UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ CENTRO DE CIÊNCIA DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E FARMACOLOGIA

BIOQUÍMICA - ROTEIRO DAS AULAS PRÁTICAS

Teresina - PI

INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO I – Instruções

1. Lembre-se que o laboratório é um lugar para trabalhos sérios e não para experimentos ao

acaso. 2. Leia as práticas com antecedência para obter melhor aproveitamento das aulas. 3. Realize somente os experimentos indicados na aula. Não é permitido realizar aqueles não au-

torizados. 4. Se tiver qualquer dúvida solicite ao professor ou monitor os devidos esclarecimentos. 5. Compareça às aulas nos dias e no laboratório designado para sua turma. 6. Não é permitido fumar em aula prática. 7. Vista a bata (avental) antes de iniciar a prática. 8. Não troque os reagentes de uma bancada para outra. 9. No final de cada aula, limpe todo o material: Passe água da torneira nos tubos de ensaio e

outros materiais utilizados. 10. Quando houver quebra ou danos nos materiais ou aparelhos, comunique o professor ou mo-

nitor.

II – Princípios Gerais de Técnicas

1. Use sempre uma pipeta para cada reagente a fim de evitar contaminação. 2. Evite as trocas de rolhas nos reagentes. 3. Para aquecer o tubo de ensaio na chama direta (no bico de Bunsen) observe se o tubo

está externamente seco, caso contrário, seque o mesmo antes de efetuar a operação. 4. Espere sempre que o vidro quente volte a esfriar antes de pegá-lo. 5. Terminado o uso do bico de Bunsen, verifique se as torneiras do gás estão bem fecha-

das, evitando assim explosões e intoxicações. 6. Nunca deixe ou abra frascos de líquidos inflamáveis (éter, álcool, acetona, etc), nas pro-

ximidades de chamas. 7. Leia duas vezes o rótulo dos frascos de reativos, antes de utiliza-los. 8. Nunca devolva a solução para o frasco estoque, porque pode estar contaminada. 9. Antes de introduzir pipetas nas soluções certifique-se de que estão limpas. 10. Para preparar soluções de ácidos fortes, verter sempre o ácido sobre a água,

nunca a água sobre o ácido, porque provoca reação exotérmica violenta. 11. Para o preparo de soluções alcalinas, tome bastante precaução, pois a reação é exotér-

mica e corrosiva. Mantenha o frasco em banho de gelo para evitar quebras.Não aspirar os vapores desprendidos.

12. Para verificar o odor das substâncias, nunca leve o rosto diretamente sobre o frasco. 13. Uso das pipetas: para volumes entre 0 e 1 mL usar pipeta de 1 mL graduada ao centési-

mo. Entre 1 e 2 mL usar pipeta de 2 mL graduada ao centésimo Entre 2 e 5mL usar pipeta de 5mL graduada ao décimo Entre 5 e 10mL usar pipeta de 10mL graduada ao décimo

14. As pipetas volumétricas são de maior precisão e são utilizadas para preparo de soluções, normais e molares.

15. O líquido no interior da vidraria forma menisco. A leitura deve ser feita na parte inferior do menisco, e na altura da linha dos olhos.

16. Para medir substâncias corrosivas ou tóxicas, obturar a extremidade superior da pipeta com um pouco de algodão, ou usar uma bureta, que é mais seguro. Recomenda-se tam-bém o uso das pipetas automáticas.

17. Quando pipetar sangue, ácido concentrado ou soluções alcalinas concentradas, lavar com água imediatamente o material utilizado.

III – Material do Aluno Cada aluno deverá trazer para os trabalhos práticos o material abaixo relacionado:

1. Avental – necessário para proteger a sua roupa e lhe facultar o desembaraço na execu-ção das operações. Não será permitida a presença do aluno sem avental.

2. Roteiro de trabalhos práticos – sem o qual é impossível realizar qualquer trabalho no la-boratório. O roteiro é individual.

