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Universidade de Aveiro
Ano 2019
Departamento de Biologia
SÉRGIO GONÇALO REIS MENDES
MICROBIOLOGIA E BIOLOGIA MOLECULAR EM CONTEXTO HOSPITALAR
DECLARAÇÃO
Declaro que este relatório é integralmente da minha autoria, estando
devidamente referenciadas as fontes e obras consultadas, bem como
identificadas de modo claro as citações dessas obras. Não contém, por isso,
qualquer tipo de plágio quer de textos publicados, qualquer que seja o meio dessa
publicação, incluindo meios eletrónicos, quer de trabalhos académicos.
Universidade de Aveiro
Ano 2019
Departamento de Biologia
SÉRGIO GONÇALO REIS MENDES
MICROBIOLOGIA E BIOLOGIA MOLECULAR EM CONTEXTO HOSPITALAR
Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Microbiologia, realizada sob a orientação científica do Doutor José Afonso Moreira, responsável pelo Setor de Biologia Molecular do Serviço de Medicina Laboratorial do Hospital Distrital da Figueira da Foz, E.P.E., e sob coorientação da Professora Doutora Adelaide Almeida, Professora Auxiliar com Agregação, do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro.
Dedico este trabalho aos meus pais e avós pelo enorme apoio e motivação e à minha namorada pelo seu grande carinho e toda a ajuda.
o júri
Presidente Prof.a Doutora Sónia Alexandra Leite Velho Mendo Barroso Professora Auxiliar com Agregação, Departamento de Biologia, Universidade de Aveiro
Arguente Prof.a Doutora Ana Cristina de Fraga Esteves Professora Auxiliar da Faculdade de Medicina Dentária, Universidade Católica Portuguesa
Orientador Prof.a Doutora Maria Adelaide de Pinho Almeida Professora Auxiliar com Agregação, Departamento de Biologia, Universidade de Aveiro
agradecimentos
Quero agradecer à Doutora Paula Vasco, Diretora Clínica do Serviço de Medicina Laboratorial do Hospital Distrital da Figueira da Foz, E.P.E. pela oportunidade que me concedeu de poder realizar o meu estágio neste laboratório. Ao Doutor José Afonso Moreira, meu orientador, um enorme agradecimento por toda a paciência, compreensão, como também todo o apoio, ajuda e ensinamentos que me transmitiu. Um agradecimento a todos os elementos que constituem o Serviço de Medicina Laboratorial do Hospital Distrital da Figueira da Foz, E.P.E., que tão gentilmente me acolheram nesta instituição. À professora Doutora Adelaide Almeida, minha coorientadora, que me apoiou bastante, agradeço todos os ensinamentos e apoio não só para este trabalho como também em todas as Unidades Curriculares lecionadas. Um agradecimento muito especial aos meus pais, os quais se esforçam desde sempre para me proporcionarem as melhores condições possíveis para realizar o meu percurso académico da melhor forma possível. Aos meus avós, um agradecimento muito especial por todo o apoio, ajuda, carinho e motivação que me transmitem. À minha namorada, um especial agradecimento pela sua enorme paciência e benevolência, como também o seu esforço e grande apoio que me tem dado para superar os momentos mais difíceis da minha vida. Um grande agradecimento à professora Maria Duarte, pelo enorme apoio, carinho, ensinamentos e ajuda que me transmite desde há muitos anos.
palavras-chave
Microbiologia Clínica, microrganismos, cultura de microrganismos, análises microbiológicas, Biologia Molecular.
resumo
O presente documento tem como objetivo apresentar e descrever as atividades realizadas no decorrer de um estágio efetuado nos Setores de Microbiologia e de Biologia Molecular do Serviço de Medicina Laboratorial do Hospital Distrital da Figueira da Foz, E.P.E. Neste documento serão também apresentadas as técnicas e metodologias relacionadas e aplicadas no decorrer da execução das respetivas atividades.
keywords
Clinical Microbiology, microorganisms, culture of microorganisms, microbiological analyzes, Molecular Biology.
abstract
The present document aims to present and describe the activities performed during an internship carried out in the Microbiology and Molecular Biology Sectors of the Laboratory Medicine Service of the Figueira da Foz District Hospital, E.P.E. In this document it will be also presented the techniques and methodologies related and applied during the execution of the respective activities.
Índice
Lista de Abreviaturas, Acrónimos e Siglas ......................................................................................................... I
Índice de Figuras ............................................................................................................................................. III
Índice de Tabelas ............................................................................................................................................. VI
1. Introdução .................................................................................................................................................. 1
2. Local do estágio curricular ........................................................................................................................ 2
3. Setor de Microbiologia .............................................................................................................................. 2
3.1 Gestão e tipos de produtos biológicos, classificação das análises efetuadas e validação de
resultados.. ..................................................................................................................................................... 2
3.1.1 Receção, triagem e integração dos produtos biológicos .............................................................. 2
3.1.2 Tipos de produtos biológicos ....................................................................................................... 3
3.1.3 Classificação das análises efetuadas aos diversos produtos biológicos ....................................... 4
3.1.4 Validação de resultados ............................................................................................................... 4
3.2 Observação, apreciação e análise visual dos meios de cultura semeados e incubados .................... 5
3.3 Meios de cultura e principais equipamentos utilizados no Setor de Microbiologia ......................... 7
3.3.1 Meios de cultura .......................................................................................................................... 7
3.3.2 Equipamentos ............................................................................................................................ 10
3.4 Produtos biológicos e análises efetuadas no Setor de Microbiologia ............................................. 16
3.4.1 Urina .......................................................................................................................................... 16
3.4.2 Sangue ....................................................................................................................................... 18
3.4.3 Líquido Cefalorraquidiano (LCR) ............................................................................................. 20
3.4.4 Expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e aspirados
pulmonares .............................................................................................................................................. 21
3.4.5 Sémen ........................................................................................................................................ 25
3.4.6 Exsudado purulento superficial ou profundo e ponta de cateter ................................................ 26
3.4.7 Fezes .......................................................................................................................................... 28
3.4.8 Exsudado vaginal e/ou anal ....................................................................................................... 39
3.4.9 Fragmentos de unhas, fragmentos de pele e cabelos ................................................................. 41
3.5 Testes de avaliação presuntiva ....................................................................................................... 43
3.5.1 Teste de suscetibilidade à bacitracina ........................................................................................ 43
3.5.2 Teste de suscetibilidade à optoquina ......................................................................................... 43
3.5.3 Teste da catalase, coagulase e esculina-bílis .............................................................................. 44
3.5.4 Teste da oxidase......................................................................................................................... 45
3.6 Controlos da Qualidade do Setor de Microbiologia ....................................................................... 46
3.6.1 Controlo Interno da Qualidade .................................................................................................. 46
3.6.2 Controlo Externo da Qualidade ................................................................................................. 46
3.7 Dados relativos aos produtos biológicos processados no Setor de Microbiologia ......................... 47
4. Setor de Biologia Molecular .................................................................................................................... 48
4.1 Extração ......................................................................................................................................... 48
4.2 Amplificação .................................................................................................................................. 49
4.3 Deteção e genotipagem do Vírus do Papiloma Humano (VPH) .................................................... 51
4.4 Deteção e quantificação da carga viral do Vírus da Hepatite B (VHB) e do Vírus da Hepatite C
(VHC)… ...................................................................................................................................................... 52
4.5 Deteção de vírus respiratórios e microrganismos atípicos ............................................................. 53
4.6 Deteção e análise do Complexo M. tuberculosis e genes de resistência ........................................ 54
4.7 Controlo Externo da Qualidade do Setor de Biologia Molecular................................................... 56
5. Conclusões............................................................................................................................................... 57
6. Referências bibliográficas ....................................................................................................................... 58
I
Lista de Abreviaturas, Acrónimos e Siglas
ATCC - American Type Culture Collection;
BAAR - Bacilos Ácido-Álcool Resistentes;
CAN2 - Meio de cultura CHROMID® Candida;
CARB/OXA - Meio de cultura CHROMID® CARBA SMART Agar;
CCDA - Meio de cultura para Campylobacter spp.;
CLED - Meio de cultura Cystine, Lactose, Electrolyte Deficient (Cistina, Lactose, Deficiente em Eletrólitos);
CMI - Concentração Mínima Inibitória;
CMRRC - Centro de Medicina e Reabilitação da Região Centro-Rovisco Pais;
CMTB - Complexo Mycobacterium tuberculosis;
COS - Meio de cultura Columbia agar com 5% de Sangue de Ovelha;
DCO - Meio de cultura D-Coccosel agar;
EDTA - Ethylenediaminetetraacetic Acid (Ácido Etilenodiaminotetracético);
EPC - Enterobactérias Produtoras de Carbapenemases;
GDH - Glutamato-Desidrogenase;
GRAN - Meio de cultura Granada agar;
H.D.F.F., E.P.E. - Hospital Distrital da Figueira da Foz, E.P.E.;
INSA - Instituo Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge;
KPC - Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (Produtora de Carbapenemases);
LCR - Líquido Cefalorraquidiano;
LJ - Meio de cultura Löwenstein-Jensen;
MCK - Meio de cultura MacConkey agar;
MOC - Microscópio Ótico Composto;
PCR - Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase);
PSO - Pesquisa de Sangue Oculto;
PVX - Meio de cultura chocolate agar PolyViteX;
qPCR - Real-Time Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da Polimerase em Tempo Real);
RT-qPCR - Reverse Transcription Real-Time Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase
em Tempo Real com Transcrição Reversa);
SALM - Meio de cultura CHROMID® Salmonella Elite;
SGA - Meio de cultura Sabouraud, Gentamicina e Actidiona;
SGC - Meio de cultura Sabouraud, Gentamicina e Cloranfenicol;
SGC2 - Meio de cultura Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol 2 agar;
SML - Serviço de Medicina Laboratorial;
SNVS - Meio de cultura SNVS;
SPZ - Espermatozoides;
SS - Meio de cultura para Salmonella spp. e Shigella spp.;
TSA - Teste de Suscetibilidade a Antimicrobianos;
UFC/mL - Unidades Formadoras de Colónias por mililitro;
II
UK NEQAS - United Kingdom National External Quality Assessment Service;
VCAT3 - Meio de cultura chocolate agar PolyViteX Vancomicina, Colistina, Anfotericina e Trimetoprim 3;
VHB - Vírus da Hepatite B;
VHC - Vírus da Hepatite C;
VPH - Vírus do Papiloma Humano;
WT - Wild Type (Tipo Selvagem).
III
Índice de Figuras
Figura 1: Meios de cultura semeados e incubados, já organizados de forma decrescente relativamente ao seu
código numérico e prontos a serem observados. ............................................................................................... 6
Figura 2: Equipamento VITEK® 2 Compact. ................................................................................................. 10
Figura 3: Suporte de cartas do VITEK® 2 Compact, com várias cartas prontas a serem inseridas na câmara de
enchimento por vácuo. Cada carta tem a si associado um tubo com uma suspensão microbiana com uma
densidade ótica conhecida. .............................................................................................................................. 10
Figura 4: Equipamento DensiCHEKTM Plus utilizado para leitura da densidade ótica de uma suspensão
microbiana na escala nefelométrica McFarland. ............................................................................................. 11
Figura 5: Equipamento BACT/ALERT® 3D. ................................................................................................. 13
Figura 6: Figura onde é possível observar a variação de cor do sensor permeável ao CO2 entre dois frascos. À
direita é possível observar uma hemocultura positiva, enquanto que à esquerda é possível observar uma
hemocultura negativa....................................................................................................................................... 13
Figura 7: Microscópio ZEISS Axio Lab. A1 utilizado no Setor de Microbiologia. ....................................... 15
Figura 8: Meio de cultura duplo Uriline. ........................................................................................................ 16
Figura 9: Procedimento para análise bacteriológica de urina. Adaptado de Fonseca et al., 2004. ................. 16
Figura 10: Staphylococcus saprophyticus isolado a partir de uma urocultura. ............................................... 17
Figura 11: Proteus mirabilis isolado a partir de uma urocultura. ................................................................... 17
Figura 12: E. coli isolada a partir de uma urocultura. .................................................................................... 17
Figura 13: Enterobacter cloacae isolado a partir de uma urocultura. ............................................................ 17
Figura 14: Procedimento para análise bacteriológica de hemoculturas positivas. Adaptado de Fonseca et al.,
2004. ................................................................................................................................................................ 18
Figura 15: Streptococcus pyogenes isolado a partir de uma hemocultura positiva. Na Figura é possível observar
um disco do teste de suscetibilidade à bacitracina. .......................................................................................... 19
Figura 16: Acinetobacter baumannii isolado a partir de uma hemocultura positiva. ..................................... 19
Figura 17: S. agalactiae isolado a partir de uma hemocultura positiva. ......................................................... 19
Figura 18: Procedimento para análise bacteriológica e avaliação citológica de LCR. Adaptado de Fonseca et
al., 2004 e Gilhus et al., 2011. ......................................................................................................................... 20
Figura 19: Observação de células mononucleares (A) e polimorfonucleares (B) durante uma avaliação
citológica de LCR. Ampliação: 10x40=400X. ................................................................................................ 20
Figura 20: Procedimento para análise bacteriológica, micológica e recolha de amostra para análise
micobacteriológica de expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e
aspirados pulmonares. Adaptado de Fonseca et al., 2004. .............................................................................. 22
Figura 21: Colónias de S. aureus, isoladas a partir da análise bacteriológica de uma expetoração. ............... 22
Figura 22: Colónias de H. influenzae, isoladas a partir da análise bacteriológica de uma expetoração. ........ 22
Figura 23: Procedimento para análise micobacteriológica de expetorações, secreções brônquicas, lavados
brônquicos, lavados broncoalveolares e aspirados pulmonares. Adaptado de Bula informativa dos frascos de
cultura, Stinson et al., 2014 e Vega et al., 2005. ............................................................................................. 23
IV
Figura 24: Observação microscópica de BAAR, após coloração através do método de Ziehl-Neelsen.
