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REGIANE MATHIAS
Imunoglobulina na patogenia da leishmaniose visceral em hamsteres
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de doutor em Ciências. Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Experimental Orientadora: Profa. Dra. Hiro Goto
São Paulo 2004
“Se não houver frutos Valeu a beleza das flores
Se não houver flores Valeu a sombra das folhas
Se não houver folhas Valeu a intenção da semente”
Maurício Francisco Ceolin
Aos meus pais, irmãos, cunhadas e sobrinhos,
torcedores silenciosos, o meu amor infinito
A amiga, companheira e irmã Aline pelo convívio
e constante alegria
Aos amigos Paulo, Marisol
e Flávia, pelas alegrias e tristezas
A Antunes, por iluminar meus dias, minha infinita admiração,
meu respeito e amor
AGRADECIMENTOS
A profa. Dra. Hiro Goto pela competente orientação, seriedade profissional,
confiança, compreensão, paciência, pelo apoio e estímulo constantes durante esses
anos de convivência e pela amizade, minha eterna gratidão.
Ao prof. Dr. Magnus Ake Gidlund pela agradável convivência e amizade.
Ao prof. Dr. Idércio Luiz Sinhorini pela constante colaboração na identificação das
ultraestruturas, ensinamentos, estímulo, pelas sugestões recebidas na qualificação e
acima de tudo pela amizade.
Aos professores Dr. Heitor Franco de Andrade Júnior e Dra. Mahasti Sahihi de
Macedo pelas sugestões recebidas na qualificação, que muito contribuíram para o
enriquecimento final desse trabalho.
A Profa. Dra. Élia Garcia Caldini por ter cedido gentilmente o seu laboratório para
a realização da técnica de imunoeletrônica.
A Shirley pela colaboração, disposição em sempre ajudar e amizade.
Aos amigos, irmãos e companheiros José Angelo Lauletta Lindoso e Francisco Assis
Lima Costa, pela maravilhosa convivência, pelo apoio, incentivo e auxílio constante
em todas as ocasiões, tanto científicas quanto pessoais.
Ao amigo Fernando Henrique das Mercês Ribeiro pela amizade e convívio.
A grande e eterna amiga Beatriz Julieta Celeste pelo convívio diário, pela grande
amizade e pelas cachaças, é claro.
A querida amiga Edna Souza pela alegria e pela força diária.
Aos amigos Edite, Carmen, Sueli, Bete, Prianti, Márcia, Célia, Mariko, Flávia,
Érika, Eduardo, Daniel, Paulo Cotrin, Milca, e aos pupilos Fábio, Fabrício,
Cristina e Alexandre pelo companheirismo e pela alegria do dia-a-dia.
Aos amigos Hélio Corrêa pelos cortes ultraestruturais e Marcelo Alves Ferreira pela
digitalização das eletromicrografias o meu eterno agradecimento e amizade.
Aos amigos Adão Caetano, Maria Cecília Marcondes, Maria Margarida Teixeira,
Gildásio, Maria do Rosário Loureiro de Aguiar, Miriam Regina Taborda Simone e
Ivone Silva Santos, do Laboratório de Biologia Celular, pela amizade, dedicação e
incansável contribuição, que com paciência e cuidado muito me ensinaram sobre o
processamento e documentação de todo o estudo de microscopia eletrônica.
Aos secretários Gallo, Sônia, Tânia e Diva do Programa de Pós Graduação da
Fisiopatologia Experimental pela paciência, por se mostrarem sempre prestativos e
pela amizade.
Ao Prof.Dr. Roger Chammas e a sua equipe por ter cedido gentilmente o seu
laboratório para a realização da digitalização das fotomicrografias finais desse
trabalho.
Aos funcionários e amigos Arthur, Eunice, Ione, Paulo, Renato e Vera, pela
amizade e pela constante disponibilidade.
Às amigas Cláudia Gomes, Márcia Laurenti, Rachel Chebabo e Vânia da Matta,
pela amizade e pelo estímulo no início dessa jornada.
Ao amigo Cleiton Alves, pelo processamento dos cortes histológicos.
Aos amigos Fábio (Mel), Marcelo (Lobster), Lúcio (Tosco), Michelangelo (Mic),
Ricardo, Nilton, David, Giovani, André, Bosco, Daniel, Rosana, Luciane, Juliana,
Rita, Andréia Bonsi, Ana Claúdia e Andréia Silva pelos momentos de desabafos,
alegrias e amizade.
A bibliotecária Valéria da FM/USP pela sistematização das referências
bibliográficas.
Ao Laboratório de Soroepidemiologia e Imunobiologia do Instituto de Medicina
Tropical pela infra-estrutura necessária para a realização desse trabalho.
Ao Laboratório de Investigação Médica (LIM-38) da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo pelo suporte financeiro.
A FAPESP pela aprovação desse projeto e liberação de recursos indispensáveis à
execução dessa dissertação.
Aos Hamsteres, personagens centrais inocentes, que deram suas vidas em
prol da ciência, meu imensurável respeito.
Esse trabalho foi desenvolvido no Laboratório de
Soroepidemiologia e Imunobiologia do Instituto de Medicina
Tropical de São Paulo e contou com o suporte financeiro de
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(Processo no. 01/07626-5 / bolsa de doutorado) e apoio do
Laboratório de Investigação Médica (LIM-38 HC-FMUSP).
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
INTRODUÇÃO........................................................................................... 1
OBJETIVOS............................................................................................... 16
MATERIAL e MÉTODOS.......................................................................... 17
Amostras de soros..................................................................................... 17
Parasitos.................................................................................................... 17
Animais e protocolo experimental.............................................................. 18
Purificação de IgG por coluna de proteína G- Sepharose......................... 19
Internalização de IgG por células endoteliais de veia de cordão umbilical
humano (HUVEC)...................................................................................... 20
Determinação de IgG internalizada por ELISA de captura........................ 21
Detecção de IgG nos tecidos por microscopia eletrônica de transmissão 22
Morfometria................................................................................................ 23
Microscopia de fluorescência intravital...................................................... 24
Análise estatística...................................................................................... 25
RESULTADOS........................................................................................... 27
Internalização de IgG por célula endotelial de veia de cordão umbilical
humano (HUVEC)......................................................................................
27
Detecção de IgG em tecido de hamster com leishmaniose visceral por
microscopia eletrônica de transmissão......................................................
29
Fígado........................................................................................ 29
Pulmão....................................................................................... 35
Rim............................................................................................. 40
Estudo da microcirculação por microscopia intravital................................ 45
DISCUSSÃO.............................................................................................. 49
CONCLUSÕES.......................................................................................... 57
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 58
ÍNDICE de FIGURAS e TABELAS
Figura 1. Representação esquemática do sistema usado para observação
da microcirculação........................................................................................ 26Figura 2. Detecção de IgG em células endoteliais de veia de cordão
umbilical humano (HUVEC) incubadas com soros de pacientes e
hamsteres...................................................................................................... 28Tabela 1. Análise morfométrica de estruturas celulares de fígado............... 30Figura 3. Detecção de IgG no fígado controle não infectado (ME).............. 31Figura 4. Detecção de IgG no fígado aos 30 dias PI (ME)........................... 32Figura 5. Detecção de IgG no fígado aos 60 dias PI (ME)........................... 33Figura 6. Análise quantitativa de IgG marcadas por proteína A-ouro em
fígado de hamsteres...................................................................................... 34Tabela 2. Análise morfométrica de células endoteliais de pulmão............... 35Figura 7. Detecção de IgG no pulmão controle não infectado (ME)............ 36Figura 8. Detecção de IgG no pulmão controle não infectado (ME)............ 37Figura 9. Detecção de IgG no pulmão controle não infectado (ME)............ 38Figura 10. Análise quantitativa de IgG marcadas por proteína A-ouro em
pulmão de hamsteres.................................................................................... 39Tabela 3. Análise morfométrica de células endoteliais de rim...................... 40Figura 11. Detecção de IgG no rim controle não infectado (ME)................. 41Figura 12. Detecção de IgG no rim controle não infectado (ME)................. 42Figura 13. Detecção de IgG no rim controle não infectado (ME)................. 43Figura 14. Análise quantitativa de IgG marcadas por proteína A-ouro em
rim de hamsteres........................................................................................... 44Figura 15. Número máximo de extravasamentos observados após
aplicação tópica de histamina na bochecha evertida de hamsteres............. 46Figura 16. Número máximo de extravasamentos observados na
bochecha evertida de hamsteres após aplicação de IgG............................. 47Figura 17. Representação da microcirculação da bolsa da bochecha de
hamster.......................................................................................................... 48
RESUMO
Na leishmaniose visceral (LV) a deposição de imunocomplexo tem sido
considerada como o mecanismo de lesões teciduais. Entretanto, outros
mecanismos envolvendo IgG tem sido descritos. Neste trabalho, estudamos
a internalização de IgG por células endoteliais como um mecanismo
alternativo de lesão. Quando células endoteliais da veia de cordão umbilical
humano (HUVEC) foram incubadas in vitro com soro de pacientes e de
hamsteres com leishmaniose visceral, observamos maior intensidade de IgG
marcada, enquanto que, com soro de leishmaniose tegumentar, observamos
pouca marcação de IgG em apenas algumas células endoteliais. Para
analisar a internalização de IgG por células endoteliais in vivo, fragmentos
de fígado, pulmão e rim foram retirados de hamsteres com LV nos diferentes
tempos e foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão.