3. Pincel atômico – para marcar adequadamente a vidraria durante a execução dos traba-lhos práticos.

PRÁTICA Nº 01 - REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DOS CARBOIDRATOS Os carboidratos podem ser definidos como: polihidroxialdeídos ou polihidroxicetonas (monossacarídeos), seus polímeros (oligossacarídeos polissacarídeos), seus produtos de redução, oxidação e seus produtos de substituição. A função mais importante dos carboidra-tos no organismo é servir como combustível, fornecendo a fonte principal de energia, graças a sua oxidação a CO2 e H2O, através de uma via complexa, de importância fundamental no metabolismo de todos os componentes da célula animal. Para um completo entendimento de muitas reações que se processam com os car-boidratos nos seres vivos, é indispensável o conhecimento de suas estruturas, suas reações e de que maneira eles são isolados e identificados no laboratório. Apresentaremos a seguir uma série de reações clássicas, geralmente reações coloridas que apesar do advento da técnica de cromatografia ainda são muito utilizadas para identificação dos diversos tipos de carboidratos. 1. TESTE DE MOLISH - Reação geral para carboidratos Os ácidos concentrados causam a desidratação de um monossacarídeo. Se um oli-gossacarídeo ou polissacarídeo estiver presente, eles são primeiro hidrolisados aos seus monossacarídeos constituintes os quais então são desidratados. As pentoses dão o furfural e as hexoses o hidroximetil furfural. Vários compostos fenólicos tais como: timol, alfa-naftol condensam com furfural ou seus derivados para dar compostos coloridos de estruturas ain-da pouco conhecidas. Hexose 5 hidroximetilfurfural produto de condensação colorido. Pentose furfural produto de condensação colorido.

O teste de Molish é considerado uma reação geral para carboidratos quer livre, quer combinados, embora não sendo específica, pois se processa com outras substâncias. A reação sendo positiva não indica necessariamente presença de um carboidrato, mas se a reação for negativa indica seguramente sua ausência. TÉCNICA: Pipeta num tubo marcado 2 mL de glicose 1%, junte 5 gotas de solução de reagente de Molish, em seguida incline o tubo e com cuidado deixe escoar bem lentamente pelas pa-redes, sem agitar 2 mL de ácido sulfúrico concentrado. Recoloque o tubo na estante. O que observou? 2. TESTE DE BENEDICT - Reação para carboidratos redutores Os monossacarídeos possuem na sua estrutura um grupamento aldeído livre ou em potencial o qual poderá reduzir certos íons metálicos. Reagentes alcalinos de sais de cobre são muito usados para pesquisas de açucares redutores. O reativo de Benedict contém sul-fato cúprico, carbonato de sódio e citrato de sódio. Tem-se assim hidróxido e cuprocitrato. Sob a ação de um agente redutor, o hidróxido cúprico é reduzido a hidróxido cuproso que por aquecimento passa a óxido cuproso. 2Cu(OH)2 2 Cu(OH) + H2O Cu2O (óxido cuproso)

H2SO4

-3 H20

Alfa-naftal

Alfa-naftol

- H20

H2SO4 - 3H2O

TÉCNICA: Tubo 1- 0.5 mL de glicose 1% + 3ml de benedict Tubo 2- 0.5 mL de sacarose 1% + 3 ml de benedict Tubo 3- 0.5 mL de água destilada + 3 ml de benedict Banho-maria 100 graus 3 minutos. Anotar o resultado. 3. TESTE DE SELIWANOFF - distinção entre aldoses e cetoses.

