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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
TRANSMISSÃO VERTICAL E OCORRÊNCIA DE ABORTOS POR Neospora caninum EM BOVINOS DE UMA CENTRAL DE
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM GOIÁS
Vanessa Silvestre Ferreira de Oliveira Orientadora: Profª. Drª. Andréa Caetano da Silva
GOIÂNIA
2007
ii
VANESSA SILVESTRE FERREIRA DE OLIVEIRA
TRANSMISSÃO VERTICAL E OCORRÊNCIA DE ABORTOS POR Neospora caninum EM BOVINOS DE UMA CENTRAL DE
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM GOIÁS
Dissertação apresentada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal junto à Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás
Área de concentração: Sanidade Animal Orientadora: Profª. Drª. Andréa Caetano da Silva -IPTSP/UFG Comitê de orientação: Profª. Drª. Lígia Miranda Ferreira Borges - IPTSP/UFG Profª. Drª. Maria Lúcia Gambarini Meirinhos - EV/UFG
GOIÂNIA
2007
iii
Dedico este trabalho aos meus pais, João e Maria Alice, por serem meu porto seguro, fonte de amor, paciência e força nos momentos mais difíceis, e pelo imenso apoio, sem o qual eu não conseguiria realizar mais este objetivo
iv
AGRADECIMENTOS A Deus, que me conduziu à Veterinária e à pesquisa, por iluminar e guiar sempre
o meu caminho.
Ao meu irmão Fábio, por seu apoio e palavras de otimismo, admiração e amizade.
A todos os meus familiares, que sempre acreditaram em mim e me deram forças
para seguir o meu caminho.
Ao Marco Aurélio, que esteve ao meu lado nos melhores e nos piores momentos,
pela sua dedicação, amor, companheirismo e tolerância.
À professora Andréa, por ter aceitado me orientar, por sua confiança, amizade e
dedicação, e também pelas oportunidades que me deu, além de todos os
exemplos, tanto profissionais quanto pessoais, e de tudo que me ensinou e
continua me ensinando.
À veterinária e amiga Márcia Carneiro Silveira, por quem tenho imensa
admiração, pela amizade, carinho, motivação, pelos ensinamentos e por todas as
portas que me abriu.
À veterinária Maria Lúcia Mundim Bernardes, pelo interesse, boa vontade,
dedicação e profissionalismo, e por ter me dado a oportunidade de realizar esta
pesquisa em sua empresa.
À Paula, Liliana e Débora, grandes amigas de todos os momentos, por me darem
apoio, força e entusiasmo, e por me ensinarem tantas coisas e terem tanta
paciência.
À Sabrina, Marina e Cybelly, por toda grande ajuda que me deram, pela amizade,
carinho, respeito e alto astral sempre presente.
À querida amiga Úrsula, que também me ajudou nas colheitas e que me
acompanhou com sua amizade, carinho e força em todos os momentos.
Ao veterinário Bruno e aos alunos de graduação Lucas, Henrique, Leonardo e
Jean, que muito me auxiliaram nas colheitas de material.
À Gabriela e ao Marcelo, estagiários queridos, que me ajudaram não só nas
colheitas, mas em tudo, com boa vontade, interesse e dedicação.
À querida amiga Diana, pela alegria sempre constante, bom humor e pela imensa
ajuda na elaboração do abstract deste trabalho.
v
Às minhas amigas Raquel, Liliane, Naira, Michely, Nicolle e Clarissa, que sempre
estiveram do meu lado e contribuíram indiretamente para a realização deste.
Ao Misael e a todos os funcionários da Central, pela imensa boa vontade e pela
colaboração, fundamentais para o andamento da pesquisa.
À professora Lígia, pela co-orientação e disposição para ajudar.
À professora Maria Lúcia, por ceder seus materiais para pesquisa e por sua co-
orientação.
Ao professor Guido, sempre disposto a tirar nossas dúvidas e a nos ensinar, com
sua solicitude e dedicação.
À professora Mirian, que emprestou seus equipamentos para o andamento das
pesquisas.
Ao CNPq, pela concessão da bolsa durante o mestrado.
À Escola de Veterinária e ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal,
que permitiram a realização deste trabalho.
Aos animais que doaram seu sangue, seu tempo e sua tolerância para que este
estudo acontecesse.
vi
"Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.
Madre Teresa de Calcutá
vii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS...................................................................................... viiiLISTA DE TABELAS...................................................................................... ixRESUMO....................................................................................................... xABSTRACT.................................................................................................... xi1 INTRODUÇÃO............................................................................................ 12 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................ 32.1 Biologia e ciclo biológico do parasito....................................................... 32.2 Neosporose bovina................................................................................. 52.2.1 Sinais clínicos........................................................................................ 62.2.2 Resposta imune e transmissão vertical................................................. 72.2.2.1 Resposta imune humoral................................................................... 82.2.2.2 Resposta imune celular...................................................................... 92.2.2.3 Relação parasito-hospedeiro............................................................. 102.3 Diagnóstico da neosporose bovina.......................................................... 122.3.1 Diagnóstico clínico e epidemiológico.................................................... 132.3.2 Diagnóstico laboratorial......................................................................... 132.3.3 Técnicas sorológicas............................................................................. 142.3.3.1 Imunofluorescência indireta (IFI)........................................................ 152.3.3.2 Ensaio imuno-enzimático (ELISA)...................................................... 152.3.3.3 Western blotting................................................................................. 162.3.3.4 Aglutinação direta............................................................................... 162.4 Importância econômica............................................................................ 172.5 Controle da neosporose bovina............................................................... 173 OBJETIVOS................................................................................................ 203.1 Objetivo Geral.......................................................................................... 203.2 Objetivos Específicos............................................................................... 204 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................ 214.1 Levantamento de dados e aspectos reprodutivos.................................... 214.2 Colheita de amostras............................................................................... 214.3 Detecção de anticorpos anti-Neospora caninum.................................... 224.4 Cultivo de células (manutenção).............................................................. 224.5 Cultivo de Neospora caninum.................................................................. 224.6 Preparação de antígeno anti-Neospora caninum..................................... 234.7 Técnica de Imunofluorescência Indireta (IFI)........................................... 244.8 Avaliação da transmissão vertical e titulação de anticorpos maternos.... 254.9 Análise estatística.................................................................................... 255 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 265.1 Ocorrência de anticorpos anti-Neospora caninum................................... 265.2 Transmissão vertical................................................................................ 275.3 Relação entre títulos de anticorpos e transmissão vertical...................... 285.4 Índices reprodutivos................................................................................. 305.5 Ocorrência de abortos.............................................................................. 316 CONCLUSÕES........................................................................................... 347 REFERÊNCIAS........................................................................................... 35
viii
LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Ciclo biológico de N. caninum (ALVAREZ–GARCIA, 2003)............ 4Figura 2 – Relação parasito-hospedeiro em vacas prenhes e não-prenhes (INNES et al., 2002).......................................................................................... 11Gráfico 1 – Cinética de anticorpos anti-N. caninum em receptoras que transmitiram a infecção ao bezerro, em central de transferência de embriões, Nerópolis, GO.................................................................................. 29
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Soroprevalência de anticorpos anti-N. caninum em bovinos provenientes de Central de Transferência de Embriões, realizada por IFI (titulação ≥ 1:200) no período de 04/2005 a 10/2006...................................
26
Tabela 2 – Ocorrência de anticorpos anti N. caninum em bezerros nascidos de receptoras positivas ou não ao N. caninum, realizada por IFI (titulação ≥ 1:200)...........................................................................................
27
Tabela 3 – Relação entre título de anticorpos anti-N. caninum maternos e transmissão vertical........................................................................................
29
Tabela 4 – Taxa de repetição de cio entre receptoras positivas e negativas para N. caninum.............................................................................................
31
Tabela 5 – Quantidade de embriões produzidos por doadoras positivas e negativas ao N. caninum e índice de prenhez das receptoras......................
31
Tabela 6 – Número de abortos ocorridos em relação ao número total de receptoras positivas e negativas.................................................................... 32
x
RESUMO
Este estudo foi realizado em uma central de transferência de embriões em Goiás,
onde foram analisadas amostras sorológicas de 101 receptoras, 61 doadoras e 90
bezerros. Desse total de animais estudados, 32,67% das receptoras mostraram-
se positivas à sorologia por imunofluorescência indireta, bem como 26,22% das
doadoras e 6,66% dos bezerros. A taxa de transmissão vertical encontrada foi de
24%. Houve diferença estatisticamente significativa entre o título de anticorpos e a
transmissão vertical, ou seja, vacas com título mais alto foram capazes de
transmitir a infecção à cria. Em relação aos índices reprodutivos, como repetição
de cio e produção de embriões, não houve diferença estatística entre as vacas
positivas e negativas ao N. caninum. Ocorreram oito abortos, dos quais seis
(75%) em fêmeas positivas e dois (25%) em fêmeas negativas. Estes resultados
indicam que a neosporose é uma importante causa de falhas reprodutivas em
centrais de transferência de embriões que utilizam receptoras sem exame prévio.
