UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE ENERGIA NUCLEAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS

ENERGÉTICAS E NUCLEARES (PROTEN)

POLPA DE Punica granatum L. COMO RADIOMODIFICADOR EM CAMUNDONGOS SOB

INDUÇÃO TUMORAL

ISVÂNIA MARIA SERAFIM DA SILVA

RECIFE – PERNAMBUCO – BRASIL

2009

POLPA DE Punica granatum L. COMO RADIOMODIFICADOR EM CAMUNDONGOS SOB

INDUÇÃO TUMORAL

ISVÂNIA MARIA SERAFIM DA SILVA

POLPA DE Punica granatum L. COMO RADIOMODIFICADOR EM CAMUNDONGOS SOB

INDUÇÃO TUMORAL

Tese submetida ao Programa de Pós–graduação em Tecnologias Energéticas e Nucleares, do Departamento de Energia Nuclear, da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito para obtenção do título de Doutora em Ciências. Área de Concentração: Aplicação de Radioisótopos.

ORIENTADORA: PROFA. DRA. MARIA TERESA JANSEM DE ALMEIDA CATANHO

RECIFE – PERNAMBUCO – BRASIL

2009

S586p Silva, Isvânia Maria Serafim da

Polpa de Punica granatum L. como radiomodificador em

camundongos sob indução tumoral / Isvânia Maria Serafim da

Silva. - Recife: O Autor, 2009.

xvii, 63 f.; il., gráfs., tabs.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco.

CTG. Programa de Pós-Graduação em Tecnologias

Energéticas e Nucleares (PROTEN), 2009.

Inclui Referências bibliográficas e Apêndices.

1. Energia nuclear. 2. Radioprotetor. 3. Punica

granatum L. 4. Biodistribuição. 5. Tumor. I. Título.

À Graça e a Narayani dedico.

AGRADECIMENTOS

À Deus, que é o alfa e ômega. A minha amiga e companheira Graça Lopes, que acompanhou e incentivou com amor e paciência o meu trabalho, me ajudando em diversas etapas, principalmente quando eu já não acreditava poder transpor determinadas barreiras. A minha filha Narayani que passou privações da minha presença, e ainda com limitações, por estar cursando a alfabetização, sempre que oportunamente acalmava o meu coração, com mensagens como essa: “Mamãe eu nunca vou deixa de ama você”.

A amiga e Profª. Drª. Maria Teresa Jansem de Almeida Catanho, que foi ponto de partida como orientadora no âmbito científico, e que em meio a muitas tribulações me acolheu e me deu suporte, para que eu chegasse até aqui, com paciência, confiança, compreensão, apoio, dedicação e perseverança. Não existem palavras que possam expressar a minha gratidão.

Ao Departamento de Energia Nuclear, por mais uma oportunidade de tê-lo como base para que pudesse subir mais um degrau. Aos professores que contribuíram para o meu desenvolvimento. A todos os funcionários, principalmente a Magalí, Nilvânia, Seu Antônio e Seu Edvaldo que sempre se mostraram prontos a prestar ajuda, e aos alunos com os quais tive a oportunidade de conviver em várias etapas. E de forma especial ao Prof. Colaço, que muito tem apoiado e contribuído para a conclusão deste trabalho.

Ao Departamento de Biofísica e Radiobiologia, pelo suporte estrutural na execução deste trabalho. Aos professores, pelo respeito e compreensão, sobretudo a Profª. Drª. Ana Maria Mendonça, pelo incentivo pessoal e científico, bem como pela oportunidade de ministrar aulas na disciplina de radiobiologia. Aos funcionários pela disponibilidade, principalmente a Elaine, seu Jorge, Valéria, Célida e seu Fredson.

Ao Departamento de Antibióticos, na pessoa da Profª. Ivone Antônia de Souza, que sempre esteve à disposição para cooperar em várias etapas desse trabalho, fornecendo apoio moral na finalização dessa fase.

Ao IRWAM, por meio de Dr. Lauro Lins e Dr. Alberto, pela parceria, abrindo as portas para execução de mais uma etapa deste trabalho, e pela disponibilidade em cooperar para que tudo transcorresse da melhor forma possível.

A Símey Magnata pela amizade e força na construção da minha vida acadêmica, e apoio em vários momentos difíceis. Àquelas pessoas que contribuíram técnica e cientificamente com esse trabalho, como André, Marília e Orion. Agradeço, também, aos amigos anônimos que já me ajudaram e cuja lembrança o tempo levou, muito obrigado! A CAPES, pelo recurso financeiro disponibilizado. E a todos que contribuíram para o bom desenvolvimento deste trabalho.

“A tarefa não é contemplar o que ninguém

ainda contemplou, mas meditar, como

ninguém ainda meditou, sobre o que todo

mundo tem diante dos olhos”.

Shopenhauer

SUMÁRIO

Página

LISTA DE FIGURAS IX

LISTA DE TABELAS XII

LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS XIII

RESUMO XVI

SUMMARY XVII

1 INTRODUÇÃO 1

2 REVISÃO DE LITERATURA 3

2.1 Medicina Nuclear e os radiofármacos. 3

2.2 Influencia de radiomodificadores sobre os radiofármacos. 4

2.3 Radioproteção química 6

2.4 Produtos naturais como radioprotetores 8

2.5 Suplementos alimentares naturais como radioprotetores 10

2.6 Possíveis mecanismos da ação radioprotetora dos produtos naturais 12

2.7 Punica granatum L. (Romã) 16

3 MATERIAL E MÉTODOS 19

3.1 Coleta e identificação do material botânico 19

3.2 Preparação do extrato de Punica granatum L. 19

3.3 Procedimento experimental 20

3.3.1 Implantação da massa tumoral 20

3.3.2 Atividade antitumoral 20

3.3.3 Biodistribuição do pertecnetato de sódio (Na 99m

TcO4) 21

3.3.4 Atividade antiinflamatória 28

3.3.5 Irradiação dos animais 28

3.3.6 Ação radioprotetora do extrato aquoso da polpa da Punica granatum L. (EAPPg) 31

3.4 Análise estatística 33

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 34

4.1 Ação antitumoral 34

4.2 Potencial antiinflamatório 38

4.3 Ação do extrato da polpa de Punica granatum L. na Biodistribuição 41

4.4 Avaliação da capacidade radioprotetora do extrato aquoso da polpa de Punica granatum L. (EAPPg) 46

5 CONCLUSÕES 49

6 PERSPECTIVAS 50

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 51

APÊNDICE 61

ix

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1 – Enzimas e mecanismo antioxidante. (A) SOD e CAT (Catalase) são

dismutases, que catalisam a oxidação e redução de moléculas de substratos

distintos, ambas são altamente específicas para seus substratos, O2• e H2O2,

respectivamente. (B) A GPx reduz H2O2 e peróxidos de lipídeos (LOOH),

utilizando GSH como co-substrato. O GSH é reciclado pela glutationa redutase

(GR) utilizando NADPH a partir da via pentose-fosfato. (C) Estrutura da GSH.

.......................................................................................................................... 14

Figura 2 – Esquema demonstrando alguns dos supostos mecanismos de radioproteção de

plantas e ervas. Dentre estes mecanismos temos o aumento do reparo e redução

do dano no DNA; redução do ciclo celular; captura de radicais livres; redução

dos peróxidos, da proteína quinase C (PKC), e do óxido nítrico; aumento das

enzimas antioxidantes (GSH, GST, CAT e SOD); e aumento da replicação do

RNAm das enzimas GSH e GST.. .................................................................... 15

Figura 3 – Imagens da planta, flor e fruto de Punica granatum L. (Romã) ....................... 17

Figura 4 – (A) Sementes de Punica granatum L.. .............................................................. 19

Figura 5 – Passos para estudo da biodistribuição do Na 99mTcO4 do grupo A (animais sem

tumor) tratados com a Punica granatum L.. ..................................................... 24

Figura 6 – Passos para o estudo da biodistribuição do Na 99mTcO4 do grupo B (animais

com tumor) tratados com a Punica granatum L.. ............................................. 25

Figura 7 – Passos para o estudo da biodistribuição do Na 99mTcO4 do grupo C (animais

com tumor) tratados antes da indução tumoral por um período de 4 dias com a

Punica granatum L., e após a indução e antes da realização da biodistribuição,

receberam salina por 8 dias............................................................................... 26

Figura 8 – Passos para o estudo da biodistribuição do Na 99mTcO4 do grupo D (animais

com tumor) tratados antes da indução tumoral por um período de 4 dias com a

Punica granatum L., e após a indução, antes da realização da biodistribuição,

x

continuaram o tratamento por 8 dias. Os animais controle receberam salina

durante o mesmo período de tempo dos tratados.............................................. 27

Figura 9 – Forma de imobilização dos animais em caixa acrílica. A seta aponta para a

tampa da caixa. ................................................................................................. 29

Figura 10 – Imagens da irradiação dos animais. a) Profuntidade da irradiação determinada

por laser. b) Irradiação superior. c) Irradiação inferior. ................................... 30

Figura 11 – Esquema para lise das hemácias e obtenção do material para análise da GSH.

.......................................................................................................................... 31

Figura 12 - Esquema para determinação da GSH .............................................................. 32

Figura 13 – Ação antitumoral do EAPPg na variação das massas dos tumores no

tratamento após indução tumoral (chamado grupo 1). O grupo EAPPg

apresentou uma redução significativa, quando comparado com o grupo

controle. ............................................................................................................ 35

Figura 14 – Imagens que apresentam tumores dos animais controle (A), e dos animais

tratados com o EAPPg (B) do grupo 1. ............................................................ 35

Figura 15 – Ação antitumoral do EAPPg na variação das massas dos tumores no

tratamento antes e após indução tumoral (grupo 3). O grupo controle (STS) e o

grupo tratado antes da indução tumoral (TTS) não apresentaram alterações

significativas. Já o grupo tratado antes e após a indução tumoral, demonstrou

uma redução significativa, quando comparado com o grupo controle (STS). .. 36

Figura 16 – Atividade antiinflamatória do EAPPg. O EAPPg em todas as concentrações

(50, 100 e 200 mg/kg) apresentou uma similaridade na capacidade

antiinflamatória quando comparado com o do ASS (antiinflamatório), com

redução significativa da porcentagem de inflamação. ..................................... 38

Figura 17 – Curva dose-resposta inflamatória. Relacionando a concentração (mg/kg) com

a porcentagem de inibição do edema de pata causado pela carraginina. .......... 40

Figura 18 – Variação da GSH em hemácias lisadas. O grupo irradiado e não tratado com o

EAPPg (grupo SI) apresenta uma redução significativa da concentração de

GSH em µmol/L de proteínas quando comparado com o grupo controle. Já o

grupo irradiado, mas tratado com o EAPPg (grupo TI) sofreu uma redução

xi

significativa da concentração de GSH em µmol/L de proteínas em relação ao

controle, mas menor do que o grupo SI. ........................................................... 47

Figura 19 – Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo A (Parte 1), onde

EAPPg corresponde aos animais tratados. ....................................................... 61

Figura 20 – Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo A (Parte 2), onde

EAPPg corresponde aos animais tratados. ....................................................... 61

Figura 21 - Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo B, onde EAPPg

corresponde aos animais tratados (Parte 1). ..................................................... 62

Figura 22 - Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo B, onde EAPPg

corresponde aos animais tratados (Parte 2). ..................................................... 62

Figura 23 - Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo C (TAT – tratado antes

do tumor) e D (TADT – tratado antes e depois do tumor) (Parte 1). ............... 63

Figura 24 - Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo C (TAT – tratado antes

do tumor) e D (TADT – tratado antes e depois do tumor) (Parte 2). ............... 63

xii

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1 – Determinação dos grupos de animais utilizados no estudo da biodistribuição do

Na 99mTcO4. ....................................................................................................... 22

Tabela 2 – Biodistribuição nos animais do grupo A. ......................................................... 41

Tabela 3 - Biodistribuição nos animais do grupo B ........................................................... 42

Tabela 4 - Biodistribuição nos animais dos grupos C e D .................................................. 44

xiii

LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

% → Porcento % captação/g → Porcentagem de captação por grama µCi → Microcurie µg/mL → micrograma por mililitro µL → Microlitro µmol/L → micromol por litro 1O2 → Oxigênio singleto 99Mo → Molibidênio-99 99mTc → Tecnécio-99m 99mTc-DMSA → Tecnécio-99m-ácido dimercaptossuccínico 99mTc-DTPA → Tecnécio-99m-ácido diaminopentacético 99mTc-GHA → Tecnécio-99m-glucoheptonato 99mTcO4Na → Pertecnetato de sódio AAS → Ácido acetil salicílico ACTH → Hormônio adenocorticotrópico B → Baço CAT → Catalase CEEA → Comitê de Ética em Experimentação Animal Cer → Cérebro CFU → Unidades formadoras de colônias cGy → Centigray cGy/min → centigray por minuto cm → Centímetro CN → Controle negativo CNEN → Comissão Nacional de Energia Nuclear Cor → Coração COX → Cicloxigenase CP → Controle positivo cpm → Contagens por minuto CTI → Contagem radioativa total injetada DNA → Ácido desoxirribonucléico DTPA → Ácido dietilenotriamina pentacético E → Estômago EAAPg → Extrato aquoso da polpa da Punica granatum L. F → Fígado g → Grama GM-CSF → Fator estimulante de colônias granulocíticas-macrofágicas GSH → Glutationa reduzida GSH-Px → Glutationa-peroxidase

xiv

GSH-Rd → Glutationa redutase GSSG → Glutationa oxidada GST → Glutationa-S-transferase Gy → Gray ICLAS → Conselho do Laboratório de Animais Experimentais ID → Intestino delgado IFN-γ → Interferon gama IG → Intestino grosso IL-1 → Interleucina 1 IL-10 → Interleucina 10 IL-12 → Interleucina 12 IL-2 → Interleucina 2 IL-4 → Interleucina 4 IL-6 → Interleucina 6 IP → Intraperitoneal IPEN → Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares IRWAM → Instituto de Radioterapia Waldemir Miranda keV → quilo eletronvolt LOO• → Radical peroxila LOX → Lipoxigenase M → Músculo MBq → megabequerel MeV → megaeletronvolt mg → miligrama mg/kg → miligrama por quilograma min → minuto mL → mililitro MPA → Ácido metafosfórico mRNA → Ácido ribonucléico – mensageiro NaCl → Cloreto de sódio nm → nanômetro O → Osso O2

- → Radical superóxido ºC → graus Célcius OH• → Radical hidroxila ON → Óxido nítrico Pan → Pâncreas PGI2 → Prostaciclina PKC → Proteína quinase C PSA → Antígeno prostático específico Pul → Pulmão R → Rins RI → Radiação ionizante

xv

S → Salina -SH → Tiol SI → Salina – irradiado SOD → Superóxido-dismutase SPECT → Tomografia computadorizada por emissão de fóton único -SS- → Pontes dissulfeto STS → Salina – tumor – salina T → Tireóide T1 → Tratado 1 com 50 mg/kg do EAPPg T2 → Tratado 2 com 100 mg/kg do EAPPg T3 → Tratado 3 com 200 mg/kg do EAPPg TI → Tratado – irradiado TNF-α → Fator de necrose tumoral alfa TS1 → Tumor – salina 1 TS2 → Tumor – salina 2 TT1 → Tumor – tratado 1 TT2 → Tumor – tratado 2 TTS → Tratado – tumor – salina TTT → Tratado – tumor – tratado TWI % → Percentagem de inibição tumoral UFPE → Universidade Federal de Pernambuco UVA → Radiação ultra-violeta A α-tocoferol → Vitamina E

xvi

POLPA DA Punica granatum L. COMO RADIOMODIFICADOR EM CAMUNDONGOS SOB

INDUÇÃO TUMORAL

AUTOR: Isvânia Maria Serafim da Silva

ORIENTADORA: Profª. Drª. Maria Teresa Jansem de Almeida Catanho

RESUMO

Radiomodificadores são substâncias que podem se comportar como radioprotetores ou radiosensibilizadores. E ainda podem alterar o metabolismo e captação dos radiofármacos na biodistribuição, o que pode resultar em erros no diagnóstico em medicina nuclear. Muitos produtos naturais podem se comportar como radiomodificadores, e a Punica granatum L. (Romã) apresenta diversas características, como a capacidade antioxidativa, que a indica como um provável radiomodificador. Dessa forma, o presente trabalho teve o objetivo de avaliar a capacidade que a polpa da Romã possui em alterar a captação do tecnécio-99m (99mTc) na biodistribuição, e comparar se essa captação modifica frente a animais sadios e com Sarcoma 180, bem como em relação a forma que é administrada. Associado a estes aspectos, avaliar a capacidade antitumoral, antinflamatória e radioprotetora. Em todo os experimentos foram empregados camundongos machos Swiss. Os animais sadios, receberam a implantação do Sarcoma 180 na região subaxilar direita. A biodistribuição foi realizada 24 horas após o tratamento com a Punica granatum L., e os animais foram eutanasiados rapidamente após 30 minutos da administração do 99mTc. Os órgãos foram retirados para pesagem e contagem da radiação em contador gama. A atividade antitumoral foi analisada baseada no indice de inibição tumoral (TWI). A avaliação antinflamatória foi realizada empregando o modelo da carragenina para provocar a ação inflamatória. E para avaliação do aspecto radioprotetor foi utilizada a dosagem da glutationa reduzida (GSH) após irradiação com cobalto-60 (60Co). Os resultados obtidos destacam-se pela possibilidade de demonstrar a ação da polpa de uma fruta tão exótica e de grande emprego pela população nordestina, resaltando que sua atividade pode ser modificada dependentemente da presença do câncer, e da sua forma de administração. Na biodistribuição foi demonstrado que a polpa da romã, nos animais que não tinham tumor, reduziu a captação do 99mTc apenas no intestino grosso e estomago, enquanto aumentou a captação na tireóide. Em animais com sarcoma 180, que foram tratados após a implantação do tumor ocorreu redução significativa da captação na grande maioria dos órgãos. Mas, nos animais que foram tratados antes e após a implantação do Sarcoma 180, ocorreu aumento da captação no pulmão, coração, pâncreas, estômago, tireóide e tumor. Estes resultados demonstram a capacidade que a polpa da romã possui em alterar a biodistribuição nos tecidos. A polpa da romã também apresentou atividade antitumoral, antinflamatória e provável ação radioprotetora decorrente da elevação dos níveis de GSH nos animais irradiados. Palavras-chaves: Radioprotetor, Punica granatum L., biodistribuição, tumor.

xvii

Punica granatum L. ARILS AS RADIOMODIFY IN MICE WITH TUMOR

AUTHOR: Isvânia Maria Serafim da Silva

ADVISER: Profª. Drª. Maria Teresa Jansem de Almeida Catanho

SUMMARY

Radiomodifies are substances that can behave as radioprotectors or radiosensibilizers. They can still alter the metabolism and uptake of radiopharmaceutics in biodistribution, what may result in diagnosis errors for nuclear medicine. Many natural products can behave as radiomodifies, and the Punica granatum L. (Pomegranate) brings very caracteristics as well the antioxidative capacity, which indicates it as a possible radiomodifier. In this way, the current paper has the objective of evaluating the capacity which the pomegranate has in altering the technetium-99m (99mTc) uptake in biodistribution, and compare if this caption modifies through healthy animals and with Sarcoma 180, as well as in relation to method it is administered. Associated to these aspects, it evaluates the antitumoral, anti inflammatory and radioprotector capacity. In all experiments were employed Swiss male mice. The healthy animals received the implantation of Sarcoma 180 by the right subaxillar region. The biodistribution was performed 24 hours after treatment and the animals were sacrified rapidly after 30 minutes of 99mTc administration. The organs were collected for weighting and radiation counting in gama counter. The antitumor activity was analyzed by the Tumor Weight Inhibition (TWI). The anti inflammatory evaluation was performed employing the carragenina model to induce the inflammatory action. And for radioprotector aspect evaluation, the reduced glutathione (GSH) dose was used after cobalt-60 (60Co) irradiation. The achieved results highlight the possibility to demonstrate the fruit arils action so exotic and with significant employment by Brazil Northeast population, rebounding that its activity may be modified dependly on cancer existence and administration method. In biodistribution, it was demonstrated that the pomegranate arils, in animals without tumor, reduced the 99mTc uptake only in large intestine and stomach, meanwhile it increased in thyroid caption. In the animals with Sarcoma 180, which were treated after the implantation of tumor, occurred significant reduction of caption in many organs. However, in the animals which were treated before and after the implantation of Sarcoma 180, occurred increasing of uptake in lungs, heart, pancreas, stomach, thyroid gland and tumor. These results demonstrate the capacity that the pomegranate arils hold in altering the biodistribution in cell tissues. The pomegranate arils also demonstrate the antitumor, anti inflammatory, and possibly radioprotector action resultant from level elevation of GSH in irradiated animals. Key-words: Radioprotector, Punica granatum L., biodistribution, tumor.