O mecanismo desta reação é semelhante a reação de Molish. As cetohexoses sob a ação de ácidos concentrados formam mais derivados do 5-hidroximetilfurfural do que as aldohexoses. Certos reagentes como resorcinol se condensam com altas concentrações dos derivados formados a partir de cetohexoses, mas não com quantidade menor formado a partir de aldohexoses. TÉCNICA: Tubo 1. 1 mL de água destilada + 5 mL de reativo de Seliwanoff (resorcinol+ HCl) Tubo 2. 1 mL de glicose 1% + 5 mL de reativo de Seliwanoff Tubo 3. 1 mL de frutose 1% + 5 mL de reativo de Seliwanoff Leve os tubos ao banho-maria fervente por três minutos. Observe os resultados. Em qual tubo a reação é mais rápida e mais intensa? 4. TESTE DO LUGOL (IODO) PARA POLISSACARÍDEOS O lugol reage com a amilose (fração não ramificada do amido) para dar um complexo de cor azul escuro característico. O glicogênio e as dextrinas se coram de um marrom avermelhado devido a sua estrutura muito ramificada (semelhante a amilopectina). TÉCNICA: Coloque num tubo 3 mL de amido 1% e junte uma gota de solução de lugol. O que observou? 5. HIDRÓLISE DA SACAROSE A sacarose é formada pela união entre uma molécula de alfa D - glicose e uma de beta frutose em ligação glicosídica 1,2 (o que explica sua propriedade de açúcar não redu-tor). Atuando um ácido sobre a sacarose haverá liberação dos seus monossacarídeos cons-tituintes e o hidrolisado torna-se redutor. TÉCNICA: Tubo 1. 2mL de sacarose 1% Tubo 2. 2 mL de sacarose 1% + 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado Coloque os tubos no banho-maria fervente por 3 minutos. Adicione então aos tubos 3 mL de reativo de Benedict, agite. Recoloque-os no banho fervente e aguarde 3 a 5 minu-tos. Retire. Explique.

PRÁTICA Nº 02 - REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DOS LIPÍDIOS Os lipídios constituem uma classe de compostos de grande interesse bioquímico que se caracterizam fisicamente, por que são pouco solúveis na água e solúveis nos chamados solventes orgânicos (éter, benzeno, clorofórmio, acetona, etc.), e quimicamente porque na maioria são ésteres de ácidos graxos. Função principal dos lipídios no organismo é a de reserva energética atuando também como isolante térmico, mecânico e como veículo de vitaminas. Fazendo parte dos lipídios encontramos os óleos e gorduras (triglicerídeos e as cêras, os fosfolipídios, os cerebrosídeos) as substâncias derivadas dos lipidios (esteróides, compostos isoprenóides). Quase todos estes compostos tem ácidos graxos nas suas estru-turas, dentre estes ácidos podemos citar: o ácido butírico, ácido capróico, e todos os outros ácidos graxos saturados. Entre os insaturados temos os ácidos: palmitoleico, oleico, linolei-co, linolênico. Nossas experiências sobre lipídios incluem o estudo das propriedades gerais dos óleos e gorduras. PROPRIEDADES GERAIS DOS ÓLEOS E GORDURAS: 1 - SAPONIFICAÇÃO - Hidrólise alcalina de Triglicerídios. TÉCNICA: Em tubo de ensaio grande, colocar aproximadamente 10 gramas de margarina, 10 mL de solução alcoólica de KOH 5%. Aquecer em banho-maria fervente durante 30 minutos. Os triglicerídios são saponificados, obtendo-se uma solução de sais alcalinos de ácidos gra-xos, isto é: sabões. Conserve o tubo em banho-maria. Escreva a equação de saponificação de um triglicerídio. 2 - SEPARAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS Retire o tubo de banho-maria. Adicione ao mesmo 1 mL de ácido clorídrico concen-trado, gota a gota, agitando o tubo. Coloque novamente no banho-maria e deixe-o lá até separação de uma camada oleosa na superfície do líquido. Deixe então o tubo esfriar num béquer com água gelada. O que observou? Isole os produtos obtidos, decantando o líquido do tubo cuidadosamente. Guarde os produtos obtidos para experiências posteriores. 3 - SOLUBILIDADE NOS SOLVENTES Retire com o bastão uma pequena quantidade dos ácidos graxos obtidos na experi-ência anterior e distribua em 3 tubos de ensaio. Acrescente 2mL de éter ao 1° tubo, 2mL de água destilada ao 2° e 2mL de álcool ao 3°. Agite. O que observou? Explique. 4 - FORMAÇÃO DE SABÕES POR REDISSOLUÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS Adicione ao tubo que contém os ácidos graxos obtidos na experiência 2, 10 ml de água destilada e 6 ml de solução de KOH 0,5N. Aqueça no banho-maria por 5 minutos, agite e observe. Guarde o tubo para a experiência seguinte. 5 - SEPARAÇÃO DOS SABÕES POR SALIFICAÇÃO Coloque em uma proveta 3 mL de solução de sabão da experiência 4. Junte água destilada até a marca de 20 mL. Adicione cloreto de sódio, misturando até saturar (o cloreto de sódio não mais se dissolve). Note que pelo aumento da tensão superficial os sabões abandonam a fase líquida, floculam e devido a sua menor densidade, flutuam. 6 - FORMAÇÃO DE SABÕES INSOLÚVEIS Pipete em 2 tubos, 2 mL de solução de sabões obtidos na experiência 4. Adicione ao 1°, 10 gotas de solução de CaCl2 5%, ao 2° 10 gotas de acetato de chumbo a 5%. Observe e explique a formação de precipitado. Escreva as equações.