Ampliação: 10x100=1000X. ........................................................................................................................... 24
Figura 25: Observação microscópica a fresco de sémen (em lâmina normal), aquando de uma análise de sémen.
Ampliação: 10x100=1000X. ........................................................................................................................... 25
Figura 26: Observação microscópica de sémen em câmara de Neubauer, para contagem de SPZ. ............... 25
Figura 27: Procedimento para análise bacteriológica de exsudado purulento superficial ou profundo e ponta
de cateter. Adaptado de Fonseca et al., 2004. ................................................................................................. 26
Figura 28: Staphylococcus epidermidis isolado a partir de um cateter com suspeita de contaminação. ........ 27
Figura 29: Enterococcus faecalis isolado a partir de um exsudado purulento em zaragatoa. ........................ 27
Figura 30: Finegoldia magna isolada a partir de um exsudado purulento líquido. ........................................ 27
Figura 31: Procedimento para análise bacteriológica de fezes. Adaptado de Fonseca et al., 2004. ............... 29
Figura 32: S. enteritidis obtida a partir da análise bacteriológica de fezes. .................................................... 29
Figura 33: Procedimento para análise parasitológica com exame microscópico em fezes. Adaptado de Bula
informativa do Kit e Forbes et al., 2007. ......................................................................................................... 30
Figura 34: Observação microscópica de um ovo de Enterobius vermicularis. Ampliação: 10x40=400X. .... 30
Figura 35: Figura onde é possível observar um cisto de Giardia lamblia. Ampliação: 10x40=400X. .......... 30
Figura 36: Teste rápido imunocromatográfico One-step Diagnostic Test FOB, positivo e válido. ................ 31
Figura 37: Teste rápido imunocromatográfico RIDA® QUICK Campylobacter, positivo e válido. .............. 32
Figura 38: Figura onde é possível observar a presença de colónias com um aspeto metálico, sendo estas
formadas por Campylobacter spp. ................................................................................................................... 32
Figura 39: Teste rápido imunoenzimático TECHLAB® C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE®, com resultado
negativo e válido. ............................................................................................................................................ 33
Figura 40: Teste rápido imunoenzimático TECHLAB® C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE®, positivo e válido
para GDH. ....................................................................................................................................................... 33
Figura 41: Teste rápido imunocromatográfico bioNexia® Rota-Adeno, positivo e válido para Rotavírus. .... 34
Figura 42: Teste rápido imunocromatográfico Pylori-strip H. pylori diagnostic, positivo e válido. .............. 35
Figura 43: Teste rápido imunocromatográfico Crypto/Giardia Duo-Strip, negativo e válido. ....................... 36
Figura 44: Procedimento para análise bacteriológica de zaragatoas retais – fezes. Adaptado de Fonseca et al.,
2004 e PPCIRA, 2017. .................................................................................................................................... 37
Figura 45: Colónias com suspeita de serem formadas por KPC (colónias à esquerda). ................................. 38
Figura 46: Repicagem de colónias com suspeita de serem formadas por KPC (Figura 45), para posterior
identificação e TSA. ........................................................................................................................................ 38
Figura 47: Procedimento para análise bacteriológica e micológica de zaragatoas vaginais e/ou anais. Adaptado
de Fonseca et al., 2004. ................................................................................................................................... 39
Figura 48: Colónias de Candida glabrata obtidas a partir de uma zaragatoa vaginal, após análise micológica
e repicagem para meio de cultura COS. .......................................................................................................... 40
Figura 49: Colónias de S. agalactiae isoladas após análise bacteriológica de uma zaragatoa vaginal enviada
para rastreio de S. agalactiae. .......................................................................................................................... 40
V
Figura 50: Procedimento para análise micológica de fragmentos de unhas, fragmentos de pele e cabelos.
Adaptado de Forbes et al., 2007 e Hainer, 2003. ............................................................................................ 41
Figura 51: Dermatófito M. canis isolado a partir de fragmentos de pele (frente). .......................................... 42
Figura 52: Dermatófito M. canis isolado a partir de fragmentos de pele (verso). .......................................... 42
Figura 53: Observação microscópica do dermatófito M. canis, sendo observado na Figura algumas estruturas
(macroconídios) deste. Ampliação: 10x40=400X. .......................................................................................... 42
Figura 54: Teste de suscetibilidade à bacitracina positivo para S. pyogenes, sendo observado um halo de
inibição em volta do disco de bacitracina. ....................................................................................................... 43
Figura 55: Teste da coagulase positivo. Suspeita de S. aureus. ...................................................................... 44
Figura 56: Colónias com suspeita de serem formadas por Enterococcus spp. O meio apresenta uma mudança
de cor, ficando com uma tonalidade bastante escura. ...................................................................................... 45
Figura 57: Figura onde é possível observar a ordem de realização dos testes da catalase, da coagulase e da
esculina-bílis no Setor de Microbiologia. ........................................................................................................ 45
Figura 58: Equipamento de extração automática QIAGEN® EZ1® Advanced. ............................................. 49
Figura 59: Termociclador Rotor-Gene 3000TM. ............................................................................................. 50
Figura 60: Equipamento TENDIGOTM. .......................................................................................................... 54
Figura 61: Tira de hibridização positiva e válida para a presença de micobactérias pertencentes ao CMTB. É
possível ainda visualizar algumas bandas dos seus genes de resistência WT, relativamente aos antibióticos
isoniazida e rifampicina. .................................................................................................................................. 55
VI
Índice de Tabelas
Tabela 1: Parâmetros qualitativos e quantitativos avaliados na realização de um espermograma. Adaptado de
WHO, 2010. .................................................................................................................................................... 25
Tabela 2: Tabela com os dados relativos ao número total de análises de alguns produtos biológicos processados
no ano de 2018. ............................................................................................................................................... 47
VII
Todas as figuras e tabelas apresentadas neste documento são da autoria do responsável pela redação
deste mesmo documento.
1
1. Introdução
O presente documento foi elaborado com base no estágio curricular de seis meses efetuado
nos Setores de Microbiologia e de Biologia Molecular do Serviço de Medicina Laboratorial (SML)
do Hospital Distrital da Figueira da Foz, E.P.E. (H.D.F.F., E.P.E.). O estágio curricular e relatório
associado foram realizados em conformidade com os requisitos de avaliação necessários à Unidade
Curricular Dissertação/Projeto/Estágio do Mestrado em Microbiologia, lecionado no Departamento
de Biologia da Universidade de Aveiro.
Este estágio curricular teve como principais objetivos, a aplicação prática de conhecimentos
teóricos adquiridos anteriormente, como também a aquisição de novas competências e experiências
através da realização de várias atividades, nos Setores de Microbiologia e de Biologia Molecular, no
SML do H.D.F.F., E.P.E. Deste modo, pude fazer parte integrante da equipa técnica, adaptando-me
à rotina inerente a cada Setor e realizando várias tarefas que me foram atribuídas durante o período
de estágio. Com o apoio e ajuda dos elementos de cada Setor, realizei em ambos os Setores a triagem
e integração dos vários produtos biológicos, o seu processamento, envolvendo diversos métodos e
equipamentos, a obtenção/gestão de resultados e a sua posterior análise e interpretação.
Por meio deste relatório, serão apresentadas de forma detalhada as tarefas e análises por mim
realizadas no decorrer do meu estágio curricular, os objetivos de cada análise, alguns dos métodos,
materiais e equipamentos utilizados no processamento dos vários produtos biológicos e ainda alguns
resultados demonstrativos obtidos em ambos os Setores de Microbiologia e de Biologia Molecular.
2
2. Local do estágio curricular
O estágio curricular em questão foi realizado num período de seis meses, sendo iniciado no
dia 10 de setembro de 2018 e finalizado no dia 18 de março de 2019, nos Setores de Microbiologia
e de Biologia Molecular do SML do H.D.F.F., E.P.E. Este Serviço encontra-se localizado na face
norte do H.D.F.F., E.P.E. e engloba ainda outros Setores, tais como o Setor de Bioquímica, o Setor
de Hematologia e o Setor de Imunohemoterapia. Atualmente, o SML do H.D.F.F., E.P.E. está sob a
chefia da Diretora Clínica Doutora Paula Vasco.
3. Setor de Microbiologia
No Setor de Microbiologia são desenvolvidas diversas atividades que envolvem por
exemplo, a triagem e integração dos produtos biológicos, a execução de diversas análises através de
várias técnicas microbiológicas clássicas e automatizadas, a interpretação dos resultados obtidos e a
sua validação no sistema informático do SML. Todas estas atividades são realizadas com o objetivo
de produzir um diagnóstico conciso e objetivo.
3.1 Gestão e tipos de produtos biológicos, classificação das análises efetuadas e
validação de resultados
3.1.1 Receção, triagem e integração dos produtos biológicos
A receção dos produtos biológicos para análise microbiológica é diária e várias vezes por
dia. Os produtos biológicos podem ser provenientes dos vários Serviços do H.D.F.F., E.P.E. ou do
Centro de Medicina e Reabilitação da Região Centro-Rovisco Pais (CMRRC, Tocha, Portugal),
sendo estes entregues nas instalações do SML. Diversos produtos biológicos são ainda provenientes
das colheitas realizadas no próprio SML.
Após a entrega dos produtos biológicos, estes são triados e integrados no sistema informático
do SML, sendo este o Clinidata®XXI (Maxdata, Carregado, Portugal). Deste modo, a cada produto
biológico pertencente a um doente com um número de processo e/ou episódio específico, são
verificadas as análises requisitadas e em simultâneo, é atribuído um código numérico único no
sistema informático do SML.
Consoante o tipo de análise e o tipo de produto biológico, são impressas várias etiquetas.
Estas por sua vez, apresentam várias informações úteis, sendo algumas delas, a data de colheita, o
código numérico único do produto biológico no sistema informático do SML e o código de barras.
Tudo isto, de forma a facilitar todo um processo complexo posterior.
3
3.1.2 Tipos de produtos biológicos
São vários os tipos de produtos biológicos que podem chegar ao Setor de Microbiologia para
análise. Estes por sua vez, dependem essencialmente do tipo de doença envolvida. No decorrer do
meu estágio curricular, pude efetuar o processamento de diversos produtos biológicos, tais como:
➢ Urina;
➢ Sangue;
➢ Líquido Cefalorraquidiano;
➢ Expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e
aspirados pulmonares;
➢ Sémen;
➢ Exsudado purulento superficial ou profundo e ponta de cateter;
➢ Fezes;
➢ Exsudado vaginal e/ou anal;
➢ Fragmentos de unhas, fragmentos de pele e cabelos.
4
3.1.3 Classificação das análises efetuadas aos diversos produtos biológicos
A requisição enviada pelo clínico para as análises a serem efetuadas, define os procedimentos
a serem realizados aos produtos biológicos. Os procedimentos das análises bacteriológicas e
micológicas (para algumas leveduras), realizadas no Setor de Microbiologia do SML, baseiam-se nas
recomendações publicadas pelo Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA) (Fonseca
et al., 2004). A classificação das análises divide-se essencialmente em quatro categorias:
a) Análise bacteriológica
A análise bacteriológica tem como principal objetivo a deteção e estudo de bactérias
responsáveis por infeção no seu hospedeiro. A análise bacteriológica engloba sempre um exame
cultural. É também realizado um exame direto sempre que possível envolvendo este, um esfregaço
em lâmina (Normax - Fábrica de Vidros Científicos, Lda., Marinha Grande, Portugal) para coloração
pelo método de Gram e posterior observação microscópica. Por último, é realizado o estudo de
identificação e Teste de Suscetibilidade a Antimicrobianos (TSA) às colónias relevantes obtidas após
incubação e observação dos meios de cultura.
b) Análise micobacteriológica
A análise micobacteriológica tem como objetivo a deteção de micobactérias. A execução
desta análise é solicitada com frequência em produtos biológicos do trato respiratório. Esta análise
engloba uma descontaminação e homogeneização inicial, seguindo-se um exame cultural com
sementeira em meio de cultura sólido e líquido. É ainda realizado um exame direto através de um
esfregaço em lâmina para coloração por método de Ziehl-Neelsen e sua observação microscópica.
c) Análise micológica
A análise micológica tem como objetivo a deteção de fungos responsáveis por várias
doenças. Esta análise envolve sempre um exame cultural, no entanto, em produtos biológicos
específicos, pode ser ainda realizado um exame direto. Aquando da deteção e obtenção de fungos
específicos como por exemplo leveduras, é realizado o seu estudo de identificação e TSA.
d) Análise parasitológica com exame microscópico
A análise parasitológica com exame microscópico tem como principal objetivo a deteção e
identificação presuntiva de parasitas causadores de diversas doenças no hospedeiro. Esta análise é
efetuada a fezes e envolve a observação microscópica dos próprios parasitas, alguns fragmentos e
também algumas das suas estruturas numa preparação a fresco, após concentração e sedimentação.
3.1.4 Validação de resultados
A validação de resultados é realizada pelos responsáveis do Setor. Esta tarefa envolve a
avaliação e inserção dos resultados obtidos, no sistema informático do SML do H.D.F.F., E.P.E.
5
3.2 Observação, apreciação e análise visual dos meios de cultura semeados e
incubados
No Setor de Microbiologia, podem ser observados dois tipos de culturas, as culturas
primárias e as repicagens. Estas consistem na realização de sementeiras em meios de cultura a partir
de uma amostra do produto biológico chegado ao Setor e a partir de colónias já presentes em meio
de cultura (cultura primária) para isolamento de um microrganismo de interesse, respetivamente.
