes suportes hidrofóbicos (hexil- e

butil-toyopearl [resina hidrofílica] e ainda, butil- e octil-agarose, apresentaram diferentes

resultados de estabilidade, atividade recuperada (casos com hiperativação e outros com quase

a inativação do biocatalisador), especificidade e força de adsorção (FERNANDEZ-

LORENTE et al. 2008).

Lima et al. (2013) obtiveram maior atividade específica (1,2 IU/mg) da lipase de

Pseudomonas fluorescens quando imobilizada em octil-Sefarose (adsorção) com alta

enantiosseletividade (E>100) na hidrolise enantiosseletiva de HPBET.

No processo de imobilização, se objetiva ter o máximo de retenção de atividade.

Quando este valor ultrapassa os 100%, diz-se que ocorreu a hiperativação. O fenômeno da

hiperativação de lipases em suportes hidrofóbicos tem sido relatado por muitos autores.

Bastida et al., (1998) mostraram a hiperativação de seis diferentes lipases (dentre elas lipase

C. antarctica A, Rhizomucor miehei e Humicola lanuginosa com 200, 700 e 2000% da

atividade relativa, respectivamente). Palomo et al., (2002, 2004) obtiveram a hiperativação de

Mucor miehei (500%) e Thermus thermophilus (400%) quando imobilizadas em octil-

sepabeads. Cunha et al., (2009) imobilizaram Penicilium simplicissimum sobre diferentes

suportes com hidrofobicidades distintas (butil-, fenil- e octil-agarose) observando a maior

atividade relativa (%) com o suporte mais hidrofóbico (octil-agarose/ 1.133%) (BATISDA et

al., 1998; PALOMO et al., 2002; PALOMO et al., 2004; CUNHA et al., 2009). Vale ressaltar

que o fenômeno de hiperativação é observado principalmente em baixas concentrações de

enzima (em unidades de atividade). Por esse motivo, nem sempre um suporte que mostra

hiperativação se apresenta como boa alternativa biocatalítica, uma vez que muitas vezes, para

que a reação ocorra, faz-se necessário uma grande quantidade de biocatalisador por grama de

suporte (CUNHA et al., 2014).

64


Quanto ao substrato: Influência dos grupamentos substituintes dos substratos

O mecanismo de enantiosseletividade em uma reação enzimática pode ser descrito por

alguns modelos que preveem a enantiopreferência pelo substrato. Fitzpatrick e Klibanov

(1991) tentaram explicar a enantiosseletividade da enzima a partir do tamanho dos

grupamentos substituintes dos substratos. Kazlauskas e colaboradores (1991) predisseram a

enantiosseletividade de lipases de Pseudomonas cepacia e Candida rugosa frente a álcoois

secundários com base no tamanho e na forma das moléculas quando estas estão no sítio ativo

da enzima. A estrutura leva a uma enantiopreferência por um determinado enantiômero. A

Figura 27 ilustra o modelo de sítio ativo de lipases que consiste de duas regiões de diferentes

tamanhos, uma grande e outra pequena.

Figura 27. Enantiomero rápido (a) e enantiomero lento (b)- modelo de sítio ativo por lipases (Reproduzido de

KAZLAUSKAS et al., 1991).

Quanto ao design do processo

Utilização de diferentes reatores na síntese de compostos bioativos em sistemas

multifásicos

A seleção do reator mais apropriado para um dado bioprocesso dependerá de alguns

aspectos chaves como controle do pH, riscos de contaminação, conhecimento da cinética do

processo e do biocatalisador, em sua forma livre (recomendável o uso de micro-organismos

seguros - GRAS- Generally Regarded As Safe) ou imobilizado etc (PALOMARES et al.,

2009; TUFVESSON et al., 2010). Estes vão determinar o modo de condução do processo, as

características do fluxo e se estes estão diretamente relacionadas com a estabilidade e re-uso

da enzima, pontos fundamentais a serem avaliados na obtenção de moléculas bioativas

visando a diminuição de custos na catálise enzimática em escala comercial.

O tipo de configuração do biorreator para preparações enzimáticas livres ou

imobilizadas deverão levar em consideração o mecanismo de reaproveitamento do

65


biocatalisador da corrente de produtos. No caso de utilização de biocatalisadores livres,

unidades de ultra- filtração ou centrifugação poderão ser acopladas ao sistema. Entretanto,

maiores opções de processo e bioreatores são possíveis se o biocatalizador estiver na forma

imobilizada (FREIRE et al., 2011).

As características da bioconversão incluem as propriedades bioquímicas dos

substratos/produtos (pontos de fusão e ebulição, solubilidade em água, estabilidade ao pH e

temperatura); além das características reacionais (pH, temperatura, controle da atividade da

água). As características do biocatalisador incluem a utilização de enzimas (desintegração

celular) ou células íntegras (necessidade de co-fatores), livres ou imobilizadas, a localização

da atividade enzimática (normalmente na fase aquosa, exceto para as lipases que são ativadas

por interfaces), e por fim a quantidade de água no sistema para manutenção da atividade

catalítica do biocatalisador.

É importante considerar ainda as interações entre o biocatalisador, substratos e

produtos. Em tanques agitados, os suportes dos biocatalisadores imobilizados nem sempre

possuem resistência ao estresse mecânico. Portanto reatores descontínuos podem não ser a

melhor escolha uma vez que com a danificação do suporte utilizado, as proteínas serão

lixiviadas e o reuso ficará comprometido (HARTMANN e JUNG, 2010).

Dentre os reatores usados em sistemas multifásicos destacam-se, os reatores agitados

mecanicamente (descontínuos ou contínuos), os reatores de leito fixo e os reatores agitados

por uma fase líquida (AIRES-BARROS, 2002). Nesta tese, os reatores agitados

mecanicamente (descontínuos ou batelada simples) e reatores de leito fixo em fluxo contínuo

serão destacados.

A maior parte dos trabalhos da literatura relata a utilização de reatores descontínuos do

tipo tanque agitado operando em modo de batelada simples em escala reduzida. Entretanto,

durante os últimos anos, houve um aumento considerável no número de trabalhos que surgiu

na literatura na área de biocatálise utilizando o processo de fluxo contínuo. Esta tecnologia

pode melhorar a eficiência de reações enzimáticas e ainda, estudos utilizando ambos sistemas,

descontínuo e contínuo, na produção de diversos produtos com aplicações biotecnológicas,

como produção de biodiesel (HASSAN, et al., 1995; HASSAN et al., 1996; KEE et al., 1999;

RAO et al., 2009; NIE et al., 2006; CHEN et al., 2010; LEE et al., 2010; TONGBORIBOON

et al., 2010; BRASK et al., 2011; KAWAKAMI et al., 2011; ITABAIANA Jr., et al. 2011,

2012a,b).

Watson (2012) realizou um estudo de investigação do interesse da tecnologia em

sistema de fluxo contínuo pelas empresas farmacêuticas. O resultado mostrou que cerca de

66


48% de todas as empresas entrevistadas manifestaram alto interesse em processos contínuos,

com algumas destas empresas já realizando processos com este sistema. A maior parte deste

percentual de empresas estudadas são as maiores companhias farmacêuticas, que possuem

fontes disponíveis para investimentos em tecnologias novas e/ou alternativas.

Cunha et al., (2010, 2012) estudaram a resolução cinética de derivados de mio-inositol

catalisados por lipase comercial imobilizada de Candida antartica (Novozym 435). Os

autores utilizaram os reatores do tipo tanque agitado operando em modo batelada, em escala

reduzida. Os autores obtiveram elevada pureza e conversão.

Boros et al. (2013) investigaram diversos métodos de imobilização e suportes

utilizando a lipase CALB (Figura 28). Os autores avaliaram a resolução cinética de aminas

secundárias em dois tipos de reatores, em sistema de batelada simples e de fluxo contínuo e

encontraram maiores produtividades para as lipases submetidas em sistema de fluxo contínuo.

Figura 28. Resolução cinética de aminas racêmicas rac -1a-c por acetilação do acetato de etila catalisado por

CalB sob variados métodos de imobilização (Modificado de BOROS et al., 2013).

A literatura reporta diversos trabalhos que apresentam o estudo de derivados do

ibuprofeno em diferentes reatores. A resolução cinética de flurbiprofeno tem sido feita em

sistema de batelada simples e fluxo contínuo. Apesar do vasto campo de aplicação do

flurbiprofeno, substância antiflamatória não-esteroidal, recentemente tem sido realizados

ensaios clínicos para tratamento de metástase contra o câncer de próstata, no qual o isômero

(R)-fluorbiprofeno é o que apresenta o efeito ativo para o tratamento (TAMBORINI et al.,

2012). O esquema da reação de esterificação em sistema de fluxo contínuo para a obtenção

67


dos isômeros (S) e (R)- flurbiprofeno, em suas formas enantiopuras (eep maior que 98%),

pode ser visualizado na Figura 29.

Figura 29. Resolução cinética global e processo de purificação do enantiômero S em sistema

de fluxo contínuo (Modificado de TAMBORINI et al., 2012).

A diminuição do tempo reacional e o aumento da produtividade são claramente

observados em determinados processos quando o sistema em batelada é substituído pelo

sistema de fluxo contínuo. Tamborini et al. (2012) conseguiram a redução de até 10 vezes no

tempo reacional e o aumento de 10 vezes na produtividade quando alteraram o tipo de

processo para fluxo contínuo.

Resoluções cinéticas catalisadas por lipases em sistemas de fluxo contínuo foram

abordados por diferentes autores. No entanto, a aplicação desta tecnologia para a síntese de

inositóis não foi previamente estudada.

Uma outra alternativa interessante aos reatores supracitados seria a utilização de

bioreatores acoplados a membranas para separação simultânea de produto e recuperação do

biocatalizador que pode estar livre ou imobilizado na membrana. A escolha da membrana

mais adequada será função do tipo de biocatalizador empregado (LAU et al., 2010; LAU et

al., 2011).

Para os reatores relatados, o desenvolvimento de produtos, em nível industrial ainda é

limitado devido ao seu alto custo e baixa estabilidade (GUMÍ et al., 2008). A maioria dos

autores operam os reatores em escala reduzida ou laboratorial.

68


Influência do agente acilante

Os primeiros relatos do uso de doadores de acila em catalise enantiosseletiva por

lipase ocorreram em 1986-1987 (DEGUEIL-CASTAING et al., 1987; SWEERS e WONG,

1986). Um ano depois, as reações de acetilação enantioselectiva foram mais descritas na

literatura (LAUMEN et al., 1988; TERAO et al., 1988; WANG et al., 1988; WANG e

WONG, 1988). A partir deste momento, inúmeros pesquisadores vêm desenvolvendo estudos

da influencia dos agentes acilantes nas reações enzimáticas.

A presença do agente acilante (ou doador de acila) é de suma importância em certas

reações como reações de transesterificação e alcoólise, devido à necessidade de um composto

éster no início da resolução racêmica ou na síntese assimétrica (WEBER et al., 1995a;

CARREA et al., 1995).

Ésteres ativados são mais adequados como doadores de acila para reações

enantioseletivas catalisadas por lipase, uma vez que estas moléculas evitam a reversibilidade

do processo (WANG et al., 1988; GOTOR-FERNÁNDEZ, BRIEVA e GOTOR, 2006;

PARAVIDINO e HANEFELD, 2011).

Acetato de vinila é doador de acila mais comum dos ésteres enólicos que são usados

em reações enantiosseletivas (PARAVIDINO e HANEFELD, 2011; SIMON et al., 2012).

Apesar do acetato de vinila ser mais reativo, acetato de isopropenila também pode ser usado

nestas reações. Estes ésteres podem ser empregados não apenas como agente acilante, mas

também como solvente da reação. O produto álcool tautomeriza a um composto carbonila,

impulsionando assim a reação e eliminando a inibição da reação para obtenção do produto

requerido. (PARAVIDINO e HANEFELD, 2011). Novos doadores de acila como dietil

malonato, também são citados na literatura (SIMON et al., 2012).

Um doador de acila ideal seria aquele com baixo custo, capaz de acilar de forma

rápida e irreversível, além de ser completamente inerte a lipase e ao meio ambiente.

Infelizmente nenhum dos doares de acila cumpre todos estes requisitos (BORNSCHEUER e

KAZLAUSKAS, 2006b; PARAVIDINO e HANEFELD, 2011). Diferentes agentes acilantes

são citados na literatura e utilizados em reações enantiosseletivas. Estes estão ilustrados na

Figura 30.

69


Figura 30. Exemplos de agentes acilantes para acilações irreversíveis a partir de álcoois (A-B-D:Reproduzido de

BORNSCHEUER e KAZLAUSKAS, 2006b; C- Reproduzido de SIMON et al., 2012).

Lipases que catalisam acilações com estes ésteres ativados (Figura 30-A) permitem

uma catálise de até duas vezes mais rápidas do que com os ácidos ou ésteres simples. Além

disso, estes ésteres deslocam a constante de equilíbrio a favor da acilação (BORNSCHEUER

e KAZLAUSKAS, 2006b).

No caso dos enol-ésteres e anidridos, a acilação é praticamente irreversível. Como

reações irreversíveis são requeridas para resolução cinética de álcoois, estes são

frequentemente utilizados (BORNSCHEUER e KAZLAUSKAS, 2006b; CUNHA et al.,

2011; MANOEL et al., 2012a). Em reações do tipo reversíveis, ocorre a diminuição da pureza

enantiomérica do substrato não reagido (LUNDH et al., 1995; BORNSCHEUER e

KAZLAUSKAS, 2006b).

BERKOWITZ et al. (1992) desenvolveram de maneira eficiente uma rota para

oligossacarídeos artificiais. Os autores obtiveram 47% de conversão em 11h de tempo

reacional (Figura 31):

Figura 31. Síntese de oligossacarídeos artificiais utilizando a lipase PS-30 e acetato de vinila durante 11h de

tempo reacional (Modificado de BERKOWITZ et al., [1994] por BORNSCHEUER e KAZLAUSKAS, 2006b).

A literatura tem mostrado que muitas lipases toleram o acetaldeído liberado pela

tautomerização do acetato de vinila, com exceção das lipases CRL (lipase de C. rugosa) e

GCL (lipase de Geotrichum candidum). A inativação da lipase pelo acetaldeído se dá

A B

C D

70


provavelmente devido a formação da base de Schiff com o resíduo de aminoácido Lisina que

inativa lentamente a enzima. Por outro lado, quando o acetato de isopropenila é utilizado

como agente acilante, tem-se a liberação da acetona (WEBER et al., 1995). Diferente do

aldeído, a acetona é menos reativa. Outra alternativa é utilizar o acetato 1-etoxivinila, que

libera acetato de etila.

Anidridos cíclicos (anidrido succínico, por exemplo) são mais frequentemente

utilizados para a resolução cinética de álcoois do que seu equivalente acíclico, principalmente

escala industrial. O uso dos anidridos acíclicos é feito de maneira limitada uma vez que estes

são agentes irritantes, desativam algumas enzimas ao acilá-las, liberam ácido em suas reações

podendo prejudicar o sistema (PARAVIDINO e HANEFELD, 2011).

O doador de acila ideal que mais se adeque aos 12 princípios da química verde ainda é

desconhecido. Em reações de grande escala, o ácido carboxílico aparece como sendo o doador

de acila mais indicado na perspectiva da química verde. Apesar de muitos esforços,

pesquisadores enfatizam a importância de estudos na busca de alternativas mais sustentáveis,

uma vez que os agentes acilantes mais utilizados na literatura (enol-ésteres), não se

enquadram nos 12 princípios da química verde, portanto a redução da utilização dos mesmos

se faz necessário (PARAVIDINO e HANEFELD, 2011).

Influência do solvente

O emprego de diferentes solventes, agentes acilantes e quantidade da água no meio

reacional pode afetar drasticamente a reação de biotransformação. Diversos fatores afetam

uma reação de resolução enantiomérica desde o sistema de solvente empregado, que tem o

poder de alterar a especificidade, quimiosseletividade, regiosseletividade e

enantiosseletividade das lipases, até o teor de água presente na reação.

No início de um trabalho, há a necessidade da realização de experimentos

preliminares, os quais identificarão o melhor sistema de solvente, as enzimas que serão

capazes de catalisar a reação e quais agentes acilantes poderão ser empregados.

Apesar da grande influência da natureza do solvente sobre a enantio-, régio-e

quimiosseletividade da enzima, ainda não foi estabelecido um consenso sobre qual parâmetro

melhor descreve a influência do solvente sobre a reação enzimática (COSTA e AMORIM,

1999; LIU et al., 2009).

Uma vez que o conceito de biotransformação está associado ao uso de

biocatalisadores, onde a água é o solvente preponderante, é fácil compreender que a mesma

71


função tenha sido desempenhada por este solvente em inúmeros estudos da cinética

enzimática. Contudo, o uso exclusivo da água como solvente restringia a gama de aplicações

da biocatálise, bem como limitava a produtividade de diversos processos que envolvessem

solventes hidrofóbicos. Por outro lado, a constatação de que muitas enzimas funcionam in

vivo em ambientes ricos em lipídeos hidrofóbicos levou a conclusão de que os meios não

aquosos são igualmente adequados à atividade biocatalítica. A convergência dos dois aspectos

conduziu a incorporação do meio reacional de solventes orgânicos, fluídos supercríticos, fases

gasosas ou sólidas, conhecidos hoje como meios não convencionais (AIRES, 2002).

Solventes orgânicos têm sido utilizados como meios reacionais para

biotransformações enzimáticas em inúmeros processos de síntese orgânica. Muitos estudos

vêm empregando diferentes sistemas de solventes na resolução enantiosseletiva (COSTA e

AMORIM, 1999; LIU et al., 2009). A seletividade das enzimas, incluindo enantio, regio e

quimiosseletividades, é alterada em diferentes solventes, o que normalmente é atribuído às

modificações das conformações da enzima (alteração de estrutura e flexibilidade) causadas

pelo estabelecimento de diferentes tipos de interações enzima-solvente (SHEN et al., 2008).

Em biocatálise, as propriedades dos solventes como polaridade (1/ε), hidrofobicidade

(geralmente determinada como log P1), geometria molecular e habilidade de solvatação são

fatores significativos. Apesar de ainda não ter sido estabelecido um parâmetro que melhor

descreva a influência do solvente sobre a reação enzimática, dois parâmetros vêm sendo

utilizados por diferentes autores para caracterizar as propriedades físico-químicas dos

solventes, log P e constante dielétrica (ε). Dentre eles, o log P é o mais utilizado para a

escolha do solvente. Primeiro, porque este parâmetro é uma medida direta da hidrofobicidade;

segundo, porque seu valor pode ser facilmente determinado por método padrão ou calculado

com base nas constantes hidrofóbicas tabeladas; e terceiro, devido à sua sensibilidade a

pequenas diferenças de polaridade das moléculas (CHUA e SARMIDI, 2006).

Apesar das numerosas exceções, o parâmetro log P é o que apresenta melhor correlação

com a atividade enzimática e, geralmente, as enzimas são mais estáveis em solventes com

caráter hidrofóbico (log P>2) (YANG e RUSSEL, 1996). Contudo o efeito do solvente é

distinto para cada enzima.

A Tabela 4, a seguir, lista alguns solventes de uso comum e os valores de log P relativos

a eles.

72


Tabela 4. Valor de log P de solventes orgânicos (ADLERCREUTZ, 2000).

A forma como os solventes afetam a atividade enzimática e a enantiosseletividade ainda

não é bem compreendida e as hipóteses apresentadas para explicar esse fenômeno possuem

discrepâncias entre si (COSTA e AMORIM, 1999). Pode-se observar nos trabalhos que

exploram esse tema, a preocupação em salientar que os resultados alcançados são restritos aos

sistemas estudados, evitando-se generalizações.

O fato das enzimas manterem a atividade catalítica em solventes orgânicos não possui

explicação simples. A hipótese mais aceita é de que, quando a enzima é colocada em solvente

orgânico anidro, esta é cineticamente ―congelada‖ no seu estado nativo. Isso ocorre em parte

devido à baixa constante dielétrica do meio, que produz uma maior efetividade nas forças

eletrostáticas dos resíduos carregados responsáveis pela integridade estrutural da proteína,

(responsáveis pela manutenção da estrutura enzimática) embora possam tornar as enzimas

menos ativas (ZAKS e KLIBANOV, 1988; ZACKS et al., 1996).

Diversos autores têm relatado a influência da hidrofobicidade do solvente na

enantiosseletividade de enzima. De maneira geral, o efeito tem sido analisado em termos de

partição, de moléculas de água presentes no sítio ativo da enzima (SAKURAI et al., 1988) ou

de grupos funcionais dos substratos (TAWAKI e KLIBANOV, 1992).

Sakurai et al., (1988) observaram uma correlação linear entre a diferença de energia

livre de ativação (G) para a relação de transesterificação entre o éster N-acetil-2-cloroetil-

alanina e propanol e os valores de log P dos 13 diferentes solventes orgânicos empregados,

utilizando subtilisina como catalisador da reação. Os autores encontraram uma relação inversa

entre o valor G e da hidrofobicidade, expressa em valores de log P, como consequência, uma

relação inversa a enantiosseletividade. A dependência entre estes fatores ocorreu

Solvente log P Solvente log P

Metanol -0,76 TBME 1,5

Acetonitrila -0,33 Clorofórmio 2,0

Etanol -0,24 Tolueno 2,5

Acetato de etila 0,68 Hexano 3,5

73


principalmente pela dificuldade no deslocamento das moléculas de água presente na cavidade

hidrofóbica do sítio de ligação da enzima durante a ligação enzima-substrato. O deslocamento

destas moléculas de água é termodinamicamente menos favorecido em solventes hidrofóbicos

do que naqueles hidrofílicos.

Os solventes hidrofóbicos não retiram a água de solvatação da estrutura protéica,

prevenindo a desnaturação e mantendo a estrutura conformacional da enzima. Moléculas do

solvente podem ainda interagir com a estrutura protéica e exercer efeitos ativadores ou

estabilizadores, efeitos esses que também podem estar relacionados com a presença do

suporte quando se trabalha com enzimas imobilizadas (PENCREACH e BARATTI, 1997).

Nesta interação com a estrutura protéica, ainda deve ser considerado que solventes apolares

podem manter a enzima em sua conformação aberta, ou seja, na presença destes solventes, a

tampa hidrofóbica não estaria cobrindo o sítio ativo, o que poderia manter ou até aumentar a

atividade enzimática (RÚA et al., 1993).

Nakamura et al. (1991) estabeleceram um modelo empírico para a escolha do solvente

adequado em reações catalisadas por lipases. Segundo os autores, solventes cíclicos são os

mais adequados para encontrar uma maior enantiosseletividade. Os autores estudaram a

influência da estrutura do solvente na reação entre 1-nitro-propanol e acetato de vinila,

utilizando lipase de Pseudomonas sp. como biocatalisador. Nakamura e colaboradores

observaram que em solventes lineares obtinham maior valor de enantiosseletividade do que

quando os respectivos solventes ramificados eram usados. Constataram ainda que em série

homóloga aos cicloalcanos a enantiosseletividade diminuía conforme o aumento de carbonos

na estrutura dos solventes cíclicos. Isso foi explicado pela facilidade dos solventes lineares e

cíclicos (com um menor número de carbono) se incorporarem melhor na cavidade menor do

sítio ativo da enzima.

Influência da atividade da água

A camada de solvatação presente nas enzimas tem um papel fundamental atuando

como componente primário do microambiente enzimático. Este ambiente é capaz de manter

uma dinâmica molecular mínima, essencial à atividade enzimática em ambientes orgânicos

(ZAKS e KLIBANOV, 1988).

De fato a água presente no meio reacional pode estar dissolvida no solvente, ligada à

enzima ou ao suporte, logo a quantidade de água do meio não indica o grau de hidratação da

enzima. O conceito termodinâmico da atividade de água (aw) é o melhor parâmetro para se

74


referir à quantidade de água disponível em um sistema orgânico (ADLERCREUTZ, 1996;

HALLING, 2003;). A atividade de água (aw), é definida como a razão entre a pressão parcial

da água no sistema (pw) e a pressão parcial da água pura (p

0

w), como mostra a Equação 10.

(Eq. 10)

O parâmetro aw representa a umidade relativa do sistema considerado, situando-se

entre 0 e 1, sendo que quando a atividade de água iguala-se a 1, já há formação de uma fase

aquosa distinta (apud BARON, 2003).

A Tabela 5 apresenta uma lista com os sais mais adequados ao controle da atividade

de água e as atividades de suas respectivas soluções.

Tabela 5. Soluções salinas saturadas adequadas ao controle da atividade de água (ADLERCREUTZ, 2000).

Sal Atividade de água

(25oC)

LiCl 0,113

Acetato de potássio 0,225

MgCl2 0,328

K2CO3 0,432

Mg(NO3)2 0,529

SrCl2 0,708

KCl 0,843

KNO3 0,936

K2SO4 0,973

Como relatado anteriormente, solventes hidrofílicos (aqueles com maior afinidade pela

água) tendem a remover a camada de água da superfície proteica em maior quantidade,

podendo até inativá-la (GORMAN e DORDICK, 1992). Logo a quantidade ótima de água

necessária à reação está relacionada também a polaridade do solvente. Metanol (log P = –

0,76) foi capaz de promover a dessorção de até 60% da água ligada a enzimas (quimiotripsina,

subtilisina e peroxidase) enquanto hexano (log P = 3,5) promoveu a dessorção de apenas 0,5%

da água ligada às essas mesmas enzimas (YANG e RUSSEL, 1996).

75


A quantidade de água presente no meio reacional, assim como qualquer outro

substrato ou produto, afeta também o equilíbrio termodinâmico entre as reações catalisadas

pelas enzimas, alterando a conversão de equilíbrio, embora não modifique a constante de

equilíbrio (PAIVA et al., 2000).

A influência da atividade de água nos sistemas reacionais tem sido estudada por

diferentes autores (SVENSSON et al., 1994; VALIVETY et al., 1992a; MANOEL et al.,

2011; CUNHA et al., 2012). Os resultados obtidos pelos mesmos mostraram que lipases

respondem diferentemente para um aumento da atividade de água. Enquanto algumas lipases

possuem a atividade ótima em baixa atividade de água (Rhizopus arrhizus), outras possuem o

aumento da atividade com o aumento da atividade de água (Pseudomonas sp.). Ainda há

aquelas que possuem perfis intermediários (Candida rugosa) (WEHTJE e ADLERCREUTZ,

1997). A Figura 32 mostra a variação no perfil de atividade de lipases de Rhizopus arrhizus,

Candida rugosa e Pseudomonas sp. em um sistema empregando como reação modelo a

esterificação entre ácido decanóico e dodecanol (WEHTJE e ADLERCREUTZ, 1997).

Figura 32. Efeito da atividade de água na atividade enzimática de lipases de origens diversas: Rhizopus arrhizus

( ) ; Candida rugosa ( ); Pseudomonas sp. ( ) (Reproduzido de WEHTJE e ADLERCREUTZ, 1997).

A quantidade máxima de água requerida para maximizar a atividade enzimática pode

ser determinada para a maioria das lipases e dependerá de cada sistema de solvente orgânico

empregado, de cada biocatalisador e do suporte, quando a lipase estiver em sua forma

imobilizada. Cunha et al., (2012) e Manoel et al. (2011) estudaram por meio de planejamento

experimental a quantidade de água como uma variável independente na reação de alcoólise de

diferentes derivados de mio-inositol utilizando Novozym 435 (C. antarctica tipo B

imobilizada em resina acrílica e PS-IM (P. cepacia imobilizada em terra de diatomácea). Para

76


ambos os casos a variável independente (quantidade de água) mostrou um efeito significativo

negativo para o aumento da conversão enzimática.

77

Capítulo IV – MATERIAL E MÉTODOS

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 MATERIAIS

4.1.1 Biocatalisadores utilizados

As lipases comerciais de Rhizomucor miehei (Lipozyme RM IM) e de Candida

antarctica tipo B (CALB, Novozym 435) foram adquiridas da empresa Novozymes.

A lipase B de Candida antarctica expressa em Pichia pastoris - extrato liofilizado;

lipase de Pyrococcus furiosus expressa em E.coli (imobilizada em diferentes suportes); lipase

de Rhizomucor miehei (produzida por Fermentação em estado solido utilizando torta de

babaçu); lipase vegetal de Jatropha curcas L. foram fornecidas pelo laboratório de

Biotecnologia Microbiana (LaBim-IQ/UFRJ). Lipase liofilizada de Yarrowia lipolytica foi

obtida pelo Grupo Biose, da Escola de Química (EQ-UFRJ). Os solventes e demais reagentes

empregados neste trabalho para a resolução cinética dos derivados de mio-inositol e

imobilização foram de grau analítico.

4.1.2 Substratos utilizados

Os substratos foram sintetizados pelo laboratório Roderick Barnes, especificamente

pela química Karla Ceodaro e o farmacêutico Angelo Amaro, ambos alunos de doutorado,

orientados pelo Professor Dr. Alessandro B. C. Simas, NPPN (Núcleo de Pesquisas de

Produtos Naturais)/UFRJ. Os racematos (±)-1,4,5,6-tetra-O-benzil-mio-inositol (rac-1); (±)-

1,4,5,6-tetra-O-alil-mio-inositol (rac-2); (±)-1,3,4-tri-O-benzil-mio-inositol (rac-3) e (±)-3,6-

di-O-benzil-1,2-O-isopropilideno-mio-inositol (rac-4) carecem de resolução óptica e estão

apresentados na Figura 33.

Figura 33. Derivados de mio-inositol utilizados na resolução cinética por lipases.

78


Portanto, os quatro racematos, derivados racêmicos de mio-inositol, serão substratos

utilizados na resolução enzimática. A Figura 34 simplifica o processo que ocorre desde a

síntese orgânica (NPPN/UFRJ) até a síntese enzimática, que foi realizada neste trabalho.

Figura 34. Síntese de potenciais substratos para lipases

4.1.3 Suportes utilizados na imobilização por adsorção

O suporte comercial Accurel® MP 1000 (poli-propileno) foi adquirido da empresa

Membrana GmbH (Alemanha) e foi utilizado como suporte modelo para fins comparativos

aos demais suportes home-made para este processo.

79


Os suportes do tipo casca-núcleo utilizados para imobilização neste trabalho foram

cedidos pelo Laboratório de Modelagem, Simulação e Controle de Processos-

PEQ/COPPE/UFRJ segundo a metodologia de Lenzi et al. (2003), Pinto et al. (2006) e Besteti

(2009). A metodologia de produção dos suportes, realizada pelo laboratório supra-citado,

combina processos em suspensão e em emulsão. Primeiramente, é feita uma polimerização

em suspensão, gerando um núcleo não poroso. Em seguida, promove-se, no mesmo reator,

sem qualquer separação de componentes, uma polimerização em emulsão. Em função da alta

viscosidade e caráter pegajoso, o núcleo atua como um centro de aglomeração das partículas

que são geradas pela emulsão, originando polímeros com morfologia casca-núcleo.