Qualitativamente observamos maior quantidade de IgG em células
endoteliais de fígado, pulmão e rim de hamsteres infectados quando
comparados aos controles não infectados. Quantitativamente, observamos
mais partículas aos 30 e 60 dias pós-infecção (PI) em células endoteliais do
fígado e pulmão e aos 60 dias no rim, quando comparados aos controles
não infectados. Alterações na permeabilidade vascular foram estudadas na
bochecha de hamsteres infectados por microscopia de fluorescência
intravital, usando histamina como estimulante, foi observado inibição do
extravasamento em animais infectados aos 30 dias. Em prosseguimento, foi
detectado aumento no extravasamento plasmático quando IgG purificada de
hamsteres com 60 dias PI foi aplicada em bochecha de hamsteres normais.
Estes resultados sugerem que a internalização de IgG ocorrida em células
endoteliais provavelmente possa ser um dos mecanismos envolvidos na
patogênese da LV.
ABSTRACT
In visceral leishmaniasis (VL) the immune complex deposition has been
claimed as the mechanism of tissue lesions. However other mechanisms
involving IgG have been described and in this work, we studied
internalization of IgG by endothelial cells as an alternative mechanism of
lesion. When human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were
incubated in vitro with VL sera of patients and hamsters, high intensity of IgG
staining was observed in endothelial cells whilst with tegumentary
leishmaniasis sera only low intensity IgG staining in fewer endothelial cells
was observed. To study this phenomenon in vivo, liver, lung and kidney were
taken from hamsters with VL at different time periods and analyzed under
transmission electron microscopy for internalization of IgG by endothelial
cells. Qualitatively, we observed greater amount of IgG at 30 days post-
infection (PI) in the endothelial cells from liver, lung and kidney of infected
hamsters when compared with non-infected controls. Quantitatively, we
observed more particles at 30 and 60 days PI in endothelial cells in the liver
and lung, and at 60 days in the kidney when compared with non-infected
control. Vascular permeability changes were studied in cheek pouch of
hamsters by intravital fluorescent microscopy, and using stimulation with
histamine, plasma leakage was inhibited in infected animals at 30 days of
infections. Further, increased leakage was detected when purified IgG from
hamsters with 60 days PI was applied on normal hamsters cheek pouch.
These data suggest that internalization of IgG occurring in endothelial cells
probably may be one of the mechanisms involved in the pathogenesis in the
VL.
INTRODUÇÃO
As leishmanioses são doenças causadas por protozoários
pertencentes ao reino Protista, especificamente ao filo Mastigophora, que
inclui todos os protozoários que possuem um ou mais flagelos e reprodução
assexuada por divisão binária. Pertencem à ordem Kinetoplastida,
caracterizada pela presença de um cinetoplasto e à família
Trypanosomatidae, gênero Leishmania (Lainson e Shaw, 1987). Todas as
espécies de Leishmania exibem um ciclo de vida heteroxênico semelhante.
São encontradas na forma promastigota (com flagelo externo) vivendo no
trato digestivo do inseto vetor e como forma amastigota, arredondada e sem
flagelo externo, sendo parasito intracelular obrigatório de hospedeiros
vertebrados cuja multiplicação se dá por divisão binária. O tamanho da
forma promastigota varia muito; o corpo mede, em geral, 10,0 a 20,0 x 1,5 a
3,0 µm com um flagelo freqüentemente muito maior que o corpo. A forma
amastigota mede de 2,5 a 1,5 x 6,8 a 4,5 µm dependendo da espécie do
parasito (Lainson e Shaw, 1987).
As principais espécies causadoras de leishmanioses são
classificadas segundo Lainson e Shaw (1987), de acordo com o seu
desenvolvimento dentro do vetor, em dois subgêneros: Leishmania
(parasitos que tem seu desenvolvimento limitado ao estômago do vetor) e
Viannia (parasitos que se aderem pelo flagelo às paredes do piloro e/ou
íleo). O subgênero Viannia está dividido em 4 complexos: Leishmania
(Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania
(Viannia) naiffi e Leishmania (Viannia) lainsoni e o subgênero Leishmania
em 11 complexos: Leishmania (Leishmania) hertigi, Leishmania
(Leishmania) mexicana, Leishmania (Leishmania) amazonensis,
Leishmania (Leishmania) enrietti, Leishmania (Leishmania) arabica,
Leishmania (Leishmania) aethiopica, Leishmania (Leishmania) gerbilli,
Leishmania (Leishmania) major, Leishmania (Leishmania) tropica,
Leishmania (Leishmania) donovani e Leishmania (Leishmania) infantum
(Thomas–Soccol et al., 1993). Para Lainson e Shaw (1987) as espécies
Leishmania (Viannia) panamensis e Leishmania (Viannia) peruviana
também pertencem ao subgênero Viannia e Leishmania (Leishmania)
chagasi, Leishmania (Leishmania) aristidesi e Leishmania (Leishmania)
venezuelensis ao subgênero Leishmania.
A leishmaniose visceral é encontrada em quatro dos seis
continentes. Na Índia e no leste da África é causada pela Leishmania
(Leishmania) donovani; na China, Ásia Central e nos países mediterrâneos
da Europa e África é causada pela Leishmania (Leishmania) infantum e, na
América Latina pela Leishmania (Leishmania) chagasi (Laison e Shaw,
1987; Berman, 1997; Lainson e Shaw, 1992).
A ocorrência das espécies de Leishmania é normalmente limitada à
distribuição do vetor que é determinada geograficamente. Os vetores
pertencem à sub-família Phlebotominae que é dividida em dois gêneros
principais: Phlebotomus e Lutzomyia. Na Europa, Ásia e África (Velho
Mundo) os vetores das espécies causadoras das leishmanioses visceral e
cutânea são do gênero Phlebotomus (Lainson e Shaw, 1987). Nas
Américas (Novo Mundo) os vetores são do gênero Lutzomyia (Pearson e
Queiroz Sousa, 1996). A Lutzomyia longipalpis é o vetor da Leishmania
(Leishmania) chagasi e outras espécies de Lutzomyia são vetores dos
agentes das leishmanioses tegumentares americanas (Lanzaro e Warburg,
1995).
Certas espécies do vetor são encontradas em florestas, outras são
endêmicas em regiões de deserto e algumas são peridomiciliares,
residentes em restos de lixo ou entulhos próximos às casas ou construções
em áreas rurais (Lainson e Shaw, 1987) e também encontradas em áreas
urbanas, tais como Teresina, São Luís, Fortaleza e mais recentemente no
interior de São Paulo (Araçatuba e Bauru) (www.saude.gov.br/svs).
Os hospedeiros vertebrados incluem uma grande variedade de
mamíferos. As infecções mais comuns ocorrem nos roedores e canídeos,
sendo conhecidas também em edentados (tamanduá, bicho preguiça e
tatu), marsupiais (gambá), procionídeos (mão pelada e quati) e primatas
(inclusive o homem) (Lainson e Shaw, 1987).
A transmissão dos parasitos para os reservatórios humanos e
animais é feita pela picada da fêmea do inseto vetor, quando do repasto
sangüíneo, porém outras formas de transmissão tem sido observadas.
Pearson e Sousa, 1996, descrevem que a doença no homem pode ser
transmitida por via congênita ou por transfusão de sangue contaminado. Há
relatos de que indivíduos com leishmaniose visceral ativa, por
apresentarem leucócitos infectados, principalmente monócitos (Chulay et
al., 1985) podem atuar também como reservatório de parasitos (Costa,
1997). Na região do Mediterrâneo, principalmente na Espanha, França,
Itália e Portugal um ciclo antroponótico da leishmaniose visceral é
observado em pacientes com infecção pelo HIV, usuários de drogas ilícitas
endovenosas (Paredes et al., 1997).
As leishmanioses ocorrem em 88 países, sendo 21 países
pertencentes ao Novo Mundo e 66 ao Velho Mundo. Por ter um espectro
tão amplo e pela repercussão econômica e social desta endemia, a
Organização Mundial de Saúde as atribui a sexta colocação entre as
doenças tropicais mais importantes. A enfermidade atualmente, constitui-se
numa ameaça para 350 milhões de pessoas e estima-se que 12 milhões de
pessoas já estejam infectadas em todo o mundo (WHO, 1998). O Brasil
está incluído entre os países onde são registrados mais de 90% de casos
de leishmanioses (WHO, 1998), sendo que 66% dos casos ocorrem na
região nordeste e atualmente a região sudeste (Minas Gerias e São Paulo)
comporta 25% dos casos do Brasil. Por ser uma doença endêmica a
leishmaniose visceral constitui-se num crescente e importante problema de
saúde pública e sócio-econômico. O aumento na incidência da doença
associado ao aumento da letalidade, a disseminação para novas áreas
geográficas e sua urbanização é motivo de preocupação crescente para as
autoridades de saúde pública do país.
