Uma perspectiva estrutural em onde, como,

UMA PERSPECTIVA ESTRUTURAL EM ONDE, COMO, POR QUE E O QUE DO POSICIONAMENTO DO NUCLEOSSOMO

INTRODUÇÃO

• DNA eucariótico associado à proteínas é compactado numa estrutura chamada cromatina, que é composta por pequenas unidades repetidas chamadas nucleossomos (nucleos de 8 proteínas histônicas - H2A, H2B, H3 e H4- enrolados por DNA)

• Núcleo do nucleossomo regula a acessibilidade ao DNA por outras macromolécula (como fatores de ligação) posição desses nucleossomos fornecem evidencias importantes para a compreensão do empacotamento da cromatina e regulação gênica.

• Neste artigo: Revisão de avanços recentes no mapeamento da posição dos

nucleossomos em todo o genoma, os determinantes moleculares e estruturais do posicionamento dos nucleossomos e a importância do posicionamento do nucleossomo

• Nucleossomos e cromatina exercem controle nas seqüências de DNA e sobre processos como transcrição, replicação, recombinação e reparo.

• Modificações pós-traducionais na histona, variantes de histona, enzimas remodeladoras e outras proteínas arquiteturais tem um papel importante na regulação da cromatina.

• “Posicionamento do nucleossomo”—ou seja, a probabilidade de um nucleossomo começar num determinado par de bases— também tem um papel importante na regulação gênica

• Assim, nucleossomos podem não estar distribuídos aleatoriamente mas sim posicionados em regiões específicas por algum motivo.

INTRODUÇÃO

Posicionamento do nucleossomo pode ser caracterizada através:

1. “Nucleosome repeat length” (NRL) – comprimento médio do DNA associado com um nucleossomo (DNA nucleossomal e DNA de ligação). Como comprimento do DNA que circula o octâmero de histonas é sempre o mesmo, o DNA ligante é o que varia o NRL

INTRODUÇÃO

Nucleossomo “vago”– flutuações na probabilidade de um nucleossomo se posicionar num locus gênico obtido por uma série de medições. Nucleossomos posicionados fortemente se mostram como picos acentuados no mapa de posicionamento do nucleossomo. Já no posicionamento vago ou indistinto, a localização do pico se mostra borrada por causa da deslocação do nucleossomo.

INTRODUÇÃO

Ocupação do nucleossomo – presença ou absença de um nucleossomo numa seqüência específica no genoma, como sítios de ligação de fatores de transcrição. Difere de posicionamento de nucleossomo no sentido de que na ocupação não interessa onde o nucleossomo começa, contanto que cubra um determinado par de bases.

INTRODUÇÃO

“Nucleosome phasing” – um agrupamento de posições repetidas de nucleossomos no DNA sobre certos genes ou domínios cromossômicos. “phasing” do nucleossomo tende a refletir o NRL mas, ao contrario deste, é ligado a uma seqüência de DNA específica.

INTRODUÇÃO

ONDE OS NUCLEOSSOMOS ESTÃO POSICIONADOS?

Posicionamento global dos nucleossomos

Varia de espécie para espécie e entre os tecidos, especialmente no DNA ligante

O comprimento do DNA ligante depender da neutralização da carga in vitro

in vivo - ele deve depender da atividade transcricional do genoma. Em organismos pluricelulares o NRL parece refletir mudanças tecido-específica ou célula-específica

Depende de sua localização cromossomal quantidade nucleossomos relacionado diretamente com atividade transcricional (Escassos no telômero, excessivos no centrômero, + em regiões codificantes do gene, - em regiões intergênicas e não codificantes, como promotores.)

Ou transcrição induz aglomeração de nucleossomos

Ou transcrição requer formação de estruturas nucleossomicas ordenadas, talvez para aumentar o tempo de permanência da polimerase em cada sitio afim de obter maior fidelidade

MAS: alguns genes altamente transcritos não tem muitos nucleossomos, o que abre espaço para mais discussão.


Padrões de posicionamento local Promotor aberto:


•Geralmente sem TATA, com “região exaurida de nucleossomo” (NDR) à montante (upstream) do “sitio de inicio transcricional” (TSS).

•A extremidade +1 do nucleossomo tende a se posicionar no TSS

• O padrão dos nucleossomos a montante do TSS perde periodicidade rapidamente

•A ocupação média de nucleossomo é freqüentemente mais alta a jusante do TSS (dentro do gene) quando comparado a regiões intergênicas a montante

•Os nucleossomos perto de TSS geralmente contem a variante H2A.Z ao invés da histona H2A

Promotores fechados:


• Sem uma assinatura NDR clara, mas completamente ocupado por nucleossomos ou tendo uma taxa de ocupação crescente a jusante de TSS;

• Geralmente com TATA-box;

• O TSS e a maioria do sítios de ligação a ativadores transcricionais estão ocupados e um sitio (ou DNA de ligação ou no DNA nucleossomal perto da entrada /saída) está exposto;

• Exemplo: promotor PHO5.