A eficiência de recobrimento do núcleo está diretamente relacionada ao instante em

que a emulsão tem início (ou seja, a duração da etapa de suspensão). Os monômeros

utilizados foram estireno (PS) e metil metacrilato (PMMA), ambos foram reticulados com

divinilbenzeno. Os suportes selecionados foram aqueles que apresentaram maior atividade de

esterificação após o processo de imobilização, além de boas estabilidades frente à diferentes

solventes orgânicos (Figura 35). Estes tiveram por base os resultados de Cunha (2011) e

Cunha et al. (2014). Algumas propriedades das superfícies poliméricas, como a área

específica (m2/g) e o diâmetro de poro (Å) também foram analisadas (Tabela 6):

1. PS-co-DVB/PS-co-DVB 25% (2 horas de suspensão) - núcleo de poli(estireno-co-

divinilbenzeno) e casca de poli(estireno-co-divinilbenzeno) contendo 25% de

divinilbenzeno.

2. PMMA-co-DVB/PMMA-co-DVB 25% (2 horas de suspensão) - núcleo de

poli(metacrilato de metila-co-divinilbenzeno) e casca de poli(metacrilato de metila-co-

divinilbenzeno) contendo 25% de divinilbenzeno.

Tabela 6. Dados de caracterização dos suportes poliméricos selecionados para esta tese (BESTETI, et al., 2009,

2010)

Suportes Área específica (m2/g) Diâmetro do poro (Å)

Accurel MP 1000 39,0 230,0

PS-co-DVB/PS-co-DVB 25% 29,0 190,4

PMMA-co-DVB/PMMA-co-DVB 25% 12,6 193,4

80


Figura 35- Micrografia óptica e micrografia eletrônica de varredura dos suportes PMMA-co-DVB/ PMMA-co-

DVB 25% e PS-co-DVB/PS-co-DVB 25%. (Reproduzido de BESTETI et al., 2011).

4.2. MÉTODOS

4.2.1 Seleção de lipases e substratos por meio da reação de acetilação realizados em

sistema descontínuo (ou modo de batelada)

Com o objetivo de selecionar o melhor par lipase-substrato, as reações de acetilação

foram realizadas com as lipases home-made em suas formas liofilizadas e imobilizadas, e com

os racematos mencionados (descritos no item 4.1.1. e 4.1.2, pag. 77), conduzidas em frascos

fechados termostatizados e agitados magneticamente (Figura 36).

81


Figura 36. Foto da aparelhagem utilizada no sistema operacional empregado nas reações de acetilação dos

derivados racêmicos.

A seleção inicial foi feita em sistema de batelada simples em reatores (encamisados),

realizada com 5 mg de cada racemato, dissolvidos em 2,5 mL de acetato de vinila utilizado

como solvente e agente acilante, 50 U de enzima, a 30º C, 40º C e 50º C de temperatura por

48 horas. As reações foram realizadas utilizando, a princípio, acetato de vinila como agente

acilante e solvente da reação, uma vez que este agente acilante tem se mostrado o mais

adequado nas reações com mio-inositol (SIMAS et al., 2011) e para a literatura (KALER et

al., 2011; HERBS et al., 2012), além dos benefícios supracitados (pag.68).

Após o período citado (48 horas), as reações foram interrompidas pela remoção do

biocatalisador (quer seja em sua forma livre ou imobilizado) do meio reacional da seguinte

forma: a amostra foi centrifugada com o objetivo de separar o biocatalisador do produto. O

sobrenadante contendo o produto foi levado ao concentrador a vácuo de velocidade (Speed

vac concentrator-Savant SPD 1010-Thermo scientific). O biocatalisador foi lavado três vezes

com 1mL de acetato de etila afim de se retirar todo o produto contido no frasco. O

biocatalisador, já separado, foi levado ao Concentrador a vácuo de velocidade (Speed vac

concentrator) para a evaporação do solvente residual para posterior reutilização do mesmo.

As reações foram acompanhadas por cromatografia em camada fina (CCF), conforme descrito

no item 4.2.5.

82


4.2.2 Efeito do agente acilante na conversão e na enantiosseletividade

Para a reação onde a acetilação resultou em formação de produto para um determinado

par substrato-lipase home-made utilizada, ou ainda, substrato lipase comercial imobilizada

utilizada, seguiu-se com a análise do efeito do agente acilante. Agentes acilantes distintos

foram usados com o objetivo de se estudar a influência dos mesmos na conversão e na

enantiosseletividade, em sistema livre de solvente.

As reações enzimáticas foram realizadas em frascos fechados termostatizados

contendo 5 mg de substrato dissolvidos em 2,5 mL de agente acilante (acetato de etila, acetato

de vinila ou acetato de isopropenila) em sistema livre de solvente e 50 U de enzima, a 30° C.

Alíquotas de 100 µL foram retiradas nos intervalos de 0,5, 6, 24, 48, 72, 96 e 120 h. As

reações foram paralisadas pela remoção do biocatalisador do meio reacional e o solvente foi

evaporado no concentrador a vácuo de velocidade (Speed Vac Concentrator- Savant SPD

1010-Thermo scientific). As amostras foram resolubilizadas com 1 mL de fase móvel

acetronitrila:H2O (60:40) para a análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em fase

reversa e em coluna quiral, conforme descrito no item 4.2.5.

4.2.3 Efeito do solvente na conversão e na enantiosseletividade

Após a seleção do melhor agente acilante, seguiu-se com a análise do efeito do

solvente na conversão e enantiosseletividade. De fato, sabe-se que a influência do solvente na

enantiosseletividade é relevante (SHEN et al., 2008). Diferentes solventes orgânicos (grau

analítico, Tedia®) foram avaliados, em triplicata, para a reação de resolução cinética dos

derivados do mio-inositol catalisada pelas diferentes lipases: terc-metil butil éter, hexano,

acetato de etila, acetato de vinila e acetato de isopropenila. As reações enzimáticas foram

realizadas em frascos fechados termostatizados contendo 5 mg do substrato selecionado

dissolvidos em 2,0 mL de solvente e agente acilante selecionado (1,5:1), e 136,4 U de enzima

(condição já otimizada), a 30°C. Alíquotas de 100 µL foram retiradas nos intervalos de 0,5, 6,

24, 48, 72, 96 e 120h. As reações foram feitas para cada solvente citado.

As reações foram interrompidas pela remoção do biocatalisador do meio reacional. As

amostras foram ressolubilizadas com 1mL de fase móvel acetronitrila: água (60:40) para a

análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em fase reversa e em coluna

quiral. O volume injetado foi de 20µL na coluna em fase reversa e 10 µL na coluna quiral.

83


4.2.4 Estudo da resolução cinética dos substratos/lipases selecionadas utilizando o

sistema de fluxo contínuo

O equipamento do sistema em fluxo contínuo

As reações enzimáticas realizadas em condições de fluxo contínuo foram conduzidas

usando o sistema de fluxo Asia system da empresa Syrris (Figura 37).

Figura 37. Reator Asia system, sistema em fluxo contínuo da empresa Syrris mostrando a coluna utilizada para as

reações: A) Detalhe da bomba do equipamento; B) Coluna termoestatizada.

Basicamente o sistema em reatores Asia system funciona da seguinte maneira: A

solução é impulsionada pela bomba (Figura 37.A) ao interior da coluna termostatizada pelo

equipamento (Figura 37.B) contendo o biocatalisador da reação, em uma coluna de leito fixo.

Posteriormente, a solução é recolhida em sua parte superior e preparada para a análise por

CLAE. A taxa do fluxo e a temperatura foram variáveis monitoradas durante todo o processo.

A coluna utilizada foi do tipo ajustável, modelo Omnfit 600psi fornecido igualmente

pela empresa Syrris, como ilustrado na Figura 38.

A

B

84


Figura 38. Coluna de leito fixo utilizada no sistema de fluxo contínuo adquirido pela empresa Syrris, onde A)

detalhe do lúmen da coluna onde o biocatalisador é colocado; B) Setas representando a altura que o

biocatalisador preenche a coluna, em centímetros (cm), para cálculo do volume da coluna.

A massa do biocatalisador (de valor conhecido) foi inserida na coluna. A empresa

fornece informações prévias para os cálculos de volume para cada coluna, como pode ser

visualizado na Figura 40.A. Neste caso, 0,7854 x BED (cm) será o valor do volume utilizado.

O valor (em cm) dependerá da altura após preenchimento com o biocatalisador.

O tempo de residência (tr) foi calculado da seguinte forma (CABRAL e TRAMPER,

2005):

tr= V/F

Onde V (mL) é o volume ocupado pela coluna e F é o fluxo utilizado (mL/min).

Porosidade do leito

A fração de vazios ou porosidade média é definida como a razão entre o volume vazio

em relação ao volume total do leito. Esta é uma propriedade estrutural global do leito, sendo

utilizado para caracterizar o espaço total disponível para o fluxo. Uma vez que a porosidade

pode influenciar os perfis de velocidade, podendo causar perda de carga ao longo do leito

(FREUND, 2003; FOLTIN, 2013), este valor foi calculado quando a enzima Novozym 435

foi utilizada:

A

B

85


Onde Ɛ é adimensional:

Ɛ = 1 –[(1,60mL)/(2,1)]

Ɛ= 0,238.

Condições reacionais no sistema em fluxo contínuo

O estudo em condições de fluxo contínuo foi realizado com a lipase Novozym 435

utilizando como ponto de partida TBME (Terc-Butil-Metil-Eter) e Hexano como solvente,

uma vez que estes foram os melhores solventes encontrados anteriormente (MANOEL et al.,

2012b). Os agentes acilantes testados foram acetato de vinila, acetato de etila, acetato de

isopropenila e anidrido acético.

Uma solução contendo 4,86 mM de solvente foi usada em condições de fluxo

contínuo. A coluna Omnifit com capacidade de 12,3 mL foi usada preenchida com 527 mg de

enzima imobilizada (atividade de esterificação de Novozym 435 por meio da reação de síntese

do oleato de etila foi de 2728+ 339 U/gsuporte). A coluna de leito fixo preenchida com 527mg

de biocatalisador foi usada para conduzir todas as reações neste tipo de sistema.

Diferentes proporções de substrato/agente acilante foram usados (1:1; 1:5: 1:10 e 1:15

mmol, respectivamente). Os parâmetros reacionais selecionados foram temperatura (30–60º

C) e taxa de fluxo (0,5; 1 e 1,5mL/min). Alíquotas de 0,2 mL e 1,5 mL foram coletadas por

5min para análises posteriores de conversão e excesso enantiomérico em CLAE.

Diversos ciclos de operação em sistema de fluxo contínuo foram feitos utilizando-se a

mesma coluna inicial (preenchida com 527 mg do biocatalisador) durante todo este estudo.

Após o término de cada corrida, a coluna foi lavada com solvente puro (acetato de etila)

utilizando um fluxo de 0,5 mL/min (durante 15 min) para a retirada de possíveis produtos, a

fim de preparar a coluna para uma próxima utilização. No começo e no final de cada dia de

trabalho no equipamento, 1,5 mL foi coletado para a dosagem de proteínas (método Bradford)

e para atividade hidrolítica/esterásica, com o objetivo de analisar perda protéica (dessorção do

catalisador do suporte) ou perda da atividade enzimática.

O mesmo procedimento foi feito utilizando como substrato o rac- 4.

4.2.5 Métodos analíticos

86


Análise por CCF (Cromatografia de Camada Fina/delgada ou do inglês, TLC – Thin

Layer Chromatography)

Análises qualitativas por Cromatografia em Camada Fina (CCF) foram feitas

previamente à análise por CLAE (no inglês HPLC).

A cromatografia em camada delgada foi realizada aplicando uma pequena amostra do

meio reacional da fase orgânica. A aplicação foi feita com auxílio de tubo capilar. Utilizou-se

uma solução de acetato de etila: hexano (3:7) como fase móvel e a sílica, da placa de CCF,

como a fase estacionária. Como revelador KMnO4 foi utilizado seguido da secagem da placa

de CCF em placa de aquecimento. O fator de retenção (Rf) foi utilizado como critério de

distinção entre o Rf do substrato e o do produto formado pela Equação 7:

Rf = deslocamento da substância

Deslocamento do eluente (Eq. 7)

O termo Rf expressa a migração de uma substância em relação ao deslocamento total do

solvente (Front do solvente) em um sistema cromatográfico, sendo constante e característico

para cada substância.

A análise qualitativa do grau de conversão da reação por CCF foi avaliada por um

critério baseado na visualização das marcas do substrato e produto, comparado com seus

respectivos padrões, assim como a intensidade dessas marcas quando a placa foi revelada

como já mencionado.

Para as análises em CCF foram utilizadas folhas de alumínio KieselGel 60 F254 e

como fase móvel hexano:acetato de etila (7:3). A visualização das substâncias

cromatografadas foi realizada por revelação de KMnO4 (Permanganato de Potássio).

KMnO4 é um agente oxidante de coloração violeta e foi preparado da seguinte forma:

1º Adiciona-se 150mL de água e 10g de K2CO3; 2º Adiciona-se 2,5mL de NaOH (5% aq.) e

homogeneizar o sistema; 3º Adicionar KMnO4 (1,5g) aos poucos.

Análise das reações de acetilação por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

Análise da conversão

A análise da conversão dos substratos: rac-1, rac-2, rac-3 e rac-4, além dos seus

respectivos compostos acetilados foi feita em CLAE em fase reversa, com coluna Kromasil-

87


C18, uma bomba Shimadzu LC-20AT, fase móvel acetonitrila:água (60:40) com velocidade

de fluxo de 0,5 mL/min e coluna termostatizada a 40° C com o forno CTO-20A. Foi utilizado

o detector UV/visível de comprimento de onda variável Shimadzu SPD-M20A com

comprimento de onda 215 nm e a integração do cromatograma foi feita utilizando o programa

Shimadzu LCsolution.

Os padrões racêmicos utilizados no cromatograma em sistema de fase reversa foram

obtidos a partir da amostra sintética contendo o substrato tribenzilado (rac-3) e seus

respectivos monoéster (mono-O-acetilado, duas possibilidades devido a duas hidroxilas

menos impedidas estericamente), diéster (diacetilado) e triéster (triacetilado) estão

apresentados na Figura 39 e 40. Os seus respectivos tempo de retenção (tr) foram de 8,17,

12,45, 13,29, 21,79 e 38,74 min.

Figura 39. Cromatograma referente ao padrão do substrato (rac-3) por CLAE em fase reversa com tr de

8,178min (Reproduzido de MANOEL, 2011).

88


Figura 40 Cromatograma referente a mistura do padrão racêmico (rac-3) do produto analisados por CLAE em

fase reversa. O tr de 12,456min é referente ao primeiro monoacetilado, o tr =13,296min é referente ao segundo.

O tr =21,797min é referente ao diacetilado e o tr = 38,745min ao triacetilado. O tr de 8,325min é referente ao

substrato (Reproduzido de MANOEL, 2011).

A Figura 40 representa o padrão sintético do rac-3. A Figura 40 representa o padrão

sintético dos derivados acetilados de rac-3 obtido como componente de uma mistura contendo

dois possíveis mono-acetilados, nos tr= 12,456 e tr=13,296 (acetila nas posições C5 e C6,

respectivamente), diacetilado e uma pequena quantidade do substrato não acetilado (tr=

8,325). A mistura de padrões foi importante para o acompanhamento inicial das reações

enzimáticas. A quantificação da conversão, foi feita segundo Chen et al. (1982) (eq. 3, pag.

23) após a análise por CLAE.

A concentração do substrato rac-3 foi comparada com os valores das áreas da curva de

calibração (Figura 41) (SHAH e MARYANOFF, 2001).

Figura 41. Curva de calibração calculada a partir da curva padrão para o rac-3 (Reproduzido de MANOEL,

2011).

89


A concentração do substrato rac-4 foi comparada com os valores das áreas da curva de

calibração (Figura 42) (SHAH e MARYANOFF, 2001).

Figura 42. Curva de calibração calculada a partir da curva padrão para o rac-4 (Reproduzido de MANOEL,

2011)..

Os padrões para o rac-4 foram analisados no cromatograma em sistema de fase

reversa e obtidos a partir da amostra sintética contendo o diol (rac-4) (Figura 43), dois

monoésteres e o diéster (CUNHA et al., 2010) (Figura 44). Os tempos de retenção para o diol

(rac-4), monoéster e diéster foram 9,3, 15,4 e 26,8 min, respectivamente.

Figura 43. Cromatograma em sistema de fase reversa (Shimadzu C-18) do padrão diol.

90


Figura 44. Cromatograma em sistema de fase reversa (Shimadzu C-18) da mistura sintética dos padrões: diol; os

dois possíveis monoésteres e o diéster, visualizados da esquerda para a direita (Modificado de CUNHA 2011).

Determinação do excesso enantiomérico da resolução cinética de rac-3

A determinação do excesso enantiomérico pelo produto e do excesso enantiomérico do

substrato não reagido, para cada reação, foi feito após a análise por CLAE com coluna

Kromasil-C18. O substrato não reagido e o produto são coletados por CLAE utilizando a

coluna Kromasil-C18 conforme a programação feita no software vinculado ao sistema CLAE.

Posteriormente, o excesso enantiomérico dos materiais coletados da resolução cinética de rac-

3 foi analisado na coluna quiral Chiralcel OD-H (fase móvel hexano: 2-propanol (7:3), fluxo

0,6 ml/min e comprimento de onda de 215 nm). Foram utilizados a mesma bomba, detector e

integrador que os da análise em fase reversa. A Figura 45 apresenta o cromatograma dos

isômeros do substrato (rac-3). Os tempos de retenção do padrão do produto foram de 36,1

min para o (D)-isômero e de 43,7 min (L)-isômero.

Uma vez que os tempos de retenção dos enantiômeros L-(-)-2 e D-(+)-1, no padrão

racêmico puro mostraram-se ser muito próximos quando eluído nas colunas quirais utilizadas,

não foi possível analisar com eficiência o excesso enantiomérico do padrão desta forma.

Portanto, outro procedimento foi pesquisado, seguindo então Laumen e Ghisalba (1994).

Após a reação enzimática, os autores fizeram uma reação de metanólise do produto da reação

e analisaram o produto hidrolisado na coluna quiral.

91


Figura 45 – Cromatograma em sistema quiral (Chiracel OD-H) do padrão do produto (D)-isômero e (L)-isômero

do (±)- 1,3,4-tri-O-benzil-mio-inositol (rac-3). Reproduzido de Manoel, 2011.

Adicionou-se ao produto de reação previamente separado do substrato não reagido

(separado por CLAE) o carbonato de potássio (K2CO3 -0,4g, 2,9mmol) e metanol (MeOH -

100ml). A reação de hidrólise ocorreu durante um período de 2h a temperatura ambiente. Os

frascos foram agitados magneticamente para maior interação do sistema. Após a reação,

adicionou-se no sistema 1mL do solvente orgânico diclorometano e 1mL de água, para uma

extração líquido-líquido do sistema (para maior purificação do produto hidrolisado). O

mesmo foi posteriormente seco no concentrador a vácuo de alta velocidade. Em seguida, a

fase móvel foi então adicionada para a análise na coluna quiral Chiracel OD-H, pelo qual os

valores dos excessos enantioméricos foram obtidos eficientementes. O produto da reação uma

vez isolado foi analisado por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) por alunos do

laboratório Roderick Barnes, no Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais que confirmaram

o isômero obtido da resolução cinética.

Determinação do excesso enantiomérico da resolução cinética de rac-4

A análise do excesso enantiomérico pelo produto e do excesso enantiomérico do

substrato não reagido da resolução cinética de rac-4 foi feito pelo mesmo processo que por

rac-3, salvo algumas exceções: Após a análise por CLAE com coluna Kromasil-C18, o

substrato não reagido e o produto foram coletados por CLAE utilizando a coluna Kromasil-

C18 conforme a programação feita no software vinculado ao sistema CLAE. Posteriormente,

o excesso enantiomérico dos materiais coletados da resolução cinética de rac-4 foi analisado

na coluna quiral Chiralcel OD-H (fase móvel hexano: 2-propanol (9:1), fluxo 0,8 ml/min e

comprimento de onda de 215 nm), conforme descrito por Cunha (2011). Foram utilizados a

92


mesma bomba, detector e integrador que os da análise em fase reversa. A Figura 46 apresenta

o cromatograma dos isômeros do substrato (rac-4). Os tempos de retenção do padrão do

produto foram de 15,7 min para o (D)-isômero e de 22,3 min para o (L)-isômero.

Figura 46. Cromatograma em sistema de quiral (Chiracel-OD-H) do (D)-isômero e (L)-isômero do rac-4.

(Reproduzido de CUNHA, 2011).

A conversão e o excesso enantiomérico do substrato e do produto foram determinados

pelas equações 3, 4 e 7 respectivamente (pags.23 e 24). A razão enantiomérica (E) do produto

formado foi determinada pela equação 6 (pag. 23) de acordo com Chen e colaboradores

(1982).

Dosagem de atividade hidrolítica de lipase método espectrofotométrico

As atividades hidrolíticas das enzimas na forma solúvel foram determinadas a partir da

reação de hidrólise do p-nitrofenil laurato catalisada pela lipase com a formação do produto

cromóforo p-nitro fenol. 2,5 mL de solução contendo 2,5 mM de p-nitrofenil laurato (p-NFL)

em tampão fosfato de sódio (25 mM e pH 7,0) foi termostatizada a 30°C. A reação foi

iniciada pela adição de 0,05 mL de solução enzimática liofilizada (enzima liofilizada diluída

no mesmo tampão supracitado). O progresso da reação foi acompanhado por

espectrofotômetro com leituras de absorbância a 410 nm. No caso de preparações com

enzimas imobilizadas, utilizou-se o seguinte procedimento experimental: 1 mL de solução

contendo 2,5 mM de p-nitrofenil laurato (p-NFL) em 9 mL de tampão fosfato de sódio (25

mM e pH 7,0), termostatizada a 30°C. A reação foi iniciada pela adição de 3mg da enzima

imobilizada. A reação se inicia pela adição da enzima imobilizada ao meio reacional, em um

reator aberto, provido de agitação magnética e conectado a um banho termostático. Alíquotas

93


de 1mL foram retiradas do meio reacional em triplicata, e inseridas na cubeta para leituras no

tempo zero e em tempos de reação determinados. O progresso da reação foi acompanhado por

espectrofotômetro com leituras de absorbância a 410 nm. Como se trata de enzima

imobilizada, o cálculo da atividade foi realizado utilizando a equação (8), porém com o valor

da massa de enzima (Menz) pesada no denominador da equação.

Uma unidade internacional (UI) foi definida como a quantidade de enzima necessária

para formar 1,0 µmol de p-nitrofenol por minuto nas condições de ensaio.

O cálculo da atividade foi realizado utilizando-se a equação (8).

(Eq. 8)

onde A é atividade lipásica (U/mL) ou (U/g de suporte); Vfinal é volume final de meio

reacional (mL); f é fator obtido na curva de calibração de p-nitro fenol (µmol/mL)

(0,1223±0,0168), fdil é o fator de diluição, caso seja feita diluição da solução para a dosagem;

Xenz é o Venz, volume da solução enzimática (mL), no caso de dosagem de atividade

hidrolítica de enzimas liofilizadas ou Menz, massa de enzima (g), para as versões imobilizadas.

Dosagem da atividade de esterificação por método titulométrico

A atividade de esterificação da enzima imobilizada foi quantificada pelo consumo de

ácido oléico na reação de esterificação com etanol na razão molar de ácido: álcool de 1:1. A

reação foi conduzida à temperatura de 40°C utilizando-se 3% (m/m) de enzima imobilizada

sob agitação constante (CUNHA, 2011). A reação foi iniciada pela adição da enzima ao meio

reacional, em um reator aberto, provido de agitação magnética e conectado a um banho

termostático. Alíquotas de 200 µL foram retiradas do meio reacional (volume reacional de 5

mL) em triplicata, no tempo zero e em tempos de reação determinados, até um limite máximo

de 10%, afim de garantir que a reação estivesse em velocidade inicial. A cada amostra foram

adicionados 20 mL de uma solução de acetona-etanol (1:1) (v/v). A quantidade de ácido

consumido foi determinada por titulação com NaOH 0,02 M. Uma unidade de atividade

enzimática de esterificação foi definida como a quantidade de enzima que esterifica 1,0 μmol

de ácido graxo por minuto, nas condições do ensaio. A atividade enzimática foi calculada

segundo a Equação 9:

94


(Eq. 9)

onde A é a atividade de esterificação (μmol/ min. gsuporte ou UE/gsuporte); Va é o volume

de NaOH gasto na titulação da amostra retirada no tempo zero (mL); Vb é o volume de NaOH

gasto na titulação da amostra retirada após o tempo t (mL); M é a molaridade da solução de

NaOH (mmol/mL); Vfinal é o volume final de meio reacional (mL); m é a massa da enzima

imobilizada utilizada na reação (g); Ve é o volume da alíquota do meio reacional retirada para

titulação (mL) e t é o tempo (min).

Imobilização da lipase por adsorção hidrofóbica

Os suportes hidrofóbicos descritos no item 4.1.3 foram primeiramente lavados com

etanol e posteriormente com água destilada. Este tratamento é feito com o objetivo da retirada

de ar de dentro dos poros do suporte. O processo ocorreu da seguinte forma: 1º- Lavagem do

suporte com etanol (100%) durante 30 min, 2º- Lavagem com etanol:água destilada (50:50)

por 10min, 3º- Lavagem com água destilada (100%) até a retirada total do etanol do meio com

os suportes. Uma vez que os suportes já se encontravam hidratados, os mesmos foram pré-

equilibrados com a solução tampão utilizada na imobilização.

O experimento padrão de imobilização consiste em 1 g de suporte hidratado em 10 mL

de solução lipásica selecionada. Utilizou-se diferentes quantidades em unidades enzimáticas

(U) a saber: 50U, 200U, 350U, 700U para cada suporte, afim de se estudar qual a capacidade

máxima de carga/g de suporte. A suspensão foi mantida sob agitação (250 rpm) à temperatura

ambiente. O processo de imobilização foi acompanhado pela determinação da atividade

hidrolítica com p-NFL da suspensão e do sobrenadante em intervalos de tempo de 0, 30, 60,

90, 120 e 180 min. Após estabelecido o melhor tempo, este foi selecionado para dar

continuidade ao processo. Ao término da imobilização, a enzima imobilizada foi removida

por filtração simples, lavada com água destilada e armazenada a 4ºC.

Cálculo dos parâmetros de imobilização

O processo de imobilização foi acompanhado pela determinação da atividade

hidrolítica da solução com p-NFL e da suspensão em tempos determinados. Os parâmetros de

imobilização foram calculados de acordo com as fórmulas a seguir:

95


A eficiência de imobilização (Eimo) foi calculada pela equação (10):

(Eq. 10)

O rendimento de imobilização em atividade (P) foi calculado pela equação (11):

(Eq. 11)

A retenção de atividade (Ra) foi calculada pela equação (12):

(Eq. 12)

Onde Uimo são as unidades de enzima medida após a imobilização (U/g de suporte);

UC são as unidades totais de enzima que são colocadas na etapa de imobilização, no

sobrenadante (U/g de suporte); US são as unidades de enzima do sobrenadante, que não

reagiram com o suporte e que saíram nas primeiras lavagens (U/g de suporte); e UTeo são as

unidades de enzima teoricamente imobilizada (UC-US)/gsuporte.

Dosagem da concentração de proteína

A concentração de proteínas foi determinada pelo método de Bradford, utilizando a

albumina de soro bovino (BSA) como padrão (BRADFORD, 1976). Para o preparo da

solução de Bradford, 10 mg de Coomassie Brilliant Blue G 250 foram solubilizados em 5 mL

de etanol 95%. Após completa homogeneização, adicionaram-se 10 mL de ácido fosfórico

85%, e o volume foi completado com água ultrapura até 100 mL. Posteriormente, esta solução

foi filtrada em papel Whatmam n°1 e estocada ao abrigo da luz. Para a dosagem de proteínas

foram utilizados 1000 μL da solução de Bradford mais 50 μL da amostra diluída, sendo a

leitura feita em espectrofotômetro a 595 nm. Todas as análises de proteína foram realizadas

com triplicatas.

c

imo

U

U 100.(%)

Teo

imoa

U

UR

100.(%)

c

Teoimo

U

UE

100.(%)

96


4.2.6 Teste de estabilidade de estocagem das lipases imobilizadas

A lipase imobilizada sobre os suportes poliméricos foi estocada à temperatura média

de 4º C. A estabilidade da enzima foi testada pela determinação da atividade hidrolítica em

tempos determinados (a cada 10 dias).

4.2.7 Desenho Experimental e Análise Estatística para resolução cinética do rac-3

Para determinação das condições experimentais que maximizassem a resolução

cinética do rac-3, selecionado nos experimentos anteriores, realizou-se previamente um

Planejamento Fracionário 24-1

para a escolha das variáveis que fossem significativas para a

reação de acetilação. Tomou-se por base os conhecimentos prévios para as escolhas das

variáveis independentes (MANOEL, 2011; MANOEL et al., 2012a; CUNHA et al., 2013).

As reações enzimáticas foram realizadas em frascos agitados e termostatizados

contendo diferentes concentrações do substrato, acetato de vinila e Novozym 435. A

quantidade de Novozym 435 utilizada foi calculada a partir da atividade de esterificação da

lipase (estão expressas em U-unidade de atividade da enzima). A atividade de esterificação da

Novozym 435 (conforme descrito na pag. 93) obtida por meio da reação de síntese do oleato

de etila foi de 2728 ± 400 U/gsuporte. O solvente utilizado nas reações foi hexano, uma vez que

foi o melhor solvente encontrado após o estudo da influência de solvente para esta reação

(MANOEL et al., 2012a). O volume final da reação foi de 2,0 mL.

As variáveis selecionadas (com seus valores reais e codificados), para o planejamento

fracionário, estão descritas na Tabela 7.

Tabela 7. Valores reais e codificados das variáveis empregadas no Planejamento experimental Fracionário.