1 INTRODUÇÃO

Os produtos naturais e sintéticos vêm sendo muito estudados nos últimos anos,

principalmente no Brasil, devido a sua grande biodiversidade. Estes produtos podem

interferir nos testes experimentais alterando o comportamento farmacocinético e

farmacodinâmico dos radiobiocomplexos (radiofármacos), modificando a resposta

farmacológica, como relatado em estudos com Maytenus ilicifolia, Coffea beans, Thuya

occidentallis, Ginkgo biloba, Mentha crispa, Tabacco, (OLIVEIRA et al., 1997;

GUTFILEN et al., 1998; OLIVEIRA et al., 2000; MORENO et al., 2001; FALCÃO, 2003;

OLIVEIRA et al., 2003; SANTOS-FILHO et al., 2004).

A influência desses compostos naturais sobre a biodisponibilidade dos

radiobiocomplexos pode ser observada nas modificações das imagens em medicina

nuclear (BERNARDO-FILHO et al., 2005). As substâncias que atuam gerando essas

mudanças são classificadas como radiomodificadoras.

O interesse por produtos radiomodificadores tem dado origem a trabalhos como o

de CAPRILES et al., (2002) que estudaram o efeito do extrato de Solanum melogena

(berinjela) na biodistribuição do pertecnetato de sódio (Na 99mTcO4). No qual, a ação do

extrato levou ao aumento da captação do radioisótopo no fígado dos animais tratados,

causado provavelmente pelos glicocorticóides existentes na planta. MOUSINHO (2006)

estudou o efeito do Ricinus communis L. na determinação da atividade antitumoral e na

biodistribuição do Na 99mTcO4, constatando a sua capacidade e poder radiomodificador,

pois causou aumento da captação do radioisótopo nos rins e no estômago.

Segundo JAGETIA (2007), os produtos naturais que apresentam atividade anti-

inflamatória, antitumoral, antioxidante, antimicrobiana, imunomoduladora, anti-estresse e

que capturam radicais livres, são potenciais radiomodificadores, e devem ser estudados

mais amplamente em relação a esta característica.

Diante do exposto, é importante que a busca por produtos naturais com

propriedades radiomodificadoras seja estimulada, principalmente no que diz respeito a

radioproteção, para aplicação direta em vários momentos de exposição à radiação

ionizante. Contudo, para utilizá-los efetivamente é importante que os mecanismos de ação

2

sejam elucidados, com o objetivo de evitar enganos nos diagnósticos em medicina

nuclear, já que os compostos radioprotetores podem alterar a biodistribuição dos

radiobiocomplexos. Desta maneira, para determinação de aspectos tão complexos, esses

estudos podem propiciar a fusão de ferramentas disponíveis no País e estimular a

biotecnologia, aproximando as ciências básicas e garantindo respaldo social.

A Punica granatum L., conhecida vulgarmente por romã, é uma potente fonte de

estudo para esta finalidade, por apresentar uma série de características dentro destes

aspectos (LANSKY; NEWMAN, 2007).

Diversas propriedades da Punica granatum L. já vêm sendo testadas no meio

científico, e aliada a elas existem estudos sobre o poder antioxidante e antitumoral.

Contudo, muitos aspectos precisam ser mais bem estudados e esclarecidos, principalmente,

referentes às possíveis características radiomodificadoras sobre os radiobiocomplexos

(NIMRI et al., 1999; NASCIMENTO et al., 2000; MOUHAJIR et al., 2001).

Alguns estudos já direcionam a Punica granatum L. como um potencial

radiomodificador, como o realizado por LAMAR et al., (2005), onde o extrato da Punica

granatum L. foi capaz de seqüestrar espécies reativas de oxigênio produzidas pelo

peróxido de hidrogênio, mecanismo mediante o qual, pode exercer uma ação protetora do

DNA, frente às lesões causadas pela oxidação.

Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar a capacidade radiomodificadora do

extrato aquoso da polpa da Punica granatum L. na biodistribuição do pertecnetato de

sódio (Na 99mTcO4) em camundongos sadios e sob indução tumoral do Sarcoma 180, bem

como de avaliar a sua atividade antitumoral e antiinflamatória, e a capacidade

radioprotetora.

3

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Medicina Nuclear e os radiofármacos.

Das ciências que deram origem às hoje chamadas especialidades em diagnóstico

por imagem, a medicina nuclear é a segunda mais antiga, precedida apenas pela radiologia

convencional, que faz uso dos raios X (THOM; SMANIO, 2007).

A Medicina Nuclear é uma especialidade médica que faz uso das radiações

nucleares para fins de diagnóstico e terapia, empregando compostos radioativos, chamados

de radiofármacos. A riqueza e a capacidade diagnóstica dessa técnica residem na

diversidade dos radiofármacos disponíveis atualmente (THRALL; ZIESSMAN, 2003).

Os procedimentos em medicina nuclear tiveram aplicação desde o início do século

XX. Em 1910, Wickman e Degrais referiram-se ao uso de injeções de rádio em lesões

cutâneas de lúpus e mais tarde, em 1913, Frederick Proescher publicou sobre a injeção

intravenosa de rádio para tratamento de várias doenças (TUBIS; WOLF, 1976).

No campo diagnóstico, a aplicação de técnicas traçadoras no estudo em humanos

começou na década de 1920 com Herrman Blumgart, quando pela primeira vez, foram

aplicados isótopos radioativos naturais em estudos de circulação sanguínea em humanos.

Os isótopos radioativos artificiais foram introduzidos por Lawrence, por volta de 1932.

“Indicadores radioativos”, clássico de George Hevesy, 1948, trouxe princípios básicos

posteriormente incorporados às técnicas de diagnóstico (TUBIS; WOLF, 1976).

Finalmente, em 1946, o Instituto Oak Ridge (Tennessee – EUA) começou a produzir

radionuclídeos com propósitos médicos.

O radiofármaco é uma preparação farmacêutica, sem ação farmacológica, que tem

na sua composição um radionuclídeo, fonte de radiação, e um fármaco, responsável pela

seletividade biológica do composto (OLIVEIRA et al., 2006).

Aproximadamente 80 % de todos os radiofármacos usados na medicina nuclear são

compostos marcados com tecnécio metaestável (99mTc). A razão dessa preferência são as

características físico-químicas extremamente favoráveis que esse isótopo apresenta:

emissão de raios gama de energia ótima (140 keV), meia-vida de seis horas, facilidade de

4

conjugação com outras moléculas e viabilidade de obtenção pelo gerador molibdênio –

tecnécio (99Mo – 99mTc) (SAHA, 2005).

O 99mTc é considerado ideal para as aplicações médicas. Sua meia-vida é

suficientemente longa para permitir a preparação, administração do fármaco e realização

dos exames, mas suficientemente curta para que as doses que o paciente receba sejam

mínimas. A ausência de emissão beta diminui ainda mais as doses recebidas pelo paciente

(OLIVEIRA et al., 2006).

Apesar do 99mTc ser ideal para o emprego em medicina nuclear, padrões

inesperados da sua biodistribuição podem estar associados com doenças e terapia com

drogas, que podem se comportar como radiomodificadores (GOMES et al., 2002).

2.2 Influencia de radiomodificadores sobre os radiofármacos.

Compostos radiomodificadores são substâncias que quando administradas ao

organismo e absorvidas, podem interagir e influenciar o mecanismo de ação da radiação

ionizante (RI), modificando seus efeitos biológicos. Isto pode ser observado nos ensaios

envolvendo a biodistribuição de radiofármacos.

O emprego da biodistribuição como modelo experimental contribui para um melhor

entendimento dos mecanismos que possam vir a interferir na imagem em medicina nuclear,

decorrentes da interação de drogas sintéticas ou da atividade de produtos naturais

(HOLANDA et al., 2008). E a relação direta entre a biodistribuição e a medicina nuclear

pode ser observada em estudos como o de KIM et al., (2007) que possibilitou a comparação

da dose absorvida média devido a ligação do radiofármaco ao tumor em imagens por

SPECT (“Single-Photon Emission Computed Tomography” = Tomografia computadorizada

por emissão de fóton único), com aquela obtida pela biodistribuição, demonstrando com os

seus resultados, que é consistente o emprego da biodistribuição como método preditivo para

investigar a geração de imagens em medicina nuclear.

Mais uma vez, o estudo da biodistribuição é primordial para estabelecer a eficácia

do uso do radiofármaco na medicina nuclear. Isto inclui a absorção, distribuição,

metabolismo e excreção da substância pelo organismo. No entanto, a biodistribuição dos

5

radiobiocomplexos pode ser alterada por doenças, como o câncer, e por uma ampla

variedade de condições, como as terapias com radiação ou com drogas, bem como por

diversos procedimentos médicos invasivos (MORENO, et al., 2005; SANTOS-FILHO;

BERNARDO-FILHO, 2005).

Existe um interesse constante na avaliação da biodistribuição do radioisótopo 99mTc ,

já que devido as suas características , ele é corriqueiramente empregado em mais de 80 % de

todos os estudos com imagens em medicina nuclear, (MATTOS et al., 2000). Dentre alguns

ensaios, se encontra o de MORENO, et al. (2005) que averiguou a interação farmacocinética

do extrato de Ginkgo biloba na biodistribuição do pertecnetato de sódio (Na 99mTcO4), e

demonstrou que o mesmo leva a um decréscimo na porcentagem de captação no duodeno,

supondo que este fato pode ser devido a alterações nas células caliciformes, as quais são

aparentemente causadas por ações em estruturas específicas, devido à geração de metabólitos

do extrato.

É importante frisar que a medicina nuclear nos dias atuais é bastante requerida para

o diagnóstico, terapia e para o acompanhamento de pacientes com câncer. E que estes

pacientes podem estar fazendo uso de alguma substância terapêutica, a qual pode modificar

a natureza do fármaco, o meio bioquímico ao qual o radiofármaco está exposto, a

capacidade do radiofármaco de se ligar aos elementos sangüíneos e até os alvos

preferenciais de ligação (SRIVASTAVA, 1987; SAMPSON, 1996), e isso pode ser

principalmente devido às propriedades radioprotetoras ou radiosensibilizadoras, ou seja,

radiomodificadoras, que essas drogas podem possuir.

Compostos radiomodificadores podem ser de origem sintética ou natural, contudo

a alta toxicidade de compostos sintéticos gerou a necessidade de pesquisar agentes

alternativos, que fossem menos tóxicos e possuíssem a capacidade de atuar mais

amplamente. Surgem assim os produtos ou compostos isolados de fontes naturais, que

muitas vezes atendem a esses pré-requisitos (JAGETIA, 2007).

Os radiomodificadores podem ainda atuar como radioprotetores ou

radiossensibilizadores, ou até como ambos em tecidos diferentes, dependendo de diversos

fatores metabólicos. E a radioproteção é alvo de grande interesse no meio onde se aplica a

radiação ionizante, principalmente por meio de mecanismos químicos.

6

2.3 Radioproteção química

O emprego da radiação ionizante (RI), com o avanço tecnológico, está presente em

diversos setores. Entre eles está a área médica, no diagnóstico e na terapia, a área

industrial, o setor energético e ainda exposições devido à viagens espaciais. Além da

ocorrência de exposições em acidentes nucleares, ou eminência de ataques terroristas

nucleares. Assim, tem aumentado consideravelmente a exposição humana a RI (JAGETIA,

2007).

O efeito da RI no ser vivo é resultado da interação com os átomos, produzindo

ionizações, e conseqüentemente depositando energia diretamente sobre os tecidos. Devido

a esta transferência de energia para moléculas como a água, ocorrem interferências na

fisiologia celular, o que pode levar ao stress oxidativo, caracterizado pelo aumento da

concentração de substâncias oxidantes, mais conhecidas como radicais livres, que são

altamente reativos, provocando sérios danos biológicos (BUSHONG, 2004; PONTUAL,

2005).

A blindagem de chumbo e outras medidas físicas são incômodas para utilização em

algumas situações, portanto a intervenção farmacológica pode ser a mais prudente

estratégia para proteção humana contra os efeitos prejudiciais provocados pela RI

(JAGETIA, 2007).

O emprego de compostos químicos como proteção contra os efeitos danosos da RI

foi inicialmente tentado após a II Guerra Mundial, devido a necessidade de proteger os

indivíduos contra o uso militar de armas atômicas. PATT et al., em 1949, foi o primeiro a

investigar o efeito do aminoácido cisteína em ratos expostos a doses letais de radiação X,

onde perceberam que o pré-tratamento dos ratos com este aminoácido protegia contra a

letalidade induzida pela radiação.

Atualmente, vários compostos químicos e seus análogos tem sido estudados quanto

a sua habilidade radioprotetora, contudo, normalmente estes compostos possuem uma alta

toxicidade nas doses ótimas para radioproteção, o que tem impedido o seu emprego clínico

(SWEENEY, 1979; MAISIN, 1998).

Outro maior recuo do emprego dos compostos químicos como radioprotetores vem

do fato de que eles têm se mostrado incapazes de promover proteção pós-irradiação, o que

7

é de extrema importância em radioterapia, pois se sabe que a proteção do tecido normal é

tão importante quanto à destruição das células cancerígenas. Assim, uma boa parte das

pesquisas na busca por radioprotetores está mais voltada aos aspectos terapêuticos

(JAGETIA, 2007).

A alta toxicidade dos tióis, que pertencem ao mesmo grupo químico da cisteína,

trouxe a necessidade de pesquisas em busca de agentes alternativos, que sejam menos

tóxicos e bastante efetivos em níveis de doses não tóxicas. Surge, portanto, a idéia de que

produtos ou compostos isolados de fontes naturais podem ser usados como radioprotetores

não tóxicos (CRAGG et al., 1997).

A possibilidade de obtenção de produtos não tóxicos desviaram a atenção dos

investigadores para as plantas e produtos naturais durante as últimas duas décadas, e

atualmente muitas drogas descobertas para tratamento de doenças em humanos são

derivadas de plantas (CRAGG et al., 1997).

No momento de selecionar uma substância como radioprotetora, é importante

observar suas propriedades, se a substância é antiinflamatória, antioxidante,

antimicrobiana, imunomoduladora, capturador de radicais livres ou anti-stress, pois são

propriedades indicativas de um potencial radioprotetor (JAGETIA, 2007)

Alguns testes in vitro podem fornecer informações para uma avaliação detalhada da

atividade radioprotetora, como a avaliação da peroxidação lipídica, a redução da presença

de radicais livres e aumento da presença de compostos antioxidantes, o aumento da

sobrevivência de células expostas à RI, a redução na formação de micronúcleos radio-

induzidos, avaliação da redução das quebras da fita de DNA, redução da apoptose,

estimativa da glutationa (GSH) e enzimas como catalase e glutationa peroxidase. Todos

estes testes, individualmente ou agrupados, podem indicar que qualquer produto

farmacológico possui atividade radioprotetora (JAGETIA; BALIGA, 2003).

O padrão ouro para verificar a atividade radioprotetora é a avaliação da sobrevida

em 30 dias de roedores submetidos a doses letais de corpo inteiro. A sobrevivência destes

roedores indica a capacidade que o agente farmacológico possui em modelar a recuperação

e regeneração do epitélio gastrointestinal e as células progenitoras hematopoiéticas da

medula óssea, sabendo que estes são os dois órgãos mais radiosensíveis para sustentação

da vida (JAGETIA; BALIGA, 2003).

8

A eficácia de radioprotetores na prática clínica requer o emprego de diferentes

formas avaliativas. Entre outras formas avaliativas sensíveis a determinação dos efeitos

benéficos dos radioprotetores está a redução da mucosite e xerostomia resultantes de

radioterapia de cabeça e pescoço, como também a redução dos efeitos quando o trato

gastrointestinal está no campo de irradiação (MALAKER, 1998).

Um bom protetor químico deve ser capaz de proteger contra os efeitos danosos da

radiação ionizante durante procedimentos terapêuticos, bem como durante acidentes

nucleares, voos espaciais e até da irradiação natural. Um radioprotetor ideal deve ser

barato, não produzir efeitos tóxicos em uma ampla variação de doses, ser administrado

oralmente e ter uma absorção rápida, apresentar um fator de redução de dose considerável,

e atuar através de multiplos mecanismos. Todas essas qualidades podem ser encontradas

em plantas ou produtos naturais (JAGETIA, 2007).