A leishmaniose visceral é uma doença espectral com manifestações
clínicas variadas, havendo desde forma assintomática caracterizada por
sorologia positiva para leishmaniose sem nenhuma manifestação clínica,
sendo encontrada em áreas endêmicas, passando pela forma
oligossintomática caracterizada por sorologia positiva e presença de sinais
e/ou sintomas discretos como febre, hepatomegalia e/ou esplenomegalia de
pequeno grau, até a forma clássica que é a doença plenamente manifesta
caracterizada por hepatoesplenomegalia volumosa, febre, pancitopenia,
hipergamaglobulinemia e com grande comprometimento do estado geral
(Badaró et al., 1986). A leishmaniose tegumentar apresenta-se nas formas
cutânea, muco-cutânea e cutânea difusa (Lainson e Shaw, 1994), presentes
principalmente no continente americano, que não cicatriza com o tempo e
apresenta o teste de hipersensibilidade tardia ao antígeno de Leishmania
(reação de Montenegro) negativo (Bryceson et al., 1970).
No estudo da leishmaniose visceral experimental o modelo animal
mais utilizado é o de camundongo de linhagens isogênicas em que algumas
se comportam como suscetíveis e outras resistentes à infecção por
Leishmania donovani. Segundo Bradley (1987) camundongos da linhagem
BALB/c e algumas linhagens congênicas de C57BL/10 são considerados
suscetíveis à infecção por Leishmania donovani. Nestas linhagens, porém,
há progressão da infecção somente nas primeiras semanas ocorrendo
controle posterior da replicação do parasito com formação de granuloma
(Murray et al., 1987 e Barbosa Júnior et al., 1987). Quando os
camundongos da linhagem C57BL/10 são comparados aos DBA/2,
considerados resistentes, o que se observa é a demora na formação do
granuloma na linhagem suscetível, porém, não se estabelece uma
progressão da doença como forma clássica de leishmaniose visceral
humana (Barbosa Júnior et al., 1987).
Um outro modelo para estudar leishmaniose visceral e que
desenvolve alterações semelhantes à doença humana é o cão. No cão as
leishmanioses são causadas pelos mesmos agentes que provocam a
doença no homem (Schaefer et al., 1994). As manifestações clínicas nos
cães também são classificadas como forma assintomática, quando somente
apresenta sorologia positiva para leishmaniose, como forma
oligossintomática, quando apresenta sinais inespecíficos (adenopatia, perda
de peso e esplenomegalia leve) e como sintomática com ulcerações
cutâneas, ceratoconjutivite, unhas crescidas, esplenomegalia evidente e
comprometimento do estado geral (Pozio et al., 1981).
Para o estudo da doença propriamente dita, em sua forma
manifesta, o hamster é considerado um bom modelo experimental para o
estudo da leishmaniose visceral. A sua utilização é decorrente da
descoberta de sua suscetibilidade à infecção por Leishmania donovani, fato
observado inicialmente por Young et al. (1919). Um estudo sistematizado
do hamster em relação a outros animais foi publicado em 1958 por Stauber.
Neste estudo, o hamster foi considerado ao lado da chinchila, como
extremamente suscetível à infecção por leishmânia ao contrário de coelhos
e ratos brancos que são resistentes à infecção. Hamsteres desenvolvem
doença comparável à humana, com perda de peso, hipertrofia do baço e
fígado (Melleney, 1925 e Stauber, 1958), hipergamaglobulinemia e uma
depressão da resposta imune celular específica e inespecífica (Bunn-
Moreno et al.,1985 e Pearson et al., 1996). Recentemente Requena et al.
(2000) inoculando promastigotas de Leishmania (L.) infantum, por via
intracardíaca, mostraram que hamsteres podem desenvolver dois tipos de
infecção: sintomática e assintomática. A forma clínica assintomática foi
dividida em dois subgrupos: oligossintomático e assintomático propriamente
dito. O grupo de animais que não desenvolveram sinais externos da
doença, mas que apresentaram esplenomegalia e moderada carga
parasitária no baço e fígado foram considerados oligossintomáticos.
Consideraram o outro grupo de hamsteres como assintomáticos baseados
na ausência de sinais clínicos da doença e pelo fato de anticorpos
formadores de imunocomplexos, como um sinal potencial da patologia, não
estarem presentes no tecido renal. Esses mesmos autores acreditam que
hamsteres são excelentes modelos experimentais para a pesquisa de um
grande número de doenças infecciosas humanas e que são apropriados
para o desenvolvimento de vacinas.
Quando inoculado na pele do hospedeiro o parasito se multiplica
em células do sistema fagocítico mononuclear provocando alterações
principalmente no baço e fígado, que fazem parte desse sistema, podendo
contudo atingir praticamente todos os órgãos (Wilcocks e Manson-Bahr,
1972; Corbett et al., 1992; Duarte et al. 1983 e 1989; Duarte e Corbett,
1987). A infecção compromete também órgãos do trato gastro-intestinal, do
sistema nervoso central, do sistema genital e sistema urinário (Alencar,
1959; Evans e Rebêlo, 1996). No baço e no fígado a alteração
predominante é a hiperplasia e a hipertrofia das células do sistema
fagocítico mononuclear (Wilcocks e Manson-Bahr, 1972; Duarte e Corbett,
1987) onde ocorre a proliferação dos parasitos. Em outros tecidos, a
alteração apresenta-se sob a forma de processo inflamatório intersticial
(Duarte et al., 1983; Duarte et al., 1989).
Na descrição anátomo-patológica da leishmaniose visceral no
homem elaborada por Duarte (2000), verificaram-se alterações
histopatológicas nos vários órgãos expostas a seguir. No baço foi
observada esplenomegalia com muitos macrófagos parasitados por
amastigotas. As alterações hepáticas foram classificadas em três padrões.
Padrão típico ou clássico, caracterizado por hepatomegalia, hipertrofia e
hiperplasia de células de Kupffer parasitadas. No padrão nodular observou-
se formação de agregados de células mononucleares (macrófagos,
plasmócitos e linfócitos) com pequeno número de amastigotas fagocitadas
além de hipertrofia e hiperplasia de células de Kupffer. No padrão
fibrogênico verificou-se focos múltiplos de fibrose intralobular, hipertrofia e
hiperplasia de células de Kupffer, raras amastigotas e discreto infiltrado
mononuclear portal e intralobular. No pulmão foi observada pneumonia
intersticial multifocal caracterizada por espessamento dos septos
alveolares. Congestão de capilares septais e edema discreto foram
observados. A etiologia leishmaniótica dessa pneumonia intersticial foi
confirmada pela presença de material antigênico no citoplasma dos
macrófagos e livre no interstício septal. O acometimento renal foi
manifestado, nos casos fatais, por nefrite intersticial caracterizada por
múltiplos focos de infiltrado de mononucleares e edema no córtex renal,
especialmente em torno de pequenos vasos. Amastigotas são raramente
encontradas. Comprometimento glomerular é discreto, mas ocorrem
alterações essencialmente no mesângio que sofre espessamento
membranoso ou hialino da matriz acompanhado de hipertrofia e hiperplasia
de células mesangiais, as quais raramente fagocitam amastigotas.
Existem evidências de que na leishmaniose visceral as lesões são
mediadas imunologicamente devido à escassez de parasitos em alguns
órgãos onde há injúria. Na leishmaniose visceral a imunidade celular é
considerada importante tanto na proteção quanto na suscetibilidade (Sacks
et al., 1993; Reiner, 1995 e Murray et al.,1987). No entanto, no homem e
em modelo experimental ocorre hipergamaglobulinemia devido à ativação
policlonal de linfócitos B (Campos-Neto et al. 1982; Galvão Castro et
al.,1984, Bunn-Moreno et al., 1985). Os anticorpos anti-Leishmania não tem
efeito protetor evidente na infecção (Sacks et al., 1993), mas, esses
anticorpos podem estar envolvidos potencialmente na patogenia das lesões
tissulares.
O mecanismo patogênico até hoje aceito na leishmaniose visceral é
o mediado por imunocomplexo. No pulmão a lesão foi correlacionada com a
presença de antígeno de Leishmania (Duarte et al. 1989). No rim as lesões
glomerulares na leishmaniose visceral têm sido atribuídas à deposição de
imunocomplexos. À semelhança do que ocorre no homem (Brown et al.,
1996) acredita-se que complexo imune circulante e complexo imune in situ
participem do processo patogênico renal (Muller-Peddinghaus e Trautwun,
1977; Slauson e Lewis, 1979) como mediadores primários. No primeiro
caso, anticorpos reagem com antígenos não glomerulares na circulação
para formar imunocomplexos que se depositam no glomérulo, revelando um
padrão de depósito granular de imunoglobulinas e complemento observado
por imunofluorescência à época (Winter e Majid, 1984; Pedersen, 1999). No
segundo caso, extremamente raro nos animais em condições naturais
(Wiseman et al., 1980; Cook e Cowgill, 1996), mas observado
experimentalmente (Mcphaul et al., 1974; Shirota e Fujiwara, 1982),
anticorpos reagem com antígenos na membrana basal glomerular
(antígenos glomerulares insolúveis ou antígenos extra-glomerulares
localizados no glomérulo), revelando um padrão de depósito de
imunoglobulina uniforme, liso e linear a imunofluorescência (Kurtz et al.,
1972). Algumas vezes, esses eventos podem atuar simultaneamente na
indução da injúria glomerular (Halliwell e Blakemore, 1972).
