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Produção de Aminoácidos
Produção de Aminoácidos
- nutrição humana e animal- agentes flavorizantes- cosméticos- medicamentos- alimentação intravenosa
Interessam apenas -L-aminoácidosvantagem da síntese microbiológica-desvantagem: vias de síntese altamente reguladasAlto consumo energético.
COOH
H2N H
CH3
ala
Movimenta US $1,9 bilhões anuais
Aminoácidos Essenciais
Metionina*TreoninaLisina*LeucinaIsoleucinaTriptofanoFenilalaninaHistidina
*são deficientes na maioria dos cereais.
NH2CH
CO
OH
CH2
CH2
S
CH3
NH2CH
CO
OH
CH2
CH2
CH2
CH2
NH2
Produção- Hidrólise de proteínas- Síntese química- Transformação enzimática- Produção microbiológica
a) Produção direta a partir de substrato baratob) Biotransformação de precursor barato
Condições Gerais de Fermentação
- Alto consumo de oxigênio- Consequente aumento acentuado de temperatura 28 a 38 oC.
- Correção do pH com NH3 (que também servirá de fonte de nitrogênio).
3,44 kcal.g-1 de O2 consumido
Recuperação do produto
- Acidificação até o ponto isoelétrico- Troca iônica- Eletrodiálise- Extração por solvente orgânico
Aminoácido (metric tons) Métodos Uso
L-Alanina 130 1,3c Realce de saborDL-Alanina 700 2 Realce de saborL-Arginina 1.000 1,3a Parenteral, cosméticosL-aspartato 4.000 1,3c Realce sabor, aspartameL-asparagina 50 1,2 terapêuticaL-cisteína 700 1 Aditivo pão, antioxidante
L-glutamato 370.000 3a Realce de saborL-glutamina 500 3a terapêutica
Glicina 6.000 2 Síntese orgânicaL-histidina 200 1, 3a terapêutica
L-isoleucina 150 3a parenteralL-leucina 150 1, 3a parenteralL-lisina 70.000 3c, 3a Parenteral, Aditivo alimentar
DL-metionina
70.000 2 Aditivo alimentarL-metionina 150 3c terapêuticaL-ornitina 50 3c, 3a terapêutica
L-fenilalanina
3.000 3c, 3a Terapêutica, parenteral, aspartame
1 - Hidrólise de proteínas 2 - Síntese química3a - Fermentação direta3b - Transformação microbiana de precursores3c - Uso de enzimas ou células imobilizadas.
Glicina 6.000 Síntese orgânicaL-histidina 200 1, 3a terapêutica
L-isoleucina 150 3a parenteralL-leucina 150 1, 3a parenteralL-lisina 70.000 3c, 3a Parenteral, Aditivo alimentar
DL-metionina 70.000 2 Aditivo alimentarL-metionina 150 3c terapêuticaL-ornitina 50 3c, 3a terapêutica
L-fenilalanina 3.000 3c, 3a Parenteral, aspartameL-prolina 100 3a parenteralL-serina 50 3b, 3a cosméticos
L-treonina 160 3a Aditivo alimentarL-triptofano 200 3c, 3a Parenteral, terapêuticaL-tirosina 100 1, 3c parenteralL-valina 150 3c, 3a parenteral
1 - Hidrólise de proteínas 2 - Síntese química3a - Fermentação direta3b - Transformação microbiana de precursores3c - Uso de enzimas ou células imobilizadas.
Flavorizantes
Sabores: DoceAmargoSalgadoAzedoUmami*
66 % alimentação humana31 % rações animais4% cosméticos
L-lisina, L- triptofano, L-metionina, L-treonina usados como complementos em alimentos de origem vegetal.L-fenilalanina e ácido L-aspártico = aspartame.Fibras de polialanina e resinas de isocianato de lisina.L-histidina ácido urônico usado como bronzeador.
Estratégias
- Uso de cepas desreprimidas
Combinação de síntese química, enzimáticas e microbiológica.- Adaptação para uso de matérias primas mais baratas.- Otimização dos aumentos de escala.
DNA recombinanteFusão de protoplastosmutações
Microrganismos mais usados
Escherichia coliSerratia marcescensCorynebacterium glutamicumBrevibacterium lactofermentumB. flavum.
Controles: Enzimas reguladorasExpressão Gênica
glutamato
Glutamato kinase ativa
prolina
Glutamato kinase inativa
Inibição alostérica
Promotor argB argc argH
RNA polimerase
Promotor argB argc argH
argininaProteína repressora
Repressão da transcrição
Produção de mutantes
Replicação de Colônias
Produção de auxotróficos
Semeadura de prototróficos
Agente mutagênico Semeadura em meio contendoPenicilina e sem o aminoácido
alvo.Protróficos são mortos ao
tentarem se reproduzir
Semeadura em meio sem Penicilina mas com o
aminoácido alvoCrescimento dos auxotróficos
Como são incapazes de produzir um determinados aminoácido, os
auxotróficos formados não tentam se reproduzir. Ao ficarem
quiescentes quando semeados em meio contendo penicilina,
eles conseguem sobreviver
L-ornitina
L-citrulina
L-arginina
1. Seleção de auxotrófico para arginina.2. Semeadura em meio contendo citrulina.3. Somente crescerão auxotróficos capazes
de transformarem a citrulina em arginina.