2.4 Produtos naturais como radioprotetores

Diversas espécies de plantas têm sido examinadas com o objetivo de averiguar o

potencial radioprotetor que elas são capazes de apresentar, e muitas são aquelas que por

diversos mecanismos, ainda não elucidados, têm provado ser de grande importância na

busca por novos agentes que possam ser empregados na proteção radiológica. A partir de

então, acompanharemos diversos estudos dentro destas perspectivas.

Entre eles, está um estudo realizado com o Gingko biloba em uma dose de 100 mg

por paciente, o qual mostrou-se efetivo no tratamento de pacientes com edema vasogênico

após a irradiação do cérebro. Ele também tem sido relatado como um protetor contra

fatores clastogênicos do plasma de indivíduos irradiados, e no tratamento de trabalhadores

no acidente de Chernobyl, na dose de 40 mg por dia, três vezes ao dia por 2 meses

(HANNEQUIN et al., 1986; EMERIT et al., 1995).

Segundo outro estudo realizado, o extrato aquoso de Centella asiática (pata de

cavalo) reduz o efeito adverso da radiação, protegendo contra a perda de peso radio –

induzida em camundongos expostos a 8 Gy de radiação gama (SHARMA; SHARMA,

2002).

9

Em trabalho realizado por MIZINA; SITNIKOVA (1999), foi possível verificar que

a administração oral do suco concentrado de Hippophae rhamnoides (espinheiro marítimo)

para ratos antes e após a irradiação aumentou o tempo de vida. Também, restaurou os

níveis sanguíneos de 11-oxicorticosteróides, restituiu o peso das adrenais isoladas, e

normalizou a atividade basal e a resposta para ACTH (Hormônio adenocorticotrópico) e

corticotropina sob condições in vitro.

Já o extrato hidroalcóolico de Hippophae rhamnoides também se mostrou como

protetor de camundongos contra a mortalidade celular radio-induzida, contribuindo com a

manutenção das unidades formadoras de colônias (CFU) e redução da formação de

micronúcleos (GOEL et al., 2002a; AGRAWAL; GOEL, 2002; GOEL et al., 2003).

As propriedades radioprotetoras do Osimum sanctum foi inicialmente comentada

por JAGETIA et al. (1986), onde foi verificada a redução da mortalidade radioinduzida. E

através de outros estudos foi estabelecida a atividade radioprotetora do Osimum sanctum

empregando análise de aberrações cromossômicas nas células da medula óssea de

camundongos, redução da peroxidação lipídica e redução da concentração de glutationa

(UMA DEVI; GANASOUNDARI, 1995; GANASOUNDARI et al., 1997).

Outra planta que vem sendo pesquisada como radioprotetora é o Panax ginseng

(ginseng), onde já foi estudada a capacidade dele em aumentar a quantidade de eritrócitos e

plaquetas sanguíneas após a irradiação. O estudo do extrato de ginseng fracionado, não se

mostrou efetivo como radioprotetor. Contudo o emprego do extrato total do ginseng

também se apresenta como redutor da apoptose das células da cripta do jejuno, e redutor da

peroxidação lipídica testicular (YONEZAWA et al., 1985; ZHANG et al., 1987; PANDE

et al., 1998; KIM et al., 2001; KUMAR et al., 2003). Ele também apresentou um caráter

imunomodulador, ao regular a produção de citocinas, como as interleucinas (IL-1, IL-2,

IL-4, IL-6, IL-10, IL-12), o interferon gama (IFN-γ), o fator de necrose tumoral alfa (TNF-

α) e o fator estimulante de colônias granulocíticas-macrofágicas (GM-CSF). E sua

capacidade radioprotetora pode ser atribuída ainda à possibilidade que ele possui em

imunomodular, contribuindo na proteção das células da medula óssea e reduzindo a

magnitude da regressão radio-induzida no sistema imuno-hematopoético (LEE et al.,

2005).

10

O Podophyllum hexandrum é outra planta que tem sido relatada como

radioprotetora, reduzindo a mortalidade radioinduzida, o dano gastrointestinal e

melhorando o desenvolvimento do sistema nervoso embriogênico em camundongos, bem

como minimizando o declínio da glutationa-S-transferase e da superóxido dismutase no

fígado e intestino de camundongos irradiados (SALIN et al., 2001; GOEL et al., 2002b;

MITTAL et al., 2002).

Existem compostos, que apesar de não serem originários de plantas, podem ser

considerados naturais, por serem endógenos, como a melatonina, e que ao longo de vários

estudos tem se mostrado como um potente agente radioprotetor. Os resultados obtidos por

VIJAYALAXMI et al. em 1999, demonstraram que o emprego de altas doses de

melatonina antes da irradiação de camundongos de corpo inteiro, com uma dose de 815

cGy, foi efetivo em aumentar a sobrevivência dos animais.

Como pudemos observar, são muitos os produtos naturais que apresentam

características radioprotetoras, mas a pesquisa de compostos alimentares radioprotetores

deve ser implementada, já que eles são produtos que podem ser consumidos

constantemente, viabilizando a proteção de forma mais simplificada.

2.5 Suplementos alimentares naturais como radioprotetores

Baseado nos dados apresentados anteriormente é possível perceber, que várias

plantas e ervas que não fazem parte de um suplemento alimentar diário têm sido

pesquisadas como radioprotetoras. Contudo produtos suplementares da dieta ainda

permanecem pouco explorados em relação ao potencial radioprotetor, e existe uma

importância crucial nas pesquisas envolvendo suplementos alimentares diários, pois os

mesmos são consumidos diariamente, normalmente não são tóxicos e tem uma ampla

aceitabilidade (JAGETIA, 2007).

Um desses suplementos é o fruto jambolão (Syzigium cumini), conhecido

popularmente no nordeste como azeitona preta, que tem sido estudado e vem apresentando

várias propriedades medicinais. Como radioprotetor in vitro ele tem se mostrado efetivo

em reduzir a quantidade de micronúcleos em linfócitos do sangue periférico, sendo

11

necessário apenas 12,5 µg/mL do extrato metanólico para obtenção deste resultado. Para

avaliação in vivo ele mostrou-se efetivo em reduzir os danos radioinduzidos, como a morte

das células da medula óssea e do sistema gastrointestinal (JAGETIA; BALIGA, 2002a;

JAGETIA; BALIGA 2003), e também tem se mostrado efetivo em reduzir os sintomas da

síndrome aguda da radiação e a aumentar a sobrevivência, quando do emprego do extrato

na dose de 80 mg/kg de peso, antes da exposição à radiação gama em níveis de dose de 6,

7, 8, 9, 10 e 11 Gy (JAGETIA et al., 2005).

Outro suplemento é a hortelã (Mentha arvensis), que quando empregada em

camundongos a uma concentração de 10 mg/kg de peso, protegeu contra os danos

radioinduzidos e morte das células do sistema hematopoiético e gastrointestinal com um

fator de redução de dose de 1,2, apresentando uma grande vantagem por não ser tóxica

mesmo a altas doses como 1000 mg/kg de peso (JAGETIA; BALIGA, 2002b).

O pré-tratamento de camundongos com outra espécie de hortelã, a hortelã-pimenta

(Mentha piperita), demonstrou que ela atua como radioprotetor de camundongos ao

minimizar a redução dos constituintes hematológicos, da fosfatase sérica, do peso do baço,

e dos danos cromossômicos (SAMARTH et al., 2001; SAMARTH et al., 2002;

SAMARTH; KUMAR, 2003).

Ainda foi estudado o mentruz ou erva-de-são-joão (Ageratum conyzoides) é outro

suplemento alimentar natural, e tem sido usado em várias partes da África, Ásia e América

do Sul, para curar várias doenças. O estudo de várias doses do extrato alcoólico de

Ageratum conyzoides, revelou que a melhor dose para obtenção do efeito radioprotetor foi

de 75 mg/kg, reduzindo a morte das células do sistema hematopoiético e gastrointestinal,

com um fator de redução de dose de 1,3. Tendo sido atribuído o efeito radioprotetor, a

capacidade que o Ageratum conyzoides possui em capturar radicais livres (JAGETIA et al.,

2003b).

E em estudo realizado com o melão-de-são-caetano (Momordica charantia L.) foi

possível demonstrar um provável efeito radioprotetor, baseado no fato de que o extrato

aquoso das folhas foi capaz de alterar o comportamento biológico (biodistribuição) nos

tecidos, sobretudo no fígado, rins e testículos, que são tecidos que apresentam a enzima

antioxidante glutationa-S-transferase (GST) (MAGNATA, 2007).

12

Depois de acompanhar os trabalhos apresentados, constatamos que vários

suplementos alimentares podem apresentar características radioprotetoras, e que elas foram

analisadas por meio de muitos mecanismos. Dessa maneira torna-se importante tentar

entender os possíveis mecanismos de ação radioprotetora dos produtos naturais.

2.6 Possíveis mecanismos da ação radioprotetora dos produtos naturais

As radiações ionizantes são capazes de produzir uma série de espécies reativas de

oxigênio na forma de radical hidroxila (OH˙), oxigênio singlete (1O2), radical superóxido

(O2¯), óxido nítrico, entre outros. Eles seguem uma cascata de eventos levando ao dano no

DNA (ácido desoxirribonucléico) na forma de quebra de uma fita simples (quebra simples)

ou quebra das duas fitas (dupla quebra), danos na base, ligações cruzadas (cross-links)

entre DNA-DNA ou entre DNA-proteína, e essas lesões agrupam-se como um complexo

local, multiplicando os danos. As duplas quebras são consideradas, dentre os eventos, os

mais letais após a exposição a RI, e os principais alvos de morte celular (JAGETIA, 2007).

Com o objetivo de se proteger, a célula possui um sistema de defesa que pode atuar

em duas linhas. Uma delas atua como detoxificadora do agente antes que ele cause lesão.

Esta linha é constituída por glutationa reduzida (GSH), superóxido-dismutase (SOD),

catalase , glutationa-peroxidade (GSH-Px) e vitamina E (α-tocoferol). A outra linha de

defesa tem a função de reparar a lesão ocorrida, sendo constituída pelo ácido ascórbico,

pela glutationa-redutase (GSH-Rd) e pela GSH-Px, entre outros. Com exceção da vitamina

E, que é um antioxidante estrutural, a maior parte dos agentes antioxidantes está no meio

intracelular (FERREIRA; MATSUBARA, 1997; OLIVEIRA et al., 2009).

Ao observar a forma de ação de alguns compostos antioxidantes, podemos citar a

ação da glutationa reduzida (GSH ou γ-glutamilcisteinilglicina), que está presente na

maioria das células, e é o tiol (-SH) mais abundante no meio intracelular. Sua capacidade

redutora é determinada pelo grupamento -SH, presente na cisteína. A GSH pode ser

considerada um dos agentes mais importantes do sistema de defesa antioxidante da célula,

protegendo-a contra lesão resultante da exposição a agentes como íons ferro, oxigênio

hiperbárico, radiação ultravioleta, e por que não, da radiação ionizante. Além disto,

13

diminui a suscetibilidade à lesão renal decorrente da isquemia e reperfusão; atua como

transportadora e reservatório da cistina e participa da detoxificação de agentes químicos e

da eliminação de produtos da lipoperoxidação. E ainda, é requerida para síntese de DNA,

de proteínas e de algumas prostaglandinas (FERREIRA; MATSUBARA, 1997). E segundo

ORŠOLIC; BAŠIC (2005), ela pode estar relacionada com o controle da proliferação e

apoptose celular.

Na inativação de um agente oxidante ocorre produção de GSSG (glutationa

oxidada) e depleção de GSH (Figura 1). Em situações em que o sistema de óxido-redução

está íntegro, haverá recuperação da GSH. Entretanto, sob condições de excesso de agentes

oxidantes e/ou deficiência do sistema protetor, haverá desequilíbrio entre o consumo de

GSH e a produção de GSSG, o que caracteriza o estresse oxidativo. O excesso de GSSG

resulta em ambiente mais oxidante, que favorece a formação de pontes dissulfeto (-SS-)

nas proteínas portadoras de grupamento tiol (-SH). As pontes dissulfeto oxidam estas

proteínas, com prejuízo de suas funções. Esta oxidação é reversível às custas da ação de

compostos antioxidantes, como a GSH (BAYNES; DOMINICZAK, 2007).

Utilizando a hemácia como célula-alvo, podemos acompanhar o fenômeno do

estresse oxidativo, já que a membrana dessa célula contém grande número de grupos -SH,

e os agentes oxidantes podem converter estes grupos tióis (R-SH) em componentes

dissulfeto (R-SSG), levando à desnaturação das proteínas da membrana (FERREIRA;

MATSUBARA, 1997).

Existem ainda outros mecanismos envolvidos na capacidade radioprotetora de

compostos naturais, como a capacidade imunomoduladora. Isso pode ser observado em

trabalho desenvolvido por ORŠOLIC; BAŠIC (2005), no qual foi demonstrado que o

própolis foi capaz de aumentar a proliferação de células nucleadas, principalmente

macrófagos e as células hematopoiéticas no baço e na medula óssea, de animais irradiados de

corpo inteiro com uma dose absorvida de 6 Gy. E também manteve os níveis de hemácias

constantes no sangue periférico. Isto deve ser devido à influência do extrato sobre a atividade

dos macrófagos e produção de interleucina-1 (IL-1) por estas células, já que a IL-1 é

conhecida como agente estimulante da hematopoiese.

14

Figura 1 – Enzimas e mecanismo antioxidante. (A) SOD e CAT (Catalase) são dismutases, que catalisam a oxidação e redução de moléculas de substratos distintos, ambas são altamente específicas para seus substratos, O2• e H2O2, respectivamente. (B) A GPx reduz H2O2 e peróxidos de lipídeos (LOOH), utilizando GSH como co-substrato. O GSH é reciclado pela glutationa redutase (GR) utilizando NADPH a partir da via pentose-fosfato. (C) Estrutura da GSH (BAYNES; DOMINICZAK, 2007).

As supostas formas de radioproteção de produtos naturais podem ser mediados

através de vários mecanismos, tendo em vista que tanto as plantas quanto as ervas são

complexas misturas de vários químicos. Na Figura 2 podemos visualizar alguns dos

possíveis mecanismos radioprotetores conhecidos atualmente.

15

Figura 2 – Esquema demonstrando alguns dos supostos mecanismos de radioproteção de plantas e ervas. Dentre estes mecanismos temos o aumento do reparo e redução do dano no DNA; redução do ciclo celular; captura de radicais livres; redução dos peróxidos, da proteína quinase C (PKC), e do óxido nítrico; aumento das enzimas antioxidantes (GSH, GST, CAT e SOD); e aumento da replicação do RNAm das enzimas GSH e GST. (JAGETIA, 2007). Os métodos mais utilizados para aferição indireta das espécies reativas de oxigênio,

formadas pelo estresse oxidativo decorrente de exposição à RI, são os espectrofotométricos

e cromatométricos, que medem a atividade enzimática (Superóxido dismutase – SOD;

catalase; glutationa peroxidade – GSH-Px e glutationa redutase – GSH-Rd) e/ou a

concentração de tripeptídeos (glutationa reduzida – GSH; glutationa oxidada – GSSG).

Estas medidas podem ser realizadas em tecidos, sangue e outros fluidos (FERREIRA;

MATSUBARA, 1997).

Sabendo que os produtos naturais podem atuar como potentes agentes

antioxidantes, cresce o interesse por mais estudos com estes compostos. E a Punica

LOO

PKC

ON

Plantas e Ervas

- SH

Capturador

de radicais

livres

Ciclo

celular

Reparo

DNA

Dano

DNA

mRNA

GSH

GST

GSH

GST

CAT

SOD

16

granatum L. tem apresentado diversas propriedades medicinais e nutricionais que

estimulam ainda mais o estudo na busca por determinações dos seus mecanismos de ação.

2.7 Punica granatum L. (Romã)

A Punica granatum L. (Figura 3) conhecida popularmente como romã é uma

antiga, mística, e exclusiva fruta, nascida de uma pequena árvore de vida longa, cultivada

em toda a região Mediterrânea, na região norte distante do Himalaia, no sudeste da Ásia,

na California e Arizona nos Estados Unidos, e no Brasil (JURENCA, 2008).

Na antiga mitologia Grega era conhecida como “fruto dos mortos”, e era um

alimento disponível no reino de Hades para os seus moradores. O próprio senhor Hades, se

beneficiava, utilizando seis sementes da Punica granatum L. do seu próprio reino, para

selar o noivado dele com a bela filha de Zeus e Demeter, rainha do submundo, chamada

Persephone. Na tradição Hebraica, a Punica granatum L. adornou as vestimentas de

sacerdotes, foi exaltada por Salomão nos Salmos, o número de suas sementes foi

considerado místicamente equivalente ao número de virtudes em uma única pessoa, e para

os iniciados, ela foi entendida como sendo símbolo da feminilidade do Criador. Os

Babilônios respeitam as sementes como agente de ressurreição; para os Persas ela promove

invencibilidade nas batalhas; e para os antigos adeptos da alquimia chinesa, o suco da

polpa brilhante confere longevidade ou mesmo imortalidade (LANSKY et al., 2000).

Na região Nordeste do Brasil, a Punica granatum L. tem sido empregada como

gargarejo contra infecções e inflamações do trato respiratório superior (AGRA et al., 2007;

OLIVEIRA et al., 2007; SILVA et al., 2008). Na medicina tradicional cubana, o fruto da

Punica grantum L. tem sido usada para tratar acidose, diarréia, infecções microbianas,

helmintíases, hemorragia e patologias respiratórias (FUENTES; EXPÓSITO, 1995;

SÁNCHEZ-LAMAR et al., 2008). Além do mais, esta espécie parece ter interessante

atividade antiviral, pois ela tem se mostrado efetiva contra o vírus do herpes (SÁNCHEZ-

LAMAR et al., 2008), e o extrato alcoólico do fruto inteiro tem exibido alta atividade

contra o vírus da influenza (SÁNCHEZ-LAMAR et al., 2008; CABALLERO et al., 2001;

PEÑA; MARTÍNEZ, 2001). Em estudo realizado por LEI et al. (2007), foi relatado que o

17

extrato das folhas da Punica granatum L. apresentaram capacidade de inibir o

desenvolvimento da obesidade e hiperlipidemia em ratos com dieta altamente calórica.