Finalizadores transcricionais: padrão de posicionamento no sitio do finalizador 3’ dos genes, que é ocupado por nucleossomo seguido por NDR na região intergênica a jusante.

Isoladores de cromatina: seqüências de DNA que segregam sítios genomicos vizinhos . Podem desconectar um promotor do acentuador próximo ou separar domínios reprimidos de domínios ativos

CTCF é uma proteína de ligação a isoladores que é essencial para atividade de isolação, tendo um papel importante na organização estrutural e espacial no núcleo interfásico.


COMO OS NUCLEOSSOMOS SÃO POSICIONADOS?

Efeitos da sequencia do DNA

In vitro – posicionamento de nucleossomos pode ser baseada apenas na seqüência de DNA

In vivo – ainda não é claro o quanto a seqüência de DNA influencia

DNA sequence bendability:

• Preferência nucleossomica por seqüência DNA: mecânica dependente da seqüência do DNA

• Seqüências mais favoráveis:• AA/TT/AT: permite expansão do sulco maior• Dicnucleotideos GC em intervalos de 10pb: permite contração

= facilitar forte dobramento do DNA no nucleossomo

Grupos de Widom e Pugh – propõem a existência de um código de posicionamento de nucleossomos no DNA

MAS apenas uma fração do posicionamento de nucleossomos é intrinsecamente devido a seqüência

Trifonov et al – forte seqüência de posicionamento a cada 4 nucleossomos em partes do genoma humano

Analogia com estacionamento

Seqüência de DNA codifica a presença de nucleossomos nas posições – 1 e + 1 do promotor, na abstenção de nucleossomos na região NDR do promotor e no posicionamento da terminação 3’ do nucleossomo

Seqüência de DNA parece não codificar posicionamento para regiões codificantes



“Linker histone binding”: • A seqüência de DNA pode “aprisionar” ou “reprimir” o

posicionamento “linker histone binding”

• Isso sugere que a seqüência de DNA ligante pode mediar “linker histone binding” e determinar os limites do núcleo/ligador

• Previsões do posicionamento do nucleossomo precisam levar em conta tais padrões adicionais nos limites nucleossomos para posicionamento adequado dos nucleossomos no genoma

Forças físicas do posicionamento Posicionamento estatístico:

“Phasing” de nucleossomo observado em genes é ordenado pelos princípios estatísticos de posicionamento;A presença de uma barreira física restringe a posição do nucleossomo vizinho, que por sua vez age como uma barreira para o próximo nucleossomo, começando assim uma cadeia de restrições de posicionamento que diminui com o distanciamento da barreira original

Ligação da polimerase: “Phasing” do nucleossomo a jusante do nucleossomo +1 nucleossomo no TSS é relacionado com a iniciação transcricional e ligação de polimerase


Empacotamento de nucleossomo e restrição de interações: - O dobramento tridimensional da fibra de cromatina também impõe restrições

nas posições que permitem nucleossomos- Posições de nucleossomos que levaria à sobreposição no espaço 3D não

seria favorecido no espaço 1D.- Interações de atração internucleossomais mediadas pelas caudas das

histonas e interações repulsivas entre o DNA no nucleossomo também influencia o arranjo 3D (e também o 1D) dos nucleossomos.


Interações com os fatores de transcrição:

- Proteínas associadas ao DNA (como fatores de transcrição) podem competir com nucleossomos pelos sítios de ligação.

- Muitos sítios de ligação a fatores de transcrição são encontrados nas regiões exauridas de nucleossomo como o DNA de ligação.


Ação enzimática Remodeladores de cromatina: Remodeladores SWI/SNF – disruptivos e pode deslizar ou expulsar nucleossomos.

Possuem papel importante na ativação do promotor.Remodeladores ISWI - não são disruptivos e estão envolvidos no posicionamento dos

nucleossomos. Variantes de histonas e modificações pós-traducionais

Modificações pós-traducionais podem alterar a interação entre DNA e histonas para modificar a preferência por seqüência de DNA pelo nucleossomo, alterar “nucleosome repeat lengths”, a interação entre os complexos remodeladores de cromatina e com outras proteínas arquiteturais.

Substituição de histonas importantes por variante que modulam as interações DNA/histonas e alteram a interação internucleossomal também pode afetar o posicionamento de nucleossomos

Metilação de DNA pode alterar a preferência do nucleossomo por certas seqüência, pois pode diminuir o dobramento do DNA.


POR QUE OS NUCLEOSSOMOS SÃO POSICIONADOS NAS REGIÕES PROMOTORAS DO GENE?

Posicionamento do nucleossomo em promotores ocupados

Promotores estão quase ou completamente ocupados com nucleossomos.

