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UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE BAURU
MARCELA MARTINI TAGLIANI
Efeitos comparativos de diferentes geacuteis agrave base de Cranberry
e Proantocianidina sobre a dentina submetida agrave erosatildeo
estudo in vitro
BAURU
2015
MARCELA MARTINI TAGLIANI
Efeitos comparativos de diferentes geacuteis agrave base de Cranberry
e Proantocianidina sobre a dentina submetida agrave erosatildeo
estudo in vitro
Tese apresentada agrave Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de Satildeo Paulo para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutora em Ciecircncias no Programa de Ciecircncias Odontoloacutegicas Aplicadas na aacuterea de concentraccedilatildeo Sauacutede Coletiva Orientador Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio
Versatildeo corrigida
BAURU
2015
Nota A versatildeo original desta tese encontra-se disponiacutevel no Serviccedilo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo da Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP
Tagliani Marcela Efeitos comparativos de diferentes geacuteis agrave base
de Cranberry e Proantocianidina sobre a dentina submetida agrave erosatildeo estudo in vitro Marcela Martini Tagliani ndash Bauru 2015
80p il 30cm
Tese (Doutorado) ndash Faculdade de Odontologia de Bauru Universidade de Satildeo Paulo
Orientador Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio
T128e
Autorizo exclusivamente para fins acadecircmicos e cientiacuteficos a reproduccedilatildeo total ou parcial desta tese por processos fotocopiadores e outros meios eletrocircnicos
Marcela Martini Tagliani
Data
DEDICATOacuteRIA
Dedico essa tese a Stella e Vivian minhas filhas
A Paulo e Eliana meus pais
Se eu pudesse novamente viver a minha vida na proacutexima trataria de cometer mais erros Natildeo tentaria ser tatildeo perfeito relaxaria mais seria mais tolo do que
tenho sido Na verdade bem poucas coisas levaria a seacuterio Seria menos higiecircnico Correria mais riscos viajaria mais contemplaria mais entardeceres subiria mais montanhas nadaria mais rios Iria a mais lugares onde nunca fui tomaria mais sorvetes e menos lentilha teria mais problemas reais e menos problemas imaginaacuterios Eu fui uma dessas pessoas que viveu sensata e profundamente cada minuto de sua vida claro que tive momentos de alegria Mas se eu pudesse voltar a viver trataria somente de ter bons momentos Porque se natildeo sabem disso eacute feita a vida soacute de momentos natildeo percam o agora Eu era um daqueles que nunca ia a parte alguma sem um termocircmetro uma bolsa de aacutegua quente um guarda-chuva e um paacutera-quedas e se voltasse a viver viajaria mais leve
Se eu pudesse voltar a viver comeccedilaria a andar descalccedilo no comeccedilo da primavera e continuaria assim ateacute o fim do outono Daria mais voltas na minha rua contemplaria mais amanheceres e brincaria com mais crianccedilas se tivesse outra vez uma vida pela frente Mas jaacute viram tenho 85 anos e estou morrendo
Autoria desconhecida
Filhas faccedilam suas vidas dignas de serem vividas Faccedilam o BEM ao
proacuteximo AMEM sem parcimocircnia sejam livres Amo vocecircs infinitamente e aleacutem
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Aos meus queridos orientadores
Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio Palavras satildeo poucas para agradecer o grande professor pesquisador orientador
mestre e liacuteder que o senhor foi para mim Muito obrigada por me acolher me ajudar
tanto por ser incriacutevel em sabedoria e conhecimento Um ser humano admiraacutevel
tambeacutem No tempo em que convivemos soacute vi o senhor brilhar muito aleacutem das
paredes da Faculdade O senhor vai muito muito longe Que sua jornada seja de
paz e alegrias dentro e fora da Universidade Muito obrigada pelos ensinamentos
oportunidade acolhimento e generosidade O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo
Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo seria possiacutevel
Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-graduando
ldquoIf you choose to use your status and influence to raise your voice on behalf of those who have no voice if you choose to identify not only with the powerful but with the powerless if you retain the ability to imagine yourself into the
lives of those who do not have your advantages then it will not only be your proud families who celebrate your existence but thousands and millions of people whose reality you have helped change We do not need magic to change the world we carry all the power we need inside ourselves already we have the power to imagine betterrdquo
excerpt from JK Rowling 2008 Harvard Commencement Speech
Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris Professor Lauris ter sido sua aluna e orientada foi uma grata surpresa que a vida
me concedeu Foi uma daacutediva O senhor eacute uma pessoa excepcional seu jeito
tranquilo de ser sua forma de encontrar soluccedilotildees capacidade de conciliar a
atividade docente com a diretoria do campus a facilidade que tem em ajudar as
pessoas Tudo isso me impressionou O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo Grande
professor pesquisador e liacuteder Muito obrigada pela chance por ter me aceitado
Muito obrigada pela oportunidade por ter me direcionado Muito obrigada por ter
mostrado tanta luz com bondade Por ter acreditado O senhor tem toda minha
admiraccedilatildeo Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo
seria possiacutevel Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-
graduando
ldquoI learned that people will forget what you said people will forget what you did but people will never forget how you made them feelrdquo
Maya Angelou
Ao Universo a Deus ldquoA mente eacute implacaacutevel O que vocecirc pensa vocecirc realizardquo
Buda
Newton meu amor
Obrigada por me apoiar e me amar de maneira tatildeo doce
Meu irmatildeo Luis Tagliani Neto
Depois de dez anos de formada ainda eacute o melhor dentista que jaacute conheci Agradeccedilo demais
seu carinho apoio e irmandade no maior sentido da palavra
ldquoLamor che move il sole e laltre stellerdquo
Dante Alighieri
Cristiane Silva
Para minha irmatilde desta e de outras vidas dedico essa oraccedilatildeo
ldquoDeus obrigado pois sei que nunca iraacute me desamparar mesmo nos momentos mais difiacuteceis da minha vida o Senhor sempre estaraacute presente Obrigado pelo amanhecer ele me mostra que sempre posso recomeccedilar Obrigado tambeacutem pelo anoitecer ele me faz lembrar que tudo nessa vida eacute passageiro e que nenhum momento da vida seja bom ou ruim duraraacute para semprerdquo
Chico Xavier
Eacute uma honra e um orgulho ser julgada pela senhora Prof Dra Cristiane Maria da Costa Silva
doutora em Sauacutede Coletiva Muito obrigada
Dr Celso Charuri
ldquoExiste um amor maior Existe uma bondade maior Existe um poder maior A nossa mente estaacute ligada com o Universo Noacutes natildeo somos uma parte isolada do Universo Noacutes estamos juntos com todas as partes Noacutes fazemos parte da mesma respiraccedilatildeo ndash a grande respiraccedilatildeo A nossa pequena respiraccedilatildeo pulmonar eacute apenas ilusoacuteria O nosso movimento eacute apenas ilusoacuterio O nosso real movimento eacute mental espiritual Eacute ateacute onde noacutes conseguimos ver do todo que nos cerca e do qual fazemos parterdquo
Celso Charuri excerto de palestra de 8 de Setembro de 1981
AGRADECIMENTOS
Agrave Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP
ldquoQuando era bem pequena eu e minha famiacutelia passeaacutevamos de carro em
frente agrave FOB quando disse um dia estudarei aqui As palavras tem poderrdquo
Ao diretor do campus Bauru Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris
Agrave diretora da FOBUSP Prof Dra Maria Aparecida Machado
Agrave comissatildeo de poacutes-graduaccedilatildeo da FOBUSP