Vários fatores influenciam a deposição de imunocomplexo nos
tecidos (Abbas et al., 1997), mas, nos rins, os mais importantes estão
relacionados com carga elétrica e tamanho dos complexos solúveis
circulantes formados (Isaacs e Miller, 1982; Sehgal et al., 1982; Abrass,
1997). Imunocomplexos circulantes depositados no glomérulo ou anticorpos
anti-membrana basal glomerular, sozinhos, raramente produzem danos
glomerulares significativos (Tisher e Brenner, 1994), entretanto alterações
mais severas podem ser causadas por mediadores secundários como
componentes do sistema complemento, leucócitos (Slauson e Lewis, 1979)
e plaquetas circulantes (Clark et al., 1976), fatores de coagulação (Kincaid-
Smith, 1972), citocinas (Ostendorf et al., 1996), quimiocinas (Banas et al.,
1996) e moléculas de adesão (Bonventre e Colvin, 1996). O glomérulo
responde a essas injúrias por meio de proliferação, espessamento da
membrana basal glomerular e se a injúria persiste, por hialinização e
esclerose (Grauer, 1992). O componente terminal do complemento, o
complexo de ataque de membrana (C5b-9), provavelmente represente um
importante mecanismo de injúria glomerular envolvendo depósitos de
imunoglobulinas no mesângio e ao longo da superfície interna da parede
capilar para induzir glomerulonefrites proliferativas, bem como em
localização subepitelial para reproduzir glomerulonefrite membranosa
(Couser, 1998).
A detecção de imunoglobulinas e complemento em tecido renal
pressupõe a presença de imunocomplexo (Johnson e Ward, 1982). No
entanto, Brito et al. (1975) evidenciaram em três casos humanos, com
comprometimento renal, depósitos de imunoglobulinas e complemento no
glomérulo, mas não observaram a presença de antígeno de leishmânia.
Weisinger et al. (1978) em um relato de caso humano, também observaram
depósitos de imunoglobulinas, complemento e fibrinogênio no glomérulo.
Sartori et al. (1987), verificaram a presença de depósitos granulares de
antígeno de Leishmania donovani e imunoglobulinas no mesângio e no
glomérulo de hamster. Em 1991, Poli et al., estudando cães naturalmente
infectados com L. infantum, detectaram depósitos de imunoglobulinas e
complemento na parede dos capilares glomerulares e no mesângio. Porém,
a presença de antígeno foi demonstrada somente por Sartori et al. (1987),
provavelmente em virtude da via de inoculação (intracardíaca) utilizada para
infectar os animais. Entretanto, a escassez de antígeno e o tipo de infiltrado
celular não são totalmente compatíveis com esse mecanismo.
Em modelo murino de Lupus eritematoso sistêmico, lesões
glomerulares foram induzidas por anticorpos (IgG3) derivados de clones de
hibridomas, resultando em lesões glomerulares proliferativas e em alça de
arame com características semelhantes às que são encontradas na nefrite
lúpica humana (Itoh et al., 1993). A análise da seqüência do gene dessas
imunoglobulinas desencadeadoras de lesões lúpicas mostrou que há poucas
mutações somáticas na região variável da cadeia pesada (Ono et al., 1995),
diferindo de outros autoanticorpos como anticorpos IgG anti-DNA e fatores
reumatóides IgG observados nesses modelos (Shlomchik et al., 1990, 1987)
que se supõem causadores de lesões por imunocomplexos (Theofilopoulos
et al., 1985). Observou-se que esses anticorpos eram internalizados por
células endoteliais (Nose, comunicação pessoal). Nossos dados preliminares
utilizando soros de pacientes com leishmaniose visceral indicam a
possibilidade da existência de mecanismo semelhante de internalização de
imunoglobulinas por células endoteliais (Goto et al.,1997).
Diante desses achados, durante o mestrado, estudamos a
participação de imunoglobulinas no fígado, pulmão e rim de hamsteres
infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi. Em hamsteres
inoculados intraperitonealmente com 2x107 amastigotas de Leishmania
(Leishmania) chagasi observamos aumento progressivo da carga
parasitária no baço e no fígado e do título de anticorpos anti-Leishmania no
soro durante a evolução da infecção. Depósitos de IgG foram detectados,
por técnica imunoenzimática, no fígado acompanhando o sinusóide e no
pulmão nos septos alveolares. Os depósitos de C3 no fígado e no pulmão
não foram significantes quando comparados aos controles não infectados.
Como tanto a localização de depósitos de IgG quanto a ausência de
depósito de C3 não condizem com o mecanismo de deposição de
imunocomplexo, examinamos o rim e observamos depósitos de IgG ao
redor das paredes dos capilares glomerulares e nos túbulos e depósitos de
C3 de fraca intensidade. Em todos os órgãos os depósitos de IgG foram
mais intensos aos 30 e 45 dias PI (Mathias et al., 2001). A análise
histopatológica do fígado, do pulmão e do rim mostrou alteração
progressiva, porém, com mudança na composição do infiltrado inflamatório
sugerindo participação de mecanismos patogênicos diferentes em fases
diversas da infecção. Antígeno de leishmânia foi detectado nos órgãos no
interior de macrófagos e como material particulado extracelular. Como as
observações à microscopia óptica não foram totalmente compatíveis com a
deposição de imunocomplexos, partiu-se para estudo da internalização de
imunoglobulinas por células endoteliais e procedeu-se a análise qualitativa
e quantitativa da presença de imunoglobulinas, ultraestruturalmente, nestas
células. No fígado observou-se um alargamento do espaço de Disse e uma
maior quantidade de imunoglobulina em célula endotelial, no espaço de
Disse e sinusóide aos 30 dias pós-infecção em comparação aos controles
não infectados. No pulmão quantidade significantemente maior de
imunoglobulinas foi observada aos 30 dias pós-infecção em célula
endotelial quando comparado aos 60 dias pós-infecção. No rim depósitos
em quantidade significantemente maior de imunoglobulinas foram
observados em células endoteliais glomerulares e da região tubular e em
células epiteliais tubulares aos 30 dias pós-infecção quando comparados
aos controles não infectados. Os nossos resultados mostraram depósito e
internalização de imunoglobulinas em células endoteliais na leishmaniose
visceral em hamsteres. Este fenômeno ocorre marcadamente ao redor de
30 dias de infecção. Sugerimos a partir desses dados que este processo
pode ser um mecanismo alternativo de lesão na leishmaniose visceral
(Mathias, 2001).
Como o nosso trabalho está focado na participação de
imunoglobulinas internalizadas por células endoteliais e sabendo que estas,
desempenham um papel central em todo processo inflamatório (Pereira,
2000 e Mantovani et al., 1997) e que nossos dados anteriores mostraram
essa internalização prosseguimos com o estudo in vitro utilizando soros de
pacientes com leishmaniose visceral que indicam a possibilidade da
existência de mecanismo de internalização de imunoglobulinas pelas
células endoteliais vinculada à patogenia da inflamação na leishmaniose
visceral (Goto et al. 1997). Ao mesmo tempo, aprofundamos os estudos in
vivo em leishmaniose visceral em hamster detectando IgG por
imunodetecção e observação à microscopia de transmissão, uma vez que
analisamos depósitos de imunoglobulinas, sem identificação do isótipo.
A luz da literatura, o fator de necrose tumoral (TNF), produzido por
linfócitos e macrófagos, participa de todas as fases do processo inflamatório,
estimulando as células endoteliais a liberarem quimiocinas (IL-8 e proteína
quimiotática para neutrófilo), que agem separadamente sobre os leucócitos
aumentando o tropismo de Mac-1 e LFA-1 pelo ICAM-1. Também, estimulam
a migração dos leucócitos bem como a locomoção celular, o que
desencadeia o extravasamento leucocitário (Abbas et al., 1998; Ballermann,
1997; Rosenberg e Gallin, 1999). As células endoteliais têm papel
importante, tanto nas fases de vasoconstrição e vasodilatação arteriolares
quanto na exsudação plasmática e celular, no desencadeamento do
processo inflamatório.
Considerando a importância das células endoteliais no processo
inflamatório, a possibilidade da presença de um mecanismo alternativo de
lesão na leishmaniose visceral e supondo também que a internalização
possa desencadear a ativação de células endoteliais induzindo a expressão
de moléculas de adesão, importante na migração de células inflamatórias,
neste ponto baseamo-nos no fato de termos detectado em outro projeto do
nosso grupo, células T na lesão na nefropatia da leishmaniose visceral
canina (Costa et al., 2000), propomo-nos a estudar a patogenia da
internalização de imunoglobulinas por células endoteliais na leishmaniose
visceral em hamsteres.
OBJETIVO GERAL
Estudo do papel da imunoglobulina na patogenia da leishmaniose
visceral em fígado, pulmão e rim de hamsteres.