*p-level <0,1

Variáveis independentes Siglas

Intervalos de estudo

-1 0 1

Concentração de substrato (mg/mL) S1 2 8 14

Concentração de agente acilante (mg/mL) S2 186,8 373,6 560,4

Quantidade de Enzima (U) E 54,56 81,84 136,4

Temperatura (oC) T 30 40 50

97


O tempo de reação selecionado foi de 24 horas (alíquotas foram previamente retiradas

nos intervalos 0, 12, 24 e 36h. O tempo de 24h foi considerado o melhor tempo para o

planejamento experimental). Ao final da reação, o biocatalisador foi removido do meio

reacional e o solvente evaporado a vácuo. Os produtos das reações foram analisados em

sistema de CLAE em fase reversa, para a determinar o grau de conversão da reação, e em

coluna quiral, para determinar o excesso enantiomérico do produto.

Após a seleção das variáveis que fossem significativas para o processo, o

Planejamento Composto Central Rotacional (ou DCCR) foi realizado. No presente trabalho, o

planejamento foi feito para 3 variáveis: (23) mais 6 ensaios axiais com 4 repetições no ponto

central totalizando 18 ensaios. Em cada caso a conversão e o excesso enantiomérico foram

verificados. As variáveis que apresentassem valores menores que 0,05% (i.e. 95% de

intervalo de confiança) eram consideradas de valor significativo e portanto, de influência

significativa na maximização da resolução do racemato selecionado (rac-3). As variáveis e

suas faixas foram escolhidas com base nos experimentos do planejamento experimental

fracionário.

As variáveis selecionadas para o DCCR (com seus valores reais e codificados) para o

estudo da resolução cinética de rac-3 catalisada pela Novozym 435 estão descritas na Tabela

8.

Tabela 8. Valores reais e codificados das variáveis empregadas no Planejamento experimental Composto

Central.

A equação do polinômio de segunda ordem para as variáveis foi a seguinte:

𝑌 = 𝑎0 + 𝑎𝑖𝑥𝑖

𝑛

𝑖=0

+ 𝑎𝑖𝑗 𝑥𝑖𝑥𝑗

𝑛

𝑗=𝑖+1

𝑛−1

𝑖=1

(Eq. 13)

Variáveis independentes Siglas

Intervalos de estudo

-1,68 -1 0 1 1,68

Concentração de substrato (mg/mL) S1 2 5 8,5 11,5 15

Quantidade de Enzima (U) E 80,5 136,4 218,2 300,1 355,8

Temperatura (oC) T 23 30 40 50 57

98


onde Y é a variável de resposta, ao é o termo independente, ai o coeficiente do efeito linear, aij

o coeficiente do efeito de interação, xi e xj, são as variáveis independentes.

Os dados de ambos planejamentos experimentais foram tratados com o software

STATISTICA 7.0.

4.2.8 Testes prévios com aumento de volume

Com o objetivo de estudar o comportamento da reação selecionada em um maior

volume, realizou-se um teste para a reação enzimática em uma escala em massa de 100 vezes

maior (escala em grama, antes apenas realizada em miligrama) utilizando as respectivas

proporções de reagentes encontrados no planejamento experimental (para Novozym 435) e na

melhor condição encontrada com o mesmo, em sistema de batelada.

4.2.9 Estudo do reuso das reações de acetilação dos substratos/lipases selecionadas

utilizando o sistema de batelada simples

Após cada reação de 24h de tempo reacional, o experimento foi interrompido e o meio

reacional foi centrifugado. A fase líquida foi recolhida para análise cromatográfica de

conversão e excesso enantiomérico, enquanto o biocatalisador foi separado e cuidadosamente

lavado com acetato de etila para possível retirada do produto e substrato remanescentes da

reação anterior. Posteriormente a lipase foi conduzida para a próxima reação, nas condições

ótimas encontradas. Em cada corrida uma amostra de 100 μL foi retirada para análise da

atividade hidrolítica/esterásica. O reuso do biocatalisador foi feito em sistema de batelada até

que houvesse queda na conversão e/ou perda da atividade enzimática.

99

Capítulo V- RESULTADOS E DISCUSSÃO

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Neste capítulo serão apresentados os resultados com as lipases comerciais e àquelas

produzidas na UFRJ, abordando as diferenças no desempenho nas reações enantiosseletivas.

5.1 SELEÇÃO DE SUBSTRATOS E LIPASES HOME-MADE

Os substratos selecionados para este trabalho foram pesquisados com base na literatura

(DESAI et al., 1994; EINICKER-LAMAS et al., 1999; OLIVEIRA et al., 2000; MILLS e

POTTER, 2002; SIMAS et al., 2011) a fim de escolher não apenas moléculas inéditas para a

aplicação farmacológica, mas também aqueles substratos pouco estudados e/ou com rotas

dispendiosas do ponto de vista da química orgânica.

Com isso foram realizados experimentos preliminares que tinham como objetivo

identificar: os solventes capazes de solubilizar o substrato; as enzimas que seriam capazes de

catalisar a reação de resolução cinética de derivados de mio-inositol (enzimas provenientes da

coleção de culturas do LABIM/UFRJ e BIOSE/UFRJ) e os agentes acilantes que poderiam ser

empregados.

Deste modo, para a realização deste trabalho, foram escolhidas cinco lipases

promissoras do ponto de vista biotecnológico: LIPB (Lipase B de Candida antarctica

expressa em Pichia pastoris - extrato liofilizado); Lipase de Pyrococcus furiosus expressa em

E.coli (imobilizada em diferentes suportes-lipase proveniente da coleção do LABIM/UFRJ);

Lipase vegetal de Jatropha curcas L. e Lipase de Yarrowia lypolitica (extrato liofilizado).

Algumas são citadas na literatura (SOUZA et al., 2009, 2010; GUTARRA et al., 2011;

MARTINS, 2012; FONTES, 2012), outras estão sendo apresentadas pela primeira vez neste

trabalho como biocatalisadores para diversos substratos intermediários farmacológicos.

Os substratos (±)-1,4,5,6-tetra-O-benzil-mio-inositol (rac-1), (±)-1,4,5,6-tetra-O-alil-

mio-inositol (rac-2), (±)-1,3,4-tri-O-benzil-mio-inositol (rac-3) e (±)-3,6-di-O-benzil-1,2-O-

isopropilideno-mio-inositol (rac-4) foram os substratos propostos para investigar a viabilidade

do emprego de lipases na resolução cinética enzimática de derivados de mio-inositol por

reações de alcoólise, em reações em modo de batelada (Figura 47).

100


Bn= Benzil=

Alil=

Figura 47- Derivados de mio-inositol utilizados na resolução cinética por lipases.

Nesta primeira etapa, teve-se como objetivo apenas a realização do screening inicial

para a seleção do biocatalisador mais eficiente para estas reações. O efeito do solvente foi

estudado posteriormente.

A seleção inicial (screening) realizada em sistema de batelada e o resultado dos

produtos das resoluções cinéticas (analisados por CCF) dos racematos podem ser visualizados

na Tabela 9, juntamente com a atividade esterásica determinada para cada biocatalisador.

Como se pode notar, não foi observado formação de produto nas reações de acetilação dos

rac-1 e rac-2 com acetato de vinila (em reação livre de solvente) com os biocatalisadores

testados. A catálise do rac-2 pode não ter ocorrido pela não reatividade do substrato com os

biocatalisadores. Possivelmente a catálise do rac-1 não ocorreu devido ao impedimento

estérico dado pelos substituintes benzila ao lado do grupamento hidroxila, presente neste

substrato.

Outros autores também observaram a não formação de produtos com outros derivados

de mio-inositol benzilados e igualmente atribuíram este fato ao efeito do impedimento

estérico do substrato volumoso no sítio ativo da enzima (LING e OZAKI, 1995; SIMAS et

al., 2011). Ling e Ozaki (1995) notificaram a não formação do produto no estudo da resolução

do 3,4,5,6-O-tetrabenzil-mio-inositol por meio da esterificação enzimática dos grupos

hidroxila (C-1 e C-2) e da hidrólise enzimática do éster correspondente (1,2-O-diacetil-

3,4,5,6-O-tetrabenzil-mio-inositol). Os biocatalisadores utilizados pelos autores foram as

Lipases P, PS e CES (Pseudomonas sp., Amano), KWI-56 (Pseudomonas sp.), Lipase AY

(Candida rugosa) e SP-435 (lipase B de Candida antarctica).

101


Tabela 9. Seleção inicial de lipases por CCF produzidas pelos laboratórios LaBiM e Biose (UFRJ) na resolução cinética de derivados de mio-inositol.

Enzimas

Reação de alcoólise

30º C


40º C


50º C

Atividade esterásica

(U/mL ou U/g)*

rac-1 rac-2 rac-3 rac-4 rac-1 rac-2 rac-3 rac-4 rac-1 rac-2 rac-3 rac-4

Lipase B de Candida antarctica expressa

em Pichia pastoris (LIPB) - - + + - - + + - - + + 33,2 U/mL

Lipase de Pyrococcus furiosus expressa em

E.coli imobilizada em Octilagarose - - - - - - - - - - + + 1,7 U/g


E.coli imobilizada em Glioxil - - - - - - - - - - - + 2,1 U/g


E.coli imobilizada em Accurel - - - - - - - - - - - + 2 U/g

Lipase vegetal de Jatropha curcas L. - - - - - - - + - - - - ---

Lipase de Yarrowia lypolitica liofilizada - - - - - - - - - - - - 1,1 U/mL

Condições das reações em batelada simples: Tempo reacional: 48h; Solvente e agente acilante: Acetato de vinila; Enzima: 220 U; substrato: 5 mg.

Atividade hidrolítica/esterásica pelo método espectrofotométrico utilizando pNFL como substrato. (unidade U/mL refere a unidade das enzimas liofilizadas e em U/g para as imobilizadas.

Símbolos (-) não houve reação; (+) houve reação.

102


A resolução cinética dos racematos e das lipases supra-citadas foi feita utilizando a

princípio acetato de vinila (como agente acilante e solvente da reação), uma vez que este

agente acilante tem se mostrado o mais adequado nas reações com mio-inositol como já

relatado pelo grupo (SIMAS et al. 2011) gerando uma maior conversão.

No estudo com os demais substratos (rac-3 e rac-4) foi possível visualizar a formação

de produto pela análise em CCF. Das cinco lipases utilizadas, três mostraram a capacidade de

catálise nas condições estudadas: lipase B de C. antarctica expressa em P. pastoris, em sua

forma liofilizada; lipase de P. furiosus expressa em E. coli, imobilizada nos três suportes e

lipase vegetal de J. curcas L. (Tabela 10). Posteriormente às análises por CCF, as amostras

foram analisadas por CLAE e o valor da conversão foi calculado. O esquema da possível

reação de acetilação enantiosseletiva de rac-3 pode ser visualizado na Figura 48. Os

resultados da acetilação enantiosseletiva de rac-3, após a realização do screening, podem ser

visualizados na Tabela 10.

Figura 48. Resolução cinética enzimática do racemato rac-3 catalisada por diferentes lipases home-made em

acetato de vinila.

Tabela 10. Resultados do screening realizado com as diferentes lipases na resolução cinética de rac-3 utilizando

acetato de vinila como solvente e agente acilante.

Lipase Conversão

(X%) eep

b E

c

Tempo reacional/

Temperatura

LIPB- Lipase B de

Candida antarctica

expressa em Pichia

pastoris

3 n.d n.d 24h/ 30º C


furiosus expressa em

E.coli imobilizada em

Octilagarose

2,8 n.d. n.d. 48h/ 50º C




2,5 n.d. n.d. 48h/ 50º C

103


Glioxil

Lipase vegetal de

Jatropha curcas L.

2 n.d. n.d. 24h/ 40º C

O esquema da possível reação de acetilação enantiosseletiva para o rac-4 pode ser

visualizado na Figura 49. Os resultados da acetilação enantiosseletiva para o rac-4, após a

realização do screening, pode ser visualizado na Tabela11.

Figura 49. Resolução cinética enzimática do racemato rac-4 catalisada por diferentes lipases home-made em

acetato de vinila.

Tabela 11. Resultados do screening realizado com as diferentes lipases na resolução cinética de rac-4 utilizando

acetato de vinila como solvente e agente acilante.

Lipase Conversão*

(X%) eep

b E

c

Tempo reacional /

Temperatura

LIPB- Lipase B de

Candida antarctica

expressa em Pichia

pastoris

18 99 >200 24h/ 30º C




Octilagarose

2,5 n.d. n.d. 48h/ 50º C




Glioxil

1,5 n.d. n.d. 48h/ 50º C

Condições das reações em batelada simples: Solvente e agente acilante: Acetato de vinila; Enzima: 220 U; substrato:

5 mg. *n.d.=não detectado

104





Accurel

2 n.d. n.d. 48h/ 50º C

Lipase vegetal de

Jatropha curcas L.

6 n.d. n.d. 24h/ 40º C

*Condições das reações em batelada simples: Solvente e agente acilante: Acetato de vinila; Enzima: 200 U;

substrato: 5 mg.

Como se pode observar nas tabelas 10 e 11, a reação de alcoólise mostrou maior

conversão quando a LIPB, em sua forma liofilizada, foi utilizada como biocatalisador para o

substrato rac-4. Apesar da baixa conversão na resolução cinética de rac-3 (3%), como esta

apresentou melhor resultado em comparação com as demais, este substrato foi selecionado

juntamente com o rac-4 (18%) para os estudos de imobilização, que serão apresentados mais

adiante nesta tese. Por esta razão, selecionou-se esta lipase para os estudos da otimização da

resolução cinética para ambos os substratos com a finalidade de, ao final do estudo,

compararmos os resultados deste biocatalisador com o comercial: Novozym 435 (lipase de C.

antarctica B imobilizada em resina acrílica), CALB em sua forma liofilizada e CalB

imobilizada com os suportes inéditos preparados na UFRJ.

As Figuras 50 e 51 apresentam os cromatogramas das reações de acetilação da LIPB

com o rac-3 e rac-4 mostrando os produtos formados: L-(-)-2 e L-5. A reação foi

regiosseletiva formando apenas um dos produtos mono-O-acetilados possíveis. Não houve a

formação do produto diacetilado (os cromatogramas das triplicatas não apresentaram pico

referente ao mesmo, como observado na Figura 40 e 44, respectivamente).

105


Figura 50. Cromatograma em sistema de CLAE em fase reversa (Shimadzu C-18) da reação de acetilação do

rac-3 catalisado pela LIPB em sua forma liofilizada em acetato de vinila após 24 horas de reação. Os picos nos

tempos de 8,102 e 12,04 são substrato e produto formado, respectivamente.

Figura 51. Cromatograma em sistema de CLAE em fase reversa (Shimadzu C-18) da reação de acetilação do

rac-4 catalisado pela LIPB em sua forma liofilizada em acetato de vinila após 24 horas de reação. Os picos nos

tempos de 9,323 e 15,425 são substrato e produto formado, respectivamente.

A literatura apresenta trabalhos de resolução cinética enzimática com excelentes

resultados utilizando derivados de mio-inositol com menor impedimento estérico (LAUMEN

e GHISALBA, 1999). Os autores estudaram a resolução cinética enzimática do (±)2,6-di-O-

106


benzil-mio-inositol utilizando a lipase B de Candida antarctica (Novozym 435) como

biocatalisador em acetato de vinila. A reação foi regiosseletiva e enantiosseletiva

esterificando apenas o grupo hidroxila do C-5 do isômero L, o produto monoacetilado L-5-O-

acetil-2,6-di-O-benzil-mio-inositol foi obtido com 49% de conversão e 99% de excesso

enantiomérico. A posição do grupo hidroxila quiral do mio-inositol reconhecido pela enzima

foi dependente das substituições existentes no substrato.

A investigação do melhoramento da resolução cinética de rac-4 com a Novozym 435

foi estudada recentemente pelo nosso grupo de estudo. O estudo da otimização de solventes

mostrou que o uso do acetato de vinila como solvente e agente acilante resulta em 49,9% de

conversão do isômero L-5 (L-(-)-5-O-acetyl-3,6-di-O-benzil-1,2-O-isopropilideno-mio-

inositol), com alto enantiosseletividade (>99%) e razão enantiomérica (E>100) em 48h de

tempo reacional (CUNHA et al., 2010). Por outro lado, quando TBME foi usado como

solvente (acetato de vinila como agente acilante), em apenas 24h foi possível obter 48% de

conversão (eep>99% e E>100). Com base nestes resultados, os autores realizaram um

planejamento experimental em batelada simples e acetato de vinila como agente acilante

(meio livre de solvente). As variáveis independentes utilizadas foram temperatura, percentual

de água, quantidade de enzima e quantidade de substrato. A condição que maximizou a

resolução cinética de rac-4 (49,2% de conversão; eep>99%; E > 100) foi 45º C de

temperatura, 5mg/mL de substrato, 71 U de enzima e 0% de água. Com o planejamento

experimental foi possível reduzir o tempo reacional para 24h (antes 48h). Os autores

aumentaram ainda em 14 vezes a produtividade da reação (0,0145mgproduto/mgenzima.h

comparado com a condição não otimizada [0,001mgproduto/mgenzima.h]) (CUNHA et al., 2012).

Uma vez tendo as condições otimizadas para o racemato 4 (rac-4), em batelada

simples, utilizando a lipase comercial Novozym 435 (CUNHA et al., 2013), resolveu-se

estudar o comportamento deste biocatalisador para o rac-3, no mesmo sistema reacional.

5.2 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL DA REAÇÃO DE

ACETILAÇÃO DE RAC-3 UTILIZANDO A LIPASE NOVOZYM 435 EM

SISTEMA DE BATELADA

O estudo da otimização da resolução cinética de rac-3 catalisada pela enzima

Novozym 435 foi feito por meio de métodos estatísticos: Planejamento Fatorial Fracionário e

Planejamento Composto Central Rotacional. O objetivo principal da otimização do processo

foi encontrar os parâmetros que resultassem na máxima formação do produto

107


enantiomericamente puro, em um menor intervalo de tempo, aumentando a produtividade e

reduzindo os custos da produção.

Primeiramente, para determinar quais seriam as variáveis de efeito significativo na

resolução cinética, um Planejamento Fatorial Fracionado foi realizado. As variáveis

selecionadas foram temperatura, concentração de enzima, concentração de substrato e

concentração de agente acilante. A concentração de água foi de 0 mg/mL, uma vez que em

trabalhos anteriores, pôde-se notar um melhor desempenho da lipase Novozym 435 com os

derivados de mio-inositol na ausência de água (CUNHA et al., 2013). Logo, foi realizado um

planejamento com 24-1

ensaios e três pontos centrais. As faixas das variáveis estudadas foram

escolhidas com base em experimentos prévios de reação de resolução cinética e testes de

solubilidade.

Recentemente, estudou-se o efeito de diferentes solventes e agentes acilantes na

resolução cinética de rac-3 com a enzima Novozym 435 (MANOEL et al., 2012a). Neste

trabalho, obteve-se 48,3% de conversão (97% eep e E>200) quando hexano foi utilizado como

solvente e acetato de vinila como agente acilante (1,5:1), em 112h de tempo reacional. Por

este motivo este sistema de solventes foi selecionado para as reações dos planejamentos

experimentais. Após os ensaios preliminares o tempo reacional selecionado foi de 24h.

5.2.1- Análise estatística dos dados

Seleção das variáveis pelo Planejamento Fatorial Fracionário

O primeiro tratamento estatístico realizado, Planejamento Fatorial Fracionário, com os

valores reais e codificados para as variáveis independentes e para a variável de resposta

conversão (X%), está apresentado na Tabela 6 (pag.110). Para todos os casos, o eep foi de

98% (± 0,8).

Os resultados do planejamento Fatorial Fracionário revelaram que as concentrações de

enzima e de substrato são as variáveis mais relevantes para a variável de resposta conversão.

O gráfico de pareto apresenta de forma rápida e clara estes fatores estatisticamente

importantes (Figura 52).

108


Figura 52. Gráfico de pareto após o Planejamento Fatorial Fracionário mostrando as variáveis significativas para

a variável conversão (X%), após o tracejado vermelho (* p-level < 0,1).

Os resultados representados pelo gráfico de pareto mostram que os efeitos cujos

retângulos estiverem à direita da linha divisória (p=0,1) devem ser considerados no modelo

matemático, ou seja, se os fatores que estão representados segundo o teste t de Student

ultrapassarem a linha rejeitam a hipótese nula, sendo então significativos. Os fatores que não

ultrapassam essa linha divisória aceitam a hipótese nula e por isso são considerados não

significativos estatisticamente. Os valores encontrados no teste t de Student são utilizados

nesse tipo de análise em módulo, não considerando os sinais positivos ou negativos. Os

valores ao lado de cada retângulo representam a estatística de teste t de Student, que também

podem ser encontrados na tabela de coeficiente de correlação, quando gerada pelo programa

Statistica.

Embora a variável temperatura não tenha sido considerada estatisticamente

significativa para o Planejamento Fatorial Fracionário, esta variável foi inserida no

Planejamento Composto Central Rotacional (DCCR). Estudos univariáveis realizados para

esta variável mostraram que a mesma é um fator determinante na conversão do substrato à

produto conforme apresentado na Tabela 12.

109


Tabela 12. Influência da variável temperatura na conversão em 48h de tempo reacionala

aEnsaios com 136,4 U de Novozym 435 e 5mg/mL de rac-3

Os resultados do Planejamento Fatorial Fracionário (Tabela 13) resultaram em um

coeficiente de determinação significativo (R2 = 96,9%). Esse valor demonstra a significância

do modelo, uma vez que do total de variações (100%), o modelo foi incapaz de explicar

apenas 3,1%.

A variável agente acilante (S2) foi a menos significativa para a influência da

conversão. Logo a concentração desta variável foi fixada para os ensaios no planejamento

composto central rotacional (DCCR) na menor concentração utilizada (0,3 mL de acetato de

vinila em 1,7 ml de hexano-Volume final de 2 mL).

110


Tabela 13. Matriz do Planejamento Fatorial Fracionário com os valores reais e codificados para as variáveis independentes e para a variável de resposta conversão (X%).

111


Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR)

Com base nos resultados do modelo fracionário, o Planejamento Composto Central

Rotacional (DCCR) com 23 ensaios, incluindo quatro réplicas no ponto central e seis pontos

axiais, foi empregado para obter o modelo de segunda ordem a fim de avaliar a influência das

variáveis do processo (variáveis independentes) no rendimento final de L-(-)-2. As seguintes

variáveis foram selecionadas para o DCCR: atividade enzimática (U ou µmol/min),

concentração do substrato (mg/mL) e temperatura (oC). Os resultados do tratamento

estatístico estão apresentados na Tabela 14. Para todos os casos, eep permaneceu maior que

98%.

O maior valor de conversão obtido foi de 51,66% no ensaio 2. Todas as amostras

apresentaram um baixo percentual de erro. Os valores das conversões foram similares aos

seus respectivos valores preditos com um máximo de desvio de -4,7% (ensaio 10).

A análise do DCCR revelou que a interação entre os termos lineares da concentração

do substrato e da temperatura (S.T) e a interação entre os termos lineares da temperatura e da

atividade enzimática (E.T) não mostraram significância estatística.

112


Tabela 14. Matriz do Planejamento Composto Central Rotacional com os valores reais e codificados para as variáveis independentes e para a variável de resposta conversão

(X%), tempo reacional de 24hs.

113


Os efeitos estimados (em termos das variáveis escalonadas) gerados a partir do DCCR

podem ser visualizados na Tabela 15 (apenas as variáveis significativas estão apresentadas na

Tabela). Igualmente o valor do test t está apresentado na tabela, logo a significância estatística

dos parâmetros pode ser analisada. A análise da significância dos coeficientes pode ser

encontrada na Tabela dos efeitos estimados (coeficientes das variáveis escalonadas, uma vez

que as variáveis originais apresentam valores com diferentes ordens de grandeza).

Tabela 15. Efeitos estimados para a análise da variável de resposta conversão na resolução cinética de rac-3

(apenas com as variáveis que apresentaram efeito significativo).

aFatores significativos p<0,05.

Os termos lineares e quadráticos da variável concentração de substrato e os termos

quadráticos da quantidade de enzima adicionada e da temperatura mostraram um efeito

negativo para a variável de resposta conversão na faixa estudada. Por outro lado, os termos

lineares da temperatura e da atividade enzimática mostraram um efeito significativo na faixa

estudada. Como esperado, o aumento da conversão foi observado. De fato, a forte

dependência da temperatura e na quantidade de enzima adicionada na conversão foi

estabelecida.

Além disso, o ajuste do modelo estatístico para os dados experimentais foi confirmado

pela Tabela da ANOVA (Tabela 16).

114


Tabela 16. Análise de variância para desenvolvimento experimental da resolução cinética de rac-3.a

aCoeficiente de determinação (R

2) = 0,9687.

bF0,05; 9; 8 (Ftabelado) = 3,50.

O valor do teste F (27,52) mostrou ser significativo, uma vez que o F-calculado foi

maior que o valor do teste Ftabelado (3,50), levando então a rejeição da hipótese nula. Portanto,

uma vez que o valor do teste F foi maior aproximadamente 8 vezes ao test F tabelado, com

alta significancia (p = 0,000044), o modelo pode ser considerado predito. Além disso, o

coeficiente de determinação foi altamente significativo (R2 = 96.87%), o que significa que o

modelo não explica somente 3,13% do total de variação.

Diante do exposto, o modelo de segunda ordem que considera os parâmetros

estatisticamente significativos (p <0,05) e que descreve o efeito do aumento da conversão na

resolução cinética de rac-3, foi gerado a partir das variáveis escalonadas, originando a

equação 14:

X%= 48,37 – 7,60.S – 3,29.S2 + 6,14. E – 4,70. E

2 + 7,80.T – 5,94. T

2 + 3,04. S.E

Eq. (14)

onde S, E e T representam a concentração de substrato, quantidade de enzima na reação (U) e

temperatura, respectivamente. As siglas S2, E

2 e T

2 representam os termos quadráticos para a

concentração de substrato, quantidade de enzima adicionada e temperatura. As interações

entre os termos lineares concentração de substrato e enzima foram representados por ―S.E‖.

Análise dos resíduos

A verificação da adequação do modelo pode ainda ser estudada pela análise dos

resíduos. Para isso é preciso realizamos a análise da variância. Este é um teste exato de

hipóteses de nenhuma diferença nas médias dos tratamentos. Dessa forma, é primordial

verificar que essas suposições sejam válidas, por meio de testes dos resíduos.

115


Teste da Normalidade

O gráfico de probabilidade normal dos resíduos foi gerado e apresentado na Figura 53.

Figura 53. Gráfico da probabilidade normal dos resíduos gerado após o DCCR da análise da resolução cinética

de rac-3.

Desta forma, verificou-se que os resíduos seguem uma distribuição normal, visto que

os pontos experimentais estão próximos da linha contínua, o que é representativo de um bom

modelo. Quanto mais próximos os pontos experimentais estiverem da linha contínua, mais

será válida a suposição da normalidade dos resíduos. Segundo Calado e Montgomery (2003),

os pontos devem estar cobertos por um ―lápis gordo‖ colocado sobre a linha reta. Isso garante

a normalidade dos resíduos.

Com o objetivo de averiguar a variância constante dos erros, a Figura 54 foi gerada.

Figura 54. Gráfico da homogeneidade da variância-valores observados x Resíduos gerado após o DCCR da

análise da resolução cinética de rac-3.

116


A análise do gráfico de homogeneidade da variância pode apresentar 4 diferentes

padrões de comportamento, sendo a forma aleatória o aspecto esperado deste gráfico

(CALADO e MONTGOMERY, 2003). A Figura 54 apresenta o padrão de comportamento

obtido na análise da variável de resposta (conversão). Comparando o resultado obtido nesta

Figura com os padrões de comportamento da homogeneidade da variância (CALADO e

MONTGOMERY, 2003), pode-se concluir que o padrão na forma aleatória é o que melhor

descreve o comportamento obtido neste trabalho.

Uma forma de obter uma análise quantitativa de teste de normalidade é realizando os

testes de Shapiro e Kolmogorov-Smirnov. O teste foi realizado e confirmou a normalidade

dos resíduos (Figura 55).

Figura 55. Gráfico de Shapiro e Komogorov com p= 0,9844 e p>0,20, respectivamente.

Neste trabalho, os testes confirmaram a suposição de normalidade dos resíduos, tanto

para Shapiro (p = 0, 9844), quanto para Kolmogorov (p > 0,20). Logo a hipótese nula (Ho) foi

aceita significando que os resíduos têm distribuição normal.

Análise das superfícies de resposta e gráficos de contorno

A análise da superfície de resposta é importante pois a partir dela é possível

visualizarmos a robustez experimental do processo (RODRIGUES e IEMMA, 2005). Com os

resultados obtidos do modelo foi possível gerar as superfícies de resposta e os gráficos de

contorno.

117


A Figura 56 representa a superfície de resposta (esquerda) e o gráfico de contorno

(direita) na interação entre a temperatura e a quantidade enzimática (em termos de unidades

de enzima adicionada-U) na conversão.

Figura 56. Superfície de resposta (esquerda) e gráfico de contorno (direita) na interação entre

as variáveis temperatura e atividade enzimática para a variável de resposta conversão (X%). O

valor da concentração do substrato foi fixada em 4mg/mL.

Como pode ser observado na Figura 56, a interação da temperatura e da atividade

enzimática contribui para o aumento da conversão, indicando o efeito benéfico de ambas as

variáveis (efeito significativamente positivo). A superfície indica que o melhor valor de

conversão encontrado foi obtido no ponto médio do eixo da atividade enzimática e da

temperatura, passando em um ponto ótimo. Valores acima de 55º C no entanto, mostraram

uma queda da conversão. Esse resultado já era esperado, uma vez que a utilização de

temperaturas muito altas pode diminuir a estabilidade da enzima, diminuindo a sua resposta

sobre a conversão. Além disso, as altas temperaturas podem degradar o substrato ou os

produtos lábeis e aumentar o custo do processo (CUNHA, 2011).

Yadav e Sivakumar (2004) igualmente observaram o aumento da conversão com a

temperatura durante o estudo de hidrólise de R,S-(+)-mandelato de metila catalisada pela

Novozym 435 em meio orgânico, na faixa de temperatura de 30-60°C. Quando a temperatura

passou de 30 para 50°C, houve um aumento da conversão. Entretanto para temperaturas

superiores a 60°C, ocorreu a diminuição da concentração. Os autores atribuíram este fato à

desnaturação da proteína a altas temperaturas, causando a redução da atividade enzimática.

118


Por outro lado, na Figura 57, no gráfico de superfície de resposta e de contorno para a

interação entre o substrato e a atividade enzimática, os efeitos entre estas variáveis foram

diferentes para se obter a máxima conversão.

Figura 57. Superfície de resposta (esquerda) e gráfico de contorno (direita) na interação entre as variáveis

concentração de substrato e atividade enzimática, para a variável de resposta conversão (X%). O valor da

temperatura foi fixada em 40º C.

