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i
FURG
Tese de Doutorado
SÍNTESE DE NOVOS HÍBRIDOS MONASTROL-ÁCIDOS
GRAXOS 6-ALQUIL SUBSTITUÍDOS: Avaliação dos
efeitos citotóxicos em linhagem celular de glioma de
rato (C6)
___________________________________
Patrick Martins De Oliveira
PPGQTA
Rio Grande, RS - Brasil
2016
ii
SÍNTESE DE NOVOS HÍBRIDOS MONASTROL-ÁCIDOS
GRAXOS 6-ALQUIL SUBSTITUÍDOS: Avaliação dos efeitos
citotóxicos em linhagem celular de glioma de rato (C6)
por
Patrick Martins De Oliveira
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Química Tecnológica e Ambiental da Universidade Federal
do Rio Grande (RS), como requisito parcial para obtenção
do título de DOUTOR EM QUÍMICA.
PPGQTA
Rio Grande, RS - Brasil
2016
iii
Universidade Federal do Rio Grande Escola de Química e Alimentos
Programa de Pós-Graduação em Química Tecnológica e Ambiental
A Comissão Examinadora abaixo assinada aprova a Tese de Doutorado
SÍNTESE DE NOVOS HÍBRIDOS MONASTROL-ÁCIDOS GRAXOS 6-ALQUIL SUBSTITUÍDOS: Avaliação dos efeitos
citotóxicos em linhagem celular de glioma de rato (C6)
elaborada por
PATRICK MARTINS DE OLIVEIRA
Como requisito parcial para a obtenção do título de
Doutor em Química
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Marcelo Gonçalves Montes D’Oca (Presidente, PPGQTA/FURG)
Prof. Dr. Gustavo Pozza Silveira (Membro, PPGQ/UFRGS)
Prof. Dr. Mariana Appel Hort (Membro, PPGCiSau/FURG)
Prof. Dr. Alex Fabiani Claro Flores (Membro, PPGQTA/FURG)
Prof. Dr. Marcelo de Godoi (Membro, PPGQTA/FURG)
Rio Grande, 18 de outubro de 2016.
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus por moldar meu caminho.
Agradeço à Universidade Federal do Rio Grande – FURG e ao Programa de
Pós-Graduação em Química Tecnológica e Ambiental pela oportunidade cedida, assim
como as agências financiadoras CAPES, CNPq e MCT/FINEP e a prefeitura do Rio
Grande pelo apoio financeiro.
Ao professor Marcelo Gonçalves Montes D’Oca pela orientação nessa etapa do
meu aperfeiçoamento acadêmico.
Aos membros do Kolbe pelo apoio técnico.
Aos professores do PPGQTA por compartilharem seus conhecimentos.
A meu pai, minha mãe, minha esposa e meus irmãos por escolha por estarem
presentes no decorrer dos melhores momentos da minha vida.
Ao Ernesto cuja memória permanecerá viva para sempre.
v
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... vi
LISTA DE ESQUEMAS ................................................................................................ ix
LISTA DE TABELAS .................................................................................................... xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ..................................................................xii
RESUMO .................................................................................................................... xiii
ABSTRACT .................................................................................................................xiv
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15
2. OBJETIVOS ............................................................................................................ 20
3. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................... 23
4. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS ....................................... 42
5. CONCLUSÃO ......................................................................................................... 76
6. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 78
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 93
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Nifedipina 1 ou BAY A1040®Bayer 16 ............................................................ 16
Figura 2. Monastrol 2 .................................................................................................... 17
Figura 3. Série do monastrol 2 e de seus análogos graxos (posição 5 e 6-substituída)
...................................................................................................................................... 19
Figura 4. Avaliação citotóxica do monastrol 2 e dos análogos graxos 23, 4a-c e 8a-c
frente a linhagem celular de glioma ............................................................................... 22
Figura 5. Estrutura do piperastrol 28 ............................................................................ 27
Figura 6. Composto tipo-Biginelli derivado do 2-hidroxi-1-naftaldeido (35) .................. 29
Figura 7. Resultados do teste de viabilidade celular para as moléculas Monastrol-
ácidos graxos-5C-alquil substituídas (Treptow et al., 2015) .......................................... 30
Figura 8. DHPMs de ocorrência natural e sintética ...................................................... 31
Figura 9. N-Acil homoserinas lactonas 52 de ocorrência natural .................................. 37
Figura 10. Espectro de RMN 1H (400 MHz/CDCl3) do composto 3b ............................ 54
Figura 11. Expansão da região do próton benzílico (400 MHz/CDCl3) do composto 3b
...................................................................................................................................... 55
Figura 12. Espectro de 13C (100 MHz/CDCl3) do composto 3b .................................... 56
Figura 13. Contagem celular da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de
tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado com DMSO para os compostos 24 (esquerda) e 2 (direita). ANOVA seguido de
pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao controle. ....................... 65
Figura 14. Contagem celular da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de
tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado com DMSO para os compostos 4a (esquerda) e 8a (direita). ANOVA seguido de
pós-teste de Tukey, *** p <0.001 com relação ao controle. ........................................... 66
Figura 15. Contagem celular da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de
tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado exclusivamente com DMSO para os compostos 4b (esquerda) e 8b (direita).
ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao
controle. ........................................................................................................................ 67
vii
Figura 16. Contagem celular da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de
tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado exclusivamente com DMSO para os compostos 4c (esquerda) e 8c (direita).
ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao
controle. ........................................................................................................................ 68
Figura 17. Ensaio de MTT da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de
tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado com DMSO para os compostos 24 (esquerda) e 2 (direita). ANOVA seguido de
pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao controle. ....................... 69
Figura 18. Ensaio de MTT da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de
tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado exclusivamente com DMSO para os compostos 4a (esquerda) e 8a (direita).
ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao
controle. ........................................................................................................................ 69
Figura 19. Ensaio de MTT da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de
tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado exclusivamente com DMSO para os compostos 4b (esquerda) e 8b (direita).
ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao
controle. ........................................................................................................................ 70
Figura 20. Ensaio de MTT da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de
tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado exclusivamente com DMSO para os compostos 4c (esquerda) e 8c (direita).
ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao
controle. ........................................................................................................................ 70
Figura 21. Composto 4a ............................................................................................... 80
Figura 22. Composto 4b ............................................................................................... 80
Figura 23. Composto 4c ............................................................................................... 81
Figura 24. Composto 8a ............................................................................................... 81
Figura 25. Composto 8b ............................................................................................... 82
Figura 26. Composto 8c ............................................................................................... 83
Figura 27. Composto 3a ............................................................................................... 83
Figura 28. Composto 3b ............................................................................................... 84
Figura 29. Composto 3c ............................................................................................... 84
viii
Figura 30. Composto 5a ............................................................................................... 85
Figura 31. Composto 5c ............................................................................................... 85
Figura 32. Composto 6a ............................................................................................... 86
Figura 33. Composto 6b ............................................................................................... 86
Figura 34. Composto 6c ............................................................................................... 87
Figura 35. Composto 7a ............................................................................................... 87
Figura 36. Composto 7b ............................................................................................... 88
Figura 37. Composto 9a ............................................................................................... 88
Figura 38. Composto 10a ............................................................................................. 89
Figura 39. Composto 10 b ............................................................................................ 89
Figura 40. Composto 10c ............................................................................................. 90
ix
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1. Reação multicomponente de Biginelli visando a síntese de
diidropirimidinonas/tionas funcionalizadas .................................................................... 16
Esquema 2. Retrossíntese das novas diidropirimidinonas/tionas-ácidos graxos 6-alquil
substituídas 3-10a-c derivadas de fontes renováveis ................................................... 20
Esquema 3. Síntese de β-cetoésteres graxos 11a-c .................................................... 21
Esquema 4. Síntese de diidropirimidinonas 3-6a-c e diidropirimidintionas 7-10a-c ..... 21
Esquema 5. Síntese linear tradicional em três etapas vs. reação multicomponente .... 24
Esquema 6. Variedade estrutural baseada em primárias ou clássicas RMC e reações
secundárias ................................................................................................................... 25
Esquema 7. Síntese de dímeros do monastrol 32, 33a-e ............................................. 28
Esquema 8. Síntese de novas DHPMs-5-graxas ......................................................... 29
Esquema 9. Síntese de β-cetoéster via acilação do ácido de Meldrum (Oikawa et al.,
1978) ............................................................................................................................. 33
Esquema 10. Síntese dos β-cetoéster via acilação do ácido de Meldrum .................... 34
Esquema 11. Utilização de N,N´carbonildiimidazol na síntese de β-cetoésteres
aromáticos 48 ................................................................................................................ 34
Esquema 12. Síntese de β-cetoamidas via ácido de Meldrum (Pak et al., 1992) ......... 35
Esquema 13. Mecanismo de aminólise do Meldrum acilado com agente sililante ....... 36
Esquema 14. N-Azidoacil homoserina lactona e N-Acil homoserinas lactonas
funcionalizadas .............................................................................................................. 37
Esquema 15. Avaliação do ácido sulfâmico como catalisador em sistema livre de
solvente ......................................................................................................................... 38
Esquema 16. Aplicação do ácido sulfâmico como catalisador em sistema livre de
solventes ....................................................................................................................... 39
Esquema 17. Ácido sulfâmico suportado em sílica ...................................................... 40
Esquema 18. Uso de ácido sulfâmico suportado em nanopartículas magnéticas ........ 41
Esquema 19. Reação entre o ácido de Meldrum e diferentes carbodiimidas ............... 44
x
Esquema 20. Obtenção de um composto derivado de carbodiimidas .......................... 44
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Síntese de β-cetoésteres graxos 11a-c a partir da acilação do ácido de
Meldrum 13 com ácidos graxos 12a-c e posterior metanólise ...................................... 43
Tabela 2. Reação multicomponente de Biginelli usando β-cetoéster estárico 11b,
benzaldeído 17 e ureia 21 com diferentes catalisadores .............................................. 47
Tabela 3. Estruturas e rendimentos das DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas 3-6a-c
obtidas pela reação multicomponente de Biginelli ......................................................... 50
Tabela 4. Estruturas e rendimentos das DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas 7-10a-c
obtidas pela reação multicomponente de Biginelli ......................................................... 58
Tabela 5. Predição do coeficiente de partição (ClogP) dos compostos avaliados quanto
aos efeitos citostáticos/citotóxicos na linhagem celular de glioma de rato (C6). ........... 62
Tabela 6. Valores de IC50 para os compostos avaliados quanto aos efeitos
citostáticos/citotóxicos na linhagem celular de glioma de rato (C6) .............................. 73
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ADMET/ADME Adsorção, distribuição, metabolismo, excreção e
toxicidade/adsorção, distribuição, metabolismo, excreção
BFI Bond-forming-index (índice de formação de ligação)
BHE Barreira hemato-encefálica
CCD Cromatografia em camada delgada
ClogP Coeficiente de partição
DCC Diciclohexilcarbodiimida
DHP Diidropiridina
DHPM Diidropirimidinona
DMAP Dimetilaminopiridina
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium
IV Espectroscopia de infravermelho
NMP Nanopartícula magnética
RMC Reação multicomponente
RMN Ressonância magnética nuclear
SFB Soro fetal bovino
SNC sistema nervoso central
xiii
RESUMO
Título: SÍNTESE DE NOVOS HÍBRIDOS MONASTROL-ÁCIDOS GRAXOS 6-ALQUIL
SUBSTITUÍDOS: Avaliação dos efeitos citotóxicos em linhagem celular de glioma
de rato (C6)
Autor: Patrick Martins De Oliveira
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Gonçalves Montes D’Oca
Este trabalho propôs a síntese de novas diidropirimidinonas/tionas-ácidos graxos
6-alquil substituídos (DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas) e a avaliação dos
análogos graxos do monastrol (Monastrol-ácidos graxos-6C-substituídos) quanto aos
efeitos citotóxicos em glioma de rato. As DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas foram
sintetizadas a partir da condensação multicomponente de Biginelli utilizando β-
cetoésteres graxos (C16:0, C18:0 e cis-C18:1), aldeídos aromáticos (benzaldeído, 3-
hidroxibenzaldeído, 4-hidroxibenzaldeído, 3-nitrobenzaldeído e 4-nitrobenzaldeído),
ureia ou tioureia e ácido sulfâmico como catalisador, sendo obtidas estruturas diversas
e complexas ainda inéditas na literatura, com rendimentos entre 60-85%. Devido ao
efeito antitumoral apresentado pelo monastrol, assim como do aumento da lipofilicidade
das novas estruturas com a possível facilitação na passagem por diferentes barreiras
celulares, as novas monastrol-ácidos graxos-6C-substituídos foram analisadas quanto
aos seus efeitos citotóxicos na linhagem celular de glioma de rato (C6). De acordo com
os resultados as moléculas derivadas da tioureia, contendo as cadeias palmítica e
esteárica exibiram a maior atividade na diminuição da viabilidade celular e na
citotoxicidade na linhagem de glioma, com potencial na diminuição da viabilidade
celular 17 vezes superior ao monastrol e 6 vezes maior que seus análogos DHPMs-
ácidos graxos-5C-alquil substituídas, sendo definidas como potenciais candidatas para
a continuação dos estudos no tratamento de células tumorais.
Palavras-chaves: ácidos graxos; reação multicomponente; compostos de Biginelli;
atividade antitumoral; glioma
xiv
ABSTRACT
Title: SYNTHESIS OF NOVEL HYBRID MONASTROL C6-FATTY ACIDS: cytotoxic
effects against rat glioma cell line (C6)
Author: Patrick Martins De Oliveira
Advisor: Prof. Dr. Marcelo Gonçalves Montes D’Oca
This work presents the synthesis of novel hybrid dihydropyrimidinones/thiones-
fatty acids 6-alkyl substituted (DHPMs-fatty acid-C6-substituted). In addition, the
cytotoxic effects of a series of fatty monastrol analogues (C6-fatty acid-monastrol) was
investigated in rat glioma cell line. The novel C6-fatty acid-DHPMs were synthesized
from the Biginelli multicomponent condensation in 60-85% yields using fatty acid β-
ketoesters (C16:0, C18:0 and cis-C18:1), aromatic aldehydes (benzaldehyde, 3-
hydroxybenzaldehyde, 4 hydroxybenzaldehyde, 3-nitrobenzaldehyde and 4-
nitrobenzaldehyde), urea or thiourea and sulfamic acid as catalyst. Due to the antitumor
effect shown by monastrol as well as increasing the lipophilicity of the novel molecules
with possibility to facilitate the passage through various cellular barriers, the novel
hybrids monastrol-C6-fatty acid were analyzed for their cytotoxic effects on rat glioma
cell line (C6). According to results palmitic or stearic fatty acid derivatives exhibited the
greatest activity in viability and cytotoxicity reducing cell off glioma line, with the
potential in the decrease of cell viability 17 times higher than monastrol and 6 times
greater than its analogues C5-fatty acid-DHPMs. This finding suggests that the
increased lipophilicity of fatty acid monastrol offers a promising approach for the
development of new antitumoral compounds.