PRÁTICA Nº 03 - DETERMINAÇÃO QUALITATIVA DOS AMINOÁCIDOS As proteínas são substâncias orgânicas de alto peso molecular formadas por um grande número de aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas. As células de todos o organismo vivas contêm uma variedade de proteínas com funções diferentes. As membra-nas que circundam as células são proteínas, as reações metabólicas que se dão no interior das células são catalisadas por enzimas que são proteínas. A reprodução das células e a transmissão das características hereditárias dependem das proteínas. Certos hormônios são proteínas, e os anticorpos que defendem o corpo são proteínas. Quando as proteínas são hidrolisadas, elas são convertidas numa mistura de aminoácidos. São conhecidos cerca de 20 aminoácidos obtidos a partir de proteínas. O propósito das experiências descritas é o de distingui-las uma das outras. A molécula protéica é tão complexa que às vezes é difícil inter-pretar o seu comportamento químico. Proteína de um modo geral refletirá as propriedades químicas de seus aminoácidos. Muitas das reações coloridas das proteínas dependem da presença de um determinado aminoácido. 1 - REAÇÃO DO BIURETO As proteínas e seus produtos de hidrólise que contenham mais de duas ligações peptídicas dão este teste positivo. É chamada reação de Biureto, porque um composto chamado Biureto dá a mesma reação. Reativo de Biureto - sulfato de cobre, tartarato de sódio e potássio, hidróxido de sódio. TÉCNICA: Tubo 1. 2 mL de solução de ovoalbumina + 3 mL de biureto Tubo 2. 2 mL de água destilada + 3 mL de biureto

Tubo 3. 2 mL de solução de gelatina 1% + 3 mL de biureto Agite e anote o resultado. Houve alguma diferença entre os tubos? 2 - REAÇÃO DE NINHIDRINA A reação é devida aos grupos amina, dando positiva para as proteínas, os peptídios, os aminoácidos, aminas primárias e amônia. Esta reação é importante na revelação e dosa-gem de proteínas. Quando uma solução de ninhidrina é aquecida com uma solução de ami-noácido, peptídio ou proteína, desenvolve-se uma coloração azul violeta. TÉCNICA: Pipete em um tubo 10 gotas da solução de ninhidrina a 0,1%, junte 1mL da solução de ovoalbumina e ferva durante 2 minutos. Observe, explique e equacione a reação. 3 - PRECIPITAÇÃO COM SAIS DE METAIS PESADOS Os metais pesados precipitam as proteínas devido à formação de sais insolúveis de metal com as proteínas negativamente carregadas, forma em que se encontram em meio alcalino. TÉCNICA Tubo 1. 2 mL de solução de ovoalbumina + 7 gotas de HgCl2 5% Tubo 2. 2 mL de solução de ovoalbumina + 5 gotas de acetato de chumbo 10%. Explique. 4 - PRECIPITAÇÃO PELOS ÁCIDOS METAIS FORTES Estes ácidos desnaturam as proteínas transformando-as em metaproteínas insolúveis. TÉCNICA: Pipete num tubo, 1 mL de solução de ovoalbumina + 3 mL de água destilada, incline