Palavras-chave: Neospora caninum, aborto, vacas, transmissão vertical,
transferência de embriões
xi
ABSTRACT This study was made in an embryo transfer center where there were analyzed
serological samples from 101 recipients, 61 donors and 90 calves. Among these
animals, 32,67% of the recipients were positive on immunofluorescence indirect
reaction, 22,22% of the donors and 6,66% of the calves. The rate of vertical
transmission found was 24%. There were statistically significative difference
between the antibody title and the vertical transmission, it means, cows with higher
title were able to transmit the infection to their offspring. About the reproductive
indexes, such as estrum repetition and embryo production, statistical difference
was not found between the positive and negative cows to Neospora caninum.
Eight abortion occurred, six (75%) in positive females and two (25%) in negative
females. These results indicate that neosporosis is an important cause of
reproductive failure in embryo transfer centers that use non-examined recipients.
Keywords: Neospora caninum, abortion, cows, vertical transmission, embryo
transfer
1 INTRODUÇÃO
A neosporose bovina é considerada uma das principais causas de
aborto em bovinos, em várias regiões do mundo. Em bovinos, o principal modo de
transmissão é o vertical, passado da mãe para o feto, podendo ocasionar aborto,
nascimento de bezerros cronicamente infectados ou com apresentação de sinais
neurológicos, além de falhas reprodutivas, como repetições de cio e infertilidade.
BJERKAS e colaboradores, em 1984, descreveram em cães jovens
uma infecção causada por um parasito similar ao Toxoplasma gondii, que
apresentava uma síndrome caracterizada por encefalomielite e miosite. Em 1988,
nos Estados Unidos, DUBEY e colaboradores propuseram um novo gênero ao
identificar um protozoário em cães que apresentavam sinais neuromusculares,
como paresia de membros posteriores depois de cinco a oito semanas após o
nascimento, devido a poliradiculoneurite e polimiosite granulomatosa. Esta nova
espécie foi denominada de Neospora caninum, pertencente ao filo Apicomplexa,
família Sarcocystidae.
Em Medicina Veterinária, o interesse por esse protozoário aumentou
quando THILSTED & DUBEY (1989) identificaram pela primeira vez o N. caninum
como agente etiológico de aborto em bovinos, confirmando que a infecção por
este parasito era uma das principais causas de abortamento no rebanho leiteiro
da Califórnia (ANDERSON et al., 1991). Em 1992, comprovou-se
experimentalmente a transmissão vertical do agente na espécie bovina e em 1993
foi conseguido o primeiro isolado procedente de um feto bovino abortado (DUBEY
et al., 1992; CONRAD et al., 1993).
Na história desse protozoário, mereceram menção especial,
primeiramente, a descoberta do cão (Canis familiaris) como hospedeiro definitivo
e, por conseguinte, a possibilidade de transmissão horizontal da infecção
(MCALLISTER et al., 1998). Além dos cães, os coiotes (Canis latrans) foram
recentemente reconhecidos como hospedeiros definitivos de N. caninum
(GONDIM et al., 2004).
Atualmente, a neosporose bovina é considerada uma enfermidade
parasitária de distribuição cosmopolita e uma das causas mais freqüentes de
falhas reprodutivas nos rebanhos bovinos (DUBEY, 2003).
2
Goiás é um dos maiores produtores de carne bovina do País e o
segundo maior produtor de leite (IBGE, 2006). Outra prática bastante utilizada no
Estado é a transferência de embriões, empregada principalmente em rebanhos de
alta genética.
O mercado nacional de embriões registrou uma marcante expansão
nos últimos cinco anos. Dados da Sociedade Brasileira de Tecnologia de
Embriões (SBTE), relativos a 2004, apontam crescimento de 545,27% na
produção por aspiração folicular e FIV (fecundação in vitro) e de 47,12% na
produção por meio da técnica de TE (transferência de embriões). Ainda, o número
de vacas receptoras chega a 220 mil. As biotécnicas FIV e TE trouxeram uma
nova dimensão à importância das fêmeas no processo seletivo. Se antes uma
matriz ficava restrita a uma cria por ano, hoje esse número pode chegar a
centenas. É exatamente essa nova dimensão de aproveitamento e ampliação da
genética da linhagem materna que implica na seleção cuidadosa de matrizes
doadoras (ABCZ, 2006).
Porém, somente os cuidados com as doadoras não são suficientes, se
a seleção das receptoras não for feita de maneira adequada. Além do manejo
nutricional, o sanitário é de extrema importância, uma vez que os animais
receberão embriões de alto valor genético e, conseqüentemente, de alto custo.
Levando-se em conta que existem várias doenças reprodutivas, capazes de
provocar aborto, repetição de cios e até infertilidade, este estudo tem como
principal objetivo demonstrar o impacto da neosporose bovina em receptoras de
embriões, o que contribui para perdas econômicas significativas no setor e para
um maior risco de nascimento de bezerros de alto valor genético congenitamente
infectados.
3
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Biologia e ciclo biológico do parasito
Neospora caninum é um parasito intracelular obrigatório, que penetra
na célula hospedeira mediante invasão ativa e se localiza no interior de um
vacúolo parasitóforo no citoplasma. O fenômeno de invasão foi amplamente
estudado em cultivos celulares e consiste em prévio reconhecimento e adesão à
célula hospedeira. No interior do vacúolo parasitóforo, os taquizoítos se
multiplicam mediante endodiogenia, podendo uma célula conter mais de 100
taquizoítos. Após a ruptura celular, os taquizoítos saem para o meio extracelular e
em poucas horas iniciam os mecanismos de adesão e invasão de novas células
(HEMPHILL et al., 1996).
Os cistos teciduais são observados principalmente em tecido nervoso
(como cérebro, medula espinhal, nervos), músculos cardíacos e esqueléticos,
fígado e músculos oculares (ANDERSON et al., 1991; BARR et al., 1991a;
DUBEY & LINDSAY, 1996, LINDSAY et al., 1996). Nos cistos, os bradizoítos
conservam sua capacidade infectante durante períodos de tempo prolongados
(um ano no cérebro de camundongos com infecção experimental) e são
resistentes à ação do ácido clorídrico (HCl) e à pepsina (LINDSAY & DUBEY,
1990).
O ciclo biológico do N. caninum é caracterizado pela fase assexuada,
que se desenvolve tanto no hospedeiro definitivo como no intermediário, e pela
fase sexuada, que ocorre nos hospedeiros definitivos. O ciclo intestinal do
parasito ainda não foi descrito (GONDIM et al., 2002); porém, pela semelhança
com o Toxoplasma gondii, acredita-se que a fase sexuada provavelmente ocorra
no intestino dos hospedeiros definitivos que se infectam ao consumir taquizoítos
ou tecidos infectados com cistos parasitários. Os cães, após ingerirem tecidos
infectados, eliminam oocistos não-esporulados nas fezes (MCALLISTER et al.,
1998) (Figura 1). Os oocistos esporulam no ambiente dentro de 42 a 72 horas, em
condições favoráveis, podendo ser ingeridos pelos hospedeiros intermediários. Os
oocistos esporulados contêm dois esporocistos, com quatro esporozoítos cada
(MCALLISTER et al., 1998; LINDSAY et al., 1999).
4
Figura 1 - Ciclo biológico de N. caninum (ALVAREZ–GARCIA, 2003)
Os hospedeiros intermediários de N. caninum já descritos são os
bovinos, ovinos, caprinos, cervídeos, eqüinos, bubalinos, raposas e felinos, que
se infectam por meio da ingestão de oocistos liberados nas fezes dos hospedeiros
definitivos (MCALLISTER et al., 1998).
HI
HD
5
Os hospedeiros intermediários podem se infectar ao consumir água ou
alimentos contaminados com oocistos esporulados. A presença de cães
soropositivos para N. caninum em fazendas foi correlacionada com a alta
soroprevalência do parasito no rebanho bovino (WOUDA et al., 1999). Dessa
forma, o cão parece ter um importante papel na rota da transmissão horizontal da
infecção em bovinos (DUBEY, 1999), o que foi recentemente comprovado no
México por SANCHEZ et al. (2003).
Entretanto, estudos epidemiológicos realizados até o momento indicam
que a infecção pós-natal tem menor importância, ocorrendo em níveis inferiores
aos verificados na via transplacentária, principal modo de transmissão em bovinos
e responsável pela manutenção e pela perpetuação da infecção nos rebanhos
(SCHARES et al., 1998; DAVISON et al., 1999b; DUBEY 2003; HALL et al.,
2005). A transmissão congênita tem papel preponderante, com percentagens que
variam entre 50% e 95% (WOUDA et al., 1997; SCHARES et al., 1998). As
fêmeas bovinas infectadas permanecem nesse estado por toda a vida e têm até
7,4 vezes mais chances de abortar do que uma vaca não-infectada (THURMOND
& HIETALA, 1997).