Consoante os meios de cultura e as necessidades dos microrganismos que se suspeitem que estejam
presentes, os meios de cultura podem ficar em incubação em aerobiose, anaerobiose, atmosfera rica
em dióxido de carbono (CO2) ou microaerofilia.
A observação e apreciação visual de todos os meios de cultura é uma tarefa realizada
diariamente, sempre ao início do dia. Todos os dias de manhã são observados os meios de cultura
semeados nos dias anteriores ou durante a noite do próprio dia (Figura 1). Durante a análise e
observação dos meios de cultura, são avaliados diversos fatores (Fonseca et al., 2004), sendo estes:
• Cor das colónias em crescimento;
• Presença ou ausência de vários tipos de colónias (colónias com vários formatos e cores no
mesmo meio de cultura);
• Odor;
• Formato das colónias;
• Presença ou ausência de hemólise e o tipo de hemólise (colónias α-hemolíticas, β-
hemolíticas ou ϒ-hemolíticas);
• Textura;
• Alteração da cor do meio de cultura na presença de colónias microbianas específicas;
• Observação da presença ou ausência de halos de inibição (ex: na adição de um disco de
bacitracina ou optoquina nos testes de avaliação presuntiva).
Aquando da observação e análise dos meios de cultura semeados e incubados, podem ser
obtidos quatro tipos de resultados tendo em consideração o crescimento microbiano, sendo estes:
• Cultura sem crescimento de microrganismos;
• Cultura sem crescimento de microrganismos relevantes ou predominantes;
• Cultura com crescimento de microrganismos relevantes ou predominantes;
• Cultura polimicrobiana (três ou mais isolados de microrganismos).
Excecionalmente, culturas polimicrobianas obtidas a partir de análises realizadas a urinas,
são descartadas, uma vez que tanto impossibilita a realização de repicagens, como pode levar à
invalidação do diagnóstico devido à possibilidade de contaminações.
Os resultados obtidos após observação e análise dos meios de cultura são posteriormente
inseridos e validados no sistema informático do SML.
6
Para posteriores testes de identificação e TSA, são realizadas anotações para esse efeito.
Adicionalmente, podem ser registadas anotações para a realização de esfregaços para coloração pelo
método de Gram ou pelo método de Ziehl-Neelsen, mas também para a execução de testes de
avaliação presuntiva.
Figura 1: Meios de cultura semeados e incubados, já organizados de forma decrescente relativamente ao seu
código numérico e prontos a serem observados.
7
3.3 Meios de cultura e principais equipamentos utilizados no Setor de Microbiologia
3.3.1 Meios de cultura
a) Meio de cultura Columbia agar com 5% de Sangue de Ovelha (COS) (bioMérieux S.A.,
Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura destinado ao crescimento e isolamento da grande maioria dos
microrganismos com importância na Microbiologia Clínica, incluindo os fastidiosos. Este meio de
cultura não seletivo e não diferencial é nutritivo e contém 5% de sangue de ovelha. A presença de
sangue neste meio, possibilita a deteção de microrganismos capazes de gerar hemólise (bioMérieux,
2019g; Murray et al., 2007). Este meio de cultura é utilizado em quase todas as análises efetuadas,
essencialmente na realização de culturas primárias.
b) Meio de cultura Cystine Lactose Electrolyte Deficient agar (CLED) (bioMérieux S.A.,
Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura diferencial e não seletivo, recomendado para a deteção e isolamento de
microrganismos infeciosos do trato urinário. A presença de cistina permite o desenvolvimento de
microrganismos que são dependentes deste reagente, enquanto que a lactose e o indicador de pH azul
de bromotimol possibilitam a diferenciação entre microrganismos fermentadores e não
fermentadores da lactose. Os microrganismos fermentadores da lactose formam colónias amarelas,
enquanto que os microrganismos não fermentadores formam colónias verdes, azuis ou incolores. Por
fim, a sua deficiência em eletrólitos evita a formação de “swarming” por parte de espécies de Proteus
spp. (Benito et al., 1990; bioMérieux, 2019f; Fonseca et al., 2004).
c) Meio de cultura cromogénico CHROMID® CARBA SMART Agar (CARB/OXA)
(bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura cromogénico seletivo duplo com um antibiótico em cada lateral, utilizado
para a deteção de Enterobactérias Produtoras de Carbapenemases (EPC), como por exemplo
Klebsiella pneumoniae Produtora de Carbapenemases (KPC) (bioMérieux, 2019d).
d) Meio de cultura MacConkey agar (MCK) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo e diferencial aplicado para o isolamento seletivo de microrganismos
de Gram-negativo como por exemplo, enterobactérias. Os sais biliares e violeta de cristal presentes
na sua composição inibem o crescimento de bactérias de Gram-positivo. A lactose e vermelho neutro
presentes na sua composição permitem a diferenciação entre microrganismos fermentadores da
lactose e não fermentadores. Microrganismos fermentadores da lactose geram colónias de cor rosa
ou vermelha (bioMérieux, 2019j; Fonseca et al., 2004; Murray et al., 2007).
8
e) Meio de cultura cromogénico CHROMID® Salmonella ELITE (SALM) (bioMérieux S.A.,
Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo e cromogénico aplicado para o isolamento seletivo e identificação
de Salmonella spp. (bioMérieux, 2019e).
f) Meio de enriquecimento Selenite F BD-BBL (Becton, Dickinson and Company, Nova
Jersey, Estados Unidos da América)
Meio de enriquecimento líquido e nutritivo, destinado ao isolamento de Salmonella spp. e
Shigella spp. a partir de amostras de fezes. A presença de selenito inibe o desenvolvimento de outros
microrganismos como por exemplo, coliformes (Fonseca et al., 2004; Murray et al., 2007).
g) Meio de cultura Salmonella Shigella agar (SS) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo e diferencial utilizado para o isolamento seletivo de Salmonella spp.
e Shigella spp. Os sais biliares, citratos e verde brilhante da sua composição inibem o crescimento
de microrganismos de Gram-positivo. A presença de lactose e o indicador de pH vermelho neutro na
sua composição, permitem a diferenciação entre microrganismos fermentadores da lactose que geram
colónias vermelhas e microrganismos não fermentadores que geram colónias incolores. Sendo a
Salmonella spp. e a Shigella spp. não fermentadoras, estas geram colónias incolores. Este meio
permite ainda diferenciar microrganismos produtores de sulfeto de hidrogénio, os quais geram
colónias com um centro negro (ex: Salmonella spp.) (bioMérieux, 2019l; Murray et al., 2007).
h) Meio de cultura duplo Uriline (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura duplo de transporte, sendo uma das faces constituída por meio de cultura
MacConkey agar (MCK) e a outra face constituída por meio de cultura CLED. Este meio de cultura
duplo é aplicado para a sementeira de urinas (Bula informativa).
i) Meio de cultura duplo Mycoline (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura duplo de transporte, constituído por meio de cultura Sabouraud, Gentamicina
e Cloranfenicol (SGC) e a outra face constituída por meio de cultura Sabouraud, Gentamicina e
Actidiona (SGA). Este meio de cultura duplo é aplicado na deteção de fungos (Bula informativa).
j) Meio de cultura Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol 2 agar (SGC2) (bioMérieux S.A.,
Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo aplicado para a deteção e isolamento seletivo de fungos filamentosos
ou leveduriformes de importância microbiológica clínica. Este meio de cultura é rico em glucose e
peptonas, o que favorece o crescimento de fungos. Contém gentamicina para inibição da grande
maioria de bactérias de Gram-positivo e de Gram-negativo. O cloranfenicol é adicionado para a
inibição do crescimento de bactérias que possam apresentar resistência à gentamicina (Benito et al.,
1990; bioMérieux, 2019k; Murray et al., 2007).
9
k) Meio de cultura CHROMID® Candida (CAN2) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo e cromogénico utilizado para a deteção e isolamento seletivo de
leveduras causadoras de infeções como por exemplo, Candida spp. (bioMérieux, 2019c).
l) Meio de cultura Granada agar (GRAN) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo aplicado para a pesquisa e identificação de Streptococcus do grupo
B de Lancefield como Streptococcus agalactiae (bioMérieux, 2019i).
m) Meio de cultura Chocolate agar PolyViteX (PVX) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile,
França)
Meio de cultura não seletivo o qual contém componentes específicos como fator X (hemina)
e fator V (NAD) fornecidos pela hemoglobina e pelo PolyViteX, respetivamente. Este meio de
cultura é aplicado para o isolamento de estirpes fastidiosas, tais como Neisseria spp. ou Haemophilus
spp. (bioMérieux, 2019a; Fonseca et al., 2004; Murray et al., 2007).
n) Meio de cultura Chocolate agar PolyViteX Vancomicina, Colistina, Anfotericina e
Trimetoprim 3 (VCAT3) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo utilizado para o isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae ou
Neisseria meningitidis (bioMérieux, 2019b; Fonseca et al., 2004).
o) Meio de cultura SNVS (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo empregue no isolamento seletivo de microrganismos anaeróbios. A
sua composição inclui por exemplo, peptonas e sangue de ovelha (Murray et al., 2007).
p) Meio de cultura D-Coccosel agar (DCO) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura seletivo e diferencial utilizado para o isolamento seletivo e diferenciação de
Streptococcus do Grupo D de Lancefield e Enterococcus spp. de outros microrganismos. Na presença
destes microrganismos, a esculina é hidrolisada e o meio adquire uma tonalidade escura devido à
precipitação de sais de ferro. O carácter seletivo deste meio de cultura é proporcionado pela bílis
(bioMérieux, 2019h; Murray et al., 2007).
q) Meio de Cultura Löwenstein-Jensen (LJ) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
Meio de cultura não seletivo aplicado para o isolamento de Mycobacterium spp. Os
compostos específicos incluem por exemplo, glicerol, amido de batata, ovos e verde de malaquita.
Este último, inibe o crescimento de outros microrganismos (Murray et al., 2007).
r) Meio de cultura CCDA (Biogerm S.A., Maia, Portugal)
Meio de cultura seletivo o qual contém por exemplo carvão e cefoperazona. Este meio de
cultura é aplicado no isolamento seletivo de Campylobacter jejuni e Campylobacter coli, a partir de
amostras de fezes (Murray et al., 2007).
10
3.3.2 Equipamentos
a) VITEK® 2 Compact (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
O Setor de Microbiologia está atualmente equipado com um sistema automático para o
estudo de identificação e TSA, sendo este o VITEK® 2 Compact (Figura 2).
Figura 2: Equipamento VITEK® 2 Compact.
O VITEK® 2 Compact compreende várias secções, como por exemplo a câmara de
enchimento de cartas por vácuo, a câmara de selagem de cartas e recolha das mesmas, a câmara de
incubação e a zona de leitura de cartas. Após o enchimento e selagem, este equipamento realiza a
incubação e a leitura periódica e automática de reações/alterações que ocorrem dentro de poços de
cartas VITEK® 2 (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França) específicas, estando algumas
apresentadas abaixo na Figura 3. Estas cartas podem ser aplicadas para identificação microbiana ou
TSA, sendo estas por sua vez, utilizadas após a realização de uma suspensão microbiana com uma
densidade ótica específica medida e obtida na escala McFarland, através do equipamento
DensiCHEKTM Plus (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França) (Figura 4). As cartas de identificação
microbiana contêm poços com compostos específicos como por exemplo substratos que permitem
que o crescimento microbiano e metabolização associados se traduzam em alterações de turvação
e/ou cor. Estas alterações são então lidas por turbidimetria e colorimetria pelo leitor do equipamento.
Os dados obtidos são posteriormente transmitidos para um computador com um software específico
para análise da informação (bioMérieux, 2018b; Michalik and bioMérieux, 2017; Pincus, 2006).
Figura 3: Suporte de cartas do VITEK® 2 Compact, com várias cartas prontas a serem inseridas na câmara
de enchimento por vácuo. Cada carta tem a si associado um tubo com uma suspensão microbiana com uma
densidade ótica conhecida.
11
Relativamente às cartas para TSA, estas contêm no seu interior poços de controlo e poços de
teste. Os poços de teste contêm no seu interior antimicrobianos conhecidos, cujas concentrações vão
sendo crescentes de poço para poço. O equipamento realiza a leitura periódica do crescimento
microbiano em cada poço através de turbidimetria, sendo os dados obtidos transmitidos para um
computador com um software específico para análise da informação. A suscetibilidade a cada
antimicrobiano é então fornecida em valores internacionais de Concentração Mínima Inibitória
(CMI). Após a finalização de cada teste, as cartas são então descartadas automaticamente pelo
equipamento (bioMérieux, 2018b; Michalik and bioMérieux, 2017).
Figura 4: Equipamento DensiCHEKTM Plus utilizado para leitura da densidade ótica de uma suspensão
microbiana na escala nefelométrica McFarland.
12
Cartas VITEK® 2 utilizadas no estudo de identificação e TSA:
➢ Identificação
• Cartas para identificação de microrganismos anaeróbios microaerófilos;
• Cartas para identificação de microrganismos de Gram-negativo;
• Cartas para identificação de microrganismos de Gram-positivo;
• Cartas para identificação de leveduras de maior importância clínica.
➢ TSA
Leveduras
• Cartas para leveduras de maior importância clínica.
Microrganismos de Gram-negativo
• Cartas para microrganismos de Gram-negativo fermentadores como por exemplo
Escherichia coli;
• Cartas para microrganismos de Gram-negativo não fermentadores como por exemplo
Pseudomonas aeruginosa;
• Cartas para microrganismos de Gram-negativo fastidiosos/crescimento lento como por
exemplo N. gonorrhoeae;
• Cartas para microrganismos multirresistentes como por exemplo KPC.