A Punica granatum L. é uma planta e um alimento medicinal que apresenta

diversas propriedades farmacológicas e terapêuticas, as quais estão distribuídas em todas as

partes da planta. O conhecimento detalhado da relação do seu conteúdo químico e sua

desejável ação farmacológica vem sendo constantemente pesquisado. E grande parte dos

seus componentes têm sido identificados. Mas, pesquisas recentes indicam que a maioria

dos benefícios terapêuticos, são devidos ao ácido elágico, elagitaninos (incluindo a

punicalagina, ácido púnico, flavonóides, antocianidinas, antocianina, flavonóides

estrogênicos e flavonas (JURENKA, 2008).

Figura 3 – Imagens da planta, flor e fruto de Punica granatum L. (Romã) (www.saberweb.com.br/natureza/roma.htm - Junho 2009)

Os constituintes bioativos primários do suco são os polifenóis e sua potente

característica antioxidante. A punicalagina é o maior polifenol antioxidante no suco da

Punica granatum L. A atividade dos constituintes antioxidantes do fruto foi testada in

vitro, com a avaliação do suco, da punicalagina, ácido elágico, e taninos totais, e o

resultado deste experimento identificou que o suco do fruto inteiro possui maior atividade

antioxidante do que os seus constituintes individuais. A superioridade do suco comparado

com os polifenóis individuais evidenciou a sinergia dos múltiplos compostos (SEERAM et

al., 2005).

18

Outras propriedades também têm sido estudadas, como a ação antibacteriana e

antimicrobiana. Estes atributos têm sido aplicados no campo odontológico, pois, em testes

contra um grupo de diferentes microorganismos, o gel produzido a partir da Punica

granatum L. possui grande eficiência em inibir a aderência microbiana quando comparado

com o micozanol (Daktarin oral gel) (VASCONCELOS, et al. 2006).

Em outro estudo com o extrato do fruto da Punica granatum L., ele se apresentou

como protetor da pele, quando foi capaz de minimizar os danos mediados pela radiação

ultravioleta A (UVA), ao modular a via celular, prevenindo potenciais cânceres de pele. Já

em um trabalho realizado por SUMNER, et al. (2005), ele testou o efeito do suco em

pacientes com doença coronária e concluiu que o consumo diário pode melhorar o estresse

induzido pela isquemia miocárdica.

O suco, a casca, e o óleo das sementes também têm apresentado propriedades

antitumorais, inibindo a proliferação, o ciclo celular e a angiogênese. Em uma pesquisa

realizada por LANSKY et al. (2005) utilizando o extrato do fruto da Punica granatum L.,

ele mostrou que o crescimento celular em células PC-3 do carcinoma de próstata humano,

foi inibido, além de ter sido acompanhado pelo aumento da apoptose.

Como podemos observar, são inúmeras as aplicações e ações da Punica granatum

L., e em decorrência disso o seu emprego tem aumentado, logo é de extrema importância

ampliar ainda mais as pesquisas, para averiguar também, se ela é capaz de interferir nos

exames em medicina nuclear, nas mais diversas formas, além de ser um potencial

radioprotetor.

19

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Coleta e identificação do material botânico

Amostra de Punica granatum L. foi coletada da região de Rio Doce, Olinda –

Pernambuco / Brasil, e encaminhada ao Herbário Geraldo Mariz, do Departamento de

Botânica, da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE, Brasil).

3.2 Preparação do extrato de Punica granatum L.

Para obtenção do extrato, utilizamos a polpa (parte comestível do fruto). O material

foi espremido e coado, dando origem ao suco, sem auxílio de solvente (Figura 4). Após o

processo o extrato foi liofilizado, resultando na produção de uma substância com aspecto

pilulado.

O conteúdo foi acondicionado em freezer à -20º C. O extrato aquoso da polpa foi

chamado de EAPPg (Extrato Aquoso da Polpa da Punica granatum L.).

Figura 4 – (A) Sementes de Punica granatum L. depois de retirada a polpa e (B) Suco da polpa, sem acréscimo de solvente.

20

3.3 Procedimento experimental

Foram selecionados camundongos machos albinos Swiss (mus musculus), com

aproximadamente 45 dias de nascidos e pesos entre 30 – 35 g. Todos foram adquiridos no

Biotério Aggeu Magalhães (Fiocruz), Recife. Noventa e um animais foram separados em

grupos de no máximo cinco e mantidos em gaiolas de polipropileno, em condições

controladas de iluminação (ciclo 12 horas claro/escuro) e temperatura (22 ± 2º C) e

receberam água ad libitum. O procedimento foi realizado de acordo com as normas

internacionais do Conselho do Laboratório de Animais Experimentais (ICLAS), em

seguida foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do

Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco (CEEA-UFPE).

3.3.1 Implantação da massa tumoral

O modelo experimental foi realizado a partir da obtenção do tumor Sarcoma 180

procedido do biotério do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de

Pernambuco.

O procedimento foi realizado de acordo com a técnica descrita por STOCK et al.

(1955) e modificada por KOMIYAMA (1992), que consistiu na aspiração do líquido ascítico

dos animais portadores de tumor maligno Sarcoma 180 e inoculado, um volume de 0,2 mL

com aproximadamente 106 células tumorais por mL, em animais receptores por via subcutânea

em região axilar. O número e a viabilidade das células foram determinados através da

utilização de trypan, em câmara hemocitométrica de Neubauer. O tratamento com o EAPPg

foi iniciado 48 horas após inoculação do tumor.

3.3.2 Atividade antitumoral

Nesta fase experimental o procedimento foi dividido em três etapas (grupo 1, grupo 2 e

grupo 3). Na primeira etapa (grupo 1), que foi preliminar, foram empregados seis animais,

21

divididos em dois sub-grupos de três animais, controle (TS1) e Tratado (TT1). Na segunda

etapa (grupo 2) foram utilizados 10 animais, cinco controles (TS2) e cinco tratados (TT2). Na

terceira etapa (grupo 3) foram utilizados 15 animais, divididos em três sub-grupos com cinco

animais cada, um grupo controle (STS) e dois tratados (TTS e TTT).

Na primeira e segunda etapa (grupos 1 e 2), que foram semelhantes, o tratamento foi

iniciado após 48 h da implantação do tumor, e se estendeu durante oito dias. Para os sub-

grupos controle (TS1 e TS2) foi administrado 0,5 mL de solução salina a 0,9 % por via intra-

gástrica (gavagem). Aos sub-grupos tratados (TT1 e TT2) foi administrado 0,5 mL do extrato,

correspondente a 100 mg/kg, com via de administração semelhante a do controle.

Na terceira etapa (grupo 3), o EAPPg foi administrado previamente ao implante do

tumor sarcoma 180 durante quatro dias aos dois sub-grupos tratados (TTS e TTT). Após

quarenta e oito horas da indução tumoral, ao sub-grupo TTS foi administrado solução salina a

0,9 %, enquanto o sub-grupo TTT continuou o tratamento com o extrato (100 mg/kg), durante

oito dias consecutivos. O sub-grupo controle STS recebeu salina a 0,9 % por quatro dias

previamente ao implante e oito dias após 48 horas do implante. Nesta etapa todas as

administrações foram realizadas por via intra-gástrica (gavagem).

Ao término do tratamento, os animais foram pesados e sacrificados rapidamente. Em

seguida os tumores foram extirpados e a inibição tumoral foi calculada de acordo com a

fórmula preconizada (MACHON et al., 1981)

Onde:

TWI% = Percentagem de inibição tumoral

C = Média dos pesos dos tumores dos animais do grupo controle

T = Média dos pesos dos tumores dos animais do grupo tratado.

3.3.3 Biodistribuição do pertecnetato de sódio (Na 99mTcO4)

Para o estudo da biodistribuição, previamente os animais foram divididos em quatro

grupos (A, B, C e D), que tiveram tratamentos diferenciados. O grupo A corresponde aos

100C

TC%TWI ⋅

−=

22

animais sadios, ou seja, sem tumor, que foram divididos em dois grupos: controle A (cinco

animais) e tratado A (cinco animais). O grupo controle A, recebeu apenas solução salina

0,9 %, por via intra-gástrica (gavagem), durante oito dias, enquanto o grupo tratado A

recebeu o EAPPg pelo mesmo período. O grupo B reuniu os animais portadores do

sarcoma 180, que foram divididos grupos controle B (cinco animais) e tratado B (cinco

animais), que 48 horas após a indução do tumor, foram tratados de forma semelhante ao

grupo A. O grupo C (ou TAT) e D (ou TADT) ocorreram concomitantemente, utilizando

apenas um grupo controle (cinco animais), um grupo tratado C (5 animais) e um grupo

tratado D (5 animais). O grupo controle, recebeu solução salina 0,9 % por quatro dias

consecutivos, no quinto dia teve a indução tumoral realizada, e 48 horas após a indução

continuou a receber solução salina 0,9 % por mais oito dias. O grupo tratado C, recebeu o

EAPPg, por via intra-gástrica (gavagem), por quatro dias antes da indução tumoral, e 48

horas após, ficou recebendo apenas a solução salina 0,9 % pelos oito dias seguintes. E o

grupo tratado D, recebeu o EAPPg, via oral, por quatro dias antes da indução tumoral, e 48

horas após, voltou a receber o EAPPg pelos oito dias seguintes. A distribuição dos grupos

pode ser visualizada na Tabela 1.

Tabela 1 – Determinação dos grupos de animais utilizados no estudo da biodistribuição do

Na 99mTcO4.

Grupo Indução tumoral

Tratamento Número de Animais

Controle (Salina 0,9 %)

Tratado (EAPPg)

A (Figura 5)

Não 8 dias consecutivos 5 5

B (Figura 6)

Sim 8 dias consecutivos - 48 h após a indução tumoral

5 5

C (Figura 7)

Sim 4 dias consecutivos antes da indução tumoral

5 5

D (Figura 8)

Sim 4 dias consecutivos antes da

indução e 8 dias consecutivos após a indução tumoral

* 5

* Mesmo grupo de animais controle do grupo C.

23

No estudo da biodistribuição foram empregados o radioisótopo na forma de

pertecnetato de sódio (Na 99mTcO4) eluído em solução de cloreto de sódio 0,9 % a partir

do gerador 99Mo/99mTc do Hospital das Clínicas de Pernambuco, produzido no centro de

radiofarmácia do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN/CNEN) de São

Paulo, Brasil. A atividade administrada inicial foi de 10 µCi (ou 0,37 MBq).

A biodistribuição foi realizada em todos os Grupos (A, B, C e D), um dia após o

término do tratamento, onde todos os animais foram pesados, 0,1 µL do pertecnetato de

sódio (Na 99mTcO4) injetado pela veia caudal e os animais sacrificados 30 minutos após a

administração do radioisótopo. A escolha desse tempo está em concordância com a

maioria dos trabalhos que envolvem a biodistribuição do Na 99mTcO4 (MATTOS et al.,

2000; VALENCA et al., 2005; CHACON et al., 2007), tendo em vista que é suficiente

para que o Na 99mTcO4 alcance e se concentre nos órgão pelos quais ele tem afinidade.

Após o sacrifício, os tecidos e órgãos retirados foram: coração, pulmão, pâncreas,

estômago, fígado, baço, intestino grosso e delgado, rins, músculo, osso, cérebro e tireóide,

que foram pesados, e em seguida realizadas as leituras no contador gama modelo COBRA

II – AUTO GAMMA (PACKARD – A, Canberra Company), do Laboratório de

Endocrinologia e Metabolismo, do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFPE,

para obtenção das contagens por minuto (cpm) da atividade radioativa. Os resultados

foram analisados por meio do cálculo da contagem radioativa total injetada por animal

(CTI), em porcentagem.

Os esquemas que demonstram as etapas da biodistribuição do pertecnetato de

sódio (Na 99mTcO4) nos quatro grupos podem ser visualizados nas Figuras 5, 6, 7 e 8.

24

Figura 5 – Passos para estudo da biodistribuição do Na 99mTcO4 do grupo A (animais sem tumor) tratados com a Punica granatum L. após a indução tumoral por um período de 8 dias, antes da realização da biodistribuição.

Controle (Gavagem) Salina 0,9 %

Tratado (Gavagem) EAPPg 100 mg/mL

Grupo A

8 dias 8 dias

24 horas

99mTcO4Na (0,37 MBq) Veia caudal

30 minutos

Sacrifício, retirada e pesagem dos órgãos Contagem da radiação

25

Figura 6 – Passos para o estudo da biodistribuição do Na 99mTcO4 do grupo B (animais com tumor) tratados com a Punica granatum L. após a indução tumoral por um período de 8 dias, antes da realização da biodistribuição.

Controle (Gavagem) Salina 0,9 %

Tratado (Gavagem) EAPPg 100 mg/mL

Grupo B

8 dias 8 dias

24 horas

99mTcO4Na (0,37 MBq) Veia caudal

30 minutos

Sacrifício, retirada e pesagem dos órgãos Contagem da radiação

Indução Tumoral

48 horas

26

Figura 7 – Passos para o estudo da biodistribuição do Na 99mTcO4 do grupo C (animais com tumor) tratados antes da indução tumoral por um período de 4 dias com a Punica

granatum L., e após a indução e antes da realização da biodistribuição, receberam salina por 8 dias.

Indução Tumoral no 5º dia

Grupo C

48 horas

24 horas

99mTcO4Na (0,37 MBq) Veia caudal

30 minutos

Sacrifício, retirada e pesagem dos órgãos Contagem da radiação

Tratado (Gavagem) EAPPg 100 mg/mL

4 dias

Salina 0,9 %

8 dias

27

Figura 8 – Passos para o estudo da biodistribuição do Na 99mTcO4 do grupo D (animais com tumor) tratados antes da indução tumoral por um período de 4 dias com a Punica

granatum L., e após a indução e antes da realização da biodistribuição, continuaram o tratamento por 8 dias. Os animais controle receberam salina durante o mesmo período de tempo dos tratados.

Controle (Gavagem) Salina 0,9 %

Tratado (Gavagem) EAPPg 100 mg/mL

Grupo D

8 dias 8 dias

24 horas

99mTcO4Na (0,37 MBq) Veia caudal

30 minutos

Sacrifício, retirada e pesagem dos órgãos Contagem da radiação

Indução Tumoral no 5º dia

48 horas

Controle (Gavagem) Salina 0,9 %

Tratado (Gavagem) EAPPg 100 mg/mL

4 dias 4 dias

28

3.3.4 Atividade antiinflamatória

A verificação da atividade antiinflamatória das doses administradas foi realizada

empregando-se um total de 25 animais, sendo 2 grupos controles (CP – controle positivo e

CN – controle negativo) e 3 grupos tratados (T1 – com 50 mg/kg de EAPPg, T2 – com

100 mg/kg de EAPPg e T3 – com 200 mg/kg de EAPPg).

Para induzir a reação inflamatória utilizou-se 0,1 mL de solução aquosa de

carragenina a 1 %, injetado na pata trazeira esquerda de cada animal. Após um período de

30 min todos os grupos foram submetidos ao seguinte tratamento: grupo CN recebeu 0,5

mL de solução salina 0,9 %, grupo CP recebeu 0,5 mL de AAS com dose equivalente a

250 mg/kg. Os animais tratados com EAPPg receberam 0,5 mL do extrato, seguindo a

ordem e a concentração do extrato já apresentada acima.

Decorridas 4 horas da administração das drogas para tratamento, os animais foram

anestesiados e sacrificados em dose excessiva de anestésico, para que suas patas fossem

retiradas e posteriormente pesadas, para comparação da capacidade de redução do

processo inflamatório (LEVY, 1969; SRIVASTAVA et al., 1987).

3.3.5 Irradiação dos animais

A irradiação foi realizada no Instituto de Radioterapia Waldemir Miranda

(IRWAM), Recife - PE. Foram empregados 25 animais, divididos em três grupos. Grupo

Controle S (5 animais), que corresponde aos animais que receberam apenas salina durante

o período concomitante ao tratamento com o EAPPg, grupo controle SI (10 animais), que

recebeu salina por 8 dias e foi irradiado, e grupo tratado TI (10 animais), que recebeu o

tratamento com EAPPg por 8 dias consecutivos e foi irradiado. A irradiação ocorreu 24

horas após a última administração.

Para irradiação, os animais foram colocados em uma caixa acrílica com dimensões

de 35 cm x 35 cm e tampa apropriada, para imobilização dos animais durante a exposição

(Figura 9), em seguida foram colocados na mesa para proceder a irradiação. Os vinte

animais dos grupos SI e TI foram irradiados simultaneamente.

29

Figura 9 – Forma de imobilização dos animais em caixa acrílica. A seta aponta para a tampa da caixa.

O campo de irradiação foi de 35 cm X 35 cm, e 2 cm de profundidade (Figura

10a). A dose foi administrada com o equipamento em duas posições: superior, fornecendo

uma dose de 5 Gy (Figura 10b), e inferior acrescentando mais 5 Gy (Figura 10c). Desta

forma, os animais foram irradiados de corpo inteiro com uma dose de 10 Gy de radiação

gama de 60Co, fonte convencionalmente empregada nos processos de radioterapia, por

possuir meia-vida física de 5,3 anos, e emitir radiações gama em cascata de 1,17 e 1,33

MeV.

A distância focal correspondeu a 80 cm da fonte de irradiação que apresentava taxa

de dose de 192,3 cGy/min. O tempo de irradiação (T) foi de 2,60 minutos em cada

momento de irradiação, e foi obtido a partir da fórmula:

30

� =500 ���

179,32 × 0,984 × 1,091≅ 2,60 ���

Depois de 48 horas após a irradiação, os animais foram sacrificados em dose

excessiva de anestésico e o seu sangue retirado para avaliação da glutationa reduzida

(GSH).

Figura 10 – Imagens da irradiação dos animais. a) Profuntidade da irradiação determinada por laser. b) Irradiação superior. c) Irradiação inferior.

Fator de eficiência para isocentro à 80 cm

Fator de conversão para profundidade

Fator de conversão para área de 35 cm X 35 cm

b

a

c

3.3.6 Ação radioprotetora do

Na ação radioprotetora do EAP

(GSH), a qual foi analisada empregando um Kit de avaliação colorimétrica da OXFORD

BIOMEDICAL RESEARCH e hemácias lisadas.

Para lise das hemácias, foi utilizado 500 µL de sangue total

irradiado, os quais foram centrifugado

um deles foi descartado e as hemácias foram

metafosfórico (MPA) a 4º C.