Keywords: fatty acids; multicomponent reaction; Biginelli compound; Antitumor activity;
glioma
15
1. INTRODUÇÃO
Condensações multicomponentes ou reações multicomponentes (RMCs) são
reações químicas que envolvem três ou mais compostos combinados em uma única
etapa com a geração de um único produto que contém partes majoritárias dos
reagentes.1 Devido a essa natureza, as RMCs são utilizadas na obtenção de novos
compostos com a redução de etapas reacionais de sínteses lineares.2 O resultado das
reações multicomponentes está intimamente ligado à natureza dos solventes, ao tipo
de catalisador utilizado e a razão molar (excessos) dos reagentes empregados,
tornando a otimização das condições reacionais um passo decisivo no
desenvolvimento e aplicação das RMCs, em comparação às reações sequenciais.
Contudo a eficiência atômica, assim como as condições reacionais empregadas
(geralmente simples e de baixa necessidade energética) definem as RMCs como uma
poderosa ferramenta para a síntese orgânica e a química medicinal.3
Uma das mais relevantes RMCs é a reação tricomponente de Biginelli
(desenvolvida pelo químico Pietro Biginelli) que envolve uma condensação simples de
acetoacetatos, aldeídos (em sua maioria aromáticos) e ureia ou tioureia, gerando
compostos conhecidos como compostos de Biginelli ou diidropirimidinonas (DHPMs)4
(Esquema 1). Do ponto de vista sintético as RMCs (e por consequência a RMC de
Biginelli) possibilitam a geração de grandes bibliotecas de compostos com elevada
complexidade e a aplicação dos mesmos na pesquisa e descobertas de potenciais
fármacos.5-7 Por este motivo as RMCs representam um dos pilares da química
combinatória e da síntese orientada para a diversidade, as colocando em um ponto
central no estudo e desenvolvimento de metodologias sintéticas modernas voltadas a
química medicinal.8 Dessa forma, um dos grandes atributos da RMC de Biginelli
consiste na diversidade dos blocos de construção tolerados na condensação, sendo
responsável pela geração de um grande grupo de moléculas baseados em uma
estrutura comum e facilmente sintetizadas pela variação dos precursores. 9
16
Esquema 1. Reação multicomponente de Biginelli visando a síntese de
diidropirimidinonas/tionas
Além da geração de bibliotecas de compostos com elevada diversidade e
complexidade outro fator de elevada relevância apresentado pelas RMCs é a ligação
com os aspectos básicos da química verde.10 Premissas como prevenção da geração
de resíduos, economia de átomos, eficiência energética e redução na formação de
subprodutos, são comuns as RMCs e a química verde – tornando as condensações
multicomponentes um passo importante para obtenção de estruturas diversificadas e
complexas com importantes aspectos ambientais.11, 12
Somado a esses fatos, da geração de bibliotecas diversificadas e complexas
com atributos ambientalmente favoráveis, uma das aplicações mais importante dos
compostos de Biginelli é a de moduladores de processos biológicos, sendo
notadamente reconhecidos na química medicinal. Primariamente os compostos de
Biginelli, devido a sua similaridade estrutural com as diidropiridinas (DHPs) e a natural
analogia ao perfil farmacológico dessas na modulação do canal de cálcio como a
apresentada pela nifedipina (1) (Figura 1), foram testados como bloqueadores de canal
de cálcio sendo demonstrada a atividade anti-hipertensiva das DHPMs similar a das
DHPs.13-15
Figura 1. Nifedipina 1 ou BAY A1040®Bayer 16
17
Além da aplicação clássica como bloqueadores do canal de cálcio outros efeitos
farmacológicos e biológicos importantes das DHPMs foram pesquisados incluindo a
atividade anti-inflamatória17, bactericida, antiviral18, antifúngica19 e antioxidante20
demonstrando assim o elevado potencial farmacológico e a ampla gama de processos
biológicos atrativamente afetados diretamente pelas DHPMs.
Ainda dentro das aplicações nas modulações de processos biológicos, as
DHPMs foram identificadas como potenciais agentes antitumorais, estando envolvidas
no bloqueio da mitose pela inibição da cinesina, uma proteína importante para o
processo mitótico.21, 22 Estudos baseados em bibliotecas de moléculas com baixo peso
molecular (>500 g/mol) demonstraram a capacidade das DHPMs, principalmente do
monastrol (2) (Figura 2), em atuar na inibição da cinesina,21-26 sendo que compostos
com capacidade de perturbar a mitose celular (série ordenada de eventos
fundamentalmente mecânicos em que cópias idênticas do genoma são movidas dentro
da célula) tem demonstrado eficácia no tratamento de diversas linhagens tumorais.21
Figura 2. Monastrol (2)
Nosso grupo de pesquisa tem em sua principal linha de investigação a síntese
de novos compostos derivados de ácidos graxos visando a avaliação da sua atividade
biológica/farmacológica.27-34 Essa linha relaciona a influência da presença de cadeias
graxas na atividade de compostos orgânicos através do desenvolvimento de
metodologias para a síntese de novas moléculas nitrogenadas graxas de interesse
farmacológico e tecnológico – estruturalmente simples e de baixo custo, assim como o
aumento da lipofilicidade de moléculas notadamente ativas biologicamente. O aumento
da lipofilicidade tem impacto direto sobre o perfil farmacocinético – sendo uma
18
propriedade físico-química chave na determinação das propriedades ADMET
(adsorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade),35 consistindo em
propriedades relevantes para a admissão de novos fármacos. No caso específico do
sistema nervoso central (SNC), o aumento da lipofilicidade pode ser um ponto chave
para a entrega de fármacos devido à presença da barreira hemato-encefálica (BHE),
elemento formado por camadas de células que separam o sangue do parênquima
cerebral, sendo a BHE seletiva a passagem de substâncias de acordo com
características bioquímicas.36
Dentro dessa linha, o estudo de Treptow e colaboradores34 baseou-se na
funcionalização da estrutura básica das DHPMs através da inserção de cadeias graxas
na posição 5 do heterocíclico. Este estudo relacionou a atividade biológica dos
compostos de Biginelli graxos e diferentes linhagens tumorais, comprovando a elevada
atividade dos derivados graxos análogos ao monastrol.
A atuação destes compostos como agentes antitumorais e os efeitos sobre a
lipofilicidade gerados com a funcionalização graxa na posição 5 do heterocíclico
incentivaram a criação de uma biblioteca de diidropirimidinonas/tionas 6-substituídas
com cadeias graxas inéditas e análogas as estruturas sintetizadas por Treptow e
colaboradores34 e a aplicação dos compostos análogos ao monastrol na avaliação do
efeito citotóxico na linhagem celular de glioma de rato (C6) (em comparação ao
monastrol e ao análogo diidropirimidinona 5-substituída derivada da cadeia palmítica),
conforme exposto na Figura 3.
19
Figura 3. Série do monastrol (2) e de seus análogos graxos (substituídos na posição 5
e 6)
20
2. OBJETIVOS
Objetivo geral
O objetivo geral do estudo foi realizar a síntese de novas
diidropirimidinonas/tionas-ácidos graxos 6-alquil substituídas híbridas 3-10a-c (DHPMs-
ácidos graxos-6C-substituídas) utilizando como precursores β-cetoésteres graxos (βce)
11a-c obtidos a partir de ácidos graxos 12a-c (saturados e insaturados) derivados de
fontes renováveis e avaliar o possível efeito citotóxico dos compostos sintetizados
derivados do monastrol (Esquema 2).
Esquema 2. Retrossíntese das novas diidropirimidinonas/tionas-ácidos graxos 6-alquil
substituídas 3-10a-c derivadas de fontes renováveis
Objetivos específicos
Realizar a síntese dos β-cetoésteres graxos (βce) 11a-c a partir da
acilação do ácido de Meldrum (13) com ácidos graxos 12a-c usando
como agentes de acoplamento DCC (14) e DMAP (15) seguido da
abertura com metanol (Esquema 3);
21
Esquema 3. Síntese de β-cetoésteres graxos 11a-c
Realizar a síntese de diidropirimidinonas 3-6a-c e diidropirimidintionas 7-
10a-c (DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas) com substituinte graxo na
posição 6 a partir da reação multicomponente de Biginelli, usando a
condensação de β-cetoésteres graxos (βce) 11a-c, diferentes aldeídos
aromáticos 17-20 e ureia (21) e/ou tioureia (22) com aplicação do ácido
sulfâmico (23) como catalisador (Esquema 4);
Esquema 4. Síntese de diidropirimidinonas 3-6a-c e diidropirimidintionas 7-10a-c
Realizar a caracterização e a elucidação estrutural das moléculas
sintetizadas análogas ao monastrol (Monastrol-ácidos graxos-6C-
22
substituídas) através do ponto de fusão, ressonância magnética nuclear
de próton (RMN1H) e ressonância magnética nuclear de carbono
(RMN13C)
Avaliar a atividade das moléculas graxas análogas do oxo-monastrol 4a-c
e do Monastrol-ácidos graxos-6C-substituídas 8a-c frente à linhagem
celular de glioma de rato (C6) e comparar com o monastrol (2) e com o
seu análogo diidropirimidinona 24 derivado da cadeia palmítica 5-
substituída (Figura 4);
Figura 4. Avaliação citotóxica do monastrol (2) e dos análogos graxos 23, 4a-c e 8a-c
frente a linhagem celular de glioma
23
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1. Aplicação das RMCs na química medicinal
A tarefa de selecionar um potencial e seletivo modulador molecular no vasto
espaço químico (o espaço químico de moléculas com massa molecular inferior a 500
g/mol – correspondendo a moléculas pequenas – construídas a partir de elementos
comuns – como carbono, hidrogênio, nitrogênio, enxofre e oxigênio – pode estender
10200 estruturas)37 é extremamente elaborada. Ainda que o espaço de compostos
biologicamente atrativos (espaço químico biologicamente relevante) seja uma
constrição do espaço químico38 este espaço ainda é constituído por uma grande
variedade de estruturas; devido a essa grande variedade de estruturas, no projeto de
novos potenciais fármacos o conceito de compostos híbridos é notadamente uma
feramente útil, visto que a partir de estruturas notadamente ativas biologicamente é
possível estabelecer novos compostos com atividade farmacológica melhorada. A
síntese de compostos híbridos baseia-se na combinação de grupos farmacofóricos de
diferentes substâncias bioativas para produzir um novo composto híbrido com afinidade
e eficácia melhorada,39 sendo que essa estratégia conduz a compostos com
seletividade e perfil modificados, diferentes dos efeitos originais ou de modo sinérgico,
com possível redução nos efeitos secundários.40
Muitas características são ligadas as reações multicomponentes, tais como
elevada economia de átomos (com a maioria dos átomos, ou mesmo a totalidade,
sendo incluídas no produto-alvo), alta eficiência (com rendimentos maiores em
comparação a reações sequênciais em múltiplas etapas na obtenção de um mesmo
alvo-sintético), convergência (diversos compostos iniciais são combinados em uma
reação para formar o alvo-sintético) e elevado índice de formação de ligações ou BFI,
do inglês bond-forming-index (diversas ligações de átomos, excetuando o hidrogênio,
são formadas em uma transformação sintética).41 Dessa forma, as reações
multicomponentes oferecem uma alternativa prática para a síntese sequencial em
múltiplas etapas,42 além do alto potencial exploratório quanto ao escopo químico e de
24
serem idealmente aplicadas para a geração de bibliotecas de compostos2 (Esquema
5). Diversas reações multicomponentes são descritas na literatura – como as reações
multicomponentes de Ugi,43 Passerini,44 Van Leusen,45 Strecker,46 Hantzsch,47 e
Biginelli,4 entre outras, além de suas variações – sendo classificadas como reações
clássicas da síntese orgânica. Adicionalmente, as reações multicomponentes oferecem
alta compatibilidade com grupos funcionais ortogonais não protegidos, que em um
segundo nível, podem aumentar a diversidade de estrutura pela introdução de grupos
funcionais nas reações multicomponentes primárias e transformações subsequentes,
tais como formação de anel. Essa estratégia em duas etapas é aplicada na química
combinatória e medicinal para a criação de fármacos inéditos.48, 49 Essa estratégia em
duas etapas é ilustrada no Esquema 6.
Esquema 5. Síntese linear tradicional em três etapas vs. reação multicomponente
25
Esquema 6. Variedade estrutural baseada em primárias ou clássicas RMC e reações
secundárias
Dessa forma, a síntese simples e rápida de compostos biologicamente
relevantes gerados pelas reações multicomponentes assim como a possibilidade de
diversidade estrutural dos compostos gerados nessas reações – as define como uma
ferramenta no projeto, desenvolvimento e descoberta de compostos biologicamente
ativos.42
Uma grande necessidade ligada ao projeto de novos fármacos é a síntese de
compostos com possibilidade de aplicação como agentes antitumorais, devido a grande
taxa de mortalidade e heterogeneidade dos tipos de câncer. O câncer é definido como
um conjunto de mais de 100 doenças com possibilidade de acometer todos os órgãos
do corpo.50 Os tumores de sistema nervoso central (SNC) são de elevada relevância
quando se trata de estudo de novos fármacos, devido à alta taxa de mortalidade
apresentada e de suas co-morbidades. Os tumores de sistema nervoso central se
dividem em neuroma (tumor de células neuronais) e glioma (tumores de células gliais)
considerado o tumor primário mais comum no cérebro (de 50 a 60% destes).51 Apesar
dos tratamentos atualmente aplicados, pacientes diagnosticados apresentam uma
sobrevida média baixa com o quadro permanecendo inalterado ao longo das últimas
décadas.52, 53 As causas desta recorrência parecem ser principalmente a proliferação
de alta invasividade e a resistência à radiação.54 Além disso, os tumores do SNC
podem progredir rapidamente com geração de metáteses em diversas partes do
organismo ou outras funções vitais.2, 55
Apesar do grande número de fármacos utilizados no tratamento destas
patologias a efetividade é pequena devido a entrada destes compostos no SNC ser
dificultada pela presença da barreira hemato-encefálica (BHE), elemento da
26
neurovasculatura que serve como um impedimento para a entrada ilimitada de
substâncias no cérebro, limitando fortemente a gama de propriedades físico-químicas
das substâncias que entram no SNC, fazendo com que muitos fármacos sejam
desenvolvidos conforme estas orientações (CARVEY et al, 2009; UPTON, 2007). O
desenvolvimento de novos fármacos não é relacionado exclusivamente ao
reconhecimento específico e potente dos alvos farmacodinâmicos – mas igualmente a
entrega eficiência aos sítios de destino. Os efeitos farmacológicos e terapêuticos de
determinado fármaco são associados a passagem por diversas barreiras celulares
visando uma resposta in vivo. A permeabilidade através de várias barreiras celulares é
ligada a diversas propriedades como solubilidade, estabilidade e efeito de primeira
passagem, além das propriedades farmacocinéticas (taxa de depuração, meia-vida
biológica, e volume de distribuição entre outras). Pelas amplas ligações com as
propriedades ADMET e a adequação geral de candidatos a fármacos, a lipofilicidade
tem emergido como um parâmetro crítico na descoberta e projetos de novos fármacos.
A lipofilicidade se refere à capacidade se dissolver em substâncias apolares, sendo
reconhecida como um fator importante para a passagem bem sucedido de fármacos.35,
56, 57 A relação entre o aumento da lipofilicidade de compostos e sua avaliação
citotóxica foi relatada por Hudgines e colaboradores58 – sendo possível estabelecer
inclusive no teste in vitro o aumento do potencial inibitório contra as linhagens tumorais
de tumor de próstata (PC3), glioma (U87) e melanoma com o aumento da lipofilicidade
das estruturas dos análogos ao fenilacetato (25), com destaque para o 1-naftilacetato
(26) e 4-iodo- fenilacetato (27).
