UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC – CCNH

FELIPE SILVA DE ALCÂNTARA FERNANDO HENRIQUE GOMES ZUCATELLI

GUSTAVO PASSOS MEDROS LEANDRO PEREIRA DOS SANTOS

THIAGO RODRIGUES BRITO

RELATÓRIO DE TRANSFORMAÇÕES BIOQUÍMICAS – TURMA A1 EXPERIÊNCIA 3 – DESNATURAÇÃO E PRECIPITAÇÃO DE

PROTEÍNAS

SANTO ANDRÉ

MARÇO / 2010

Sumário

1. INTRODUÇÃO..............................................................................................................2 2. OBJETIVOS...................................................................................................................3 3. METODOLOGIA...........................................................................................................3

3.1. Materiais .....................................................................................................................3 3.2. Reagentes....................................................................................................................4 3.3. Métodos ......................................................................................................................4

3.3.1. Parte 1: Atividade enzimática do suco de abacaxi e desnaturação protéica por aquecimento..........................................................................................................................4 3.3.2. Parte 2: Precipitação de proteínas..........................................................................5

4. RESULTADOS ..............................................................................................................5 4.1.1. Parte 1 ....................................................................................................................5 4.1.2. Parte 2 ....................................................................................................................6

5. DISCUSSÃO..................................................................................................................7 6. CONCLUSÃO................................................................................................................8 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................................9

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1. INTRODUÇÃO

A manutenção da vida celular depende da continua ocorrência de um conjunto

de reações químicas, que devem atender duas exigências fundamentais: Elas

devem ocorrer em velocidades adequadas à fisiologia celular e precisam ser

altamente especificadas de modo a gerar produtos definidos [1].

As enzimas, substâncias orgânicas normalmente de origem protéica, são

responsáveis por essa manutenção, pois além de atender as duas requisições

principais regula a velocidade das reações celulares facilitando os processos.

Diferentes enzimas catalisam diferentes passos da via metabólica e cada enzima

pode sofrer uma regulação de sua atividade [1].

Nas reações enzimáticas, os reagentes são chamados de substratos, e cada

enzima é capaz de desenvolver reações apenas em seu determinado substrato

graças a uma região em sua estrutura denominada sitio ativo que armazena o

substrato especifico que a enzima devera catalisar. Logo, as enzimas são

extremamente especificas ao substrato onde atuam. Porém algumas enzimas

necessitam da presença de um cofator, orgânico ou inorgânico, para auxiliar a

reação que esta catalisa [1].

Enzimas Proteolíticas ou Proteases são enzimas que catalisam a clivagem

hidrolítica das ligações peptídicas, representam uma classe de enzimas com grande

relevância em processos fisiológicos, como coagulação sanguínea, morte celular e

diferenciação de tecidos, catalisam a quebra de ligações peptídicas em uma

proteína e uma família são divididas em exopeptidases e endopeptidases, de acordo

com a localização da ligação a ser clivada. As exopeptidases atuam na região final

das cadeias peptídicas, nos grupos amino ou carboxila terminais. Enquanto

endopeptidases atuam nas regiões internas da cadeia peptídica, entre os grupos

amino e carboxila [1] a [3].

As proteases possuem diversas aplicações comerciais e tecnológicas, são

responsáveis por mais da metade das vendas de enzimas. Por sua grande

importância em processos orgânicos, são valiosas para o desenvolvimento de novos

compostos farmacêuticos, sendo usadas em pomadas cicatrizantes e tem potencial

uso em outros medicamentos. Sua aplicação se estende até a indústria de

detergente e alimentícia, ou mesmo substituindo compostos tóxicos em tratamentos

de couro [4].

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Existem dois fatores fundamentais limitantes no funcionamento das enzimas

que são o pH e a temperatura do meio enzimático. Para a maioria das enzimas

existe uma faixa de pH no qual a atividade enzimática é máxima (na maioria dos

casos essa faixa é próxima do pH neutro) e mínima ao longo que este se afasta

desta faixa ideal. Já o caso da velocidade, como na maioria das reações químicas, a

velocidade da reação é favorecida pelo acréscimo da temperatura, que aumenta a

energia cinética das moléculas, fazendo com que um número maior delas atinja o

estado de transição. No entanto acima dos 50°C grande parte das enzimas sofre

desnaturação, provocando alterações na conformação da molécula causando a

perda do poder de catálise [1].