Quanto menor a concentração do substrato e maior atividade enzimática, em termos de

unidades total adicionada, maior a conversão. Outros resultados foram obtidos por Cunha

(2011). Neste trabalho, a autora observou que a concentração do derivado de mio-inositol

utilizado não influenciava o aumento ou a diminuição da conversão. Possivelmente, os

distintos grupos constituintes dos derivados de mio-inositol podem estar influenciando a

regiosseletividade da enzima, alterando os valores de conversão.

Com isso, o modelo para a resolução cinética de rac-3 utilizando Novozym 435 com

acetato de vinila em hexano resultou nas seguintes condições ótimas dentro das faixas

estudadas: 45º C, 4mg/mL de substrato e 222,8 U de enzima (valores obtidos pela função

desirability do Statistic). A acurácia do modelo foi validada com três replicas nas condições

ótimas supramencionadas. Os resultados da conversão após a validação do modelo foram de

49,7% ± 0,2% depois de 24h de reação contra o valor predito de 52% de conversão (Figura

58).

119


Figura 58. Cromatograma da reação de acetilação do rac-3 com a Novozym 435 em acetato de vinila e hexano.

O eep foi maior que 98% (E > 200) em todas as amostras durante o tempo reacional de

24h (Figura 59).

Figura 59. Cromatograma do produto L-(-)-2 obtido na reação de acetilação do rac-3 com a Novozym 435 em

hexano.

A curva de progresso da reação enzimática foi realizada nas condições ótimas e está

representada na Figura 60.

Figura 60. Curva de progresso da resolução cinética de rac-3 em hexano catalisada pela Novozym 435 nas

condições ótimas encontradas no planejamento experimental: 45 °C, 4 mg/mL de substrato e 222,8U de

atividade enzimática.

120


Embora o melhor valor da concentração do substrato no planejamento experimental

para a resolução cinética de rac-3, tenha sido de 4mg/mL, o desejável seria um aumento da

concentração de substrato por uma questão de economicidade e viabilidade do processo

(maior concentração de substrato com a mesma quantidade de enzima). Por isso testes foram

realizados na tentativa de aumentar esta concentração, mantendo as outras variáveis, de forma

que não houvesse queda na conversão. Os resultados podem ser analisados na Figura 61.

Figura 61. Gráfico de contorno para a variável de resposta conversão (X%) usando 220U da lipase Novozym

435. Valores de concentração de substrato foram fixadas (a) 4 mg/mL, (b) 8,5 mg/mL, and (c) 14 mg/mL.

Os resultados mostraram que nas concentrações de substrato dentro do intervalo de 4 a

8,5mg/mL e utilizando 220U de lipase, ainda foi possível obter altos valores de conversão

(Figura 61a,b). Um aumento adicional da concentração de substrato de até 11 mg/mL não

mostrou perdas significativas na conversão. O uso de maiores valores de concentração de

substrato (14 mg/mL -Figura 61c) exigiria maior carga de enzima (280U) para obter o mesmo

nível de conversão. Dependendo do processo, estes valores poderão tornar o processo menos

vantajoso do ponto de vista econômico. Por outro lado, dependendo do processo, maiores

valores de carga enzimática podem gerar maiores quantidades de produto formado, logo esse

valor precisa ser estudado.

Claramente, o planejamento experimental reduziu o tempo reacional, uma vez que

antes das condições otimizadas eram necessárias 112h para obter a máxima conversão de

48,3% na resolução cinética do rac-3. De fato, o efeito da otimização na produtividade

específica da reação foi significativa (Figura 62).

121


Figura 62. Produtividade e evolução da conversão na resolução cinética de rac-3 nas condições ótimas não

otimizadas (Manoel, 2011) e nas condições otimizadas (45 °C, 4 mg/mL da concentração de substrato e 222,8 U

de atividade enzimática).

Apesar da acentuada queda da produtividade ao longo do tempo, a produtividade da

reação na condição otimizada superou a da condição não otimizada. Pouca variação da

produtividade foi observada após as 20h de reação (oitavo ensaio) em ambas condições (não

otimizada e otimizada).

Apesar de a máxima conversão ter sido encontrada após 24h de reação, a

produtividade neste tempo não seria a máxima. Todavia, como pode ser observado na Figura

49, há um ponto de intercessão entre a produtividade máxima e a conversão. Este intercepto

ocorre em 8h de tempo reacional. Então, dependendo do objetivo do trabalho, quando se

deseja a maior produtividade no processo e ao mesmo tempo, o máximo valor de conversão,

as reações podem ser interrompidas no tempo reacional de 8h. Assim, por meio do processo

de otimização do sistema pelo DCCR, a produtividade teve um aumento de 15 vezes (0,006

mgproduto/[mgenzima x h] com 8h de tempo reacional) em relação ao protocolo original: 0.0004

mgproduto/[mgenzima x h] – 112h de tempo reacional (MANOEL et al., 2012a).

Além de aumentar o desempenho catalítico de conversão (máxima conversão em um

curto intervalo de tempo) na resolução cinética de rac-3 pela Novozym 435, a otimização

promove maior economia, como a utilização de menores quantidades de solvente e de

catalisador necessários no processo. Além disso, a conversão elevada obtida (49,7 ± 0,2%)

122


permitiu a síntese tanto do produto acilado (ee%> 99) quanto do substrato restante (aquele

que não reagiu, com ee igual a 95%), ambos em sua forma enantiomericamente pura.

Neste trabalho, todo o produto formado (intermediário farmacológico L-(-)-2) foi

posteriormente utilizado para a síntese final do fármaco de interesse. Por este motivo o

objetivo nesta etapa do trabalho foi obter a maior conversão deste produto, por intermédio da

catálise enzimática, para então utilizá-la nas etapas finais na síntese orgânica. Deste modo, as

reações posteriores foram interrompidas com tempo de reação de 24h, onde foi obtido o

máximo valor de conversão.

Reações em escala maior

Com o objetivo de avaliar se a condição ótima em escala de bancada resultaria na

mesma conversão quando as reações fossem submetidas a outras escalas de trabalho e

sabendo a importância do ajuste do processo na escala laboratorial para a escala de planta

piloto ou em escala comercial, um estudo de aumento de volume reacional foi realizado em

reatores do tipo batelada (manteve-se as mesmas relações geométricas dos reatores).

A condição estipulada após o DCCR pôde ser reproduzida em escala maior (aumento

de 100x), em escala de grama (g). O processo pôde ser reproduzido e os resultados

encontrados mostraram alta conversão (50% ± 1), seletividades (eep maior que 99%; E maior

que 100) e ainda valores de produtividade idênticos aos obtidos nas reações com menor

volume. (Tabela 17).

Tabela 17. Resultados na condição ótima de rac-3 (45 °C, 4 mg/mL da concentração de substrato e 222,8 U de

atividade enzimática) em sistema de batelada utilizando escala de mg e uma escala maior (100x).

Escala X(%) eep(%) E Produtividade

(mgproduto/[mgenzima x h)

1x 49,7± 0,20 >99 >100 0,006

100x 50± 1 >99 >100 0.006

123


Reuso do biocatalisador

O reuso da enzima imobilizada é importante para a viabilidade econômica dos

processos que utilizam biocatalisadores imobilizados. Os resultados de re-uso desta enzima na

reação otimizada anteriormente em sistema de batelada estão apresentados na Figura 63.

Figura 63. Estabilidade operacional na resolução cinética de rac-3 por Novozym 435 sob as condições

concebidas para: 4 mg / mL de substrato, 222,8 U de enzima, a 45 ° C de temperatura em sistema de batelada.

A lipase imobilizada foi utilizada por 14 dias consecutivos (com 24h para cada ciclo).

Até o 7º reciclo, praticamente, não houve queda da conversão (49%± 0,7), deste ponto até o

10º reciclo, a conversão mostrou uma ligeira queda (40% ± 0,5). Ao longo deste estudo de re-

uso foi observada a desintegração gradativa da estrutura polimérica do suporte, o que

provavelmente pode ter levado a lixiviação do biocatalisador e consequentemente a queda dos

valores de conversão. Apesar da queda na conversão, todos os ciclos, do 1º até o 10º reciclo,

resultaram em 98% eep e E maior que 100. Não houve queda da atividade hidrolítica até o 7º

reciclo. Estes resultados justificam plenamente o uso da lipase imobilizada e qualifica o

procedimento otimizado em maior escala (grama) na síntese enantiosseletiva para derivados

de mio-inositol.

124


5.2.3 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL DA REAÇÃO DE ACETILAÇÃO DE

RAC-3 UTILIZANDO A LIPASE NOVOZYM 435 EM SISTEMA DE FLUXO

CONTÍNUO

Apesar do sucesso das reações catalisadas pela Novozym 435 em reatores

descontínuos, o uso do sistema em fluxo contínuo foi realizado para a possível redução do

tempo reacional e do biocatalisador.

A Figura 64 representa o esquema da reação em sistema de fluxo contínuo.

Figura 64. Resolução cinética de rac-3 utilizando a lipase Novozym 435: (A) sistema em batelada (B) sistema de

fluxo contínuo em leito fixo.

Mesmo conhecendo a melhor condição de reação para o rac-3 em sistema de batelada,

reator do tipo BSTR, esta condição não necessariamente seria a mesma para o sistema de

fluxo contínuo em leito fixo, pois inúmeras são as variáveis que distinguem um sistema do

outro. A possibilidade de melhorar ainda mais a eficiência reacional com o aumento da

conversão, estereoseletividade e produtividade em um novo sistema, levou ao estudo em

reator de fluxo contínuo.

Escolha do melhor sistema de solvente-agente acilante para o sistema de fluxo contínuo

Tomou-se como ponto de partida, a investigação dos solventes e agentes acilantes que

têm sido considerados na resolução de rac-3 quando Novozym 435 foi usada (MANOEL et

al., 2012a). Assim, uma solução contendo o rac-3, acetato de vinila e acetato de etila (como

solvente e agente acilante, respectivamente) foi bombeada através do reator de leito fixo

carregado com 527 mg de Novozym 435 (2728 U/gsuporte). Utilizaram-se diferentes

125


temperaturas, tempos de residência e proporções de rac-3 e acetato de vinila nesta primeira

investigação. O esquema da reação está apresentado na Figura 65.

Figura 65. Resolução cinética de rac-3 utilizando a lipase Novozym 435, acetato de vinila como agente acilante

e acetato de etila como solvente.

Os resultados da conversão em função da temperatura para diferentes tempos de

residência, no reator de fluxo contínuo, estão apresentados na Tabela 18.

Tabela 18. Resolução cinética de rac-3 em acetate de etila como solvente da reação em sistema de fluxo

contínuo.

Os dados apresentados na Tabela 18 (Ensaios 1 ao 4) mostram que baixos valores de

conversão foram encontrados na resolução cinética de rac-3 no sistema de fluxo contínuo. O

Ensaio

rac-3 /

acetato de

vinila

Temperatura

Tempo de

Residência

Conversão

(X%)

1 1:5 30ºC

3 min 0,1

1,5 min 0,1

2 1:5 60ºC

3 min 5,8

1,5 min 2,4

3 1:15 30ºC

3 min 2

1,5 min 1,3

4 1:15 60ºC

3 min 9

1,5 min 3

126


aumento da temperatura e do tempo de residência aumentaram os valores de conversão,

entretanto estes valores ainda permaneceram muito baixos. Outros valores de temperatura

foram igualmente estudados (40 e 50º C), todavia resultados semelhantes foram obtidos.

Os resultados apresentados na Tabela 18 são diferentes daqueles apresentados por

Manoel et al., (2012a) quando estudaram diferentes solventes na resolução de rac-3, em

sistema de batelada. Neste trabalho, os autores observaram que o uso do acetato de etila

revelou uma elevada conversão quando foi utilizado como solvente do meio de reação (com

29,4% de conversão em 112h de tempo de reação). Isso revela o quão diferentes sistemas

reacionais podem resultar em diferentes comportamentos.

Outra possível explicação para o baixo rendimento observado na Tabela 18, para as

reações em fluxo contínuo, seria a possibilidade de uma reação de transesterificação

preferencial entre o acetato de etila e o acetato de vinila, que conduz ao consumo do agente de

acetilação mais reativo.

Recentemente, foi obtida a melhora significativa no rendimento na biotransformação

de rac-3 quando hexano foi utilizado como solvente, seguido do TBME (MANOEL et al.,

2012a, TREVISAN et al., 2013). Entretanto, devido à baixa solubilidade do substrato em

hexano, decidiu-se realizar as reações em TBME (Tabela 19). Com exceção do solvente, os

ensaios foram feitos sob as mesmas condições anteriores (Figura 66).

Figura 66. Resolução cinética de rac-3 utilizando a lipase Novozym 435, acetato de vinila como agente acilante

acetato de etila como solvente.

127


Tabela 19. Resolução cinética de rac-3 em TBME como solvente da reação em sistema de fluxo contínuo.

128


Como mostrado na Tabela 19, os resultados obtidos pela utilização de TBME como

solvente são muito melhores comparativamente às reações onde acetato de etila foi avaliado

como solvente (Tabela 18). Em geral, as proporções de 1:10 e 1:15 (substrato / acetato de

vinila) resultaram nos melhores valores de conversão / seletividade. A utilização de um menor

excesso de acetato de vinila (1:5) gerou baixos valores de conversão e E inferior (ensaios 1, 4,

7 e 10, Tabela 19).

O sistema de fluxo contínuo com TBME como solvente, além de resultar em maiores

produtividades, permitiu o uso de menores quantidades de acetato de vinila, em comparação

ao processo de batelada (1:300 proporção de substrato/acetato de vinila), o que torna o

processo mais interessante do ponto de vista econômico.

Em relação a temperatura, os melhores rendimentos foram alcançados no intervalo

entre 50 e 60 °C (Tabela 19). Os resultados obtidos a 30 e 40 °C podem ter conversões

melhoradas com o uso de uma proporção maior de agente de acetilação (Tabela 19, ensaios 1

ao 3 (30º C) e 4 ao 6 (40º C)) ou por tempos de residência mais longos, com a consequente

diminuição de produtividade. Independentemente da temperatura escolhida, um tempo de

permanência de apenas 3 minutos gerou a mais alta conversão para o produto (L-(-)-2) com

elevado excesso enantiomérico (eep) e razões enantioméricas (E). Por esta razão, as melhores

condições obtidas pela resolução cinética de rac-3, com o acetato de vinila sob condições de

fluxo contínuo (1:10, 50°C e 3 minutos de tempo de residência) resultaram em uma

produtividade 531 vezes maior (3,188 mgproduto/mgenzima. h) do que no processo em batelada

(0,006 mgproduto/mgenzima. h).

A condição de reação que resultou no melhor desempenho para o rac-3, quando

submetidas em sistema de fluxo, foi aplicada a outros agentes de acetilação a fim de

confirmar o uso do acetato de vinila como a melhor opção para o sistema de fluxo contínuo.

Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 20.

129


Tabela 20. Resolução cinética de rac-3/acetato de vinila (1:10) em TBME catalisado pela Novozym 435 a 50oC

em condições de fluxo contínuo (tempo de residência de 3min) usando diferentes agentes acilantes.

Os resultados obtidos por meio da utilização de acetato de isopropenila e anidrido

acético em TBME (ensaios 1 e 2, Tabela 20) foram satisfatórios. Contudo, quando

comparados com a sequência anterior, utilizando acetato de vinila (ensaio 8, Tabela 19),

percebe-se uma pequena diminuição na conversão e na seletividade. TBME, como solvente, e

acetato de etila, como agente de acilação, conduziram a baixa conversão e seletividade

moderada (ensaio 3, Tabela 20). Uma vez que o TBME é considerado um bom solvente para

esta reação (MANOEL et al., 2012a), uma probabilidade para a diminuição da seletividade e

conversão seria pelo uso do acetato de etila, menos reativo que o acetato de vinila.

A reutilização do biocatalisador empacotado na coluna foi avaliada por vários dias,

efetuando a resolução cinética de (±) -1,3,6-tri-O-benzil-mio-inositol (rac-3), nas melhores

condições, e os resultados são mostrados na Figura 67.

130


Figura 67. Integridade do reactor de leito fixo depois de nove ciclos na resolução cinética de rac-3 utilizando a

Novozym 435 como biocatalisador, nas melhores condições experimentais: TBME como solvente, acetato de

vinila, como doador de acila (proporção 1:10), a 50◦C. Tempo de residência: 3min.

A integridade do biocatalisador foi investigada em todas as reações. A coluna

empacotada com 527 mg de Novozym 435 foi reutilizada 9 vezes sem que houvesse perda de

conversão. Além disso, durante as reações não foi observado lixiviação de proteína e nem

queda da atividade enzimática. Este fato foi comprovado por meio da dosagem de proteína e

de atividade na solução (rac-3 solubilizado em TBME e acetato de vinila) a todo tempo. A

lixiviação de proteínas precisa ser investigada uma vez que esta pode jusificar uma possível

queda na conversão, uma vez que há menos catalisador disponível para a reação

enantiosseletiva.

O sistema em fluxo contínuo tem sido cada vez mais utilizado em síntese orgânica e é

uma ferramenta importante para o desenvolvimento de novas metodologias reacionais (RAO,

et al., 2009). Todavia, apesar de numerosos trabalhos estarem utilizando este sistema, o reuso

do biocatalisador não tem sido muito explorado nos trabalhos recentes de catálise enzimática

neste tipo de sistema (ITABAIANA Jr. et al., 2011).

131


5.2.5- Imobilização da lipase B de Candida antarctica expressa em Pichia pastoris (LIPB)

por adsorção hidrofóbica em diferentes suportes

Existe uma constante busca pela síntese de novos suportes que resulte em

biocatalisadores mais eficientes. O Laboratório de Modelagem, Simulação e Controle de

Processos-PEQ-UFRJ (LMSCP) vem se empenhado nessa busca com a síntese novos suportes

poliméricos por meio de reações de polimerização simultâneas em suspensão e emulsão,

formando partículas do tipo casca-núcleo (PINTO et al., 2006; BESTETI, 2009, BESTETI,

FREIRE e PINTO, 2011; BESTETI et al., 2014). A escolha dos melhores suportes para este

estudo foi realizada com base na literatura (CUNHA, 2011); com base nos parâmetros de

imobilização, como atividade hidrolitica, atividade de esterificação, retenção da atividade e

rendimento de imobilização além dos parâmetros relacionados com a estrutura do suporte.

Neste tópico, procurou-se avaliar diferentes suportes na imobilização de LIPB e posterior

comparações com as versões comerciais, CalB, versão liofilizada e Novozym 435.

Os suportes estudados para a imobilização por adsorção hidrofóbica foram PMMA-co-

DVB/PMMA-co-DVB 25% e PS-co-DVB/PS-co-DVB 25%. Os dois últimos suportes foram

sintetizados com adição de agentes ―cross-linking‖ divinil-benzeno com o objetivo de

aumento das propriedades de porosidade do suporte, a resitencia mecânica e a solventes

químicos. O terceiro suporte estudado foi o Accurel MP 1000, suporte comercial, que foi

utilizado como modelo de comparação.

A adsorção hidrofóbica de LIPB sobre os suportes, citados anteriormente, foi

conduzida utilizando diferentes quantidades de biocatalisador obtidas por atividade hidrolítica

(em unidades de atividade, 50, 200, 350, 700U). Este procedimento foi feito com o objetivo

de avaliar qual a capacidade máxima de enzima, na solução de imobilização, que resultasse na

obtenção de um biocatalisador com elevada atividade (Tabela 21).

132


Tabela 21. Valores de atividade hidrolítica e parâmetros de imobilização de LIPB sobre diferentes suportes

poliméricos.

Imobilização em Accurel MP 1000

Biocatalisador Uc Uimo (U/g de suporte) Eimo(%) Ra(%) Proteína (mg/g suporte)

LIPB

50 2,1 74,3 86,5 1,9

200 8,4 87,0 95,7 8,7

350 19,3 97,1 97,5 10,6

700 22,2 92,6 98,3 16,3

Imobilização em PS-co-DVB/ PS-co-DVB 25%


LIPB

50 1,8 77,4 93,3 1,8

200 6,1 75,1 84,2 5,1

350 18,8 94,2 94,6 8,2

700 17,9 94,4 99,6 11,3

Imobilização em PMMA-co-DVB/ PMMA-co-DVB 25%


LIPB

50 1,4 86,0 98,0 1,9

200 6,4 88,6 97,8 4,8

350 9,3 93,4 94,1 7,2

700 11,2 93,6 95,2 10,4 *Uc é o total de unidades de enzima que são colocadas na etapa de imobilização (U/g de suporte);

US são as unidades de enzima que não se adsorveram sobre o suporte e que saíram nas primeiras lavagens (U/g

de suporte); Uimo são as unidades de enzima real imobilizada (U/g de suporte); Proteína (mg/gsuporteinicial -

mg/gsuportefinal); Tempo de imobilização: 6 hs.

As lipases imobilizadas mostraram alta eficiência de imobilização (Eimo) e alta

retenção de atividade (Ra%) para os três suportes utilizados. Ambos suportes home-made e

comercial mostraram ser suportes com excelente capacidade de adsorção. A lipase

imobilizada sobre o suporte Accurel MP 1000 alcançou a maior atividade hidrolítica (22,2

U/gde suporte) quando 700 U de atividade inicial foram utilizados. Entretanto, valores similares

foram alcançados quando apenas metade de unidades de enzima foi utilizado (350 U). O bom

rendimento destes suportes pode ser explicado pelo alto grau de hidrofobicidade dos

polímeros (poli-estireno presente na casca, para o suporte PS-co-DVB/ PS-co-DVB 25%, por

exemplo), além da área superficial e diâmetro do poro, de valores maiores para o Accurel MP

1000 (CUNHA, 2011).

133


O maior rendimento de imobilização foi obtido quando Accurel MP 1000 foi utilizado,

seguido de PS-co-DVB/ PS-co-DVB 25% e PMMA-co-DVB/ PMMA-co-DVB 25%. Os três

suportes mostraram alta capacidade de adsorção da enzima. Para os três suportes, o

rendimento de imobilização permaneceu alto quando houve aumento de 350U para 700U de

atividade inicial.

Nos experimentos realizados, o suporte Accurel MP 1000 foi aquele que adsorveu a

maior quantidade de proteína (16,3 mg/gsuporte) seguido de PS-co-DVB/ PS-co-DVB 25%

(11,3 mg/gsuporte). Cabrera et al. (2009) realizaram a imobilização de CalB em suportes

poliméricos hidrofóbicos distintos (octil-agarose, butil-agarose e octadecil-sepabeads)

obtendo capacidade de adsorção em termos de proteína entre 20 a 23 mg/gsuporte.

Besteti et al., (2014) imobilizaram CALB comercial em diferentes suportes do tipo

casca-núcleo. Os autores utilizaram uma quantidade menor de enzima em termos de unidade

de atividade durante o processo de imobilização. Estes obtiveram atividade hidrolítica de

1,4U/gsuporte de CALB comercial imobilizada (atividade inicial de 41,3U) quando o suporte

PMMA/PS foi utilizado. Estes valores foram similares aos desta tese quando LIPB foi

imobilizada em PMMA-co-DVB (casca e núcleo-Tabela 21). Entretanto, os autores

encontraram uma baixa retenção de atividade durante todo o processo de imobilização

(máxima de 34,3%), diferente dos resultados aqui encontrados.

Cunha et al., (2014) relatou sobre o aumento da atividade hidrolítica e dos parâmetros

de imobilização quando divinil-benzeno foi incorporado na casca dos polímeros. Os autores

imobilizaram CalB comercial em diversos suportes do tipo casca-núcleo e obteve baixos

rendimentos de imobilização quando utilizou PS-PS e PMMA/PMMA, na ausência do

divinilbenzeno. O aumento da área supercial e do diâmetro do poro promovidos pelo

divinilbenzeno levou, consequentemente, ao aumento dos valores dos parâmetros de

imobilização. A imobilização de CALB comercial em PS-co-DVB/ PS-co-DVB 25% foi

realizada pelos autores. Estes apresentaram resultados de atividades enzimáticas do

biocatalisador imobilizado similares aos desta tese, quando LIPB foi imobilizada no mesmo

suporte (ambos com 350U de atividade inicial).

134


Apesar de LIPB imobilizada em suportes do tipo casca-núcleo estar sendo descrita

pela primeira vez, Gutarra et al. (2011) realizaram a imobilização covalente multi-pontual de

CALB expressa em P. pastoris e CALB comercial em suportes heterofuncionais de

organoborano-aldeídos. O método de imobilização utilizado permitiu maior rendimento de

imobilização de LIPB quando as mesmas condições de ensaio foram usadas. Além disso, esta

metodologia resultou no aumento da estabilidade à temperatura e solventes para o novo

biocatalisador. Este foi submetido na reação de hidrólise enantiosseletiva de diferentes ésteres

sendo mandelato de metila (um intermediário farmacêutico de interesse industrial) o que

resultou um maior rendimento, 67%, com 89% de eep para o isômero (R).

Cinética de Imobilização

A cinética de imobilização pôde ser acompanhada por meio da atividade hidrolítica do

sobrenadante durante todo o processo de imobilização. O tempo necessário para que ocorresse

a imobilização da maior quantidade de enzima, por atividade, pode ser visualizado na Figura

68.

Figura 68. Cinética de imobilização da LIPB sobre os suportes Accurel MP 1000, PS-co-DVB/PS-co-DVB 25%,

PMMA-co-DVB/PMMA-co-DVB 25%. Atividade inicial de 350U.

135


Apesar do comportamento de adsorção enzimática ser relativamente similar entre os

suportes, PS-co-DVB/PS-co-DVB 25% mostrou ter uma adsorção inicial mais rápida que os

demais, apresentando cerca de 83% de atividade hidrolítica após 2 horas de imobilização de

LIPB.

Os biocatalisadores produzidos (LIPB imobilizada em Accurel MP 1000, PS-co-

DVB/PS-co-DVB 25% e PMMA-co-DVB/PMMA-co-DVB 25%) ainda foram avaliados

quanto ao seu comportamento em meio orgânico. Para tal os mesmos foram utilizados na

reação de síntese do oleato de etila. A Tabela 22 apresenta os resultados da atividade de

esterificação.

Tabela 22. Atividade de esterificação da LIPB imobilizada sobre diferentes suportes poliméricos.

Suportes Atividade de esterificação (U/gsuporte)

Accurel MP 1000 1.970,00 + 220

PS-co-DVB/PS-co-DVB 25% 1.958,00 + 109

PMMA-co-DVB/ PMMA-co-DVB 25% 1.755,00 + 170

Novozym 435 2.728,00 + 339

Dos biocatalisadores imobilizados neste trabalho, os maiores valores de atividade de

esterificação foram observados com LIPB imobilizada em Accurel MP 1000 e LIPB

imobilizada em PS-co-DVB/PS-co-DVB 25% com atividade de esterificação de 1.970,00 +

220 e 1.958,00+ 109, respectivamente. A maior atividade de esterificação pode ser explicada

pela dependência da área específica e do diâmetro do poro do suporte, com valores superiores

para o Accurel MP 1000, o que já foi observado em outros estudos (CUNHA, 2011).

5.2.6- Estabilidade dos biocatalisadores ao longo do tempo

A fim de estudar a estabilidade dos biocatalisadores ao longo do tempo, os

biocatalisadores foram estocados a 30º C e suas atividades hidrolíticas determinadas

periodicamente, utilizando como substrato o p-NFL (Figura 69). O estudo da estabilidade de

136


estocagem foi realizado com a LIPB sobre os suportes Accurel MP 1000, PS-co-DVB/PS-co-

DVB 25% e PMMA-co-DVB/ PMMA-co-DVB 25%.

Figura 69. Curva de estabilidade da LIPB imobilizada sobre os suportes Accurel MP 1000, PS-co-DVB/PS-co-

DVB 25% e PMMA-co-DVB/ PMMA-co-DVB 25%, estocada a 4 ºC.

Conforme apresentado pela Figura 69, a lipase imobilizada em diferentes suportes se

manteve estável ao longo do tempo (60 dias) sem que houvesse perda de sua atividade

hidrolítica.

Normalmente os biocatalisadores se mantem estáveis em condições de estocagem,

caso não ocorra a mudança de pH e temperatura. Assim como o suporte comercial Accurel

MP 1000, os suportes do tipo casca-núcleo mostraram ser adequados para a imobilização de

LIPB uma vez que apresentaram altos valores dos parâmetros de imobilização, além de

apresentarem estabilidade ao longo do tempo.

5.2.7- Imobilização da lipase CALB em Accurel MP 1000 e comparações com LIPB

As lipases CALB e LIPB foram imobilizadas em Accurel MP 1000, suporte comercial

selecionado para fins comparativos (Tabela 23).

137


Tabela 23. Valores de atividade hidrolítica e parâmetros de imobilização de CaLB e LIPB em Accurel MP 1000.

Imobilização em Accurel MP 1000

Biocatalisador Uc Uimo (U/g de suporte) η(%) Ra(%) Proteína (mg/g suporte)

CalB comercial liofilizada 50 2,4 100 51,0 1,2

200 7,2 97 77,0 6,2

350 10 91,4 89,0 7,1

700 25 94,9 94,0 16,1

LIPB 50 2,1 74,3 86,5 1,9

200 8,4 87,0 95,7 8,7

350 19,3 97,1 97,5 10,6

700 22,2 92,6 98,3 16,3

Conforme observado na Tabela 23, valores similares de atividade da enzima

imobilizada foram obtidos. Ambos, rendimento de imobilização e retenção de atividade

mostraram que as lipases, LIPB e CALB puderam ser adsorvidas no suporte. Entretanto, LIPB

mostrou melhor desempenho do que a versão enzimática comercial (CALB).

5.2.8- Resolução cinética de rac-3 utilizando lipase B de Candida antarctica expressa em

Pichia pastoris, imobilizada sobre diferentes suportes

A resolução cinética do rac-3 foi realizada em sistema de batelada simples afim de se

comprovar a viabilidade de CalB em diferentes versões (imobilizada e liofilizada, comercial e

home-made). As condições reacionais foram àquelas já otimizadas obtidas no planejamento

experimental para rac-3 e Novozym 435. Os resultados estão representados na Figura 70 e na

Tabela 24.

Figura 70. Resolução enantiosseltica de rac-3 catalisada por CalB comercial e LIPB (home-made) imobilizadas

em diferentes suportes.

138


Tabela 24. Resultados da resolução enantiosseletiva de rac-3 para as diferentes versões da lipase B de Candida

antarctica.

*Condições em batelada simples, 45º C, 4mg/mL de substrato e 222,8 U de enzima, 24h. Hexano como solvente.