3000 g a 4º C por 10 minutos. O sobrenadante foi

11 temos um esquema das etapas dessa fase.

Figura 11 – Esquema para lise das hemácias e obtenção do material para análise da GSH.

500 µL de sangue total

Sobrenadante para análise

Ação radioprotetora do extrato aquoso da polpa da Punica granatum

ação radioprotetora do EAPPg foi usada a dosagem da glutationa reduzida

foi analisada empregando um Kit de avaliação colorimétrica da OXFORD

BIOMEDICAL RESEARCH e hemácias lisadas.

Para lise das hemácias, foi utilizado 500 µL de sangue total

centrifugados a 2500 g a 4º C por 5 minutos. O plasma

foi descartado e as hemácias foram resuspendidas em

A) a 4º C. Em seguida foi realizada homogeneização e

3000 g a 4º C por 10 minutos. O sobrenadante foi utilizado na análise da GSH

temos um esquema das etapas dessa fase.

Esquema para lise das hemácias e obtenção do material para análise da GSH.

Lise das Hemácias

Centrifuga 2500 g a 4º C por 5 min

Sobrenadante para análise

Centrifuga 3000 g a 4º C por 10 min

31

Punica granatum L. (EAPPg)

a dosagem da glutationa reduzida

foi analisada empregando um Kit de avaliação colorimétrica da OXFORD

Para lise das hemácias, foi utilizado 500 µL de sangue total de cada animal

a 2500 g a 4º C por 5 minutos. O plasma de cada

2 mL de ácido

homogeneização e centrifugação a

da GSH. Na Figura

Esquema para lise das hemácias e obtenção do material para análise da GSH.

Descarta o plasma

Adiciona 2 mL de MPA

A quantificação da

que descreve os seguintes passos:

substituição (tioéteres) entre um reagente patenteado do Kit, chamado de

(4-cloro-1-metil-7-trifluorometil

Na segunda etapa ocorre a reação de

reagente 2 – R2 (30 % NaOH), que

(tioéter) obtido com GSH em uma tiona cromofórica que tem absorbância máxima no

comprimento de onda de 400 nm.

Para análise das amostras

distintas de GSH. Na determinação da GSH das amostras foi utiliza

de potássio, contendo ácido dietilenotriamina pentacético

Em cada amostra foi utilizado 850 µL do tampão, 50 µL da amostra, e 50 µL de

R1. A mistura foi homogeneizada, então recebeu o R2, seguindo uma no

homogeneização, depois se incubou

protegida da luz, em seguida

12).

Figura

850 µL do tampão 50 µL da amostra

50 µL do R1

Leitura a 400 nm

GSH foi realizado segundo o método de ANDERSON (1989),

que descreve os seguintes passos: na primeira etapa temos a formação de produtos de

entre um reagente patenteado do Kit, chamado de

trifluorometil-quinolinium metilsulfato) e o GSH presente na amostra.

Na segunda etapa ocorre a reação de β-eliminação em meio alcalino

% NaOH), que transforma especificamente o produto de substituição

(tioéter) obtido com GSH em uma tiona cromofórica que tem absorbância máxima no

comprimento de onda de 400 nm.

das amostras foi obtido uma curva padrão com cinco

Na determinação da GSH das amostras foi utilizado um tampão (fosfato

de potássio, contendo ácido dietilenotriamina pentacético – DTPA e lubrol)

cada amostra foi utilizado 850 µL do tampão, 50 µL da amostra, e 50 µL de

R1. A mistura foi homogeneizada, então recebeu o R2, seguindo uma no

homogeneização, depois se incubou a mistura a 25 ± 3º C por 10 minutos, mantendo

em seguida efetuou-se a leitura no espectrofotômetro a 400 nm

Figura 12 - Esquema para determinação da GSH

Incubou a 25 ± 3º C10 minutos (Protegido da Luz)Leitura a 400 nm

Homogeneizou

Homogeneizou

Determinação da GSH

32

foi realizado segundo o método de ANDERSON (1989),

a primeira etapa temos a formação de produtos de

entre um reagente patenteado do Kit, chamado de reagente 1 - R1

quinolinium metilsulfato) e o GSH presente na amostra.

eliminação em meio alcalino mediada pelo

transforma especificamente o produto de substituição

(tioéter) obtido com GSH em uma tiona cromofórica que tem absorbância máxima no

obtido uma curva padrão com cinco concentrações

do um tampão (fosfato

DTPA e lubrol), o R1 e o R2.

cada amostra foi utilizado 850 µL do tampão, 50 µL da amostra, e 50 µL de

R1. A mistura foi homogeneizada, então recebeu o R2, seguindo uma nova

a mistura a 25 ± 3º C por 10 minutos, mantendo-a

a leitura no espectrofotômetro a 400 nm (Figura

50 µL do R2

Incubou a 25 ± 3º C 10 minutos (Protegido da Luz)

Homogeneizou

33

3.4 Análise estatística

Os dados obtidos neste trabalho foram analisados por meio do Teste “t” de Student

para dados pareados, identificado como teste bi-caudado, além dos cálculos da média e do

desvio padrão das amostras estudadas. O nível de significância foi menor que 5 % (p <

0,05). E o programa computacional utilizado foi o Microsoft Office Excel 2007.

34

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

As etapas executadas para obtenção dos dados, que expressam a forma de atuação

do extrato aquoso da polpa da Punica granatum L. (EAPPg) em diferentes ramos do

metabolismo biológico, encontram-se resumidos abaixo.

O estudo foi iniciado pela avaliação da atividade antitumoral e potencial

antiinflamatório, seguido pela observação da ação na biodistribuição do pertecnetato de

sódio (Na 99mTcO4), em animais sadios, e portadores de sarcoma 180, como agente

preventivo e terapêutico. E por fim foi avaliado o potencial radioprotetor, baseado na

análise da glutationa (GSH), após irradiação de corpo inteiro dos camundongos.

4.1 Ação antitumoral

A Figura 13 retrata a ação antitumoral do EAPPg. Na qual, camundongos tratados

com EAPPg na concentração de 100 mg/kg, após a indução do tumor (grupo 1),

apresentaram uma diminuição da massa tumoral. Estes resultados foram repetidos e

confirmados no grupo 2. Em seguida, o índice de inibição tumoral foi calculado para os

grupos 1 e 2, apresentando os valores de 67,9 % (p < 0,01) e 68,3 % (p < 0,05),

respectivamente.

Na Figura 14 é possível visualizar as massas tumorais retiradas dos camundongos

do grupo 1, controles (TS1) e tratados ( TT1), confirmando o índice de inibição tumoral

que o EAPPg foi capaz de apresentar.

Nesse primeiro experimento, os resultados obtidos das médias dos pesos dos

tumores, para os animais controles e tratados do grupo 1, foram respectivamente de 4,05 g

(± 0,52), e 1,30 g (± 0,72). Associando estes resultados com o índice de redução tumoral,

podemos observar que o EAPPg demonstrou atividade antitumoral quando administrado o

EAPPg após a indução tumoral.

Figura 13 – Ação antitumoral do EAPtratamento após indução tumoral redução significativa (* p < 0,01

Figura 14 – Imagens que tratados com o EAPPg (B)

A Figura 15 apresenta os resultados do grupo 3, e

tumores dos animais controle

e dos animais tratados antes e após a indução tumoral

experimento para avaliação da ação antitumoral como agente preventivo e terapêutico

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

Mas

sa d

os

tum

ore

s (g

)

A

Ação antitumoral do EAPPg na variação das massastratamento após indução tumoral (chamado grupo 1). O grupo EAPPg

* p < 0,01), quando comparado com o grupo controle

Imagens que apresentam tumores dos animais controle do grupo 1.

apresenta os resultados do grupo 3, e mostra a variação

tumores dos animais controle (STS), dos animais tratados antes da indução tumoral

e dos animais tratados antes e após a indução tumoral (TTT), que são r

ara avaliação da ação antitumoral como agente preventivo e terapêutico

Grupos

*

B

35

das massas dos tumores no Pg apresentou uma

), quando comparado com o grupo controle.

controle (A), e dos animais

mostra a variação das massas dos

, dos animais tratados antes da indução tumoral (TTS),

, que são resultados do

ara avaliação da ação antitumoral como agente preventivo e terapêutico. No

Controle

EAPPg

grupo STS foi observado valor médio de 5,84 g (± 1,27)

de 5,99 g (± 1,03), e no grupo

Figura 15 – Ação antitumoral do EAPtratamento antes e após indução tumoral tratado antes da indução tumoral (TTS) não apresentaram alterações significativas. Já o grupo tratado antes e após a indução tumoral, demonstrou uma redução significativa (* p < 0,01), quando comparado com o grupo controle (STS).

O EAPPg não demonstrou ação antitumoral preventiva, já que não houve diferença

significativa na redução do tumor dos animais t

indução tumoral (TTS), quando comparado

animais tratados com o EAP

tumoral foi de 65,5 %, com p < 0,01, demonstrando

grupos 1 e 2 na avaliação antitumoral.

A ação antitumoral da

diferentes hipóteses. KAWAII & LANSKY (2004)

do suco fresco e fermentado d

células HL-60 da leucemia promielocítica humana. Este

do fruto inteiro e da casca da

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Mas

sa d

os

Tu

mo

res

(g)

observado valor médio de 5,84 g (± 1,27), no grupo TTS

de 5,99 g (± 1,03), e no grupo TTT, tivemos o valor médio de 2,01 g (± 0,13).

Ação antitumoral do EAPPg na variação das massasapós indução tumoral (grupo 3). O grupo controle (STS) e o grupo

tratado antes da indução tumoral (TTS) não apresentaram alterações significativas. Já o ntes e após a indução tumoral, demonstrou uma redução significativa (* p <

0,01), quando comparado com o grupo controle (STS).

não demonstrou ação antitumoral preventiva, já que não houve diferença

na redução do tumor dos animais tratados com o EAPPg

quando comparado aos animais controle (STS)

animais tratados com o EAPPg antes e após a indução tumoral (TTT), o índice de inibição

tumoral foi de 65,5 %, com p < 0,01, demonstrando ação terapêutica se

na avaliação antitumoral.

A ação antitumoral da Punica granatum L. tem sido explicada por

KAWAII & LANSKY (2004) demonstraram que o extrato d

do suco fresco e fermentado do fruto inteiro era capaz de promover a diferenciação das

leucemia promielocítica humana. Este fato estimula a hipótese da ação

da Punica granatum L., como agente antiproliferativo

Grupos

*

36

TTS o valor médio foi

de 2,01 g (± 0,13).

das massas dos tumores no O grupo controle (STS) e o grupo

tratado antes da indução tumoral (TTS) não apresentaram alterações significativas. Já o ntes e após a indução tumoral, demonstrou uma redução significativa (* p <

não demonstrou ação antitumoral preventiva, já que não houve diferença

Pg apenas antes da

(STS). Contudo, nos

, o índice de inibição

ação terapêutica semelhante aos

tem sido explicada por meio de

straram que o extrato da casca e

era capaz de promover a diferenciação das

estimula a hipótese da ação

, como agente antiproliferativo. Todavia,

STS

TTS

TTT

37

a terapia por diferenciação é melhor conhecida em doenças hematológicas, mas os

tratamentos baseados na diferenciação são também aplicáveis à outros tipos de câncer.

Outra forma de ação pode ser atribuída ao efeito citotóxico da Punica granatum L.

sobre as células tumorais. Como avaliado em estudo realizado por OLIVEIRA et al. (2005)

que ao testar várias concentrações (0,39 a 50 mg/mL) do extrato alcoólico da planta em

cultura de células de tumor ascítico de Ehrlich, notou que as diversas concentrações

produziram um efeito citotóxico dose-dependente, onde a citotoxicidade é extrema nas

doses de 25 e 50 mg/mL, ocasionando 100 % de morte nas células tumorais em relação ao

controle, independente do período de incubação. Nas concentrações de 6,25 e 12,5 mg/mL,

após 24 horas também não ficou nenhuma célula viável. E mesmo empregando a menor

concentração, após 48 horas não havia mais nenhuma célula tumoral viva, demonstrando

assim ação antitumoral in vitro.

Partindo de outros estudos, em busca dos mecanismos de ação antitumoral da

Punica granatum L., chegamos a dois trabalhos com camundongos implantados com

linhagens celulares PC-3 de câncer de próstata, onde foi demonstrado que o extrato da

parte comestível do fruto inibiu o crescimento celular e induziu apoptose via modulação

das proteínas que regulam a apoptose (MALIK et al., 2005; MALIK; MUKHTAR, 2006).

Ainda em investigação adicional, PANTUCK et al. (2006), realizou uma triagem clínica

em 46 homens com câncer de próstata recorrente, onde 35 % dos pacientes mostraram um

significante decréscimo nos níveis séricos de PSA (antígeno prostático específico) durante

o tratamento com o suco da Punica granatum L. Estes resultados sugerem que a prevenção

na geração do óxido nítrico decorrente da ingestão dos polifenóis do suco,

significativamente estão correlacionados com os baixos valores de PSA, indicando

portanto que a Punica granatum L. pode afetar o câncer de próstata devido aos efeito

antiproliferativo, apoptótico, antioxidante e, possivelmente, antiinflamatório.

A ação terapêutica da polpa da Punica granatum L. pode ser decorrente da ação

citotóxica dos compostos presentes nela, mas pode estar ligada à interferência na

proliferação das células tumorais, bem como à ação sobre o ciclo celular, além de atuar

minimizando a invasão celular e angiogênese, resultando, então, na redução da massa

tumoral, o que corrobora com os dados da literatura. Todos estes aspectos podem estar

associados com a ação antiinflamatória e antioxidante da polpa.

4.2 Potencial antiinflamatório

Nesta etapa, se avaliou o efeito do EAP

inflamatório do edema de pata induzido por carraginina, usando o ácido acetil salicílico

(AAS) como controle positivo. A Figura

quatro horas de indução do edema de pata com carraginina nos animais tratados com o

extrato, em diferentes concentrações.

Figura 16 – Atividade antiinflamat(50, 100 e 200 mg/kg) apresentou uma similaridade na capacidade antiinflamatória quando comparado com o do ASS (antiinflamatório), com redução significativaporcentagem de inflamação

A atividade antiinflamatór

grupo controle (NaCl 0,9 %), com a resposta antiinflamatória sendo obtida pela diferença

dos dados encontrados nos demais grupos em relação ao grupo controle. Houve uma

redução significativa (p < 0,01) no

250 mg/kg de AAS. A administração do EAP

via oral (gavagem), promoveu uma redução significativa (p < 0,01) no edema de

resultados já equivalentes àquel

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

% d

e in

flam

ação

.2 Potencial antiinflamatório

avaliou o efeito do EAPPg sob diferentes concentrações no modelo

inflamatório do edema de pata induzido por carraginina, usando o ácido acetil salicílico

(AAS) como controle positivo. A Figura 16 apresenta o percentual de inflamação após

do edema de pata com carraginina nos animais tratados com o

extrato, em diferentes concentrações.

Atividade antiinflamatória do EAPPg. O EAPPg em todas as concentrações (50, 100 e 200 mg/kg) apresentou uma similaridade na capacidade antiinflamatória quando comparado com o do ASS (antiinflamatório), com redução significativaporcentagem de inflamação.

A atividade antiinflamatória foi avaliada considerando 100 % de inflamação no

grupo controle (NaCl 0,9 %), com a resposta antiinflamatória sendo obtida pela diferença

dos dados encontrados nos demais grupos em relação ao grupo controle. Houve uma

redução significativa (p < 0,01) no edema de pata (29,1 %) induzida pela administração de

AAS. A administração do EAPPg numa concentração de 50 mg/kg, usando a

via oral (gavagem), promoveu uma redução significativa (p < 0,01) no edema de

resultados já equivalentes àqueles promovidos pelo controle positivo.

Tipos de Tratamento

Salina

ASS

EAPPg 50 mg/kg

EAPPg 100 mg/kg

EAPPg 200 mg/kg

* * * *

38

sob diferentes concentrações no modelo

inflamatório do edema de pata induzido por carraginina, usando o ácido acetil salicílico

apresenta o percentual de inflamação após

do edema de pata com carraginina nos animais tratados com o

em todas as concentrações (50, 100 e 200 mg/kg) apresentou uma similaridade na capacidade antiinflamatória quando comparado com o do ASS (antiinflamatório), com redução significativa (* p < 0,01) da

ia foi avaliada considerando 100 % de inflamação no

grupo controle (NaCl 0,9 %), com a resposta antiinflamatória sendo obtida pela diferença

dos dados encontrados nos demais grupos em relação ao grupo controle. Houve uma

edema de pata (29,1 %) induzida pela administração de

numa concentração de 50 mg/kg, usando a

via oral (gavagem), promoveu uma redução significativa (p < 0,01) no edema de 31,5 %,

Salina

ASS

EAPPg 50 mg/kg

EAPPg 100 mg/kg

EAPPg 200 mg/kg

39

Neste contexto, quando os resultados obtidos com a administração do extrato foram

comparados aos dados em relação à administração do ácido acetil salicílico (AAS), se

observa que o EAPPg apresenta uma tendência de proporcionar uma atividade

antiinflamatória levemente maior, com o aumento da concentração. Contudo, não houve

diferença significativa.

O edema de pata induzido pela carraginina tem sido comumente utilizado como um

modelo experimental animal para inflamação aguda, que se acredita ser bifásica. A fase

que compreende as duas primeiras horas do modelo com carraginina é provavelmente

mediada por histamina, serotonina e aumento na síntese de prostaglandinas nos tecidos

afetados. A fase seguinte é provida pela liberação de prostaglandina e mediada por

bradicidinas, leucotrienos e células polimorfonucleares, produzidas por macrófagos

teciduais (DONGMO et al., 2005).

A atividade inibitória do EAPPg após quatro horas da indução do edema de pata, na

segunda fase do modelo, não se mostrou aparentemente dose-dependente. Ao se observar a

curva dose-resposta (Figura 17), a concentração de 200 mg/kg deflagrou uma redução

maior, mas não significativa (p > 0,05). Os valores de inibição do edema do EAPPg nas

concentrações de 50 mg/kg, 100 mg/kg e 200 mg/kg, foram respectivamente 31,5 % (±

8,1), 30,8 % (± 6,6) e 40,9 % (± 9,3). Estes resultados estimulam estudos com

concentrações superiores, para determinar o aspecto dose-dependente.

Figura 17 – Curva dose-resposta a porcentagem de inibição do edema de pata causado pela carraginina.