2. OBJETIVOS

Este experimento tem por objetivo analisar a atividade enzimática das

proteínas presentes no abacaxi sobre o colágeno e como a temperatura influência

nessa atividade. Também é objetivo do experimento analisar a ação de álcool e

sulfato de amônio (separadamente) sobre o colágeno.

3. METODOLOGIA

3.1. Materiais

• 8 tubos de ensaio de 20 mL.

• 1 tubo de ensaio de 30 mL.

• Estante para tubos de ensaio.

• Béquer de vidro de 100 mL (para aquecer água).

• Béquer de 50 mL (para água destilada).

• Funil de vidro pequeno e papel de filtro.

• Recipiente com gelo.

• Almofariz e pistilo.

• Pipetas de vidro de 5,0 mL.

• Bastão de vidro (para dissolver a gelatina).

• Placa aquecida ou banho-maria 100ºC.

• Estufa a 37°C.

• Balança.

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3.2. Reagentes

• Solução de sulfato de amônio 3 mol/L.

• Etanol absoluto.

• Abacaxi maduro (1 fatia média).

• Gelatina incolor e sem sabor.

• Água destilada.

3.3. Métodos

3.3.1. Parte 1: Atividade enzimática do suco de abacaxi e

desnaturação protéica por aquecimento.

Uma fatia de abacaxi foi cortada em pequenos pedaços e macerada, utilizando

almofariz e pistilo, a fim de extrair o suco. O suco foi filtrado em seguida utilizando o

funil de vidro e papel de filtro, em um tubo de ensaio de 20 mL e posteriormente

armazenado no gelo.

Posteriormente foram pesados 2g de gelatina incolor e sem sabor com uma

balança e dissolvidos em 20mL de água destilada em um tubo de ensaio de 30mL. A

solução foi agitada constante com uso do bastão de vidro em meio à água quente.

Após a solubilização, a solução de gelatina deve ser aquecida a 60°C e mantida

nessa temperatura até o uso.

Foram pipetados os itens da Tabela 1 nos tubos de ensaio de 20mL e as

amostras aquecidas a duas temperaturas (60°C e fervida) foram incubadas em suas

respectivas temperaturas por 5 minutos, e resfriadas no gelo imediatamente. Após o

resfriamento das amostras fervidas foram adicionadas a todos os tubos as soluções

de gelatina. As amostras foram incubadas por 10 minutos a 37°C e em seguida

resfriadas todas as amostras no gelo por 15 minutos.

Tabela 1 – Resumo do procedimento experimental.

Tubo 1 2 3 4

Água 2,0mL

Amostra de Abacaxi 2,0mL

Amostra de Abacaxi 60°C 2,0mL

Amostra de Abacaxi Fervida 2,0mL

Gelatina 2,0mL 2,0mL 2,0mL 2,0mL

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3.3.2. Parte 2: Precipitação de proteínas.

Foram pipetados nos tubos de ensaio de 20mL os reagentes conforme a

Tabela 2 e realizado o experimento em temperatura ambiente (~25°C). Os

resultados foram observados e anotados para serem discutidos.

Tabela 2 – Resumo do procedimento experimental.

Tubo 1 2 3

Água 2,0mL

Sulfato de Amônio 2,0mL

Etanol Absoluto 2,0mL

Gelatina 2,0mL 2,0mL 2,0mL

4. RESULTADOS

4.1.1. Parte 1

A análise dos resultados se baseou na formação ou não do gel, processo que

depende da integridade das cadeias poliméricas da proteína, caso ocorra alguma

fragmentação nas cadeias poliméricas, a formação do gel ficará comprometida.

Como relatado na Tabela 3, nos tubos 2 e 3 não houve formação de um gel,

mas sim de soluções homogêneas, essa constatação indica que ocorreu a ação de

enzimas proteolíticas presentes no suco de abacaxi, tal enzimas como a bromelina,

provocaram a degradação das macromoléculas da proteína (colágeno) presentes na

gelatina, provocando, assim, a perda do processo de formação do gel.