Atividade antitumoral das diidropirimidinonas
As DHPMs exibem uma grande gama de diferentes atividades farmacológicas,
tais como atividade antiviral, anti-inflamatória, antibactericida, antifungica, antiepilética,
antimalárica entre outras. Devido à alta incidência do câncer, assim como da
dificuldade atrelada ao tratamento, a atividade antitumoral de compostos é
extremamente relevante na pesquisa, sendo atualmente este um tópico fundamental no
estudo desses heterocíclicos.59
27
Os adutos de Biginelli são uma estrutura promissora para o tratamento de
tumores, sendo o monastrol (2) um exemplo de aduto de Biginelli empregado em
estudos para o tratamento de tumores. Mayer e colaboradores descreveram pela
primeira vez o efeito do monastrol na atividade antitumoral, demonstrado a ação direta
do monastrol na interrupção da mitose inibindo a atividade motora na cinesina EG5,
uma proteína envolvida na formação do fuso bipolar.60 A partir dessa aplicação o
monastrol se tornou o alvo de inúmeras publicações como potencial agente antitumoral.
Russowsky e colaboradores sintetizaram 11 compostos análogos ao monastrol,
sendo o piperastrol (28) considerado um potente agente antitumoral contra diversas
linhagens de células tumorais (baseados na concentração do composto para inibir o
crescimento celular em 50% do efeito máximo - EC50, IC50 ou GI50) tais como linhagens
de mama (MCF-7), rim (786-0), colón (HT-29), melanona (UACC62) e ovário
(OVCAR03) (Figura 5). O piperastrol demonstrou resultado de 1,9 µg/mL contra a
linhagem de mama MCF-7 e de 2,0 µg/mL contra a linhagem de rim 786-0, além das
demais linhagens nas quais apresentou concentração inferior a 6,6 µg/mL (sendo que
piperastrol demonstrou atividade 30 vezes superior ao monastrol). Além do piperastrol,
Russowsky e colaboradores obtiveram excelentes resultados com os outros
compostos, sendo que com exceção da linhagem de células tumorais colón HT-29 os
derivados do monastrol foram mais potentes que os derivados oxo- sugerindo a
importância da presença de enxofre para a atividade anti-proliferativa.61
Figura 5. Estrutura do piperastrol 28
Kamal e colaboradores estudaram a síntese de dímeros do monastrol é a
avaliação deles como potencial agente citotóxico em linhagens tumorais humanas. A
síntese dos dibenzaldeídos substituídos 29 foi realizada a partir de compostos de
28
dibromo, sendo os dibenzaldeídos utilizados na condensação de Biginelli com tioureia e
acetoacetato de etila 30 ou acetoacetato de 2-carboxilato-pirrolidina 31 conforme
demonstrado no Esquema 7. Foram obtidas 10 estruturas de análogos ao monastrol
(32, 33a-e) sendo aplicadas na inibição da viabilidade celular de uma série de
linhagens tumorais - MCF-7b (câncer de mama), A431c (câncer de pele), Colo-205d
(câncer de cólon), A549 (câncer de pulmão) sendo que as mesmas demonstram
atividade de moderada a baixa.62
Esquema 7. Síntese de dímeros do monastrol 32, 33a-e
Kaur e colaboradores estudaram a condensação de 2-aminobenzimidazol 34
com acetoacetato de etila e diferentes aldeídos (aromáticos e heteroaromáticos),
obtendo bons rendimentos (exceto para os aldeídos funcionalizados com grupos
retiradores como OH nas posições –orto e –para). A inibição da viabilidade celular foi
estudada contra as linhagens PC3 (células de câncer de próstata), NCI-H1299 (células
de câncer de pulmão) e HCT116 p53 (−/−) (células de câncer de colón), demonstrando
atividade inibitória de moderada a excelente, com destaque para o composto derivado
do 2-hidroxi-1-naftaldeido 35 (Figura 6) que apresentou IC50=37 μM para inibição em
cultura de PC3 e IC50=40 μM para inibição em cultura de NCI-H1299.63
29
Figura 6. Composto tipo-Biginelli derivado do 2-hidroxi-1-naftaldeido (35)
Treptow e colaboradores34 desenvolveram a síntese de uma série de
diidropirimidinonas-ácidos graxos 5- alquil substituídas (DHPMs-5C-graxas) através da
condensação de acetoacetatos graxos, aldeídos aromáticos e ureia ou tioureia obtendo
15 compostos inéditos. A síntese foi realizada em duas etapas com a etapa inicial
sintetizando acetoacetato graxos (36) pela reação de transesterificação de álcoois
graxos (37) e acetoacetato de metila (38) e a segunda etapa pela condensação de
Biginelli propriamente dita (Esquema 8).
Esquema 8. Síntese de novas DHPMs-5-graxas
Após a etapa de síntese foram testadas quanto ao efeito da citotoxicidade em
linhagens tumorais de C6-rato e U-138-MG glioma humano. Esse estudo demonstrou
que as moléculas análogas ao monastrol derivadas das cadeias palmítica e oleica
30
demonstraram melhor resultados que a temozolamida (39), demonstrando assim o
potencial da funcionalização com cadeias graxas em fármacos antimorais. A Figura 7
mostra o efeito das DHPMs na viabilidade celular para a linhagem celular de glioma
humano U-138-MG após 24 horas de tratamento.
Figura 7. Resultados do teste de viabilidade celular para as moléculas Monastrol-
ácidos graxos-5C-alquil substituídas (Treptow et al., 2015)
31
3.2. Síntese das DHPMs
Dentro das diversas possibilidades geradas pelas reações multicomponentes –
as 3,4-diidropirimidinonas constituem uma importante classe de compostos com
excelentes propriedades farmacológicas.64 As 3,4-diidropirimidinonas, adutos de
Biginelli, compostos de Biginelli ou simplesmente diidropirimidinonas (DHPMs) foram
sintetizados primeiramente pelo químico italiano Pietro Biginelli em 1891, sendo uma
das primeiras reações multicomponentes realizadas. Os compostos sintetizados nessa
reação multicomponente – as 3,4-diidropirimidin-2(1H)-onas/tionas DHPMs, adutos de
Biginelli ou compostos de Biginelli – envolvem a reação de compostos 1,3-
dicarbonílicos, aldeídos e ureia (24) ou tioureia (25) em uma única etapa, possuindo
tanto ocorrência natural, como no caso de alguns alcaloides marinhos presentes nas
batzeladinas (40) ou de natureza sintética, como no caso do SNAP-6383 (41) um
potencial agente no combate da hiperplasia prostática benigna. A variação dos três
componentes ou blocos de construção gera uma enorme gama de produtos derivados
com uma ampla diversidade estrutural.65
Figura 8. DHPMs de ocorrência natural e sintética
Os três precursores utilizados na RMC de Biginelli podem ser generalizados em
compostos dicarbonílicos, aldeídos e compostos do tipo ureia, sendo que a
combinação desses três blocos de construção gera uma enorme gama de compostos
com grande diversidade e complexidade.9
32
A maior variação nos blocos de construção ao qual são submetidos os
compostos de Biginelli compreende a variação no bloco correspondente ao aldeído 9,
sendo utilizados em sua maioria compostos aromáticos com diferentes orientações de
substituição (orto-, meta- e para-), funcionalizados com grupos doadores e retiradores
de elétrons. Preferencialmente os maiores rendimentos são obtidos com aldeídos
aromáticos substituídos nas posições orto- e meta- com grupos eletro-retiradores. A
substituição em orto- gera menores rendimentos com grupos mais volumosos devido
ao impedimento estérico.4, 9, 64, 65 A literatura ainda relata a utilização de aldeídos
alifáticos e aldeídos heterocíclicos.
Outra variação responsável pela diversidade e complexidade das
diidropirimidinonas é no bloco da ureia e derivados. O último bloco de construção
passível de alteração é o dos compostos dicarbonílicos, que podem exibir uma ampla
gama de funções orgânicas, como tioester, cetoesteres, cetos, cetoamidas, etc.
Síntese de compostos 1,3-Dicarbonilicos
Os três precursores utilizados na RMC de Biginelli podem ser generalizados em
compostos 1,3-dicarbonílicos, aldeídos e compostos do tipo ureia, sendo que a
combinação desses três blocos de construção gera uma enorme gama de compostos
com grande diversidade e complexidade.9 Dentre os blocos construtores o bloco
relativo aos compostos 1,3-dicarbonílicos é o mais relevante com podendo exibir uma
ampla gama de funções orgânicas, como tioester, cetoesteres, cetos, cetoamidas, etc.
Uma importante via de obtenção de blocos construtores do tipo dicarbonílicos
altamente funcionalizados visando a geração de diidropirimidinonas 6-funcionalizadas
consiste na funcionalização do ácido de Meldrum e posterior geração de compostos do
tipo 1,3-dicarbonílicos com funcionalização no grupo ceto.
Oikawa e colaboradores sintetizaram uma série de β-cetoésteres a partir da
acilação direta do ácido de Meldrum com diferentes cloretos de acila utilizando piridina
como catalisador. Neste caso, após a etapa da acilação o Meldrum acilado foi
submetido a reação de alcóolise na presença de diferentes álcoois como metanol,
33
etanol, álcool terc-butílico, álcool benzílico e tricloroetanol, sendo obtidos uma grande
variedade de β-cetoesteres (42),66 conforme Esquema 9.
Esquema 9. Síntese de β-cetoéster via acilação do ácido de Meldrum (Oikawa et al.,
1978)
Baseado no mesmo princípio Lacotte e colaboradores67 visando obter
precursores para uma condensação de Biginelli sintetizaram uma série de β-cetoester
a partir da acilação do ácido de Meldrum com diferentes ácidos carboxílicos (43), sendo
os mesmos tratados álcool 4-metoxibenzílico (44), conforme Esquema 10, produzindo
β-cetoésteres aromáticos (45).
Em outro estudo Shimkin e colaboradores68 realizaram a acilação do ácido de
Meldrum com diferentes grupos arílicos a partir de imidazois de ácido carboxílico (46),
obtendo um Meldrum acilado com aromático (47) seguido da abertura com etanol,
sendo obtidos β-cetoésteres (48). Além da aplicação dessa reação com N,N´-
carbonildiimidazol, outros três métodos foram utilizados; cloretos de acila e piridina,
cloretos de acila e DMAP e cloretos de acila com DCC, com a segunda etapa de
alcóolise mantida inalterada. Dentro os métodos, o método com N,N´carbonildiimidazol
foi o que demonstrou maior rendimento, independente do grupo arílico utilizado sendo
exposto no Esquema 11.
34
Esquema 10. Síntese dos β-cetoéster via acilação do ácido de Meldrum
Esquema 11. Utilização de N,N´carbonildiimidazol na síntese de β-cetoésteres
aromáticos 48
35
Além da alcóolise do Meldrum acilado a estrutura acilada pode reagir com outros
nucleófilos, tais como aminas, gerando β-cetoamidas. A aminólise do Meldrum acilado
visando a obtenção de β-cetoamidas (49) foi estuda por Pak e colaboradores69 a partir
da acilação do Meldrum com diferentes cloretos de acila, sendo o produto da acilação
refluxado em benzeno com diferentes aminas primárias e secundárias (50) sendo
obtidas as β-cetoamidas.
Esquema 12. Síntese de β-cetoamidas via ácido de Meldrum (Pak et al., 1992)
Contudo os estudos desenvolvidos por Janikowska e colaboradores70, 71
demonstraram a baixa eficiência de aminas secundárias na aminólise direta de
Meldrum acilado, com a obtenção de baixos rendimentos (26-50%), em oposição aos
experimentos realizados na aminólise direta do Meldrum com aminas primárias que
obtiveram rendimentos elevados. Para contornar os problemas relacionados à baixa
nucleofilicidade das aminas secundárias foi testada a adição do agente sililante
clorotrimetilsilano (51) ao meio. No Esquema 13 é exposto o mecanismo da reação
com adição de agente sililante, com a formação do intermediário entre o
triclorometilsilano e a amina secundária, com rendimentos finais entre 93-96%.
36
Esquema 13. Mecanismo de aminólise do Meldrum acilado com agente sililante
Outra aplicação sintética do Meldrum acilado é na síntese das N-Acil
Homoserinas Lactonas (NAHLs) (52) (Figura 9), compostos que mimimetizam
moléculas responsáveis pelo quorum sensing de bactérias. O quorum sensing é um
processo baseado em moléculas sinalizadoras de baixo peso molecular para
comunicar informações sobre as densidades populacionais locais, visando controlar e
coordenar seu comportamento, sendo estas moléculas de sinalização – conhecidas
como auto indutores – responsáveis por um papel chave em um complexo mecanismo
de comunicação célula a célula.72
37
Figura 9. N-Acil homoserinas lactonas 52 de ocorrência natural
Thomanek e colaboradores 73 sintetizaram NAHL funcionalizados com ácido 10-
azidodecanóico (53) a partir do ácido de Meldrum e ácido 12-azidododecanóico (54)
(via DCC e DMAP). Além da funcionalização na cadeia graxa foram realizados estudos
com diferentes substituintes no anel da lactona (55) (Esquema 14) gerando N-Acil
Homoserinas lactonas funcionalizadas (56).
Esquema 14. N-Azidoacil homoserina lactona e N-Acil homoserinas lactonas
funcionalizadas
38
Reação de Biginelli utilizando ácido sulfâmico
Diversos catalisadores foram amplamente estudados e aplicados na reação de
Biginelli, sendo que atualmente os catalisadores verdes tem recebido maior atenção.
Dentro desse contexto o ácido sulfâmico, devido as suas características excepcionais
de estabilidade, não-volatilidade, não corrosividade, atoxicidade e baixo custo,74 se
mostra um potencial catalisador para as condensações de Biginelli (tanto nas formas
suportadas quanto não-suportadas).