Sabe-se que o extrato da

inflamatório, inibindo a lipoxigenase

pró-inflamatórios (SCHUBERT et al., 1999; AFAQ et al., 2005

que a inibição da COX por drogas antiinflamatórias não esteróides convencionais podem

afetar de forma adversa a função cardiov

(PGI2) (GROSSER et al., 2006)

esta verdade, quando promove a expressão de PGI

após o seu consumo (POLAGRUTO et al., 2003)

Neste trabalho, quando da administração do extrato da polpa da

L., observou-se uma redução

que essa redução se deve a inibição da LOX e COX,

ácido aracdônico. Contudo, como a

expressão de prostaciclinas

do extrato não tenha sido expressivo em reduzir o proces

não há dados experimentais que permitam relacionar este aspecto.

para o fato de que a Punica granatum

estudada em relação a sua capacidade radiomodifi

0

10

20

30

40

50

60

-50 0

% i

nib

içã

o d

o e

de

ma

de

pa

ta

resposta inflamatória. Relacionando a concentração (mg/kg) com a porcentagem de inibição do edema de pata causado pela carraginina.

se que o extrato da Punica granatum L. é capaz de interferir no processo

inflamatório, inibindo a lipoxigenase (LOX) e a cicloxigenase (COX), que são mediadores

(SCHUBERT et al., 1999; AFAQ et al., 2005; LANSKY et al., 2005

que a inibição da COX por drogas antiinflamatórias não esteróides convencionais podem

afetar de forma adversa a função cardiovascular, devido à supressão de prostraciclina

) (GROSSER et al., 2006). Mas, o suco da polpa da Punica granatum

esta verdade, quando promove a expressão de PGI2 em humanos, 20 minutos e seis horas

(POLAGRUTO et al., 2003).

Neste trabalho, quando da administração do extrato da polpa da

se uma redução no processo inflamatório causado pela carragenina.

deve a inibição da LOX e COX, interferindo, desse modo

Contudo, como a Punica granatum L. também pode estar promovendo a

ciclinas, esta pode ser a razão pela qual o aumento nas concentrações

expressivo em reduzir o processo inflamatório. No entanto, ainda

não há dados experimentais que permitam relacionar este aspecto. Estes

Punica granatum L. interfere no metabolismo celular

em relação a sua capacidade radiomodificadora.

50 100 150 200

Concentração (mg/kg)

40

Relacionando a concentração (mg/kg) com

é capaz de interferir no processo

, que são mediadores

; LANSKY et al., 2005). E

que a inibição da COX por drogas antiinflamatórias não esteróides convencionais podem

supressão de prostraciclina

Punica granatum L. se opõe a

em humanos, 20 minutos e seis horas

Neste trabalho, quando da administração do extrato da polpa da Punica granatum

atório causado pela carragenina. Sugere-se

do, desse modo no ciclo do

também pode estar promovendo a

, esta pode ser a razão pela qual o aumento nas concentrações

so inflamatório. No entanto, ainda

Estes dados apontam

interfere no metabolismo celular, logo deve ser

250

41

4.3 Ação do extrato da polpa de Punica granatum L. na Biodistribuição

Na avaliação do comportamento radiomodificador foi realizada a técnica de

biodistribuição, com intuito de estudar o comportamento radiomodificador do EAPPg em

animais sem tumor e com tumor (sarcoma 180), avaliando também como o EAPPg

influencia na distribuição do radioisótopo, dependendo da forma de administração, ou seja,

na administração antes da indução tumoral, e antes e após a indução tumoral. O que

permite verificar a ação do extrato quando utilizado preventivamente, e terapeuticamente.

A Tabela 2 apresenta os resultados obtidos no estudo da biodistribuição com

pertecnetato de sódio (Na 99mTcO4), dos animais normais, ou seja, sem tumor, chamados de

grupo A, que foram tratados por oito dias. Os animais controle receberam apenas solução

salina (NaCl 0,9 %), e os animais tratados receberam o EAPPg.

Tabela 2 – Biodistribuição nos animais do grupo A.

Órgão Controle (Salina 0,9 %)

(% Captação/g)

Tratado (EAPPg)

(% Captação/g)

Pulmão 0,58 (± 0,05) 0,55 (± 0,04)

Pâncreas 0,28 (± 0,02) 0,24 (± 0,03)

Intestino delgado 0,25 (± 0,05) 0,36 (± 0,14)

Intestino grosso 0,25 (± 0,06) 0,15 (± 0,03) *

Baço 0,32 (± 0,01) 0,28 (± 0,06)

Rins 0,42 (± 0,05) 0,49 (± 0,04)

Coração 0,28 (± 0,03) 0,27 (± 0,02)

Fígado 0,53 (± 0,03) 0,51 (± 0,04)

Músculo 0,55 (± 0,09) 0,52 (± 0,12)

Osso 1,11 (± 0,15) 0,90 (± 0,22)

Cérebro 0,25 (± 0,04) 0,21 (± 0,06)

Estômago 5,35 (± 0,6) 2,03 (± 0,66) **

Tireóide 0,63 (± 0,14) 3,17 (± 0,81) *

Resultados expressos em % captação/g de tecido ± DP * p < 0,05 ** p < 0,01

42

Os valores apresentados na Tabela 2 demonstram que houve redução significativa

no intestino grosso (p < 0,05) e estômago (p < 0,01), e um aumento significativo na

porcentagem de captação na tireóide. Nas Figuras 19 e 20 (apêndice), é possível observar

mais detalhadamente estas alterações.

A Tabela 3 apresenta os resultados obtidos no estudo da biodistribuição do grupo B,

onde todos os animais tiveram o sarcoma 180 implantado na axila direita, e apenas depois

de 48 horas iniciaram o tratamento. O grupo controle só recebeu solução salina (NaCl 0,9

%), e o grupo tratado recebeu o EAPPg a 100 mg/kg. Tanto os animais controle quanto os

animais tratados, foram submetidos a administração via oral (gavagem), por oito dias.

Tabela 3 - Biodistribuição nos animais do grupo B

Órgão Controle (Salina 0,9 %)

(% Captação/g)

Tratado (EAPPg)

(% Captação/g)

Pulmão 2,8 (± 0,4) 1,9 (± 0,29) **

Pâncreas 1,5 (± 0,08) 1,2 (± 0,2) *

Intestino delgado 2,5 (± 0,7) 0,8 (± 0,16)

Intestino grosso 1,3 (± 0,3) 0,7 (± 0,17) *

Baço 1,3 (± 0,1) 0,8 (± 0,09) **

Rins 2,7 (± 0,3) 2,1 (± 0,2) **

Coração 1,8 (± 0,3) 1,3 (± 0,3) *

Fígado 2,8 (± 0,3) 1,2 (± 0,3) **

Músculo 0,5 (± 0,09) 0,5 (± 0,1)

Osso 1,1 (± 0,1) 0,9 (± 0,2)

Cérebro 0,2 (± 0,04) 0,2 (± 0,05)

Estômago 18,0 (± 3,9) 2,8 (± 0,4) *

Tireóde 4,6 (± 2,7) 9,8 (± 1,9)

Tumor 2,0 (± 0,3) 1,2 (± 0,25) *

Resultados expressos em % captação/g de tecido ± DP * p < 0,05 ** p < 0,01

43

Ao analisar os valores apresentados na Tabela 3, se pode observar que nos animais

sob indução tumoral (grupo B), o EAPPg apresentou uma capacidade maior em modificar

a biodistribuição do pertecnetato de sódio (Na 99mTcO4), em quase todos os órgãos.

Reduzindo a porcentagem de captação significativamente no pulmão, pâncreas, intestino

grosso, baço, rins, coração, fígado, estômago e no tumor. Estas modificações podem ser

melhor visualizadas nas Figuras 21 e 22 (apêndice).

Na avaliação dos animais dos grupos C e D, temos a Tabela 4, que mostra os

resultados obtidos após a biodistribuição do pertecnetato de sódio (Na 99mTcO4), nos

animais que receberam tratamento antes da indução tumoral (grupo C ou TAT), e naqueles

que foram tratados antes e após a indução tumoral (grupo D ou TADT). Os animais

controle receberam salina (NaCl 0,9 %) quatro dias antes da indução, e mais oito dias após

48 horas da indução tumoral, conforme esquema da Figura 8, que se encontra disponível

no item Material e Métodos.

Os resultados obtidos demonstram que os animais que receberam o tratamento de

forma preventiva (grupo C), não apresentaram modificações significativas, quando

comparados com o controle, na porcentagem de captação nos órgãos, com exceção do

músculo que teve a sua captação reduzida significativamente (p < 0,05). Já os animais que

receberam o tratamento preventivamente, mas continuaram com a ingestão do EAPPg após

a indução tumoral, de forma terapêutica (grupo D), apresentaram modificações na captação

de vários órgãos, elevando significativamente o percentual, no pulmão, pâncreas, coração,

estômago, tireóide e tumor. Ao comparar os resultados entre os grupos C e D, foi

verificado que ocorre um aumento significativo (p < 0,05) na captação no pâncreas,

coração, músculo, estômago, tireóide e tumor.

Para uma melhor percepção dos resultados associados, entre o grupo controle e os grupos

tratados C e D, podemos visualizar os resultados nas Figuras 23 e 24 (apêndice).

Todos os resultados obtidos das biodistribuições nos quatro grupos (Figuras 20, 22

e 24 no apêndice) foram validados pela presença da alta captação apresentada no estômago

e na tireóide, tendo em vista que essa é uma característica do 99mTc ao se distribuir no

organismo (CHACON et al., 2007; VALENCA et al., 2005).

44

Tabela 4 - Biodistribuição nos animais dos grupos C e D

Órgão Controle (Salina 0,9 %)

(% Captação/g)

Tratado C

(% Captação/g)

Tratado D

(% Captação/g)

Pulmão 0,46 (± 0,09) 0,62 (± 0,09) 1,3 (± 0,3) *

Pâncreas 0,32 (± 0,06) 0,31 (± 0,03) 0,62 (± 0,08) ** ♦

Intestino delgado 0,35 (± 0,04) 0,38 (± 0,05) 0,55 (± 0,09)

Intestino grosso 0,25 (± 0,04) 0,40 (± 0,1) 0,34 (± 0,1)

Baço 0,23 (± 0,02) 0,28 (± 0,03) 0,44 (± 0,18)

Rins 0,65 (± 0,09) 0,55 (± 0,05) 0,83 (± 0,2)

Coração 0,28 (± 0,04) 0,35 (± 0,05) 1,1 (± 0,2) * ♦

Fígado 0,37 (± 0,09) 0,50 (± 0,06) 0,78 (± 0,29)

Músculo 0,33 (± 0,06) 0,15 (± 0,008) * 0,25 (± 0,04) ♦

Osso 0,24 (± 0,07) 0,32 (± 0,01) 0,38 (± 0,1)

Cérebro 0,04 (± 0,01) 0,06 (± 0,02) 0,07 (± 0,03)

Estômago 2,86 (± 0,4) 4,3 (± 0,7) 17,6 (± 3,7) * ♦

Tireóde 7,7 (± 0,9) 5,8 (± 1,3) 14,6 (± 2,9) * ♦

Tumor 0,60 (± 0,06) 0,47 (± 0,15) 2,35 (± 0,5) * ♦

Resultados expressos em % captação/g de tecido ± DP. Tratado C, recebeu EAPPg quatro dias antes da indução tumoral. Tratado D, recebeu EAPPg quatro dias antes e oito dias após 48 horas da indução tumoral. * p < 0,05, quando comparado com o controle. ** p < 0,01, quando comparado com o controle. ♦ p < 0,05, quando comparado entre os grupos C e D.

O estudo da biodistribuição é essencial para um melhor entendimento dos

mecanismos que influenciem a imagem em medicina nuclear, devido a atividades

biológicas de substâncias naturais. É muito amplo o emprego de compostos derivados de

plantas nas mais diversas situações, como em casos patológicos, ou mesmo no consumo

alimentar rotineiro. A vincristina é um desses casos, já que tem sido utilizada em vários

protocolos quimioterápicos em oncologia. Ela é derivada de produtos naturais, mas

mostrou-se capaz de aumentar a captação do 99mTc-DMSA e do 99mTc-DTPA em vários

órgãos, enquanto diminuiu a captação do 99mTc-GHA. Esses resultados estimularam outros

estudos, tendo em vista, que existe a possibilidade que isso tenha ocorrido devido à ação

45

imunossupressora, terapêutica ou ainda por mudanças no mecanismo de metabolização

(MATTOS et al., 2000).

Informações relacionadas a interações entre radiofármacos com produtos naturais

são escassas. E o emprego de extratos vegetais pode alterar a marcação de constituintes

sanguíneos, possivelmente devido à presença de compostos antioxidantes, que podem gerar

mudanças na membrana plasmática e/ou competir com o tecnécio-99m pelo mesmo sítio

de ligação. Além disso, extratos vegetais podem gerar metabólitos capazes de promover

modificações morfológicas e/ou fisiológicas em órgãos, alterando a biodistribuição do

pertecnetato de sódio (Na 99mTcO4) em animais tratados (SOARES et al., 2006).

Dentre os estudos da biodistribuição do pertecnetato de sódio (Na99mTcO4)

visualizados neste trabalho, é possível identificar que os animais com sarcoma 180,

apresentaram o maior número de modificações na captação em vários órgãos. Nos animais

que iniciaram o tratamento após a implantação do tumor (grupo B), pode ser visualizada

uma redução significativa no pulmão, pâncreas, intestino grosso, baço, rins, coração,

fígado, estômago e no tumor. Isso pode ser devido a mudanças na aceleração do

metabolismo decorrente da presença de tecido tumoral. Mas, nos animais que receberam o

extrato antes da implantação do tumor, e após (grupo D), o comportamento foi

completamente diferente, levando ao aumento significativo da captação no pulmão,

pâncreas, coração, estômago, tireóide e no tumor. Tendo como possível razão a

modificação dos sítios de ligação pelo extrato (SOARES et al., 2006) antes da implantação,

que com a aceleração do metabolismo decorrente da presença do tumor, levou a

amplificação das modificações nos sítios, elevando assim a captação do pertecnetato de

sódio (Na 99mTcO4).

Outro possível mecanismo pelo qual ocorreu redução na captação do radioisótopo

no grupo B, pode ser ausência de absorção dos componentes do extrato nas células de

vários tecidos, antes da indução tumoral, logo, não houve influencia intracelular previa.

Então, a aceleração no metabolismo dos animais com tumor contribuiu para que ocorresse

uma rápida eliminação do 99mTc.

Nos animais do grupo C, a absorção dos componentes do extrato só ocorreu antes

da indução tumoral, e baseado nos resultados apresentados nas Figuras 23 e 24, é possível

supor que, a ação do extrato em modificar a resposta intracelular se deve ao consumo

46

contínuo. Fato este, observado também em relação à redução da massa tumoral (Figura

15).

Nos animais do grupo D, o extrato pôde modificar a resposta biológica por se

encontrar intracelularmente antes da indução tumoral, e permanecer agindo no

metabolismo celular mesmo após a indução. Isso repercutiu no aumento da captação em

grande parte dos órgãos estudados. Este mecanismo de ação está baseado no trabalho de

JARDINI et al. (2007), que em estudo realizado com células tumorais Caco-2,

provenientes de adenocarcinoma de cólon, demonstrou que os componentes do extrato da

Punica granatum L. são absorvidos por essas células, levando a alterações metabólicas.

Em estudo de perfusão cardíaca com SPECT de pacientes com doença coronária

que consumiu o suco da Punica granatum L. por três meses, SUMNER et al. (2005)

verificaram que houve melhora na perfusão miocárdica em 17 %, o que corrobora com o

nosso estudo, quando é possível observar que, onde o consumo do extrato foi mais

prolongado, ocorre aumento da captação no coração, como apresentado pelo grupo D.

A captação do radiofármaco depende do fluxo sanguíneo, perfusão tecidual,

permeabilidade capilar e capacidade de difusão (OLIVEIRA et al., 2006). E todas estas

características podem ser modificadas em razão da presença do sarcoma 180, por

compostos terapêuticos, ou ainda por substâncias naturais consumidas rotineiramente, que

podem atuar por mecanismos radioprotetores.

4.4 Avaliação da capacidade radioprotetora do extrato aquoso da polpa de Punica

granatum L. (EAPPg)

Na avaliação do efeito do EAPPg referente ao aspecto radioprotetor, foi medida a

concentração da glutationa reduzida (GSH), em hemácias lisadas.

A Figura 18 mostra a variação da GSH nos dois grupos experimentais e no

controle. No grupo controle foram observados valores médios de 89,7 µmol/L (± 4,9), e

nos grupos SI e TI valores na ordem de 40,1 µmol/L (± 6,7) e 68,5 µmol/L (± 1,9)

respectivamente.

Figura 18 – Variação da GSH em hemácias lEAPPg (grupo SI) apresenta uma redução significativa da concentração de GSH em µmol/L de proteínas (**p < 0,01irradiado, mas tratado com o EAPPg (grupo TI) sofreu uma redução significativa (**p < 0,01) da concentração de GSH em µmol/L de proteínas em relação ao controle, mas menor do que o grupo SI.

Ao analisar os valores obtidos foi possível observar que no grupo experimental SI

houve uma redução significativa (p < 0,01) de 55,3 % na GSH, contudo no grupo

experimental TI, apesar de apresentar também uma redução significativa

relação ao grupo controle, esta redução foi apenas de 23,6 %.

grupo SI com o grupo TI, foi verificado um au

de glutationa das hemácias, nos animais que receberam o EAP

Diversas espécies de plantas

examinadas com o objetivo de averiguar o potencial radioprotetor que elas são capazes de

apresentar, e muitas são aquelas que

provado ser de grande importância na busca por novos agentes que possam ser empregados

na proteção radiológica. Entre elas temos a

consumida diariamente no mundo inteiro como uma especiaria ou tempero. Existem muitas

demonstrações de que essa raiz possui diversas propriedades medicinais. No entanto,

referente à radioproteção, JAGETIA

gengibre aumenta os níveis de

capturar radicais livres in vitro

(IP) ou 250 mg/kg via oral do extrato hidroalcóolico de gengibre, uma vez por dia, durante

0

20

40

60

80

100

[GS

H]

µm

ol/L

pro

teín

as

Variação da GSH em hemácias lisadas. O grupo irradiado e não tratado com o (grupo SI) apresenta uma redução significativa da concentração de GSH em

**p < 0,01) quando comparado com o grupo controleirradiado, mas tratado com o EAPPg (grupo TI) sofreu uma redução significativa (**p <

entração de GSH em µmol/L de proteínas em relação ao controle, mas menor

Ao analisar os valores obtidos foi possível observar que no grupo experimental SI

houve uma redução significativa (p < 0,01) de 55,3 % na GSH, contudo no grupo

perimental TI, apesar de apresentar também uma redução significativa

relação ao grupo controle, esta redução foi apenas de 23,6 %. Relacionando, no entanto, o

grupo SI com o grupo TI, foi verificado um aumento significativo (p < 0,01)

de glutationa das hemácias, nos animais que receberam o EAPPg (grupo TI).

