primária – Imunofluorescência, ELISA, Western Blotting, Fluorometria, Luminescência, Radioimunoensaio e Citometria de Fluxo.secundária – Precipitação e Aglutinação

As próximas oito aulas tratam de métodos que se baseiam na ligação do anticorpo com o antí-geno. Tais ligações, como você já sabe, podem ser do tipo primária, secundária e terciária. Veja os métodos que serão apresentados, com base na ligação:

Aula 6

Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob orientação dos professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cláudia Brods-Kyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. Atualizado em junho de 2003

• Complexos moleculares gerados a partir da interação de Ag solúveis com Ac específicos tendem a precipitar em um determinado meio.

• Este fenômeno permitiu o desenvolvimento de técnicas em que se observa a formação do precipitado, o que só é possível se o Ac e o Ag interagirem.

• Técnicas utilizando a precipitação em meio líquido são raramente utilizadas (e somente em pesquisa), para verificação da resposta de um animal a um dado antígeno solúvel.

• Algumas técnicas foram desenvolvidas a partir da observação de que Ag - Ac precipitam em meio semi-sólido, tipo gel (em geral de agarose). Ex: - Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese

Curva de precipitaçãoÉ importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-

Ac em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo:

Zona de excesso de anticorpo

Zona de equivalência

Zona de excesso de antígeno

+ - -

+- -Anticorpo livre

Antígeno livre 100%--

Percentual de complexo imune precipitado

Quantidade de antígeno adicionado

Veja os detalhes no próximo slide

À medida que concentrações crescentes de Ag são adicionados a uma quantidade constante de Ac, a quantidade de complexos imunes preci-pitados inicialmente aumenta, caindo a seguir. De modo sequenciado,observa-se a:

* zona de excesso de Ac: quantidade de Ag é insuficiente para reagir come precipitar todo o Ac presente. O Ac livre pode ser detectado no sobrena-dante.

* zona de equivalência: o Ag adicionado é suficiente para se combinarcom e precipitar todo o Ac presente. Nem Ag nem Ac livre podem serdetectados no sobrenadante.

* zona de excesso do Ag: a quantidade de Ag excede aquela necessáriapara ligar todo o Ac, havendo redução da quantidade de Ac precipitado.Esta diminuição é resultante da solubilização dos complexos Ag-Ac pelo excesso de Ag.

A seguir, as principais técnicas de precipitação em gel:

IMUNODIFUSÃO

Imunodifusão dupla:

•Coloca-se agarose sobre uma lâmina, por exemplo de vidrotipo de microscopia, deixando-a solidificar:

. Faz-se em seguida pequenos orifícios no gel e são adicionadasas soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo é mostra-do abaixo:

Ac

Ag Ag

Ac

Ag Ag

* Pode ser visualizada após lavagem do gel , para remoção dasproteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitaçãocom corante.

Ac

Ag Ag

Lavagem + coloração Ac

Ag Ag

Observe a seguir os principais padrões de reação que podem ser gerados:

* As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação:

* São três os padrões possíveis:

1) Os arcos de precipitação formados entre o Ac e os dois antígenos se fundem, indicando que o Ac está precipitando epítopos idênticos.

2) O Ac preparado distingue os três Ag diferentes que formam arcos independentes de precipitação.

3) Os antígenos compartilham o epítopo 1, mas um delestambém possui um epítopo 3. A linha de precipitação in- dica, então, uma identidade parcial e não total, entre as preparações de Ag.

1 1

Ac

Anti -1

A: identidade Ag

B: não identidade

1 2,4

Ac

C: identidade parcial

Anti –1, 2 e 4

1 1/3

Anti –1 e 3

esporão

Ac

Utilização: muito usada em pesquisa.Na rotina: diagnóstico de algumas doenças,

como a cistecercose

IMUNODIFUSÃO RADIAL

Imunodifusão radial simples

Gráfico padrão2

Diâmetrodo anel

0 2510 50 100

Concentração do antígeno

Concentrações conhecidas

Gel contendo Ac

Ag

Ag colocado no orifício

Anel de precipitação

Ag

Teste

* Permite a quantificação do antígeno ou doanticorpo.*O Ac é adicionado a uma solução de agarose(~1%), que em seguida é dispensada em lâmi-nas e deixada gelificar.*Orifícios são feitos no gel para adição doAg teste.

*Incubação por 24h. Durante este período oAg adicionado difunde-se no gel de agarose,formando complexos solúveis com o Ac.

*O processo continua até ser atingida a zonade equivalência, com os complexos precipitan-do-se em um anel (halo) em torno do orifício.

*Colocando-se pelo menos em tres dos orifíci-os concentrações conhecidas do Ag, é possívelconstruir uma curva com os diâmetros dos ha-los obtidos. Assim, medindo-se o halo geradopor uma concentração desconhecida do Ag e lançando-se o valor na curva, a concentra-ção é determinada.

Utilização da técnica:

dosagem de imunoglobulinas(A,G,M)

e outras proteínas séricas

Imunodifusão radial

Um exemplo de sua utilização: dosagem de imunoglobulinas numa placa disponível nomercado.

Poços onde são colocados padrões e amostras a serem dosados

Agarose contendo anticorposanti-IgG humana PLACA PARA DOSAGEM DE IgG HUMANA

Halo de precipitaçãoIgG – anti-IgG

IMUNOELETROFORESE

+ -

Ag

Ag

1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna

canaleta

2- Anti-soro na canaleta

canaleta

3- Difusão e precipitação

Veja a explicação no próximo slide

NA IMUNOELETROFORESE:

* Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag.

* Os Ag são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.

* O pH do gel é escolhido de modo que as moléculas carregadas positivamente migrem para o eletrodo negativo. Um fluxo de água gerado por ação das cargas residuais (negativas) da agarose (eletroendosmose), empurra tais moléculas para o pólo negativo.

Assim, após um tempo determinado, essas moléculas apresentam-se distribuídas no gel, de acordo com os seus PM e cargas elétricas.

* Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde.

* O Ag e Ac formam arcos de precipitação.

Utilização: avaliação de atipias das imunoglobulinas G, M e A

FIM