Os resultados mostraram que tanto as versões de CalB comercial (liofilizada,

imobilizada em Accurel MP 1000 e Novozym 435), quanto a lipase B de Candida antarctica

expressa em Pichia pastoris (LIPB), catalisaram a reação enantiosseletiva de rac-3. Os

valores de conversão foram similares para as lipases imobilizadas, mesmo sendo a condição

otimizada para Novozym 435. O produto L-(-)-2 foi obtido com alto grau de pureza (eep de

99%) e alto excesso enantiomérico (E).

5.2.9- Resolução cinética de rac-4 utilizando lipase B de Candida antarctica expressa em

Pichia pastoris, imobilizada em diferentes suportes

A resolução cinética de outro substrato, o rac-4, foi realizada em sistema de batelada

simples a fim de se comprovar a viabilidade da reação para diferentes substratos e enzimas

(CalB em diferentes versões: comercial e home-made, em sua forma imobilizada e

liofilizada). As condições reacionais foram àquelas já otimizadas obtidas no planejamento

LIPASE COMERCIAL X(%) eep E

CalB liofilizada 20 99 >200

CalB imobilizada em Accurel MP 1000 46 99 >200

Novozym 435 49,5 99 >200

LIPB X(%) eep E

LIPB liofilizada 3 99 >200

LIPB imobilizada em Accurel MP 1000 41 99 >200

LIPB imobilizada em PS-co-DVB/PS-co-DVB

25%

47 99 >200

LIPB imobilizada em PMMA-co-

DVB/PMMA-co-DVB 25%

41 99 >200

139


experimental para rac-4 e Novozym 435 (CUNHA et al. 2013). Os resultados estão

representados na Figura 71 e na Tabela 25.

Figura 71. Resolução enantiosseltica de rac-4 catalisada por CalB comercial e LIPB (home-made) imobilizadas

em diferentes suportes.

Tabela 25. Resultados da resolução enantiosseletiva de rac-4 para as diferentes versões da lipase B de Candida

antarctica.

rac-4

LIPASE COMERCIAL X(%) eep E

CalB liofilizada 28 99 >200

CalB imobilizada em Accurel MP 1000 40,8 99 >200

Novozym 435 49 99 >200

LIPB X(%) eep E

LIPB liofilizada 18 99 >200

LIPB imobilizada em Accurel MP 1000 48 99 >200

LIPB imobilizada em PS-co-DVB/PS-co-DVB 25% 49 99 >200

LIPB imobilizada em PMMA-co-DVB/PMMA-co-

DVB 25%

49 99 >200

*Condições em batelada simples, 45º C, 14mg/mL de substrato e 218 U de enzima, tempo reacional de 24h,

reação sem solvente, acetato de vinila como agente acilante e solvente.

Os resultados mostraram que tanto as versões de CalB comercial (versão liofilizada,

imobilizada em Accurel MP 1000 e Novozym 435), quanto a lipase B de Candida antarctica

expressa em Pichia pastoris (LIPB), catalisaram a reação enantiosseletiva de rac-4. Os

140


valores de conversão foram similares para as lipases imobilizadas, mesmo as reações sendo

feitas na condição otimizada de Novozym 435. O produto L-5 foi obtido com alto grau de

pureza (eep de 99%) e alto excesso enantiomérico (E).

Os biocatalisadores imobilizados home-made mostraram o mesmo comportamento que

a lipase comercial Novozym 435, nas mesmas condições reacionais. Para a lipase imobilizada

em Accurel MP 1000, o valor de conversão foi ligeiramente menor (48%).

Cunha (2011) observou conversões de 47% (eep de 99%) quando CalB comercial foi

imobilizada em PS-co-DVB/PS-co-DVB 25%, PMMA-co-DVB/PMMA-co-DVB 25% e em

Accurel MP 1000.

Os três suportes, o comercial e os produzidos por laboratórios de pesquisa (PS-co-

DVB/PS-co-DVB 25% e PMMA-co-DVB/PMMA-co-DVB 25%), mostraram ser adequados

não apenas para a imobilização de LIPB, mantendo sua atividade catalítica e enantiosseletiva,

mas também para as reações cinéticas de rac-3 e rac-4. Este trabalho mostrou que LIPB,

apesar de estar sendo utilizada nas condições previamente otimizadas para o biocatalisador

comercial (Novozym 435), apresentou grande eficiência no processo reacional. Este resultou

em valores de conversão similares àqueles encontrados para a versão comercial.

141

Capítulo VI- CONCLUSÕES

6. CONCLUSÕES

Com a otimização realizada em sistema de batelada para a resolução cinética de rac-3,

catalisada por Novozym 435, foi possível obter o valor máximo de conversão (50%) com alta

pureza óptica (> 99%) para o produto e para o substrato remanescente. De fato, a condição

otimizada, por meio do DCCR, reduziu o tempo reacional, para 24h (tempo reacional no

protocolo original, antes da otimização era de 120h) levando o aumento considerado da

produtividade (3,188mgproduto/mgenzima.h, aumento de 15 vezes sob o protocolo original).

Em contrapartida, a abordagem desenvolvida utilizando o sistema de fluxo contínuo

em leito fixo também mostrou ser muito eficiente. Os máximos valores de conversão do rac-3

foram obtidos em apenas 3 min de tempo de residência. Com isso foi garantido o aumento da

produtividade em 531 vezes em relação ao sistema BSTR.

Em ambos os sistemas, contínuo e descontínuo, a reutilização do biocatalisador foi realizada

com êxito durante vários reciclos, o que pode contribuir com a economicidade do processo.

A tentativa do aumento da escala utilizada no processo descontínuo (BSTR), gerou

altos valores de conversão (50% ± 1) e seletividades (eep igual a 99%; E maior que 100).

Após o processo de seleção de biocatalisadores home-made se estabeleceu que LIPB

foi o mais promissor. Os suportes home-made utilizados no processo de imobilização de LIPB

mostraram alta capacidade de adsorção, atividade hidrolítica e esterásica, similar a

imobilização feita no suporte comercial.

LIPB em suportes home-made PS-co-DVB/PS-co-DVB e PMMA-co-DVB/ PMMA-

co-DVB mostrou grande desempenho na resolução cinética dos substratos utilizados em

sistema BSTR, com destaque para o rac-4, mostrando valores de conversão (entre 47% e

49%, para rac-3 e rac-4, respectivamente) e eep (>99%) muito parecidos com a versão

imobilizada comercial, Novozym 435.

Uma vez otimizada a produção dos derivados racêmicos (rac- 3 e rac-4), seus

respectivos produtos e substratos não reagidos podem então ser inseridos na rota sintética para

a produção de fármacos opticamente puros.

A otimização realizada neste trabalho permitiu utilizarmos pela primeira vez suportes

e biocatalisadores, ambos home-made, no processo de imobilização, aplicados na área

farmacêutica. Além disso, a rota enzimática na produção do fármaco permitiu a redução do

número de etapas, comparando-se com a literatura.

142

Capítulo VII- SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Os trabalhos desenvolvidos nesta tese fortaleceram a linha de pesquisa da biocatálise

para produção de fármacos, abrindo possibilidades para novas investigações sobre o tema

estudado.

As sugestões para os trabalhos futuros podem ser mencionados:

- Produção de novos biocatalisadores para outros derivados farmacológicos. Realizar

ainda a caracterização bioquímica dos novos biocatalisadores produzidos.

- Empregar a catálise enzimática proporcionada por lipases em reações de resolução

cinética e dessimetrizações para novas moléculas com potencial ativo.

- Aprofundar os estudos na imobilização de LIPB em suportes hidrofóbicos e testar os

mesmos nas reações mencionadas anteriormente.

- Desenvolver novos biocatalisadores com base na produção de lipase por diferentes

fungos e bactérias da cepa dos laboratórios deste grupo de pesquisa.

- As reações empregadas nesta tese ainda fazem uso de solventes orgânicos. Uma das

metas para trabalhos futuros é desenvolver reações com o uso dos Líquidos Iônicos,

contribuindo mais eficientemente para os princípios da química verde.

- Escalonamento do processo, em nível industrial, na produção do fármaco de interesse.

143

Capítulo VIII- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABIGOR, R.D., UADIA, P.O., FOGLIA, T.A., HAAS, M.J., JONES, K.C., OKPEFA, E., OBIBUZOR, J.U.e

BAFOR, M.E. Lipase-catalysed production of biodiesel fuel from some Nigerian lauric oils. Biochem. Soc.

Transactions., v. 28, p. 979-981, 2000.

ABIGOR, R.D., UADIA, P.O., FOGLIA, T.A., HAAS, M.J.; SCOTT, K.; SAVARY, B.J. Partial purification

and properties of lipase from germinating seeds of Jatropha curcas L., JAOCS, v. 79 (11), p. 1123-1126.

ADLERCREUTZ, P. Enzyme-catalyzed lipid modification. Biotechnol. Genet. Eng. Rev., v. 12, p.231-254,

1994.

ADLERCREUTZ, P. Modes of using enzymes in organic media‖ In: Enzymatic reactions in organic media, Eds:

Koskinen e Klibanov, Ed.Blackie academic & professional, Great Britain. 1996.

ADLERCREUTZ, P. Biocatalysis in non-conventional media In: Applied biocatalysis, Eds.: Straathof e

Adlercreutz, Ed. Harwood academic publishers Netherlands. 2000.

ADER, U.; ANDERSCH, P.; BERGER, M.; GOERGENS, U.; SEEMAYER, R. e SCHNEIDER, M., Pure Appl.

Chem. v. 64, p.1165–1170, 1992.

AGER, D.A. (Ed.), Handbook of Chiral Chemicals, Taylor & Francis, 2 edition. USA, 2006, 626p.

AHMED, M., Kelly, T., GHANEM, A. Applications of enzymatic and non-enzymatic methods to access

enantiomerically pure compounds using kinetic resolution and racemization, Tetrahedron, v. 68, p. 6781-6802,

2012.

AIRES-BARROS M.R. Biocatálise em solventes orgânicos. Boletim Biotecnologia, n. 72, p.2-12, 2002.

AKIN, N., AYDEMIR, S., KÇAK, C. e YILDIZ, M.A., Changes of free fatty acid contents and sensory

properties of white pickled cheese during ripening, Food Chemistry, v.80, p. 77–83, 2003.

ALMEIDA, M.V., SILVA, D.S., SOUZA, M.V.N. e BENÍCIO, A.A.A. A Cascata dos fosfoinositídeos. Quim.

Nova, v.26, n.1, p.105-111, 2003.

ALMEIDA, R.V., Clonagem, Expressão, Caracterização e Modelagem estrutural de uma esterase termoestável

de Pyrococcus furiosus. Tese doutorado. Engenharia Química, COPPE/UFRJ, Rio de janeiro, RJ – Brasil nov.

2005. 109p.

ALOULOU, A., RODRIGUEZ, J. A., FERNANDEZ, S., OSTERHOUT, D., PUCCINELLI, D., CARRIÈRE,

F., ―Exploring the specific features of interfacial enzymology based on lipase studies‖, Biochimica et Biophysica

Acta, v.1761, p. 995–1013, 2006.

AMUD, A.E.; da SILVA, R.P.; TARDIOLI, P.W.; SOARES, C.M.F.; MORAES, F.F. ZANIN, G.M. Methods

ans support for immobilization of cyclomaltodextrin glucanotransferase from Thermoanaerobacter, App.

Biochem. Biotechnol., v.146, p.189-201, 2008.

ANDERSON, E. M., LARSSON, K. M., KIRK, O., One biocatalyst – many applications: The use of Candida

antarctica B-lipase in organic synthesis, Biocatal. Biotransform. v.16, p.181-204, 1998.

ANOVÁ, C.M. e HUTTA, M. Role of biological matrices during the analysis of chiral drugs by Liquid

Chromatography. J. Chromatog. B, Amsterdam, v. 797, p. 91-109, 2003.

ANTHONSEN, T. Reactions Catalysed by enzymes. In: Straathof, A., Adlercreutz, P. (Eds.) Applied

Biocatalysis, second edition. Harwood academic publishers. Netherlands. 2005. 545p.

ANVISA. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/Legis/index.htm. Acesso em 04 jan. 2012.

ARRUDA, A. Utilização do promotor do gene PGK1 de Pichia pastoris para expressão heteróloga. 2008.

Dissertação de mestrado apresentado ao corpo docente de Biologia Celular do Instituto de Ciências da

Universidade de Brasília. Brasília. 2008, 90p.

AYBASTIER T.; DEMIR C.; J. Mol. Catal. B: Enzym. 63 (2010) 170–178.

BAGI K., SIMON L. M., Biotechnol. Tech. 13 (1999) 309–312.

BAI, Y. X., YAN, F. L., YANG., Y., YI, L. X., Covalent immobilization of triacylglycerol lipase onto

functionalized novel mesoporous silica supports, Journal of Biotechnology, v.125, n.4, p. 574-582, 2006.

144


BAI Y. X., Li Y. F., YANG Y., Yi L. X., Process Biochem. 41 (2006b) 770–777.

BAIA, Z. W., ZHOU, Y. K., A novel enzyme support derived from aminated silica gel and polysuccinimide:

preparation and application for the immobilization of porcine pancreatic lipase, Reactive & Functional Polymers,

v. 59, p. 93–98, 2004.

BAKER, R.; KULAGOWSKI, J.K.; BILLINGTON, D.C.; LEESON, P.D.; LENNOM, J.C.; LIVERTON, N. J.;

Journal Chem. Soc. Chem. Communication, p. 1383, 1989.

BAKER, G.A., BAKER, S., PANDEY, S., BRIGHT, F.V., Analyst, v.130, p. 800–808, 2005.

BALCÃO, V. M., PAIVA, A. L., MALCATA, F. X. Bioreactors with immobilized lipases, Enzyme and

Microbial Technology, v. 18, p. 392-416, 1996.

BARBOSA, O., ORTIZ, C., TORRES, R., FERNANDEZ-LAFUENTE, R., Effect of the immobilization

protocol on the properties of lipase B from Candida antarctica in organic media: Enantiospecifc production of

atenolol acetate, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v.71, p. 24–132, 2011.

BARON, A.M. Biocatálise em ambientes aquo-restrictos:comparação de diferentes sistemas reacionais‖, tese de

mestrado, Universidade federal do Paraná, Curitiba. 2003.

BARROS M., FLEURI L.F. E MACEDO, G.A., Seed lipases: sources, applications and properties- a review.

Brazilian Journal of Chemical Engineering, v. 27, n. 1, p.15-29, 2010.

BASTIDA, A., SABUQUILLO, P., ARMISEN, P., FERNÁNDEZ-LAFUENTE, R., HUGUET, J., GUISÁN, J.

M., A single step purification, immobilization, and hyperactivation of lipases via interfacial adsorptions on

strongly hydrophobic supports, Biotechnology and Bioengineering, v. 58, n.5, p. 486-493, 1998.

BEHRENS, G.A., HUMMEL, A., PADHI, S.K., SCHÄTZLE, S., BORNSCHEUER, U.T., Discovery and

protein engineering of biocatalysts for organic synthesis. Adv. Synth. Catal., v.353, n.13, p.2191–2215, 2011.

BELLEZZA, F., CIPICIANI, A., COSTANTINO, U., Esterase activity of biocomposites constituted by lipases

adsorbed on layered zirconium phosphate and phosphonates: selective adsorption of different enzyme isoformas,

Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 26, p. 47–56, 2003.

BENJAMIN, S., PANDEY, A. Yeast, v. 14, p.69–87, 1998.

BEN SALAH, R., ZOUARI, N., REINBOLT, J. e MEJDOUB, H., 2003. Purification of turkey pancreatic

phospholipase A2. Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, p.2139–2144.

BERGLUND P. Controlling lipase enantioselectivity for organic synthesis. Biomol Eng., v.18, p.13–22, 2001.

BERKOWITZ, D. B., DANISHEFSKY, S. J., SCHULTE, G. K. A route to artificial glycoconjugates and

oligosaccharides via enzymatically resolved glycals: Dramatic effects of the handedness of the sugar domain

upon the properties of an anthracycline drug, J. Am. Chem. Soc., v.114, n.12, p.4518- 4529, 1992.

BERNSMANN, H; GRUNER, M. e METZ, P., Tetrahedron Lett., v. 41, p. 7629–7633, 2000.

BESTETI, M. D. Dissertação de M.Sc., COPPE/UFRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, 2009.

BESTETI, M. D.; CUNHA, A. G.; FREIRE, D.M.G. e PINTO, J.C. Core/Shell Polymer Particles by Semibatch

Combined Suspension/Emulsion Polymerizations for Enzyme Immobilization. Macromol. Mater. Eng., 299,

135–143, 2014.

BESTETI, M.D., CUNHA, A. G., FREIRE, D. M. G., LIMA, E. L., PINTO, J. C. CBPol.- 10º CONGRESSO

BRASILEIRO DE POLÍMEROS, Foz do Iguaçu, Brasil, 2009.

BESTETI, M.D., SANTOS, D.P., CUNHA, A.G., ALMEIDA, R.V., FREIRE, D.M.G., PINTO, J. C. COBEQ

2010 – XVIII CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA QUÍMICA, Foz do Iguaçu, Brasil, 2010.

BESTETI, M.D., Tese de Doutorado em Engenharia Química, EQ/UFRJ, Rio de Janeiro, 2011.

BESTETI, M.D.; FREIRE, D.M.G.; PINTO, J.C. Production of Core–shell Particles by Combined Semibatch

Emulsion/Suspension Polymerizations. Macromol. React. Eng. 2011, 5, 518–532.

BESTETI, M.D.; CUNHA, A.G.; FREIRE, D.M.G.; PINTO, J.C. Core/Shell Polymer Particles by

Semibatch Combined Suspension/Emulsion Polymerizations for Enzyme Immobilization. Macromolecular

Materials and Engineering Volume 299, Issue 2, Article first published online: 22 OCT 2013.

http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1002/(ISSN)1439-2054

http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1002/(ISSN)1439-2054

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mame.v299.2/issuetoc

145


BEVILAQUA, J.V., PINTO, J.C., LIMA, L.M., BARREIRO, E.J., ALVES, T.L.M., FREIRE, D.M.G.

Enzymatic hydrolysis by immobilized lipase applied to a new prototype anti-asthma drug, Biochemical

Engineering Journal, v. 21, p. 103–110, 2004.

BEVILAQUA, J.V., CUNHA, A.G., LIMA, L.M., ALVES, T.L.M., BARREIRO, E.J., PAIVA, L.M.C.,

FREIRE, D.M.G., Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 121, p. 117-128, 2005.

BLANCO, R. M., TERREROS, P., FERNÁNDEZ-PÉREZ, M., OTERO, C., DIAZ-GONZÁLEZ G.,

Functionalization of mesoporous silica for lipase immobilization characterization of the support and the

catalysts, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 30, p. 83–93, 2004.

BLANK, K., MOFILL, J., GUMPP, H., GAUB, H.E. Functional expression of Candida antarctica lipase B in

Escherichia coli, J. Biotechnol. v.125, p.474–483, 2006.

BOMMARIUS, S. ; BLUM, J. K. e ABRAHAMSON, M. J. Curr. Opin. Chem. Biol., 2011, 15, 194–200.

BORNSCHEUER, U.T. Microbial carboxyl esterases: classification, properties and application in biocatalysis.

FEMS Microbiol. Review., v. 733, p. 1-9, 2002.

BORNSCHEUER, U.T., Angewandte Chemie International Edition, v. 42, p.3336, 2003.

BORNSCHEUER, U. T. e KAZLAUSKAS, R.J. 2006. Ionic Liquids. In: BORNSCHEUER, U. T. e

KAZLAUSKAS, R.J. Hydrolases in Organic Synthesis. Regio- and Stereoselective Biotransformations. 2nd

edition. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. 2006a, 355p.

BORNSCHEUER, U. T. e KAZLAUSKAS, R.J. 2006. Lipases and esterases. In: BORNSCHEUER, U. T. e

KAZLAUSKAS, R.J. Hydrolases in Organic Synthesis. Regio- and Stereoselective Biotransformations. 2nd

edition. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. 2006b, pp.61-183 (Chapter 5).

BORNSCHEUER; U.T., HULT, K. Expression of Candida antarctica lipase B in Pichia pastoris and various

Escherichia coli systems Marianne Wittrup Larsen; Protein Expression and Purification, v.62, p. 90–97, 2008.

BOROS, Z.; FALUS, P.; MÁRKUS, M.; WEISER, D.; OLÁH, M.; HORNYÁNSZKY, G.; NAGY, J. e

POPPEA, L. How the mode of Candida antarctica lipase B immobilization affects the continuous-flow kinetic

resolution of racemic amines at various temperatures Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 85–86,

p.119–125, 2013.

BORSODY, M.K. e WEISS, J.M., Influence of corticotropin-releasing hormone on electrophysiological

activity of locus coeruleus neurons Brain Research, v. 724, p. 149-168, 1996.

BÖTTCHER D. e BORNSCHEUER U. T., Curr. Opin. Microbiol., 2010, 13, 274–282.

BRADFORD, M.M. Analytical Biochemistry, 1976, 72, 248-254.

BRADFORD, M.M., Analytical Biochemistry, v. 72, p. 248-554, 1976.

BRADY, L., BROZOZOWSKI, A. M., DEREWENDA, Z. S., DODSON, E., DODSON, G., TOLLEY, S.,

TURKENBURG, J. P., CHRISTIANXEN, L., JUGE-JENSEN, B., ORSKOV, L. e MENGE, U. A serine

protease triad forms the catalytic center of a triacylglycerol lipase. Nature, v. 343, p. 767-770, 1990.

BRANCO, R.V.; GUTARRA, M.L.E.; FREIRE, D.M.G.; ALMEIDA, R.V. Immobilization and Characterization

of a Recombinant Thermostable lipase (Pf2001) from Pyrococcus furiosus on supports with different degrees of

hydrophobicity, Enzyme Research, v.2010, 8p., 2010. Doi:10.4061/2010/180418.

BRANCO, R.V. Estudo de diferentes métodos de imobilização da lipase termoestável recombinante de

Pyrococcus furiosus: Estabilidade, enantiosseletividade e engenharia de proteínas. Tese submetida ao corpo

docente do programa de pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Rio

de Janeiro, 2012.109p.

BRASK, J., DAMSTRUP, M.L., NIELSEN, P.M., HOLM, H.C., MAES, J., GREYT, W. Applied Biochemistry

and Biotechnology, v.163, p. 918, 2011.

BRENA B.B. e BATISTA-VIEIRA F., Immobilization of enzymes, In: J. M. Guisan, Immobilized of Enzyme

and Cells. Methods in Biotechnology, 2nd Edition, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2006, ch. 2, pp. 15-30.

BRUSTAD E. M. e ARNOLD, F. H. Curr. Opin. Chem. Biol., 2011, 15, 201–210.

BRZOZOWSKI, A.M., DEREWENDA, U., DEREWENDA, Z. S., DODSON, G. G., LAWSON, D. M.,

TURKENBURG, J. P., BJORKLING, F., HUGE-JENSEN, B., PATKAR, S. A., THIM, L., A model for

146


interfacial activation in lipases from the structure of a fungal lipase–inhibitor complex, Nature, v.351, p. 491–

494, 1991.

BRZOZOWSKI, A.M., SAVAGE, H., VERMA, C.S., TURKENBURG, J.P., LAWSON, D.M., SVENDSEN,

A., PATKAR, S., Structural origins of the interfacial activation in Thermomyces (Humicola) lanuginosa lipase,

Biochemistry, v. 39, p. 5071–15082, 2000.

BUCALÁ, V., FORESTI, M.L., TRUBIANO, G., FERREIRA, M.L., BRIOZZO, M. e OTTINI, S. Analysis of

solvent-free ethyl oleate enzymatic synthesis at equilibrium conditions. Enzyme Microbial Technol., v. 38, p.

914-920. 2006.

BUČKO M., MISLOVIČOVÁ D., NAHÁLKA J., VIKARTOVSKÁ A., ŠEFČOVIČOVÁ J., KATRLÍK J.,

TKÁČ J., GEMEINER P., LACÍK I., ŠTEFUCA V.; POLAKOVIČ M., ROSENBERG M., REBROŠ M.,

ŠMOGROVIČOVÁ D. e ŠVITEL J. Immobilization in biotechnology and biorecognition: from macro- to

nanoscale systems, Chemical Papers 66 (11) 983–998 (2012) DOI: 10.2478/s11696-012-0226-3

BUSTO, E.; GOTOR-FERNÁNDEZ e GOTOR, V. Asymmetric Chemoenzymatic Synthesis of Ramatroban

Using Lipases and Oxidoreductases. J. Org. Chem. v. 77, p.4842-4848, 2012.

BYZOZOWSKI, A. M., DEREWENDA, U., DEREWENDA, Z. S., DODSON, G. G., LAWSON, D. M.,

TURKEMBURG, J. P., BJORKLING, F., HUGE-JENSEN, B., PATKAR, S. S., THIM, L. 1991. A model for

interfacial activation in lipases from the structure of a fungal lipase–inhibitor complex. Nature 351: 491–494

CAO, L., van RANTWIJK, F., SHELDON, R. A., Cross-linked enzyme aggregates: a simple and effective

method for the immobilization of penicillin acylase, Org. Lett., v.2, p. 1361-1364, 2000.

CAO, L., van LANGEN, L. M., van RANTWIJK, F., SHELDON, R. A., Cross-linked aggregates of penicillin

acylase: robust catalysts for the synthesis of β-lactam antibiotics, J. Mol. Catal. B: Enzym. v.11, p. 665-670,

2001.

CABALLERO V., BAUTISTA F. M., CAMPELO J. M., LUNA D., MARINAS J. M., ROMERO A. A.,

HIDALGO J. M., LUQUE R., MACARIO A., GIORDANO G., Process Biochem. 44 (2009a) 334–342.

CABALLERO, E.; WILSON, L.; AROCA, G. New Biotechnol. 2009b, 25, S138.

CABRAL, J. M. S. e TRAMPER, J. Bioreactor Design in: STRAATHOF, A. J. J. e ADLERCREUTZ, P. (Eds.)

Applied Biocatalysis, second edition, hardwood academic publishers, Amsterdam, Netherlands, 2005, pags.392-

440.

CABRERA Z., FERNANDEZ-LORENTE G., FERNANDEZ-LAFUENTE R., PALOMO, J.M., GUISÁN, J.M.;

Novozym 345 displays very different selectivity compared to lipase from Candida Antarctica B adsorved on

other hydrophobic supports, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 57, p. 171-176, 2009.

CAJAL, Y., SVENDSEN, A., GIRONA, V., PATKAR, S. A. and ALSINA, M. A. Interfacial control of lid

opening in Thermomyces lanuginosa lipase. Biochemistry, v.39, p.413–423, 2000.

CAJAL, Y., SVENDSEN, A., DE BOLÓS, J., PATLAR, S.A. e ALSINA, M.A. Effect of the lipid interface on

the catalytic activity and spectroscopic of a fungal lipase. Biochimie., v.82, p.1053-1061. 2000b.

CALADO, V. e MONTGOMERY, D. C. Planejamento de experimentos usando o Statistica. Rio de Janeiro: E-

papers Serviços editoriais, 260 p., 2003.

CALGAROTO C., SCHERER R. P., CALGAROTO S., OLIVEIRA J. V., de OLIVEIRA D., PERGHER S. B.

C., Appl. Catal. A 394 (2011) 101–104.

CAMBILLAU, G., TILBEURGH, H. VAN., Structure of hidrolases- lipases and celulases, Curr. Opin. Struct.

Biol., v.3, p.885-895, 1993.

CAMMAROTA, M. C.; ROSA, D. R.; DUARTE, T. C. R.; SAAVEDRA, N. K.; VARESCHE, M. B. A.;

ZAIAT, M.; FREIRE, D. M. G. The effect of enzymatic pre-hydrolysis of dairy wastewater on the granular and

immobilized microbial community in anaerobic bioreactors. Environmental Technology, v. 34, 4, pages 417-

428, 2013.

CAMMAROTA, M. C. e FREIRE, D. M. G. A review on hydrolytic enzymes in the treatment of wastewater

with high oil and grease content. Bioresource Technology, v.97, n.2, p.195-210, 2006.

CAMMAROTA, M. C., TEIXEIRA, G. A. e FREIRE, D. M. G. Enzymatic prehydrolysis and anaerobic

degradation of wastewater with high fat content. Biotechnology Letters, v.71, p.44-50, 2001.

http://www.tandfonline.com/loi/tent20?open=34#vol_34

http://www.tandfonline.com/toc/tent20/34/4

147


CAREY, F.A. e SUNDBERG, R.J. Stereochemistry, Conformation, and Stereoselectivity In: Advanced Organic

Chemistry Part A:Structure and Mechanisms. 2ª edition, Springer Science+Business Media, New York, NY,

USA, 2007, 1199p.

de CARVALHO. C.C.C.R., Enzymatic and whole cell catalysis: Finding new strategies for old processes,

Biotechnology Advances, v.29, p. 75–83, 2011.

CASTRO, H.F., MENDES, A.A., SANTOS, J.C. e AGUIAR, C.L. Modificação de Óleos e Gorduras por

Biotransformação. Quimica Nova, v. 27, p. 146-156, 2004.

CASTRO-OCHOA, L. D., RODRÍGUEZ-GÓMEZ, C., VALERIO-ALFARO, G. e ROS, R.O. Screening,

purification and characterization of the thermoalkalophilic lipase produced by Bacillus thermoleovorans CCR11.

Enzyme and Microbial Technology, v. 37, n.6, p.648-654, 2005.

CASTRO H. F., ZANIN G. M., de MORAES F. F., SÁ-PEREIRA P. Imobilização de enzimas e sua

estabilização. In: E. P. S. [et al] BON, M. A. FERRARA, and M. L. CORVO, Enzimas em biotecnologia:

produção, aplicações e mercado, Interciência, 2008, ch 6, pp.123-151.

CASTRO, A.M., BEVILAQUA, J.V., FREIRE, D. M. G., TORRES, F. A. G., SANTAANNA, L. M. M.,

GUTARRA, M. L. E., BARBOSA, C. A., V. ALMEIDA, R., MENEZES, R. R. e CUNHA, A. G. Processo de

produção de lipases por meio de modificação genética de levedura. Pedido de Patente ao INPI: Privilégio e

Inovação no. PI0905122-8 depositada em 17/12/2009, 2009.

CAVALCANTI, E.D.C., MACIEL, F.M., VILLENEUVE, P., LAGO, R. C. A., MACHADO, O. L. e FREIRE,

D.M.G. Acetone Powder from Dormant Seeds of Ricinus communis L.: Lipase Activity and Presence of Toxic

and Allergenic Compounds. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.136, p.57 – 65, 2007.