Com a mudança de temperatura, observou-se que quando o suco foi

submetido a uma temperatura de 60°C (tubo 3), não houve formação de gel, o que

indica a presença de atividade enzimática em tal temperatura. Já na amostra

submetida a uma temperatura de 37°C (tubo 4), houve formação do gel, tal fato está

relacionado com a possível redução da atividade enzimática, decorrente da

desnaturação em tal temperatura, como verificado por [10]

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Tabela 3 – Resumo do procedimento experimental (Tubos referentes à Tabela 1).

Parte 1

Tubo 1 Formação de uma mistura de caráter gelatinoso

Tubo 2 Solução homogênea

Tubo 3 Solução homogênea

Tubo 4 Formação de uma mistura gelatinosa, com pequenas

partículas sólidas no seu interior

4.1.2. Parte 2

A Tabela 4 apresenta um resumo das interações do etanol e do sulfato de

amônio com o colágeno da gelatina.

Tabela 4 – Resumo do procedimento experimental (Tubos referentes à Tabela 2).

Parte 2

Tubo 1 Completa dissolução, formação de uma solução homogênea.

Tubo 2

Mistura com 3 fases, sendo a superior de aspecto gelatinoso, a intermediária também de caráter gelatinoso mas de coloração branca e inferior líquida com algumas estruturas brancas provenientes da parte

intermediária.

Tubo 3 Mistura com 2 fases, a superior de caráter gelatinoso e coloração branca

com pequenos resíduos sólidos; inferior líquida com aspecto turvo.

No caso da adição de etanol, o que se observou foi à precipitação das

proteínas da gelatina devido à desnaturação, causada pelo rompimento das

interações fracas na proteína. A adição de sulfato de amônio provocou o efeito

denominado salting out, que consiste na diminuição da interação das proteínas com

a água, devido à solvatação dos íons presentes na solução salina. Essa diminuição

de interação provocou a coagulação das proteínas, o que explica a turvação

observada na amostra (Figura 1).

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Figura 1 – Resultado da adição dos reagentes na parte 2 do experimento. Da esquerda para a direita

tubos: 1(água) � 2(sulfato de amônio)� 3(etanol).

A dificuldade encontrada na realização do experimento foi à solubilização da

gelatina, pois a água deveria ser mantida a uma temperatura fixa quente, para que o

colágeno não se solidificasse.

5. DISCUSSÃO

O abacaxi é a principal fonte da enzima proteolítica bromelina (EC 3.4.22.4)

sendo este um nome genérico dado ao conjunto de enzimas proteolíticas

encontradas nos vegetais da família Bromeliaceae, da qual o abacaxi é o mais

conhecido. A bromelina é encontrada no caule, folhas, raízes e no fruto do abacaxi

(A. comosus) e em todas as espécies da família Bromeliaceae [5], [6]. Entretanto é

mais concentrada no caule. Ela pode ser obtida através dos restos do abacaxi, como

casca e caule após obter o suco do abacaxi. Existe uma protease no suco e outra no

extrato das sobras do abacaxi, a bromelaína do caule e a bromelaína da fruta, esta

mais concentrada.

Para realizar a purificação com intuito de preservar a sua função existem

diversas técnicas como, por exemplo: centrifugação fracionada, precipitação ou

dissolução por ação de sais e variadas técnicas cromatográficas (filtração em gel,

troca iônica, cromatografia de afinidade). No suco de abacaxi, a separação pode ser

feita por cromatografia de exclusão (filtração em gel). Essa técnica separa as

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proteínas de acordo com seus tamanhos e a matriz é constituída de um gel

conhecido comercialmente como Sephadex, que é sintetizado com diversos

tamanhos de poros, isto permite a exclusão de moléculas com um largo intervalo de

massa molecular [1].

As funções das proteases podem ser otimizadas fazendo com que as

interações entre o substrato e a enzima sejam realizadas completamente, ao se

levar o substrato ao estado de transição. Isto ocorre quando a temperatura alcança o

valor chamado de “temperatura ótima” e o “pH ótimo”, sendo a máxima temperatura

que pode ser atingida antes da desnaturação da proteína e o pH que possui a

distribuição de cargas elétricas ideal [7].