Aos professores do departamento de Sauacutede Coletiva da FOBUSP em
especial Prof Dr Lauris Prof Dr Heitor Prof Dra Nilce Prof Dr Eliel e Prof
Dra Silvia
Ao querido Prof Dr Roosevelt muito obrigada pela presenccedila constante
Agrave Prof Dra Daniela Rios muito obrigada por sua ajuda atenccedilatildeo e
ensinamentos
Agrave Prof Dra Anuradha Prakki agradeccedilo o fornecimento do extrato de
Cranberry
Agrave Prof Dra Astrid Vono uma inspiraccedilatildeo
Aos funcionaacuterios do departamento de Sauacutede Coletiva e do laboratoacuterio
de bioquiacutemica em especial Telma e Larissa
Aos alunos do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica com os quais convivi durante o
desenvolvimento da pesquisa
Agrave Ana Ameacutelia Silva Santos Thame pela caprichosa contribuiccedilatildeo na
formataccedilatildeo da Tese
Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita
Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete
Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio
Fernandes
Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa
e ao Prof Dr Maacutercio Beloti
Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa
cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela
Faculdade
Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial
A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz
Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara
grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta
excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de
pesquisas
Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado
RESUMO
Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry
possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de
agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho
tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de
Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a
dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina
bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-
gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de
Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de
extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a
base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a
base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os
diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro
desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3
ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos
seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as
3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15
horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os
dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os
resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5
190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10
152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de
Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na
reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados
Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio
ABSTRACT
In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion
Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might
inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental
wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and
Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive
challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by
different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel
(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-
005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10
Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-
5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied
over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the
blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and
artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles
the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to
quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test
(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd
G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac
G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin
gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)
and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other
evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry
and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in
vitro
Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28
3 PROPOSICcedilAtildeO 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41
45 PERFILOMETRIA INICIAL 43
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45
49 CICLAGEM EROSIVA 45
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48
5 RESULTADOS 49
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 59
REFEREcircNCIAS 63
APEcircNDICE 73
1 Introduccedilatildeo
1 Introduccedilatildeo 13
1 INTRODUCcedilAtildeO
A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste
dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos
principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007
GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo
dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido
feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO
1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al
2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)
Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da
estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al
2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT
2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como
a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de
dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por
exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo
do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos
extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados
como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo
comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI
JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)
Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do
esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do
dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes
amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos
consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de
exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave
presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al
1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de
soluccedilatildeo profissional
1 Introduccedilatildeo 14
Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos
pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia
regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite
crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia
doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002
BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia
pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a
siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)
Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena
como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de
natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com
os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de
vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO
SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)
Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos
(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo
excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias
de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE
1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese
inicial do paciente
Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado
por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do
esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato
(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas
colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de
superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ
SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o
esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al
2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)
A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa
concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio
foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)
favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
Referecircncias 65
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
MARCELA MARTINI TAGLIANI
Efeitos comparativos de diferentes geacuteis agrave base de Cranberry
e Proantocianidina sobre a dentina submetida agrave erosatildeo
estudo in vitro
Tese apresentada agrave Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de Satildeo Paulo para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutora em Ciecircncias no Programa de Ciecircncias Odontoloacutegicas Aplicadas na aacuterea de concentraccedilatildeo Sauacutede Coletiva Orientador Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio
Versatildeo corrigida
BAURU
2015
Nota A versatildeo original desta tese encontra-se disponiacutevel no Serviccedilo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo da Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP
Tagliani Marcela Efeitos comparativos de diferentes geacuteis agrave base
de Cranberry e Proantocianidina sobre a dentina submetida agrave erosatildeo estudo in vitro Marcela Martini Tagliani ndash Bauru 2015
80p il 30cm
Tese (Doutorado) ndash Faculdade de Odontologia de Bauru Universidade de Satildeo Paulo
Orientador Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio
T128e
Autorizo exclusivamente para fins acadecircmicos e cientiacuteficos a reproduccedilatildeo total ou parcial desta tese por processos fotocopiadores e outros meios eletrocircnicos
Marcela Martini Tagliani
Data
DEDICATOacuteRIA
Dedico essa tese a Stella e Vivian minhas filhas
A Paulo e Eliana meus pais
Se eu pudesse novamente viver a minha vida na proacutexima trataria de cometer mais erros Natildeo tentaria ser tatildeo perfeito relaxaria mais seria mais tolo do que
tenho sido Na verdade bem poucas coisas levaria a seacuterio Seria menos higiecircnico Correria mais riscos viajaria mais contemplaria mais entardeceres subiria mais montanhas nadaria mais rios Iria a mais lugares onde nunca fui tomaria mais sorvetes e menos lentilha teria mais problemas reais e menos problemas imaginaacuterios Eu fui uma dessas pessoas que viveu sensata e profundamente cada minuto de sua vida claro que tive momentos de alegria Mas se eu pudesse voltar a viver trataria somente de ter bons momentos Porque se natildeo sabem disso eacute feita a vida soacute de momentos natildeo percam o agora Eu era um daqueles que nunca ia a parte alguma sem um termocircmetro uma bolsa de aacutegua quente um guarda-chuva e um paacutera-quedas e se voltasse a viver viajaria mais leve
Se eu pudesse voltar a viver comeccedilaria a andar descalccedilo no comeccedilo da primavera e continuaria assim ateacute o fim do outono Daria mais voltas na minha rua contemplaria mais amanheceres e brincaria com mais crianccedilas se tivesse outra vez uma vida pela frente Mas jaacute viram tenho 85 anos e estou morrendo
Autoria desconhecida
Filhas faccedilam suas vidas dignas de serem vividas Faccedilam o BEM ao
proacuteximo AMEM sem parcimocircnia sejam livres Amo vocecircs infinitamente e aleacutem
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Aos meus queridos orientadores
Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio Palavras satildeo poucas para agradecer o grande professor pesquisador orientador
mestre e liacuteder que o senhor foi para mim Muito obrigada por me acolher me ajudar
tanto por ser incriacutevel em sabedoria e conhecimento Um ser humano admiraacutevel
tambeacutem No tempo em que convivemos soacute vi o senhor brilhar muito aleacutem das
paredes da Faculdade O senhor vai muito muito longe Que sua jornada seja de
paz e alegrias dentro e fora da Universidade Muito obrigada pelos ensinamentos
oportunidade acolhimento e generosidade O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo
Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo seria possiacutevel
Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-graduando
ldquoIf you choose to use your status and influence to raise your voice on behalf of those who have no voice if you choose to identify not only with the powerful but with the powerless if you retain the ability to imagine yourself into the
lives of those who do not have your advantages then it will not only be your proud families who celebrate your existence but thousands and millions of people whose reality you have helped change We do not need magic to change the world we carry all the power we need inside ourselves already we have the power to imagine betterrdquo
excerpt from JK Rowling 2008 Harvard Commencement Speech
Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris Professor Lauris ter sido sua aluna e orientada foi uma grata surpresa que a vida
me concedeu Foi uma daacutediva O senhor eacute uma pessoa excepcional seu jeito
tranquilo de ser sua forma de encontrar soluccedilotildees capacidade de conciliar a
atividade docente com a diretoria do campus a facilidade que tem em ajudar as
pessoas Tudo isso me impressionou O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo Grande
professor pesquisador e liacuteder Muito obrigada pela chance por ter me aceitado
Muito obrigada pela oportunidade por ter me direcionado Muito obrigada por ter
mostrado tanta luz com bondade Por ter acreditado O senhor tem toda minha
admiraccedilatildeo Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo
seria possiacutevel Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-
graduando
ldquoI learned that people will forget what you said people will forget what you did but people will never forget how you made them feelrdquo
Maya Angelou
Ao Universo a Deus ldquoA mente eacute implacaacutevel O que vocecirc pensa vocecirc realizardquo
Buda
Newton meu amor
Obrigada por me apoiar e me amar de maneira tatildeo doce
Meu irmatildeo Luis Tagliani Neto
Depois de dez anos de formada ainda eacute o melhor dentista que jaacute conheci Agradeccedilo demais
seu carinho apoio e irmandade no maior sentido da palavra
ldquoLamor che move il sole e laltre stellerdquo
Dante Alighieri
Cristiane Silva
Para minha irmatilde desta e de outras vidas dedico essa oraccedilatildeo
ldquoDeus obrigado pois sei que nunca iraacute me desamparar mesmo nos momentos mais difiacuteceis da minha vida o Senhor sempre estaraacute presente Obrigado pelo amanhecer ele me mostra que sempre posso recomeccedilar Obrigado tambeacutem pelo anoitecer ele me faz lembrar que tudo nessa vida eacute passageiro e que nenhum momento da vida seja bom ou ruim duraraacute para semprerdquo
Chico Xavier
Eacute uma honra e um orgulho ser julgada pela senhora Prof Dra Cristiane Maria da Costa Silva
doutora em Sauacutede Coletiva Muito obrigada
Dr Celso Charuri
ldquoExiste um amor maior Existe uma bondade maior Existe um poder maior A nossa mente estaacute ligada com o Universo Noacutes natildeo somos uma parte isolada do Universo Noacutes estamos juntos com todas as partes Noacutes fazemos parte da mesma respiraccedilatildeo ndash a grande respiraccedilatildeo A nossa pequena respiraccedilatildeo pulmonar eacute apenas ilusoacuteria O nosso movimento eacute apenas ilusoacuterio O nosso real movimento eacute mental espiritual Eacute ateacute onde noacutes conseguimos ver do todo que nos cerca e do qual fazemos parterdquo
Celso Charuri excerto de palestra de 8 de Setembro de 1981
AGRADECIMENTOS
Agrave Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP
ldquoQuando era bem pequena eu e minha famiacutelia passeaacutevamos de carro em
frente agrave FOB quando disse um dia estudarei aqui As palavras tem poderrdquo