A viabilidade do ácido sulfâmico como catalisador em sistemas com ausência de
solvente foi estudada por Chen e colaboradores. Nesse estudo, primariamente, foi
avaliada a condensação multicomponente entre o acetato de etila , benzaldeído e ureia
com diferentes quantidades de ácido sulfâmico, variando entre 10 e 40%, temperaturas
reacionais (100 e 120°C) e diferentes tempos reacionais (entre 8 e 20 minutos). O
melhor resultado (94%) obtido nessa avaliação prévia foi com 30mol% de ácido
sulfâmico a 120 °C durante 8 minutos. Após esse resultado inicial o escopo dos blocos
de construção foi variado (Esquema 15) gerando uma biblioteca de compostos em
rendimentos excelentes (80-96%), comprovando a eficácia do ácido sulfâmico como
catalisador independente da variação estrutural empregada nos blocos de
construção.75
Esquema 15. Avaliação do ácido sulfâmico como catalisador em sistema livre de
solvente
39
Outro estudo que avaliou o ácido sulfâmico como catalisador da reação de
Biginelli em sistemas com ausência de solvente foi avaliada em um estudo de Yao e
colaboradores a partir da condensação de acetato de metila ou etila, diferentes
aldeídos aromáticos, e do 5-aminotetrazol (57) (Esquema 16) gerando derivados das
DHPMs altamente funcionalizados (58). A reação foi realizada a 120°C e empregando
10%mol de ácido sulfâmico, sendo os rendimentos obtidos na faixa de 77 a 88%.76
Esquema 16. Aplicação do ácido sulfâmico como catalisador em sistema livre de
solventes
Outro trabalho estudou o uso comparativo do aquecimento convencional e do
aquecimento via micro-ondas utilizando a relação estequiométrica de 1:1:1,5
(aldeído:1,3-dicarbonílico:ureia/tioureia) e 20% de ácido sulfâmico em ambas formas de
aquecimento; os rendimentos obtidos para o aquecimento convencional ficaram na
faixa de 64 a 80% em períodos de até 7 horas enquanto com o aquecimento via
microondas foi de 84 a 93% usando períodos inferiores a 3,5 minutos.77
Shen e colaboradores (2012) empregaram ácido sulfâmico na catálise da
condensação de Biginelli, utilizando 10% mol de catalisador em etanol a 90 °C de 7 a 9
horas sendo obtidos rendimentos entre 76 e 90%. A condensação de Biginelli foi
40
realizada utilizando a relação estequiométrica de 1:1:1 (aldeído:1,3-
dicarbonílico:carbonato de fenilguanidina).78
Em outro estudo, Jetti e colaboradores utilizaram como suporte para o ácido
sulfâmico sílica, catalisando a reação multicomponente com sílica ligada a N-propil
ácido sulfâmico. A reação foi realizada empregando uma relação estequiométrica de
1:1:1 (aldeído:1,3-dicarbonílico:ureia/tioureia) e 200 mg da sílica funcionalizada com
ácido sulfâmico (2,4% mol de SO3H) para 2,5 mmol de aldeído. A reação foi realizada
utilizando etanol como solvente a 80°C, conforme demonstrado no Esquema 17. Os
rendimentos da reação ficaram na faixa de 90 a 95% com o tempo reacional variando
entre 3 e 4 horas.79
Esquema 17. Ácido sulfâmico suportado em sílica
A catálise da condensação de Biginelli via ácido sulfâmico suportado foi
estudada por Toosi e colaboradores, sendo o ácido sulfâmico suportado em
nanopartículas magnéticas de Fe3O4. As nanopartículas magnéticas foram obtidas a
partir da coprecipitação dos íons Fe2+ e Fe3+, seguido do revestimento por 3-
aminopropil-trietoxisilano e posterior reação com ácido clorossulfúrico. A condensação
de Biginelli foi realizada utilizando a relação estequiométrica de 1:1,2:1,5 (aldeído:1,3-
dicarbonílico:ureia/tioureia) e 120 mg da nanopartícula magnética funcionalizada com
ácido sulfâmico (para 1 mmol de aldeído) a 100 °C durante 2 horas. Os rendimentos
41
obtidos para os derivados da ureia ficaram entre 80 e 92% e para os compostos
derivados da tioureia na faixa de 75 a 85% (Esquema 18).80
Esquema 18. Uso de ácido sulfâmico suportado em nanopartículas magnéticas
42
4. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
4.1. Síntese dos β-cetoésteres 13a-c
A partir dos estudos desenvolvidos por Oikawa e colaboradores e Lacotte e
colaboradores 66, 67 sobre a síntese de compostos 1,3-dicarbonílicos a partir da acilação
do ácido de Meldrum foram desenvolvidas duas metodologias para a síntese dos β-
cetoésteres. A primeira metodologia envolveu a adição em uma única etapa do ácido
graxo, DCC, DMAP, ácido de Meldrum e piridina; e a segunda metodologia ocorreu em
duas etapas, adição do ácido graxo, DCC e DMAP seguido da adição de uma mistura
de ácido de Meldrum e piridina. Em ambos as metodologias a etapa de alcóolise foi
realizada para obtenção dos respectivos β-cetoésteres 11a-c.
Com a reação em uma única etapa foram observados rendimentos de
moderados a bons (Tabela 1) conforme já descrito por Brinkerhoff e colaboradores29
sendo os rendimentos moderados atribuídos a possível reação paralela do DCC e do
ácido de Meldrum. Visando contornar essa reação, foi estudada a acilação em duas
etapas. Nessa metodologia a adição do ácido de Meldrum foi realizada após a ativação
do ácido graxo pela presença de DCC seguido da etapa de alcóolise para levar a
formação dos β-cetoésteres graxos 11a-c. No processo acima, em duas etapas, a
formação de subprodutos foi evitada levando a formação dos β-cetoésteres graxos
13a-c em bom rendimentos (Tabela 1).
43
Tabela 1. Síntese de β-cetoésteres graxos 11a-c a partir da acilação do ácido de
Meldrum 13 com ácidos graxos 12a-c e posterior metanólise
Ácido graxo β-Cetoésteres 13a-c Rend. (%)a Rend. (%)b
65 80
69 84
70 81
a: etapa de acilação do ácido de Meldrum (13) com ácidos graxos (12a-c) realizada em uma
única etapa; b: etapa de acilação do ácido de Meldrum (13) com ácidos graxos (12a-c) realizada em duas
etapas (i) reação do ácido graxo (12a-c) com DMAP e DCC (ii) seguido da adição do ácido de Meldrum
(13) e piridina;
A reação entre o DDC e o ácidos de Meldrum foi descrita na literatura em um
estudo de Augustin e Giinther em condições similares a utilizada anteriormente.81
Neste trabalho a reação do ácido de Meldrum foi realizada com diferentes
carbodiimidas (Esquema 19) sendo obtidos rendimentos entre 60 e 70% para os
produtos de condensação (59).
44
Esquema 19. Reação entre o ácido de Meldrum e diferentes carbodiimidas
Em outro estudo dos mesmos autores o produto da reação do ácido de Meldrum
com carbodiimida foi tratada com etanol sendo obtido um éster derivado de
carbodiimidas (Esquema 20).
Esquema 20. Obtenção de um composto derivado de carbodiimidas
Após a obtenção dos β-cetoésteres 11a-c os compostos foram caracterizados.
Os dados de ressonância magnética dos compostos sintetizados foram condizentes
com os dados da literatura conforme descrito por Brinkerhoff e colaboradores.29
45
4.2. Síntese das DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas
3-10a-c
Baseado no estudo anterior da síntese de diidropirimidinonas graxas 5-
substituídas34 a síntese dos novos análogos diidropirimidinonas graxas 6-substituídas,
alvo sintético deste trabalho, foi realizada a partir da condensação tricomponente de
Biginelli entre os β-cetoésteres graxos, aldeídos aromáticos e ureia ou tioureia, usando
como reação protótipo a condensação de β-cetoéster esteárico 11a, benzaldeído 17 e
ureia 21. A reação foi realizada nas mesmas condições reacionais utilizando refluxo em
acetonitrila e ácido sulfâmico como catalisador.
Como um dos objetivos era a avaliação de um catalisador verde na reação de
Biginelli, e impulsionado pelos estudos já realizados em nosso grupo de pesquisa74, o
ácido sulfâmico foi escolhido como catalisador para a reação de Biginelli sendo
aplicado inicialmente nas mesmas quantidades catalíticas descritas por Treptow e
colaboradores.34 Entretanto, os rendimentos obtidos para a síntese das
diidropirimidinonas graxas 6-substituídas não foram satisfatórios, sendo aplicadas
modificações na reação protótipo como variação do solvente e da quantidade de ácido
sulfâmico empregada. Como observado na
46
Tabela 2, o ácido sulfâmico devido a sua acidez moderada se mostrou eficiente quando
empregado em maiores proporções.
47
Tabela 2. Reação multicomponente de Biginelli usando β-cetoéster estárico 11b,
benzaldeído 17 e ureia 21 com diferentes catalisadores
Entradaa Solvente Catalisador Catalisador
(%mol) Rendimento (%)b
1 MeCN
NH2SO3H 10 50
2 NH2SO3H 20 55
3 MeOH
NH2SO3H 10 50
4 NH2SO3H 20 65
5 EtOH
NH2SO3H 10 45
6 NH2SO3H 20 48
7
MeOH
NH2SO3H 40 83
8 NH2SO3H 60 85
9 NH2SO3H 80 75
10 NH2SO3H 100 81
11 MeCN InCl3 10 26
12 MeOH InCl3 10 42
13 MeCN InCl3 20 30
14 MeOH InCl3 20 44
15 MeCN SnCl3 10 36
16 MeOH SnCl3 10 38
17 MeCN SnCl3 20 40
14 MeOH SnCl3 20 32
a: Reação multicomponente de Biginelli 1 eqv.:1 eqv.:1,3 eqv. (respectivamente β-cetoesteres,
aldeído, ureia); refluxo de solvente; 24 horas; b: Composto isolado por cromatografia em coluna
48
Apesar da maior quantidade empregada a aplicação do ácido sulfâmico
apresenta inúmeras vantagens, como a baixa toxicidade apresentada pelo mesmo,
assim como do baixo valor e da possibilidade de reutilização, devido a heterogeneidade
do mesmo no meio. De acordo com o resultado os maiores rendimentos foram obtidos
em metanol com 60% de ácido sulfâmico (entrada 8). A diminuição no rendimento em
valores superiores a 60% pode ter ocorrido devido a possibilidade da ocorrência de
reações paralelas e concorrentes com efeitos diretos sobre o rendimento da reação.
A reação foi acompanhada por CCD sendo monitorado o consumo dos
reagentes limitantes (β-cetoéster esteárico e benzaldeído). A DHPM graxa 3b foi
observada após 24h de reação sendo isolada por coluna cromatográfica (7:3
hexano:acetoacetato de etila) com rendimento final de 50%. O rendimento observado
foi inferior a estrutura análoga DHPM graxa 5-substituida obtida nas mesmas
condições. Essa diferença entre os rendimentos das estruturas análogos 5 e 6
substituidas foi atribuída a diferença na reatividade dos compostos 1,3-dicarbonílicos
empregados, acetoacetato graxoe β-cetoester graxo, respectivamente.
Srilatha e colaboradores82 estudaram o comportamento e a influência da cadeia
alquílica na reação de esterificação de ácidos carboxílicos. Em seus estudos, foi
concluído que a medida que ocorrem adições de carbono na cadeia alquilica, aumenta
o efeito indutivo restringindo o ataque nucleofílico do álcool ao ácido carboxílico. Outro
ponto decisivo é o componente estérico que aumenta com o aumento da cadeia
alquilica do ácido, sendo o impedimento estérico ligado ao tamanho molecular que rege
a indução com a repulsão eletrônica entre os átomos não ligados das moléculas. Neste
caso diminui a densidade eletrônica na região e alterando as diversas ligações
intermoleculares da ligação, sendo os fatores chaves a reatividade restrita dos
compostos graxos a natureza indutiva e estérica. Esse fator de diminuição de
reatividade é recorrente e pode ser verificado inclusive na síntese de heterocíclos
nitrogenados baseados em blocos precursores tais como PHQs,28 DHPMs34 e DHPs.
Ainda, o ácido sulfâmico teve seu desempenho comparado com a catálise
desempenhada pelo cloreto de índio e pelo cloreto de estanho sendo superior aos dois
ácidos de Lewis, confirmando a eficiência da catálise com ácido sulfâmico frente a
sistemas clássicos de catálise.
49
Baseado no resultado demonstrado com metanol como solvente e 60% de ácido
sulfâmico como catalisador, a próxima etapa envolveu a variação nos blocos de
construção com variação nos β-cetoésteres assim como nos aldeídos envolvidos,
sendo realizada a síntese de uma série de diidropirimidinonas (3-6a-c).
50
Tabela 3. Estruturas e rendimentos das DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas 3-6a-c
obtidas pela reação multicomponente de Biginelli
Entradaa β-Cetoésteres
11a-c
DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas
3-6a-cb
Rend. (%)c
1
83
2
78
3
81
51
4
67
5
74
6
85
7
83
52
8
61
9
67
10
68
11
71
53
12
60
a: Reação multicomponente de Biginelli 1 eqv.:1 eqv.:1,3 eqv. (respectivamente β-cetoesteres,
aldeído, ureia); refluxo de CH3OH; 24 horas; b: DHPMs-6C-graxas (3-6a-c) elucidadas estruturalmente
por IV, RMN1H e RMN
13C;
c: Composto isolado por cromatografia em coluna.
Conforme pode ser demonstrado na
54
Tabela 3, foram sintetizados compostos com elevada diversidade e complexidade, em
bons rendimentos. A variação estrutural empregada na porção aromática do heterociclo
foi realizada de maneira a obter diferentes grupos funcionais, doadores e retiradores de
densidade eletrônica, nas posições meta e para do anel aromático. A variação
estrutural na posição seis do anel empregou três cadeias graxas, tanto saturadas
quanto insaturada, sendo as mesmas derivadas de fontes renováveis. Os compostos
foram identificados através de Espectroscopia de RMN de hidrogênio e carbono.
Abaixo é apresentado o espectro de RMN de hidrogênio do composto 3b (Figura 10).
Figura 10. Espectro de RMN de 1H (400 MHz/CDCl3) do composto 3b
Observando o espectro de hidrogênio foi possível identificar os sinais referentes
ao composto 3b. Em 0,88 ppm foi possível observar um tripleto relativo aos hidrogênios
da metila da cadeia graxa; em 1,32 o multipleto referente ao CH2 da cadeia graxa, em
1,58 os hidrogênios relativos aos hidrogênios homoalílicos e em 2,70 ppm o sinal
relativo aos prótons alílicos. O simpleto relativo aos sinais dos prótons da metoxila foi
55
percebido em 3,6 ppm. Em 5,37 ppm foi observado o dupleto relativo ao hidrogênio
benzílico H4 onde a expansão dessa região se encontra explicitada na Figura 11. Os
sinais relativos aos hidrogênios ligados ao nitrogênio do heterociclo são definidos em
5,9 ppm e 8,0 ppm. A região dos prótons ligados ao anel aromático é definida no
multipleto em 7,55.
Figura 11. Expansão da região do próton benzílico (400 MHz/CDCl3) do composto 3b
O espectro de carbono do composto 3b é ilustrado na Figura 12. Em 165,7 é
exposto o carbono do éster e em 153,2 é ilustrado o carbono da posição 2 do
heterociclo. Por sua vez, em 151,0 é exibido o sinal referente ao carbono vinílico da
posição 6. Em 143,8 é exposto o sinal do carbono relativo ao carbono da porção do
aldeído ligado ao heterociclo. Entre 126,4 e 128,7 ppm estão os sinais relativos aos
carbonos aromáticos e em 100,8 o carbono na posição 5. Em 55,7 está o sinal do
carbono benzilico, na região de 50,93 ppm é definido o sinal do carbono da metoxila; os
sinais definidos entre 22,65 e 29,66 são relativos aos carbonos da cadeia graxa estão
56
entre 28,20 e 31,89 ppm e os sinais do carbono terminal e alfa-terminal estão
sinalizados respectivamente em 22,69 e 13,99 ppm, respectivamente.
Figura 12. Espectro de RMN de 13C (100 MHz/CDCl3) do composto 3b
Somado as diidropirimidinonas, foram sintetizadas uma série de
diidropirimidintionas 8-12a-c, sendo os resultados demonstrados na
57
Tabela 4.
58
Tabela 4. Estruturas e rendimentos das DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas
7-10a-c obtidas pela reação multicomponente de Biginelli
Entradaa β-Cetoésteres
13a-c
DHPMs-6C-graxas
8-12a-cb Rend. (%)c
13
76
14
81
15
77
59
16
67
17
78
18
74
19
75
60
20
64
21
64
22
60
23
68
61
24
63
a: Reação multicomponente de Biginelli 1 eqv.:1 eqv.:1,3 eqv. (respectivamente β-cetoesteres,
aldeído, tioureia); refluxo de CH3OH; 24 horas; b: DHPMs-6C-graxas (7-11a-c) elucidadas
estruturalmente por IV, RMN1H e RMN
13C;
c: Composto isolado por cromatografia em coluna.