o tubo e acrescente lentamente pelas paredes 0,5 mL de ácido nítrico concentrado. Não agite. O que observou? 5 - REAÇÃO XANTOPROTEICA: Tirosina e Triptófano Esta reação é devido à presença na molécula protéica do grupo fenil – C6H5 com o qual o ácido nítrico forma nitroderivados que são fortemente coloridos em meio alcalino. Os componentes da proteína responsáveis por esta reação são: tirosina e triptófano. A fenilala-nina que também contém o anel benzênico não dá este teste nas condições descritas, so-mente utilizando um agente de nitração mais enérgico. TÉCNICA: Num tubo pipete 1 mL de solução de ovoalbumina, junte 10 gotas de ácido nítrico concentrado, ferva. Acrescente 4 mL de solução NaOH 2N. O que observou? Equacione. 6 - REAÇÃO DE MILLON: Tirosina Quando aquecemos uma proteína contendo tirosina, com o reativo de MILLON (mis-tura de mercúrio e ácido nítrico concentrado), observamos a formação de um produto colori-do. Isto é explicado pela reação do grupo hidroxifenil da tirosina, com o mercúrio reativo, tendo com resultado a formação de fenolato de mercúrio. A reação não deve ser feita em meio alcalino forte devido à precipitação do mercúrio sob a forma de óxido. TÉCNICA: Tubo 1. 1mL de solução de ovoalbumina + 5 gotas do reativo de Millon Tubo 2. 1mL de solução de gelatina 1% + 5 gotas do reativo de Millon Aquecer. O que observou? Equacione. 7 – REAÇÃO DO GRUPO SULFIDRILA – CISTINA E CISTEÍNA Cistina e cisteína quando são aquecidos com álcali forte, em presença de acetato de chumbo, há formação de um precipitado de sulfeto de chumbo. TÉCNICA: Coloque num tubo uma pequena quantidade de cabelo, junte 5 gotas de solução de acetato de chumbo 5% e 2 mL de solução NaOH 50%. Ferva durante 5 minutos. O que ob-servou.

PRÁTICA Nº04 - PROPRIEDADES DA UREASE 1 - REAÇÃO DA UREASE COM O BIURETO TÉCNICA Tubo 1. 3 gotas de solução de urease + 1 mL de biureto Tubo 2. 1 mL de biureto Comparar as cores dos dois tubos. Explicar. 2 - TESTE DE ATIVIDADE Pela ação da urease a uréia se converte em amônia e ácido carbônico CO (NH2)2 + 2 H2O H2CO3 + NH3

H2 CO3 H2O + CO2 A ação enzimática da urease pode ser demonstrada fazendo-a reagir com uma solu-ção de uréia fracamente tamponada a pH 7,0 contendo o indicador vermelho de fenol (ama-