Microrganismos de Gram-positivo
• Cartas para microrganismos de Gram-positivo como por exemplo Staphylococcus aureus;
• Cartas para microrganismos de Gram-positivo como por exemplo Streptococcus
pneumoniae ou Streptococcus viridans;
• Cartas para microrganismos de Gram-positivo, em particular para Enterococcus spp. e S.
agalactiae.
TSA manual para Haemophilus spp. e Moraxella Catarrhalis
• A execução de TSA para Haemophilus spp. e M. Catarrhalis envolve as galerias ATBTM
HAEMO EU (08) (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França), sendo esta análise realizada
manualmente.
13
b) BACT/ALERT® 3D (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França)
O Setor de Microbiologia está equipado com um equipamento para a incubação e deteção de
microrganismos em frascos de hemocultura BACT/ALERT® FN Plus, BACT/ALERT® FA Plus e
BACT/ALERT® PF Plus (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França) e frascos de cultura
BACT/ALERT® MP (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França) para deteção de micobactérias sendo
este, o BACT/ALERT® 3D (Figura 5).
Figura 5: Equipamento BACT/ALERT® 3D.
Este equipamento realiza a incubação e a monitorização periódica dos frascos. Cada frasco
contém no fundo um sensor de emulsão líquida. Este sensor é permeável ao CO2 libertado pelos
microrganismos aquando do seu crescimento e metabolização dos substratos presentes no meio de
cultura. Na presença de uma quantidade significativa de CO2, o pH diminui e o sensor sofre uma
variação de cor (Figura 6), detetada pelo equipamento por colorimetria. O frasco em causa é então
assinalado como positivo para o crescimento microbiano (bioMérieux, 2018a; Bulas informativas
dos frascos de hemocultura e cultura).
Figura 6: Figura onde é possível observar a variação de cor do sensor permeável ao CO2 entre dois frascos.
À direita é possível observar uma hemocultura positiva, enquanto que à esquerda é possível observar uma
hemocultura negativa.
14
No Setor de Microbiologia existem frascos de hemocultura para colheitas em adultos e para
colheitas pediátricas. A principal diferença entre estes dois tipos de frascos de hemocultura reside no
volume de sangue que é colhido para cada tipo de frasco. Relativamente aos frascos de hemocultura
para adultos, é colhido um volume de sangue maior comparativamente ao volume de sangue colhido
para frascos de hemocultura para colheitas pediátricas. Em relação aos fracos de hemocultura para
colheitas em adultos, estes subdividem-se em frascos de hemocultura para deteção de
microrganismos anaeróbios e facultativos (BACT/ALERT® FN Plus) e frascos de hemocultura para
deteção de microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos (BACT/ALERT® FA Plus).
Relativamente aos frascos de hemocultura BACT/ALERT® PF Plus, estes são utilizados para deteção
de microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos em colheitas pediátricas. Após sementeira, os
fracos de hemocultura ficam em incubação à temperatura constante e controlada de 37 ºC no
equipamento até 5 dias. Caso haja desenvolvimento e multiplicação microbiana durante este período
de tempo, o equipamento assinala a positividade no monitor (Bulas informativas dos frascos de
hemocultura).
Por fim, existem ainda os frascos de cultura para crescimento e deteção de micobactérias
(BACT/ALERT® MP). Após sementeira, estes frascos são mantidos em incubação a 37 ºC até 42
dias. Caso exista desenvolvimento e multiplicação durante esse período de tempo, o equipamento
assinala a positividade no monitor (Bula informativa dos frascos de cultura).
15
c) Estufas de incubação
Existem duas estufas de incubação no Setor de Microbiologia, ambas à temperatura regulada
de 37 ºC. Uma é utilizada para incubação de todos os meios de cultura e enriquecimento de
microrganismos que não sejam micobactérias. A segunda estufa é utilizada para incubação de meios
de cultura semeados para deteção e isolamento de micobactérias.
d) Câmara de fluxo laminar
No Setor de Microbiologia, é utilizada a câmara de fluxo laminar Labconco Logic+, classe
II (Labconco Corporation, Kansas, Estados Unidos da América).
e) Frigoríficos
No Setor de Microbiologia, existem duas arcas de refrigeração. Nestas, estão colocados
vários materiais, incluindo os meios de cultura e enriquecimento, cartas de identificação e TSA para
o VITEK® 2 Compact e testes rápidos imunocromatográficos e imunoenzimáticos.
f) Microscópio Ótico Composto
O Setor de Microbiologia está equipado com um Microscópio Ótico Composto (MOC)
ZEISS Axio Lab. A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha) apresentado abaixo na Figura
7. Este equipamento é utilizado para a realização de observações microscópicas de preparações a
fresco e observação microscópica de esfregaços após coloração.
Figura 7: Microscópio ZEISS Axio Lab. A1 utilizado no Setor de Microbiologia.
16
3.4 Produtos biológicos e análises efetuadas no Setor de Microbiologia
3.4.1 Urina
As infeções urinárias podem ser divididas em duas categorias, a infeção urinária superior e
inferior, que podem envolver por exemplo, os rins e a uretra, respetivamente (Koneman et al., 1997).
As infeções deste trato são frequentes em humanos e um dos tipos mais frequentes de infeção
nosocomial (Elliott and Justiz-vaillant, 2018: Fonseca et al., 2004: Murray et al., 2007). As infeções
urinárias agudas são normalmente provocadas por microrganismos da microbiota natural do ser
humano (Fonseca et al., 2004).
Para análise de urina, a colheita pode ser efetuada através de vários métodos como por
exemplo, a partir do jato médio da manhã por micção, por punção supra-púbica ou punção de cateter
urinário (Fonseca et al., 2004). As urinas podem chegar ao Setor de Microbiologia em frascos estéreis
de colheita de fluidos e líquidos biológicos ou já semeadas. Tendo como objetivo a deteção e estudo
do agente infecioso, a análise de urina é maioritariamente bacteriológica (urocultura). Esta perfaz
neste Setor, a grande maioria das análises efetuadas (Tabela 2), estando o seu procedimento descrito
abaixo na Figura 9. As urinas são ainda analisadas no equipamento ROCHE cobas® u601 e ROCHE
cobas® u701 (F. Hoffmann-La Roche AG Ltd., Basileia, Suíça) localizado no Setor de Bioquímica.
No caso de urinas cujos resultados sejam urgentes (pediatria), estas chegam já semeadas em meios
de cultura duplos Uriline (Figura 8), os quais possuem a vantagem de conter em simultâneo num só
suporte os meios de cultura CLED e MCK.
Figura 8: Meio de cultura duplo Uriline.
Figura 9: Procedimento para análise bacteriológica de urina. Adaptado de Fonseca et al., 2004.
Urina
Exame cultural
Sementeira em meio de cultura COS Sementeira em meio de cultura CLED
Incubação em aerobiose, a 37 ºC entre 18 a 24 horas
Observação dos meios de cultura
Identificação e TSA
17
Resultados
Durante a observação dos meios de cultura, além dos parâmetros e fatores gerais que são
avaliados, são ainda retiradas conclusões relativamente à concentração em Unidades Formadoras de
Colónias por mililitro (UFC/mL). A contagem de UFC/mL é feita de um modo presuntivo, avaliando
visualmente o meio de cultura. Os resultados de UFC/mL podem variar entre 103 UFC/mL e igual ou
superior a 105 UFC/mL, tendo em consideração o número de colónias presentes no meio de cultura
observado. Nesta contagem são valorizados essencialmente os resultados iguais ou superiores a 105
UFC/mL (Fonseca et al., 2004). Durante o período de estágio, o agente etiológico mais vezes
detetado e identificado na análise bacteriológica de urinas foi E. coli (Figura 12).
Os resultados obtidos no Setor de Microbiologia são inseridos e validados no sistema
informático do SML, sendo estes associados aos resultados obtidos nos equipamentos de avaliação
dos restantes parâmetros (Setor de Bioquímica). Nas Figuras 10, 11, 12 e 13 apresentadas abaixo, é
possível observar alguns resultados obtidos a partir de uroculturas.
Figura 10: Staphylococcus saprophyticus isolado a
partir de uma urocultura.
Figura 11: Proteus mirabilis isolado a partir de
uma urocultura.
Figura 12: E. coli isolada a partir de uma
urocultura.
Figura 13: Enterobacter cloacae isolado a partir de
uma urocultura.
18
3.4.2 Sangue
Sendo o sangue um líquido estéril, a presença e deteção de qualquer microrganismo
representa uma elevada importância clínica para a suspeita e identificação da origem de uma possível
infeção (Benito et al., 1990). A presença de microrganismos na corrente sanguínea tais como
bactérias (bacteriémia) é detetada através da realização de hemoculturas. O sangue é colhido
diretamente do utente por punção venosa periférica para os respetivos frascos de hemocultura. As
colheitas devem ser realizadas em localizações anatómicas diferentes (Fonseca et al., 2004).
No H.D.F.F., E.P.E., em condições normais, para hemoculturas de adultos, são realizadas
três colheitas para deteção de microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos e três colheitas para
deteção de microrganismos anaeróbios e facultativos. Em hemoculturas pediátricas, é realizada uma
colheita por cada utente para deteção de microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos. Após
incubação dos frascos de hemocultura, são realizadas análises microbiológicas para avaliação e
estudo do agente infecioso, em hemoculturas positivas. Na Figura 14 abaixo situada, é apresentado
o procedimento para análise bacteriológica de hemoculturas positivas.
Figura 14: Procedimento para análise bacteriológica de hemoculturas positivas. Adaptado de Fonseca et al.,
2004.
Hemocultura positiva
Exame cultural Exame direto
Frasco de hemocultura para deteção
de microrganismos aeróbios e
anaeróbios facultativos
Frasco de hemocultura para deteção
de microrganismos anaeróbios e
facultativos Esfregaço para
coloração Gram
Sementeira em meio de cultura COS Sementeira em meio de cultura COS
Incubação em aerobiose, a 37 ºC
durante 24 horas
Incubação em anaerobiose, a 37 ºC
durante 24 horas
Observação dos meios de cultura
Identificação e TSA Observação ao MOC
19
Resultados
Nas Figuras 15, 16 e 17 apresentadas abaixo, é possível observar alguns resultados de
hemoculturas positivas obtidas durante o período de estágio.
Figura 15: Streptococcus pyogenes isolado a partir de uma hemocultura positiva. Na Figura é possível
observar um disco do teste de suscetibilidade à bacitracina.
Figura 16: Acinetobacter baumannii isolado a partir
de uma hemocultura positiva.
Figura 17: S. agalactiae isolado a partir de uma
hemocultura positiva.
20
3.4.3 Líquido Cefalorraquidiano (LCR)
No caso de um doente com uma suspeita de infeção das meninges, é realizada uma punção
lombar para o estudo microbiológico dessa infeção. Aquando da colheita, a amostra a ser retirada
para análise microbiológica é preferencialmente a terceira por se entender que as probabilidades de
contaminação sejam menores (Fonseca et al., 2004). O LCR é entregue no Setor de Microbiologia
em pequenos frascos de colheita de vidro apropriados.
A análise efetuada ao LCR é maioritariamente bacteriológica, no entanto, pode ainda ser
requisitada uma avaliação citológica do mesmo em câmara de Fuchs-Rosenthal (Marienfeld Superior
GmbH & Co., Lauda-Königshofen, Alemanha), estando o procedimento para o processamento de
LCR apresentado abaixo na Figura 18.
Figura 18: Procedimento para análise bacteriológica e avaliação citológica de LCR. Adaptado de Fonseca et
al., 2004 e Gilhus et al., 2011.
Resultados
Na Figura 19 apresentada abaixo é possível observar algumas células do sistema imunitário
detetadas em LCR.
Figura 19: Observação de células mononucleares (A) e polimorfonucleares (B) durante uma avaliação
citológica de LCR. Ampliação: 10x40=400X.
LCR
Exame cultural Exame direto Exame citológico
Sementeira em
meio de cultura
COS
Sementeira
em meio de
cultura PVX
Sementeira em meio de
cultura VCAT3
(na suspeita de infeção
por Neisseria spp.) Esfregaço para
coloração Gram
Observação
microscópica do
LCR em câmara de
Fuchs-Rosenthal
Incubação em
aerobiose, a 37 ºC
durante 5 dias
Incubação em atmosfera rica em CO2,
a 37 ºC durante 5 dias
Observação dos meios de cultura
Identificação e TSA Observação ao
MOC
A
B
21
3.4.4 Expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados
broncoalveolares e aspirados pulmonares
A análise microbiológica dos produtos biológicos obtidos aquando do processo infecioso do
trato respiratório inferior é importante, pois permite averiguar as causas microbiológicas da infeção
em questão (Fonseca et al., 2004).
A estes produtos biológicos podem ser realizadas várias análises, tais como análises
bacteriológicas, micológicas e micobacteriológicas. Estes produtos biológicos são enviados
essencialmente pela área hospitalar de internamento, em recipientes próprios, sendo as expetorações,
os produtos biológicos mais frequentemente analisados no Setor de Microbiologia em relação aos
produtos biológicos do trato respiratório (Tabela 2).
a) Análise bacteriológica, micológica e recolha de amostra para análise micobacteriológica
Durante a realização da análise bacteriológica, é efetuado um exame direto envolvendo este,
um esfregaço para coloração pelo método de Gram e a sua posterior observação microscópica.
Relativamente às expetorações e secreções brônquicas, este exame direto permite a avaliação da
qualidade do produto biológico para análise. Deste modo, durante a realização da observação
microscópica, são avaliadas a quantidade de células epiteliais e também a quantidade de leucócitos
presentes (Fonseca et al., 2004).