2.2 Neosporose bovina
Nos diversos países onde é estudada a neosporose bovina tem sido
considerada uma enfermidade parasitária de distribuição cosmopolita e uma das
causas mais freqüentes de falhas reprodutivas (GONZÁLES et al., 1999; TREES
et al., 1999). Desde sua descrição nos Estados Unidos, como causa de aborto, a
importância da neosporose bovina vem aumentando significativamente. Vários
estudos sorológicos realizados demonstram uma elevada prevalência, individual e
em rebanhos, nas principais zonas produtoras de bovinos do mundo (DUBEY &
LINDSAY, 1996; DAVISON et al., 1999a).
No Brasil, Neospora caninum foi identificado pela primeira vez em feto
abortado proveniente de uma exploração leiteira na Bahia, por GONDIM et al.
(1999), que detectaram prevalência de 14,09% entre bovinos leiteiros.
RAGOZO et al. (2003) verificaram a ocorrência de animais
soropositivos em seis estados brasileiros (Mato Grosso do Sul, Minas Gerais,
6
Paraná, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e São Paulo), encontrando 23,6% de
positividade. O Rio de Janeiro apresentou a menor percentagem de soropositivos
(14,7%) e Minas Gerais, a maior (29,0%). Com relação à aptidão animal,
observou-se maior ocorrência nos bovinos leiteiros (26,2%) do que nos de corte
(19,1%), com os estados do Paraná, Mato Grosso do Sul e Rio Grande do Sul
apresentando os maiores valores de ocorrência nos bovinos de corte e Minas
Gerais nos leiteiros. Em estudo realizado em Goiás, foi detectada prevalência
entre 10,3% e 89,7%, tanto em rebanhos leiteiros como de corte (MELO et al,
2006).
2.2.1 Sinais clínicos
Bovinos infectados por N. caninum antes da gestação podem sofrer
abortos, o que sugere que a imunidade gerada pela primeira exposição ao
parasito é insuficiente para protegê-los da doença. Em vacas, o aborto é o único
sinal clínico observado, além da repetição de cio. Vacas soropositivas, em
comparação com soronegativas, podem apresentar maior número de
inseminações por prenhez, evidenciando baixo desempenho reprodutivo
(STENLUND et al., 1999; HALL et al., 2005).
Nos rebanhos infectados por N. caninum, os abortos podem
apresentar-se de forma esporádica, endêmica ou epidêmica (DAVISON et al.,
1999b). A forma esporádica ocorre em rebanhos em que a taxa de aborto é baixa
e acontece a intervalos irregulares.
Nos casos que apresentam padrão endêmico de abortos, a taxa anual
de abortamento é elevada, persistindo durante períodos de tempo prolongados
(ANDERSON et al., 2000). O padrão endêmico é a forma mais freqüente de
abortos e ocorre em rebanhos em que o parasito é transmitido, principalmente, de
modo vertical entre gerações sucessivas.
Nos abortos epidêmicos causados pelo N. caninum, são observadas
altas taxas de soroprevalência e associação significativa entre eles e a
soropositividade da mãe (WOUDA et al., 1999).
As vacas afetadas abortam em qualquer idade ou estado de gestação,
desde o terceiro até o oitavo mês, ainda que a idade gestacional média dos fetos
7
abortados esteja entre o quinto e o sexto mês (THORNTON et al., 1994;
MCALLISTER et al., 1996; WOUDA et al., 1999).
Apesar de a infecção subclínica ser a forma mais freqüente de
apresentação da neosporose congênita, também são descritos casos de bezerros
infectados durante a gestação que apresentaram quadro nervoso como
conseqüência da presença de cistos no Sistema Nervoso Central (SNC). As
lesões localizadas nos músculos e no SNC seriam as responsáveis pelos sinais
neurológicos e neuromusculares observados ocasionalmente (BARR et al.,
1991a; DUBEY & LINDSAY, 1996).
2.2.2 Resposta imune e transmissão vertical
N. caninum é um parasito intracelular obrigatório. Tanto a resposta de
anticorpos específicos, de grande ajuda no diagnóstico e nos estudos
epidemiológicos (CONRAD et al., 1993), quanto os mecanismos implicados na
resposta celular são elementos importantes da resposta imune frente ao parasito.
Nesse sentido, os diversos estudos sobre a resposta imune desenvolvida pelo
hospedeiro vêm demonstrando que a infecção induz a uma resposta humoral e
celular (ÁLVARES-GARCIA, 2003). Anticorpos específicos e imunidade mediada
por células, que envolve proliferação celular e produção de INF-γ (Interferon γ),
são observados em animais infectados naturalmente ou experimentalmente com
taquizoítos ou oocistos, após infecção primária com o parasito ou por meio de
recrudescência de uma infecção prévia (LUNDÉN et al., 1998; DE MAREZ et al.,
1999; ANDRIANARIVO et al., 2001; INNES et al., 2002).
A gestação cria um desequilíbrio na relação hospedeiro-parasito, o que
pode ajudar na explicação da patogenia da neosporose. A resposta imune
desenvolvida frente à infecção é capaz de prejudicar o sucesso da gestação e
comprometer a capacidade do animal em levar a gestação adiante (INNES et al.,
2002).
Em mamíferos, mecanismos imunológicos complexos agem para
permitir que a fêmea mantenha o feto e não o rejeite como estranho (ENTRICAN,
2002). Nos ruminantes, estes mecanismos são mediados por meio da interface
8
materno-fetal, constituída de vários pontos de contato (placentomas). Cada
placentoma é composto por um cotilédone da placenta fetal, projetado para dentro
da superfície do útero e intimamente conectado com a carúncula materna. A
transferência de nutrientes e oxigênio da mãe para o feto acontece por meio
dessas estruturas, que formam o placentoma.
Como parte do equilíbrio imunológico da placenta, citocinas maternas
benéficas do tipo Th2, como a interleucina (IL) 10 e TGF-β (Transforming Growth
Factor β), são predominantes, enquanto potentes citocinas destrutivas do tipo
Th1, como IL-2, IL-12, IFN-γ e TNF-α (Tumor Necrosis Factor α), são restritas
(ENTRICAN, 2002). Conseqüentemente, esse equilíbrio imunológico que permite
à mãe manter a gestação pode favorecer a invasão da placenta e a infecção do
feto por certos microrganismos, inclusive N. caninum (INNES et al., 2001).
Outros fatores que podem influenciar no resultado da infecção por N.
caninum na gestação são: o tempo, a quantidade e a duração da parasitemia
durante a gestação, a eficiência da resposta imune materna e a habilidade do feto
em montar uma resposta imune efetiva (INNES et al., 2002).
Portanto, os abortos causados por N. caninum podem ser o resultado
de uma resposta inflamatória que é conseqüência da invasão e da multiplicação
dos taquizoítos em células da placenta do feto ou da mãe, estimulando uma
resposta imune inapropriada, que comprometeria a gestação (ÁLVARES-
GARCIA, 2003).
2.2.2.1 Resposta imune humoral
Tanto nos animais adultos como nos fetos capazes de montar resposta
imune, a infecção provoca o desenvolvimento de uma resposta imune humoral,
mediada majoritariamente por IgG2 (ANDRIANARIVO et al., 2001).
Estudos realizados com animais persistentemente infectados
demonstraram aumento de anticorpos maternos específicos durante a metade da
gestação, o que pode ser um indicativo de recrudescência do parasito em fêmeas
infectadas naturalmente (GUY et al., 2001). Porém, apesar de os anticorpos
serem indicadores indiretos da multiplicação parasitária no hospedeiro, é ainda
9
desconhecido se estes podem influenciar diretamente na recrudescência do
parasito (INNES et al., 2002).
Em rebanhos que apresentam aborto endêmico têm sido detectadas
flutuações nos níveis de anticorpos ao longo da gestação. Tais níveis podem
preceder a infecção congênita ou o aborto. Nesse sentido, é desconhecido se
essas flutuações são devidas a estímulos antigênicos por reativação de infecções
latentes ou por reinfecções a partir de fonte externa. Também não se sabe o
papel desses anticorpos no desenvolvimento de uma imunidade protetora.
Existem dados contraditórios a esse respeito (COLLANTES-FERNÁNDEZ, 2003),
uma vez que a imunidade desenvolvida em resposta a uma exposição primária ao
N. caninum geralmente é insuficiente para prevenir contra a ocorrência de
transmissão vertical (PARÉ et al., 1996).
Estudos realizados com animais experimentalmente infectados
(WILLIAMS et al., 2000) demonstraram haver diferença na resposta imune em
relação aqueles naturalmente infectados. Quando vacas adultas foram expostas à
primo-infecção, desenvolveram uma imunidade adequada para N. caninum, a fim
de inibir a transmissão vertical do parasito. Vacas naturalmente e cronicamente
infectadas tiveram proteção contra aborto seguida da exposição exógena, mas
não foram capazes de evitar a transmissão vertical do parasito (INNES et al.,
2001).