relo 7,0 8,6 vermelho). Sob a ação da enzima formará amônia suficiente par sobrepujar a ação do tampão e o pH subirá. A cor da solução então mudará de amarelo para vermelho. TÉCNICA Pipetar 1,5 mL de solução de uréia (0,4M, pH 7,0) num tubo de ensaio e adicionar 3 gotas de solução de urease. Misturar. Observar a mudança de coloração após 3 minutos. 3 - ESPECIFICIDADE A urease é especificada pelo seu substrato, a uréia. Podemos demonstrar isso, rea-gindo-a com derivados da uréia, como exemplo tem a tiouréia (NH2 - CS – NH2). TÉCNICA Em um tubo adicione 1,5 mL de solução de tiouréia (0,4M, pH 7,0) + 3 gotas de solu-ção de urease e compare com o tubo do teste de atividade (reação 2). Explicar o que ocor-reu. 4 - DESNATURAÇÃO PELO CALOR TÉCNICA Misturar num tubo de ensaio 1 mL de água destilada com 3 gotas de solução de urease. Levar ao banho-maria a 100°C durante 5 minutos. Pipetar em outro tubo 1,5 mL de solução de uréia e adicione 0,5 mL da solução de urease fervida. Aguardar 5 minutos. Com-parar com o tubo do teste de atividade (reação 2). Explicar. 5 - INIBIÇÃO POR SAIS DE MERCÚRIO Os grupos (-SH) sulfidrílicos são essenciais para a atividade da urease. Eles podem manter ou talvez constitua parte do centro ativo da enzima. Se forem oxidados a enzima se tornará inativa. 2(-SH) + HgCl2 S - Hg - S + 2HCl Realizar os testes abaixo: TUBOS UREASE ÁGUA HgCl2 5% URÉIA COLORAÇÃO

1 3 gotas 1 mL 1,5 mL 2 3 gotas 1 mL 5 gotas 1,5 mL

Urease

PRÁTICA Nº05 - PESQUISA QUALITATIVA DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS DO LEITE I - EXTRAÇÕES 01 - Adicionar 50 ml de água destilada morna a 50 ml de leite em béquer de 250 ml. 02 - Acrescentar solução de ácido acético 10% gota a gota, agitando, até que o leite se coagule (queijo). 03 - Deixar em repouso cerca de 5 minutos. 04 - Decantar o líquido sobrenadante sobre o papel de filtro, recolhendo o filtrado no er-lenmeyer de 125 ml. Guardar o precipitado. 05 - Transferir o filtrado para o béquer de 250 ml. Aquecê-lo diretamente na chama até ebulição. Baixar a chama e deixar fervendo até reduzir o volume a mais ou menos 40 ml. Soprar na superfície quando houver formação de espuma. 06 - Filtrar e deixar esfriar. Esta solução será utilizada para os testes de alguns constituin-tes químicos. 07 - Colocar o precipitado obtido no item 4 num béquer de 100 ml. 08 - Adicionar 10 ml de álcool e amassar com o bastão. Decantar e desprezar o sobre-nadante na pia. 09 - Adicionar novamente cerca de 10 ml de álcool e repetir a operação anterior. 10 - Adicionar cerca de 5 ml de éter e fazer a extração com auxílio do bastão. 11 - Passar o líquido sobrenadante para uma placa de Petri. Deixar evaporar o éter à temperatura ambiente, e observar o resíduo. 12 - Recolher o precipitado lavado pelo éter em papel de filtro e deixar evaporar o éter restante à temperatura ambiente. 13 - Interprete o resultado. II - RECONHECIMENTO DA PORÇÃO PROTEICA DO LEITE - Teste do Biureto 01 - Colocar um pequeno fragmento do precipitado em um tubo de ensaio. 02 - Adicionar 3 mL do reagente de biureto. 03 - Agitar. 04 - O aparecimento de uma coloração violeta indica reação positiva. 05 - Interprete o resultado.

III - PESQUISA DE AÇÚCAR REDUTOR - Teste de Benedict 01 - Colocar 2 mL do reagente de Benedict num tubo de ensaio. 02 - Adicionar 1 mL do filtrado obtido no item I - 6. Misturar. 03 - Aquecer até a ebulição e observar a mudança de coloração do reagente. 04 - Interpretar o resultado.

IV - PESQUISA DE CÁLCIO 01 - Colocar 2 mL de filtrado em um tubo de ensaio. 02 - Adicionar o reativo de Sulkowitch gota a gota até aparecimento de uma turvação ou um precipitado branco. 03 - Interpretar o resultado. V - PESQUISA DE CLORETOS 01 - Colocar 2 mL do filtrado em um tubo de ensaio. 02 - Adicionar 2 a 3 gotas de HNO3 concentrado. 03 - Adicionar gotas de AgNO3 5% até o aparecimento de turvação ou precipitado. 04 - Interprete o resultado.