Objetivos Específicos
In vitro
estudo do processo de internalização de IgG do soro de pacientes e
hamsteres com leishmaniose visceral e de soros de pacientes com
leishmaniose tegumentar por células endoteliais de veia de cordão
umbilical humano (HUVEC)
In vivo
estudo ultraestrutural da detecção de IgG em tecido de hamsteres
com leishmaniose visceral por microscopia eletrônica de transmissão
estudo da microcirculação na bochecha evertida de hamsteres por
microscopia de fluorescência intravital
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras de soros
Soros foram obtidos de 13 pacientes com diagnóstico confirmado de
leishmaniose visceral (LV) por achado de Leishmania em aspirado de
medula óssea, 15 pacientes com leishmaniose tegumentar (LT) com
diagnóstico confirmado pelo teste cutâneo de Montenegro e análise
histopatológica das lesões cutâneas e seis soros de controles normais com
anticorpo anti-Leishmania negativo. Todos os pacientes com LV são
oriundos do Nordeste, os pacientes com LT são do Nordeste e Sudeste do
Brasil e os controles normais são doadores saudáveis voluntários. Todos os
procedimentos com pacientes foram seguidos de acordo com as normas
éticas institucionais.
Parasitos
Leishmania (Leishmania) chagasi (MHOM/BR/72/cepa 46) foram
mantidas em hamsteres por inoculações sucessivas de homogeneizado de
baço de animais infectados com parasito a cada três meses. Para os
experimentos, hamsteres com leishmaniose visceral, com dois a três meses
de infecção, foram sacrificados sob anestesia e o baço foi removido
assepticamente e as amastigotas foram purificadas de acordo com Dwyer
(1976), com algumas modificações. Resumidamente, os baços foram
homogeneizados em meio RPMI 1640 (GIBCO, EUA) frio, a suspensão
celular foi deixada por 10 minutos em gelo, o pellet foi filtrado em gaze,
passado quatro vezes em agulha fina (24G) e centrifugado a 250 x g por 10
minutos. O sobrenadante foi recuperado e centrifugado novamente a 250 x g
por 10 minutos. Posteriormente, o sobrenadante resultante foi centrifugado a
2100 x g por 15 minutos. O sedimento foi ressuspenso em meio RPMI 1640
e a concentração de parasitos foi ajustada para 2x107/ml em meio RPMI
1640.
Animais e protocolo experimental
Setenta e oito hamsteres (Mesocricetus auratus) outbred, machos,
com idade de 45 a 60 dias, fornecidos pelo Centro de Bioterismo da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP) foram
mantidos no Biotério de Experimentação do Instituto de Medicina
Tropical de São Paulo durante o experimento. Os animais foram
manuseados e sacrificados sob anestesia geral usando-se 0,1 mL (60
mg/mL) de pentobarbital sódico. Cinqüenta hamsteres foram
inoculados intraperitonealmente com 2x107 amastigotas de
Leishmania (Leishmania) chagasi e sacrificados aos 15, 30, 45 e 60
dias pós-infecção (PI). Vinte e oito animais controles foram inoculados
com meio RPMI 1640 e sacrificados nos mesmos períodos de tempo.
No momento do sacrifício foram coletados sangue, fígado, pulmão e
rim. Fragmentos de tecidos foram utilizados para técnica de
imunoistoquímica e imunoeletrônica.
Purificação de IgG por cromatografia de afinidade com proteína G-
Sefarose
Soro de hamsteres misturado com solução salina volume a volume foi
acrescido de (NH4)2SO4 80%, gota a gota. A solução foi deixada por 12
horas em geladeira para sedimentação, sendo o pellet lavado duas vezes
com 20 mL de sulfato de amônia e centrifugado a 3000g por 15 minutos e o
pellet final foi ressuspenso em um mL de NaCl 0,85%. A solução final foi
transferida para tubos de diálise (Sigma, EUA), sendo a ausência de sulfato
de amônia verificada na solução pela reação com BaCl2 10%. Foi iniciada a
diálise contra solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,01M, pH 7,2
trocando-se o banho a cada três horas. Após centrifugação, o sobrenadante
resultante foi recuperado, sendo este gama-globulina. As amostras foram
dialisadas e o sobrenadante resultante, ou seja, a imunoglobulina,
centrifugada novamente. Após serem filtradas em pré-filtro e depois em filtro
de 0,45 µm, as amostras foram passadas em coluna de proteína G-Sefarose
(Pharmacia, EUA), aproximadamente dois mL, overnight. Lavadas com
tampão PBS, pH 7,2, checando a saída no espectro 280 nm até zerar.
Eluídas com ácido acético 0,5 M, pH 3,0. O eluato foi coletado em 2 M de
Tris-HCl, pH 9,0 e a medida da densidade óptica foi feita no
espectrofotômetro (Pharmacia, EUA). As amostras foram então filtradas e
guardadas até o uso.
Fator para IgG – D.O.mg/ml
1,5
Internalização de IgG por células endoteliais da veia de cordão
umbilical humano (HUVEC)
HUVEC obtidas de acordo com Jaffe et al. (1973) foram cultivadas em
meio E300 (Kyokutou, Ibaraki, Japão) para células endoteliais,
suplementado com 5 % de soro fetal bovino inativado pelo calor (GIBCO,
EUA) em placas pré-tratadas com 10 µg/mL de fibrinogênio do plasma
bovino (Sigma, EUA) em solução salina balanceada de Hanks (GIBCO,
EUA). As células foram mantidas a 37 oC em 5 % de CO2 , até atingir o
estágio subconfluente e foram usadas nos experimentos do terceiro ao
décimo repique. Para o estudo da internalização de IgG do soro por HUVEC,
as células foram cultivadas em placas Lab-Tek Chamber (NUNC,
Dinamarca) ou em placas de cultura de seis orifícios (Costar, EUA) pré-
tratada com fibrinogênio até atingir estado subconfluente, depois incubadas
por duas horas em meio E300 contendo 30 % das amostras dos diferentes
soros. As células cultivadas em placas de seis orifícios foram processadas
para quantificar a IgG internalizada por ELISA de captura como descrito
abaixo.
Culturas em placas Lab-Tek Chamber foram processadas para
observação em microscopia de fluorescência. As lâminas foram removidas
das placas Lab-Tek Chamber, lavadas três vezes com 0,01 M de solução D-
PBS (Dulbecco`s phosphate-buffered saline), pH 7,2, com 1 % de albumina
bovina (BSA- Sigma, EUA) e 0,02 % de azida sódica (Sigma, EUA). As
lâminas foram fixadas por 30 minutos a 4 oC em paraformaldeído 2%
(Sigma, EUA), hidrocloreto de L-Lysina 0,1M em tampão fosfato 0,05M, pH
7,4 contendo 0,01M periodato de sódio. Após três lavagens em D-PBS-1%
BSA as células foram incubadas com anticorpo de coelho anti-IgG humana
conjugado com FITC (Dako, EUA), por 60 minutos a 4 oC. Após 3 lavagens
em PBS-1% BSA, as células foram incubadas com 4 µg/ml de iodeto de
propídio (Sigma, EUA) em PBS-1% BSA por 10 minutos, lavadas 3 vezes e
montadas em glicerol-PBS (9:1 vol/vol) e analisadas ao microscópio de
fluorescência (Zeiss, Alemanha).
Determinação de IgG internalizada por ELISA de captura
HUVEC cultivadas em placas de cultura de seis orifícios e incubadas
com os soros testes foram rompidas com 0,1 % de Triton X 100 em
Na3C6H5O72H2O, pH 7,4, e as amostras foram avaliadas pela determinação
de IgG. Anticorpo de cabra anti-IgG humana diluída 1:50 em D-PBS (50
µL/orifício) foi dispensado em uma placa de ELISA de 96 orifícios (Dynatech,
EUA), incubadas overnight a 4 oC, lavadas três vezes com PBS, bloqueadas
com leite em pó (10 %) em DPBS (100 µL/orifício) por uma hora a
temperatura ambiente e posteriormente lavadas três vezes com D-PBS 0,1
% Tween 20. Foi realizada incubação com amostras testes preparadas em
placa plana ou amostra padrão (IgG humana) serialmente diluída em
PBS/T/1 % BSA (Sigma, EUA) (50 µL/orifício) por uma hora a 37 oC e
posteriormente lavadas três vezes com D-PBS/T. Feita incubação com
F(ab`)2 de cabra anti-IgG humana conjugada com fosfatase alcalina (Protos,
EUA) diluída 1:1000 em PBS/T/BSA (50 µL/orifício) por uma hora a 37 oC.
Antes de serem incubadas com o substrato 104R (Sigma, EUA) em tampão
(1 mg/ml, 1 tab./5 ml) (100 µL/orifício) por 15 a 60 minutos a 37 oC, em 9,7 %
de dietanolamina, 3,07 mM NaN3, 0,49 mM de MgCL26H2O, pH 9,8, a placa
foi lavada quatro vezes com PBS/T.