Ao diretor do campus Bauru Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris
Agrave diretora da FOBUSP Prof Dra Maria Aparecida Machado
Agrave comissatildeo de poacutes-graduaccedilatildeo da FOBUSP
Aos professores do departamento de Sauacutede Coletiva da FOBUSP em
especial Prof Dr Lauris Prof Dr Heitor Prof Dra Nilce Prof Dr Eliel e Prof
Dra Silvia
Ao querido Prof Dr Roosevelt muito obrigada pela presenccedila constante
Agrave Prof Dra Daniela Rios muito obrigada por sua ajuda atenccedilatildeo e
ensinamentos
Agrave Prof Dra Anuradha Prakki agradeccedilo o fornecimento do extrato de
Cranberry
Agrave Prof Dra Astrid Vono uma inspiraccedilatildeo
Aos funcionaacuterios do departamento de Sauacutede Coletiva e do laboratoacuterio
de bioquiacutemica em especial Telma e Larissa
Aos alunos do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica com os quais convivi durante o
desenvolvimento da pesquisa
Agrave Ana Ameacutelia Silva Santos Thame pela caprichosa contribuiccedilatildeo na
formataccedilatildeo da Tese
Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita
Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete
Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio
Fernandes
Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa
e ao Prof Dr Maacutercio Beloti
Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa
cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela
Faculdade
Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial
A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz
Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara
grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta
excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de
pesquisas
Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado
RESUMO
Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry
possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de
agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho
tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de
Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a
dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina
bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-
gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de
Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de
extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a
base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a
base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os
diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro
desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3
ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos
seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as
3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15
horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os
dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os
resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5
190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10
152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de
Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na
reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados
Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio
ABSTRACT
In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion
Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might
inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental
wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and
Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive
challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by
different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel
(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-
005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10
Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-
5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied
over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the
blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and
artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles
the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to
quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test
(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd
G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac
G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin
gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)
and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other
evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry
and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in
vitro
Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28
3 PROPOSICcedilAtildeO 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41
45 PERFILOMETRIA INICIAL 43
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45
49 CICLAGEM EROSIVA 45
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48
5 RESULTADOS 49
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 59
REFEREcircNCIAS 63
APEcircNDICE 73
1 Introduccedilatildeo
1 Introduccedilatildeo 13
1 INTRODUCcedilAtildeO
A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste
dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos
principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007
GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo
dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido
feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO
1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al
2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)
Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da
estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al
2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT
2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como
a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de
dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por
exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo
do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos
extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados
como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo
comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI
JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)
Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do
esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do
dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes
amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos
consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de
exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave
presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al
1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de
soluccedilatildeo profissional
1 Introduccedilatildeo 14
Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos
pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia
regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite
crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia
doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002
BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia
pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a
siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)
Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena
como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de
natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com
os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de
vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO
SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)
Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos
(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo
excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias
de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE
1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese
inicial do paciente
Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado
por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do
esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato
(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas
colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de
superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ
SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o
esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al
2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)
A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa
concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio
foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)
favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
Referecircncias 65
REFEREcircNCIAS
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32
16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701
17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74
18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53
19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50
20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
Nota A versatildeo original desta tese encontra-se disponiacutevel no Serviccedilo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo da Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP
Tagliani Marcela Efeitos comparativos de diferentes geacuteis agrave base
de Cranberry e Proantocianidina sobre a dentina submetida agrave erosatildeo estudo in vitro Marcela Martini Tagliani ndash Bauru 2015
80p il 30cm
Tese (Doutorado) ndash Faculdade de Odontologia de Bauru Universidade de Satildeo Paulo
Orientador Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio
T128e
Autorizo exclusivamente para fins acadecircmicos e cientiacuteficos a reproduccedilatildeo total ou parcial desta tese por processos fotocopiadores e outros meios eletrocircnicos
Marcela Martini Tagliani
Data
DEDICATOacuteRIA
Dedico essa tese a Stella e Vivian minhas filhas
A Paulo e Eliana meus pais
Se eu pudesse novamente viver a minha vida na proacutexima trataria de cometer mais erros Natildeo tentaria ser tatildeo perfeito relaxaria mais seria mais tolo do que
tenho sido Na verdade bem poucas coisas levaria a seacuterio Seria menos higiecircnico Correria mais riscos viajaria mais contemplaria mais entardeceres subiria mais montanhas nadaria mais rios Iria a mais lugares onde nunca fui tomaria mais sorvetes e menos lentilha teria mais problemas reais e menos problemas imaginaacuterios Eu fui uma dessas pessoas que viveu sensata e profundamente cada minuto de sua vida claro que tive momentos de alegria Mas se eu pudesse voltar a viver trataria somente de ter bons momentos Porque se natildeo sabem disso eacute feita a vida soacute de momentos natildeo percam o agora Eu era um daqueles que nunca ia a parte alguma sem um termocircmetro uma bolsa de aacutegua quente um guarda-chuva e um paacutera-quedas e se voltasse a viver viajaria mais leve
Se eu pudesse voltar a viver comeccedilaria a andar descalccedilo no comeccedilo da primavera e continuaria assim ateacute o fim do outono Daria mais voltas na minha rua contemplaria mais amanheceres e brincaria com mais crianccedilas se tivesse outra vez uma vida pela frente Mas jaacute viram tenho 85 anos e estou morrendo
Autoria desconhecida
Filhas faccedilam suas vidas dignas de serem vividas Faccedilam o BEM ao
proacuteximo AMEM sem parcimocircnia sejam livres Amo vocecircs infinitamente e aleacutem
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Aos meus queridos orientadores
Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio Palavras satildeo poucas para agradecer o grande professor pesquisador orientador
mestre e liacuteder que o senhor foi para mim Muito obrigada por me acolher me ajudar
tanto por ser incriacutevel em sabedoria e conhecimento Um ser humano admiraacutevel
tambeacutem No tempo em que convivemos soacute vi o senhor brilhar muito aleacutem das
paredes da Faculdade O senhor vai muito muito longe Que sua jornada seja de
paz e alegrias dentro e fora da Universidade Muito obrigada pelos ensinamentos
oportunidade acolhimento e generosidade O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo
Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo seria possiacutevel
Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-graduando
ldquoIf you choose to use your status and influence to raise your voice on behalf of those who have no voice if you choose to identify not only with the powerful but with the powerless if you retain the ability to imagine yourself into the
lives of those who do not have your advantages then it will not only be your proud families who celebrate your existence but thousands and millions of people whose reality you have helped change We do not need magic to change the world we carry all the power we need inside ourselves already we have the power to imagine betterrdquo
excerpt from JK Rowling 2008 Harvard Commencement Speech
Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris Professor Lauris ter sido sua aluna e orientada foi uma grata surpresa que a vida
me concedeu Foi uma daacutediva O senhor eacute uma pessoa excepcional seu jeito
tranquilo de ser sua forma de encontrar soluccedilotildees capacidade de conciliar a
atividade docente com a diretoria do campus a facilidade que tem em ajudar as
pessoas Tudo isso me impressionou O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo Grande
professor pesquisador e liacuteder Muito obrigada pela chance por ter me aceitado
Muito obrigada pela oportunidade por ter me direcionado Muito obrigada por ter
mostrado tanta luz com bondade Por ter acreditado O senhor tem toda minha
admiraccedilatildeo Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo
seria possiacutevel Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-
graduando
ldquoI learned that people will forget what you said people will forget what you did but people will never forget how you made them feelrdquo
Maya Angelou
Ao Universo a Deus ldquoA mente eacute implacaacutevel O que vocecirc pensa vocecirc realizardquo
Buda
Newton meu amor
Obrigada por me apoiar e me amar de maneira tatildeo doce
Meu irmatildeo Luis Tagliani Neto
Depois de dez anos de formada ainda eacute o melhor dentista que jaacute conheci Agradeccedilo demais
seu carinho apoio e irmandade no maior sentido da palavra
ldquoLamor che move il sole e laltre stellerdquo
Dante Alighieri
Cristiane Silva
Para minha irmatilde desta e de outras vidas dedico essa oraccedilatildeo
ldquoDeus obrigado pois sei que nunca iraacute me desamparar mesmo nos momentos mais difiacuteceis da minha vida o Senhor sempre estaraacute presente Obrigado pelo amanhecer ele me mostra que sempre posso recomeccedilar Obrigado tambeacutem pelo anoitecer ele me faz lembrar que tudo nessa vida eacute passageiro e que nenhum momento da vida seja bom ou ruim duraraacute para semprerdquo
Chico Xavier
Eacute uma honra e um orgulho ser julgada pela senhora Prof Dra Cristiane Maria da Costa Silva
doutora em Sauacutede Coletiva Muito obrigada
Dr Celso Charuri
ldquoExiste um amor maior Existe uma bondade maior Existe um poder maior A nossa mente estaacute ligada com o Universo Noacutes natildeo somos uma parte isolada do Universo Noacutes estamos juntos com todas as partes Noacutes fazemos parte da mesma respiraccedilatildeo ndash a grande respiraccedilatildeo A nossa pequena respiraccedilatildeo pulmonar eacute apenas ilusoacuteria O nosso movimento eacute apenas ilusoacuterio O nosso real movimento eacute mental espiritual Eacute ateacute onde noacutes conseguimos ver do todo que nos cerca e do qual fazemos parterdquo
Celso Charuri excerto de palestra de 8 de Setembro de 1981
AGRADECIMENTOS
Agrave Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP
ldquoQuando era bem pequena eu e minha famiacutelia passeaacutevamos de carro em
frente agrave FOB quando disse um dia estudarei aqui As palavras tem poderrdquo
