Seqenciamento e montagem do genoma humanoe anlise de transcriptoma

Seqenciamento do Genoma HumanoEmbate: Consrcio pblico x Celera genomics:

Consrcio pblico: mapeamento fsico, shotgun hierriquico.

Celera genomics: whole genome shotgun

Em fevereiro de 2001 foi publicada de forma independendente verso draft ou preliminar ambos grupos.

Seqenciamento do Genoma Humano2003: Consrcio pblico apresenta verso final do seqenciamento do genoma humanoComprimento total: 3 bilhes pb99% deste total foi seqenciadoErro de seqenciamento estimado em 1/10.000 nt99.9% no apresenta diferenas entre indivduos.25.000 genes Genes codificadores de protenas correspondem a apenas 2% do genoma50 % do genoma consiste de regies repetitivas (D.melanogaster 3%, C.elegans 7%)

Celera Genomics Iniciativa privada

Whole genome shotgun (WGS)GenomaBiblioteca genmicaPlasmdeo (inserto 10 kb)BAC (inserto 100 kb)Seqenciamento das extremidadesdo insertoLeituras ou reads

Celera Genomics Iniciativa privada

Whole genome shotgun (WGS) MontagemAGCGTTA GTTACAAC

AGCGTTACAAC

ContigContigMate pairsCelera Genomics Iniciativa privada

Whole genome shotgun (WGS) Montagem

ContigContigMate pairsBAC contendo inserto demaior comprimentoCelera Genomics Iniciativa privada

Whole genome shotgun (WGS) Montagem

ContigContigMate pairsContigContigScaffoldMate pairsCelera Genomics Iniciativa privada

Whole genome shotgun (WGS) Montagem

Consrcio pblicoMapeamento fsico, shotgun hierrquicoCromossomoBiblioteca genmicaem BAC (inserto 100Kb)Fragmento cromossmicoBiblioteca genmicaem BAC

Consrcio pblicoMapeamento fsico, shotgun hierrquicoCromossomoBiblioteca genmicaem BAC (inserto 100Kb)Fragmento cromossmicoBiblioteca genmicaem BAC

BACBibliotecaPlasmdeo (inserto 10 kb)Seqenciamento das extremidadesdo insertoLeituras ou readsConsrcio pblicoMapeamento fsico, shotgun hierrquico - Montagem

ContigMate pairsAGCGTTA GTTACAAC

AGCGTTACAACConsrcio pblicoMapeamento fsico, shotgun hierrquico - Montagem

Consrcio pblicoMapeamento fsico, shotgun hierrquicoCromossomoBiblioteca genmicaem BAC (inserto 100 kb)

Consrcio pblicoMapeamento fsico, shotgun hierrquicoCromossomoBiblioteca genmicaem BAC (inserto 100 kb)

Consrcio pblicoMapeamento fsico, shotgun hierrquicoCromossomoBiblioteca genmicaem BAC (inserto 100 kb)

Avaliao de estratgias de seqenciamento

Vantagens WGS

Estratgia mais simples com menos etapas.

Vantagens Shotgun Hierrquico

Menos vulnervel que a estratgia WGS em relao a montagem de regies repetitivas.

Avaliao de estratgias de seqenciamentoRepeties no genomaXXCenrio IXMontagemGenoma

Processo de montagem suscetvel a erros quando empregado em genomas com alto ndice de repetices.WGS: Montagem de 3 bilhes de bases (todo genoma).

Shotgun hierrquico: Montagem de 100 mil bases (inserto de cada BAC).

In silico

Base-calling

Gerao de uma seqncia de nucleotdeos atravs da anlise dos chromatogramas

PHREDgaattcggcacgagagttctcccggagacgctccgtgcgaagattatggaggccgtcaatgtggtcggttcccgccactttgctcgcctgcgcatcgatgtaacagtccgtggtgacgaagtcataccgttaagtattacgtttttgttgtcgttgttgcagcaatagtagaggacgggcgcttttttttttgtcaagagaaagggggaggggcgtactaccgctttatcgaggttggtattatttcttatatataaagggaaagagcaacgtgaagcgggtaagggaagagtgaaagtcgag

Mascaramento

Eliminar fragmentos de vetor cross_match>5gctccaccgcggtggcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcggcacgagagttctcccggagacgctccgtgcgaagattatggaggccgtcaatgtggtcggttcccgccactttgctcgcctgcgcatcgatgtaacagtccgtggtgacgaagtcataccgttaagtattacgtttttgttgtcgttgttgca

>3gcaatagtagaggacgggcgcttttttttttgtcaagagaaagggggaggggcgtactaccgctttatcgaggttggtattatttcttatatataaagggaaagagcaacgtgaagcgggtaagggaagagtgaaagtcgagggggggcccggtacccaattc

Montagem

Produzir uma seqncia contgua atravs de seqncias menores que possuam regies de sobreposioPHRAP, Celera Assembler, Arachnecontigleituras

Anotao

Localizar na seqencia genmica final: Genes que codificam protenas e RNAs no traduzidos (tRNA, rRNA, snRNA)

Determinar, se possvel, o produto provvel de cada gene encontrado.

Associar cada gene uma categoria funcional ou via metablica. Ex.: sntese de lipdeos, maquinaria de traduo, fosforilao oxidativa, etc.