Assim como na síntese das diidropirimidinonas, as diidropirimidintionas foram
obtidas com grande diversidade estrutural devido ao caráter modular da reação. Foram
realizadas variações na posição 6 heterociclo a partir da modificação do β-cetoéstres e
na porção do aldeído, com diferentes grupos doadores e retiradores na posição meta e
para do aromático.
4.3. Avaliação da atividade antitumoral dos hibridos
Monastrol-ácidos graxos-6C-substituídos
Baseado nos trabalhos anteriores sobre a atividade das DHPMs como fármacos
antitumorais60 e principalmente relacionando a atividade do monastrol como potencial
fármaco (Russowsky et al., 2006) a avaliação da atividade antitumoral foi focado nos
derivados graxos do monastrol. Em artigo anterior34 foram avaliadas diferentes DHPMs
graxas sendo demonstrado no mesmo a relação do monastrol com a maior atividade
antiproliferativa, sendo o atual estudo focado nos hibridos DHPMs graxas 6-
substituidas análogos ao monastrol. Por esse motivo, foram avaliados 3 derivados
graxos do monastrol e 3 derivados graxos do oxo-monastrol, além do derivado graxo
hibrido DHPM 5-substituido que demonstrou maior potencial como fármaco antitumoral
sintetizado por Treptow e colaboradores34 e o próprio monastrol , usado nesse estudo
como controle positivo, visando avaliar o efeito da inserção da cadeia graxa na
atividade antitumoral.
62
As DHPMs tiveram sua citotoxicidade avaliadas frente à linhagem celular de
glioma de rato (C6) sendo esse estudo desenvolvido em parceria com o grupo de
pesquisa da professora Ana Paula Horn do Laboratório de Cultura Celular do Instituto
de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio Grande – FURG. As moléculas
foram avaliadas quanto à citotoxicidade (contagem celular), à viabilidade celular (MTT),
à necrose (marcação com iodeto de própidio) e a potência (IC50).
A
Tabela 5 resume as estruturas testadas mostrando o coeficiente de partição
(ClogP) dos compostos avaliados.
Tabela 5. Predição do coeficiente de partição (ClogP) dos compostos avaliados quanto
aos efeitos citostáticos/citotóxicos na linhagem celular de glioma de rato (C6).
Composto
Estrutura
Monastrol-ácidos graxos-6C-substituídas
LogPa
tPSA Å Crippen
23
Viswanadhan
26
Broto
17
Controle
positivo
graxo -
Hibrido oxo-
monastrol-
C16:0-5-
substituído
6,06
(±0,47)
5,90
(±0,49)
7,11
(±1,01) 87,66
Controle
positivo –
monastrol
1,57
(±0,47)
1,91
(±0,49)
1,23
(±0,88) 70,59
63
Híbrido
monastrol-
C16:0-6-
substituído
5,72
(±0,47)
5,56
(±0,49)
6,82
(±1,04) 87,66
Híbrido
monastrol-
C18:0-6-
substituído
5,47
(±0,47)
6,35
(±0,49)
7,73
(±1,06) 87,66
Híbrido
monastrol-
C18:1-6-
substituído
6,23
(±0,47)
6,09
(±0,49)
7,01
(±1,11) 87,66
Híbrido
monastrol-
C16:0-6-
substituído
7,15
(±0,47)
7,19
(±0,49)
6,82
(±1,09) 70,59
64
Híbrido
monastrol-
C18:0-6-
substituído
7,98
(±0,47)
7,98
(±0,49)
8,24
(±1,11) 70,59
Híbrido
monastrol-
C18:1-6-
substituído
7,66
(±0,47)
7,72
(±0,49)
8,53
(±1,16) 70,59
a: CLog P e tPSA calculados utilizando o software Chem Draw Ultra
® 12.0.2.1076
O teste de contagem celular realizado após o intervalo de 48 horas de
tratamento com as DHPMs em linhagem celular de glioma mostrou que todas as
moléculas testadas apresentam efeito antitumoral. As moléculas 4b, 8a e 8b
apresentaram melhores resultados, com redução no número de células viáveis desde a
menor concentração, sendo que as moléculas 8a e 8b, derivadas da tioureia e dos
ácidos palmítico (C16:0) e esteárico (C18:0), respectivamente, mostraram uma maior
redução, com diferença estatística de 0,001 quando comparadas ao grupo controle. As
figuras abaixo trazem a contagem celular na linhagem C6.
65
Figura 13. Contagem celular da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de
tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado com DMSO para os composto 24 (esquerda) e 2 (direita). ANOVA seguido de
pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao controle.
66
Figura 14. Contagem celular da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de
tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado com DMSO para os composto 4a (esquerda) e 8a (direita). ANOVA seguido de
pós-teste de Tukey, *** p <0.001 com relação ao controle.
67
Figura 15. Contagem celular da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de
tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado exclusivamente com DMSO para os composto 4b (esquerda) e 8b (direita).
ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao
controle.
68
Figura 16. Contagem celular da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de
tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado exclusivamente com DMSO para os composto 4c (esquerda) e 8c (direita).
ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao
controle.
O MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromídio], teste que estima
quantidade de células viáveis através do metabolismo mitocondrial, demonstrou que
todas moléculas testadas apresentam redução na viabilidade celular, confirmando a
hipótese de que as DHPMs sintetizadas seriam efetivas no tratamento antitumoral.
Neste teste, as moléculas 4a, 4b, 8a, 8b e 8c apresentaram resultados
significativos desde a menor concentração testada (5µM), sendo que destas 4b, 8a e
8b apresentaram diferença de 0,001, indo ao encontro dos resultados obtidos na
contagem celular.
69
A funcionalização da cadeia graxa demonstrou ser relevante para a
potencialização do efeito in vitro. Entre as cadeias derivadas do ácido palmítico e do
ácido esteárico não foi notada diferença, desde que mantidos dentro do mesmo
grupamento tio ou oxo. E a combinação da funcionalização da cadeia graxa somada a
presença de um grupo tio, segundo os dados obtidos neste estudo, potencializam o
efeito das DHPMs testadas. As figuras a seguir trazem o ensaio de MTT.
Figura 17. Ensaio de MTT da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado com DMSO para os composto 24 (esquerda) e 2 (direita). ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao controle.
Figura 18. Ensaio de MTT da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
70
tratado exclusivamente com DMSO para os composto 4a (esquerda) e 8a (direita). ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao
controle.
Figura 19. Ensaio de MTT da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado exclusivamente com DMSO para os composto 4b (esquerda) e 8b (direita). ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao
controle.
Figura 20. Ensaio de MTT da linhagem de glioma de rato (C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM e C sendo grupo controle
tratado exclusivamente com DMSO para os composto 4c (esquerda) e 8c (direita). ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, ** p <0.01 e *** p <0.001 com relação ao
controle.
71
O iodeto de propídeo foi marcado nas imagens em campo escuro nos
compostos de analisados comprovando que o mecanismo antitumoral das moléculas
testadas envolve necrose celular ou apoptose tardia, conforme demonstrado nas
imagens do ANEXO 2.
A avalição do IC50 (
72
Tabela 6) e do teste do MTT corrobora com os resultados obtidos até então, onde as
moléculas 8a e 8b são as mais potentes das moléculas testadas chegando a uma
inibição de 50% em concentrações de na concentração de 5 µM e 6 µM,
respectivamente. Além disso, podemos observar que todas as moléculas, com exceção
da 4c, apresentam valores de IC50 melhores que a molécula utilizada neste estudo
como controle positivo (monastrol), demostrando que a funcionalização com adição de
cadeia graxa é capaz de potencializar o efeito da molécula mesmo in vitro.
73
Tabela 6. Valores de IC50 para os compostos avaliados quanto aos efeitos
citostáticos/citotóxicos na linhagem celular de glioma de rato (C6)
Composto IC50 (µM) Composto IC50 (µM)
Oxo Tio
16,68
(14,47-19,23)
87,83
(58,34-132,2)
79,37
(49,76-126,6)
5,11
(4,13-6,32)
21,77
(18,65-25,41)
6,85
(6,18-7,60)
166,4
(78,40-353,00)
38,36
(25,87- 56,90)
74
O resultado apresentado pelo composto 4a foi semelhante ao resultado obtido
pelo monastrol em relação ao potencial de inibição, já o composto 4b foi superior ao
monastrol, evidenciando que o aumento da cadeia graxa nos compostos oxo- pode
influenciar no caráter inibitório. Porém o resultado exposto pelo composto 4c foi inferior
ao monastrol, possivelmente devido a presença da insaturação no carbono 9 que altera
a conformação da molécula no espaço modificando a ação desta in vitro. Em relação
ao controle positivo graxo 24 o comportamento do composto oxo- foi inferior ao controle
graxo, com exceção do composto 4b o qual apresentou equivalência da eficácia
inibitória.
Os compostos derivados da tioureia 8a, 8b e 8c quando comparados ao
monastrol (controle) apresentaram resultados superiores em relação a eficácia inibitória
comprovando assim o efeito da inserção da cadeia graxa nas estruturas análogos ao
monastrol. Entre os composto 8a e 8b não houve diferença em relação a eficácia
inibitória demonstrando o aumento da cadeia graxa não foi relevante nos compostos
análogos ao monastrol. Quando comparados com o controle positivo graxo Hibrido
monastrol-C16:0 5-substituído 24 ambos compostos 8a e 8b foram mais eficazes
apresentado o IC50 inferior a metade do valor apresentado pelo valor do 24,
demonstrado o alto potencial inibitória destas estruturas.
Outra informação relevante quanto ao IC50 foi a diferença nos resultados em
relação a comparação dos análogos do monastrol 8a, 8b e 8c e dos análogos ao oxo-
monastrol 4a, 4b e 4c. Os compostos híbridos da condensação com tioureia tiveram
resultados superiores de IC50 quando comparados aos compostos híbridos análogos
derivados da condensação com ureia, esse dado pode indicar que a presença do
enxofre facilita a ação antitumoral. Esse resultado foi condizente com o apresentado
por Russowsky e colaboradores,61 demonstrando a importância da condensação
utilizando tioureia na reação de Biginelli.
Ainda, a presença da instauração, seja nas moléculas derivadas do monastrol e
do oxo-monastrol, reduz a potência destes compostos. Isso possivelmente ocorre
75
devido a mudança conformacional gerada pela presença da instauração, e com isso
dificultando a interação da molécula com o sítio de ligação com a cinesina.
76
5. CONCLUSÃO
A síntese de novos híbridos DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas 3-10a-c a
partir de precursores graxos foi concluída com a obtenção de 24 novos compostos.
A síntese dos β-cetoésteres graxos foi realizada baseada na acilação de ácidos
graxos e posterior metanólise com obtenção de β-cetoésteres 13a-c funcionalizados na
posição ceto com diferentes cadeias graxas em rendimentos de 80-84%.
A síntese das oxo- e tio-DHPMs graxas 6-substituidas envolveu a condensação
multicomponente de β-cetoésteres graxos 11a-c, diferentes aldeídos aromáticos e
ureia ou tioureia sendo a reação multicomponente de Biginelli catalisada por ácido
sulfâmico, um catalisador verde com elevadas características ambientalmente
amigáveis. O rendimento da síntese das oxo-DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas foi
entre 60-85% e das tio- DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas graxas 6-substituidas foi
entre 60-81%, sendo todas as estruturas Monastrol-ácidos graxos-6C-substituídos
caracterizadas por espectro de RMN de1H e 13C.
Os resultados do ensaio com MTT mostram que todas as moléculas testadas
apresentaram ação antitumoral e que as moléculas com cadeias graxas saturadas
derivadas da tioureia induzem uma significativa queda na viabilidade celular desde a
menor concentração utilizada e que essa redução segue uma curva concentração-
resposta, qualificando as moléculas 8a e 8b como mais eficazes. Além disso, a
marcação com IP sugere que as DHPMs apresentaram mecanismo antitumoral
envolvendo necrose celular ou apoptose tardia. O teste de contagem celular demonstra
a ação das DHPMs na linhagem celular C6, provando sua ação já que todos os
compostos tiveram diminuição no número de células após o tratamento, sendo que as
moléculas 8a e 8b apresentaram melhores resultados (diferença siginificativa de 0,001
desde a menor concentração de tratamento). Dentro das moléculas avaliadas, os
resultados demonstrados pelo IC50 indicam como moléculas com maior possibilidade
farmacológico 8a e 8b derivadas das cadeias palmítica (C16:0) e esteárica (C18:0),
respectivamente devido a ambas serem as moléculas mais potentes. Todas as
diidropirimidinonas graxas 6-substiutídas com cadeias graxas demonstraram potencial
77
superior ao do monastrol (com exceção da molécula 4c) – porém apenas as moléculas
8a e 8b mostraram potencial inibitório superior a molécula 24 (diidropirimidinonas
graxas 5-substiutídas com cadeias graxas). Os resultados dos testes indicam que as
oxo-DHPM graxas 6-substituidas e as tio-DHPM graxas 6-substituidas testadas
apresentam atividade antitumoral in vitro em uma linhagem de tumor cerebral maligno,
e dentre estas os compostos 8a e 8b obtiveram resultados superiores ao monastrol
(controle positivo) e ao controle Hibrido monastrol-C16:0-5-substituído (controle positivo
graxo), sendo promissoras para futuros experimentos in vivo.
78
6. MATERIAIS E MÉTODOS
6.1. Materiais
Os reagentes e solventes utilizados nas etapas sintéticas foram obtidos
comercialmente e purificados, quando necessário, por destilação ou métodos
específicos. O ácido de Meldrum (SIGMA-ALDRICH), empregado na síntese dos β-
cetoésteres, foi purificado de acordo com o procedimento de Armarego e
Colaboradores 22. A piridina foi destilada de acordo com Perrin e Armarego 83. O DCC,
empregado como agente de acoplamento, foi triturado e seco sob vácuo a temperatura
ambiente, sendo que outras medidas de purificação como as descritas por Armarego e
Colaboradores 22 não foram necessárias. O diclorometano empregado como solvente
das reações de acilação foi desumidificado em duas etapas – desumidificação prévia
com sulfato magnésio e destilação com pentóxido de sódio 83. Os demais reagentes
empregados foram utilizados em seu grau comercial.
As reações foram monitoradas por CCD em sílica gel Merck 60GF245. Os
produtos obtidos foram purificados em coluna cromatográfica utilizando sílica gel
(ACROS 60-200 mesh).
As análises de ressonância magnética nuclear 1H e 13C foram realizadas nos
aparelhos Varian VNMRS operando a 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C
(INSTITUTO DE QUÍMICA - UFRGS), BRUKER DPX-400 operando a 400 MHz para 1H
e 100 MHz para 13C (DEPARTAMENTO DE QUÍMICA - UFSM) e Varian VNMRS
operando a 400 MHz para 1H e 100 MHz para 13C (CENTRAL ANALÍTICA DA ESCOLA
DE QUÍMICA E ALIMENTOS/FURG). Os deslocamentos químicos (δ) foram
registrados em ppm. Os espectros de RMN 1H tiveram seus dados expressos em
multiplicidade (s, simpleto, d, dupleto, t, tripleto e m, multipleto) e constante de
acoplamentos.