CAVALCANTI-OLIVEIRA, E.A., SILVA, P.R., RAMOS, A.P., DONATO, D.A.G. e FREIRE, D.M.G. Study

of Soybean Oil Hydrolysis Catalyzed by Thermomyces lanuginosus. Lipase and Its Application to Biodiesel

Production via Hydroesterification. Enzyme Research, 2011, doi:10.4061/2011/618692

CHAE, M.-H., PARK, H.-K., KWON, K.-I., KIM, J.-W., HONG, S.I., KIM, Y., KIM, B.H.,

CHARTRAIN, M., GREASHAM, R., MOORE, J., REIDER, P., ROBINSON, D., BUCKLAND, B., Journal of

Molecular Catalysis B: Enzymatic, v.11, p. 503, 2001.

CHEN, C. S.; FUJIMOTO, Y.; GIRDAUKAS, G.; SIH, C. J. J. Amerian Chem. Society, v.104, p.7294–7299,

1982.

CHEN, C.-S. e SIH, C.J., General Aspects and Optimization of Enantioselective Biocatalysis in Organic

Solvents: The Use of Lipases. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., v. 28, p. 695–707, 1989.

CHEN, C.S.; FUJIMOTO, Y.; GIRDAUKAS, G.; SIH, C.J., Quantitative analyses of biochemical kinetic

resolutions of enatiomers, Journal American Chemical Society, v. 104, p. 7294–7299, 1982.

CHEN, S.T. e FANG, J.M. J. Org. Chem., v. 62, p. 4349–4357, 1997.

CHEN, Y.-H., HUANG, Y.-H., LIN, R.-H., SHANG, N.-C. Bioresource Technology, v. 101, p.668, 2010.

CHEN., B., MILLER, M.E., GROSS, R.A., Langmuir, v. 23, p. 6467-6474, 2007.

CHIOU, S.H., WU, W.T., Immobilization of Candida rugosa lipase on chitosan with activation of the hydroxil

groups, Biomaterials, v. 25, p. 197-204, 2004.

CHOWDARY GV, RAMESH MN, PRAPULLA SG. Enzymic synthesis of isoamyl isovalerate using

immobilized lipase from Rhizomucor miehei: multivariate analysis. Process Biochem 2001;36:331–9.

CHUA, L. e SARMIDI, M. Effect of solvent and initial water content on (R, S)-1- phenylethanol resolution.

Enzyme and Microbial Technology, v. 38, p. 551–556, 2006.

CHO, A. R., YOO, S.K., KIM, E. J. FEMS Microbiology Letters, v. 186, p. 235-238, 2000.

CHUNG, S.K., CHANG, Y.T., LEE E. J., SHIN, B.G., KWON, Y.U., KIM K.C., LEE, D.H., KIM, M.J.,

Syntheses of two enantiomeric pairs of myo-inositol(1,2,4,5,6) and (1,2,3,4,5) pentakisphosphate, Bioorganic &

Medicinal Chemistry Letters, v. 8, p. 1503-1506, 1998.

CLAIR, N. L., NAVIA, M. A., Cross-linked enzyme crystals as robust biocatalysts, J. Am.Chem. Soc. v.114,

n.18, p. 7314-7316. 1992.

CORZO, G. e REVAH, S. (1999). ―Production and characteristics of the lipase from Yarrowia lipolytica 681‖,

Bioresource Technol., v.70, pp.173-180

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975010001151

148


COSTA, V.E.U., AMORIN, H.L., O emprego de lipases como agentes de resolução cinética de enantiomeros em

síntese orgânica: aspectos gerais sobre a influencia do solvente, Química Nova, v. 22, n. 6, p. 863-873, 1999.

COWAN D. A. e FERNANDEZ-LAFUENTE R., Enhancing the functional properties of thermophilic enzymes

by chemical modification and immobilization. Enzyme Microb. Technol., 2011, 49, 326–346. DOI:

10.1016/j.enzmictec.2011.06. 023.

CUNHA, A.G., FERNÁNDEZ-LORENTE, G., BEVILAQUA, J.V., DESTAIN, J., PAIVA, L.M.C., FREIRE,

D.M.G., FERNÁNDEZ-LAFUENTE, R., GUISÁN, J.M., AppliedBiochemistry and Biotechnology, v.146, p. 49-

56, 2008.

CUNHA, A.G.; FERNÁNDEZ-LORENTE, G.; GUTARRA, M.L.E.; BEVILAQUA, J.V.; ALMEIDA, R.V.;

PAIVA, L.M.C.; FERNÁNDEZ-LAFUENTE, R.; GUISÁN, J.M.; FREIRE, D.M.G.. Appl Biochem Biotechnol,

v.156, p. 563-575, 2009.

CUNHA, A.G.; da SILVA, A.A.T.; da SILVA, A.J.; TINOCO, L.W.; ALMEIDA, R.V.; de ALENCASTRO,

R.B.; SIMAS, A.B.C. e Freire, D.M.G., Efficient kinetic resolution of (±)-1,2-O-isopropylidene-3,6-di-O-

benzyl-myo-inositol with the lipase B of Candida Antarctica. Tetrahedron: Asymmetry, v. 21, p.2899-2903,

2010.

CUNHA, A.G. Resolução cinética de derivados de mio-inositol catalisada por lipases. Tese de Doutorado,

IQ/UFRJ, Rio de Janeiro. 140p. 2011.

CUNHA, A. G., da SILVA, A. A. T., GODOY, M. G., ALMEIDA, R. V., SIMAS, A. B. C. e FREIRE, D. M.

G., Experimental design of the kinetic resolution of a key precursor of high-value bioactive myo-inositols by an

immobilized lipase. J. Chem. Technol. Biotechnol. doi: 10.1002/jctb.3806. 2012.

CUNHA, A.G.; da SILVA, A.A.T.; GODOY, M.G.; ALMEIDA, R.V.; SIMAS, A.B.C. e Freire, D.M.G.

Experimental design of the kinetic resolution of a key precursor of high-value bioactive myo-inositols by an

immobilized lipase. J Chem Technol Biotechnol. v. 88, p. 205–211, 2013.

CUNHA, A.G.; BESTETI, M.D.; MANOEL, E.A.; da SILVA, A.A.T.; ALMEIDA, R.V.; SIMAS, A.B.C.;

FERNANDEZ-LAFUENTE, R.; PINTO, J.C.; FREIRE, D.M.G. Preparation of core–shell polymer supports to

immobilize lipase B from Candida antarctica. Effect of the support nature on catalytic properties. J. Mol.

Catalysis B: Enzymatic., v. 100, p. 59-67, 2014.

CYGLER, M., SCHRAG, J. D., ERGAN, F., Advances in structural understanding of lipases, Biotechnol. Genet.

Eng. Rev. v.10, p.143-184, 1992.

CYGLER, M. e SCHRAG, J. D. 1997. Structure as basis for understanding interfacial properties of lipases.

Methods Enzymol, 284, part A, p. 3-27.

DAMASCENO, F.S.C.; CAMMAROTA, M.C.; FREIRE, D.M.G. The combined use of a biosurfactant and an

enzyme preparation to treat an effluent with a high fat contente. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 95,

n.15, p. 241–246, 2012.

DALLA-VECCHIA, R., NASCIMENTO, M.G., SOLDI, V. Química Nova, v. 27, n. 4, p. 1-16, 2004.

DEGUEIL-CASTAING, M., de JESO, B., DROUILLARD, S. e MAILLARD, B. Enzymatic reactions in organic

synthesis: 2-Ester interchange of vinyl esters, Tetrahedron Lett. v. 28, n.9, p. 953-954, 1987.

DEREWENDA, U., BRZOZOWSKI, A.M.; LAWSON, D.M. e DEREWENDA, Z. S., Biochemistry, v.31,

p.532-1541, 1992.

DEREWENDA, U., SWENSON, L., GREEN, R., WEI, Y., DODSON, G. G., YAMAGUCHI, S., HAAS, M. J.

e DEREWENDA, Z. S., An unsusal buried polar cluster in a family of fungal lipases, Nature Struct. Biol., v.1,

p.36-47, 1994a.

DEREWENDA, U., SWENSON, L., GREEN, R., WEI, Y., YAMAGUCHI, S., JOERGER, R., HAAS, M. J.,

DEREWENDA, Z. S., Current progress in crystallographic studies of new lipases from filamentous fungi,

Protein Engineer, v.7, p.551-557, 1994b.

DESAI, T.; GIGG, J.; GIGG, R.; MARTÍN-ZAMORA, E. SCHNETZ, N.; Carbohydr. Res., v. 258, p. 135-144,

1994.

DESAI, T., GIGG, J., GIGG, R. e MARTIN-ZAMORA, E., The preparation of racemic nd enantiomerically

pure myo-inositol derivatives as intermediates for the synthesis of phosphatidylinositol3-, 3,4-bis-and 3,4,5-tris-

phosphates and for the synthesis of analogues of lD-myo-inositol 1,3,4,5tetrakisphosphate. Carbohydrate

Research, v. 296, p.97-133, 1996.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/09277765

http://www.sciencedirect.com/science/journal/09277765/95/supp/C

149


DESAI P.D., DAVE A.M., DEVI S., Food Chem. 95 (2006) 193–199.

DEWAN, S. S. BCC Research; BCC Research: 2012. Disponível em http://bccresearch.com/report/chiral-

technology-bio012e.html. Acesso em 10. Jan. 2013.

DÍAZ-RODRÍGUEZ e B. G. DAVIS, Curr. Opin. Chem. Biol., 2011, 15, 211–219.

DIJKSTRA, Z. J.; MERCHANT, R.; KEURENTJES, J. T. F. J. Supercritic. Fluids 2007, 41, 102-108.

DIZGE, N., KESKINLER, B., TANRISEVEN, A., Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 66, p. 34–38,

2008.

DODSON, G. G., LAWSON, D. M. e WINKLER, F. K., Structural and evolutionary relationships in lipase

mechanism and activation, Faraday Discuss. p.95-105. 1992.

DU, W. J. Mol. Cat. B: Enzym., 2004, 30, 125–129.

DUNN P.J., WELLS A.S., WILLIAMS M.T. (Eds.), Green Chemistry in the Pharmaceutica, Industry, Wiley-

VCH, Weinheim, 2010, pp. 269–287 (Chapter 13).

EINICKER-LAMAS, M., MALAQUIAS, A.T., DE CASTRO, S.L., SMITH, G.A., OLIVEIRA, M.M.,

Parasitology Research, v. 85, p. 232–238, 1999.

EGGERT, T., VAN POUDEROYEN G., DIJKSTRA, B.W., JAEGER, K.E. Lipolytic Enzymes LipA and LipB

from Bacillus subtilis differ in regulation of gene expression, biochemical properties, and three-dimensional

structure. FEBS Lett 502:89–92, 2001.

EGLOFF, P., RANSAC, S., MARGUET, F., ROGALSKA, E., VAN TILBEURGH, H., BUONO, G.,

CAMBILLAU, C. e BERGER, R. Les lipases: cinétiques, spécificités et aspects structuraux. In MALCATA,

F.X. (Ed). Engineering of/with lipases. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1995.

EVANS, C.T., ROBERTS, S.M., SHOBERU, K.A., SUTHERLAND, A.G., Potential use of carbocylic

nucleosides for the treatment of AIDS: chemo-enzymatic syntheses of the enantiomers of carbovir. J. Chem. Soc.

Perkin Trans. v.1, p.589–592, 1992.

FABER, K. Biotransformations in Organic Chemistry, Sringer-Verlag New York INC.: New York, 1997.

FABER, K. Biotransformations in Organic Chemistry, 4 ed. Springer: Berlin, 2000.

FABER, K., Non-sequential processes for the transformation of a racemate into a single stereoisomeric product:

proposal for stereochemical classification, Chem. Eur. J., v.7, p.5004-5010, 2001.

FABER, K. Biocatalytic Applications In: Biotransformations in organic chemistry, 2011. 423p.

FABER, K., FRANSSEN, M.C.R., Prospectsor the increase application of biocatayst in organic transformations,

Trends in Biotechnol., v. 11, p.461-470, 1993.

FABER, K., OTTOLINA, G. e RIVA, S., Selectivity-Enhancement of Hydrolase Reactions. Biocatalysis , v. 8,

p. 91–132, 1993.

FERNANDES, M.L.M., KRIEGER, N., BARON, A.O, ZAMORA, P.P., RAMOS, L.P. e MITCHELL, D.A.

Hydrolysis and synthesis reactions catalysed by Thermomyces lanuginosa lipase in OT/Isooctane reversed

micellar system. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic., v. 30, p. 43-49, 2004.

FERNANDES, M.L.M., SAAD, E.B., MEIRA, J.A., RAMOS, L.P., MITCHELL, D.A. e KRIEGER, N.

Esterification and transesterification reactions catalysed by addition of fermented solids to organic reaction

media. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic., v. 263, p. 8-13, 2006.

FERNANDEZ-ÁLVARO, E.; ESQUIVIAS, J.; PÉREZ-SÁNCHEZ, M.; DE MARIA, P.D.; REMUINÁN-

BLANCO, M.J. Assessing biocatalysis for the synthesis of optically activetetrahydropyrazolo[1,5- _]pyrimidines

(THPPs) as noveltherapeutic agentes. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 100 (2014) 1– 6.

FERNANDEZ-LAFUENTE, R., ARMISÉN, P., SABUPUILLO, P., FERNÁNDEZ-LORENTE, G., GUISÁN,

J. M., ―Immobilization of lipases by selective adsorption on hydrophobic supports‖, Chemistry and Physics of

Lipids, v. 93, pp. 185-197, 1998.

FERNÁNDEZ-LORENTE, G., TERRENI, M., MATEO, C., BASTIDA, A, FERNÁNDEZ-LAFUENTE, R.,

DALMASES, P., HUGUET, J., GUISÁN, J.M., Modulation of lipase properties in macro-aqueous systems by

controlled enzyme immobilization: enantioseletive hydrolysis of a chiral ester by immobilized Pseudomonas

lipase, Enz. Microbial Technol.,, v. 28, p. 389-396, 2001.

http://bccresearch.com/report/chiral-technology-bio012e.html

http://bccresearch.com/report/chiral-technology-bio012e.html

150


FERNÁNDEZ-LORENTE, G.; PALOMO J.M.; FUENTES M., MATEO, C.; GUISÁN, J.M.; FERNANDEZ-

LAFUENTE, R. Self-assembly of Pseudomonas fluorescens lipase into bimolecular aggregates dramatically

affects functional properties. Biotechnol Bioeng 2003;82:232–7.

FERNÁNDEZ-LORENTE G, CABRERA Z, GODOY C, FERNANDEZ-LAFUENTE R, PALOMO JM,

GUISAN JM. Interfacially activated lipases against hydrophobic supports: effect of the support nature on the

biocatalytic properties. Process Biochem 2008;43:1061–7.

FERRARIO V.; EBERT, C.; KNAPIC, L.; FATTOR, D.; BASSO, A.; et al. Conformational changes of lipases

in aqueous media: A comparative computacional study and experimental implications. Adv. Synth Catal. 353:

2466-2480, 2011.

FITZPATRICK, P.A., KLIBANOV, A.M., Journal American Chemical Society, v.113, p. 3166, 1991.

FOLTIN, J.P. Avaliação da perda de carga em leito fixo de partículas irregulars utilizando xisto betuminoso,

analisando a modelagem matemárica através do efeito de parede e porosidade. Dissertação apresentada a curso

de mestrado em engenharia química da Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Brasil.2013,104p.

FONTES, G.C.; RAMOS, N. M.; AMARAL, P. F. F.; NELE, M.; COELHO, M. A. Z., Renewable resources for

biosurfactant production by Yarrowia lipolytica. Brazilian Journal of Chemical Engineering (Impresso), v. 29, p.

483-494, 2012.

FORDE, J.; VAKUROV, A.; GIBSON, T. D.; MILLNER, P.; WHELEHAN, M.; MARISON, I. W.;

Ó'FÁGÁIN, C. J.Mol. Catal. B: Enzym. 2010, 66, 203-209.

FORESTI, M.L, FERREIRA, M.L., Chitosan-immobilized lipases for the catalysis of fatty acid esterifications,

Enzyme and Microbial Technology, v. 40, n.4, p. 769-777, 2006.

FREEMAN A. e LILLY M. D., Enzyme Microb. Technol., 1998, 23, 335–345.

FREIRE, D.M.G. Imobilização de amiloglicosidase em quitina – caracterização e testes em reatores contínuos de

leito expandido, Dissertação de Mestrado, EQ/UFRJ, Rio de Janeiro, 1988.

FREIRE, D.M.G. e CASTILHO L. R. 2010. Lipases em Biocatálise. In: Elba Pinto da Silva BON;Maria

Antonieta Ferrara;Maria Luisa Corvo. (Org.). Enzimas em Biotecnologia. Produção, Aplicações e Mercado..

1ed.Rio de Janeiro: Editora Interciência, 2008, v. 1, p. 369.

FREIRE, D.M.G.; de SOUSA, J.S.; CAVALCANTI E.D.C. Biotechnological Methods to Produce Biodiesel.In:

PANDEY, A.; LARROCHE, C.; RICKE, S.C.; DUSSAP, C.G. e GNANSOUNOU, E. (Eds.). Biofuels,

Burlington: Academic Press, 2011, p. 315-337. ISBN: 978-0-12-385099-7.

FREUND, H. et al. Numerical simulations of single phase reacting flows in randomly packed fixed-bed reactors

and experimental validation, Chemical Engineering Science, Netherlands, v. 58, p. 903-910, 2003.

FUENTES, I.E., VISERAS, C.A., UBIALI, D., TERRENI, ALCÂNTARA, A.R., Different phyllosilicates as

supports for lipase immobilisation, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 11, p.657–663, 2001.

GANJALIKHANY,M.R.; RANJBAR, B.; TAGHAVI, A.H.; MOGHADAM, T.T.. 2012. Functional motions of

Candida Antarctica lipase B: A survey through open-close conformations. Plosone, v. 7, issue 7, p. 1-11.

GAO, S., WANG, Y., WANG, T., LUO, G., DAÍ, Y., Bioresource Technology v. 100, p.996–999, 2009.

GARCIA-GALAN, C.; BERENGUER-MURCIA, A.; FERNANDEZ-LAFUENTE R.; RODRIGUES, R. C.

Potential of different enzyme immobilization strategies to improve enzyme performance. Adv. Synth. Catal.,

2011, 353, 2885–2904. DOI: 10.1002/adsc.201100534.

GARCÍA-URDIALES, E., AFONSO, I. E GOTOR, V., Enantioselective Enzymatic Desymmetrizations in

Organic Synthesis, Chem. Rev., v.111, p.110-180, 2011.

GAREGG, P.; LINDBERG, B.; KVARNSTRÖM, I.; C.T. SVENSSON, S. Carbohydrate Research, v. 139, p.

209-215, 1985.

GELLISSEN G. Heterologous protein production in methylotrophic yeasts. Appl Microbiol Biotechnol, v.54,

p.741–750, 2000.

GHANEM, A.; ABOUL-ENEIN, H. Y. Tetrahedron: Asymmetry, v. 15, p. 3331-3351, 2004.

GHANEM, A. 2007. Trends in lipase-catalyzed asymmetric access to enantiomerically pureenriched

compounds. Tetrahedron, v. 63, p.1721–1754, 2007.

http://lattes.cnpq.br/3903704349157492

151


GHANEM, A., ABOUL-ENEIN, M.N., EL-AZZOUNY, A. e EL-BEHAIRY, M.F. Lipase-mediated

enantioselective kinetic resolution of racemic acidic drugs in non-standard organic solvents: Direct chiral liquid

chromatography monitoring and accurate determinationof the enantiomeric excesses. J. Chromatogr. A 1217,

p.1063–1074, 2010.

GONG, P.-F. e XU, J.H. Bio-resolution of a chiral epoxide using whole cells of Bacillus megaterium ECU1001

in a biphasic system. Enzyme and Microbial Technology, v.36, p.252–257, 2005.

GONG, P.-F. e XU, J.-H., Bio-resolution of a chiral epoxide using whole cells of Bacillus megaterium ECU1001

in a biphasic system. Enzyme and Microbial Technology, v. 36, p. 252–257, 2005.

GONZALEZ-SABÍN, J., LAVANDERA, I., REBOLLEDO, F., GOTOR, V., Redesigning the mechanism of the

lipase-catalysed aminolysis of esters, Tetrahedron: Asymmetry, v. 17, n.8, p. 1264–1274, 2006.

GORMAN, L. A. e DORDICK, J. S. Biotechnol. Bioeng. v. 39, p.392, 1992.

GOSWAMI D.; BASU J.K.; DE D.; Crit. Rev. Biotechnol. 33 (2013) 81–96.

GOTOR, V. F., BRIEVA, R., GOTOR, V., Lipases: Useful biocatalysts for the preparation of pharmaceuticals,

Journal of Molecular Catalysis B: enzymatic, v. 40, p. 111-129, 2006.

GOTOR-FERNANDEZ, V., BUSTO E., GOTOR, V., Candida antarctica Lipase B: An Ideal Biocatalyst for the

Preparation of Nitrogenated Organic Compounds, Adv. Synth. Catal., v. 348, p.797–812, 2006.

GROCHULSKI, P., BOUTHILLIER, F., KAZLAUSKAS, R.J., SERREQI, A.N., SCHRAG, J.D., ZIOMEK, E.,

CYGLER, M., ―Analogs of reaction intermediates identify a unique substrate binding site in Candida rugosa

lipase‖, Biochemistry, v. 33, pp. 3494–3500, 1994.

GROENER, J.E.M., BAX, W., STUANI C. e PAGANI, F. Biochimica et Biophysica Acta Molecular and Cell

Biology of Lipids, v. 27, p. 155-162. 2000.

GU, Q.; LIN, Q.; HU, C.; YANG, B. J. Appl. Polym. Sci., 2005, 95, 404-412.

GUISÁN, J.M., ALVARO, G., FERNANDEZ-LAFUENTE, R., ROSELL, C.M., GARCIALOPEZ, J.L.,

TAGLIATI, A., Biotechnology Bioeng., v. 42, p. 455–464, 1993.

GUISÁN, J. M., SABUQUILLO, P., FERNANDEZ-LAFUENTE, R., FERNANDEZ-LORENTE, G.,

Preparation of new lipases derivatives with high activity-stability in anhydrous media: adsorption on

hydrophobic supports plus hydrophilization with polyethylemine, Journal of molecular Catalysis B: enzymatic,

v. 11, p. 817-824, 2001.

GUISAN J.M. Immobilization of Enzymes as the 21st Century Begins In: Guisan, J.M. Immobilized of Enzyme

and Cells. Methods in Biotechnology, second Edition, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2006. 465p.

GUMÍ, T., ALBACETE, J.F.D., PAOLUCCI-JEANJEAN, D., BELLEVILLE, M.P., RIOS, G.M. Study of the

influence of the hydrodynamic parameters on the performance of an enzymatic membrane reactor, Journal of

Membrane Science, v.311, p.147–152, 2008.

GUTARRA, M.L.E; MATEO, C.; FREIRE, D.M.G; TORRES, F.A.G.; CASTRO, A.M., GUISAN, J.M. e

PALOMO, J.M., Oriented irreversible immobilization of a glycosylated Candida antarctica B lipase on

heterofunctional organoborane-aldehyde support., Catal. Sci. Technol., v.1, p.260–266, 2011.

GÜVENÇ, A., KAPUCU, N. e MEHMETOGÙLU, U., The production of isoamyl acetate using immobilized

lipases in a solvent-free system‖, Proc. Biochem., v.38, p.379-386, 2002.

HA, S.H., LAN, M.N., LEE, S.H., HWANG, S.M. e KOO, Y.M. Lipase catalyzed biodiesel production from

soybean oil in ionic liquids, Enzyme and Microbial Technology, v. 41, p. 480-483, 2007.

HAKI, G.D., RAKSHIT, S.K., Bioresource Technology, v. 89, p. 17–34, 2003.

HALLING, P.J. Protein Structure and Molecular. Biochimica et Biophysica Acta. Enzymology, v. 1040, n.2, p.

225-228, 2003.

HANEFELD, U., GARDOSSI, L., MAGNER, E., Understanding enzyme immobilisation. Chem. Soc. Rev., v.

38, n.2, p.453–468, 2009.

HASAN, F., SHAH, A. A. e HAMEED, A. Industrial applications of microbial lipases, Enzyme and Microbial

Technology, v. 39, p. 235-251, 2006.

HARA, P.; HANEFELD, U.; KANERVA, L. T. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2008, 50, 80-86.

152


HARTMANN, M., JUNG, D., Journal of Materials Chemistry, v. 20, p. 844, 2010.

HASSAN, M.M., ATIQULLAH, M., BEG, S.A., CHOWDHURY, M.H.M. Chemical Engineering Journal and

the Biochemical Engineering Journal, v.58, p.275, 1995.

HASSAN, M.M., ATIQULLAH, M., BEG, S.A., CHOWDHURY, M.H.M., Journal of Chemical Technology

and Biotechnology, v. 66, p.41, 1996.

HE F., WANG C.F., JIANG T., HAN B., ZHUO R.X., Biomacromolecules 11 (2010) 3028–3035.

HERBS, D.; PEPER, S.; NIEMEYER, B. Enzyme catalysis in organic solvents: influence of water content,

solvent composition and temperature on Candida rugosa lipase catalyzed transesterification, Journal of

Biotechnology, 162, 398-403p., 2012.

HELLYER, S. A., CHANDLER, I. C. e BOSLEY, J. A., Can the Fatty Acid Selectivity of Plant Lipases be

Predicted from the Composition of the Seed Triglyceride? Biochemica et Biophysica Acta, v.1440, n. 2-3, p.215,

1999.

HERNÁNDEZ K., FERNÁNDEZ-LAFUENTE R., Enzyme Microb. Technol. 48 (2011) 107–122.

HERNÁNDEZ K., GARCIA-GALAN, C.; FERNÁNDEZ-LAFUENTE R., Enzyme Microb. Technol. 49 (2011)

72–78.

HIDE, W., CHAN, L. e LI, W. J. Lipid. Res., v. 33, p. 167-178, 1992.

HOEGH, I., PATKAR, S., HALKIER, T., HANSEN, M. T., Two lipases from Candida antarctica - cloning and

expression in Aspergillus oryzae, Can. J. Botan. v. 73, p. 869-875, 1995.

HOMANN, M.J., VAIL, R., MORGAN, B., SABESAN, V., LEVY, C., DODDS, D.R., ZAKS, A., 2001.

Enzymatic hydrolysis of a prochiral 3-substituted glutarate ester, na intermediate in the synthesis of an

NK1/NK2 dual antagonist. Adv. Synth. Catal. 343 (6–7), 744–749.

HSU, AN-FEI, JONES, K.C., FOGLIA, T.A. e MARMER, W.N. Transesterification activity of lipase

immobilized in a phyllosilicate sol-gel matrix. Biotechnol. Letters, v. 26, p.917-921, 2004.

HUANG, W.; ALEXANDER, G. E.; DALY, E. M.; SHETTY, H. U.; KRASUSKI, J. S.; RAPOPORT, S. I.;

SCHAPIRO, M. B.; Am. J. Psychiatry, 1999, 156, 1879-1999.

HUANG, D.F., HAN, S.Y., HAN, Z.L., LIN, Y., Biodiesel production catalyzed by Rhizomucor miehei lipase-

displaying Pichia pastoris whole cells in an isooctane system. Biochem. Eng. J., v. 63, p.10–14, 2010.

ILLANES, A. Biotecnologia de enzimas, Ediciones Universitarias de Valparaíso, Chile, 1994.

IRVINE, R.F., BROWN, K.D., BERRIDGE, M.J., Biochemistry Journal, v. 222, p. 269,1984.

ISO, M., CHEN, B., EGUCHI, M., KUDO T. e SHRESTHA, S. Production of biodiesel fuel from triglycerides

and alcohol using immobilized lipase, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v.16, p.53–58, 2001.

ITABAIANA Jr., F.K. SUTILI, F.K., LEITE, S.G.F., MIRANDA, L.S.M., LEAL, I.C.R. e SOUZA, R.O.M.A.,

Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic, v.72, p.313, 2011.

ITABAIANA Jr., I. FLORES, M.C., SUTILI, F.K., LEITE, S.G.F., MIRANDA, L.S.M., LEAL, I.C.R. e

SOUZA, R.O.M.A. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic v.77, p. 53, 2012.

ITABAIANA Jr., I., MIRANDA, L.S.M., de SOUZA, R.O.M.A, Towards a continuous flow environment for

lipase-catalyzed reactions. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 85– 86, p.1– 9, 2013.

ITABAIANA Jr., I., FLORES, M.C.; SUTILI, F.K., LEITE, S.G.F., MIRANDA, L.S.M., LEAL, I.C.R. e

SOUZA R.O.M.A., Lipase-Catalyzed Monostearin Synthesis under Continuous Flow Conditions Org. Process

Res. Dev., v.16, p.1098–1101, 2012.

JAEGER, K., RANSAC, S., DIJKSTRA, B.W., FEMS Microbiology Reviews, v. 15, p. 29-63, 1994.

JAEGER, K.E.; REETZ, M.T. 1998. Microbial Lipases form versatile tools for biotechnology. TIBTECH, 16,

396-403.

JAEGER, K.E., DIJKSTRA, B.W., REETZ, M.T., Bacterial biocatalysts: molecular biology, three-dimensional

structures, and biotechnological applications of lipases, Annual Review of Microbiology, v.53, p. 315-351, 1999.

JAEGER, K. E. e EGGERT, T. 2002. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol., 13,390-397.

153


JAEGER, K-E. e EGGERT, T. Enantioselective biocatalysis optimized by directed evolution. Curr. Opin.

Biotechnol. v.15, p.305–313, 2004.

JAIN, N., KUMAR, A., CHAUHAN, S., CHAUHAN, S.M.S. Tetrahedron, v.61, p. 1015, 2005.

JIN, Z., NTWALI, J., HAN, S.Y., ZHENG, S.P., LIN, Y., Production of flavor esters catalyzed by CALB-

displaying Pichia pastoris whole-cells in a batch reactor. J. Biotechnol., v.159, p.108–114, 2012.

JIN, Z., HAN, S.Y., ZHANG, L., ZHENG, S.P., WANG, Y., LIN, Y., Combined utilization of lipase-displaying

Pichia pastoris whole-cell biocatalysts to improve biodiesel production in co-solvent media, Bioresource

Technology, v.130, p.102–109, 2013.