Detecção de IgG nos tecidos por microscopia eletrônica de
transmissão
Fragmentos de tecido de cerca de 0,3 mm3 foram fixados por duas horas
em paraformaldeído 4% e aldeído glutárico 0,1%, em tampão fosfato 0,1M
pH 7,4, lavados três vezes por 15 minutos cada com tampão fosfato 0,1M pH
7,4 e incubados com 50mM de cloreto de amônia em tampão fosfato 0,1 M
pH 7,4 por 15 minutos. Em seguida, foram desidratados em concentrações
crescentes de etanol, incluídos em resina LR White hard grade (Sigma,
U.S.A) / etanol 1:1 (vol:vol) por 30 minutos, LR White:etanol 3:1 (vol:vol)
duas vezes por 30 minutos, LR White:etanol 3:1 (vol:vol) overnight a 4°C, LR
White puro duas vezes por 30 minutos cada, LR White puro overnight a 4°C,
mais uma vez em resina pura por uma hora, e depois colocados em
cápsulas de gelatina que foram preenchidas até a borda com LR White puro
e conservadas em estufa a 52 ºC por três a cinco dias, para polimerização.
Cortes ultrafinos foram colocados em telas de níquel (Sigma, EUA) cobertos
com formvar e foram lavadas uma vez em PBS por cinco minutos. Após
hidratação com PBS acrescido de 0.1% de albumina bovina (Tampão BSA)
pH 7,4 por cinco minutos, foram incubados com anticorpo biotinilado de
cabra anti-IgG de hamster (20 µg/ml em tampão BSA) (Rockland,
Gilbertsville, PA, USA ) por duas horas em câmara úmida em temperatura
ambiente. Antes da incubação com proteína A-ouro 10 nm (Sigma, USA)
diluída 1:10 em PBS pH 7,4 – 1% de BSA por duas horas em câmara úmida
em temperatura ambiente, foram lavadas duas vezes por cinco minutos
cada, seguidas de quatro lavagens de quatro minutos em PBS pH 7,4,
0,05% Tween 20, 1% de BSA e por um minuto em água destilada. Foram
fixadas em glutaraldeído aquoso 2% por 15 minutos, lavaram-se novamente
três vezes em água destilada, incubadas por cinco minutos com tetróxido de
ósmio aquoso 1%, lavadas três vezes em água destilada por 15 minutos.
Secaram-se a temperatura ambiente e em seguida foram incubadas, para
contraste, com uranila ultrafiltrada por 10 minutos, lavadas várias vezes
rapidamente em água destilada e por cinco minutos com chumbo, sendo
novamente lavadas em água destilada. Os cortes ultrafinos processados
foram observados ao microscópio eletrônico de transmissão JEOL. Os
campos de interesse foram eletromicrografados, analisados e submetidos à
análise morfométrica.
Morfometria
As eletromicrografias foram analisadas para quantificação de
depósitos de imunoglobulina e IgG presentes nos tecidos, marcadas por
partículas de proteína A-ouro. Para isso, utilizou-se uma folha transparente
quadriculada (cada quadriculado de um cm2) que foi sobreposta às
eletromicrografias. Delimitou-se a área de cada célula endotelial e foram
contadas as partículas de proteína A-ouro a cada cinco quadrados, contando
assim 20% da área. Para avaliar os depósitos inespecíficos de proteína A-
ouro, foram contadas partículas encontradas sobre o núcleo das células que
foram consideradas não específicas e subtraídas da contagem do
citoplasma das células endoteliais. Utilizaram-se cortes de tecidos de fígado,
pulmão e rim de animais infectados aos 30 e 60 dias e de animais controles
não infectados. A análise morfométrica foi realizada num total de 24
eletromicrografias de fígado, em 26 de pulmão e em 21 de rim.
Microscopia de fluorescência intravital
Hamsteres foram anestesiados intraperitonealmente com 0,1 ml de
pentabarbital sódico (60 mg/ml), sendo suplementado intravenosamente com
2,5% de solução de cloralose (∼0,1 ml/hora) através de um catéter (PE 10)
na veia femoral direita. Um outro catéter foi introduzido na veia femoral
esquerda sendo usado para infusão de FITC-dextran. Uma cânula traqueal
(PE 190) foi inserida para facilitar a respiração espontânea e a temperatura
do corpo foi mantida a 37 oC por uma placa aquecedora e o controle foi feito
por termômetro retal. A bolsa da bochecha foi preparada para microscopia
intravital de acordo com Duling (1973) com modificações (Svensjö, 1978 e
1990) (Figura 1). Resumidamente a bolsa foi evertida e fixada na placa do
microscópio e uma área de um cm2 foi preparada para microscopia intravital.
A bolsa foi perfundida com solução salina tamponada com bicarbonato
aquecida a 35 oC, que estava continuamente borbulhando em função das
concentrações de 95% de N2 e 5% de CO2 para manter a baixa tensão de
O2 (∼4 kPa) e um pH de 7,4. Trinta minutos após completada a preparação,
dextran marcado com fluoresceína (FITC-dextran, MW= 150000, TdB
Consultancy, Uppsala - Sweden) usado como marcador macromolecular, foi
injetado intravenosamente (25 mg/100 gb.w.). O aumento da permeabilidade
microvascular foi quantificado por grandes moléculas e por contagem de
pontos fluorescentes (locais de extravasamento plasmático) em vênulas pós-
capilares (Svensjö, 1978 e 1990). O número de extravasamentos foram
contados antes de dois, cinco, sete, quinze e trinta minutos e após aplicação
tópica de histamina 5x10-6 M por cinco minutos. A resposta da
permeabilidade vascular a histamina foi estudada em hamsteres que tinham
sido injetados intraperitonealmente com meio RPMI 1640 (controle) ou com
amastigotas purificadas de Leishmania (L.) chagasi e a microcirculação da
bochecha foi estudada em 15, 30, e 60 dias pós-infecção por microscopia
fluorescente intravital. Para cada período de tempo um número de quatro a
seis hamsteres controles e seis a sete hamsteres infectados por Leishmania
foram estudados. Em outro estudo, hamsteres normais foram preparados e
IgG purificadas (290µg/ml) de hamsteres infectados por Leishmania e não
infectados foram aplicadas topicamente na bochecha.
Análise estatística
Os dados da detecção de IgG em tecidos analisados à microscopia
eletrônica de transmissão e os obtidos pela microscopia intravital foram
submetidos à análise estatística utilizando o programa Sigma Stat (Sigma,
EUA). Foram analisados pelos testes One Way ANOVA e de Kruskal-Wallis
e Dunn. Foram consideradas significantes as diferenças quando p < 0,05.
RESULTADOS
Estudamos a internalização de imunoglobulinas por células
endoteliais in vitro e in vivo na leishmaniose visceral em hamsteres. Além
disso, temos pesquisado o efeito patofisiológico da IgG na microcirculação
na leishmaniose visceral em hamsteres.
Internalização de IgG por célula endotelial de veia de cordão
umbilical humano (HUVEC)
Quando HUVEC foram incubadas com soros de pacientes com
leishmaniose visceral, observamos maior intensidade de IgG marcada em
células endoteliais em 11 dos 13 soros (Figura 2A), enquanto que, com
soro de leishmaniose tegumentar, observamos pouca marcação de IgG
em apenas algumas células endoteliais em oito dos 15 soros analisados
(Figura 2B). Já com soros normais observamos uma discreta marcação
de IgG (dados não apresentados). Pacientes com leishmaniose visceral
apresentam hipergamaglobulinemia, por isso a internalização de IgG por
células endoteliais foi quantitativamente avaliada após incubação de
HUVEC com as mesmas concentrações de IgG dos diferentes soros em
meio E300. Alta ingestão de IgG do soro de pacientes com leishmaniose
visceral foi confirmada por ELISA de captura (N=10; mediana=230,
variação – 60 a 2.610 pg/ 1000 células) quando comparado aos pacientes
com leishmaniose tegumentar (N=8; mediana=30, variação – 30 a 260 pg/
1000 células). Quando soros de hamsteres com leishmaniose visceral,
interagindo com HUVEC, foram analisados, observamos intensa
marcação de IgG com amostras de 30 (Figura 2C) e 45 (Figura 2D) dias
pós-infecção (PI). A marcação de IgG com soros de animais controles não
infectados e infectados de outros períodos experimentais foi muito
discreta (dados não apresentados).
C
A B
D
Figura 2. Detecção de IgG em células endoteliais da veia de cordão umbilicalhumano (HUVEC) incubadas com soros de pacientes e hamsteres comleishmaniose visceral e de pacientes com leishmaniose tegumentar. A) Soros depacientes com leishmaniose visceral. B) Soros de pacientes com leishmaniosetegumentar. C e D) Soros de hamsteres com leishmaniose visceral aos 30 e 45dias pós-infecção, respectivamente. Fluorescência. 400X.
Detecção de IgG em tecido de hamster com leishmaniose visceral por
microscopia eletrônica de transmissão
Quando verificamos in vitro a internalização de IgG do soro de pacientes e
hamsteres com leishmaniose visceral por células endoteliais (HUVEC),
prosseguimos com o estudo in vivo da leishmaniose visceral em hamsteres,
detectando IgG em células endoteliais de fígado, pulmão e rim, aos 30 e 60
dias PI, por microscopia eletrônica de transmissão.