A principal diferença entre bovinos natural e experimentalmente
infectados é a maturidade relativa do sistema imune no tempo inicial à exposição
ao parasito, pois a maioria dos bovinos infectados naturalmente tem a primeira
experiência do parasito in utero, quando o sistema imune ainda está se
desenvolvendo (INNES et al., 2002).
2.2.2.2 Resposta imune celular
A imunidade mediada por células é mais freqüentemente envolvida na
defesa do hospedeiro contra protozoários (ANDRIANARIVO et al., 2000).
Até o momento, as informações sobre o papel das diferentes linfocinas
e populações celulares na resposta imune bovina são escassas. Os diversos
estudos realizados tanto em infecções naturais como experimentais sobre a
10
resposta imune celular destacam a participação de células CD4+, Th1 e linfocinas
como IFN-γ, IL-12 e macrófagos (ANDRIANARIVO et al., 2001). GUY et al. (2001)
demonstraram o efeito protetor do IFN-γ ao final da gestação em fêmeas com
infecção natural, sendo seus valores especialmente elevados nas reprodutoras
que não transmitiram a infecção à descendência. Recentemente, ALMERIA et al.
(2003) estudaram a resposta imune desenvolvida pelas fêmeas e seus fetos
quando estas foram infectadas no segundo trimestre da gestação. Nesse estudo
foram detectados maiores níveis de linfócitos CD3+, CD4+ e CD8+ nas
reprodutoras infectadas. Nos fetos, destacou-se a presença de linfócitos CD3+ e a
infecção estimulou resposta tanto Th1 como Th2.
Em novilhas infectadas experimentalmente, houve uma resposta imune
de base celular, na qual se destacaram elevados níveis de IFN-γ (LUNDEN et al.,
1998; INNES et al., 2001). No estudo realizado por WILLIAMS et al. (2000), a
infecção veio acompanhada de uma resposta de tipo Th1, mediada por IgG2,
linfoproliferação e elevados níveis de IFN-γ.
2.2.2.3 Relação parasito-hospedeiro
O feto é especialmente vulnerável durante o primeiro terço de
gestação, devido à imaturidade de seu sistema imune, quando está
desenvolvendo o timo, o baço e os nódulos linfáticos periféricos (BUXTON et al.,
2002).
Durante o terço médio da gestação, esses tecidos começam a
reconhecer e a responder frente aos microrganismos. O feto é, então, capaz de
iniciar uma resposta imune rudimentar, que talvez ainda não seja suficiente para
evitar o abortamento, uma vez que a maioria dos abortos ocorre nessa fase
(GONZÁLEZ et al., 1999). No terceiro trimestre, o feto já é capaz de,
progressivamente, desenvolver uma resposta imune competente contra o
parasito, o que resulta no nascimento de bezerros congenitamente infectados,
porém clinicamente sadios (BUXTON et al., 2002).
A Figura 2 (INNES et al., 2002) ilustra diferentes aspectos da relação
hospedeiro-parasito em vacas prenhes e não-prenhes. O gráfico (a)(i) mostra o
desenvolvimento da imunidade mediada por células (verde), envolvendo
11
proliferação celular e produção de INF-γ e resposta de anticorpo (vermelho), após
a infecção experimental com N. caninum de vacas não-prenhes.
Fonte: INNES et al (2003)
Relação parasito-hospedeiro(a) (i)
(b) (i)
0 2 4
Cisto com bradizoítos
INF-y
Res
pos t
a
IMC
Res
post
a A
cR
espost
a
IMC
Res
post
a A
c
0 14 28 42Semanas de gestação
(ii) Recrudescência ou nova infecção?
(iii) Recrudescência ou infecção
↓ Th1
Invasão da placenta Th2
Imunidade fetal imatura
(iv) Invasão da placenta e tecido fetal
Imunidade fetal capaz de resistir
à infecção
Citocinas pro-
inflamatórias
sf
ce
INF-y
Semanas pós infecção
(a) (ii)
1º trimestre 2º trimestre3º trimestre
INF-y
Fonte: INNES et al (2003)
Relação parasito-hospedeiro(a) (i)
(b) (i)
0 2 4
Cisto com bradizoítos
INF-y
Res
pos t
a
IMC
Res
post
a A
cR
espost
a
IMC
Res
post
a A
c
0 14 28 42Semanas de gestação
(ii) Recrudescência ou nova infecção?
(iii) Recrudescência ou infecção
↓ Th1
Invasão da placenta Th2
Imunidade fetal imatura
(iv) Invasão da placenta e tecido fetal
Imunidade fetal capaz de resistir
à infecção
Citocinas pro-
inflamatórias
sf
ce
INF-y
Semanas pós infecção
(a) (ii)
1º trimestre 2º trimestre3º trimestre
INF-y
Figura 2 – Relação parasito-hospedeiro em vacas prenhes e não prenhes (INNES et al., 2002)
Em animais não-prenhes, a infecção por N. caninum não costuma
causar doença clínica. INF-γ produzido por células T-CD4+ (roxo) é capaz de
limitar a multiplicação intracelular do parasito e isso é um importante componente
da proteção imunológica (esquema (b)(i)). O parasito consegue persistir em forma
de bradizoítos dentro de cistos teciduais no Sistema Nervoso Central (SNC).
O gráfico (a)(ii) mostra a relativa importância da resposta imune
mediada por células (IMC) específica para N. caninum (verde) e diferentes
exemplos de resposta de anticorpos durante toda a gestação em vacas, quando a
parasitemia ocorre no meio da gestação (vermelho) ou em seu fim (azul). A
relativa maturidade da resposta imune fetal também é indicada no gráfico
(amarelo). Se as vacas são infectadas experimentalmente com N. caninum no
12
início da gestação, as conseqüências podem ser graves, resultando em morte do
feto. A causa precisa do aborto é assunto de debate. Se o feto se torna infectado,
é pouco provável que seja capaz de organizar uma resposta imune efetiva, devido
à imaturidade do sistema imune. Se não, é sabido que, no início da gestação, a
mãe é capaz de montar uma forte resposta de proliferação celular com produção
de INF-γ em resposta ao antígeno do parasito (INNES et al., 2002).
Conseqüentemente, é possível que o aborto seja causado pela presença de
citocinas pró-inflamatórias tipo 1 (Th1) na interface materno-fetal, quando o
sistema imune materno combate a infecção (esquema (b)(ii)). Significante imunomodulação de células de proliferação e de INF-γ
ocorre no meio da gestação, podendo ser desencadeada por recrudescência da
infecção, pela existência de parasitos contidos dentro dos cistos teciduais
(esquema (b)(iii)). Nesse estágio da gestação, as conseqüências da infecção
podem ser morte fetal ou o nascimento do bezerro congenitamente infectado, já
demonstrando sinais da parasitemia.
A idade do feto ao tempo da infecção é crucial para determinar a
gravidade da doença (BARR et al., 1991a; BARR et al., 1994; BUXTON et al.,
1998; WILLIAMS et al., 2000). A transmissão vertical do parasito para o feto no
fim da gestação resulta em menor probabilidade de aborto, presumivelmente por
causa da maturidade do sistema imune fetal (esquema (b)(iv)). O provável efeito
da infecção fetal no final da gestação é o nascimento de bezerros congenitamente
infectados, mas clinicamente sadios. A infecção intrauterina induz, em fetos
imunocompetentes, a produção de títulos elevados de anticorpos específicos pré-
colostrais, que podem chegar a ser superiores aos títulos de anticorpos das mães
(ÁLVARES-GARCIA, 2003).
2.3 Diagnóstico da neosporose bovina
O diagnóstico clínico da neosporose é difícil, devido à inexistência de
sinais nos animais cronicamente infectados e ao número reduzido de parasitos
encontrados nos fetos abortados (JENKINS et al., 2002). Atualmente o
diagnóstico é baseado na detecção de anticorpos específicos frente ao parasito
em bovinos adultos (BJORKMAN & UGLA, 1999) e em lesões compatíveis no
13
cérebro, no coração e no fígado de fetos abortados, combinadas com o exame
imunoistoquímico (BARR et al., 1990, 1991b; ANDERSON et al., 1991), com a
reação em cadeia da polimerase (PCR) em tecidos fetais (GOTTSTEIN et al.,
1998; PEREIRA-BUENO et al., 2003) e com a sorologia fetal (BARR et al., 1995;
BUXTON et al., 1997).
2.3.1 Diagnóstico clínico e epidemiológico
Além de dados relativos ao tipo de exploração e ao manejo do
rebanho, a história clínica da doença pode facilitar a realização de um diagnóstico
preciso. Nos rebanhos infectados por N. caninum, os abortos ocorrem tanto em
novilhas como em vacas e podem apresentar-se de forma esporádica, endêmica
ou epidêmica, em qualquer época do ano. Uma vez que a infecção congênita é o
principal modo de transmissão entre bovinos, é importante o estudo de abortos
que possam ter ocorrido nos ascendentes ou descendentes dos animais
infectados (ÁLVARES-GARCIA, 2003).