KADEMI, A.; AÏT-ABDELKADER, N.; FAKHREDDINE, L.; BARATTI, J.C., Journal of Molecular Catalysis

B: enzymatic, v. 10, p. 395–401, 2000.

KALER, A.; MEENA, V.S.; SING, M.; PUJALA, B.; CHAKRABORTI, A.K., BANERJEE, U.C. Lipase-

mediated kinetic resolution of (RS)-1-bromo-3-[4-(2-methoxy-ethyl)-phenoxy]-propan-2-ol to ®-1-bromo-3-(4-

(2-methoxyethyk)ohenoxy) propan-2-yl acetate. Tetrahedron Letters, v. 52, issue 41, 5355-5358p., 2011.

KAPPOR, M. e GUPTA, M.N. Lipase promiscuity and its biochemical applications. V. 47, Issue 4, 2012, p.

555–569 Process Biochemistry.

KATO, K., SEELAN, S., Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 109, n. 6, p. 615–617, 2010.

KATCHALSKI-KATZIR E., Trends Biotechnol. 11 (1993) 471–478.

KAUR, J. e SHARMA, R. Directed evolution: an approach to engineer enzymes. Crit. Rev. Biotechnol., v. 26,

p.165–199, 2006.

KAWAKAMI, K., ODA, Y., TAKAHASHI, R. Biotechnology for Biofuels, 2011.

KAWANO, S. HASEGAWA J., YASOHARA Y., Efficient Preparation of (R)-3-Hydroxypentanenitrile with

High Enantiomeric Excess by Enzymatic Reduction with subsequent enhancement of the optical purity by

lipase-catalysed ester hydrolysis. Biosci. Biotechnol. Biochem., v. 76, n. 9, p. 1796-1798, 2012.

KAZLAUSKAS, R.J., WEISSFLOCH, A.N.E., RAPPAPORT, A.T., CUCCIA, L.A., Journal Organic

Chemical, v. 56, p. 2656–2665, 1991.

KEE, C.Y.G., HASSAN, M., RAMACHANDRAN, K.B., Artificial Cells Blood Substitutes and Immobilization

Biotechnology, v.27, p. 393, 1999.

KIRK, O, BORCHERT T.V. e FUGLSANG C.C. Industrial Enzymes applications. Current Op. Biotechnol., v.

13, p.345–351, 2002a.

KIRK O., WURTZ M., Org. Process Res. Dev. 6 (2002b) 446–451.

KISS, V., EGRI, G, BÁLINT, J., LING, I., BARKÓCZ, J., FOGASSY, E., ―Kinetic and chemical resolution of

different 1-phenyl-2-propanol derivatives‖, Tetrahedron: Asymmetry, v. 17, p. 2220–2234, 2006.

KITA, Y., TAKEBE, Y., MURATA, K., NAKA, T., AKAI, S. 1-Ethoxyvinyl acetate as a novel, highly reactive,

and reliable acyl donor for enzymatic resolution of alcohols, Tetrahedron Lett. v.37, p.7369-7372, 1996.

KNEZEVIC, Z., MILOSAVIC, N., BEZBRADICA, D., JAKOVLJEVIC, Z., PRODANOVIC, R.,

Immobilization of lipase from Candida rugosa on Eupergit® C supports by covalent attachment, Biochemical

Engineering Journal, v. 30, p. 269–278, 2006.

KOTIK M., BRICHAC J. e KYSLÍK P. 2005. Novel microbial epoxide hydrolases for biohydrolysis of glycidyl

derivatives. J Biotechnol., v. 120, p. 364–375, 2005.

KOURIST R., BRUNDIEK H., e BORNSCHEUER U. T., Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2010, 112, 64–74.

KOSZELEWSKI D., REDZEJ A., OSTASZEWSKI R., J. Mol. Catal. B: Enzym. 47 (2007)51–57.

KOZIKOVSKI, A. P., FAUQ, A. H., POWIS, G. e MELDER, D. C. J. Am. Chem. Soc., v. 112, p. 4528-4531,

1990.

KRAJEWSKA B. Ureases. II. Properties and customizing by enzyme immobilizations: A review.

J. Mol. Catal. B: Enzym., 2009, 59, 22-40. doi: 10.1016/j.molcatb.2009.01.004.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/13595113/47/4

154


KRIEGER, N., BHATNAGAR, T., BARATTI, J.C., BARON, A.M., LIMA, V.M.G. e MITCHELL, D. Non-

Aqueous Biocatalysis in Heterogeneous Solvent Systems. Food Technol. Biotechnol., v. 42, n.4, p.279–286,

2004.

LANGONE, M. Síntese de triglicerídeos utilizando lipase, Tese de Doutorado, COPPE/UFRJ, Rio de Janeiro,

1998.

LARIOS, A. Appl. Microbiol.Biotechnol., v.65, n.4, p.373-376, 2004.

LARSEN, M.W., BORNSCHEUER, U. e HULT, K. Expression of Candida antarctica lipase B in Pichia

pastoris and various Escherichia coli, Protein Expression and Purification, v.62, p.90–97, 2008.

LAU, R.M., VAN RANTWIJK, F., SEDDON, K.R., SHELDON, R.A. Organic Letters v. 2, p. 4189, 2000.

LAU, S.Y., UZIR, M.H., KAMARUDDIN, A.H., BHATIA, S., Lipase-catalyzed dynamic kinetic resolution of

racemic ibuprofen ester via hollow fiber membrane reactor: Modeling and simulation, Journal of Membrane

Science, v.357, p.109–121, 2010.

LAU, S.Y., GONAWAN, F.N., BHATIA, S., KAMARUDDIN, A.H. e UZIR, M.H. Conceptual design and

simulation of a plant for the production of high purity (S)-ibuprofen acid using innovative enzymatic membrane

technology, Chemical Engineering Journal, v.166, p. 726–737, 2011.

LAUMEN, K., BREITGOFF, D., SCHNEIDER, M. P. Enzymic preparation of enantiomerically pure secondary

alcohols. Ester synthesis by irreversible acyl transfer using a highly selective ester hydrolase from Pseudomonas

sp.; an attractive alternative to ester hydrolysis, J. Chem. Soc., Chem. Commun. p.1459-1461, 1988a.

LAUMEN, K., SCHNEIDER, M. P. A highly selective ester hydrolase from Pseudomonas sp. for the enzymic

preparation of enantiomerically pure secondary alcohols chiral auxiliaries in organic synthesis, J. Chem. Soc.,

Chem. Commun. p.598-600, 1988b.

LAUMEN, K., GHISALBA, O., Preparative scale Chemo-enzymatic Synthesis of Optically Pure D-myo-

Inositol-1-phosphate, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, v. 58 (11), p. 2046-2049, 1994.

LAUMEN, K., GHISALBA, O., ―Chemo-enzymatic synthesis of both enantiomers of myo-inositol 1,3,4,5-

tetrakisphosphate‖, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, v. 63, p. 1374-1377, 1999.

LEAL, M.C.C.R., CAMMAROTA, M.C., FREIRE, D.M.G. e SANT’ANNA Jr., G.L. 2002. Hydrolytic enzymes

as coadjuvants in the anaerobic treatment of dairy wastewaters. Brazilian J. Chemical Eng., v. 19, n.2, 2002.

LEE, D.G., PONVEL, K.M., KIM, M., HWANG, S., AHN, I.S., LEE, C.H. Journal of Molecular Catalysis B:

Enzymatic, 2008.

D.G. Lee, K.M. Ponvel, M. Kim, S. Hwang, I.-S. Ahn, C.-H. Lee, J. Mol. Catal. B: Enzym. 57 (2009) 62–66.

LEE, J.H., KIM, S.B., PARK, C., TAE, B., HAN, S.O., KIM, S.W. Applied Biochemistry and Biotechnology,

v.161, p.365, 2010.

LENZI, M. K.; SILVA, F. M.; LIMA, E.L.; PINTO, J. C. J. Appl. Polym. Sci., v.89, p.3021, 2003.

LENZI, M.K., Modelagem da Polimerização Simultânea de Estireno em Suspensão e Emulsão, D.Sc. Thesis,

COPPE/Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2002.

LIMA, L.M., Planejamento, síntese e avaliação farmacológica de novos candidatos a fármacos de agentes

antiinflamatórios e antiasmáticos, Tese de Doutorado, IQ/UFRJ, Rio de Janeiro, 2001.

de LIMA L. N.; ARAGON C. C.; MATEO C.; PALOMO J. M.; GIORDANO R. L. C.; TARDIOLI P. W.;

GUISAN J. M., FERNANDEZ-LORENTE G. Immobilization and stabilization of a bimolecular aggregate of the

lipase from Pseudomonas fluorescens by multipoint covalent attachment, Process Biochem., 2013, 48, 118–123.

doi:10.1016/j.procbio.2012.11.008.

LING, L., OZAKI, S., A chemoenzymatic synthesis of D-myo-inositol 1,4,5-triphosphate, Carbohydrate

Research, v. 256, p. 49-58, 1994.

LING, L., OZAKI, S., Enzymatic resolution of the sterically hindered myo-inositol derivative, Bull Chemical

Society Jpn., v. 68, p. 1200-1205, 1995.

LIU Y, WANG F, TAN T. Cyclic resolution of racemic ibuprofen via coupled eficiente lipase and acid-base

catalysis. Chirality, v. 21, n.3, p.349–353, 2009.

LUETZ S., GIVER L., e LALONDE J., Biotechnol. Bioeng., 2008, 101, 647–653.

155


LUNDH, H., NORDIN, O., HEDENSTRÖM, E., HÖGBERG, H. E. Enzyme catalysed irreversible

transesterifications with vinyl acetate - are they really irreversible? Tetrahedron: Asymmetry, v. 6, p.2237-2244,

1995.

MACHADO, A.C.O., da SILVA, A.A.T.T., BORGES, C.P., SIMAS, A.B.C., FREIRE, D.M.G., Kinetic

resolution of (R,S)-1,2-isopropylidene glycerol (solketal) ester derivatives by lipases, Journal of Molecular

Catalysis B: Enzymatic, v.69, p.42–46, 2011.

MACHADO, A.C.O.; da SILVA, A.A.T.; BORGES, C.P.; SIMAS, A.B.C.; FREIRE, D.M.G., Kinetic resolution

of (R,S)-1,2-isopropylidene glycerol (solketal) ester derivatives by lipases. Journal of Molecular Catalysis B:

Enzymatic v.69, p. 42–46, 2011.

MAGNUSSON, A.; TAKWA, M.; HAMBERG, M.A. e HULT, K., Angew. Chem. Int. Ed. 44, p.4582–4585,

2005a.

MAGNUSSON, A.O.; ROTTICCI-MULDER, J.C; SANTAGOSTINO, A. e HULT, K., Chem.Bio.Chem. v.6,

p.1051–1056, 2005b.

MALCATA, F.X. H.R. Reyes, H.S. Garcia, C.G. Hill Jr., C.H. Amundson, J. Am. Oil Chem. Soc. 67 (1990)

890–910.

MANOEL, E.A. Resolução de derivados racêmicos do mio-inositol catalisada por lipases. Dissertação de

mestrado. Escola de Química. Rio de Janeiro, RJ. 2011, 117p.

MANOEL, E.A.; PAES, K.C.; CUNHA, A.G.; COELHO, M.A.Z.; FREIRE, D.M.G. e SIMAS, A.B.C., On the

kinetic resolution of sterically hindered myo-inositol derivatives in organic media by lipase. Tetrahedron:

Asymmetry, v. 23, p. 47, 2012a.

MANOEL, E.A.; PAES, K.C.; CUNHA, A.G.; SIMAS, A.B.C.; COELHO, M.A.Z. e FREIRE, D.M.G., Kinetic

Resolution of 1,3,6-Tri‑O‑benzyl-myo-Inositol by Novozym 435: Optimization and Enzyme Reuse, Org. Process

Res. Dev., v. 16, p.1378-1384. 2012b.

MANOEL, E.A., PAIS, K.C., FLORES, M.C., MIRANDA, L.S.M., COELHO, M.A.Z., SIMAS, A.B.C.,

FREIRE, D.M.G. e SOUZA, R.O.M.A. Kinetic resolution of a precursor for myo-inositol phosphates under

continuous flow conditions, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 87, p.139–143, 2013.

MARCH, J. 1992. Advanced Organic Chemistry: reactions, mechanisms and structure. 4. ed. John Wiley &

Sons: New York

MARCHETTI, J.M., MIGUEL, V.U. e ERRAZU, A.F., Possible methods for biodiesel production, Renewable

and Sustainable Energy Reviews, v. 11, p. 1300–1311, 2007.

MARGOLIN, A. L. Novel crystalline catalysts, Trends Biotechnol. v.14, p. 223-230, 1996.

MARGOLIN, A. L., Enzym. Microbial Technol., v.15, p.266-280, 1993.

MARTINS, F.F., FERREIRA, T.F., AZEVEDO, D., COELHO, M.A.Z., Evaluation of crude oil degradation by

Yarrowia lipolytica. Chemical Engineering Transactions, v. 27, p. 223-228, 2012.

MARTON, Z.; LÉONARD-NEVERS, V.; SYRÉN, P.; BAUER, C.; LAMARE, S.; HULT, K.K., J. Mol. Catal.

B: Enzym. v. 65, p. 11–17, 2010.

MATEO, C.; ABIAN, O.; BERNEDO, M.; CUENCA, E.; FUENTES, M.; FERNÁNDEZ- LORENTE, G.;

PALOMO, J. M.; GRAZU, V.; PESSELA, B.C.C.; GIACOMINI, C.; IRAZOQUI, G.; VILLARINO, A.;

OVSEJEVI, K.; BATISTA-VIERA, F.; FERNÁNDEZ -LAFUENTE, R. e GUISAN, J. M., Improvement of

enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques. Enzyme Microb. Technol., v.36, p. 447–

454. 2005

MATEO, C., PALOMO, J.M., FUENTES, M., BETANCOUR, L., GRAZU, V., LÓPEZ-GALEGO, F.,

PESSELA, B.C.C., HIDALGO, A., FERNANDEZ-LORENTE, G., FERNANDEZ-LAFUENTE, R., GUISÁN,

J.M., Glyoxyl Agarose: a fully inert and hydrophilic support for immobilization and high stabilization of

proteins, Enzyme and Microbial Technology, v. 39, p. 274-280, 2006.

MATEO, C., PALOMO, J.M., FERNANDEZ-LORENTE, G., GUISÁN, J.M., FERNANDEZLAFUENTE, R,

Enzyme and Microbial Technology, v. 40, p. 1451–1463, 2007.

MATSUSHIMA, A., KODERA, Y., HIROTO, M., Bioconjugates of proteins and polyethylene glycol: potent

tools in biotechnological processes, Journal of Molecular Catalysis B: enzymatic, v. 2, p. 1-17, 1996.



156


MAY, O. Green Chemistry with Biocatalysis for Production of Pharmaceuticals 305-321p. In: TAO, J.; LIN,

G.Q.; LIESE A. Biocatalysis for the pharmaceutical industry: Discovery, Development, and Manufacturing.

John Wiley & Sons (Asia) Pte Ltd. Singapura.2009.324p.

MCCLEAN, K.H. Biocatalyst Identification and Scale-up: Molecular Biology for Chemists. In: John Whittall &

Peter Sutton. Practical Methods for Biocatalysis and Biotransformations. John Wiley and Sons, Ltd. 2010. Reino

Unido. 402p.

MENDES A. A., OLIVEIRA P. C., de CASTRO H. F.; Properties and biotechnological applications of porcine

pancreatic lipase Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 78 (2012) 119– 134

MENSAH, P., GAINER, J.L., CARTA, G. Biotechnology and Bioengineering, v. 60, p.445, 1998.

MCLAURIN, J., GOLOMB, R., JUREWICZ, A., ANTEL, J. P., FRASER, P. E., Journal of Biological

Chemistry, v. 275, p.18495, 2000.

MILÉTIC, N., VUKOVIC, Z., NASTASOVIC, A., LOOS, K., Macroporous poly(glycidyl methacrylate-co-

ethylene glycol dimethacrylate) resins—Versatile immobilization supports for biocatalysts, Journal of Molecular

Catalysis B: Enzymatic, v. 56, p. 196-201, 2009.

MILÉTIC, N., ABETZ, V., EBERT, K., LOOS, K., Macromolecular Rapid communications, v. 31, no. 1, p. 71–

74, 2010.

MILETÍC N., NASTASOVIC A. LOOS K. Immobilization of biocatalysts for enzymatic polymerizations:

Possibilities, advantages, applications, Bioresour. Technol., 2012, 115, 126–135,

doi:10.1016/j.biortech.2011.11.054.

MILED, N., CANAAN, S., DUPUIS, L., ROUSSEL, A., RIVIÈRE, M., CARRIÈRE, F., DE CARO, A.,

CAMBILLAU, C. e VERGER, R. Digestive lipases: From three-imensional structure to physiology. Review

article. Biochimie., v. 82, p. 973-986, 2000.

MILLS S.J. e POTTER B.V.L. Synthesis of D- and L-myo-Inositol 1,4,6- Trisphosphate, Regioisomers of a

Ubiquitous Second Messenger. J. Org. Chem. v. 61, n. 25, p.8980-8987, 1996.

MILLS, S. J., LIU, C. e POTTER, B. V. L. Synthesis of D- and L-myo-inositol 2,4,5-triphosphate and

triphosphorothioate: structural analogues of D-myo-inositol 1,4,5- triphosphate. Carbohydr. Res. v. 337, p.1795-

1801, 2002.

MILNER, S. E. e MAGUIRE, A. R. Arkivoc, 2012, 321–382.

MING-MING ZHENG, YONG LU, FENG-HONG HUANG, LIAN WANG, PING-MEI GUO, YU-QI FENG, e

QIAN-CHUN DENG Lipase Immobilization on Hyper-Cross-Linked Polymer-Coated Silica for Biocatalytic

Synthesis of Phytosterol Esters with Controllable Fatty Acid Composition dx.doi.org/10.1021/jf3042962 J.

Agric. Food Chem. 2013, 61, 231−237

MONTGOMERY, D.C. e RUNGER, G.C. Estatística Aplicada e probabilidade para engenheiros.Segunda

edição. LTC editora. S.A. 2003, 463p.

MONTGOMERY, D.C. Design and Analysis of Experiments. 5aedição. John Wiley & Sons, I.N.C. New York

Chechester Weinheim Brisbane Toronto Singapura. 2001, 680p.

MUKHERJEE, K. D. Plant lipases and their application in lipid biotransformations. Prog. Lipid Res., v. 33, n.1-

2, p.165-174, 1994.

MUKHERJEE, M. Human digestive and metabolic lipases—a brief review J. Mol.Catalysis B: Enzymatic., v.22,

p. 369–376. 2003.

NAIK, S., BASU, A., SAIKIA, R., MADAN, B., PAUL, P., CHATERJEE, R., BRASK, J., SVENDSEN, A.,

Lipases for use in industrial biocatalysis: Specificity of selected structural groups of lipases, Journal of

Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 65, p.18–23, 2010.

NAGY E., Basic equations of the mass transport through a membrane layer, Elsevier, Amsterdam ; Boston, 1st

ed., 2012, ch. 9, pp. 213-247

NAKAMURA, K., TAKEBE, Y., KITAYAMA, T. e OHNO. A. Effect of solvente structure on

enantioselectivity of lipase-catalyzed transesterfication. Tetrahedron, 32, 4941-4944, 1991.

NASRATUN, M.; SAID, H. A.; NORAZIAH, A.; ALLA, A. N. Immobilization of lipase from Candida rugosa

on chitosan beads for transesterification reaction. Am. J. Appl. Sci. 2009, 6 (9), 1653−1657.

157


NAUSHADA, M., ALOTHMANA, Z.A., KHANB, A.B., ALI, M., Effect of ionic liquid on activity, stability,

and structure of enzymes: A review, International Journal of Biological Macromolecules, v. 51, p.555– 560,

2012.

NELSON J. M. e GRIFFIN, E. G. J. Am. Chem. Soc., 1916, 38, 1109–1115.

NESTL, B.M., NEBEL, B.A., HAUER, B., Recent progress in industrial biocatalysis. Curr. Opin. Chem. Biol. v.

15, n.2, p. 187–193, 2011.

NIE, K., XIE, F., WANG, F., TAN, T. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic, v.43, p. 142, 2006.

NINI, L., SARDA, L., LOUIS-CLAUDE, C., BOITARD, E., JEAN-PAUL, DD. E CHAHINIAN. H., Lipase-

catalysed hydrolysis of short-chain substrates in solution and in emulsion: a Kinetic study. Biochim. Biophys.

Acta., v.534, p.34-44, 2001.

NISHIO, T., KAMIMURA, M., MURATA, M., TERAO, Y., ACHIWA, K. 1989. Production of optically active

esters and alcohols from racemic alcohols by lipase-catalyzed stereoselective transesterification in nonaqueous

reaction system, J. Biochem. v.105, p.510-512.

NISHIZUKA, Y. Nature , v. 334, p. 356, 1988.

OKAZAKI, S., KAMIYA, N., GOTO, M. e NAKASHIO, F., Purification and characterization of a novel

lipolytic enzyme from Aspergillus oryzae, J. Ferment. Bioeng., v.78, n.6, p.413-419, 1997.

OLIVEIRA, D., FEIHRMANN, A. C., DARIVA, C., CUNHA, A. G., BEVILAQUA, J. V., DESTAIN, J.,

OLIVEIRA, J. V., FREIRE, D. M. G., Influence of compressed fluids treatment on the activity of Yarrowia

lipolytica lipase, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 39, p. 117-123, 2006.

OLIVEIRA, D.; FEIHRMANN, A.C.; DARIVA, C.; CUNHA, A.G.; BEVILAQUA, J.V.; DESTAIN, J.;

OLIVEIRA, J.V.; FREIRE, D.M.G. J. Mol. Cat. B: enzym., v. 39, p.117-123. 2006.

OLIVEIRA, M.M.; EINICKER-LAMAS, M. Anais da Academia Brasileira de Ciências, Brasil, v.72, p.413-419,

2000.

ONG, A.L.; KAMARUDDIN, A.H., BHATIA, S.W.; LONG W.S.; LIM S.T.; KUMARI R. Enzyme Microb

Technol., v.39, p.924–929. 2006.

OSÓRIO, N.M., FERREIRA-DIAS, S., GUSMÃO, J.H. e FONSECA, M.M.R., Response surface modelling of

the production of v-3 polyunsaturated fatty acidsenriched fats by a commercial immobilized lipase, Journal of

Molecular Catalysis B: Enzymatic, v.11, p.677–686, 2001.

OSTREICHER, E.G., PINTO, G.F. e ANTUNES, O.A.C. 2001. Cadernos didáticos de pós graduação. Catálise

Assimétrica. Editor Angelo C. Pinto. Setor Científico Cultural Intituto de Química-UFRJ. v. 2, 1-114p.

OTERO C., BALLESTERO, A., GUISAN, J. M., Immobilization/stabilization of lipase from Candida rugosa,

Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 19, p. 163-175, 1991.

OTTEN, L.G., HOLLMANN, F. e ARENDS, I. W.C.E.; Enzyme engineering for enantioselectivity: from trial-

and-error to rational design? Trends in Biotechnology, v.28, n.1, p. 46-54, 2009.

OZAKI, S.; WATANABE, Y.; OGASAWARA, T.; KONDO, Y.; SHIOTANI, N.; NISHII, H.;

MATSUKI, T. Tetrahedron Letters, v. 27, p. 3157-3160, 1986.

OZAKI, S.; KONDO, Y.; NAKAHIRA, H.; YAMAOKA, S.; WATANABE, Y. Tetrahedron Letters, v. 28, p.

4691-4694, 1987.

OZYILMAZ, G., The effect of spacer arm on hydrolytic and synthetic activity of Candida rugosa lipase

immobilized on silica gel, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 56, p. 231–236, 2009.

PAIVA, A. L., BALCÃO, V. M., MALCATA, F. X., Kinetics and mechanics of reactions catalyzed by

immobilized lipases, Enzyme and Microbial Technology, v. 27, p. 187-204, 2000.

PALOCCI, C., FIORILLO, F. e MONACHE, D. Lipolytic isoenzymes from Euphorbia latex. Plant Sci., v. 165,

p. 577– 582, 2003.

PALOMO, J. M.; FERNÁNDEZ- LORENTE, G.; MATEO, C.; FERNÁNDEZ -LAFUENTE, R. e GUISAN, J.

M. Tetrahedron: Asymmetry, v. 13, n.21, p.2375–2381, 2002a.

PALOMO, J. M., MUNOZ, G., FERNANDEZ-LORENTE, G., MATEO, C., FERNANDEZ-LAFUENTE, R.,

GUISAN, J.M., Interfacial adsorption of lipases on very hydrophobic support (octadecyl-Sepabeads):

158


immobilization, hyper activation and stabilization of the open form of lipases, Journal of Molecular Catalysis B:

enzymatic, v. 19, p. 279-286, 2002b.

PALOMO, J. M.; FUENTES M.; FERNANDEZ-LORENTE, G.; MATEO, C, GUISAN, J.M.; FERNANDEZ-

LAFUENTE, R. General trend of lipase to auto-assemble giving bi-molecular aggregates greatly modifies the

enzyme functionality. Biomacromolecules 2003;4:1–6.

PALOMO, J. M., SEGURA, R. L., FERNANDEZ-LORENTE, G., PERNA, M., RUA, M. L., GUISAN, J.M,

FERNANDEZ-LAFUENTE, R., Purification, immobilization and stabilization of a lipase from Bacillus

thermocatenulatus by adsorption on hydrofobic supports, Biotechnology Program, v. 20, p. 630-635, 2004.

PALOMO, J. M., SEGURA, R. L., MATEO, C., TERRENI, M., FERNANDEZ-LAFUENTE, R., GUISAN,

J.M., Synthesis of enantiomerically pure glycidol via a fully enantioselective lipase-catalyzed resolution,

Tetrahedron: Asymmetry, v. 16, p. 869–874, 2005a.

PALOMO, J. M.; ORTIZ C.; FERNANDEZ-LORENTE, G.; FUENTES M.; GUISAN, J.M.; FERNANDEZ-

LAFUENTE, R. Lipase–lipase interactions as a new tool to immobilize and modulate the lipase properties.

Enzyme Microb. Technol., 2005b, 36, 447–454. Doi: 10.1016/j.enzmictec.2004.09.013

PALOMO, J. M., SEGURA, R. L., FERNANDEZ-LORENTE, G., FERNANDEZ-LAFUENTE, R., GUISAN,

J.M., Glutaraldehyde modification of lipases adsorbed on aminated supports: A simple way to improve their

behaviour as enantioselective biocatalyst, Enzyme and Microbial Technology, v. 40, n. 4, p. 704-707, 2007.

PANDEY, A., BENJAMIN, S., SOCCOL, C.R., NIGAM, P., KRIEGER, N., SOCCOL, V. T., The realm of

microbial lipases in biotechnology, Applied Biotechnology Biochemistry, v. 29, p. 119-131, 1999.

PANDEY, A.; BENJAMIN, S.; SOCCOL, C.R. Biotechnol. Appl. Biochem., v.29, p.119-131, 1999.

PANZAVOLTA, F., SORO, S., D’AMATO, R., PALOCCI, C., CERNIA, E., RUSSO, M. V., Acetylenic

polymers as new immobilization matrices for lipolytic enzymes, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v.

32, p. 67–76, 2005.

PARAVIDINO, M. e HANEFELD, U. Enzymatic acylation: assessing the greenness of diferente acyl donors,

Green Chem., v.13, p.2651-2657, 2011.

PARK, H.J., JOO, J.C., PARK, K., KIMD, Y.H., YOO, Y.J., Prediction of the solvent affecting site and the

computational design of stable Candida antarctica lipase B in a hydrophilic organic solvent, Journal of

Biotechnology, v. 163, p.346–352, 2013.

PARKER, W.L.; HANSON, R.L.; GOLDBERG, S.L.; TULLY, T.P. e GOSWAMI, A. Preparation of (S)-1-

Cyclopropyl-2-methoxyethanamine by a Chemoenzymatic route using leucine dehydrogenase. Org. Process Res.

Dev. v. 16, p. 464−469, 2012.

PAULA A.V., URIOSTE D., SANTOS J.C., de CASTRO H.F., J. Chem. Technol. Biotechnol. 82 (2007) 281–

288.

PENCREACH, G. e BARATTI, J. C. Activity of Pseudomonas cepacia lipase in organic media is greatly

enhanced after immobilization on a polypropylene support. Applied Microbiology and Biotechnology, v.47, p.

630-635, 1997.

PELLISSIER, H., Dynamic kinetic resolution, Tetrahedron, v.59, p.8291-8327, 2003.

PETERSEN, M.T..N.; FOJAN, P.; PETERSEN, S.B., How do lipases and esterases work: the electrostatic

contribution. Journal of Biotechnology v. 85, p. 115–147, 2001.

PETKAR, M., LALI, A., CAIMI, P., DAMINATI, M., Immobilization of lipases for non-aqueous synthesis,

Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 39, p. 83–90, 2006.

PINTO, J.C.; LOPEZ, G.E.; NIEMEYER, M.A.L.; SILVA, F.M.; NELE, M.; MELO, P.A.; Process for the

Synthesis of Poly(Vinyl Alcohol) and/or Poly(Vinyl Acetate) With Spherical Morphology ans Shell and Nucleus

Structure and Its Use in Vascular Embolization, Pedido de patente internacional PCT/WO2006/050591 A2,

2006.

POTTER, B.V.L e LAMPE, D. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. v.34, p.1993-1972, 1995.

POUDEROYEN, G.V., THORSTEN, E., JAEGER, K.E. e DIJKSTRA, B.W. The Crystal Structure of Bacillus

subtilis Lipase: A Minimal a/b Hydrolase Fold Enzyme‖, J. Mol. Biol., v. 309, p. 215-226, 2001.

PRIEGO, J., ORTÍZ-NAVA, C.; CARRILLO-MORALES, M.; LÓPEZ-MUNGUÍA, A.; ESCALANTE, J.;

CASTILLO, E. Tetrahedron v.65, p.536-539, 2009.

http://dx.doi.org/10.1016/j.enzmictec.2004.09.013

159


PUSCH, J.; VAN HERK, A. M. Macromolecules, v.38, p.909-6914, 2005.

QUARTEY, E.G.K., HUSTAD, J.A., FABER, K. e ANTHONSEN, T., Selectivity enhancement of PPL-

catalysed resolution by enzyme-fractionation and mediumengineering: Synthesis of both enantiomers of

tetrahydropyran-2-methanol. Enzyme.Microb. Technol., v.19, p. 361–366, 1996.

QUYEN, D.T.; SCHMIDT-DANNERT, C.; SCHMID, R.D. Protein Expr. Purification., v. 28, p. 102-110, 2003.