Fígado
Quando analisamos qualitativamente a presença de IgG (partículas de
proteína A-ouro) sobre as diferentes estruturas do fígado, observamos maior
quantidade de partículas nas amostras dos animais infectados do que nos
controles não infectados (Figuras 3, 4 e 5).
A análise morfométrica foi realizada em seis animais controles não
infectados, em nove animais com 30 dias PI e em nove animais com 60 dias
PI.
Quantitativamente, observamos maior marcação com proteína A-ouro
aos 30 dias PI em células endoteliais em relação aos controles não
infectados e no sinusóide observamos maior marcação em relação aos
animais com 60 dias de infecção. Já aos 60 dias PI verificamos maior
quantidade de partículas em células endoteliais em relação aos controles
não infectados (Tabela 1 e Figura 6). Nas outras estruturas estudadas não
foram observadas diferenças significantes.
Fígado Controle 30 30PI 60PI
Célula endotelial 0 (n=06)
0,32±0,24* (n=09)
0,13±0,06* (n=09)
Sinusóide 0 (n=05)
0,11±0,21** (n=08)
0 (n=07)
Tabela 1. Análise morfométrica (média ± desvio padrão). Número de
partículas de proteína A-ouro /cm2 no fígado. Detecção de imunoglobulina G
de hamster com anticorpo de cabra anti-IgG de hamster. N= número total de
eletromicrografias. PI = pós-infecção. * P < 0,05 em relação aos controles
não infectados. ** P < 0,05 em relação aos animais com 60 dias PI. (testes
de Kruskal Wallis e Dunn).
Pulmão Foram analisadas eletromicrografias de nove animais controles, de
seis animais com 30 dias PI e de 11 animais com 60 dias PI. Analisamos
qualitativamente as eletromicrografias e observamos maior quantidade de
partículas nas amostras dos animais infectados do que nos controles não
infectados (Figuras 7, 8 e 9).
Na análise quantitativa observamos quantidade significantemente
maior de IgG marcadas por proteína A-ouro em células endoteliais aos 30
dias PI e aos 60 dias PI quando comparados aos controles não infectados
(Tabela 2 e Figura 10). Nas outras estruturas estudadas não foram
observadas diferenças significantes.
Pulmão Controle 30 30PI 60PI
Célula endotelial 0 (n=09)
0,26±0,18* (n=06)
0,23±0,28* (n=11)
Tabela 2. Análise morfométrica (média ± desvio padrão). Número de
partículas de proteína A-ouro /cm2 no pulmão. Detecção de imunoglobulina
G de hamster com anticorpo de cabra anti-IgG de hamster. N= número total
de eletromicrografias. * P < 0,05 em relação aos controles não infectados
(testes de Kruskal Wallis e Dunn).
Rim
A análise morfométrica foi realizada em 10 animais controles não
infectados, em seis animais com 30 dias PI e em cinco animais com 60 dias
PI.
Qualitativamente observamos presença de partículas de proteína A-
ouro tanto nos animais infectados quanto nos animais controles não
infectados (Figuras 11, 12 e 13), porém em maior quantidade nos animais
infectados.
Na análise quantitativa, observamos quantidade significantemente
maior de IgG marcada por proteína A-ouro em célula endotelial glomerular
aos 60 dias PI quando comparada aos 30 dias PI e aos controles não
infectados (Tabela 3 e Figura 14).
Rim Controle 30 30PI 60PI Célula endotelial 0,04±0,06
(n=10) 0,11±0,13
(n=06) 0,58±0,50*
(n=05) Tabela 3. Análise morfométrica (média ± desvio padrão). Número de
partículas de proteína A-ouro /cm2 no rim. Detecção de imunoglobulina G de
hamster com anticorpo de cabra anti-IgG de hamster. N= número total de
eletromicrografias. * P < 0,05 em relação aos controles não infectados
(testes de Kruskal Wallis e Dunn).
Estudo da microcirculação por microscopia intravital
Considerando que as células endoteliais estão envolvidas no
processo inflamatório e que as alterações na permeabilidade vascular é um
dos principais fatores da inflamação, este aspecto foi estudado na
microcirculação da bochecha de hamster. Quando estimulamos a bochecha
com histamina, todos os hamsteres responderam a histamina com aumento
do número de extravasamento pós-capilar que foi reversível com o tempo.
No grupo controle nenhuma diferença significante foi observada na
magnitude da resposta a histamina aos 15, 30 e 60 dias. Nos animais
infectados a resposta à histamina foi menor aos 30 dias (P<0,05) do que nos
animais controles (Figura 15). Quando realizamos o experimento usando IgG
purificada dos soros de hamsteres infectados e não infectados, observamos
aumento significante no número de extravasamento pós-capilares nas
amostras de 60 dias PI quando comparados com o controle não infectado e
as amostras de 30 dias PI (Figura 16). Na figura 17 representamos o
aspecto normal da microcirculação e o extravasamento plasmático antes e
após o estímulo com histamina, respectivamente.
DISCUSSÃO
O mecanismo imunopatológico de lesão tecidual na leishmaniose
visceral é atribuído à deposição de imunocomplexos, principalmente no rim
(Weisinger et al., 1978; Tafuri et al., 1989; Sartori et al., 1987), porém
quando da análise da presença de imunocomplexo, principalmente, a
ausência ou pouca quantidade de antígeno (Brito et al., 1975), assim como a
localização diferenciada de antígeno, imunoglobulina e complemento não
ratificam esta hipótese plenamente, havendo, portanto necessidade de
avaliação de outro possível mecanismo estar envolvido na lesão tecidual.
Mecanismo alternativo de lesão tecidual foi analisado em rim de
camundongo com nefrite lúpica, sendo mostrado a participação de
imunoglobulinas (Itoh et al., 1993; Ono et al., 1995). O papel dessas
imunoglobulinas envolve a internalização das mesmas por células
endoteliais, sugerindo ser este o possível mecanismo de injúria tecidual na
nefrite lúpica em camundongos (Fujii et al., 2003). Na leishmaniose visceral
ocorre lesão tecidual que já foi anteriormente relacionado à presença de
imunocomplexo ou participação de células T (Sartori et al. 1987, Costa et al.,
2000). Como a leishmaniose visceral apresenta lesão tecidual semelhante a
que ocorre na nefrite lúpica, analisamos anteriormente a internalização de
imunoglobulinas total por células endoteliais em tecido renal, pulmonar e
hepático de hamsteres com leishmaniose visceral experimental e
observamos maior detecção de imunoglobulinas aos 30 e 45 dias pós-
infecção (Mathias et al., 2001).
Como havíamos detectado imunoglobulinas internalizadas in vivo,
partimos neste estudo para avaliar a participação de imunoglobulina G na
imunopatogenia, avaliando a internalização das mesmas como possível
papel de lesão tecidual. Inicialmente, estudamos a interação de
imunoglobulina de soro de pacientes com leishmaniose visceral ou com
leishmaniose tegumentar e de hamsteres com leishmaniose visceral
experimental e observamos intensa marcação de IgG células endoteliais de
veia de cordão umbilical humano, quando utilizamos soros de animais com
30 e 45 dias de infecção e soro de pacientes com leishmaniose visceral. Os
dados sugerem internalização de IgG, não somente a presença de IgG na
superfície, pois, detectamos IgG em células após remoção utilizando
detergente que supostamente removem IgG por ventura presente na
superfície celular, procedimento utilizado quando medimos a concentração
de IgG presente nas células HUVEC. A IgG internalizada não parece ser
espacífica a antígenos de Leishmania pois não se observou correlação com
título de anticorpos anti-leishmânia.
A internalização de imunoglobulinas por células vivas foi relatada
inicialmente por Alarcón-Segovia et al. (1979) que observaram este
fenômeno em linfócitos T e na ocasião foi correlacionada a autoperpetuação
da doença autoimune. O estudo deste mecanismo tinha sido abandonado na
última década, tendo sido retomado nos últimos anos. Recentemente,
surgiram relatos de internalização de imunoglobulinas envolvendo diferentes
células. Yanase et al. (1997) observaram a internalização de anticorpos
monoclonais anti-DNA, provenientes de modelo experimental de lupus
eritematoso sistêmico, em células da linhagem de hepatoma.
Imunoglobulinas de soros de pacientes com mieloma foram internalizadas
por células de túbulos renais contorcidos proximais (Batuman et al., 1997).
Também Ronda et al. (1997), observaram a internalização de
imunoglobulinas normais em células endoteliais humanas. Recentemente,
Fuji et al. (2003) mostraram a interação entre anticorpos particulares e
integrinas da superfície de células endoteliais via fibronectina e sua
internalização por células endoteliais levando a deposição de anticorpos no
glomérulo, sugerindo que este possa ser o mecanismo de injúria glomerular
em nefrite lúpica.