A ausência de sinais nos animais adultos infectados impede o
diagnóstico clínico. Quando ocorre aborto, o exame macroscópico do feto e da
placenta geralmente não contém informações que possam ser conclusivas
(ÁLVARES-GARCIA, 2003).
Os bezerros infectados por N. caninum podem nascer com peso abaixo
do normal, dificuldades de se levantar e com manifestações nervosas (DUBEY &
LINDSAY, 1996). Os membros, mais freqüentemente os posteriores, podem estar
flexionados ou hiperestendidos. Os animais também podem apresentar ataxia,
diminuição do reflexo patelar e perda da consciência, bem como exoftalmia e
aparência assimétrica dos olhos. Entretanto, é importante destacar que estes
casos não são freqüentes, sendo mais comum o nascimento de bezerros
congenitamente infectados, mas clinicamente sadios (FERRE et al., 2003).
2.3.2 Diagnóstico laboratorial
A detecção da infecção em bovinos se fundamenta na verificação de
anticorpos específicos anti - N. caninum no soro, por meio de técnicas sorológicas
14
(COLLANTES-FERNÁNDEZ, 2003). A transmissão congênita também é avaliada
pela detecção de anticorpos em soro pré-colostral de bezerros recém-nascidos,
uma vez que em bovinos não existe transferência de anticorpos da mãe para o
feto durante a gestação (PARÉ et al., 1996).
No feto, o diagnóstico laboratorial é feito em tecidos e líquidos fetais,
por meio de técnicas que permitem a detecção de lesões, o isolamento do
parasito e sua identificação, a detecção de DNA nos tecidos infectados e a
evidência de anticorpos anti-Neospora nos fluidos fetais (ÁLVARES-GARCIA,
2003). Como exemplos podem ser utilizadas técnicas histológicas, PCR,
imunoistoquímica, isolamento e inoculação em animais de laboratório. As lesões
mais características em fetos abortados se localizam preferencialmente no
cérebro, podendo ser detectadas inclusive em fetos mumificados ou autolisados
(SILVA, 2004).
2.3.3 Técnicas sorológicas
As técnicas sorológicas apresentam elevada sensibilidade e
especificidade, além de possibilitarem o exame in vivo dos animais. Para detectar
anticorpos específicos anti - N. caninum, diferentes provas sorológicas foram
desenvolvidas, como a imunofluorescência indireta (IFI), o ensaio
imunoenzimático (ELISA), o western-blot (WB) e a aglutinação direta (AT).
(COLLANTES-FERNÁNDEZ, 2003).
Desde a primeira descrição do parasito (DUBEY et al., 1988),
diferentes provas sorológicas foram desenvolvidas para a detecção de anticorpos
específicos frente ao N. caninum, o que tem permitido melhorar o diagnóstico e o
conhecimento da biologia e da epidemiologia da infecção.
A primeira prova utilizada no diagnóstico da neosporose foi a IFI e
desde então foram desenvolvidas várias provas de ELISA baseadas em
diferentes preparações antigênicas, bem como a prova de aglutinação direta e o
western blotting (BJÖRKMAN & UGGLA, 1999).
As técnicas sorológicas permitem o diagnóstico da infecção e o estudo
do papel que pode ter o animal no ciclo biológico do parasito ou na epidemiologia
da doença. As limitações da sorologia são relacionadas às diferenças existentes
15
entre os laboratórios, às propriedades da técnica aplicada e às oscilações dos
níveis de anticorpos específicos produzidos nos animais infectados, que podem
influir consideravelmente na sensibilidade da técnica utilizada (CONRAD et al.,
1993).
2.3.3.1 Imunofluorescência indireta (IFI)
A imunofluorescência indireta foi a primeira técnica sorológica aplicada
à neosporose e é utilizada como prova de referência. A IFI utiliza como antígeno
taquizoítos cultivados em meio livre de soro ou com soro eqüino (COLLANTES-
FERNÁNDEZ, 2003), e detecta anticorpos que se unem a antígenos localizados
na superfície celular de N. caninum. O resultado é considerado positivo quando se
observa a fluorescência em todas as partes do taquizoíto (ALVAREZ-GARCIA,
2003). Os pontos de corte utilizados para IFI variam entre os diferentes
laboratórios; em bovinos adultos são utilizados pontos de corte que oscilam entre
1:200 (SCHARES et al., 1998) e 1:640 (CONRAD et al., 1993); na sorologia fetal,
os pontos de corte mais aceitos variam de 1:50 até 1:80 (SILVA, 2004).
A IFI é uma técnica específica, sendo que não foram detectadas
reações cruzadas com outros protozoários relacionados (DUBEY & LINDSAY,
1996). Os inconvenientes observados dizem respeito ao certo grau de
subjetividade na interpretação dos resultados e ao requerimento de experiência
prévia do técnico (BJÖRKMAN & UGLA, 1999).
2.3.3.2 Ensaio imuno-enzimático (ELISA)
A prova de ELISA possui numerosas vantagens, como a simplicidade,
a rapidez, a facilidade de interpretação dos resultados, a capacidade de
automatização e o baixo custo, o que a torna a técnica mais utilizada quando se
analisa um número elevado de amostras (COLLANTES-FERNÁNDEZ, 2003).
Diversas provas de ELISA foram desenvolvidas para a detecção
imuno-enzimática de anticorpos específicos anti - N. caninum, com a utilização de
diferentes tipos de antígenos. O ELISA convencional utiliza antígeno solúvel de
taquizoítos, sendo a técnica de diagnóstico utilizada com maior freqüência na
16
detecção de anticorpos específicos em soro e líquidos fetais (BJÖRKMAN &
UGGLA, 1999). Uma variante do ELISA convencional é o ELISA de competição,
uma prova indireta que utiliza um anticorpo monoclonal que compete com os
anticorpos específicos do soro problema, conferindo maior especificidade em
relação ao ELISA indireto tradicional (ALVAREZ-GARCIA, 2003).
Nos últimos anos, foi desenvolvido ELISA de avidez, que se baseia na
maturação do sistema imune produzido frente à exposição prévia ao parasito. A
estimação da avidez das IgGs anti-N. caninum presentes no soro dos animais
infectados pode ajudar a determinar o momento da exposição ao parasito, com o
objetivo de distinguir entre infecções recentes e crônicas (ALVAREZ-GARCIA,
2003).
2.3.3.3 Western blotting
O western blotting é empregado, essencialmente, para estudar a
composição antigênica do N. caninum, utilizando soros de diferentes espécies
infectadas. Entre os antígenos identificados, destacam-se vários
imunodominantes, de 17 kDa, 29-30 kDa, 37 kDa e 46 kDa (BJERKAS et al.,
1994). Quanto à utilidade no diagnóstico, o western blotting é uma técnica
utilizada em poucos estudos de rebanhos, como apoio a outras provas
sorológicas (IFI e ELISA), para estabelecer valores de concordância e pontos de
corte (SCHARES et al., 1998; SONDGEN et al., 2001).
Posteriormente, foi comprovado que o diagnóstico sorológico fetal
melhorava consideravelmente quando se utilizava o western blotting (SONDGEN
et al., 2001). No futuro, o conhecimento do padrão de reconhecimento específico
de taquizoítos e bradizoítos poderia ser muito útil para distinguir entre as fases
aguda e crônica da infecção por N. caninum (FERRE et al., 2003).
2.3.3.4 Aglutinação direta
A aglutinação direta se baseia na capacidade de aglutinação dos
taquizoítos formalinizados na presença de imunoglobulinas específicas
(ALVAREZ-GARCIA, 2003). Tem como vantagem o fato de não necessitar de um
17
anticorpo secundário espécie-específico, o que torna a técnica mais simples e
com capacidade de ser utilizada para diferentes espécies de hospedeiros
(BJORKMAN & UGLA, 1999).
2.4 Importância econômica
Na literatura consultada não existem dados conclusivos acerca das
perdas econômicas causadas pela neosporose bovina, mas é inquestionável a
sua importância para a cadeia produtiva. Estudos realizados na Califórnia e na
Holanda mostraram que 20% dos abortos em bovinos são causados por N.
caninum; na Bélgica e no Reino Unido, as taxas giram em torno de 12,5%
(DAVISON et al., 1999c; DE MEERSCHMAN et al., 2002); e na Espanha, entre
10,7% e 57%, dependendo da técnica de diagnóstico utilizada (GONZÁLEZ et al.,
1999; PEREIRA-BUENO et al., 2003). Estudos recentes realizados no Canadá
demonstraram uma perda anual por animal atribuída ao N. caninum de
aproximadamente CAD$ 1.766,51 por cem matrizes ou CAD$ 18,00 por matriz
infectada, sendo o aborto responsável por 50% das perdas econômicas
(HADDAD et al., 2005).