Na Figura 20 abaixo situada, é apresentado o procedimento para análise bacteriológica,
micológica e recolha de amostra para análise micobacteriológica de expetorações, secreções
brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e aspirados pulmonares.
22
Figura 20: Procedimento para análise bacteriológica, micológica e recolha de amostra para análise
micobacteriológica de expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e
aspirados pulmonares. Adaptado de Fonseca et al., 2004.
Resultados
Nas Figuras 21 e 22 apresentadas abaixo, é possível observar alguns resultados obtidos na
análise bacteriológica de expetorações.
Figura 21: Colónias de S. aureus, isoladas a partir
da análise bacteriológica de uma expetoração.
Figura 22: Colónias de H. influenzae, isoladas a
partir da análise bacteriológica de uma expetoração.
Expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares
e aspirados pulmonares
Exame cultural Exame direto Análise micobacteriológica
Sementeira em meio de
cultura COS
Sementeira em meio
de cultura CAN2
Esfregaço para
coloração
Gram
Recolha de amostra do
produto biológico para um
tubo cônico e execução do
procedimento descrito na
página 23 posteriormente
Incubação em aerobiose, a 37 ºC
durante 24 horas
Observação dos meios de cultura
Repicagem das colónias
do meio de cultura COS
para meio de cultura PVX
na suspeita de
Haemophilus influenzae
Incubação em aerobiose, a
37 ºC durante 24 horas
Observação do meio de
cultura
Identificação e TSA Observação ao
MOC
23
b) Análise micobacteriológica
As micobactérias são bactérias pertencentes ao género Mycobacterium spp. Estes
microrganismos são imóveis, aeróbios obrigatórios e sem flagelo (Vega et al., 2005). O
Mycobacterium tuberculosis é das micobactérias que mais preocupação gera, uma vez que é
responsável pela doença crónica tuberculose, uma das doenças infeciosas mais letais a nível mundial,
transmitida por via aérea/inalatória (ex: tosse) (WHO, 2018a, 2018b).
Na Figura 23 abaixo situada, é apresentado o procedimento para a análise micobacteriológica
de expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e aspirados
pulmonares.
Figura 23: Procedimento para análise micobacteriológica de expetorações, secreções brônquicas, lavados
brônquicos, lavados broncoalveolares e aspirados pulmonares. Adaptado de Bula informativa dos frascos de
cultura, Stinson et al., 2014 e Vega et al., 2005.
Expetorações, secreções brônquicas, lavados brônquicos, lavados broncoalveolares e
aspirados pulmonares
Descontaminação com NaOH e homogeneização dos produtos biológicos (eliminação de
microrganismos contaminantes)
Exame cultural Exame direto
Sementeira em meio de cultura LJ Sementeira em frasco de cultura
BACT/ALERT® MP
Esfregaço para
coloração
Ziehl-Neelsen
Incubação em aerobiose, a 37 ºC
até 60 dias
Incubação no equipamento
BACT/ALERT® 3D até 42 dias
Observação do meio de cultura Frasco BACT/ALERT® MP positivo
Esfregaço a partir das colónias
observadas, para coloração
Ziehl-Neelsen e observação ao MOC
Esfregaço para coloração Ziehl-Neelsen
com posterior observação ao MOC e
sementeira em meio de cultura COS
Deteção e confirmação no Setor de
Biologia Molecular
(Página 54)
Incubação do meio de cultura COS em
aerobiose, a 37 ºC durante 18 a 24 horas
Observação do meio de cultura
Caso não haja desenvolvimento de
colónias no meio de cultura COS, é
realizada a deteção e confirmação no
Setor de Biologia Molecular (Página 54)
Observação ao
MOC
24
Resultados
O exame direto é realizado através da execução de um esfregaço, com posterior coloração
pelo método de Ziehl-Neelsen e respetiva observação microscópica. Este exame tem como objetivo
a deteção de Bacilos Ácido-Álcool Resistentes (BAAR), em especial as micobactérias, sendo estas
resistentes à descoloração. Esta resistência encontra-se associada a uma elevada concentração de
ácidos micólicos na sua parede celular. Uma vez realizada a coloração com fucsina, estas estruturas
impedem a descoloração com misturas de ácido-álcool. Os BAAR quando observadas ao MOC em
preparações/esfregaços corados pelo método de Ziehl-Neelsen, apresentam-se de cor vermelha,
finos, compridos e por vezes curvados (Vega et al., 2005; Stinson et al., 2014).
Durante o estágio, foi possível observar algumas lâminas com evidências da presença de
BAAR, como se pode observar abaixo na Figura 24.
Figura 24: Observação microscópica de BAAR, após coloração através do método de Ziehl-Neelsen.
Ampliação: 10x100=1000X.
25
3.4.5 Sémen
No Setor de Microbiologia, são realizadas análises ao sémen, de modo a avaliar a qualidade
e quantidade do mesmo. Esta análise é requisitada maioritariamente no seguimento da consulta de
fertilidade realizada no H.D.F.F., E.P.E.
Nesta análise são avaliados vários parâmetros qualitativos e quantitativos (Tabela 1),
incluindo uma contagem de espermatozoides (SPZ) em câmara de Neubauer (Marienfeld Superior
GmbH & Co., Lauda-Königshofen, Alemanha) (WHO, 2010).
Tabela 1: Parâmetros qualitativos e quantitativos avaliados na realização de um espermograma. Adaptado de
WHO, 2010.
Sémen
Parâmetros avaliados
à vista desarmada
Parâmetros avaliados por
observação microscópica
Observação microscópica em
câmara de Neubauer
Cor Avaliação presuntiva do
número de SPZ por campo
Contagem de SPZ Volume total Vitalidade
Viscosidade Mobilidade
Opacidade
pH Morfologia
Resultados
Após a preparação, são realizadas observações ao MOC em lâmina normal (Figura 25) e em
câmara de Neubauer (Figura 26), sendo avaliados os vários parâmetros por observação microscópica.
Figura 25: Observação microscópica a fresco de
sémen (em lâmina normal), aquando de uma análise
de sémen. Ampliação: 10x100=1000X.
Figura 26: Observação microscópica de sémen em
câmara de Neubauer, para contagem de SPZ.
26
3.4.6 Exsudado purulento superficial ou profundo e ponta de cateter
Um exsudado purulento pode ser superficial ou profundo e envolve uma colheita de pus de
uma ferida. Relativamente às feridas, estas podem ser fechadas ou abertas (Fonseca et al., 2004).
Estes produtos biológicos podem chegar ao Setor de Microbiologia em zaragatoas (no caso
de exsudados purulentos) ou em frascos de colheita de líquidos e fluidos biológicos (para os
exsudados purulentos ou pontas de cateter). Tendo em conta o tipo e a proveniência do produto
biológico, podem ser requisitadas análises para deteção e estudo de microrganismos aeróbios ou
anaeróbios que poderão estar na origem da infeção. A análise destes produtos é essencialmente
bacteriológica, estando o seu procedimento apresentado abaixo na Figura 27.
Figura 27: Procedimento para análise bacteriológica de exsudado purulento superficial ou profundo e ponta
de cateter. Adaptado de Fonseca et al., 2004.
Exsudado purulento superficial ou profundo e ponta de cateter
Exame cultural Exame direto
Sementeira em meio de
cultura COS
Sementeira em meio
de cultura COS
Sementeira em meio
de cultura SNVS Esfregaço para
coloração Gram
Incubação em aerobiose, a
37 ºC durante 18 a 24 horas
Incubação em anaerobiose, a 37 ºC
durante 18 a 24 horas
Observação dos meios de cultura
Identificação e TSA Observação ao MOC
27
Resultados
No processamento destes produtos biológicos, foram observados alguns casos positivos com
relevância, apresentados abaixo nas Figuras 28, 29 e 30.
Figura 28: Staphylococcus epidermidis isolado a partir de um cateter com suspeita de contaminação.
Figura 29: Enterococcus faecalis isolado a partir
de um exsudado purulento em zaragatoa.
Figura 30: Finegoldia magna isolada a partir de
um exsudado purulento líquido.
28
3.4.7 Fezes
Os exames e as análises efetuadas às fezes no Setor de Microbiologia são orientados para a
deteção e estudo de agentes etiológicos específicos causadores de doenças no trato gastrointestinal.
As fezes são entregues em frascos de colheita estéreis, sendo sugerido aos utentes colheitas de três
amostras em dias diferentes. Estes exames e análises podem envolver um exame macroscópico, um
exame microscópico direto, uma análise bacteriológica e uma análise parasitológica com exame
microscópico. Adicionalmente aos exames e análises referidas anteriormente, quando requisitado
podem ainda ser efetuadas pesquisas/testes rápidos imunocromatográficos e/ou imunoenzimáticos
(Fonseca et al., 2004). Estes últimos, são aplicados para rastreios e/ou deteção de agentes etiológicos
específicos:
• Pesquisa de Sangue Oculto (PSO);
• Pesquisa de Campylobacter spp.;
• Pesquisa de Clostridium difficile;
• Pesquisa de Rotavírus e Adenovírus;
• Pesquisa de Helicobacter pylori;
• Pesquisa de Cryptosporidium spp. e Giardia lamblia.
Os testes rápidos imunocromatográficos e imunoenzimáticos utilizados baseiam-se na
deteção de antigénios específicos nas amostras de fezes. Os resultados obtidos nestes testes são lidos
e interpretados tendo em consideração a presença ou ausência de determinadas bandas de cor nas
linhas de teste (Bulas informativas dos Kits). Os resultados obtidos nestes testes podem ser
posteriormente comparados com os resultados obtidos nas restantes análises, caso estas tenham sido
efetuadas, conferindo um diagnóstico mais exato.
a) Exame macroscópico das fezes
Neste exame é tido em conta o aspeto macroscópico das fezes. É realizada a observação da
presença de parasitas, presença de sangue, avaliação da sua cor e determinação do aspeto
diarreico/líquido ou sólido das mesmas.
b) Exame microscópico direto das fezes
Com o objetivo de pesquisar e detetar leucócitos em fezes, pode ser efetuada quando
requisitada, uma preparação a fresco para exame microscópico direto de amostras de fezes.
29
c) Fezes - coprocultura
A análise bacteriológica de fezes no Setor de Microbiologia é orientada para a deteção e
estudo de microrganismos que infetam o trato gastrointestinal, tais como Salmonella spp. (Figura
32), Shigella spp., Yersinia enterocolitica, e Campylobacter spp. Alguns dos sintomas mais comuns
em caso de infeção (sintomática) provocada por estes agentes etiológicos são diarreia, dores
abdominais e febre (Fonseca et al., 2004; Murray et al., 2007). Esta análise envolve uma sementeira
em vários meios de cultura diferentes e um meio de enriquecimento. Abaixo na Figura 31, é
apresentado o procedimento para análise bacteriológica de fezes.
Figura 31: Procedimento para análise bacteriológica de fezes. Adaptado de Fonseca et al., 2004.
Resultados
Durante o período de estágio foi possível observar um isolamento de Salmonella enteritidis
a partir de uma amostra de fezes, tal como se pode observar abaixo na Figura 32.
Figura 32: S. enteritidis obtida a partir da análise bacteriológica de fezes.
Fezes
Exame cultural (para cada frasco)
Sementeira em
meio de cultura SS
Sementeira em meio de
cultura SALM
Sementeira em meio
de cultura MCK
Sementeira em meio de
enriquecimento Selenite F
Incubação em aerobiose, a 37 ºC durante 12 a 24 horas
Repicagem do meio
Selenite F para um meio
de cultura SS, um meio de
cultura SALM e um meio
de cultura MCK
Incubação em aerobiose, a
37 ºC durante 12 a
24 horas
Observação dos meios de cultura
Identificação e TSA caso sejam observadas colónias suspeitas
Testes serológicos de aglutinação somáticos e flagelares na presença de colónias de Salmonella spp. ou
Shigella spp.
30
d) Análise parasitológica com exame microscópico
A análise parasitológica com exame microscópico tem como principal objetivo a deteção e
identificação presuntiva visual de parasitas nas fezes, através da observação microscópica dos
próprios parasitas, fragmentos e/ou de algumas das suas estruturas, como é possível observar abaixo
na Figura 34 e Figura 35. Para ser executada uma observação microscópica é necessário realizar um
enriquecimento/recuperação inicial e posterior concentração, sendo aplicado um método baseado no
princípio da sedimentação, no qual é utilizado o Kit Concentration System (BioRépair GmbH,
Sinsheim, Alemanha). Na Figura 33 abaixo situada, é apresentado o procedimento para análise
parasitológica com exame microscópico aplicado em amostras de fezes (Bula informativa do Kit;
Forbes et al., 2007).
Figura 33: Procedimento para análise parasitológica com exame microscópico em fezes. Adaptado de Bula
informativa do Kit e Forbes et al., 2007.
Resultados
Nas Figuras 34 e 35 apresentadas abaixo é possível observar alguns resultados obtidos
durante o período de estágio, onde foram observadas algumas estruturas de parasitas.
Figura 34: Observação microscópica de um ovo de
Enterobius vermicularis. Ampliação: 10x40=400X.
Figura 35: Figura onde é possível observar um
cisto de Giardia lamblia. Ampliação: 10x40=400X.
Fezes
Enriquecimento parasitológico das fezes
Concentração das fezes por centrifugação
Suspensão do sedimento
Preparação a fresco para observação ao MOC
31
e) Pesquisa de Sangue Oculto (PSO)
A PSO é um teste de rastreio laboratorial que permite detetar a presença de vestígios de
sangue em fezes, por exemplo através da deteção de hemoglobina. Por meio destes testes é possível
detetar vestígios de sangue provenientes, por exemplo, de adenomas e lesões cancerígenas que
sangram e que possam estar presentes no cólon (Benton et al., 2015; Bula informativa do Kit).