79
6.2. Síntese dos novos híbridos DHPMs-ácidos graxos-
6C- substituídas
Síntese dos β-cetoésteres graxos 13a-c:
Etapa 1 - Acilação do ácido de meldrum: Em um balão de fundo redondo de 25
mL foram adicionados o ácido graxo 12a-c (1 mmol), o DCC (14) (1,1 mmol) e o DMAP
(0,3 mmol) (15) dissolvidos em diclorometano seco (15 mL). A reação foi mantida sob
agitação constante e atmosfera de nitrogênio gasoso a temperatura ambiente durante
30 minutos. Após esse intervalo foi adicionado com o auxílio de um funil de adição o
ácido de Meldrum (13) (2 mmol) e a piridina (3,6 mmol) em diclorometano seco (10
mL). Após 24 horas a reação foi tratada usando extração líquido-líquido (duas lavagens
com 25 mL de solução de 10% de ácido clorídrico e uma lavagem com 25 mL de água
destilada) sendo a fase orgânica seca com sulfato de magnésio e o solvente evaporado
sobre pressão reduzida, com o bruto reacional da etapa de acilação do ácido de
Meldrum utilizado sem prévia purificação.
Etapa 2 - Metanólise do acido de Meldrum: O Meldrum acilado foi dissolvido em
metanol (25 mL) sendo a reação mantida por 24 horas sob refluxo de metanol. Após
esse intervalo o metanol foi removido por em rotaevaporador. Os β-cetoésteres (11a-c)
foram obtidos por separação em coluna cromatográfica (97: 3 hexano/éter).
Síntese das DHPMs-ácidos graxos-6C-substituídas 3-12a-c:
Em um balão de 25 mL de fundo redondo foram adicionados os β-cetoésteres
11a-c (1 mmol), diferentes aldeídos aromáticos 17-20 (1 mmol), ureia (21) ou tioureia
(22) (1,3 mmol) e ácido sulfâmico (60 mol%), utilizado como catalisador sendo o
conteúdo reacional dissolvido em metanol (5 mL). A reação foi mantida em refluxo
durante 24 horas, sendo monitorada em CCD (6:4 hexano:acetato de etila). Após esse
intervalo o metanol foi removido em rotaevaporador, sendo o bruto reacional purificado
por coluna cromatográfica (7:3 hexano:acetato).
80
Dados espectroscópicos dos compostos Monastrol-ácidos graxos-6C-
substituídas:
Figura 21. Composto 4a
metil 4-(3-hidroxifenil)-2-oxo-6-pentadecil-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-
carboxilato 4a: Fórmula molecular: C27H42N2O4; Massa molecular 458,63: g.mol-1;
Óleo; Rendimento: 78%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7,93 (br. s., 1H), 6,99 –
7,19 (m, 1H), 6,80 (br. s., 1H), 6,71 (d, J = 7.82 Hz, 1H), 6,75 (d, J = 7.83 Hz, 1H), 5,27
(br. s., 1H), 3,62 (br. s., 3H), 2,52 – 2,75 (m, 2H), 1,45 – 1,64 (m, 2H), 1,16 – 1,38 (m,
24H), 0,89 (t, J = 6.85 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm 166,0; 156,8; 154,1;
150,8; 144,9; 129,9; 118,0; 115,3; 113,3; 100,9; 55,1; 51,3; 50,6; 31,9; 29,7; 29,7; 29,6;
29,6; 29,4; 28,3; 22,7; 14,1.
Figura 22. Composto 4b
metil 6-heptadecil-4-(3-hidroxifenil)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-
carboxilato 4b: Fórmula molecular: C29H46N2O4; Massa molecular: 486,69 g.mol-1;
Óleo; Rendimento: 85%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,03 (br. s., 1H), 7,09 (t, J =
7.95 Hz, 1H), 6,83 (s, 1H), 6,75 (d, J = 7.82 Hz, 1H), 6,71 (d, J = 8,07 Hz, 1H), 6,49 (br.
81
s., 1H), 5,27 (d, J = 2.69 Hz, 1H), 3,63 (s, 3H), 2,49 – 2,71 (m, 2H), 1,44 – 1,61 (m, 2H),
1,19 – 1,35 (m, 24H), 0,90 (t, J = 7.10 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm
166,0; 156,7; 154,4; 150,7; 144,9; 129,9; 118,1; 115,4; 113,2; 100,9; 55,1; 51,3; 31,9;
29,8; 29,7; 29,7; 29,6; 29,4; 29,4; 28,4, 22,7, 14,1.
Figura 23. Composto 4c
(Z)-metil 6-(heptadec-8-en-1-il)-4-(3-hidroxifenil)-2-oxo-1,2,3,4-
tetrahidropirimidina-5-carboxilato 4c: Fórmula molecular: C29H44N2O4; Massa
molecular: 484,67 g.mol-1; Óleo; Rendimento: 68%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm
8,21 (br. s., 1H), 7,25 – 7,35 (m, 6H), 5,99 (br. s., 1H), 5,40 (d, J = 2,93 Hz, 1H), 5,31 –
5,39 (m, 2H), 3,63 (s, 3H), 2,66 – 2,78 (m, 2H), 1,98 – 2,09 (m, 4H), 1,57 – 1,67 (m,
2H), 1,24 – 1,42 (m, 21H), 0,90 (t, J = 6,80 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm
165,8; 153,5; 151,1; 143,7; 130,0; 129,8; 128,8; 127,9; 126,5; 100,7; 55,6; 51,1; 31,9;
31,9; 31,9; 29,8; 29,7; 29,5; 29,4; 29,4; 29,3; 29,3; 29,3; 29,2; 28,3; 27,3; 27,2; 22,7;
14,1.
Figura 24. Composto 8a
82
metil 4-(3-hidroxifenil)-6-pentadecil-2-tioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-
carboxilato 8a: Fórmula molecular: C27H42N2O3S; Massa molecular: 474,70 g.mol-1;
Óleo; Rendimento: 81%; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,14 (t, J = 7,83 Hz, 1H),
6,76 – 6,79 (m, 1H), 6,75 – 6,76 (m, 1H), 6,69 – 6,72 (m, 1H), 5,28 (s, 1H), 3,66 (s, 3H),
2,69 – 2,84 (m, 2H), 1,56 – 1,69 (m, 2H), 1,31 (s, 24H), 0,92 (t, J = 7.10 Hz, 3H). RMN
13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 175,2; 166,1; 157,4; 148,9; 144,6; 129,3; 117,4; 114,5;
113,1; 101,3; 54,8; 50,3; 31,7; 30,3; 29,4; 29,4; 29,3; 29,3; 29,3; 29,1; 29,1; 28,2; 22,3;
13,0.
Figura 25. Composto 8b
metil 6-heptadecil-4-(3-hidroxifenil)-2-tioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-
carboxilato 8b: Fórmula molecular: C29H46N2O3S; Massa molecular: 502,75 g.mol-1;
Óleo; Rendimento: 74%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7,81 (br. s., 1H), 7,34 (br.
s., 1H), 7,19 (t, J = 7,95 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 7,58 Hz, 1H), 6,78 (s, 1H), 5.36 (d, J =
3,42 Hz, 1H), 3,67 (s, 3H), 2,66 – 2,77 (m, 2H), 1,54 – 1,67 (m, 2H), 1,28 (s, 24H), 0,90
(t, J = 6,85 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm 174,8; 165,6; 156,3; 147,4;
143,8; 130,2; 118,7; 115,6; 113,6; 102,2, 55,8; 51,5; 31,9; 31,6; 29,7; 29,6; 29,6; 29,5;
29,5; 29,3; 29,3; 28,2; 22,7; 14,1.
83
Figura 26. Composto 8c
(Z)-metil 6-(heptadec-8-en-1-il)-4-(3-hidroxifenil)-2-tioxo-1,2,3, 4-
tetrahidropirimidina-5-carboxilato 8c: Fórmula molecular: C29H44N2O3S; Massa
molecular: 500,74 g.mol-1; Óleo; Rendimento: 60%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm
8,43 (s, 1H), 7,90 (br. s., 1H), 7,25 – 7,36 (m, 5H), 5,39 (d, J = 3,42 Hz, 1H), 5,34 – 5,39
(m, 2H), 3,64 (s, 3H), 2,76 – 2,85 (m, 1H), 2,62 – 2,74 (m, 1H), 1,96 – 2,11 (m, 4H),
1,56 – 1,67 (m, 2H), 1,22 – 1,44 (m, 20H), 0,90 (t, J = 6,80 Hz, 3H). RMN 13C (100
MHz, CDCl3) δ ppm 174,8; 165,6; 156,3; 147,4; 143,8; 130,2; 118,7; 115,6; 113,6;
102,2; 55,8; 51,5; 31,9; 31,6; 29,7; 29,6; 29,6; 29,5; 29,5; 29,3; 29,3; 28,2; 22,7; 14,1.
Dados espectroscópicos dos compostos DHPM-ácidos graxos-6C-
substituídas:
Figura 27. Composto 3a
metil 2-oxo-6-pentadecil-4-fenil-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-carboxilato 3a:
Fórmula molecular: C27H42N2O3; Massa molecular 442,63: g.mol-1; Sólido; P.F. 122-124
°C ; Rendimento: 83%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,20 – 8,41 (m, 1H), 7,22 –
7,36 (m, 5H), 6,07 – 6,24 (m, 1H), 5,40 (d, J = 2,93 Hz, 1H), 3,63 (s, 3H), 2,72 (t, J =
7.70 Hz, 2H), 1,55 – 1,68 (m, 2H), 1,24 – 1,37 (m, 24H), 0,90 (t, J = 6 Hz, 3H). RMN 13C
(100 MHz, CDCl3) δ ppm 171,2; 165,9; 151,3; 143,8, 130,0; 128,8; 127,9; 126,5; 100,6;
84
60,4; 55,6; 51,1; 31,9; 31,9; 29,7; 29,7; 29,7; 29,6; 29,5; 29,4; 28,3; 22,7; 21,0; 14,2;
14,1.
Figura 28. Composto 3b
metil 6-heptadecil-2-oxo-4-fenil-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-carboxilato 3b:
Fórmula molecular: C29H46N2O3; Massa molecular 470,90: g.mol-1; Sólido; P.F. 129-131
°C; Rendimento: 74%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,00 (s, 1H), 7,23 – 7,29 (m,
5H), 5,92 (s, 1H), 5,37 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 3,60 (s, 3H), 2,66 – 2,74 (m, 2H), 1,56 – 1,63
(m, 2H), 1,25 – 1,36 (m, 30H), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ
ppm 165,7 153,5; 151,0 143,8; 128,7; 128;8; 126,4; 100,8; 55,7; 50,93; 31,82, 22,65;
29,66; 29,61; 29,52; 29,41; 29,32; 29,30; 28,20; 22,69; 13,99.
Figura 29. Composto 3c
(Z)-metil 6-(heptadec-8-en-1-il)-2-oxo-4-fenil-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-
carboxilato 3c: Fórmula molecular: C29H44N2O3; Massa molecular 468,67: g.mol-1;
Óleo; Rendimento: 67%. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,62 (br. s., 1H), 7,20 – 7,38
(m, 5H), 6,42 (br. s., 1H), 5,30 – 5,45 (m, 3H), 3,63 (s, 3H), 2,72 (t, J = 7,70 Hz, 2H),
1,92 – 2,13 (m, 4H), 1, 55 - 1.67 (m, 2H), 1.21 - 1.43 (m, 20H), 0.91 (t, J = 6.00 Hz, 3H).
85
RMN 13C (100 MHz, CDCl3) 165,9; 154,1; 151,4; 143,8; 130,0; 129,8; 128,7; 127,8;
126,5; 100,5; 55,4; 51,1; 31,9; 31,8; 29,8; 29,8; 29,6; 29,4; 29,4; 29,3; 29,3; 29,3; 28,3;
27,3; 27,2; 27,2; 25,7; 22,7; 14,1.
Figura 30. Composto 5a
metil 4-(4-hidroxifenil)-2-oxo-6-pentadecil-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-
carboxilato 5a: Fórmula molecular: C27H42N2O4; Massa molecular: 458,63 g.mol-1;
Sólido; P.F. 131-134 °C ; Rendimento: 81%; Rendimento: 74%; Rendimento: 67%.
RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7,56 - 7.85 (m, 1H), 6,99 (d, J = 8,31 Hz, 2H), 6,50 –
6,56 (m, J = 8,56 Hz, 2H), 6,43 (br. s., 1H), 5,29 (d, J = 2,69 Hz, 1H), 3,64 (s, 3H), 2,82
(d, J = 13,20 Hz, 1H), 2,62 (s, 1H), 1,54 – 1,65 (m, 2H), 1,23 – 1,42 (m, 24H), 0,.90 (t, J
= 6,80 Hz, 3H).
Figura 31. Composto 5c
(Z)-metil 6-(heptadec-8-en-1-il)-4-(4-hidrofenil)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-
5-carboxilato 3c: Fórmula molecular: C29H44N2O4; Massa molecular 484,67: g.mol-1;
Óleo; Rendimento: 71%. RMN 1H (400 MHz, C2D6OS) δ ppm 9,09 (s, 1H), 7,60 (br. s.,
86
1H), 7,02 (d, J = 8,00 Hz, 2H), 6,68 (d, J = 8,00 Hz, 2H), 5,34 (t, J = 5,14 Hz, 2H), 5,04
(d, J = 3,18 Hz, 1H), 3,52 (s, 3H), 2,54 – 2,70 (m, 2H), 1,90 – 2,07 (m, 4H), 1,52 (br. s.,
2H), 1,25 (s, 12H), 1,28 (s, 8H), 0,85 (t, J = 6,80 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, C2D6OS)
δ ppm 166,0; 157,0; 152,9; 152,9; 135,7; 130,1; 127,8; 115,5; 99,5; 53,7; 51,1; 31,8;
31,0; 29,6; 29,5; 29,3; 29,2; 29,1; 29,0; 28,6; 27,1; 27,1; 22,6; 14,4.
Figura 32. Composto 6a
metil 4-(3-nitrofenil)-2-oxo-6-pentadecil-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-carboxilato
6a: Fórmula molecular: C27H41N3O5; Massa molecular: 487,63 g.mol-1; Sólido; P.F. 125-
128 °C ; Rendimento: 67%. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 8,11 – 8,23 (m, 2H), 7,67 (d, J
= 7,82 Hz, 1H), 7,44 – 7,57 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 5,97 (br. s., 1H), 5,53 (d, J = 3,18 Hz,
1H), 3,66 (s, 3H), 2,76 (t, J = 6,85 Hz, 2H), 1,64 (br. s., 4H), 1,20 – 1,42 (m, 22H), 0,90
(t, J = 6,72 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm 165,3, 152,6, 151,9, 148,5,
145,7, 132,6, 129,9, 123,0, 121,7, 100,0, 55,2, 51,4, 32,1, 31,9, 29,7, 29,7, 29,6, 29,5,
29,4, 29,4, 29,3, 28,2, 22,7, 14,1.