Devem ser considerados, dessa maneira, os custos indiretos
associados ao aborto, tais como infertilidade, repetições de cios, assistência
veterinária, gastos com exames para diagnóstico, reposição de animais e possível
queda na produção leiteira.
2.5 Controle da neosporose bovina
Devido à inexistência de um tratamento e de vacinação eficazes frente
à neosporose bovina, os esforços para o controle da infecção devem ser dirigidos
ao estabelecimento de medidas higiênico-sanitárias, com o fim de evitar a
propagação do agente e reduzir o nível de infecção. Tendo em conta o ciclo
biológico do parasito e suas possíveis vias de transmissão, as práticas de manejo
que devem ser instauradas são divididas em função das transmissões vertical e
horizontal (COLLANTES-FERNÁNDEZ, 2003).
18
A medida mais indicada para controlar a infecção congênita é a
redução do número de animais infectados mediante o descarte e a reposição
seletiva (JENSEN et al., 1999). Inicialmente, recomenda-se estudar a taxa de
aborto presente no rebanho: se superior aos níveis admitidos (em torno de 3% a
10%), recomenda-se a realização do diagnóstico etiológico do mesmo (FORAR et
al., 1995). As medidas de controle devem atingir todo o rebanho, sempre em
função das taxas de soroprevalência e aborto. A eliminação das vacas
soropositivas pode ser a medida mais adequada se a soroprevalência for baixa;
porém, se for elevada, as medidas a serem tomadas não devem ser tão drásticas.
Nos animais soropositivos podem ser encontrados diferentes tipos de
manifestações, que influirão na decisão a ser tomada. Vacas que abortaram uma
ou mais vezes devem ser consideradas casos de descarte; vacas soropositivas,
sem antecedentes de aborto, podem atuar como portadoras da infecção,
devendo-se, portanto, evitar a utilização de sua descendência para reposição.
Se a vaca é de alto valor genético e se há o desejo de conservar sua
descendência, é recomendada a realização de sorologia pré-colostral, deixando
para reposição apenas as crias negativas, ou o uso da transferência de embriões,
que foi considerado um método seguro e eficiente para prevenir a transmissão
vertical do parasito (BAILLARGEON et al., 2001; LANDMANN et al., 2002;
CAMPERO et al., 2003). Porém, o uso intensivo da transferência de embriões,
sem exame prévio das receptoras, representa um risco substancial para a
introdução do agente no rebanho. Já o uso de receptoras negativas, mesmo
quando as doadoras são positivas, previne a transmissão vertical, evitando assim
a infecção em crias de alto valor genético (BAILLARGEON et al., 2001).
O risco da transmissão horizontal em bovinos é pouco conhecido e
presumivelmente muito escasso, razões pelas quais pouco se sabe sobre as
possíveis medidas a serem tomadas e a eficácia das mesmas (COLLANTES-
FERNÁNDEZ, 2003). Medidas higiênicas devem ser tomadas com os objetivos de
prevenir contra a infecção dos animais soronegativos e de reduzir a possível
contaminação ambiental pelas diferentes fases do parasito. Deve-se evitar a
ingestão de fetos, fluidos e restos de placentas por cães, bem como o acesso dos
mesmos a locais de comida (pastagens, currais de alimentação) e água,
mantendo sempre os alimentos em lugares fechados ou silos. Além do controle
19
da população de cães, indica-se o controle de roedores, principalmente nos
estábulos.
20
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar a transmissão congênita e a ocorrência de abortos por Neospora
caninum em uma central de transferência de embriões em Nerópolis,
Goiás.
3.2 Objetivos Específicos
Verificar a presença de anticorpos anti-N. caninum em doadoras e
receptoras de embriões;
Verificar a ocorrência de transmissão vertical de N. caninum em receptoras
de embriões;
Verificar a relação entre título de anticorpos anti-N. caninum em receptoras
e a ocorrência de transmissão vertical;
Avaliar a ocorrência de abortos e repetição de cio em receptoras de
embriões positivas para N. caninum.
Avaliar quantidade de embriões produzidos por doadoras de embriões
positivas para N. caninum.
21
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Levantamento de dados e aspectos reprodutivos
Os estudos foram realizados em uma central de transferência de
embriões localizada no município de Nerópolis, Goiás. Dados reprodutivos, como
repetição de cios, ocorrência de abortos e quantidade de embriões produzidos,
foram obtidos por meio de fichas individuais pertencentes ao banco de dados da
própria instituição.
Foram utilizadas fêmeas bovinas, sendo que as doadoras eram todas
da raça Nelore e as receptoras mestiças (Zebu/Holandês). Todos os animais
utilizados para transferência de embriões eram negativos ao exame sorológico
para brucelose e tuberculose e vacinados contra leptospirose, IBR e BVD, além
de serem tratados contra leptospirose, com antibióticos, antes de cada programa.
A Transferência de Embriões (TE) foi realizada sempre pelo mesmo
técnico, pelo método transcervical, não-cirúrgico. As doadoras foram
superovuladas e a inseminação foi realizada em tempo fixo, com a sincronização
de cios entre receptoras e doadoras.
4.2 Colheita de amostras
Foram colhidas amostras de sangue de 61 doadoras, 101 receptoras e
90 bezerros. As colheitas nas vacas foram realizadas após a inovulação das
receptoras. Para evitar possíveis transtornos aos animais, não foram colhidas
amostras antes do programa de TE, uma vez que as doadoras estavam sendo
inseminadas e passariam pelo processo de colheita de embriões, e as receptoras
apresentavam gestação recente. O material foi colhido após os 60 dias de
gestação das receptoras e após o término do programa de TE nas doadoras. As
amostras individuais de sangue venoso foram colhidas na veia coccígea nos
animais adultos e na veia jugular nos bezerros, em tubos tipo Vacutainer®, sem
anticoagulante, para a obtenção de soro. As colheitas foram realizadas nas
receptoras, durante toda a gestação, em intervalos de aproximadamente 60 dias,
com uma média de quatro a cinco colheitas por animal. Nos bezerros a colheita
22
foi realizada logo após o nascimento, antes da ingestão do colostro até os sete
meses de idade, para avaliação da transmissão vertical, com uma média de três a
cinco colheitas por bezerro. O sangue colhido foi levado ao laboratório do Centro
de Parasitologia da Escola de Veterinária/UFG e centrifugado para obtenção do
soro, que foi identificado e mantido a -20ºC até o momento de realização do
exame.
4.3 Detecção de anticorpos anti-Neospora caninum
Para a detecção de anticorpos específicos anti - N. caninum foi
utilizada a técnica de imunofluorescência indireta (IFI). O antígeno foi preparado
por meio da multiplicação de taquizoítos de N. caninum (amostra Nc-1) em
cultivos de células Marc-145.
4.4 Cultivo de células (manutenção)
Células Marc-145 foram mantidas em frascos para cultivo celular, com
meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, GIBCO®) suplementado com
solução antibiótica e antimicótica (GIBCO®), tampão HEPES (GIBCO®, 20mM) e
soro fetal bovino (GIBCO®) a 5%, em estufa para cultivo celular, a 37oC com 5%
de CO2.
Após a observação de uma monocamada celular íntegra e com
capacidade de multiplicação, o cultivo foi lavado com solução salina tamponada
(PBS - pH 7,4). O sobrenadante foi eliminado, adicionando posteriormente
solução de tripsina-EDTA (GIBCO®) e o frasco foi incubado a 37ºC por dois
minutos, para permitir que as células se despregassem. O número de células por
mL foi contado em câmara de Neubauer e posteriormente repassado para outros
frascos, utilizando-se o mesmo meio.
4.5 Cultivo de Neospora caninum
Taquizoítos de N. caninum (amostra Nc-1), foram mantidos “in vitro”,
em cultivos de células Marc-145, com repasses semanais.
23
Os repasses foram realizados quando a maioria (>90%) das células do
frasco de cultivo se encontrava lisada. As células foram raspadas para que
pudessem ser despregadas da superfície do frasco. O sobrenadante resultante do
raspado foi transferido a um frasco estéril, de onde foram colhidos 100 µL,
adicionados a 900µL de azul de Tripan em tubo eppendorf, para contagem do
número de taquizoítos presentes e verificação da viabilidade dos mesmos, em
câmara de Neubauer.
4.6 Preparação de antígeno anti-Neospora caninum
A obtenção de taquizoítos e sua purificação foram realizadas mediante
o uso de colunas PD-10, que têm capacidade de remover solutos de baixo peso
molecular e reter partículas grandes, como células, com excelente percentagem
de recuperação de parasitos viáveis.
O procedimento foi realizado da seguinte maneira:
• Foram cultivadas 15x105 células MARC-145 em frasco de cultivo de
75 cm2, com DMEM suplementado com 10% de SFB.
• Ao terceiro ou quarto dia, observou-se a presença de lacunas e
vacúolos parasitóforos em quantidade suficiente para proceder a
purificação.