Como isso reduz o risco de transcrição irregulada, promotores repletos de nucleossomos estão associados com gene que requerem uma regulação rigorosa

Taxa de transcrição é inversamente proporcional com a ocupação de nucleossomos

O propósito do posicionamento do nucleossomo em promotores fechados em genes altamente regulados é impedir a ligação de TF

Distribuição especifica de nucleossomos próximas a promotores de gene: em todo genoma, em vários organismos = grande importancia Contribuir com a reunião da maquinaria transcricional no promotor

Posicionamento dos nucleossomos em promotores abertos• Geralmente associados com genes constitutivos que não necessitam de

regulação tão rigorosa, podendo ter sítios de ligação TF disponíveis permanentemente

• Não possuem TATA • A taxa de transcrição é diretamente proporcional a ocupação por

nucleossomos. • Objetivo principal produzir um NDR que facilite o reconhecimento e

ligação das seqüências do promotor pelos TFs para transcrição• O sítio 3’ de terminação trascricional de vários genes também contem

nucleossomos bem posicionados seguidos por um NDR.• Pode ser que o NDR seja necessário para facilitar a desmontagem da

maquinaria da polimerase


Padrões nas modificações das histonas e variantes de histona nos promotores

Os nucleossomos do promotor também são afetado por modificações pos-traducionais como metilação da lisina 4 da cauda de H3 e múltiplas acetilações de lisina;

A modificação do nucleossomo +1 garante que essas modificações nucleossomo forneçam plataformas de ligação para TFs necessárias para ativação da transcrição

A variante de histona H2A.Z está associada com o posicionamento de nucleossomos

Quando comparado com H2A, a variante H2A.Z promove compactação dos nucleossomos na mesma fibra, mas inibe a interação de nucleossomos entre as fibras , mantendo assim a matriz de nucleossomos em um estado dinâmico compacto


Dinâmica do posicionamento dos nucleossomos sobre ativação ou repressão do gene Ativação ou repressão de um gene dá inicio a mudanças perceptiveis no

posicionamento nucleossomal. Nucleossomos são “expulsos” de genes ativados e são alocados em genes reprimidos MAS mudanças no posicionamento nucleossomal é restrito a apenas alguns

nucleossomos. O deslocamento do nucleossomo de sua posição inicial no TSS para algumas

posições a jusante também está associado a ativação de um gene Algumas vezes há mudanças no posicionamento de nucleossomos mesmo quando o

estado do gene permanece igual, possivelmente se preparando para processos futuros

Há uma maior “rotatividade” de nucleossomos em regiões promotoras e menos em regiões codificantes.

Essa alta rotatividade promove “phased” nucleossomos dinâmico dos nucleossomos nos promotores é regida por um mecanismo preciso


QUAL É A FUNÇÃO DO POSICIONAMENTO DO NUCLEOSSOMO NA ESTRUTURA DA CROMATINA DE ORDEM SUPERIOR?

Efeito das variações rotacionais locais Fibras de cromatina parcialmente dobradas: Observadas durante a interfase, tem uma conformação em zigzag com DNAs

de ligação relativamente retosLigação de “linker histones” estabiliza essa confirmação As posições nucleossomais são um dos principais determinantes da

estrutura da cromatina.

Fibras de cromatina completamente dobradas: Não está claro a configuração do DNA de ligação nesses casos Alguns modelos se baseiam em DNA de ligações retas, outros em DNA de

ligação super-helicoidizada (levando a arranjos solenóides), mas todos assumem que o espaçamento entre nucleossomos é regular

Espaçamento irregular não possibilitaria tamanha condensação ? MAS alguns resultados sugerem que o DNA ligante tem flexibilidade suficiente

para absorver pequena variabilidade entre os nucleossomos vizinhos. Analises computacionais revelam um maior variabilidade3 conformacional no

angulo do DNA de ligação que combina traços da organização zigzag e da solenóide

A estrutura da fibra de cromatina parece ter uma capacidade intrínseca de incorporar variabilidade conformacional dos DNA de ligação sem que isso afete a arquitetura da fibra


Efeito do “Nucleosome Repeat Length” (NRL)

Diferenças no NRL em dezenas de nucleotídeos influenciam a morfologia e a compactação da cromatina

Há aumento no diâmetro da cromatina de ~33 nm para cromatina com DNA de ligação de medindo 30-60 bp para ~42 nm DNA de ligação medindo 70-90 bp.

O comprimento do DNA de ligação também ordena se a histona ligação é necessária para maior compactação ou não

Cromatina que possui maior DNA de ligação requer histona de ligação para compactação

A cromatina com DNA de ligação mais longo é geralmente menos ativo transcricionalmente (talvez pela função repressiva da histona de ligação)


Histonas de ligação também podem facilitar a compactação da fibra de cromatina através de auto-associação, que pode apresentar um nível adicional de compactação da cromatina de ordem superior

os genes que não são mais necessárias pela célula poderiam ser globalmente alterados pela organização do seu nucleossomos em repetições uniformes através da ação dessas enzimas, sem muita dependência na seqüência de DNA.

A ativação dos genes poderia ser auxiliado através da ruptura nucleossomo local, medida por outra classe de enzimas remodelação, SWI / SNF, cuja função é desorganizar a estrutura da cromatina de forma gene-específica


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