Figura 33. Composto 6b
metil 6-heptadecil-4-(3-nitrofenil)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-carboxilato
6b: Fórmula molecular: C29H45N3O5; Massa molecular: 515,68 g.mol-1; P.F. 130-134 °C;
87
Rendimento: 61%. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 8,10 – 8,24 (m, 2H), 7,68 (d, J = 8,31 Hz,
1H), 7,45 – 7,59 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 5,96 (br. s., 1H), 5,53 (d, J = 3,18 Hz, 1H), 3,66
(s, 3H), 2,77 (t, J = 6,85 Hz, 2H), 1,64 (br. s., 4H), 1,19 – 1,36 (m, 24H), 0,90 (t, J = 6,80
Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm 189,6; 165,3; 152,6; 151,8; 148,6; 145,7;
134,6; 132,6; 129,9; 128,6; 124,5; 123,0; 121,7; 100,0; 55,2; 51,4; 32,1; 31,9; 29,7;
29,7; 29,6; 29,5; 29,4; 29,4; 29,3; 28,2; 22,7; 14,1.
Figura 34. Composto 6c
(Z)-metil 6-(heptadec-8-en-1-il)-4-(3-nitrofenil)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-
carboxilato 6c: Fórmula molecular: C29H43N3O5; Massa molecular: 513,67 g.mol-1;
Óleo; Rendimento: 60%; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 8,12 – 8,27 (m, 2H), 7,74
(d, J = 7,83 Hz, 1H), 7,60 (t, J = 7,95 Hz, 1H), 5,48 (d, J = 2,90 Hz, 1H), 5,28 – 5,42 (m,
2H), 3,64 (s, 3H), 2,66 – 2,91 (m, 2H), 2,05 – 2,04 (m, 4H), 1,59 – 1,75 (m, 2H), 1,28 –
1,45 (m, 20H), 0,90 (t, J = 6,72 Hz, 3H).
Figura 35. Composto 7a
metil 6-pentadecil-4-fenil-2-tioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-carboxilato 7a:
Fórmula molecular: C27H42N2O2S; Massa molecular 458,70: g.mol-1; Sólido; P.F. 107-
110 °C; Rendimento: 78%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,58 – 8,67 (m, 1H), 8,11
88
(br. s., 1H), 7,22 – 7,38 (m, 5H), 5,39 (d, J = 3,42 Hz, 1H), 3,63 (s, 3H), 2,79 (s, 1H),
2.71 (s, 1H), 1,56 – 1,67 (m, 2H), 1,22 – 1,42 (m, 24H), 0,90 (t, J = 6,00 Hz, 3H). RMN
13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm 174,5, 165,5, 148,0, 142,4, 128,9, 128,3, 126,7, 102,0,
55,8, 51,4, 31,9, 31,3, 29,8, 29,7, 29,7, 29,7, 29,7, 29,7, 29,6, 29,5, 29,4, 28,6, 28,4,
26,4, 25,3, 22,7, 14,1.
Figura 36. Composto 7b
metil 6-heptadecil-4-fenil-2-tioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5- carboxilato 7b:
Fórmula molecular: C29H46N2O2S; Massa molecular 486,75: g.mol-1; Sólido; P.F. 116-
118 °C; Rendimento:78%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7,29 – 7,38 (m, 5H), 5,41
(d, J = 3,18 Hz, 1H), 3,66 (s, 3H), 2,74 – 2,85 (m, 1H), 2,64 – 2,74 (m, 1H), 1,63 (s, 2H),
1,24 – 1,35 (m, 26H), 0,90 (t, J = 6,80 Hz, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm
175,0, 165,4, 147,2, 142,3, 129,0, 128,4, 126,7, 102,2, 56,2, 51,4, 31,9, 31,6, 29,8,
29,7, 29,7, 29.7, 29,6, 29,5, 29,5, 29,4, 29,3, 28,2, 22,7, 14.1.
Figura 37. Composto 9a
metil 4-(4-hidroxefenil)-6-pentadecil-2-tioxo-1,2,3,4- tetrahidropirimidina-5-
carboxilato 9a: Fórmula molecular: C27H42N2O3S; Massa molecular 474,70: g.mol-1;
89
Sólido; P.F. 122-124 °C; Rendimento: 77%; RMN 1H (400 MHz, C2D6OS) d 7,77 (d, J
= 8,56 Hz, 2H), 6,94 (d, J = 8,56 Hz, 2H), 5,08 (d, J = 3,42 Hz, 1H), 3,54 (s, 3H), 2,69
(d, J = 7,34 Hz, 2H), 1,42 – 1,58 (m, 2H), 1,24 (br. s., 24H), 0,85 (t, J = 6,60 Hz, 3H).
RMN 13C (100 MHz, C2D6OS) δ ppm 191,3; 174,6; 165,8; 163,8; 157,4; 149,7; 134,4;
132,5; 128,9; 128,0; 116,3; 115,6; 100,8; 53,9; 51,4; 31,8; 30,3; 29,6; 29,5; 29,5; 29,5;
29,3; 29,2; 29,2; 28,8; 22,6; 14,4.
Figura 38. Composto 10a
metil 4-(3-nitrofenil)-6-pentadecil-2-tioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-
carboxilato 10a: Fórmula molecular: C27H41N3O4S; Massa molecular 503,70: g.mol-1;
Sólido; P.F. 115-118 °C; Rendimento: 77%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,74 (d,
J = 1,47 Hz, 1H), 8,50 – 8,53 (m, 1H), 8,25 – 8,27 (m, 1H), 7,79 (t, J = 7,83 Hz, 1H),
5,54 (d, J = 2,93 Hz, 1H), 3,63 – 3,74 (m, 3H), 2,65 – 2,90 (m, 2H), 1,64 (br. s., 2H),
1,21 – 1,34 (m, 22H), 0,90 (t, 6.72 Hz, 3H).
Figura 39. Composto 10 b
metil 6-heptadecil-4-(3-nitrofenil)-2-tioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-
carboxilato 10b: Fórmula molecular: C29H45N3O4S; Massa molecular: 531,75 g.mol-1;
90
Sólido; P.F. 126-129 °C;; Rendimento: 64%; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,19 –
8,17 (m, 2H), 7,53 - 7,66 (m, 2H), 5,54 (d, J = 2,69 Hz, 1H), 3,59 – 3,76 (m, 2H), 2,66 –
2,81 (m, 1H), 2,55 (s, 1H), 1,58 – 1,69 (m, 2H), 1,28 (s, 28H), 0,90 (t, J = 6,72 Hz, 3H).
Figura 40. Composto 10c
(Z)-metil 6-(heptadec-8-en-1-il)-4-(3-nitrofenil)-2-tioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-
5- carboxilato 10c: Fórmula molecular: C29H43N3O4S; Massa molecular: 529,73 g.mol-
1; Óleo; Rendimento: 63%; RMN 1H (400 MHz, C2D6OS) δ ppm 9,78 (d, J = 2,20 Hz,
1H), 8,69 – 8,70 (m, 1H), 8,54 - (m, 1H), 8,35 - 8,33 (m, 1H), 8,17 – 8,14 (m, 1H), 5,23
– 5,39 (m, 3H), 3,57 (s, 3H), 2,64 – 2,83 (m, 2H), 1,88 – 2,05 (m, 4H), 1,53 (d, J = 6,85
Hz, 2H), 1,14 – 1,37 (m, 20H), 0,76 – 0,89 (t, J= 6,9 Hz, 3H).
6.3. Avaliação da atividade antitumoral:
Modelo experimental e cultura de células
Os experimentos foram realizados com uma linhagem celular de glioma derivada
de rato (C6) obtidas da ATCC (American Type Culture Collection). A linhagem foi
cultivada no meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), suplementado com
10% de soro fetal bovino (SFB) e os antibióticos penicilina e estreptomicina (1%) e
fungizona (1%). As células foram mantidas por no máximo 30 passagens em
incubadora com 5% de CO2 e temperatura de 37 ºC.
91
Tratamento e grupos experimentais
Para a escolha das concentrações a serem analisadas nos experimentos, as
DHPMs foram testadas em diferentes concentrações sendo escolhidas as
concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM. As concentrações foram escolhidas a partir dos
resultados de viabilidade celular, utilizando-se o marcador iodeto de propídeo para
avaliação. Os grupos experimentais do trabalho foram divididos em: 1) Controle veículo
(tratado com DMSO) 2) DHPMs (tratadas com as DHPMs nas concetrações indicadas).
Foram realizados experimentos em duplicatas totalizando n=4 poços.
Preparo das placas para os ensaios
Os ensaios de viabilidade e citotoxicidade foram realizados em placas de 96
poços. As células foram semeadas em meio DMEM suplementado com 10% de
solução de soro fetal bovino (SFB) em uma concentração de 5x103 células/poço..
Todos os tratamentos foram iniciados 24h após o preparo das placas e as análises dos
resultados foram acompanhadas em 48h.
Ensaio de viabilidade celular
O ensaio de viabilidade celular via MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazolio bromídio) tem por objetivo estimar a viabilidade através do
metabolismo celular, particularmente o mitocondrial. O método consiste na absorção do
sal de MTT pelas células, sendo reduzido no interior da mitocôndria a um produto
chamado formazan (sendo acumulado dentro da célula na cadeia respiratória das
mitocôndrias). A reação de redução só ocorre em células metabolicamente intactas,
com isso, o número de células viáveis é proporcional à produção de formazan 84. Após
48h de tratamento com as DHPMs, para estimativa da viabilidade celular, foram
adicionados 50 µL da solução de MTT (solução estoque de 5 mg/ml). As células foram
incubadas por 2h a 37°C sendo após esse intervalo removido o meio dos poços,
adicionando-se sobre as células 150µL de DMSO. A quantificação foi realizada por
espectrofotometria em leitor ELISA a 490nm e os resultados foram expressos em
porcentagem.
92
Marcação com iodeto de propídeo (IP)
O método utilizando-se de marcação com iodeto de propídeo foi realizado com o
objetivo de avaliar a permeabilidade das membranas celulares e a exposição do DNA,
parâmetros que indicam morte celular principalmente por necrose das células 85,
sugerindo citotoxicidade. Após 48h de tratamento, as células foram incubadas durante
1h a 37°C com 1 µL da solução de IP (solução estoque de 1mM). No final da
incubação, a fluorescência foi excitada por um microscópio invertido (Olympus IX71,
Tokyo, Japão) e as imagens de fluorescência e campo claro foram capturadas por uma
câmera acoplada ao microscópio.
Contagem celular
No final de 48h de tratamento foi realizada a contagem de células possibilitando
a estimava do número de células viáveis por poço. Foram retiradas alíquotas de 100 µL
de cada poço para contagem em câmara de Neubauer, realizada no microscópio
estereoscópio.
Cálculo da concentração inibitória 50% (IC50)
Os dados foram plotados no software GraphPad Prism® Prism 5 for Windows
Version 5.03 para análise. A IC50 foi determinada a partir de uma regressão linear,
onde foi relacionado o percentual de inibição como uma função do logaritmo das
concentrações testadas, admitindo-se um intervalo de confiança de 99% (p < 0,01),
para a reta obtida.
Análises Estatísticas
Os dados estatísticos foram expressos como média ± desvio padrão e foram
submetidos a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida de pós-teste de Tukey-
Kramer para múltiplas comparações. Diferenças entre as médias foram avaliadas como
significativas quando p<0,05.