Obtenção de superprodutores de L-ornitina
OH
NH2
NH2
O
L-ornitina
L-citrulina
L-arginina
Obtenção de superprodutores de L-ornitina
OH
NH2
NH2
O
Certeza de que o bloqueio acontece na primeira reação do processo
Ácido Glutâmico
- Realçador de sabor (Aji-no-moto)- Demanda anual mundial de 1.500.000 ton- Pode ser obtido por hidrólise ácida de proteínas ou síntese química mas fornece o isômero D, que é insípido.- Produtores • Corynebacterium glutamicum
• Arthrobacter sp• Brevibacterium flavus
Condições de Fermentação
-Se for dada quantidade suficiente de biotina o microrganismo produz ácido láctico, somente em quantidades sub-ótimas o glutamato é formado.- Geralmente necessário um agente quelante do ferro.- pH ótimo de 7,0 a 8,0.- Abundante suprimento de O2 para evitar a formação de lactato.- 35-37 oC.- Fontes de carbono:
• Amido hidrolisado• melaço de cana• melaço de beterraba
Biorreatores usados na produção de glutamato monosódico e lisina, cada um com capacidade de 2.410 hl. Por se tratar de metabolismo aeróbio cada um deles apresenta uma saída de gases
Via de Embden –Mayerhoff, seguido do ciclo de Krebs, em que o acetil-CoA é “moído”, para produção de NADH+H+ e GTP.
CO2
Se houver inibição da alfa-cetoglutarato desidrogenase ou se o microrganismo for deficiente na produção desta enzima, a via será desviada para a produção de ácido glutâmico.
CO2
A estratégia celular compensa o bloqueio realizando um “curto circuito” através do ciclo do glioxalato, resultando neste ácido e no succínico. Começa a haver competição entre as duas vias, até que praticamente todo o substrato se transforma em glutamato.
CO2
Malato sintase
Isocitrato liase
Com o contingenciamento da biotina (essencial para o metabolismo lipídico) a bicapa da membrana se desorganiza, deixando o ácido glutâmico vazar para o meio de cultivo. Outra estatégia consiste em adicionar penicilina ao meio de reação, havendo a desorganização da parede celular.
CO2
Lisina- Essencial- Peixes e soja são ricos- Usada como suplemento na forma de sais- Produção estimada em 40.000 ton (80% por fermentação)- Lisina rúmen bypass (passa pelo rúmen e vai enriquecer a carne e o leite. O
NH2
NH2OH
aspartato
aspartato kinase
aspartato semialdeído
Ácido dihidropicolínico
lisina metionina
homoserina
homoserina desidrogenase
treonina
oxibutirato
isoleucina
Auxotróficos desta via metabólica não produzem treonina, diminuindo o feedback negativo sobre a aspartato quinase. Suplementa-se o meio apenas com o mínimo necessário dessa vitamina, para a sobrevivência do microrganismo.
Existem atualmente auxotróficos deste gênero que também possui um centro regulatório defeituoso na aspartato kinase.
FermentaçãoSubstratos: Melaço de cana
Melaço de beterrabaHidrolisado de amidoEventualmente etanol ou acetato
- Biotina é usada (~50 g.l-1) para prevenir a perda do ácido glutâmico.- 28 – 33 oC.- alta aeração- ciclo fermentativo de 48 a 72 h.- isolamento por troca iônica.- transformada em lisina monohidroclórica.
Ácido Aspártico e Aspartame
- Precursor, com a fenilalanina, do aspartame- Quimicamente se forma ~40% do seu enantiômero com sabor amargo de difícil separação.- Melhor forma é a via enzimática. A Thermolysin, extraída de microrganismos termofílicos opera a 50 – 60 oC.
- Mercado mundial: 2000 ton e 100 milhões de dólares/ano
O
O
NH2
NH2
NH
OOH
Leito empacotado, contendo E. coli, grande produtora de aspartase, encapsulada em gel de carragenanos.
Produção de Aspartame
Vitamina B12
Carência: Desordens interstinaisAnemia perniciosa
Produtores: Pseudomonas denitrificansPropionibacterium shermaniiStreptomyces
Antigamente era subproduto da produção de antibióticos.Hodiernamente a demanda é muito maior.US$8000/kg.
Substratos: MilhocinaFarelo de sojaFarinha de peixeExtrato de carneHidrolisado de caseína
Adição: CarboidratosHidróxido de amônio
Após a fermentação a célula é centrifugada.Grosso da produção, no interior celular.Tratamento com ácidos, cianeto etc.Resina de troca iônica.Purificação em fenol e água.
Riboflavina – B2
Deficiência: Feridas nos lábiosÚlceras na bocaErupções na peleProblemas de visão
Produtor: Ashbya gossypii cepa produtora produz 20.000 x o necessário para o seu metabolismo.
Condições: Fermentação aeróbicacontínua em milhocinaRecuperação do meio de cultivo.