• O tapete infectado foi raspado com um cell scraper, passado por
seringa com agulha de 25G para um tubo falcon, para assegurar a
ruptura das células infectadas.
• O conteúdo foi centrifugado a 1.350g durante 15min e o
sobrenadante descartado. O sedimento contendo os taquizoítos foi
ressuspendido em 10mL de PBS 1x.
• A quantidade de taquizoítos obtidos foi contada em uma câmara de
Neubauer e novamente centrifugada a 1.350g durante 15min. O
sobrenadante foi descartado.
• O pellet foi ressuspendido em 5mL de PBS 1x e a coluna foi
equilibrada com 20mL de PBS 1x. Os taquizoítos ressuspendidos
foram filtrados passando pela coluna.
24
• Depois de filtrados, os taquizoítos foram contados novamente em
câmara de Neubauer, com azul tripan a 0,05%, e novamente
centrifugados como descrito anteriormente.
• O pellet formado foi ressuspendido em PBS 1x a uma razão de
1x108 parasitos/mL, com formol a 0,1%, e aliquotado em
eppendorfs de 1,5mL.
4.7 Técnica de Imunofluorescência Indireta (IFI)
Esta técnica se fundamenta na união do antígeno de N. caninum aos
anticorpos que possam estar presentes no soro pesquisado, e do soro a uma
imunoglobulina G anti-bovina marcada com uma substância fluorescente, o
isotiocianato de fluoresceína (FITC).
A técnica foi realizada da seguinte maneira:
Preparação das lâminas:
• Nas lâminas demarcadas para IFI foram adicionados, em cada
pocinho, 9 µL de antígeno. Elas foram deixadas para secar em
temperatura ambiente e, após estarem secas, foram fixadas em
acetona a -20°C por 10min e lavadas com água destilada por
10min em agitação.
Diluição do soro e conjugado:
• Foi realizada uma diluição inicial do soro de 1:50, com diluições
subseqüentes ao dobro, sendo o resultado considerado positivo
quando foi observada fluorescência em todo o taquizoíto, na
diluição de 1:200. Nas amostras positivas foi realizada a titulação
dos anticorpos, em diluições ao dobro, partindo de 1:50. O
conjugado anti-IgG bovina (Sigma®) foi diluído a 1:300 em azul
de Evans a 0,2% em PBS.
Controle:
• Em todas as lâminas foram adicionados controles positivo e
negativo, a fim de evitar possíveis erros.
25
Imunofluorescência:
• Acrescentou-se 9 µL do soro-teste em cada pocinho e as lâminas
foram incubadas em câmara úmida, em estufa a 37°C, durante
30min.
• As lâminas foram lavadas com PBS 1x (2x 10min) e uma vez com
água destilada (10min) em agitação.
• Acrescentou-se 9 µL do conjugado por pocinho. As lâminas foram
incubadas em câmara úmida em estufa a 37°C durante 30min.
• As lâminas foram lavadas novamente com PBS 1x (2 x 10min) e
uma vez com água destilada (10min) em agitação.
• Foram secas em temperatura ambiente, sem presença de luz.
• Glicerina tamponada foi adicionada em gotas nas lâminas, que
foram cobertas com lamínulas. A leitura foi feita em microscópio
de fluorescência, com objetiva de 40x.
4.8 Avaliação da transmissão vertical e titulação de anticorpos maternos
Esta avaliação foi realizada por meio do exame dos soros colhidos dos
bezerros, antes da ingestão de colostro, e pela titulação dos anticorpos anti-N.
caninum dos soros das receptoras positivas.
4.9 Análise estatística
A probabilidade de ocorrência de transmissão vertical foi verificada pela
fórmula p = x/(x+y), na qual x é a freqüência de bezerros positivos nascidos de
vacas positivas e y é a freqüência de bezerros negativos nascidos de vacas
positivas. O intervalo de confiança foi medido através da fórmula:
p ± 1,96 √ p (1-p)/(x+y)
A existência de relações entre a titulação da mãe e a transmissão
vertical de N. caninum e entre a produção de embriões de vacas positivas e
negativas foi avaliada pelo teste do X2.
26
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram analisadas amostras de soros de 101 receptoras, 61 doadoras e
90 bezerros. Desse total, oito das 101 receptoras abortaram e três bezerros
morreram logo após o nascimento, de causas não determinadas.
5.1 Ocorrência de anticorpos anti-Neospora caninum
Das 101 receptoras, 33 foram positivas ao diagnóstico por IFI. Entre as
doadoras que participaram do experimento, 16 foram positivas, e entre os
bezerros, apenas seis foram positivos (Tabela 1).
Tabela 1 – Ocorrência de anticorpos anti-N. caninum em bovinos provenientes de central de transferência de embriões, realizada por IFI (titulação ≥ 1:200) no período de 04/2005 a 10/2006, Nerópolis-GO
Animais Positivos Negativos Total
Receptoras 33 (32,67%) 68 (67,33%) 101
Doadoras 16 (26,22%) 45 (73,78%) 61
Bezerros 6 (6,66%) 84 (93,34%) 90
Total 55 (21,82%) 197 (78,18%) 252
No estado de Goiás, a neosporose bovina é pouco estudada, sendo
escassos os levantamentos de prevalência de N. caninum.
No Brasil, país líder mundial na produção de embriões (RUBIN, 2005),
não há registro de estudos sorológicos para N. caninum em centrais de
transferência de embriões. Na literatura consultada, entre os trabalhos publicados
até o momento sobre a neosporose bovina, apenas três foram realizados com
doadoras e receptoras de embriões (BAILLARGEON et al., 2001; LANDMANN et
al., 2002; CAMPERO et al., 2003).
Do total de receptoras deste estudo, foi encontrada uma
soroprevalência de 32,67% para N. caninum. Uma vez que estas provêm
geralmente de rebanhos leiteiros, tal resultado condiz com MELO et al. (2006),
que realizaram um estudo de soroprevalência nas microrregiões de Goiânia e
27
Anápolis, onde foram colhidas amostras sorológicas de gado de corte e de leite e
observada uma média de 30,43% de animais soropositivos. Este resultado é
superior aos encontrados por BRAUTIGAN et al. (1996) e GONDIM et al. (1999),
que verificaram uma soroprevalência de 15% no estado de São Paulo e de 14%
na Bahia, respectivamente, em rebanhos de aptidão leiteira. No Rio Grande do
Sul, foi constatado que 23,3% das vacas com histórico de aborto eram
soropositivas para N. caninum, enquanto que nas demais essa prevalência foi de
8,3% (CORBELLINI et al., 2002).
Em relação às doadoras, foi encontrada uma soroprevalência de
26,2%, índice menor que das receptoras. Isso deve-se provavelmente ao manejo
diferenciado destas, que ficam em pastos exclusivos ou em baias individuais,
recebendo tratamento e manejo especializados.
5.2 Transmissão vertical
A taxa de transmissão vertical verificada em soros pré-colostrais das
crias foi de 24% (Tabela 2).
Tabela 2 – Ocorrência de anticorpos anti-N. caninum em bezerros nascidos de receptoras positivas ou não ao N. caninum, realizada por IFI (titulação ≥ 1:200)
Animais Positivos Negativos Total
Bezerros nascidos de mãe positiva 6 (24%) 19 (76,0%) 25
Bezerros nascidos de mãe negativa 0 (0%) 65 (100%) 65
Total 6 (6,6%) 84 (93,4%) 90
BAILLARGEON et al. (2001) e LANDMANN et al. (2002) demonstraram
que a transferência de embriões é uma técnica segura e eficiente de controle da
transmissão vertical, uma vez que os embriões provindos de doadoras positivas,
se transferidos para receptoras negativas, rompem o ciclo da infecção congênita.
Porém, o contrário pode acontecer: se ocorrer a transferência de embriões de
doadoras, tanto negativas como positivas, para receptoras positivas ao N.
caninum, estas são capazes de transmitir a infecção ao feto. No estudo de
28
BAILLARGEON et al. (2001), o índice de transmissão vertical foi de 75% quando
embriões foram implantados em receptoras positivas. CAMPERO et al. (2003)
obtiveram resultado semelhante: não houve o nascimento de bezerros positivos
para N. caninum quando implantaram embriões de doadoras positivas em
receptoras negativas. Entretanto, todas as receptoras positivas obtiveram crias
positivas.
Neste experimento, observou-se índice de transmissão vertical (24%)
inferior aos índices encontrados nos estudos citados. Entretanto, houve a
ocorrência de seis abortos e duas mortes de bezerros provenientes de receptoras
positivas. Embora não tenha sido possível confirmar se N. caninum foi o agente
primário desses abortos e mortes, essa possibilidade é grande, se for considerada
a positividade das receptoras. Neste caso, se as perdas forem atribuídas à
neosporose, a taxa de transmissão congênita será de 42,4%.