No Setor de Microbiologia, a PSO nas fezes é feita através da aplicação do teste rápido
imunocromatográfico One-step Diagnostic Test FOB (Chemtrue®, Chemtron Biotech Co., Ltd.,
Shanghai, China), o qual é utilizado para deteção de hemoglobina do sangue em fezes (Bula
informativa do Kit).
Resultados
Durante o período de estágio, foi possível observar um resultado positivo para PSO. Na
Figura 36 abaixo apresentada, é possível visualizar duas bandas, ou seja, o teste é positivo e válido
para a presença de hemoglobina nas fezes (Bula informativa do Kit).
Figura 36: Teste rápido imunocromatográfico One-step Diagnostic Test FOB, positivo e válido.
32
f) Pesquisa de Campylobacter spp.
A infeção por bactérias de Gram-negativo Campylobacter spp. pode originar gastroenterites,
apresentando sintomas como diarreia, dores abdominais e febre alta (Murray et al., 2007).
Para esta pesquisa, é aplicado o teste rápido imunocromatográfico RIDA®QUICK
Campylobacter (R-Biopharm® AG, Darmstadt, Alemanha). Caso seja obtido um teste rápido positivo
(Figura 37), as fezes em causa são semeadas em meio de cultura CCDA para confirmação (Figura
38). O meio CCDA semeado é colocado em incubação em ambiente de microaerofilia dentro de uma
jarra, durante dois dias. Posteriormente é realizada a confirmação através do estudo das colónias,
sendo efetuada a identificação e TSA (Fonseca et al., 2004).
Resultados
Para o teste ser considerado positivo, deverá aparecer uma banda na linha de teste “T”, sendo
o resultado obtido, validado pela presença de uma banda na linha de Controlo “C”, como apresentado
abaixo na Figura 37 (Bula informativa do Kit). Na Figura 38 é possível observar colónias de
Campylobacter spp.
Figura 37: Teste rápido imunocromatográfico RIDA® QUICK Campylobacter, positivo e válido.
Figura 38: Figura onde é possível observar a presença de colónias com um aspeto metálico, sendo estas
formadas por Campylobacter spp.
33
g) Pesquisa de Clostridium difficile
Os fatores que levam à colonização pelo bacilo de Gram-positivo comensal C. difficile
podem ser vários, como por exemplo a antibioterapia e hospitalização. Estirpes toxigénicas de C.
difficile são capazes de produzir toxinas, sendo estas a toxina A e a toxina B. A colonização por C.
difficile pode causar uma grave diarreia no hospedeiro, no entanto podem ainda ocorrer colites
pseudomembranosas aquando da infeção (Loo et al., 2011; Murray et al., 2007).
Para a deteção rápida de C. difficile em amostras de fezes, é aplicado o teste rápido
imunoenzimático TECHLAB® C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE® (TECHLAB® Inc., Blacksburg,
Estados Unidos da América).
Resultados
Através deste teste, é possível detetar a presença de Glutamato-Desidrogenase (GDH) como
também a presença das toxinas A e B de C. difficile. Na leitura dos resultados, para o teste ser válido,
terá sempre que existir cerca de quatro pontos no centro da “Janela de Reação” do teste, estando
estes em linha com a letra “C” (Figura 39). Na mesma janela, para o teste ser positivo para a presença
de GDH de C. difficile, terá de existir uma banda de cor na lateral esquerda da mesma, ou seja, em
paralelo com as letras “Ag” (Figura 40). Para que o teste seja positivo para a presença das toxinas A
e B de C. difficile, terá de existir uma banda de cor na lateral direita da janela, ou seja, em paralelo
com as letras “Tox” (Bula informativa do Kit; TECHLAB® Inc., 2018).
Figura 39: Teste rápido imunoenzimático
TECHLAB® C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE®,
com resultado negativo e válido.
Figura 40: Teste rápido imunoenzimático
TECHLAB® C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE®,
positivo e válido para GDH.
34
h) Pesquisa de Rotavírus e Adenovírus
As infeções causadas pelos agentes etiológicos virais Rotavírus e Adenovírus estão muitas
vezes associadas a episódios de gastroenterites virais agudas em crianças, cujos principais sintomas
são diarreia (Murray et al., 2007).
A pesquisa de Rotavírus e Adenovírus é realizada através da aplicação do teste rápido
imunocromatográfico bioNexia® Rota-Adeno (bioMérieux S.A., Marcy-l'Étoile, França).
Resultados
Na Figura 41, é possível observar um teste para deteção de Rotavírus e Adenovírus, positivo
para Rotavírus, uma vez que é observada uma banda verde na linha de teste “R”. Este resultado é
validado pela presença de uma banda na linha de controlo “C”. Caso fosse positivo para Adenovírus,
observar-se-ia uma banda vermelha na linha de teste “A” (Bula informativa do Kit).
Figura 41: Teste rápido imunocromatográfico bioNexia® Rota-Adeno, positivo e válido para Rotavírus.
35
i) Pesquisa de Helicobacter pylori
A H. pylori é uma bactéria de Gram-negativa, em forma de espiral ou curva, capaz de
colonizar a mucosa gástrica e intestinal humana, estando a infeção por H. pylori associada a quadros
clínicos de úlcera péptica, carcinoma gástrico e gastrite crónica (Murray et al., 2007; Sipponen et al.,
1992; Uemura et al., 2001).
A pesquisa de H. pylori nas fezes, é realizada também através da aplicação de um teste rápido
imunocromatográfico, sendo este o Pylori-strip, H. pylori diagnostic (Coris Bioconcept, Gembloux,
Bélgica).
Resultados
Para que o teste seja positivo e válido, a fita de teste terá de apresentar uma banda de controlo
de tonalidade verde (fornecendo esta validação ao teste) e em simultâneo uma banda vermelha abaixo
(Figura 42). Caso a banda vermelha não esteja presente, o teste é válido, no entanto considerado
negativo (Bula informativa do Kit; Coris BioConcept, 2012b).
Figura 42: Teste rápido imunocromatográfico Pylori-strip H. pylori diagnostic, positivo e válido.
36
j) Pesquisa de Cryptosporidium spp. e Giardia lamblia
Cryptosporidium spp. e G. lamblia são dois géneros de protozoários parasitas com
capacidade de causar criptosporidíase e giardíase no hospedeiro, respetivamente. Aquando da
infeção, estes protozoários podem causar diarreia no hospedeiro. Estas infeções podem tornar-se
ainda mais graves em indivíduos imunocomprometidos. A sua transmissão pode ocorrer por via
fecal-oral, como por exemplo, através da ingestão de alimentos e água contaminados (Cacciò et al.,
2005; Murray et al., 2007).
A pesquisa de Cryptosporidium spp. e G. lamblia nas fezes, é realizada através da aplicação
de um teste rápido imunocromatográfico, sendo este o Crypto/Giardia Duo-Strip (Coris Bioconcept,
Gembloux, Bélgica).
Resultados
Para o teste ser considerado positivo e válido para Cryptosporidium spp. e G. lamblia, é
necessário que se desenvolvam três bandas de cor em simultâneo. A primeira banda fornece
validação ao teste (Controlo), a segunda banda é um sinal de positividade para Cryptosporidium spp.
e a terceira banda é um sinal de positividade para G. lamblia. Caso seja produzida apenas a banda
controlo o teste é considerado válido, mas negativo (Figura 43) (Bula informativa do Kit; Coris
BioConcept 2012a).
Figura 43: Teste rápido imunocromatográfico Crypto/Giardia Duo-Strip, negativo e válido.
37
k) Zaragatoa retal - Fezes
As EPC são um grave problema de saúde pública emergente em vários países, estando as
infeções por estas bactérias associadas a uma elevada morbilidade, mortalidade, como também ao
aumento de gastos por parte dos hospitais (ECDC, 2011). Estas bactérias, como por exemplo as KPC,
são normalmente resistentes a vários antimicrobianos, sendo muitas vezes suscetíveis apenas a
antibióticos de última linha (Munoz-price et al., 2013; PPCIRA, 2017).
O programa de vigilância de EPC aplicado no H.D.F.F., E.P.E., envolve a execução de
análises bacteriológicas a zaragatoas retais - fezes, cujo objetivo é prevenir a ocorrência de infeções
hospitalares relacionadas com EPC. Esta análise é efetuada com frequência no Setor de
Microbiologia (Tabela 2).
Na Figura 44 abaixo situada, é apresentado o procedimento para análise bacteriológica de
zaragatoas retais - fezes.
Figura 44: Procedimento para análise bacteriológica de zaragatoas retais – fezes. Adaptado de Fonseca et al.,
2004 e PPCIRA, 2017.
Zaragatoa retal - Fezes
Exame cultural
Sementeira em meio de cultura CARB/OXA
Incubação em aerobiose, a 37 ºC durante 18 a 24 horas
Observação do meio de cultura
Na presença de colónias com características específicas, estas são repicadas para meio de cultura COS
Incubação em aerobiose, a 37 ºC durante 18 a 24 horas
Observação do meio de cultura
Identificação e TSA
38
Resultados
Na Figura 45 é possível observar colónias com suspeita de serem formadas por KPC, tendo
sido estas repicadas e isoladas para posterior estudo de identificação e TSA (Figura 46).
Figura 45: Colónias com suspeita de serem
formadas por KPC (colónias à esquerda).
Figura 46: Repicagem de colónias com suspeita de
serem formadas por KPC (Figura 45), para
posterior identificação e TSA.
39
3.4.8 Exsudado vaginal e/ou anal
A microbiota vaginal é diversificada, podendo esta variar por várias razões tais como o
período do ciclo menstrual e a atividade sexual (Gajer et al., 2012). Esta microbiota é constituída por
vários géneros de microrganismos, mas principalmente por Lactobacillus spp. (Gajer et al., 2012;
Ravel et al., 2010). A presença desta microbiota fornece proteção contra o estabelecimento de outros
microrganismos (Martín et al., 2008), no entanto, poderá ocorrer uma infeção, podendo esta ser
protagonizada por microrganismos da própria microbiota (endógenos) (Fonseca et al., 2004). São
enviadas para o Setor de Microbiologia zaragatoas vaginais para análise, com o objetivo de deteção
e estudo do agente causador da infeção. A análise de zaragatoas vaginais pode ser bacteriológica ou
micológica (Figura 48).
Dentro deste tipo de produtos biológicos, também podem ser enviadas para o Setor,
zaragatoas vaginais e anais para uma análise bacteriológica apenas para rastreio de S. agalactiae,
como apresentado abaixo na Figura 49. A colonização por S. agalactiae no aparelho genital materno,
pode provocar graves problemas e sequelas ao feto, tais como sépsis, meningite e pneumonia, sendo
executado o seu rastreio em mulheres grávidas (Fonseca et al., 2004; Murray et al., 2007).
Na Figura 47 abaixo situada, é apresentado o procedimento para análise bacteriológica e
micológica de zaragatoas vaginais e/ou anais.
Figura 47: Procedimento para análise bacteriológica e micológica de zaragatoas vaginais e/ou anais.
Adaptado de Fonseca et al., 2004.
Zaragatoa vaginal e/ou anal
Exame cultural
Sementeira em
meio de cultura
COS
Sementeira em
meio de cultura
CAN2
Sementeira em
meio de cultura
GRAN
Sementeira em meio
de cultura PVX
Incubação em anaerobiose, a 37 ºC
durante 24 horas
Incubação em atmosfera rica em
CO2, a 37 ºC durante 24 horas
Observação dos meios de cultura
Identificação e TSA
40
Resultados
Durante o período de estágio, foram observados isolamentos de alguns fungos (Figura 48)
na análise micológica de zaragatoas vaginais. Foram também observados alguns resultados positivos,
relativamente a análises bacteriológicas de zaragatoas vaginais e anais, para o rastreio de S.
agalactiae (Figura 49).
Figura 48: Colónias de Candida glabrata obtidas a
partir de uma zaragatoa vaginal, após análise
micológica e repicagem para meio de cultura COS.
Figura 49: Colónias de S. agalactiae isoladas após
análise bacteriológica de uma zaragatoa vaginal
enviada para rastreio de S. agalactiae.
41
3.4.9 Fragmentos de unhas, fragmentos de pele e cabelos
Certos fungos possuem a capacidade de se desenvolver e infetar tecidos com queratina (como
por exemplo a pele, unhas e cabelo), tais como os géneros anamórficos Trichophyton, Microsporum
e Epidermophyton, levando a micoses superficiais/dermatofitoses. Geralmente, a transmissão destes
fungos dermatófitos queratinofílicos ocorre através de conídios, disseminados por várias vias, como
por exemplo, através do contacto de pele com pele ou por fomites. Existem ainda fungos dermatófitos
teleomórficos, como é o caso do género Arthroderma (Murray et al., 2007).
A colheita de fragmentos de unhas, fragmentos de pele e cabelos (em caso de infeção), é
feita pelos técnicos do Setor de Microbiologia, no entanto, podem ser enviados produtos biológicos
pelo Serviço de Dermatologia do hospital. Estes produtos biológicos podem também chegar já
semeados em meios de cultura duplos Mycoline.
Com o objetivo de detetar o possível fungo dermatófito causador da infeção, a análise
efetuada a estes produtos biológicos é micológica, estando abaixo apresentado o seu procedimento
na Figura 50. Sempre que é requisitada esta análise, é executado um exame direto do próprio produto
biológico para a rápida deteção do fungo, sendo também executado um exame cultural. Após o
crescimento do fungo no meio de cultura, é efetuada a sua observação macroscópica e microscópica.