Diversas espécies de plantas, que são consumidas frequentemente,

examinadas com o objetivo de averiguar o potencial radioprotetor que elas são capazes de

e muitas são aquelas que, por diversos mecanismos ainda não elucidados, têm

provado ser de grande importância na busca por novos agentes que possam ser empregados

Entre elas temos a raiz de gengibre (Zingiber officinale

sumida diariamente no mundo inteiro como uma especiaria ou tempero. Existem muitas

demonstrações de que essa raiz possui diversas propriedades medicinais. No entanto,

referente à radioproteção, JAGETIA et al. (2004) conseguiram demonstrar que a raiz de

gibre aumenta os níveis de GSH, reduz a peroxidação lipídica in vivo

in vitro. E que a administração de 10 mg/kg via

(IP) ou 250 mg/kg via oral do extrato hidroalcóolico de gengibre, uma vez por dia, durante

Grupos

Grupo S

Grupo SI

Grupo TI

**

**

47

O grupo irradiado e não tratado com o (grupo SI) apresenta uma redução significativa da concentração de GSH em

) quando comparado com o grupo controle. Já o grupo irradiado, mas tratado com o EAPPg (grupo TI) sofreu uma redução significativa (**p <

entração de GSH em µmol/L de proteínas em relação ao controle, mas menor

Ao analisar os valores obtidos foi possível observar que no grupo experimental SI

houve uma redução significativa (p < 0,01) de 55,3 % na GSH, contudo no grupo

perimental TI, apesar de apresentar também uma redução significativa (p < 0,01) em

Relacionando, no entanto, o

mento significativo (p < 0,01) na quantidade

(grupo TI).

, que são consumidas frequentemente, têm sido

examinadas com o objetivo de averiguar o potencial radioprotetor que elas são capazes de

ainda não elucidados, têm

provado ser de grande importância na busca por novos agentes que possam ser empregados

Zingiber officinale) que é

sumida diariamente no mundo inteiro como uma especiaria ou tempero. Existem muitas

demonstrações de que essa raiz possui diversas propriedades medicinais. No entanto,

(2004) conseguiram demonstrar que a raiz de

in vivo e é capaz de

que a administração de 10 mg/kg via intra peritoneal

(IP) ou 250 mg/kg via oral do extrato hidroalcóolico de gengibre, uma vez por dia, durante

Grupo S

Grupo SI

Grupo TI

48

cinco dias consecutivos, foi capaz de proteger camundongos contras os danos decorrentes

da exposição à radiação ionizante, reduzindo a morte do tecido gastrointestinal e

hematopoiético com um fator de redução de dose de 1,15 (JAGETIA et al., 2003a).

A ação da polpa da Punica granatum L. em influenciar a expressão da GSH, no

presente trabalho, demonstrou que ela foi eficiente em aumentar a concentração de GSH

nas hemácias, comportando-se de forma semelhante à raiz de gengibre. Dessa maneira, é

possível supor que, similarmente, ela também seria capaz de reduzir os danos decorrentes

da exposição à radiação ionizante por mecanismos antioxidativos.

Neste contexto, o EAPPg, na concentração estudada pode ser utilizado como

radioprotetor, e permite extrapolar suas aplicações em diversas atividades de interesse

humano, como em uso de pacientes em radioterapia, uso como coadjuvante antioxidante

em cosméticos, tais como protetores solares. Dessa forma, este trabalho traz contribuições

a população e merece ser levado adiante para estabelecer novas aplicações deste extrato,

bem como promover um maior consumo do fruto.

49

5 CONCLUSÕES

O estudo do extrato da polpa da Punica granatum L. demonstrou que o mesmo

apresentou as seguintes propriedades:

� Apresenta atividade antitumoral, apenas quando consumido após a presença do

tumor, não influenciando quando ingerido de forma aguda e preventivamente.

� Demonstrou capacidade antiinflamatória quando aplicado ao modelo de edema de

pata induzido por carraginina, se comportando de forma semelhante nas

concentrações estudadas.

� Modificou a captação do 99mTc em vários órgãos, principalmente na presença do

sarcoma 180, e dependente da forma de administração, ou seja, como agente

preventivo (agudo) ou terapêutico (crônico).

� Elevou os níveis de GSH, após exposição à radiação ionizante, demonstrando

potencial capacidade radioprotetora.

Os dados acima mencionados permitem a afirmação que o extrato da polpa da

Punica granatum é capaz de alterar o comportamento biológico em animais sadios e com

tumor, por mecanismos antioxidativos, bem como por meio de alterações fisiológicas,

sendo o mesmo influenciado por mecanismos patológicos.

50

6 PERSPECTIVAS

Informações adquiridas durante a realização deste trabalho e no cotidiano

acadêmico permitem a proposição de outras pesquisas, num futuro próximo, para

caracterizar compostos de origem natural e sintética quanto ao seu aspecto

radiomodificador, e principalmente radioprotetor. Pretende-se ainda, durante o

desenvolvimento dos novos experimentos, utilizar o cálculo do fator de redução de dose,

técnicas biofísicas e de dosimetria biológica, além da busca constante pela elucidação dos

mecanismos de ação biológica. O intuito é dar continuidade às atividades que envolvam

ciência e biotecnologia, de maneira a estimular a pesquisa e proporcionar o conhecimento.

51

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AFAQ, F.; SALEEM, M.; KRUEGER, C. G.; REED, J. D.; MUKHTAR, H. Anthocyanin- and hydrolysable tannin-rich pomegranate fruit extract modulates MAPK and NF-kappaB pathways and inhibits skin tumorigenesis in CD-1 mice. International Journal of Cancer, v. 113, p. 423 – 433, 2005. AGRA, M. F.; FRANÇA, P. F.; BARBOSA-FILHO, J. M. Synopsis of the plants known as medicinal and poisonous in Northeast of Brazil. Rev. Bras. Farmacogn., v. 17, p. 114 – 140, 2007. AGRAWAL, P. K.; GOEL, H. C. Protective effect of RH-3 with special reference to radiation-induced micronuclei in mice bone marrow. Ind. J. Exp. Biol., v. 40, p. 525 – 530, 2002. ANDERSON, M. E. Enzymatic and chemical methods for the determination of glutathione. In: Glutathione: chemical, biochemical and medical aspects, Vol. A. DOLPHIN, D.; POULSON, R.; AVRAMOVIC, O. Eds., John Wiley and Sons, pp. 339 – 365, 1989. BAYNES, J. W.; DOMINICZAK, M. H. Bioquímica médica, 2ª edição, Elsevier, Rio de Janeiro, 2007, 716 p. BERNARDO-FILHO, M.; SANTOS-FILHO, S. D.; MOURA, E. G.; MAIWORM, A. I.; ORLANDO, M. M. C.; PENAS, M. E.; CARDOSO, V. N.; BERNARDO, L. C.; BRITO, L. C. Drug interaction with radiopharmaceuticals: a review. Braz. Arch. Biol. Technol., 48, 13 – 27, 2005. BUSHONG, S.C. Molecular and cellular radiobiology: in Radiologic science for tecnologists. 8ª Ed. Missouri, Elsevier Mosby, 2004, p. 503 – 515. CAPRILES, P. V. S. Z.; DIAS, A. P. M.; COSTA, T. E. M. M.; OLIVEIRA, M. B. N.; FARIA, M. V. C.; MOURA, E. G. Effect of eggplant (Solanum melongena) extract on the biodistribuition of technetium-99m and on the biodistribution of sodium pertechnetate in rats. Cell. Mol. Biol., v. 48, p. 771-776, 2002. CABALLERO, O.; PEÑA, B. R.; ZURCHER, J.; ORTÍN, J.; MARTÍNEZ, T. Actividad inhibitory de extractos del fruto de Punica granatum sobre cepas del virus de la gripe. Revista Cubana de Química XIII, v. 106, 2001.

52

CHACON, D. A.; ARAÚJO-FILHO, I.; VILLARIM-NETO, A.; RÊGO, A. C. M.; AZEVEDO, I. M.; BERNARDO-FILHO, M.; BRANDÃO-NETO, J.; MEDEIROS, A. C. Biodistribution of the radiopharmaceutical sodium pertechnetate (Na 99mTcO4) after massive small bowel resection in rats. Acta Cirúrgica Brasileira, v. 22, n. 6, p. 430 – 435, 2007.

CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J.; SNADER, K. M. Natural products in drug discovery and development. J. Nat. Prod., v. 60, p. 52 – 60, 1997. DONGMO, A. B.; NGUELEFACK, T.; LIACALLE-DUBOIS, M. A. Antinoceptive and anti-inflamatory activies of Acácia pennata wild (Mimosaceae). Journal of Ethnopharmacology, v. 98, p. 201 – 206, 2005. EMERIT, I.; OGANESIAN, N.; LEVY, A.; CERNJAVSKY, L.; SARKISIAN, T.; POGOSSIAN, A.; ASRIAN, K. Clastogenic factors in the plasma of Chernobyl recovery workers: Anticlastogenic effects of Ginkgo biloba extract. Free Radic. Biol. Med., v. 18, p. 985 – 991, 1995. FALCÃO, E. P. S. Novas pirimidinas: Síntese e avaliação de suas Propriedades Farmacológicas. 120 f, Tese (Doutorado em Ciências Biológicas). Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2003. FERREIRA, A. L. A.; MATSUBARA, L. S. Radicais livres: conceitos, doenças relacionadas, sistema de defesa e estresse oxidativo. Rev. Ass. Med. Brasil, v. 43, n. 1, p. 61 – 68, 1997. FUENTES, V. R.; EXPÓSITO, A. Las encuestas etnobotánicas sobre plantas medicinales en Cuba. Revista del Jardín Botánico Nacional, v. 16, p. 77 – 144, 1995. GANASOUNDARI, A.; UMA DEVI, P.; RAO, M. N. A. Protection against radiation-induced chromosome damage in mouse bone marrow by Ocimum sanctum. Mutat. Res., v. 373, p. 271 – 276, 1997. GOEL, H. C.; AGRAWALA, P. K.; PATHANIA, V.; MALHOTRA, N. Immunomodulatory and cytoprotective role of RP-1 in gamma-irradiated mice. Mol. Cell. Biochem., v. 254, p. 73 – 81, 2003. GOEL, H. C.; PRASAD, J.; SINGH, S.; SAGAR, R. K.; KUMAR, I. P.; SINHA, A. K. Radioprotection by a herbal preparation of Hippophae rhamnoides, RH-3, against wholw body tethal irradiation in mice. Phytomedicine, v. 9, p. 15 – 25, 2002a. GOEL, H. C.; KUMAR, S. S.; SHARMA, A. K. Effects of Podophyllum hexandrum on radiation-induced delay of postnatal appearance of reflexes and physiological markers in rats irradiated in utero. Phytomedicine, v. 9, p. 447 – 454, 2002b.

53

GOMES, M. L.; OLIVEIRA, M. B. N.; BERNARDO-FILHO, M. Drug interaction with radiopharmaceuticals: effect on the labeling of red blood cells with technetium-99m and on the bioavailability of radiopharmaceuticals. Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 45, p. 143 – 149, 2002. GROSSER, T.; FRIES, S.; FITZGERALD, G. A. Biological basis for the cardiovascular consequences of COX-2 inhibition: therapeutic challenges and opportunities. The Journal of Clinical Investigation, v. 116, p. 4 – 15, 2006. HANNEQUIN, D.; THIBERT, A.; VASCHALDE, Y. Development of a model to study the anti-oedema properties of Ginkgo biloba extract. Presse Med., v. 15, p. 1575 – 1576, 1986. HOLANDA, C. M. C. X.; OLIVEIRA, E. H.; ROCHA, L. G.; BARBOSA, V. S. A.; SPYRIDES, M. H. C.; ARAGÃO, C. F. S.; MEDEIROS, A. C. Effect of Paclitaxel (Taxol®) on the Biodistribution of Sodium Pertechnetate (Na99mTcO4) in Female Wistar Rats. Braz. Arch. Biol. Technol., v. 51, p. 191 – 196, 2008. JAGETIA, G. C. Radioprotective potential of plants and herbs against the effects of ionizing radiation. J. Clin. Biochem. Nutr., v. 40, p. 74 – 81, 2007. JAGETIA, G. C.; BALIGA, M. S. Influence of the leaf extract of Mentha arvensis Linn. (mint) on the survival of mice exposed to different doses of gamma radiation. Strahlenther Onkol., v. 178, p. 91 – 98, 2002b. JAGETIA, G. C.; BALIGA, M. S. Syzygium cumini (Jamun) reduces the radiation-induced DNA damage in the cultured human peripheral blood lymphocytes: a preliminary study. Toxicol. Lett., v. 132, p. 19 – 25, 2002a. JAGETIA, G. C.; BALIGA, M. S. The evaluation of the radioprotective effect of the leaf extract of Syzygium cumini (Jamun) in the mice exposed to lethal dose of radiation. Nahrung/Food, v. 47, p. 181 – 185, 2003. JAGETIA, G. C.; BALIGA, M. S.; VENKATESH, P. Influence of seed extract of Syzygium Cumini (Jamun) on mice exposed to different doses of gamma-radiation. Journal of Radiation Research, v. 46, n.1, p. 59 – 65, 2005. JAGETIA, G. C.; BALIGA, M. S.; VENKATESH, P. Ginger (Zingiber officinale Rosc.) a dietary supplement, protects mice against radiation-induced lethality: mechanism of action. Cancer Biother. Radiopharm., v. 19, p. 422 – 435, 2004. JAGETIA, G. C.; BALIGA, M. S.; VENKATESH, P.; ULLOOR, J. N. Influence of ginger rhizome (Zingiber officinale Rosc) on survival, glutathione and lipid peroxidation in mice after whole-bode exposure to gamma radiation. Radiat. Res., v. 160, p. 584 – 592, 2003a.

54

JAGETIA, G. C.; SHIRWAIKAR, A.; RAO, S. K.; BHILEGAONKAR, P. M. Evaluation of the radioprotective effect of Ageratum conyzoides linn. Extract in mice exposed to different doses of gamma radiation. J. Pharm. Pharmacol., v. 55, p. 1151 – 1158, 2003b. JARDINI, F. A.; PINTO, J. R.; MENDONÇA, R. M. Z.; MANCINI, D. A. P.; MANCINI-FILHO, J. Avaliação da atividade antioxidante do extrato hidroalcoólico da romã (Punica

granatum, L.) sobre células da linhagem Caco-2. Ciênc. Tecnol. Aliment., v. 27, p. 81 – 84, 2007. JURENKA, J. Therapeutic Applications of pomegranate (Punica granatum L.): uma revisão. Alternative Medicine Review, v. 13, n. 2, p. 128 – 144, 2008. KAWAII, S.; LANSKY, E. P. Differentiation-promoting activity of Pomegranate (Punica

granatum) fruit extracts in HL-60 human promyelocytic leukemia cells. J. Med. Food, v. 7, n. 1, p. 13 – 18, 2004. KIM, H.; CHAUDHURI, T. R.; BUSHSBAUM, D. J.; WANG, D.; ZINN, K. R. Single-Photon Emission Computed Tomography Imaging with a Humanized, Apoptosis-Inducing Antibody Targeting Human Death Receptor 5 in Pancreas and Breast Tumor Xenografts. Cancer Biology & Therapy, v. 6, n. 9, p. 1396 – 1402, 2007. KIM, S. H.; SON, C. H.; NAH, S. Y.; JO, S. K.; BYUN, M. W.; SHIN, D. H. Modification of radiation response in mice by Panax ginseng and diethyldithiocarbamate. In Vivo, v. 15, p. 407 – 411, 2001. KOMIYAMA, K.; FUNAYAMA, S. Antitumor agents. In: OMURA, S. (edt.). The search for bioactive compounds from microorganisms. New York: Spriger – Verlag, pp. 79 – 97, 1992. KUMAR, M.; SHARMA, M. K.; SAXENA, P. S.; KUMAR, A. Radioprotective effect of Panax ginseng on the phosphatases and lipid peroxidation level in testes of Swiss albino mice. Biol. Pharm. Bull., v. 26, p. 308 – 312, 2003. LAMAR, A. S.; COZZI, R.; CUNDARI, E.; FIORE, M.; RICORDY, R.; GENSABELLA, G.; DEGRASSI, F.; SALVIA, R. Extracto de frutos enteros de Punica granatum L. como agente protector del dano inducido por el peróxido de hidrogeno. Rev. Cubana Plant. Méd., v. 10, n. 2, 2005. LANSKY, E. P.; NEWMAN, R. A. Punica granatum (pomegranate) and its potential for prevention and treatment of inflammation and cancer. Journal of Ethnopharmacology, v. 109, p. 177 – 206, 2007. LANSKY, E.; SHUBERT, S.; NEEMAN, I. Pharmacological and therapeutic properties of pomegranate . In MELGAREJO-MORENO P. (ED.), MARTÍNEZ-NICOLÁS J. J. (ED.), LEE. T. K.; JOHNKE, R. M.; ALLISON, R. R.; O’BRIEN, K. F.; DOBBS-JR, L. Radioprotective potential of ginseng. Mutagenesis, v. 20, n. 4, p. 237 – 243, 2005.