Anotao

Anotao AutomticaGlimmercontigRBSfindertRNAscanGeneMarkCDS

Anotao AutomticaBLAST contra KEGGInterproBLAST contra GenBankPSORTBLAST contra COGAnotao manual

Alinhamento

Determinar o grau de similaridade entre duas ou mais seqncias, ou entre fragmentos de seqncias.

Inferir homologia entre genes: parlogos, ortlogos.

Alinhamento local

Similaridade pode se ater a regies de cada seqncia

BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)

BLASTKEGGCOGGenBankNucleotdeos> SEQ1atgggcacgagagttctcccggagacgctccgtgcgaagattatggaggccgtcaatgtggtcggttcccgccactttgctcgcctgBancos de seqnciasGenBankProtenas

BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)

Aldolase Trypanosoma cruzi

.........1.........2.........3.........4.........5.........6.........7.........8.........9.........10 acaagctggagctcccgcggtggtcggcgctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcggcacgagaacaacttcaaccgcgtctggaaggc gccacgccgcccgtttgagaaggaacgccttgaccgcgagatgaaactctgcggccagtacggccttcngttgcaacgcgtgagatttggcgccgtgaac atgacgctctccaagatgcgtcgtaccgcccgtctgttgttgacgttgccggagaaccacccgcgccggcagctggagggttccgccatcatgcgccgct gccacgactacggcttcctcgagggggggcccggtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacannattcactggccgntcgntnntttacaacgtc gntnngactgggnannaaaccctggnnncgttacccaacttaatcgccttBLAST it!

Anotao AutomticaBLAST contra KEGGInterproBLAST contra GenBankPSORTBLAST contra COGAnotao manual

Aldolase Trypanosoma cruzi

.........1.........2.........3.........4.........5.........6.........7.........8.........9.........10 acaagctggagctcccgcggtggtcggcgctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcggcacgagaacaacttcaaccgcgtctggaaggc gccacgccgcccgtttgagaaggaacgccttgaccgcgagatgaaactctgcggccagtacggccttcngttgcaacgcgtgagatttggcgccgtgaac atgacgctctccaagatgcgtcgtaccgcccgtctgttgttgacgttgccggagaaccacccgcgccggcagctggagggttccgccatcatgcgccgct gccacgactacggcttcctcgagggggggcccggtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacannattcactggccgntcgntnntttacaacgtc gntnngactgggnannaaaccctggnnncgttacccaacttaatcgccttInterpro

Procura na seqncias por domnios, assinaturas ou motivos conhecidos.

Se utiliza de outros bancos de domnios para produzir seu relatrio final. PFAM, SMART, PROSITE, etcInterpro

Anotao AutomticaBLAST contra KEGGInterproBLAST contra GenBankPSORTBLAST contra COGAnotao manual

Anotao

Streptococcus pneumoniae R6

SabiSystem for Automated Bacterial Integrated Annotation

LNCC Coordenao do Projeto Genoma Brasileiro

Gerenciamento de todos softwares de Base-calling, Mascaramento, Montagem e Anotao automtica.

Disponibilizao da Anotao automtica dos resultados via Web possibilitando a realizao da Anotao manual por pesquisadores distribudos geograficamente.Exemplo SabiMapa AntesMapa Depois

Anlise do transcriptoma

Projetos que precedem seqenciamento do genoma nuclear:

Identificao de novos genes.

Estimativa do perfil de expresso da linhagem celular, estgio de desenvolvimento ou tecido avaliado

Transcrio e Transcriptoma

EST

RNA totalcstronPoli AmRNACAP53

Transcrio e Transcriptoma

ESTPoli APoli APoli APoli AcDNAVetor + cDNA

Transcrio e Transcriptoma

ESTSequenciamentoextremidades5Poli A3Poli A3 5~ 800 pbVetorVetorVetorVetorcDNA completo

Transcrio e Transcriptoma

ESTRemooSequencia de vetor(cross_match, Lucy)Remoo Poli A (Script Perl)EST5Poli A3VetorVetorPoli AXXX5353

Anlise do transcriptoma

EST AnotaoBLASTXEBLASTNGenBankNucleotdeos>clone_23 5ggcacgagagttctcccggagacgctccgtgcgaagattatggaggccgtcaatgtggtcggttcccgccactttgctcgcctgBancos de seqnciasGenBankProtenas53clone_23 5 = amastina

Anlise do transcriptoma

EST Anotao

Agrupamento deseqncia similaresouagrupamento via anotao

Nmero de ESTsAnotao4amastina6TcMUC II

Transcrio e Transcriptoma

Transcriptoma de amastigotas

Transcrio e Transcriptoma

Transcriptoma de amastigotas

Estrutral em foram de disco onde so armazenadas inmeras cpias do DNA mitocondrialConsiste na procura por sequencias similaresCluster ou sequencia individualCell Surface and MembraneCell cycleCell MotilityDNA MetabolismEnergy MetabolismHeat-shock proteins and chaperonins Kinases and phophatasesOther MetabolismProteases and proteasome

HistonasProteinas ribossomicasProteinas associadas a fosforilacao oxidativa3 proteinas de superfcie gp85, amastin e mucinasAssim como em outros trabalhos proteinas associadas maquinaria de traducao, proteinas ribossomicas, correspondem a grande parte da expressao