Quando necessário, é ainda realizada a identificação presuntiva visual do fungo tendo em
consideração as suas características (Forbes et al., 2007; Hainer, 2003).
Figura 50: Procedimento para análise micológica de fragmentos de unhas, fragmentos de pele e cabelos.
Adaptado de Forbes et al., 2007 e Hainer, 2003.
Fragmentos de unhas, fragmentos de pele e cabelos
Exame cultural Exame direto
Sementeira em meio de cultura SGC2
Preparação a fresco com
KOH e observação ao
MOC
Incubação à temperatura ambiente durante vários dias
Observação do meio de cultura e análise macroscópica do fungo
Preparação a fresco com azul de lactofenol e observação ao MOC das
estruturas fúngicas
42
Resultados
Durante o período de estágio foram obtidos vários isolamentos de fungos dermatófitos, com
mais frequência o dermatófito Microsporum canis. Nas Figuras 51 e 52 é possível observar o seu
aspeto em cultura. Na Figura 53 é possível observar as suas estruturas de reprodução.
Figura 51: Dermatófito M. canis isolado a partir de
fragmentos de pele (frente).
Figura 52: Dermatófito M. canis isolado a partir de
fragmentos de pele (verso).
Figura 53: Observação microscópica do dermatófito M. canis, sendo observado na Figura algumas
estruturas (macroconídios) deste. Ampliação: 10x40=400X.
43
3.5 Testes de avaliação presuntiva
Os testes de avaliação presuntiva são efetuados, quando necessários, para uma melhor
orientação das cartas a utilizar posteriormente no estudo de identificação e TSA. Estes testes
fornecem informações de primeira linha para os procedimentos a adotar. Os testes de avaliação
presuntiva não substituem de forma alguma a identificação e TSA, que são efetuados através do
equipamento VITEK® 2 Compact.
3.5.1 Teste de suscetibilidade à bacitracina
O teste de suscetibilidade à bacitracina é realizado com o objetivo da identificação presuntiva
de Streptococcus β-hemolítico do grupo A de Lancefield (S. pyogenes) apresentado abaixo na Figura
54 (Fonseca et al., 2004).
É realizada inicialmente uma repicagem da cultura primária para um novo meio de cultura
COS, sendo posteriormente adicionando um disco de bacitracina (Bio-Rad, Hercules, Califórnia,
Estados Unidos da América) sobre a sementeira. Após incubação do meio de cultura semeado, caso
seja observado um halo de inibição em volta do disco de bacitracina (Figura 54), este resultado é
considerado positivo para a identificação presuntiva de S. pyogenes, uma vez que este é suscetível à
bacitracina (Fonseca et al., 2004).
Figura 54: Teste de suscetibilidade à bacitracina positivo para S. pyogenes, sendo observado um halo de
inibição em volta do disco de bacitracina.
3.5.2 Teste de suscetibilidade à optoquina
O teste de suscetibilidade à optoquina é realizado para identificação presuntiva de S.
pneumoniae (Fonseca et al., 2004).
Inicialmente é realizada uma repicagem em meio de cultura COS a partir de uma amostra
retirada das colónias da cultura primária. Posteriormente, é colocado um disco de optoquina (Bio-
Rad, Hercules, Califórnia, Estados Unidos da América) sobre a sementeira realizada no novo meio
de cultura. Após incubação do meio de cultura semeado, caso seja observado um halo de inibição em
volta do disco de optoquina, este resultado é considerado positivo para a identificação presuntiva de
S. pneumoniae, uma vez que este é suscetível à optoquina (Fonseca et al., 2004).
44
3.5.3 Teste da catalase, coagulase e esculina-bílis
Os testes da catalase, da coagulase e da esculina-bílis realizados no Setor de Microbiologia,
têm como principal objetivo a diferenciação/distinção de cocos. Com base na Figura 57 abaixo
apresentada, é possível compreender em que ordem são realizados estes testes no Setor de
Microbiologia.
O teste da catalase é efetuado com o principal objetivo de distinguir os microrganismos
produtores da enzima catalase como Staphylococcus spp. (catalase positiva) dos não produtores de
catalase como Streptococcus spp. (catalase negativa). No teste da catalase é utilizado peróxido de
hidrogénio, que na presença da enzima catalase, é hidrolisado, libertando água e oxigénio, formando
bolhas (resultado positivo) (Fonseca et al., 2004).
O teste da coagulase é executado às colónias do meio de cultura cujo teste da catalase foi
positivo, com o objetivo de se averiguar a presença de microrganismos produtores de coagulase,
como por exemplo, o S. aureus (coagulase positivo). Neste teste é utilizado o Kit PASTOREXTM
STAPH PLUS (Bio-Rad, Hercules, Califórnia, Estados Unidos da América), o qual é aplicado para
a deteção conjunta do fator de afinidade ao fibrinogénio ou “fator clumping”, Proteína A e
polissacarídeos capsulares de S. aureus. Aquando da execução do teste, caso sejam formadas e
observadas aglutinações macroscópicas (Figura 55), este resultado é avaliado como positivo para a
identificação presuntiva de S. aureus (Bula informativa do Kit; Fonseca et al., 2004).
Figura 55: Teste da coagulase positivo. Suspeita de S. aureus.
Caso seja obtido um resultado negativo para um teste da catalase, é realizada uma repicagem
das colónias testadas para um meio de cultura DCO para identificação presuntiva de Enterococcus
spp. ou Streptococcus do Grupo D de Lancefield, sendo este incubado posteriormente. Caso seja
observada uma tonalidade escura do meio de cultura após incubação (Figura 56), este resultado é
avaliado como positivo para a identificação presuntiva de Enterococcus spp. ou Streptococcus do
Grupo D de Lancefield (bioMérieux, 2019h; Murray et al., 2007).
45
Figura 56: Colónias com suspeita de serem formadas por Enterococcus spp. O meio apresenta uma mudança
de cor, ficando com uma tonalidade bastante escura.
Figura 57: Figura onde é possível observar a ordem de realização dos testes da catalase, da coagulase e da
esculina-bílis no Setor de Microbiologia.
3.5.4 Teste da oxidase
No Setor de Microbiologia, o teste da oxidase é efetuado para distinguir Pseudomonas spp.
e diplococos de Gram-negativo (como por exemplo N. gonorrhoeae) que são oxidase positiva, de
outras bactérias, como por exemplo enterobactérias que são oxidase negativa. Neste teste, ocorre a
oxidação de um reagente (corante), quando estão presentes bactérias oxidase positiva, originando
uma variação de cor na tira de teste. Caso seja observada a variação de cor, este resultado é avaliado
como positivo (Fonseca et al., 2004).
Meio de cultura com suspeita de colónias formadas por cocos
Teste da catalase
Teste da catalase negativo
(ausência da produção de bolhas)
Teste da catalase positivo – Elevada
probabilidade de se tratar de Staphylococcus spp.
Repicagem da cultura primária
para um meio de cultura DCO Teste da coagulase
Desenvolvimento de
cor escura – Elevada
probabilidade
de se tratar de
Enterococcus spp. ou
Streptococcus do
Grupo D
Sem desenvolvimento
de cor escura – Elevada
probabilidade
de não se tratar de
Enterococcus spp. ou
Streptococcus do
Grupo D
Teste da coagulase
positivo – Elevada
probabilidade de se
tratar de S. aureus
Teste da coagulase
negativo – Elevada
probabilidade de não se
tratar de S. aureus
46
3.6 Controlos da Qualidade do Setor de Microbiologia
Para que sejam asseguradas a exatidão, reprodutibilidade e fiabilidade dos processos de
identificação, TSA e técnicas adjacentes, o Setor de Microbiologia do SML, no H.D.F.F., E.P.E. tem
implementados um controlo interno e um controlo externo da qualidade.
3.6.1 Controlo Interno da Qualidade
O controlo interno da qualidade, envolve a avaliação diária da esterilidade da solução salina
utilizada na realização das suspensões microbianas aquando das identificações e TSA efetuadas
através do VITEK® 2 Compact.
O controlo interno da qualidade envolve ainda a execução semanal de estudos de
identificação e TSA de estirpes padrão conhecidas American Type Culture Collection (ATCC®,
Virgínia, Estados Unidos da América) para a avaliação do correto funcionamento e desempenho das
cartas VITEK® 2 e também do próprio VITEK® 2 Compact. São utlizados quatro tipos de discos,
sendo dois deles para estudo de identificação e TSA de cocos (Staphylococcus spp. e Enterococcus
spp.) e outros dois para estudo de identificação e TSA de bacilos (P. aeruginosa e E. coli).
3.6.2 Controlo Externo da Qualidade
O Setor de Microbiologia está inserido num programa de controlo externo da qualidade, o
United Kingdom National External Quality Assessment Service, Sheffield, Londres, Reino Unido
(UK NEQAS), para a bacteriologia e parasitologia.
Relativamente à bacteriologia, são recebidos diversos exercícios anualmente com várias
amostras. Parte destas amostras são aplicadas para identificação, enquanto que, outra parte é aplicada
para a realização de identificação e TSA. Para a parasitologia são recebidos diversos exercícios
anualmente para a pesquisa e deteção de parasitas.
Cada envio traz consigo toda a informação relevante e necessária. Após execução dos
procedimentos e obtenção dos resultados, estes são inseridos online.
47
3.7 Dados relativos aos produtos biológicos processados no Setor de Microbiologia
A recolha de dados apresentada abaixo na Tabela 2 corresponde ao período de 1 de janeiro
de 2018 a 31 de dezembro de 2018. Os dados apresentados correspondem aos produtos biológicos
que perfazem a grande maioria das análises laboratoriais efetuadas no Setor de Microbiologia. Estão
ainda assinaladas as análises mais efetuadas, no entanto não está incluída a totalidade de análises e
tipos de produtos biológicos.
Tabela 2: Tabela com os dados relativos ao número total de análises de alguns produtos biológicos
processados no ano de 2018.
Produtos biológicos e análises Número total de produtos
processados
Urinas - Uroculturas 5665
Sangue - Hemoculturas 346
LCR - Análise bacteriológica 33
LCR - Análise micológica 7
Expetorações - Análise bacteriológica 1467
Expetorações - Análise micológica 116
Expetorações - Análise micobacteriológica 567
Secreções brônquicas - Análise bacteriológica 95
Secreções brônquicas - Análise micológica 3
Secreções brônquicas - Análise micobacteriológica 30
Aspirados pulmonares - Análise bacteriológica 59
Aspirados pulmonares - Análise micológica 57
Aspirados pulmonares - Análise micobacteriológica 57
Lavados brônquicos - Análise bacteriológica 36
Lavados brônquicos - Análise micológica 35
Lavados brônquicos - Análise micobacteriológica 36
Lavados broncoalveolares - Análise bacteriológica 25
Lavados broncoalveolares - Análise micológica 25
Espermogramas 12
Exsudados purulentos - Análise bacteriológica 352
Fezes - Coproculturas 272
Zaragatoas retais - fezes - Pesquisa de EPC 2916
48
4. Setor de Biologia Molecular
O Setor de Biologia Molecular do SML apresenta três áreas de trabalho, sendo estas:
a) Área de receção, tratamento e extração;
b) Área de pré-amplificação, onde são realizadas as misturas para a amplificação;
c) Área de pós-amplificação.
Este Setor recebe vários tipos de produtos biológicos, principalmente:
• Sangue colhido para tubos com Ácido Etilenodiaminotetracético (EDTA);
• Células em suspensão em meio de transporte e conservação líquido;
• Zaragatoas da nasofaringe em meio de transporte e conservação líquido.
Os produtos biológicos chegados ao Setor de Biologia Molecular, são triados e integrados
pelo mesmo método realizado para os produtos biológicos para análise no Setor de Microbiologia.
No Setor de Biologia Molecular, o método de trabalho inclui sempre o respeito das normas
gerais de um laboratório de Biologia Molecular, tendo em conta o facto da existência de DNAses e
RNAses na generalidade do material biológico, como também as probabilidades de contaminações
cruzadas. O Setor de Biologia Molecular tem também definidas as condições de conservação dos
vários produtos biológicos, dos vários reagentes e dos materiais a utilizar. O sangue colhido em
EDTA e após centrifugação (plasma) é mantido a -20 ºC. Produtos biológicos como zaragatoas da
nasofaringe e células em suspensão, são mantidos a uma temperatura de 2 a 8 ºC no máximo durante
48 horas. Os eluídos (após extração) para amplificação são mantidos a -20 ºC.
4.1 Extração
O processo de extração é o primeiro passo a ser realizado no Setor de Biologia Molecular. A
execução da extração é de elevada importância para os processos seguintes. A extração efetuada
neste Setor é automatizada, diminuindo consideravelmente os riscos de contaminação da amostra e
do próprio operador e diminuindo também o tempo necessário à execução deste processo.
O equipamento de extração automática utilizado é o QIAGEN® EZ1® Advanced (QIAGEN®,
GmbH, Hilden, Alemanha) apresentado abaixo na Figura 58. Este equipamento tem capacidade de
extração de seis amostras por cada processo de extração. Através deste equipamento juntamente com
o Kit de extração utilizado, podem ser extraídos Ácidos Desoxirribonucleicos (DNA) e Ácidos
Ribonucleicos (RNA) de vírus e DNA de bactérias, de vários tipos de produtos biológicos. O
processo de extração de DNA/RNA dos vários agentes etiológicos envolve quatro principais passos.