Ao diretor do campus Bauru Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris
Agrave diretora da FOBUSP Prof Dra Maria Aparecida Machado
Agrave comissatildeo de poacutes-graduaccedilatildeo da FOBUSP
Aos professores do departamento de Sauacutede Coletiva da FOBUSP em
especial Prof Dr Lauris Prof Dr Heitor Prof Dra Nilce Prof Dr Eliel e Prof
Dra Silvia
Ao querido Prof Dr Roosevelt muito obrigada pela presenccedila constante
Agrave Prof Dra Daniela Rios muito obrigada por sua ajuda atenccedilatildeo e
ensinamentos
Agrave Prof Dra Anuradha Prakki agradeccedilo o fornecimento do extrato de
Cranberry
Agrave Prof Dra Astrid Vono uma inspiraccedilatildeo
Aos funcionaacuterios do departamento de Sauacutede Coletiva e do laboratoacuterio
de bioquiacutemica em especial Telma e Larissa
Aos alunos do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica com os quais convivi durante o
desenvolvimento da pesquisa
Agrave Ana Ameacutelia Silva Santos Thame pela caprichosa contribuiccedilatildeo na
formataccedilatildeo da Tese
Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita
Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete
Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio
Fernandes
Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa
e ao Prof Dr Maacutercio Beloti
Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa
cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela
Faculdade
Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial
A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz
Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara
grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta
excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de
pesquisas
Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado
RESUMO
Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry
possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de
agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho
tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de
Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a
dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina
bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-
gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de
Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de
extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a
base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a
base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os
diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro
desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3
ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos
seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as
3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15
horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os
dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os
resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5
190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10
152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de
Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na
reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados
Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio
ABSTRACT
In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion
Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might
inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental
wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and
Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive
challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by
different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel
(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-
005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10
Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-
5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied
over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the
blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and
artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles
the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to
quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test
(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd
G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac
G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin
gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)
and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other
evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry
and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in
vitro
Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28
3 PROPOSICcedilAtildeO 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41
45 PERFILOMETRIA INICIAL 43
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45
49 CICLAGEM EROSIVA 45
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48
5 RESULTADOS 49
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 59
REFEREcircNCIAS 63
APEcircNDICE 73
1 Introduccedilatildeo
1 Introduccedilatildeo 13
1 INTRODUCcedilAtildeO
A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste
dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos
principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007
GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo
dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido
feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO
1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al
2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)
Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da
estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al
2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT
2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como
a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de
dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por
exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo
do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos
extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados
como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo
comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI
JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)
Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do
esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do
dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes
amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos
consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de
exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave
presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al
1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de
soluccedilatildeo profissional
1 Introduccedilatildeo 14
Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos
pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia
regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite
crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia
doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002
BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia
pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a
siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)
Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena
como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de
natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com
os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de
vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO
SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)
Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos
(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo
excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias
de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE
1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese
inicial do paciente
Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado
por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do
esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato
(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas
colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de
superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ
SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o
esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al
2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)
A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa
concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio
foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)
favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96
Apecircndice 80
15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32
16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701
17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74
18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53
19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50
20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
DEDICATOacuteRIA
Dedico essa tese a Stella e Vivian minhas filhas
A Paulo e Eliana meus pais
Se eu pudesse novamente viver a minha vida na proacutexima trataria de cometer mais erros Natildeo tentaria ser tatildeo perfeito relaxaria mais seria mais tolo do que
tenho sido Na verdade bem poucas coisas levaria a seacuterio Seria menos higiecircnico Correria mais riscos viajaria mais contemplaria mais entardeceres subiria mais montanhas nadaria mais rios Iria a mais lugares onde nunca fui tomaria mais sorvetes e menos lentilha teria mais problemas reais e menos problemas imaginaacuterios Eu fui uma dessas pessoas que viveu sensata e profundamente cada minuto de sua vida claro que tive momentos de alegria Mas se eu pudesse voltar a viver trataria somente de ter bons momentos Porque se natildeo sabem disso eacute feita a vida soacute de momentos natildeo percam o agora Eu era um daqueles que nunca ia a parte alguma sem um termocircmetro uma bolsa de aacutegua quente um guarda-chuva e um paacutera-quedas e se voltasse a viver viajaria mais leve
Se eu pudesse voltar a viver comeccedilaria a andar descalccedilo no comeccedilo da primavera e continuaria assim ateacute o fim do outono Daria mais voltas na minha rua contemplaria mais amanheceres e brincaria com mais crianccedilas se tivesse outra vez uma vida pela frente Mas jaacute viram tenho 85 anos e estou morrendo
Autoria desconhecida
Filhas faccedilam suas vidas dignas de serem vividas Faccedilam o BEM ao
proacuteximo AMEM sem parcimocircnia sejam livres Amo vocecircs infinitamente e aleacutem
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Aos meus queridos orientadores
Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio Palavras satildeo poucas para agradecer o grande professor pesquisador orientador
mestre e liacuteder que o senhor foi para mim Muito obrigada por me acolher me ajudar
tanto por ser incriacutevel em sabedoria e conhecimento Um ser humano admiraacutevel
tambeacutem No tempo em que convivemos soacute vi o senhor brilhar muito aleacutem das
paredes da Faculdade O senhor vai muito muito longe Que sua jornada seja de
paz e alegrias dentro e fora da Universidade Muito obrigada pelos ensinamentos
oportunidade acolhimento e generosidade O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo
Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo seria possiacutevel
Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-graduando
ldquoIf you choose to use your status and influence to raise your voice on behalf of those who have no voice if you choose to identify not only with the powerful but with the powerless if you retain the ability to imagine yourself into the
lives of those who do not have your advantages then it will not only be your proud families who celebrate your existence but thousands and millions of people whose reality you have helped change We do not need magic to change the world we carry all the power we need inside ourselves already we have the power to imagine betterrdquo
excerpt from JK Rowling 2008 Harvard Commencement Speech
Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris Professor Lauris ter sido sua aluna e orientada foi uma grata surpresa que a vida
me concedeu Foi uma daacutediva O senhor eacute uma pessoa excepcional seu jeito
tranquilo de ser sua forma de encontrar soluccedilotildees capacidade de conciliar a
atividade docente com a diretoria do campus a facilidade que tem em ajudar as
pessoas Tudo isso me impressionou O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo Grande
professor pesquisador e liacuteder Muito obrigada pela chance por ter me aceitado
Muito obrigada pela oportunidade por ter me direcionado Muito obrigada por ter
mostrado tanta luz com bondade Por ter acreditado O senhor tem toda minha
admiraccedilatildeo Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo
seria possiacutevel Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-
graduando
ldquoI learned that people will forget what you said people will forget what you did but people will never forget how you made them feelrdquo
Maya Angelou
Ao Universo a Deus ldquoA mente eacute implacaacutevel O que vocecirc pensa vocecirc realizardquo
Buda
Newton meu amor
Obrigada por me apoiar e me amar de maneira tatildeo doce
Meu irmatildeo Luis Tagliani Neto
Depois de dez anos de formada ainda eacute o melhor dentista que jaacute conheci Agradeccedilo demais
seu carinho apoio e irmandade no maior sentido da palavra
ldquoLamor che move il sole e laltre stellerdquo
Dante Alighieri
Cristiane Silva
Para minha irmatilde desta e de outras vidas dedico essa oraccedilatildeo
ldquoDeus obrigado pois sei que nunca iraacute me desamparar mesmo nos momentos mais difiacuteceis da minha vida o Senhor sempre estaraacute presente Obrigado pelo amanhecer ele me mostra que sempre posso recomeccedilar Obrigado tambeacutem pelo anoitecer ele me faz lembrar que tudo nessa vida eacute passageiro e que nenhum momento da vida seja bom ou ruim duraraacute para semprerdquo
Chico Xavier
Eacute uma honra e um orgulho ser julgada pela senhora Prof Dra Cristiane Maria da Costa Silva
doutora em Sauacutede Coletiva Muito obrigada
Dr Celso Charuri
ldquoExiste um amor maior Existe uma bondade maior Existe um poder maior A nossa mente estaacute ligada com o Universo Noacutes natildeo somos uma parte isolada do Universo Noacutes estamos juntos com todas as partes Noacutes fazemos parte da mesma respiraccedilatildeo ndash a grande respiraccedilatildeo A nossa pequena respiraccedilatildeo pulmonar eacute apenas ilusoacuteria O nosso movimento eacute apenas ilusoacuterio O nosso real movimento eacute mental espiritual Eacute ateacute onde noacutes conseguimos ver do todo que nos cerca e do qual fazemos parterdquo
Celso Charuri excerto de palestra de 8 de Setembro de 1981
AGRADECIMENTOS
Agrave Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP
ldquoQuando era bem pequena eu e minha famiacutelia passeaacutevamos de carro em
frente agrave FOB quando disse um dia estudarei aqui As palavras tem poderrdquo
Ao diretor do campus Bauru Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris
Agrave diretora da FOBUSP Prof Dra Maria Aparecida Machado
Agrave comissatildeo de poacutes-graduaccedilatildeo da FOBUSP
Aos professores do departamento de Sauacutede Coletiva da FOBUSP em
especial Prof Dr Lauris Prof Dr Heitor Prof Dra Nilce Prof Dr Eliel e Prof
Dra Silvia
Ao querido Prof Dr Roosevelt muito obrigada pela presenccedila constante
Agrave Prof Dra Daniela Rios muito obrigada por sua ajuda atenccedilatildeo e
ensinamentos
Agrave Prof Dra Anuradha Prakki agradeccedilo o fornecimento do extrato de
Cranberry
Agrave Prof Dra Astrid Vono uma inspiraccedilatildeo
Aos funcionaacuterios do departamento de Sauacutede Coletiva e do laboratoacuterio
de bioquiacutemica em especial Telma e Larissa