93
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ANEXO 1. Espectro dos compostos Monastrol-ácidos
graxos-6C-substituídos e DHPM-ácidos graxos-6C-
substituídas
Figura 1. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-
substituído 4a ............................................................................................................... 3
Figura 2. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-
substituído 4a ............................................................................................................... 4
Figura 3. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-
substituído 4b ............................................................................................................... 5
Figura 4. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-
substituído 4b ............................................................................................................... 6
Figura 5. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-
substituído 4c ............................................................................................................... 7
Figura 6. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-
substituído 4c ............................................................................................................... 8
Figura 7. Espectro de RMN 1H (CD3OD, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-
substituído 8a ............................................................................................................... 9
Figura 8. Espectro de RMN 1H (CD3OD, 100 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-
substituído 8a ............................................................................................................. 10
Figura 9. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-
substituído 8b ............................................................................................................. 11
Figura 10. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-
substituído 8b ............................................................................................................. 12
Figura 11. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-
substituído 8c ............................................................................................................. 13
Figura 12. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-
substituído 8c ............................................................................................................. 14
Figura 13. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 3a ............................................................................................................. 15
Figura 14. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 3a ............................................................................................................. 16
Figura 15. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 3b ............................................................................................................. 17
Figura 16. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 3b ............................................................................................................. 18
Figura 17. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 3c ............................................................................................................. 19
Figura 18. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 3c ............................................................................................................. 20
Figura 19. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 5a ............................................................................................................. 21
Figura 20. Espectro de RMN 1H (C2D6OS, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 5c ............................................................................................................. 22
Figura 21. Espectro de RMN 13C (C2D6OS, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 5c ............................................................................................................. 23
Figura 22. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 6a ............................................................................................................. 24
Figura 23. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 6a ............................................................................................................. 25
Figura 24. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 6b ............................................................................................................. 26
Figura 25. Espectro de RMN 13H (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 6b ............................................................................................................. 27
Figura 26. Espectro de RMN 1H (CD3OD, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 6c ............................................................................................................. 28
Figura 27. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 7a ............................................................................................................. 29
Figura 28. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 7a ............................................................................................................. 30
Figura 29. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 7b ............................................................................................................. 31
Figura 30. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 7b ............................................................................................................. 32
Figura 31. Espectro de RMN 1H (C2D6OS, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 9a ............................................................................................................. 33
Figura 32. Espectro de RMN 13C (C2D6OS, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 9a ............................................................................................................. 34
Figura 33. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 10a ........................................................................................................... 35
Figura 34. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 10b ........................................................................................................... 36
Figura 35. Espectro de RMN 1H (C2D6OS, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-
substituída 10c ........................................................................................................... 37
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
0
24.3
1
1.9
0
1.9
1
2.9
1
0.9
5
1.9
7
1.0
3
0.9
5
0.8
47.9
3
7.1
17.0
97.0
76.8
06.7
66.7
46.7
26.7
0
5.2
7
3.6
2
2.7
02.6
92.6
82.6
72.6
22.6
0
1.5
7 1.5
5
1.5
2
1.3
3 1.3
21.3
01.2
71.2
50.9
10.8
90.8
8
Figura 1. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 4a
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
166.0
1 156.7
8154.0
9150.7
9
144.9
4
129.8
9
117.9
8 115.3
0113.2
9
100.8
8
55.1
1
51.2
650.6
4
31.9
329.7
329.6
829.3
828.2
8
22.6
9
14.1
1
Figura 2. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 4a
9 8 7 6 5 4 3 2 1
2.7
4
24.4
9
1.5
7
1.5
7
2.6
3
0.8
5
0.7
4
1.7
3
0.8
4
0.8
7
0.7
08.0
3
7.1
1 7.0
97.0
7 6.8
36.7
66.7
46.7
26.4
9 5.2
75.2
6
3.6
3
2.7
02.6
52.5
7
1.5
41.5
1 1.3
21.2
81.2
20.9
20.9
00.8
9
Figura 3. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 4b
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
165.9
7
156.7
2154.4
1150.7
4
144.9
4
129.8
9
118.1
3115.4
0113.1
7
100.9
3
55.1
1
51.2
8
31.9
529.7
529.6
928.4
2
22.7
0
14.1
3
Figura 4. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 4b
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
0
20.7
1
1.9
9
3.9
7
2.0
1
2.9
9
1.8
6
1.1
7
0.9
5
5.4
9
0.9
38.2
1
7.3
37.3
3 7.3
27.3
17.2
87.2
87.2
77.2
77.2
6 5.9
9
5.4
05.4
05.3
75.3
65.3
5
3.6
3
2.7
52.7
42.7
32.7
22.7
1
2.0
62.0
52.0
42.0
32.0
21.6
41.3
81.3
71.3
21.2
91.2
81.2
60.9
20.9
00.8
9
Figura 5. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 4c
180 160 140 120 100 80 60 40 20
165.8
2
153.5
2151.0
9
143.7
4
130.0
0129.7
9128.7
8126.5
0
100.6
6 55.6
4
51.1
1
31.9
229.5
429.2
227.2
222.7
0
14.1
2
Figura 6. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 4c
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
2
24.0
6
2.0
8
2.0
3
3.0
2
0.9
9
0.9
7
0.9
5
1.0
7
1.0
1
7.1
6 7.1
47.1
26.7
76.7
76.7
66.7
66.7
56.7
2
5.2
8
3.6
6
2.8
12.7
92.7
72.7
52.7
32.7
21.6
71.6
51.6
31.6
1
1.3
1
0.9
30.9
20.9
0
Figura 7. Espectro de RMN 1H (CD3OD, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 8a
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
175.1
6
166.1
2
157.4
3
148.9
5
144.6
1
129.2
9
117.3
9114.5
5113.1
2
101.3
3
54.8
3
50.3
0
31.6
629.3
729.3
429.0
528.2
222.3
1
13.0
2
Figura 8. Espectro de RMN 1H (CD3OD, 100 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 8a
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.7
5
32.5
9
2.6
5
2.0
0
3.2
5
1.0
8
0.5
3
1.6
0
1.1
3
1.0
9
1.0
1
0.9
37.8
1
7.3
4
7.1
97.1
76.8
4 6.7
86.7
76.7
6
5.3
65.3
5
3.6
7
2.7
42.7
22.7
12.7
02.7
02.6
9
1.6
31.6
21.5
9
1.5
5
1.2
8
0.9
20.9
00.8
8
Figura 9. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 8b
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
174.7
9
165.5
6
156.2
9
147.3
8143.8
1 130.2
0
118.6
9115.6
2113.6
3
102.2
1
77.2
0
55.8
0 51.4
9
31.9
129.7
029.6
529.3
428.1
5 22.6
7 14.0
6
Figura 10. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 8b
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
0
20.1
0
1.9
8
3.8
7
0.9
6
1.0
5
2.9
3
1.7
4
1.0
6
5.0
4
0.9
3
0.9
28.4
3
7.9
0
7.3
37.3
27.3
1 7.2
97.2
87.2
87.2
77.2
6
5.4
05.3
95.3
75.3
75.3
65.3
5
3.6
4
2.8
22.8
12.7
92.7
7
2.7
02.6
82.0
62.0
42.0
21.6
31.3
61.3
41.3
21.2
9
0.9
20.9
00.8
8
Figura 11. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 8c
180 160 140 120 100 80 60 40 20
174.5
7
165.4
6
147.7
6
142.3
7
130.0
8130.0
0
128.9
2126.6
9
102.1
1
55.9
2
51.4
0
31.9
229.7
929.5
429.3
527.2
5
22.7
0
14.1
3
Figura 12. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 400 MHz) do Monastrol-ácido graxo-6C-substituído 8c
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
0
25.0
9
2.0
0
1.9
4
2.9
8
0.9
8
0.9
0
5.1
9
0.9
6
8.3
78.3
28.3
18.1
0
7.3
27.3
27.3
17.2
97.2
87.2
7
6.1
96.1
76.1
16.0
35.9
8
5.4
05.4
0
3.6
3
2.7
4 2.7
22.7
0
1.6
41.6
2 1.3
31.3
01.2
81.2
71.2
60.9
20.9
00.8
9
Figura 13. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 3a
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
171.1
8 165.8
6
151.2
8 143.7
8
130.0
0128.7
6126.5
0
100.5
9
60.4
1
55.5
6
51.1
0
31.9
429.7
329.3
828.3
0
22.7
021.0
4
14.2
014.1
3
Figura 14. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 3a
Figura 15. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 3b
Figura 16. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 3b
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
3.0
0
20.3
7
1.9
8
4.0
6
2.0
4
2.9
4
3.0
1
0.9
4
5.0
7
0.9
58.6
2
7.3
27.3
17.2
97.2
87.2
77.2
6
6.4
2
5.3
9 5.3
95.3
75.3
65.3
5
3.6
3
2.7
32.7
22.7
0
2.0
62.0
5 2.0
32.0
21.6
41.6
2
1.5
81.3
71.3
31.3
0
0.9
30.9
10.8
9
0.0
3
Figura 17. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 3c
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
165.8
8
154.0
8151.4
3
143.8
2
130.2
4130.1
2129.9
7129.8
2128.7
3126.4
7
100.5
2
55.4
3
51.0
7
31.9
329.8
129.5
6 29.3
627.2
625.6
622.7
0
14.1
414.0
9
Figura 18. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 3c
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
0
23.8
8
1.8
4
0.9
2
0.9
1
2.8
0
0.9
3
0.9
3
1.9
1
1.9
0
0.7
3
7.7
77.7
37.6
8
7.0
06.9
8
6.5
46.5
26.4
36.3
7
5.2
95.2
9
3.6
4
2.8
42.8
1
2.6
2
1.6
31.6
1 1.3
21.2
8
0.9
20.9
00.8
9
Figura 19. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 5a
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
0
19.5
7
1.8
4
3.7
1
1.7
9
2.6
6
0.8
8
1.9
2
1.9
1
1.9
1
0.8
8
0.8
69.0
9
7.6
0
7.0
3 7.0
1
6.7
06.6
96.6
76.6
6
5.3
55.3
45.3
25.0
55.0
4
3.5
2
2.6
5 2.6
42.6
32.6
22.6
1
2.0
01.9
91.9
7
1.5
21.2
81.2
5
0.8
70.8
60.8
4
Figura 20. Espectro de RMN 1H (C2D6OS, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 5c
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
166.0
4
157.0
4152.9
5 152.8
8 135.7
5 130.1
0127.7
6
115.4
8
99.4
8
53.7
251.1
3
31.7
629.5
829.1
627.0
6
22.5
7
14.4
0
Figura 21. Espectro de RMN 13C (C2D6OS, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 5c
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
0
23.2
1
4.1
8
1.7
5
2.6
4
0.8
8
0.7
9
0.9
4
1.7
2
0.8
8
1.6
78.1
9
7.6
67.5
4 7.5
27.5
07.2
8
5.9
7
5.5
35.5
3
3.6
6
2.7
82.7
62.7
5
1.6
4
1.3
21.2
8
0.9
20.9
00.8
8
0.0
2
Figura 22. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 6a
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
165.3
3
152.6
5151.8
5148.5
4145.6
6
132.6
2129.8
9
123.0
2121.7
1
99.9
6
77.2
1 55.1
7
51.3
7
32.0
7 31.9
229.7
0
29.3
528.1
9
22.6
8
14.0
9
Figura 23. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 6a
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
0
25.3
7
4.0
4
1.5
7
2.5
1
0.8
1
0.7
7
1.0
4
1.6
3
0.8
2
1.6
2
8.1
98.1
78.1
5
7.6
67.5
57.5
37.2
8
5.9
6
5.5
45.5
3
3.6
6
2.7
82.7
72.7
5 1.6
4
1.3
21.2
8
0.9
20.9
00.8
9
0.0
2
Figura 24. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 6b
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
189.6
5
165.3
3
152.6
3151.8
4148.5
5145.6
6
134.5
5132.6
1129.8
9128.5
8124.5
2123.0
3121.7
1
99.9
6
55.1
8
51.3
7
32.0
831.9
329.7
029.3
528.1
9
22.6
8
14.0
9
Figura 25. Espectro de RMN 13H (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 6b
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
0
25.5
3
2.4
8
4.8
3
2.3
8
3.5
7
2.0
1
0.9
8
1.0
4
1.0
7
1.7
38.2
08.1
77.7
57.7
3 7.6
07.5
8
5.4
85.3
55.3
4
3.7
13.6
42.8
62.8
52.8
4 2.8
32.8
12.7
62.7
42.7
32.0
52.0
41.6
8 1.6
61.6
41.3
51.3
0
0.9
20.9
00.8
9
Figura 26. Espectro de RMN 1H (CD3OD, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 6c
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
0
24.1
9
2.0
3
1.7
8
2.7
7
0.8
9
4.6
7
0.8
7
0.8
8
8.6
48.6
38.6
3
8.1
1
7.3
37.3
17.3
07.2
97.2
7 7.2
77.2
6
5.4
05.3
9
3.6
3
2.7
92.7
1
1.6
31.6
1
1.3
4 1.3
21.2
8
0.9
10.9
00.8
8
Figura 27. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 7a
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
174.4
8
165.5
0
147.9
6
142.4
0
128.8
9 126.7
1
102.0
4
83.0
7 55.8
2
51.3
7
33.4
531.9
4
29.3
828.4
126.3
9
22.7
0
14.1
4
Figura 28. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 7a
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
0
27.1
4
2.0
0
1.7
4
2.7
3
0.8
2
5.9
1
0.7
37.3
67.3
47.3
1 7.3
17.2
97.2
8
5.4
25.4
1
3.6
6
2.8
22.7
62.7
02.6
5
1.6
31.3
41.3
31.2
8
0.9
20.9
00.8
9
0.0
2
Figura 29. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 7b
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
174.9
7
165.4
0
147.2
5
142.3
3
129.0
0 126.6
7
102.2
4
56.2
1
51.4
3
31.9
429.7
329.3
829.3
3
22.7
0
14.1
3
0.0
1
Figura 30. Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 7b
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
0
24.2
9
1.9
7
1.7
9
2.8
9
0.9
0
1.7
2
1.6
47.7
87.7
5
6.9
56.9
3
5.0
85.0
7
3.5
4
2.7
02.6
8
1.5
2
1.2
4
0.8
70.8
50.8
4
Figura 31. Espectro de RMN 1H (C2D6OS, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 9a
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
191.3
3
174.6
4
165.8
4163.8
0
157.4
1
149.7
1
134.4
1132.5
4128.9
2 128.0
0
116.3
0115.6
5
100.8
4
53.8
551.4
2
31.8
029.5
629.5
228.7
6
22.5
9
14.4
0
Figura 32. Espectro de RMN 13C (C2D6OS, 100 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 9a
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
0
22.5
8
2.1
6
1.7
8
2.7
9
0.8
8
0.8
4
0.7
8
0.6
7
0.6
6
8.7
58.7
48.5
38.5
28.5
18.5
18.2
78.2
78.2
58.2
57.8
17.7
97.7
7
5.5
55.5
4
3.6
93.6
8
2.8
02.7
82.7
5
1.6
4
1.3
91.3
01.2
81.2
5
0.9
00.8
90.8
80.8
8
0.0
2
Figura 33. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 10a
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
1
28.1
7
2.6
7
0.5
2
1.3
3
1.9
7
0.5
6
0.3
9
1.7
6
0.4
9
1.1
68.1
9 8.1
7
7.9
6
7.6
47.5
77.5
5 7.2
9
5.5
45.5
4
3.6
93.6
7
2.8
42.8
32.7
82.7
42.6
92.5
5
1.6
51.6
3
1.2
8
0.9
20.9
00.8
8
0.0
2
Figura 34. Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 10b
9 8 7 6 5 4 3 2 1
3.0
0
19.7
2
1.9
2
3.7
7
1.9
4
2.8
2
2.8
8
0.9
9
0.5
90.5
8
0.5
7
0.8
79.7
89.7
8
8.7
08.7
08.6
98.5
28.5
28.3
58.3
38.1
68.1
58.1
4
5.5
55.3
45.3
35.3
15.3
0
3.5
7
2.7
6 2.7
42.7
22.7
0
1.9
91.9
81.9
71.5
41.5
21.2
8
1.2
21.1
90.8
5
0.8
30.8
1
Figura 35. Espectro de RMN 1H (C2D6OS, 400 MHz) da DHPM-ácido graxo-6C-substituída 10c
ANEXO 2. Teste de marcação com iodeto de propídeo
na linhagem celular de glioma de rato (C6)
Figura 1. Marcação com iodeto de propídeo da linhagem celular de glioma de rato
(C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM das
DHPMs e C sendo grupo controle (tratado exclusivamente com DMEN) para os
composto 24 (esquerda) e 2 (direita). Fotos em campo claro à esquerda e
fluorescência à direita. .................................................................................................. 2
Figura 2. Marcação com iodeto de propídeo da linhagem celular de glioma de rato
(C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM das
DHPMs e C sendo grupo controle (tratado exclusivamente com DMEN) para os
composto 4a (esquerda) e 8a (direita). Fotos em campo claro à esquerda e
fluorescência à direita. .................................................................................................. 3
Figura 3. Marcação com iodeto de propídeo da linhagem celular de glioma de rato
(C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM das
DHPMs e C sendo grupo controle (tratado exclusivamente com DMEN) para os
composto 4b (esquerda) e 8b (direita). Fotos em campo claro à esquerda e
fluorescência à direita. .................................................................................................. 4
Figura 4. Marcação com iodeto de propídeo da linhagem celular de glioma de rato
(C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM das
DHPMs e C sendo grupo controle (tratado exclusivamente com DMEN) para os
composto 4c (esquerda) e 8c (direita). Fotos em campo claro à esquerda e
fluorescência à direita. .................................................................................................. 5
Controle positivo graxo - Hibrido oxo-monastrol-C16:0-5-substituído 24
Concentração Controle positivo – monastrol 2 Concentração
C
C
5 µM 5 µM
10 µM 10 µM
25 µM 25 µM
50 µM 50 µM
Figura 1. Marcação com iodeto de propídeo da linhagem celular de glioma de rato (C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM das DHPMs e C sendo grupo controle (tratado exclusivamente com DMEN) para os
compostos 24 (esquerda) e 2 (direita). Fotos em campo claro à esquerda e fluorescência à direita.
Híbrido monastrol-C16:0-6-substituído 4a
Concentração Híbrido monastrol-C16:0-6-substituído
8a Concentração
C
C
5 µM 5 µM
10 µM 10 µM
25 µM 25 µM
50 µM 50 µM
Figura 2. Marcação com iodeto de propídeo da linhagem celular de glioma de rato (C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM das DHPMs e C sendo grupo controle (tratado exclusivamente com DMEN) para os
compostos 4a (esquerda) e 8a (direita). Fotos em campo claro à esquerda e fluorescência à direita.
Híbrido monastrol-C18:0-6-substituído 4b
Concentração Híbrido monastrol-C18:0-6-substituído
8b Concentração
C
C
5 µM 5 µM
10 µM 10 µM
25 µM 25 µM
50 µM 50 µM
Figura 3. Marcação com iodeto de propídeo da linhagem celular de glioma de rato (C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM das DHPMs e C sendo grupo controle (tratado exclusivamente com DMEN) para os
compostos 4b (esquerda) e 8b (direita). Fotos em campo claro à esquerda e fluorescência à direita.
Híbrido monastrol-C18:1-6-substituído 4c
Concentração Híbrido monastrol-C18:1-6-substituído
8c Concentração
C
C
5 µM 5 µM
10 µM 10 µM
25 µM 25 µM
50 µM 50 µM
Figura 4. Marcação com iodeto de propídeo da linhagem celular de glioma de rato (C6) após 48 horas de tratamento com as concentrações de 5, 10, 25 e 50 µM das DHPMs e C sendo grupo controle (tratado exclusivamente com DMEN) para os
compostos 4c (esquerda) e 8c (direita). Fotos em campo claro à esquerda e fluorescência à direita.