Em outros estudos realizados em rebanhos, que não utilizaram a
técnica de transferência de embriões, foram encontradas taxas de 75%, 94%,
81% e 95% de transmissão vertical, respectivamente (HALL et al., 2005,
SCHARES et al., 1998, PARÉ et al., 1996, DAVISON et al., 1999b).
PARÉ et al. (1996) relataram que a baixa probabilidade de transmissão
vertical pode ser ocasionada por uma estimulação contínua do sistema imune
materno, especialmente a resposta imune celular, em condições de
endemicidade. As fêmeas podem estar expostas ao parasito com freqüência,
produzindo estímulo contínuo do sistema imune, suficiente para prevenir a
exposição do feto frente a uma dose infectante de taquizoítos. Entretanto, não há
evidência conclusiva sobre o papel do sistema imune maternal na prevenção da
transmissão vertical.
5.3 Relação entre títulos de anticorpos e transmissão vertical
Houve diferença estatisticamente significativa entre o título de
anticorpos anti-N. caninum materno e a ocorrência de transmissão vertical. As
receptoras com título maior ou igual a 1:400 durante o período de gestação
apresentaram maior taxa de transmissão vertical (Tabela 3).
29
Tabela 3 – Relação entre título de anticorpos anti-N. caninum maternos e transmissão vertical
Título-mãe (IFI) Bezerros positivos Bezerros negativos Total
≤ 1:200 1 71 72
≥ 1:400 5 13 18
Total 6 84 90 X2 = 15,459; p≤0,001
No Gráfico 1, é possível observar que houve transmissão vertical em
receptoras que mantiveram titulação alta durante a gestação ou que tiveram
aumento nos títulos de anticorpos em determinada época da gestação. Somente
uma receptora (vaca número 6), na qual foi observada a transmissão vertical,
manteve titulação baixa (≤ 1:200).
Gráfico 1 – Cinética de anticorpos anti-N. caninum em receptoras que transmitiram a infecção ao bezerro, em central de transferência de embriões, Nerópolis, GO
10
100
1000
10000
60 110 160 200 260
dias de gestação
Títu
lo A
c
vaca 1 vaca 2 vaca 3 vaca 4 vaca 5 vaca 6
200
400
6400
3200
Títu
lo d
e A
c (lo
g)
0
800
30
PARÉ et al. (1996) em seus estudos, por meio da infecção
experimental de vacas em diferentes idades gestacionais, verificaram que as
reprodutoras com títulos elevados de anticorpos ao redor do 240º dia de gestação
tinham maior probabilidade de gerar bezerros soropositivos ao nascimento.
A associação significativa entre as flutuações de anticorpos detectadas
ao longo da gestação e a transmissão congênita foi também explicada por
PEREIRA-BUENO et al. (2000), uma vez que o aumento do título de anticorpos
durante o sexto mês de gestação foi relacionado com o nascimento de bezerros
congenitamente infectados.
5.4 Índices reprodutivos
Neste estudo, não foi encontrada diferença estatística entre receptoras
soropositivas e soronegativas a N. caninum em relação ao índice de repetição de
cio (Tabela 4). Este resultado foi diferente do observado por HALL et al. (2005),
que demonstraram que vacas soropositivas requerem maior número de
inseminações por concepção do que vacas soronegativas. HALL et al. (2005)
encontraram resultados semelhantes aos de STENLUD et al. (1999), nos quais
vacas soronegativas à enfermidade receberam 1,7 dose de sêmen para ficarem
prenhas, enquanto as soropositivas necessitaram de 2,2 doses de sêmen.
Existem evidências de que vacas soropositivas ao N. caninum sejam
eliminadas antecipadamente do rebanho, por apresentarem um baixo
desempenho reprodutivo (THURMOND & HIETALA, 1996). Isso ocorria na central
onde foi realizado este estudo: as receptoras que repetiam cio por mais de uma
vez ou que abortavam uma única vez eram descartadas e substituídas. Talvez por
este motivo não se observou diferença entre os dois grupos em relação à
repetição de cios.
31
Tabela 4 – Taxa de repetição de cios entre receptoras positivas e negativas para N. caninum
Animais Repetiram cio Não repetiram cio Total
Vacas positivas 11 (37,9%) 18 (62,1%) 29
Vacas negativas 24 (36,3%) 42 (63,7%) 66
Total 35 (35,8%) 60 (64,2%) 95 X2 = 0,02065; p>0.001
Também não houve diferença significativa entre a quantidade de
embriões produzidos por 26 doadoras, das quais foi possível a obtenção dos
dados, e o índice de prenhez das receptoras, de acordo com positividade das
doadoras para N. caninum (Tabela 5). Estes dados estão de acordo com o
observado por BAILLARGEON et al. (2001), em que os índices foram
praticamente os mesmos em grupos de doadoras positivas e negativas.
Provavelmente isso ocorre devido ao fato de que a zona pelúcida protege os
embriões contra a invasão de N. caninum, fazendo com que estes possam ser
transferidos com segurança para as receptoras (CAMPERO et al., 2003). Não foi
avaliada neste estudo a qualidade dos embriões em relação à positividade das
doadoras, uma vez que todos os embriões transferidos eram de boa qualidade
(graus I e II).
Tabela 5 - Quantidade de embriões produzidos por doadoras positivas e negativas ao N. caninum e índice de prenhez das receptoras
Animais Número de doadoras Embriões produzidos
Índice de prenhez
Doadoras positivas 9 106 50 (47,16%)
Doadoras negativas 17 137 67 (48,90%)
Total 26 243 117 (48,10%) X2= 0,0252; p>0.001
5.5 Ocorrência de abortos
Foram verificados oito casos de aborto, dos quais seis (75%)
ocorreram em receptoras positivas para N. caninum e dois (25%) em receptoras
32
negativas. Não foi possível diagnosticar a causa primária dos abortos, pois os
fetos não foram recuperados.
Dentre as receptoras positivas que abortaram, três apresentaram, no
momento do aborto, título de anticorpos anti-N. caninum de 1:200. Dessas, duas
tiveram o diagnóstico de aborto realizado aos 60 dias de gestação e uma abortou
aos sete meses de gestação. Outras duas apresentaram títulos de 1:400, sendo
que uma teve o diagnóstico de aborto aos 60 de gestação e outra abortou no
quinto mês. A outra ocorrência de aborto foi em uma receptora que apresentava
título 1:1600 e que foi diagnosticado aos 60 dias de gestação.
O número de abortos ocorridos em relação ao número total de
receptoras positivas e negativas pode ser observado na Tabela 6.
Tabela 6 – Número de abortos ocorridos em relação ao número total de receptoras positivas e negativas ao N. caninum
Abortaram Não abortaram Total
Receptoras positivas 6 (18,18%) 27 (81,82%) 33
Receptoras negativas 2 (2,94%) 66 (97,06%) 68
Total 8 (7,92%) 93 (92,08%) 101
PARÉ et al. (1996), em seus estudos com infecção experimental de N.
caninum, verificaram que as reprodutoras com títulos de anticorpos elevados
entre os dias 180 e 210 de gestação teriam maior probabilidade de abortar.
QUINTANILLA-GOZALO et al. (2000) detectaram flutuações de anticorpos em
reprodutoras com infecção natural ao longo da gestação, sendo os maiores títulos
de anticorpos encontrados nas fêmeas que abortaram na metade da gestação,
coincidindo com o momento do aborto.
Nos resultados deste experimento observou-se que a ocorrência de
abortos entre as receptoras soropositivas foi de 18,18%, enquanto a ocorrência
entre receptoras soronegativas foi de 2,94%, demonstrando uma alta
probabilidade de abortos em fêmeas positivas. Este resultado assemelha-se ao
relatado por HALL et al. (2005), no qual 31,3% de vacas soropositivas ao N.
caninum abortaram, contra 2,4% de vacas soronegativas. Segundo THURMOND
33
& HIETALA (1996), em rebanhos com moderada (10% a 20%) ou alta (>20%)
soroprevalência de infecção por N. caninum, os abortos podem ser freqüentes e
distribuídos por todo ano. O risco de aborto é duas ou três vezes mais alto nos
rebanhos soropositivos do que nos soronegativos (PARÉ et al., 1997; MOEN et
al., 1998; DAVISON et al.,1999c).
34
6 CONCLUSÕES
A partir dos resultados encontrados, podemos concluir que, na central
de transferência de embriões avaliada::
• Neospora caninum está presente em receptoras e doadoras de
embriões.
• A transmissão congênita de N. caninum e a ocorrência de
abortos são significativamente maiores em receptoras positivas.
• O título alto de anticorpos (≥1:400) influencia na ocorrência de
transmissão vertical de N. caninum.
• A positividade para N. caninum das doadoras de embriões não
interfere na produção dos embriões.
• A transferência de embriões é uma técnica segura para evitar a
transmissão vertical de N. caninum, quando são utilizadas
receptoras negativas.
• O diagnóstico sorológico em vacas receptoras é de fundamental
importância onde a transferência de embriões é desempenhada
rotineiramente.
35
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