Nossos dados de internalização de IgG por células endoteliais
sugerem um possível mecanismo de imunopatogenia na leishmaniose
visceral, pois essas células são peças importantes na inflamação, entretanto
o processo de entrada de IgG nessas células não está esclarecido. Em
nefrite lúpica este processo de entrada parece ser via transcitose de
anticorpos internalizados por células endoteliais glomerulares ou ainda
passagem através de junções intercelulares (Fujii et al., 2003). Também, as
células endoteliais quando ativadas expressam receptores diversos, tais
como de fibronectina e de moléculas de adesão, que desempenham papel
fundamental na resposta inflamatória atraindo células inflamatórias para o
local da injúria. Além disso, as alterações que ocorrem na superfície das
células endoteliais são mediadas por citocinas e levam à adesão de
neutrófilos, linfócitos e monócitos, seqüencialmente, que participam
ativamente do processo inflamatório (Pereira, 2000).
Como havíamos demonstrado a internalização de imunoglobulinas in
vitro, partimos para análise in vivo. Avaliando a internalização de IgG do soro
de hamster infectado com Leishmania (L.) chagasi por células endoteliais no
fígado, pulmão e rim, por microscopia eletrônica de transmissão,
observamos resultados similares aos obtidos in vitro. A análise quantitativa
mostrou maior número de partículas de proteína A-ouro marcando IgGs
internalizadas por células endoteliais aos 30 e 60 dias PI no fígado e no
pulmão enquanto que no rim, estas foram verificadas em quantidade
significante aos 60 dias PI. Estes nossos achados in vivo corroboram os
achados in vitro demonstrando que células endoteliais estão envolvidas na
internalização de imunoglobulinas. Em deferência a internalização de IgG
por células endoteliais nos rins ocorrerem após um tempo maior de doença,
hipotetizamos que tal fenômeno ocorra, porque este órgão recebe 25% do
rendimento cardíaco, comporta pressão intraglomerular mais alta nos
capilares glomerulares que em outros capilares sanguíneos, os capilares
glomerulares formam uma grande superfície permeável através da qual
proteínas circulantes são filtradas e podem interagir diretamente com
constituintes de parede dos capilares glomerulares (Abrass, 1997). Estas
peculiaridades do referido órgão podem refletir a diferença de internalização
de imunoglobulinas dos outros órgãos, pois supomos que as lesões
teciduais ocorram mais tardiamente no rim do que nos outros órgãos
analisados.
O mecanismo de internalização in vivo, também não está bem
descrito, entretanto na célula endotelial do fígado são conhecidos dois
mecanismos de transporte de substâncias que são a endocitose e o da
passagem direta por uma espécie de janela (Arii, 2000). Bastian et al. (1997)
descreveram uma via de transporte paracelular de fator de crescimento
insulina-símile I (IGF-I) através das células endoteliais da veia de cordão
umbilical humano diferente da via transcelular mediada por receptor. Já a
albumina e a transferrina se ligam em locais específicos no endotélio,
evidenciando a presença de um mecanismo similar ao transporte mediado
por receptor de vasos pequenos (Malik et al., 1989). Além disso, a albumina
pode interagir na seletividade e permeabilidade da parede capilar (Curry,
1985). O transporte através da célula endotelial, sendo por endocitose ou
por passagem direta, implica num processo ativo ou passivo.
Para certificarmos da implicação de imunoglobulinas no processo
inflamatório e sabendo que células endoteliais tem um papel importante na
inflamação, pesquisamos o efeito patofisiológico da IgG na leishmaniose
visceral. Estudamos a permeabilidade macromolecular vascular da
bochecha evertida de hamster, observamos aumento reversível no número
de extravasamentos pós-capilares, exceto no grupo de 30 dias pós-infecção,
que não responderam à ação vasodilatadora da histamina. Para testar
diretamente o efeito da IgG de hamster com leishmaniose visceral, esta foi
purificada e depois aplicada na bochecha de hamster normal. Quando IgG
de hamster aos 60 dias PI foi aplicada, observamos um extravasamento
significante que revelou a propriedade vasoativa da IgG obtida neste período
de infecção. O papel da IgG de hamster tornou-se evidente no
extravasamento plasmático, sugerindo que aos 30 dias de infecção IgG seria
internalizada por células endoteliais provocando vasodilatação e
promovendo inflamação, razão pela qual o hamster aos 30 dias não
responderia ao estímulo com histamina. Estando a imunoglobulina
internalizada por células endoteliais, não estando disponível na circulação,
não apresentariam nenhum efeito sobre os vasos sanguíneos de hamster
normal. No entanto, aos 60 dias a IgG, não estando internalizada por células
endoteliais, estaria disponível na circulação e exerceria seu efeito vascular.
Esses achados vão de encontro aos obtidos com a internalização de IgG por
células endoteliais em rim por microscopia eletrônica de transmissão quanto
à cronologia.
Os fenômenos que ocorrem no processo inflamatório são
caracterizados como irritativos, vasculares e exsudativos. Os fenômenos
irritativos ocorrem em resposta ao agente inflamatório, resultando na
liberação de mediadores químicos, perdurando por tempo variável durante a
inflamação, variando de caso para caso. Os mediadores de liberação
imediata são responsáveis pelo início dos fenômenos vasculares que são
representados por modificações hemodinâmicas e reológicas da
microcirculação dirigidas pelos mediadores químicos durante os fenômenos
irritativos e, menos freqüentemente, por ação direta dos agentes
desencadeadores de inflamação. As modificações são atribuídas a
vasoconstrição e vasodilatação arteriolares. A vasoconstrição arteriolar é
imediata ao estímulo inflamatório e possivelmente seja mediada pela ação
do agente agressor sobre fibras nervosas vasoconstritoras. Na lesão
vascular direta possivelmente haja liberação de endotelina-1 que participa
ativamente da vasoconstrição. Na vasodilatação arteriolar induzida pela
ação da histamina, substância P, bradicinina, PGE2, PGI2 e PAF
(mediadores químicos), aumentam o fluxo sanguíneo para a área agredida
levando a hiperemia e ao aumento da pressão hidrostática na
microcirculação. Os mediadores das alterações hemodinâmicas aumentam a
permeabilidade vascular iniciando a transudação plasmática que precede a
migração celular. Ainda nessa fase, há produção de substâncias
vasodilatadoras, como a prostaciclina (PGI2) e o óxido nítrico (NO). Na
exsudação celular, ocorre deslocamento dos leucócitos da região central da
corrente sanguínea para a periferia do vaso (marginação leucocitária) onde
inicia o evento de aderência desses ao endotélio (Pereira, 2000 em
Bogliolo). A mais importante atividade pró-inflamatória do endotélio é a
expressão de receptores, para as várias famílias de moléculas de adesão
expressas na superfície dos leucócitos, sendo caracterizadas a molécula-1
de adesão leucocitária (E-selectina ou ELAM-1), a molécula-1 de adesão
intercelular (ICAM-1) e a molécula-1 de adesão a células vasculares (VCAM-
1). A E-selectina participa ativamente da fase inicial da resposta inflamatória
tendo papel primordial na fixação inicial de neutrófilos nas vênulas dos
tecidos periféricos e também pode contribuir para a ligação inicial a outros
tipos de células inflamatórias. VCAM-1 participa numa fase mais tardia
mediando a fixação inicial de linfócitos T de memória e de leucócitos que
expressem molécula de integrina. Semelhante a VCAM-1, a ICAM-1 é
induzida no mesmo curso de tempo, porém é mais crítica para a
transmigração de leucócitos. As células inflamatórias, linfócitos T e
neutrófilos interagem com ICAM-1 e VCAM-1, respectivamente, através de
LFA-1 e de Mac-1. As alterações que ocorrem na superfície das células
endoteliais são mediadas por citocinas, e levam à adesão de neutrófilos,
linfócitos e monócitos seqüencialmente que participam ativamente do
processo inflamatório.
Sugerimos, a partir dos nossos dados, que a patogenia das lesões na
leishmaniose visceral humana e experimental, nos diferentes órgãos e
diferentes períodos de tempo, são dependentes de mecanismo que envolva
a participação de imunoglobulinas.
Para comprovarmos os nossos achados sobre o papel da
imunoglobulina na patogênese da lesão na leishmaniose visceral estudos
futuros serão planejados para estudar as características da IgG; se o
processo de internalização é dependente de mecanismo que requer ativação
celular ou se é um processo passivo, sendo necessário para isso, analisar a
fosforilação de proteínas intracelulares logo após a internalização e, avaliar
efetivamente se a internalização pode influenciar a expressão de moléculas
de adesão por células endoteliais, verificando se este fato pode ter relação
ao aumento na produção de diferentes quimiocinas na fase inicial e final da
infecção, culminando na migração de células mononucleares, inclusive
células T, na lesão, observada na nefropatia da leishmaniose visceral canina
(Costa et al., 2000).
CONCLUSÕES
Observa-se a internalização de imunoglobulinas por células
endoteliais tanto com soros de pacientes quanto com os de
hamsteres com leishmaniose visceral in vitro.
Observa-se a internalização de imunoglobulinas por células
endoteliais de fígado, pulmão e rim em diferentes tempos de infecção.
Ocorre alteração da resposta capilar a histamina na leishmaniose
visceral de hamster e a IgG induz alteração na permeabilidade a
macromoléculas.
Os dados sugerem que IgG tem participação na inflamação
possivelmente pela sua internalização.
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“O homem que evita dúvidas nunca vai encontrar certezas”
Raphael Gancz