RANSAC, S., CARRIÉRE, F., ROGALSKA, E., VERGER, R., MARGUET, F., BUONO, G., MELO, E. P.,

CABRAL, J. M. S., EGLOFF, M. P. E., van TILBEURGH, H., CAMBILLAU, C., The kinetics specificities and

structural features of lipases, In: Molecular Dynamics of Biomembranes (de Kamp, J. A. F.; Ed.), Berlin:

Springer. v. 96, p. 254-304. 1996.

RAO, N.N., LÜTZ, S., WÜRGES, K., MINÖR, D., Organic Process Research & Development, v.13, p. 607,

2009.

RATHI, P., SAPNA, B., SEXENA, R., GUPTA, R. Biotechnology Letters, v. 22, p. 495– 498, 2000.

REETZ, M. T.; Current Opin. Chem. Biol., v. 6, p. 145-150, 2002.

REETZ, M.T. et al. Learning from directed evolution: further lessons from theoretical investigations into

cooperative mutations in lipase enantioselectivity. ChemBioChem., v. 8, p.106–112, 2007.

RIBEIRO B.D., de CASTRO A.M., COELHO M.A.Z., FREIRE D.M.G. Production and use of lipases in

bioenergy: a review from the feedstocks to biodiesel production. Enzyme Res 2011, doi:10.4061/2011/615803

ROBERTS S.M., TURNER N.J., WILLETTS A.J., TURNER M.K., Introduction to biocatalysis using enzymes

and microorganisms. 1st ed. Cambridge: Cambridge University Press; 1995.

RODRIGUES, M. I. e IEMMA, A. F. Planejamento de Experimentos e Otimização de Processos. Editora Casa

do Pão, Campinas. 2005, 325p.

RODRIGUEZ, R.C., FERNANDEZ-LAFUENTE, R., Lipase from Rhizomucor miehei as an industrial

biocatalyst in chemical process., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 64, p.1–22, 2010.

RODRIGUES R.C., BERENGUER-MURCIA Á., FERNÁNDEZ-LAFUENTE R., Adv. Synth.Catal. 353 (2011)

2885–2904.

ROMERO, M.D., CALVO, L., ALBA, C., HABULIN, M., PRIMOZIC, M. e KENS, Z. Enzymatic synthesis

115 of isoamyl acetate with immobilized Candida antarctica lipase in supercritical carbon dioxide.

J.Supercritical Fluids., v. 33, p. 77-84, 2005.

ROTTICCI-MULDER, J.C. GUSTAVSSON, M. HOLMQUIST, M. HULT, K. MARTINELLE, M. Expression

in Pichia pastoris of Candida antarctica lipase B and lipase B fused to a cellulose-binding domain, Protein

Expr. Purif., v.1, p. 386–392, 2001.

ROUHI, A. M., Chem. Eng. News, v. 81, n.18, p.45. 2003.

ROUSSEL, A., MILED, N., BERTI-DUPUIS, L., RIVIERE, M., SPINELLI, S., BERNA, P., GRUBER, V.,

VERGER, R., CAMBILLAU, C., Crystal structure of the open form of dog gastric lipase in complex with a

phosphonate inhibitor, Journal of Biological Chemistry, v. 277, p. 2266–2274, 2002.

RÚA, M.L., DIAZMAURINO, T., FERNANDEZ, V.M., OTERO, C. e BALLESTEROS, A.

Purification na characterization of 2 distinct lipases from Candida cylindracea. Biochimica and Biophysica Acta,

v. 1156, p. 181-189, 1993.

RUFINO A.R., BIAGGIO F.C., SANTOS J.C., de CASTRO H.F., Int. J. Biol. Macromol. 47 (2010) 5–9.

RUIZ, C., BLANCO, A., PASTOR, J., DIAZ, P. FEMS Microbiology Letters, v. 217, p. 263-

267, 2002.

SABBANI, S., HEDENSTRÖM, H., NORDIN, O., The enantioselectivity of Candida rugosa lipase is

influenced by the particle size of the immobilising support material Accurel, Journal of Molecular Catalysis B:

Enzymatic, v. 42, p. 1-9, 2006.

SABUQUILLO, P., REINA, J., FERNANDEZ-LORENTE, G., GUISAN, J. M., FERNANDEZ-LAFUENTE,

R. Interfacial affinity chromatography’ of lipases: separation of different fractions by selective adsorption on

supports actived with hydrophobic groups, Biochimica et Biophysica Acta, v. 1388, p. 337-348, 1998.

160


SAKURAI, T., MARGOLIN, A. L., RUSSEL, A. J. e KLIBANOV, A. M. Control of enzyme enatioselectivity

by the reaction medium. J. Am. Chem. Soc., 110, 7236-7237, 1988.

SARDA, L., DESNUELE, P., Action de la lipase pancréatique sur les esters en émulsion, Biochimica et

Biophysica Acta, v. 58, p. 513-521, 1958.

SARDONINI, C.A., and DIBIASIO, D. (1992) An investigation of the diffusion-limited growth of animal cells

around single hollow fibers. Biotechnol. Bioeng. 40, 1233_1242.

SARIC, M.,VAN DER WIELEN, L.A.M.; STRAATHOF, A.J.J., Theoretical performance of countercurrent

reactors for production of enantiopure compounds, Chemical Engineering Science, v. 66, n.3, p. 510–518, 2011.

SAXENA, R. K., GHOSH, P. K., GUPTA, R., Microbial lipases: Potential biocatalysts for the future industry,

Current Science, v. 77, p. 101-115, 1999.

SCHRAG, J. D.; LI, Y.; WU, S.; CYGLER, M. Ser-His-Glul triad form the catalytic site of the lipase from the

catalytic site of the lipase from Geotrichum candidum. Nature, v.351, p.761-764, 1991.

SCHNELL, B., FABER, K., KROUTIL, W., Enzymatic racemization and its application to synthetic

biotransformations, Adv. Synth. Catal. v.345, p.653-666, 2003.

SCHUDOK, M., KRETZSCHMAR, G. 1997. Enzyme catalyzed resolution of alcohols using ethoxyvinyl

acetate, Tetrahedron Lett. v.38, p.387-388.

SCHULZE, B. e WUBBOLTS. M.G., Biocatalysis for industrial production of fine chemicals, Current Opinion

in Biotechnology, v.10, n.6, p.609-615, 1999.

SECUNDO, F.; CARREA, G.; TARABIONO, C.; GATTI-LAFRANCONI, P.; BROCCA, S.; LOTTI, M.;

JAEGER, K. E.; PULS, M.; EGGERT, T. The lid is a structural and funcional determinant of lipase activity and

selectivity. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, Amsterdam, v. 39, p. 166-170, 2006.

SHAH, R.D. e MARYANOFF, C.A. Reversed phase HPLC in: Swadesh J. K..(eds). HPLC Practical and

Industrial Applications. 2nd

edition.142-189p.ch4.2001.

SHARMA, R., CHISTI, Y. e BANERJEE, U.C., Research review paper production, purification,

characterization, and applications of lipases, Biotechnology Advances, v.19, p.627–662, 2001.

SHELDON, R.A. Chirotechnology. Marcel Dekker Inc., New York. 1993.

SHELDON, R.A. Characteristic features and biotechnological applications of cross-linked enzyme aggregates

(CLEAs), Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 92, 467–477. DOI:10.1007/s00253-011-3554-2.

SHEN, L., WANG, F., MUN, H., SUH, M. e JEONG, J. Solvent-dependent reactivity in porcine pancreatic

lipase (PPL)-catalyzed hydrolysis. Tetrahedron: Asymmetry, v. 19, p. 1647–1653, 2008.

SHIBATANI, T.; OMORI, K.; AKATSUKA, H.; KAWAI, E. e MATSUMAE, H., J. Mol. Catal. B. Enzym.

v.10, p.141–149, 2000.

SHIMADA, Y., WATANABE, H., SUGIHARA, A. e TOMINAGA, Y., Enzymatic alcoholysis for biodiesel

fuel production and application of the reaction to oil processing. J.Mol. Catal. B: Enzym. v. 17, p. 133–142,

2002.

SHIMOHAMA, S.; TANINO, H.; SUMIDA, Y.; TSUDA, J.; FUJIMOTO, S.; Neuroscience Lett., v.245, p.159,

1998.

SIDDIQUI, K.S. e CAVICCHIOLI, R. Extremophiles, v.9, p.471-476, 2005.

SIH, C.J., GIRDAUKAS, G., FUJIMOTO, Y. e CHEN, C.S. Quantitative analyses of biochemical Kinetic

resolutions of enantiomers. J. Am. Chem. Soc. v. 104, p. 7294, 1982.

SIH, C.J. e WU, S.H. Resolution of enatiomers via biocatalysis. Topics Sterochem., v.19, p. 63-125, 1989a.

SIH, C.J. e CHEN, C.S. Aspects and optimization of enantioselective biocatalysis in organic solvents: the use of

lipases. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., v. 28, p. 695-707, 1989b.

SILVA, M.A.M., MEDEIROS, V.C., LANGONE, PEREIRA, M.A. e FREIRE, D.M.G. Synthesis of

Monocaprin Catalyzed by Lipase. Applied Biochemistry and Biotechnology. v.105, p.757 – 767, 2003.

SILVA A.A.T., Dissertação de MSc., NPPN/Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil,

2009.

161


SILVA, J. do N.; GUTARRA, M.L.E.; FREIRE, D.M.G.; CAMAROTA, M.C. Application of Home-Made

Enzyme and Biosurfactant in the Anaerobic Treatment of Effluent with High Fat Content. J. Bioprocess Biotech

3, 139, 2013.

SIMAS, A.B.C.; PAIS, K.C.; DA SILVA, A.A.T. J. Org. Chem., v.68, p.5426-5428, 2003.

SIMAS, A.B.C.; DA SILVA, A.A.T.; DOS SANTOS FILHO, T.J., BARROSO, P.T.W. Tetrahedron Letters,

v.50, p.2744-2746, 2009.

SIMAS, A.B.C.; DA SILVA, A.A.T.; CUNHA, A.G., ASSUMPÇÃO, R.S., HOELZ, L.V.B., NEVES, B.C.,

GALVÃO, T.C., ALMEIDA, R.V., ALBUQUERQUE, M.G., FREIRE, D.M.G. e ALENCASTRO, R.B.,

Kinetic resolution of (±)-1,2-O-isopropylidene-3,6-di-O-benzyl-myo-inositol by lipases: An experimental and

theoretical study on the reaction of a key precursor of chiral inositols, Journal of Molecular Catalysis B:

Enzymatic., v. 70, p. 32–40, 2011.

SIMONS.; OßWALD S.; ROOS J. e GRÖGER H., Z. Naturforsch. B, 2012, 67, 1123–1126.

SIMONS, J.W.F.A.; GÖTZ, F.; EGMOND, M.R.; VERHEIJ, H.M. Chem. Phys of Lipids, v. 93, p. 27-37, 1998.

SNELLMAN E.A., SULLIVAN E.R., COLWELL R.R., Purification and properties of the extracellular lipase,

LipA, of Acinetobacter sp. RAG-1. FEBS J; v. 269, p.5771–9. 2002.

SKORIDOU, V., CHRYSINA, E., STAMATIS, H., OIKONOMAKOS, N. e KOLISIS, F. Kinetic and

modelling studies on the lipase catalysed enantioselective esterification of (±)- perillyl alcohol. Journal of

Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 29, p. 9-12, 2004.

SKJOT, M.; DE MARIA, L.; CHATTERJEE, R.; SVENDSEN A.; PATKAR, S.A. et al. Undestanding the

plasticity of the α/β hydrolase fold: lid swapping on the Candida Antarctica lipase B results in Chimeras with

interesting biocatalytic Properties. ChemBioChem, 10:520-527, 2009.

SOARES, M.F. FORESTI M.L., FERREIRA M.L; Colloid Surface A 294 (2007) 147–155.

SOLÁ, R., RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ, J., GRIEBENOW, K. Modulation of protein biophysical properties by

chemical glycosylation: biochemical insights and biomedical implications, Cell. Mol. Life Sci., v.64, p. 2133–

2152, 2007.

SOLANO, D.M.; HOYOS, P.; HERNAIZ, M.J.; ALCANTARA, A.R. e SANCHEZ-MONTERO, J.M.,

Industrial biotransformations in the synthesis of building blocks leading to enantiopure drugs Bioresource

Technology v. 115, p.196–207, 2012.

SOUSA, J. S.; CAVALCANTI E.D.C. ; ARANDA D.A.G. ; FREIRE D.M.G. . Application of Vegetable Lipase

from Physic nut (Jatropha curcas Lin.) in a New Hybrid Process (Enzymatic/Quemical) of Hidresterification ion

Biofuel Production. In: 9th International Symposium on Biocatalysis, 2009, Berne, CH. Book of Abstracts

BIOTRANS 2009, 2009. p. 73-73.

SOUSA, J. S., CAVALCANTI E.D.C., ARANDA D.A.G., FREIRE D.M.G., Application of lipase from the

physic nut (Jatropha curcas L.) to a new hybrid (enzyme/chemical) hydroesterification process for biodiesel

production. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v.65, p.133–137, 2010.

SOUMANOU M.M.; PÉRIGNON M.; VILLENEUVE P.; Eur. Lipid J. Technol. Sci. 115 (2013) 270–285.

SOUZA R. L., RESENDE W. C., BARAO C. E., ZANIN G. M., de CASTRO H. F., SANTOS O. A. A.,

FRICKS A. T., FIGUEIREDO R. T., CLEIDE A. S. L., Influence of the use of Aliquat 336 in the

immobilization procedure in sol–gel of lipase from Bacillus sp. ITP-001, J. Mol. Catal. B: Enzym., 2012, 84,

152– 159. doi: 10.1016/j.molcatb.2012.05.013

SQUIRE, T.L.; LOWE, M.E.; BAUER, V.W. e ANDREWS, M.T. Pancreatic triacylglycerol lipase in a

hibernating mamal. II Cold adapted function and differential expression. Physiological Genomics., v.16, p. 131-

140, 2003.

STAEBLER A, CRUZ A, VAN DER GOOT W, PINHEIRO HM, CABRAL JMS, FERNANDES P.

Optimization of androstenedione production in an organic–aqueous two-liquid phase system. J. Mol. Catal. B.

Enzym., v. 29, p.19–23, 2004.

STAUBMANN, R..; NCUBE, I; GUBITZ, G.M.; STEINER, W.; READ, J.S. Esterase and lipase activity in

Jatropha curcas L. Seeds. Journal of Biotechnology, 75 (1999), 117-126.

STECHER, H., FABER, K., Biocatalytic deracemization techniques: Dynamic Resolutions and Stereoinversions,

Synthesis v.1, p. 1-16, 1997.



162


STEINER, J.M. e WILLIAMS, D.A. Purification of classical pancreatic lipase from dog pancreas. Biochimie., v.

84, p. 1245-1253, 2002.

STEINER, J.M., WILSON, B.G. e WILLIAMS, D.A. Purification and partial characterization of feline classical

pancreatic lipase. Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology, v.134, p.

151-159, 2003.

STEPANOV, A., SHVETS, V. Chemistry and Physics of Lipids, v. 25, p. 247-263, 1979.

STRAATHOF, A.J.J.; PANKE, S. e SCHMID, A., The production of fine chemicals by biotransformations,

Current Opinion in Biotechnology, v. 13, p.548–556, 2002.

STRAATHOF, A.J.J. e ADLERCREUTZ, P. (Eds.) Taylor & Francis e-Library. Netherlands. Amsterdam.,

2005, 545p.

STRAATHOF, A.J.J., JONGEJAN, J.A., Enzyme and Microbial Technology, v. 21, p. 559-571, 1997.

SUGIHARA, A.; UESHIMA, M.; SHIMADA, Y.; TSUNASAWA, S; TOMINAGA, Y. Journal of

Biochemistry, v. 112, p. 598 – 603, 1992.

SURESHAN, K.M. MYSORE S. SHASHIDHAR, M.S., PRAVEEN, T. e DAS, T., Regioselective Protection

and Deprotection of Inositol Hydroxyl. Chem. Rev., v. 103, p.4477-4503, 2003a.

SURESHA K.M.; YAMASAKI, T.; HAYASHI, M.; WATANABE, Y. A simple and practical resolution of

1,2:4,5-di-O-isopropylidene-myo-inositol, Tetrahedron: Asymmm., v.14, n.13, p.1771-1774, 2003b.

SURESHKUMAR, M., LEE, C.-K. Biocatalytic reactions in hydrophobic ionic liquids. Journal of Molecular

Catalysis B: Enzymatic, v. 60, p. 1–12, 2009.

SVENDSEN, A., Biochimica et Biophysica Acta, v. 1543, p. 223-238, 2000.

SVENSSON, I., WEHTJE, E., ADLERCREUTZ, P. e MATTIASSON, B. Effects of water activity on reaction

rates and equilibrium positions in enzymatic esterifications. Biotechnology and Bioengineering, v. 44, n.5, p.

549-556, 2004.

SWEERS, H. M., WONG, C.-H. Enzyme-catalyzed regioselective deacylation of protected sugars in

carbohydrate synthesis, J. Am. Chem. Soc., v.108, p.6421-6422, 1986.

TAMBORINI, L., ROMANO, D., PINTO, A., BERTOLANI, A. MOLINARI, F. e CONTI, P. An efficient

method for the lipase-catalysed resolution and in-line purification of racemic flurbiprofen in a continuous-flow

reactor. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v.84, p.78– 82, 2012.

TAN T.; LU J.; NIE K.; DENG L.; WANG F.; Biotechnol. Adv. 28 (2010) 628–634.

TAO, J., KAZLAUKAS, R.J., 2011. Biocatalysis For Green Chemistry and Chemical Process Development.

John Wiley & Sons Ltd., Hoboken, New Jersey.

TAO. J. e XU, J.H. Enzymes and their synthetic applications: an overview-1-19p. In: Tao, J.; Lin, G.Q.; Liese A.

Biocatalysis for the pharmaceutical industry: Discovery, Development, and Manufacturing. John Wiley & Sons

(Asia) Pte Ltd. Singapura. 2009, 324p.

TARDIOLI, P.W; VIEIRA, M.F.; VIEIRA, A.M.S.; ZANIN, G.M.; BETANCOR, L., MATEO, C.;

FERNANDEZ-LORENTE, G.; GUISÁN, J.M. Immobilization-stabilization of glucoamylase: Chemical

modification of the enzyme followed by covalent attachment on highly activated glyoxyl-agarose support,

Process Biochemisry, v. 46, p.409-412, 2011.

TAWAKI, S. e KLIBANOV, A. M. Inversion of enzyme enantioselectivity mediated by the solvent. J. Am.

Chem. Soc., v. 114, p. 1882-1884, 1992.

TERAO, Y., MURATA, M., ACHIWA, K. Highly-efficient lipase-catalyzed asymmetric synthesis of chiral

glycerol derivatives leading to practical synthesis of (S)-propranolol, Tetrahedron Lett. v.29, p.5173-5176, 1988.

TISCHER, W., KASCHE, V., "Immobilized enzymes: crystal or carriers?", Trends in Biotechnology, v. 17, p.

326-335, 1999.

TONGBORIBOON, K., CHEIRSILP, B., KITTIKUN, A. H., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,

v.67, p. 52, 2010.

TORRES, R., ORTIZ, C. PESSELA, B.C.C., PALOMO, J.M., MATEO, C., GUISAN, J. M., FERNANDEZ-

LAFUENTE R., ―Improvement of the enentioselectivity of lipase (fraction B) from Candida antarctica via



163


adsorption on polyethynimine-agarose under different experimental conditions‖, Enzyme and Microbial

Tecnology, 39, pp. 167-171, 2006.

TOSA T., MORI T., FUSE N. CHIBATA I. Enzymologia, 1966, 31, 214–224.

TREVISAN, E.; LEAL NETO, M.; MORO, P.; HOSHINO, S.O.; ARROYO, P.A. Avaliação dos solventes

hexano e clorofórmio em reações de transesterificação in situ de Chlorella vulgaris. VIII Encontro Internacional

de Produção Científica, 1-4p., 22-25/ out, 2013.

TRUBIANO, G. D., BORIO, e FERREIRA, M.L. Ethyl Oleate Synthesis Using Candida rugosa Lipase in a

Solvent-Free System. Role of Hydrophobic Interactions Biomacromolecules, v. 5, p. 1832-1840, 2004.

TUFVESSON, P., Fu, W., JENSEN, J.S., WOODLEY, J.M., Process considerations for the scale-up and

implementation of biocatalysis, Food Bioprod. Process, v.88, n. 1, p.3–11, 2010.

TURNER, N.J. Controlling chirality. Cur Opin Biotechnol, v.14, p.401–406, 2003.

UNDURRAGA, D., MARKOVITS, A. e ERAZO, S., Cocoa butter equivalente through enzymic

interesterification of palm oil midfraction, Proc. Biochem., v.36, p.933–939, 2001.

UPPENBERG, J., HANSEN, M.T., PATKAR, S., JONES, T.A., The sequence, crystal sctruture determination

and refinement of two crystal form of lipase B from Candida Antarctica. Structure, v. 2, p. 293–308, 1994.

Crystallographic and molecular-modeling studies of lipase B from Candida Antarctica reveal a stereospecificity

pocket for secondary alcohols. Biochemistry 34, 16838-16851, 1995.

UPPENBERG, J.; OEHRNER, N.; NORIN, M.; HULT, K.; KLEYWEGT, G.J.; et al.

VAGANAY, S., JOLIFF, G., BERTAUX, O., TOSELLI, E., DEVIGNES, M.D. e BÉNICOURT, C. The

complete cDNA sequence encoding dog gastric lipase, v. 8, n.4, p.257-262, 1998.

VAIDYA, B.K., INGAVLE, G.C., PONRATHNA, S., KULKARNI, B.D., NENE, S.N., Bioresourch

Technology, v.99, p. 3623-3629, 2008.

VALIVETY, R. H., HALLING, P. J. e MACRAE, A. R. Reaction rate with lipase catalyst shows similar

dependence on water activity in different organic solvents, Biochim. Biophys. Acta, v.1118, p. 218–222, 1992a.

VALIVETY, R. H., HALLING, P. J., PEILOW, A. D. e MACRAE, A. R. Lipases from different sources vary

widely in dependence of catalytic activity on water activity, Biochim. Biophys. Acta 1122, p. 143–146, 1992b.

VALIVETY, R. H., HALLING, P. J. e MACRAE, A. R. Rhizomucor miehei lipase remains highly active at

water activity below 0. 0001, FEBS Lett. v.301, p. 258–260, 1992c.

VERGER, R. Interfacial activation of lipases: facts and artifacts. Trens Biotechnol., v. 15, 32-38, 1997.

VILLENEUVE, P., MUDERHWA, J.M., GRAILLE, J., HAAS, M.J., Customizing lipases for biocatalysis: a

survey of chemical, physical and molecular biological approches, J. Mol. Cat. B: enzym., v. 9, p. 113-148, 2000.

WAKABAYASHI, H., WAKABAYASHI, M., EISENREICH,W. e ENGEL, K.H. Stereoselectivity of the

Generation of 3-Mercaptohexanal and 3-Mercaptohexanol by Lipase- Catalyzed Hydrolysis of 3-

Acetylthioesters J. Agric. Food Chem., v. 51, n.15, p 4349–4355, 2003.

WANDREY, C., LIESE, A., KIHUMBU, D., Organic Process Research & Development, v. 4, p.286, 2000.

WANG, Y. F., LALONDE, J. J., MOMONGAN, M., BERGBREITER, D. E., WONG, C.-H. Lipasecatalyzed

irreversible transesterifications using enol esters as acylating reagents: preparative enantio- and regioselective

syntheses of alcohols glycerol derivatives sugars and organometallics, J. Am. Chem. Soc. v.110, p.7200-7205,

1988.

WANG, Y. F., WONG, C. H. Lipase -catalyzed irreversible transesterification for preparative synthesis of chiral

glycerol derivatives, J. Org. Chem. v.53, p.3127-3129, 1988.

WANG, Y.F., LALONDE, J.J., MOMONGAN, M., BERGBREITER, D.E., WONG, C.H., Lipase catalyzed

irreversible transesterifications using enol esters as acylating reagents: preparative enantio- and regioselective

syntheses of alcohols, glycerol derivatives, sugars, and organometallics, Journal American Chemical Society, v.

110, p. 7200–7205, 1988.

WANG X., ZHOU G., ZHANG H., DU S., XU Y., WANG C., J. Non-Cryst. Solids 357 (2011) 3027–3032.

WARD, R. S., Dynamic kinetic resolution. Tetrahedron: Asymmetry, v. 6, p. 1475-1490, 1995.

WASSERSCEID, P., WELTON, T. (Eds.), Ionic Liquids in Synthesis, Wiley-VCH, 2003.

164


WATSON. W.J.W., How do the fine chemical, pharmaceutical, and related industries approach green chemistry

and sustainability? Green Chem. v. 14, p.251, 2012.

WEBER, H. K., STECHER, H., FABER, K. Sensitivity of microbial lipases to acetaldehyde formed by acyl-

transfer reactions from vinyl esters, Biotechnol. Lett. v.17, p.803-808, 1995a.

WEBER, H. K., STECHER, H. e FABER, K., Some properties of commercially available crude lipase

preparations, In: Preparative Biotransformations (Roberts, S. M.; Eds.), New York: Wiley. 1995b.

WEHTJE, E., COSTES, D. e ADLERCREUTZ, P. Enantioselectivity of lipases: effects of water activity.

Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 3, p. 22 l-230, 1997.

WEWERS, W.; GILLANDT, H.; TRAUB, H. Tetrahedron: Asymmetry, v. 16, p. 1723-1728,2005.

WHITESELL, J. K.; REYNOLDS, D. The Journal Organic Chemistry, v. 48, p. 3548-3551, 1983.

WILKINSON B. e BACHMANN, B.O. Biocatalysis in pharmaceutical preparation and alteration. Curr Opin

Chem Biol v. 10, p. 169-176, 2006.

WILSON, L., PALOMO, J. M., FERNÁNDEZ-LORENTE, G., ILLANES, A., GUISÁN, J. M., FERNÁNDEZ-

LAFUENTE R., ―Improvement of the properties of a thermostable lipase from Alcaligenes sp. via strong

adsorption on hydrophobic supports‖, Enzyme and Microbial Tecnology, v. 38, p. 975-980, 2006.

WOOTEN, M. W.; WRENN, R. W.; FEBS Lett., v. 171, p.183, 1984.

XIE, X. and TANG, Y., Efficient synthesis of simvastatin by use of whole-cell biocatalysis. Appl. Environ.

Microbiol., v.73, p.2054–2060, 2007.

XU Y.Q., ZHOU G.W,. WU C.C,. LI T.D, SONG H.B., Solid State Sci. 13 (2011) 867–874.

YADAV, G. D. e SIVAKUMAR, P. Biochemical Engineering Journal, v. 19, p.101-107, 2004.

YANG, RUSSEL, Fundamentals of non-aqueous enzymology, Enzymatic reactions in organic media, Eds:

Koskinen e Klibanov, Ed.Blackie academic & professional, Great Britain, 1996.

YAO, C. e KOËLLER, W. Diversity of cutinases from plant pathogenic fungi: Cloning and sequence analysis of

a cutinase gene from Alternaria brassicicola. Physiol. Mol. Plant Pathol. v. 44, p. 81-92, 1994.

YAQOOB, M., NABI, A. e MASSOM-YASINZAI, M. Bovine pancreatic lipase: Purification and applications

in immobilized form for transesterification reactions. J. Chem. Society of Pakistan., v.21, p. 114-119, 1999.

YENIAD B., NAIK H., HEISE A., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 125 (2011) 69–95.

ZAKS, A. e KLIBANOV, A.M. Enzymic catalysis in non-aqueous solvents. Journal of Biological Chemistry, v.

263, p. 3194-3201, 1988.

ZAKS, A. ―New enzymatic properties in organic media‖ In: Enzymatic reactions in organic media, Eds:

Koskinen e Klibanov, Ed.Blackie academic & professional, Great Britain, 1996.

ZHANG LQ, ZHANG YD, XU L, LI XL, YANG XC, XU GL, WU XX, GAO HY, DU WB, ZHANG XT,

ZHANG XZ. Lipasecatalyzed synthesis of RGD diamide in aqueous water-miscible organic solvents. Enzyme

Microb Technol. 2001;29:129–35.

ZHANG, J., HOU, Z., YAO, C. e YU, Y. Purification and properties of a lipase from a Bacillus strain for

catalytic resolution of (R)-Naproxen. J. Mol. Catalalysis B: Enzymatic., v.18, p. 205-214, 2002.

ZHANG D. H., YUWEN L. X., Li C., Li Y. Q., Effect of poly (vinyl acetate–acrylamide) microspheres

properties and steric hindrance on the immobilization of Candida rugosa lipase, Bioresour. Technol., 2012, 124,

233-236. doi:10.1016/j.biortech.2012.08.083.

ZHAO, H., BAKER, G.A., SONG, Z., OLUBAJO, O., ZANDERS, L., CAMPBELL, S.M., Journal of

Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 57, p.149, 2009.

ZHAO, H., Journal of Chemical Technology & Biotechnology, v. 85, p.891, 2010.

ZHENG, C.Z., WANG, J.L., Li, X., LIU, B.K., WU, Q. e LIN, X.F., Regioselective synthesis of amphiphilic

metoprolol-saccharide conjugates by enzymatic strategy in organic media. v. 46, n. 1, p.123-127, 2011.

ZHENG M. M., LU Y., HUANG F. H., WANG L., GUO P. M., FENG Y. Q. e DENG Q. C., Lipase

Immobilization on Hyper-Cross-Linked Polymer-Coated Silica for Biocatalytic Synthesis of Phytosterol Esters

with Controllable Fatty Acid Composition, J. Agric. Food Chem., 2013, 61, 231−237. doi: 10.1021/jf3042962.

165


ZHOU, R., XU, J.H. Biochemical Engineering Journal, v. 23, p. 11–15, 2005.

ZOU B., HU Y., YU D., XIA J., TANG, S., LIU W., HUANG H., Biochem. Eng. J. 53 (2010) 150–153.

ZWINGENBERGER K.,WENDT S., Immunomodulation by thalidomide: systematic review of literature and of

unpublished observations. J Inflamm, v.46, p.177–211, 1996.

Documents

OBTENÇÃO DE BIOCATALISADOR PARA ESOLUÇÃOtpqb.eq.ufrj.br/download/obtencao-de-biocatalisador-para-resolucao-cinetica-de...Aos meus queridos pais, Jorge e Rosa, por sempre estarem