55

LEI, F.; ZHANG, X.N.; WANG, W.; XING, D. M.; XIE, W. D.; SU, H.; DU, L. J. Evidence af anti-obesity effects of the pomegranate leaf extract in high-fat diet induced obese mice. International J. Obesity, v. 31, p. 1023 – 1029, 2007. LEVY, L. Carragenan paw edema in the mouse. Life Sci., v. 8, p. 601 – 605, 1969. MACHOŃ, Z.; KUCZYŃSKI, L.; GIEŁDANOWSKI, J.; WIECZOREK, Z.; ZIMECKI, M.; BŁASZCZYK, B.; MORDARSKI, M.; WIECZOREK, J.; FISZER-MALISZEWSKA, L. Chemical and biological properties of 2-pyridyl-benzyl-carbinol. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz), v. 29, n. 2, p. 217 – 233, 1981. MAGNATA, S. S. L. P. Ensaios biológicos para avaliar o efeito radioprotetor da Momordica charantia L. 79 f., Tese (Doutorado em Tecnologias Energéticas e Nucleares). Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2007. MAISIN, J. R. Bacq and Alexander Award lecture – chemical radioprotection: past, present, and future prospects. Int. J. Radiat. Biol., v. 73, p. 443 – 450, 1998. MALAKER, K. Clinical experience with radioprotectors. in Radioprotectors: Chemical, biological and clinical perspective, eds. By Bump, E. A. and Malaker, K., CRC Press, Boca Raton, FL, p. 373 – 410, 1998. MALIK, A.; AFAQ, F.; SARFARAZ, S.; ADHAMI, V. M.; SYED, D. N.; MUKHTAR, H. Pomegranate fruit juice for chemoprevention and chemotherapy of prostate cancer. PNAS, vol. 102, n. 41, p. 14813 – 14818, 2005 MALIK, A.; MUKHTAR, H. Prostate cancer prevention through pomegranate fruit. Cell Cycle, v. 5, n. 4, p. 371 – 373, 2006. MARTÍNEZ-TOMÉ J. (ED.). Production, processing and marketing of pomegranate in the Mediterranean region: Advances in research and technology. CIHEAM-IAMZ, v. 46, p. 231 – 235, 2000. MATTOS, D. M. M.; GOMES, M. L.; FREITAS, R. S.; BOASQUEVISQUE, E. M.; CARDOSO, V. N.; PAULA, E. F.; BERNARDO-FILHO, M. The effect of vincristine on the biodistribution of technetium-99m DTPA, GHA, and DMSA in balb/c female mice. J. of Nuc. Med. Techn., v. 28, n. 4, p. 271 – 274, 2000. MITTAL, A.; PATHANIA, V.; AGARWALA, P. K.; PRASSAD, J.; SINGH, S.; GOEL. H. C. Influence of Podophyllum hexandrum on endogenous antioxidant defense system in mice: possible role in radioprotection. J. Ethnopharmacol., v. 76, p. 253 – 262, 2002. MIZINA, T. Y.; SITNIKOVA, S. G. Antiradiation activity of juice concentrate from Hippophae rhamnoides L. fruits. Rastitel’nye Resursy, v. 35, p. 85 – 92, 1999.

56

MORENO, S. R. F.; CARVALHO, J. J.; NASCIMENTO, A. L.; PEREIRA, M.; ROCHA, E. K.; DIRÉ, G.; ARNOBIO, A.; CALDAS, L. Q. A.; BERNARDO-FILHO, M. Bioavailability of the sodium pertechnetate and morphometry of organs isolated from rats: study of possible pharmacokinetic interactions of a Ginkgo biloba extract. Braz. Arch. Biol. Technol., v. 48, p. 73 – 78, 2005. MORENO, S. R. F.; FELICIANO, G. D.; FREITAS, R. S.; MATTOS, D. M.; GOMES, M. L.; FARAR, M. B.; LAURENTINO-FILHO, G.; ROCHA, E. K.; BERNARDO-FILHO, M. Effect of Ginkgo biloba on the in vitro labeling of red blood cells and plasma proteins with technetium-99m. J. Label. Comp. and Radioph., v. 44, p. 639-641, 2001. MOUHAJIR, F.; HUDSON, J. B.; REJDALI, M.; TOWERS, G. H. N. Multiple antiviral activities of endemic medicinal plants used by berber peoples of morocco. Pharmaceutical Biology, v. 39, n.5, p. 364 – 374, 2001. MOUSINHO, K. C. Avaliação farmacológica do Ricinus communis L. na determinação da atividade antitumoral e em estudos com radiofármaco. 79 f, Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas). Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2006. NASCIMENTO, G. G. F.; LOCATELLI, J.; FREITAS, P. C.; SILVA, G. L. Antibacterial activity of plant extracts and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology, v. 31, n. 4, p. 247 – 256, 2000. NIMRI, L. F.; MEQDAM, M. M.; ALKOFAHI. Antibacterial activity of jordanian medicinal plants. Pharmaceutical Biology, v. 37, n. 3, p. 196 – 201, 1999. OLIVEIRA, A. C.; VALENTIM, I. B.; GOULART, M. O. F. Fontes vegetais naturais de antioxidantes. Quim. Nova, v. 32, n. 3, 689 – 702, 2009. OLIVEIRA, F. Q.; GOBIRA, B.; GUIMARÃES, C.; BATISTA, J.; BARRETO, M.; SOUZA, M. Espécies vegetais indicadas na odontologia. Rev. Bras. Farmacogn., v. 17, p. 466 – 476, 2007. OLIVEIRA, J. F.; BRAGA, A. C. S.; ÁVILA, A. S.; FONSECA, L. M. B.; GUTFILEN, B.; BERNARDO-FILHO, M. Effect of Thuya occidentalis on the Labeling of Red Blood Cells and Plasma proteins with Technetium-99m. Yale Journal of Biology and Medicine, v.69, p.489-494,1997. OLIVEIRA, J. F.; BRAGA, A. C. S.; OLIVEIRA, M. B. N.; ÁVILA, A. S.; CALDEIRA-DE-ARAÚJO, A; CARDOSO, V. N.; BEZERRA, R. J. A. C.; BERNARDO-FILHO, M. Assessment of the Effect of Maytenus ilicifolia (Espinheira Santa) extract on the Labeling or Red Blood Cells and Plasma proteins with Technetium-99m. Journal of Ethnopharmacology, v. 72, p. 179-184, 2000.

57

OLIVEIRA, R.; SANTOS, D.; FERREIRA, D.; COELHO, P.; VEIGA, F. Preparações radiofarmacêuticas e suas aplicações. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 42, n. 2, p. 151 – 165, 2006. OLIVEIRA, J. F.; SANTOS-FILHO, S. D.; CATANHO, M. T. J. A; SRIVASTAVA, S.C.; LIMA-FILHO, G.L. and BERNARDO-FILHO, M. Effect of Extract of Medicinal Plants on the Labelling of Blood Elements with Technetium-99m and on the Morphology of Red Blood Cells (RBC): Toxicological Actions of Roast Coffee beans (Coffea Arabica). Indian J. of Nuc. Med., v. 18, p. 52-56, 2003. OLIVEIRA, L. P.; PINHEIRO, R. C.; VALADARES, M. C. Avaliação da citotoxicidade da Punica granatum L. sobre células tumorais. Revista Eletrônica de Farmácia, v. 2 (2), p. 150-152, 2005. ORŠOLIC, N; BAŠIC, I. Antitumor, hematostimulative and radioprotective action of water-soluble derivative of própolis (WSDP). Biomedicine & Pharmacotherapy, v. 59, p. 561 – 570, 2005. PANDE, S.; KUMAR, M.; KUMAR, A. Evaluation of radiomodifying effects of root extract of Panax ginseng. Phytother. Res., v. 12, p. 13 – 17, 1998. PANTUCK, A. J.; LEPPERT, J. T.; ZOMORODIAN, N.; ARONSON, W.; HONG, J.; BARNARD, R. J.; SEERAM, N.; LIKER, H.; WANG, H.; ELASHOFF, R.; HEBER, D.; AVIRAM, M.; IGNARRO, L.; BELLDEGRUN, A. Phase II Study of Pomegranate Juice for Men with Rising Prostate-Specific Antigen following Surgery or Radiation for Prostate Cancer. Clin. Cancer Res., v. 12, n. 13, p. 4018 – 4026, 2006. PATT, H. M.; TYREE, E. B.; STRAUBE, R. L.; SMITH, D. E. Cysteine protection against X-irradiation. Science, v. 110, p. 213 – 214, 1949. POLAGRUTO, J. A.; SCHRAMM, D. D.; WANG-POLAGRUTO, J. F.; LEE, L.; KEEN, C. L. Effects of flavonoid-rich beverages on prostacyclin synthesis in humans and human aortic endothelial cells: association with ex vivo platelet function. Journal of Medicinal Food, v. 6, p. 301 – 308, 2003. PEÑA, B. R.; MARTÍNEZ, M. T. Inhibición de la hemaaglutinación de cepas de influenza A por un extracto liofilizado de granada BLBU. Revista Cubana de Química XIII, v. 395, 2001. PONTUAL, M. L. A. Avaliação ultra-estrutural do efeito radioprotetor do selenito de sódio em glândulas submandibulares de ratos. 74 f., Tese (Doutorado em Radiologia Odontológica). Universidade de Campinas, Piracicaba, 2005. SAHA, G. B. Fundamentals of Nuclear Pharmacy, 5th edition, Springer-Verlag, New York, 2005, 383 pages.

58

SALIN, C. A.; SAMANTA, N.; GOEL, H. C. Protection of mouse jejunum against lethal irradiation by Podophyllum hexandrum. Phytomedicine, v. 8, p. 413 – 422, 2001. SAMARTH, R. M.; GOYAL, P. K.; KUMAR, A. Modulatory effect of Mentha piperita (Linn.) on serum phosphatases activity in Swiss albino mice against gamma irradiation. Indian. J. Exp. Biol., v. 39, p. 479 – 482, 2001. SAMARTH, R. M.; GOYAL, P. K.; KUMAR, A. Modulation of serum phosphatases activity in Swiss albino mice against gamma irradiation by Mentha piperita Linn. Phytother. Res., v. 16, p. 586 – 589, 2002. SAMARTH, R. M.; KUMAR, A. Mentha piperita (Linn) leaf extract provides protection against radiation induced chromosomal damage in bone marrow of mice. Indian. J. Exp. Biol., v. 41, p. 229 – 237, 2003. SAMPSON, C. B. Complications and difficulties in radiolabeling blood cells: a review. Nucl. Med. Commun., v. 17, p. 648 – 658, 1996. SÁNCHEZ-LAMAR, A.; FONSECA, G.; FUENTES, J. L.; COZZI, R.; CUNDARI, E.; FIORE, M.; RICORDY, R.; PERTICONE, P.; DEGRASSI, F.; De SALVIA, R. Assessment of the genotoxic risk of Punica granatum L. (Punicaceae) whole fruit extracts. J. Ethnopharmacology, v. 115, p. 416 – 422, 2008. SANTOS-FILHO, S. D.; BERNARDO-FILHO, M. Efeito de um extrato de hipérico (Hypericum perforatum) na marcação in vitro de elementos sanguíneos com tecnécio-99m e na biodisponibilidade do radiofármaco pertecnetato de sódio em ratos Wistar. Acta Cir. Bras., v. 20, n. 1, p. 76 – 80, 2005. SANTOS-FILHO, S. D.; DIRÉ, G. L.; LIMA, E.; OLIVEIRA, M. N. and BERNARDO-FILHO, M. Effect of Mentha crispa (mint) extract on the labeling of blood elements with technetium-99m: a possible evaluation of free radicais. J. Biol. Sci., v. 4, p. 266 – 270, 2004. SCHUBERT, S. Y.; LANSKY, E. P.; NEEMAN, I. Antioxidant and eicosanoid enzyme inhibition properties of pomegranate seed oil and fermented juice flavonoids. Journal of Ethnopharmacology, v. 66, p. 11 – 17, 1999. SEERAM, N. P.; ADAMS, L. S.; HENNING, S. M.; NIU, Y.; ZHANG, Y.; NAIR, M.N G.; HEBER, D. In vitro antiproliferative, apoptotic and antioxidant activities of punicalagin, ellagic acid and a total pomegranate tannin extract are enhanced in combination with other polyphenols as found in pomegranate juice. Journal of Nutritional Biochemistry, v. 16, p. 360 – 367, 2005. SHARMA, J.; SHARMA, R. Radioprotection of Swiss albino mouse by Centella asiática extract. Phytother. Res., v. 16, p. 785 – 786, 2002.

59

SILVA, M. A. R.; HIGINO, J. S.; PEREIRA, J. V.; SIQUEIRA-JÚNIOR, J. P.; PEREIRA, M. S. V. Antibiotic activity of the extract of Punica granatum Linn. over bovine strains of Staphylococcus aureus. Rev. Bras. Farmacogn., v. 18, n. 2, p. 209 – 212, 2008. SOARES, S. F.; BRITO, L. C.; SOUZA, D. E.; BERNARDO, L. C.; OLIVEIRA, J. F.; BERNARDO-FILHO, M. Potential pitfalls in the nuclear medicine imaging: Experimental models to evaluate the effect of natural products on the radiolabeling of blood constituents, bioavailability of radiopharmaceutical and on the survival of Escherichia coli strains submitted to the treatment with stannous ion. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A, v. 569, p. 505 – 508, 2006. SRIVASTAVA, S. State of the art (and science) blood cell labeling. Brookhaven Lecture Series, v. 232, p. 1 – 14, 1987. STOCK, C. C.; CLARCK, D. A.; PHILIPS, F. S. Sarcoma 180 inibitor screening date. Cancer Research, v. 2, p. 2 – 3, 1955. SUMNER, M. D.; ELLIOTT-ELLER, M.; WEIDNER, G.; DAUBENMIER, J. J.; CHEW, M. H.; MARLIN, R.; RAISIN, C. J.; ORNISH, D. Effects of pomegranate juice consumption on myocardial perfusion in patients with coronary heart disease, Am. J. Cardiol., v. 96, p. 810–814, 2005. SWEENEY, T. R. Survey of compounds from the antiradiation drug development program of the U. S. Army Medical Research and Development Command. Government Printing Office, Washington D. C. Publication, p. 308 – 318, 1979. THOM, A. F.; SMANIO, P. E. P. Medicina nuclear em cardiologia: da metodologia à clínica. São Paulo, Editora Atheneu, p. 3-55, 2007. THRALL, J. H.; ZIESSMAN, H. A. Medicina Nuclear. Segunda Edição, Rio de Janeiro, Editora Guanabara Koogan, p. 52-54, 2003. TUBIS, M.; WOLF, W. Radiopharmacy. New York, Jonh & Sons, p. 3 – 6, 263 – 268, 1976. UMA DEVI, P.; GANASOUNDARI, A. Radioprotective effect of leaf extract of Indian medicinal plant Ocimum sanctum. Ind. J. Exp. Biol., v. 33, p. 205 – 209, 1995. VALENCA, S. S.; LIMA, NE. A. C.; DIRE, G. F. BERNARDO-FILHO, M.; PORTO, L. C. Sodium pertechnetate (Na99mTcO4) biodistribution in mice exposed to cigarette smoke. BMC Nuclear Medicine, v. 5, n. 1, p. 1 – 5, 2005. VASCONCELOS, L. C.; SAMPAIO, F. C.; SAMPAIO, M. C.; PEREIRA, S. M.; HIGINO, J. S.; PEIXOTO, M. H. Minimum inhibitory concentration of adherence of Punica granatum Linn (pomegranate) gel against S. mutans, S. mitis and C. albicans. Brazilian Dental Journal, v. 17, n. 3, p. 223-227, 2006.

60

VIJAYALAXMI; MELTZ, M. L.; REITER, R. J.; HERMAN, T. S.; KUMAR K, S. Melatonin and protection from whole-body irradiation: survival studies in mice. Mutation Research, v. 425, p. 21 – 27, 1999. YONEZAWA, M.; KATOH, N.; TAKEDA, A. Restoration of radiation injury by ginseng. IV. Stimulation of recoveries in CFU and megakaryocyte counts related to the prevention of occult blood appearance in x-irradiated mice. J. Radiat. Res., v. 26, p. 436 – 442, 1985. ZHANG, J. S.; SIGDESTAD, C. P.; GEMMELL, M. A.; GRDINA, D. J. Modification of radiation response in mice by fractionated extracts of Panax ginseng. Radiat. Res., v. 112, p. 156 – 163, 1987.

Figura 19 – Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo A (Parte 1)EAPPg corresponde aos animais tratados

Figura 20 – Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo A (Parte 2),EAPPg corresponde aos animais tratados,

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Pul Pan ID

% C

apta

ção

/g

0

1

2

3

4

5

6

7

% C

apta

ção

/g

APÊNDICE

Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo A (Parte 1)corresponde aos animais tratados, * p < 0,05.

Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo A (Parte 2),corresponde aos animais tratados, * p < 0,05 e ** p < 0,01.

IG B R Cor F M O

Órgãos

E T

Órgãos

Controle

EAPPg

*

* **

61

Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo A (Parte 1), onde

Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo A (Parte 2), onde

Cer

Controle

EAPPg

Controle

EAPPg

Figura 21 - Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo Bcorresponde aos animais tratados

Figura 22 - Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo Bcorresponde aos animais tratados

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Pul Pan ID

% C

apta

ção

/g

0

5

10

15

20

25

% C

apta

ção

/g

**

*

Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo Bcorresponde aos animais tratados (Parte 1), * p < 0,05 e ** p < 0,01.

Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo Bcorresponde aos animais tratados (Parte 2), * p < 0,05.

IG B R Cor F M O Cer

Órgãos

E T

Órgãos

Controle

EAPPg

*

*

**

**

**

*

62

Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo B, onde EAPPg

Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo B, onde EAPPg

Tumor

Controle

EAPPg

Controle

EAPPg

*

Figura 23 - Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo C (TATdo tumor) e D (TADT – tratado antes e depois do tumor0,01, quando comparado com o controle, e C e D.

Figura 24 - Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo C do tumor) e D (TADT – tratado antes e depois do tumor)comparado com o controle,

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

F Pul Cor

% C

apta

ção

/g

0

5

10

15

20

25

% C

apta

ção

/g

* *♦♦♦♦

Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo C (TATtratado antes e depois do tumor) (Parte 1), * p < 0,05 e ** p <

, quando comparado com o controle, e ♦ p < 0,05, quando comparado entre os grupos

Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo C (TAT tratado antes e depois do tumor) (Parte 2), * p < 0,05

comparado com o controle, ♦ p < 0,05, quando comparado entre os grupos C e D

B Pan ID IG R M O Cer

Órgãos

E T

Órgãos

Controle

TAT

TADT

*

*

* *

**

♦♦♦♦

♦♦♦♦

♦♦♦♦

♦♦♦♦

♦♦♦♦

63

Visualização da Biodistribuição nos animais do grupo C (TAT – tratado antes

* p < 0,05 e ** p < , quando comparado entre os grupos

(TAT – tratado antes * p < 0,05, quando

, quando comparado entre os grupos C e D.

Cer Tumor

Controle

TAT

TADT

Controle

* ♦♦♦♦