Em primeiro lugar, é realizada uma lise com enzimas específicas, temperatura elevada e solução de
lise, libertando os ácidos nucleicos. Em segundo lugar, ocorre a ligação dos ácidos nucleicos
extraídos a partículas magnéticas. Em terceiro lugar, é realizada uma lavagem dos ácidos nucleicos
para certificação de que não ficam retidas impurezas. Por último, é efetuada uma eluição dos ácidos
49
nucleicos para um volume de solução tampão previamente selecionado (Manual informativo do
equipamento).
Figura 58: Equipamento de extração automática QIAGEN® EZ1® Advanced.
4.2 Amplificação
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma reação in vitro que consiste na amplificação
enzimática de sequências (alvo) de DNA específicas (Murray et al., 2007). No Setor de Biologia
Molecular são amplificadas sequências de ácidos nucleicos de vírus ou bactérias causadoras de
infeções, sendo utilizados dois termocicladores diferentes.
a) Rotor-Gene 3000TM (Corbett Research Ltd., Sydney, Austrália)
No Setor de Biologia Molecular, o termociclador Rotor-Gene 3000TM apresentado abaixo na
Figura 59, é utilizado para a amplificação, deteção e quantificação de sequências de ácidos nucleicos
de vários agentes etiológicos. Para tal, é realizada uma PCR em tempo real com Transcrição Reversa
(RT-qPCR) para agentes etiológicos com genoma de RNA ou uma PCR em tempo real (qPCR) para
agentes etiológicos com genoma de DNA. Uma vez que, estas reações são realizadas em tempo real,
aquando da amplificação de sequências de ácidos nucleicos, é produzida fluorescência, sendo esta
detetada e convertida em valores Ct, gerando uma curva que pode ser observada durante o período
em que decorre a reação (Bula informativa do equipamento; Murray et al., 2007).
Este equipamento permite utilizar a metodologia multiplex para as reações anteriormente
mencionadas. Para tal, este equipamento está capacitado com quatro fontes de luz e quatro canais de
leitura diferentes. Deste modo, podem ser detetados vários agentes etiológicos de uma amostra, numa
só corrida e num único tubo de PCR (Bula informativa do equipamento).
50
Figura 59: Termociclador Rotor-Gene 3000TM.
Após o processo de amplificação, na análise de resultados são analisadas as amplificações
geradas após cada corrida para cada análise e pesquisa de vários agentes etiológicos. São também
analisadas a presença ou ausência de amplificações dos Controlos Positivos, Negativos e Controlos
Internos, de modo a avaliar a qualidade da amostra, possíveis inibições e fiabilidade dos resultados
obtidos (Murray et al., 2007).
b) Px2 Thermal Cycler® (Thermo Electron Corporation, Waltham, Estados Unidos da
América)
Termociclador utilizado para a execução de amplificação por PCR multiplex na análise e
deteção do Complexo M. tuberculosis e genes de resistência.
51
4.3 Deteção e genotipagem do Vírus do Papiloma Humano (VPH)
O VPH é um vírus, em que alguns dos seus genótipos estão associados a infeções e doenças
graves, como por exemplo lesões cutâneas e cancro. Este vírus contém um genoma circular de DNA
em cadeia dupla e pertence à família Papillomaviridae. As doenças geradas por vários genótipos de
VPH são doenças sexualmente transmissíveis, podendo afetar tanto o homem como a mulher.
Particularmente, no ser humano feminino pode causar por exemplo, cancro do colo do útero (Doorbar
et al., 2016; Murray et al., 2007).
Existem vários genótipos de VPH descritos com diferentes graus de risco associado (Doorbar
et al., 2016; Murray et al., 2007). No Setor de Biologia Molecular são avaliados catorze genótipos
com um risco elevado associados ao cancro do colo do útero, sendo estes o 16, 18, 31, 33, 35, 39,
45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68. Para a realização desta análise, os produtos biológicos que chegam ao
Setor de Biologia Molecular são células do colo do útero em meio de transporte e conservação
adequado LBC solution - Cellprep® (BioDyne Co., Ltd., Gyeonggi-do, República da Coreia). A
grande maioria destes produtos biológicos são enviados pela consulta externa de ginecologia.
No Setor de Biologia Molecular, para a deteção e genotipagem de VPH, é realizada em
primeiro lugar uma extração a partir de amostras dos produtos biológicos (células do colo do útero
em suspensão). Após a extração, é realizada uma amplificação por qPCR multiplex (Rotor-Gene
3000TM), tendo como amostra os eluídos da extração. Os resultados obtidos após a amplificação são
então analisados. Após análise, os resultados são inseridos e validados no sistema informático do
SML, ficando estes à disposição do clínico.
52
4.4 Deteção e quantificação da carga viral do Vírus da Hepatite B (VHB) e do Vírus
da Hepatite C (VHC)
A hepatite é uma inflamação do fígado que pode ser causada por situações clínicas
específicas, por vírus ou ainda por consumo de substâncias tóxicas (como por exemplo bebidas
alcoólicas) (WHO, 2018c). Relativamente ao VHB, este vírus causa hepatite B enquanto que, o VHC
causa hepatite C (Murray et al., 2007).
O VHB é um vírus de genoma de DNA de cadeia dupla, com envelope, pertencente à família
Hepadnaviridae. O VHB pode ser transmitido de diversas formas, sendo algumas delas a transmissão
vertical (de mãe para filho), contacto com sangue e fluidos corporais de indivíduos infetados ou ainda
por contacto sexual. A infeção por VHB pode levar a hepatite crónica. Indivíduos com hepatite
crónica, correm o risco de desenvolver cirrose e hepatocarcinoma (Murray et al., 2007; WHO, 2015).
Relativamente ao VHC, este é um vírus de genoma de RNA de cadeia simples, com envelope
e pertencente à família Flaviviridae. A infeção por este vírus pode causar hepatite crónica, podendo
esta por sua vez, levar ao desenvolvimento de cirrose e cancro do fígado. O VHC é transmitido
essencialmente por contacto com sangue de um indivíduo infetado, mas pode ocorrer também
transmissão vertical (Murray et al., 2007; WHO, 2018d).
No Setor de Biologia Molecular, as análises para deteção e quantificação das cargas virais
de VHB e VHC em doentes infetados, são iniciadas com uma extração automática a partir de
amostras dos produtos biológicos (plasma sanguíneo). Posteriormente, é realizada uma amplificação
através de qPCR ou RT-qPCR (Rotor-Gene 3000TM), tendo como amostra os eluídos da extração.
Após amplificação, são realizadas as quantificações das cargas virais em amostras positivas. Por fim,
os resultados obtidos são analisados, sendo posteriormente inseridos e validados no sistema
informático do SML, junto dos resultados serológicos obtidos no Setor de Bioquímica.
53
4.5 Deteção de vírus respiratórios e microrganismos atípicos
No Setor de Biologia Molecular, é efetuada a deteção e identificação de agentes patogénicos
causadores de infeção no trato respiratório, sendo esta análise executada principalmente no período
de inverno. Os agentes patogénicos respiratórios detetados e identificados são, vírus Influenza (A, B
e subtipo H1N1), Adenovírus, Enterovírus, Parechovirus e microrganismos atípicos sendo estes,
Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila e Chlamydia pneumoniae.
Os vírus Influenza, Enterovírus, Parechovirus e Adenovírus são responsáveis por infeções
virais do trato respiratório, estando relacionadas diferentes sistematologias, as quais variam
dependendo do agente infecioso em causa. No entanto, alguns destes agentes etiológicos podem
ainda acarretar outras complicações clínicas mais graves (Murray et al., 2007; Olijve et al., 2018).
Os microrganismos atípicos detetados, são microrganismos causadores de infeções no trato
respiratório, como por exemplo, pneumonia adquirida na comunidade (Blasi, 2004; File et al., 1998).
Tendo como objetivo a deteção e identificação destes agentes etiológicos, são enviadas para
este Setor, zaragatoas da orofaringe em meio de transporte líquido (Vircell, S.L. Granada, Espanha).
Esta análise é iniciada com uma extração automática a partir de amostras dos produtos biológicos.
Posteriormente, é realizada uma amplificação dos ácidos nucleicos extraídos, através de qPCR ou
RT-qPCR multiplex (Rotor-Gene 3000TM), usando como amostra os eluídos da extração. Após a
amplificação, é realizada a análise dos resultados obtidos, sendo estes inseridos e validados no
sistema informático do SML, posteriormente.
54
4.6 Deteção e análise do Complexo M. tuberculosis e genes de resistência
No Setor de Biologia Molecular é realizada a deteção de micobactérias, que tem como
principal objetivo a deteção e análise de micobactérias pertencentes ao Complexo M. tuberculosis
(CMTB) e seus genes de resistência relativamente aos antibióticos isoniazida e rifampicina. Esta
análise pode ser realizada a partir de amostras de colónias provenientes de culturas em meio líquido
e/ou sólido obtidas no Setor de Microbiologia ou a partir de amostras de produtos biológicos.
O CMTB é um complexo que envolve várias espécies de micobactérias que apresentam entre
si uma elevada similaridade genética, sendo algumas delas M. tuberculosis, M. africanum, M.
canettii, e M. microti. A este complexo pertencem outros agentes patogénicos ao ser humano para
além da micobactéria M. tuberculosis, como é o caso de M. africanum e M. canettii (Bañuls et al.,
2015).
Esta análise é iniciada com uma extração, seguida de uma amplificação por PCR multiplex
(Px2 Thermal Cycler®) dos ácidos nucleicos contidos no eluído da extração. Após a amplificação,
segue-se um processo de hibridização reversa em tiras de nitrocelulose do Kit TB Resistance Module
Isoniazid, Rifampicin (Autoimmun Diagnostika GmbH, GenID® GmbH, Strassberg, Alemanha) no
equipamento TENDIGOTM (Fujirebio Inc., Tóquio, Japão) apresentado abaixo na Figura 60. No
processo de hibridização reversa em tira, ocorre a ligação específica entre fragmentos de ácidos
nucleicos extraídos, amplificados, biotinilados e desnaturados previamente e as sondas
oligonucleotídicas específicas e complementares, imobilizadas em bandas sobre uma tira de
nitrocelulose, formando híbridos (Figura 61). Após várias lavagens, na presença do complexo
fosfatase alcalina-estreptavidina juntamente com os híbridos biotinilados ligados e substrato
adicionado, são geradas reações com formação de cor (bandas) (Bula informativa do Kit).
Figura 60: Equipamento TENDIGOTM.
55
Após a realização da hibridização reversa em tira, segue-se a análise dos resultados obtidos.
Esta tarefa é efetuada através da observação da presença ou ausência de bandas de cor em locais
específicos na tira de hibridização. A presença das bandas do Controlo de Conjugado e do Controlo
de Amplificação permitem a validação dos resultados. Na presença de ácidos nucleicos de
Mycobacterium spp. na amostra, é observado o aparecimento de uma banda em paralelo à linha
“Mycobact. uni.”. Caso estejam presentes ácidos nucleicos de micobactérias pertencentes ao CMTB
na amostra, irá aparecer uma banda de cor em paralelo à linha “M. tuberculosis complex”, aparecendo
em simultâneo, as bandas de cor nas linhas para os seus genes de resistência Wild Type (WT) ou
mutados para os antibióticos isoniazida e rifampicina (Figura 61) (Bula informativa do Kit). Os
resultados obtidos, são posteriormente inseridos e validados no sistema informático do SML.
Figura 61: Tira de hibridização positiva e válida para a presença de micobactérias pertencentes ao CMTB. É
possível ainda visualizar algumas bandas dos seus genes de resistência WT, relativamente aos antibióticos
isoniazida e rifampicina.
56
4.7 Controlo Externo da Qualidade do Setor de Biologia Molecular
No Setor de Biologia Molecular, são efetuados anualmente dois tipos de controlos externos
da qualidade, através do programa UK NEQAS. Um dos controlos externos é realizado para a deteção
e quantificação de VHB e VHC. O outro controlo externo é realizado para a análise de fatores
genéticos de risco trombótico. Após o processamento das amostras e obtenção dos resultados, estes
são inseridos online.
57
5. Conclusões
Através do estágio curricular efetuado nos Setores de Microbiologia e de Biologia Molecular
do SML do H.D.F.F., E.P.E., a partir do qual foi elaborado este documento, aprofundei bastante os
meus conhecimentos nas áreas de Microbiologia Clínica e Biologia Molecular. Pude entrar em
contacto direto e diário com todo um mecanismo bastante elaborado e complexo, fazendo eu próprio,
parte integrante do mesmo.
No decorrer do estágio realizado no Setor de Microbiologia, empreendi conhecimentos,
aprendi novos métodos e técnicas de diagnóstico, como também entrei em contacto com novos
equipamentos. Deste modo, pude aprofundar particularmente e de uma forma muito especial, os
meus conhecimentos relativamente às resistências a antimicrobianos. Relativamente ao estágio
efetuado no Setor de Biologia Molecular, entrei em contacto com novos equipamentos e materiais,
pude executar novas técnicas e colocar em prática tudo o que aprendi, como também pude aprofundar
em especial os meus conhecimentos relativamente às áreas da Micobacteriologia e Virologia.
Para além do enunciado, tive ainda oportunidade de observar, como um membro integrante
como é constituído todo um sistema de comunicação e processamento de um hospital, incluindo os
vários Serviços e Setores deste, como também as interações entre eles. Muitas vezes forneci apoio
aos vários elementos que integram este Serviço, em várias tarefas.
Em suma, considero que os objetivos propostos inicialmente foram cumpridos. Para mim,
esta foi uma oportunidade única e exclusiva de poder abrir os meus horizontes e conhecimentos em
áreas de grande interesse pessoal, fazendo com que tenha aumentado muitíssimo os meus
conhecimentos nas áreas de Microbiologia Clínica e Biologia Molecular.
58
6. Referências bibliográficas
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