Todavia, quando uma proteína é aquecida até ser desnaturada (podendo ser

irreversível), esta perde suas propriedades pois não está mais na sua forma

tridimensional, e a função das proteínas é ligada a sua foram tridimensional [2], [3].

Ao cozinhar um alimento protéico, se desnaturam as proteínas do alimento,

facilitando a digestão do mesmo, já que os aminoácidos que a compõem estão mais

acessíveis do que antes pois agora a estrutura está mais próxima da estrutura

primária, e podem ser melhor digeridos e absorvidos [8], [9].

A bromelina tem diversos usos, todos baseados em sua atividade proteolítica.

Um deles está relacionado com a indústria alimentícia, como na clarificação de

cervejas, na fabricação de queijos, no amaciamento de carnes, no preparo de

alimentos infantis e dietéticos, entre outros, devida a sua capacidade de rmoper as

ligações peptídicas das proteínas e peptídeos contidos nos alimentos [5], [10].

6. CONCLUSÃO

Conclui-se que a atividade enzimática pode ser observada através da reação

das proteínas do abacaxi (bromelina) com as proteínas da gelatina (colágeno)

devido às diferenças observadas com relação ao estado final de cada mistura obtida

com reações a temperaturas diferentes.

Nas reações em que não ocorreu formação do gel, o colágeno presente na

gelatina foi degradado e nas que ocorreram a formação de gel a atividade da

protease do abacaxi foi inibida. Também se observou que a ação das proteases

depende da temperatura, sendo que depois de determinado valor, a proteína pode

sofrer degradação parcial, como observado na amostra que foi fervida, ou total.

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A ação de solventes nas proteínas ocorre de maneiras distintas dependendo de

cada solvente. No experimento foram observados 2 tipos de solventes, um que

promove o rompimento das ligações fracas (intermoléculas) das proteínas (etanol), e

outro que diminuiu a interação da proteína com a água devido à solvatação dos íons

presentes (sulfato de amônio). Efeito conhecido como salting out.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] MARZZOCO, Anita; TORRES, Bayardo B. Bioquímica Básica. 3.ed. Rio de Janeiro, Editora, Ano. p.11-30.

[2] LEHNINGER, Albert. L.; DAVID, Nelson L.; COX, Michael M. Princípios de Bioquímica. 4.ed. São Paulo, SAVIER, 2006. p.97-98, 124-127, 229.

[3] VOET, Donald; VOET. Judith G. et al. Bioquímica. 3.ed. Porto Alegre, Artmed, 2006. p.99,129, 233-240, 1414.

[4] GÓES, Paulo de. Proteases de Microrganismos. Instituto de Microbiologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Disponível em <http://www.protease.ufrj.br/proteases.htm>. Acesso em 20 de mar. 2010.

[5] PINTO, NÍSIA A. V. D. et al. Modificações na Atividade Enzimática em Abacaxi ‘Smooth Cayenne’ em Função da Temperatura de Armazenamento e do Estádio de Maturação. Disponível em <http://www.scientiaplena.org.br/sp_v5_111101.pdf> Acesso em 22 de mar. 2010.

[6] GONÇALVES, N. B. (Org.). Abacaxi. Pós-colheita. Embrapa agroindústria de Alimentos (Rio de Janeiro, RJ). Brasília: Embrapa Comunicação para Transferência de Tecnologia, (2000). 45p. (Frutas do Brasil; 5).

[7] ENZIMAS. Disponível em <http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/enzimas.htm>. Acesso em 22 de mar. 2010.

[8] GORMAN, Rachel M. Um cérebro maior graças ao cozimento dos alimentos. Disponível em <http://www2.uol.com.br/sciam/reportagens/um_cerebro_maior_gracas_ao_cozimento_dos_alimentos_5.html>. Acesso em 22 de mar. 2010.

[9] NEVES, Valdir A.; SOUZA, Karina A.F.D. de. Classificação de Proteínas. Disponível em <http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/introducao_proteinas/introducao_proteinas_quatro.htm>. Acesso em 22 de mar. 2010.

[10] ROWAN, A. D.; BUTTLE D. J.; BARRET, A. J. The cysteine proteinases of the pineapple plant. Biochemical Journal, 266: 869-75 (1990).