Aos alunos do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica com os quais convivi durante o
desenvolvimento da pesquisa
Agrave Ana Ameacutelia Silva Santos Thame pela caprichosa contribuiccedilatildeo na
formataccedilatildeo da Tese
Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita
Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete
Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio
Fernandes
Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa
e ao Prof Dr Maacutercio Beloti
Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa
cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela
Faculdade
Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial
A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz
Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara
grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta
excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de
pesquisas
Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado
RESUMO
Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry
possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de
agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho
tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de
Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a
dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina
bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-
gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de
Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de
extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a
base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a
base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os
diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro
desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3
ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos
seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as
3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15
horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os
dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os
resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5
190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10
152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de
Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na
reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados
Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio
ABSTRACT
In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion
Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might
inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental
wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and
Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive
challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by
different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel
(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-
005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10
Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-
5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied
over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the
blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and
artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles
the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to
quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test
(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd
G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac
G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin
gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)
and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other
evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry
and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in
vitro
Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28
3 PROPOSICcedilAtildeO 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41
45 PERFILOMETRIA INICIAL 43
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45
49 CICLAGEM EROSIVA 45
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48
5 RESULTADOS 49
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 59
REFEREcircNCIAS 63
APEcircNDICE 73
1 Introduccedilatildeo
1 Introduccedilatildeo 13
1 INTRODUCcedilAtildeO
A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste
dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos
principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007
GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo
dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido
feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO
1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al
2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)
Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da
estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al
2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT
2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como
a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de
dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por
exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo
do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos
extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados
como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo
comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI
JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)
Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do
esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do
dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes
amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos
consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de
exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave
presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al
1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de
soluccedilatildeo profissional
1 Introduccedilatildeo 14
Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos
pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia
regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite
crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia
doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002
BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia
pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a
siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)
Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena
como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de
natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com
os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de
vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO
SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)
Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos
(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo
excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias
de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE
1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese
inicial do paciente
Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado
por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do
esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato
(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas
colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de
superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ
SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o
esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al
2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)
A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa
concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio
foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)
favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54
14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96
Apecircndice 80
15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32
16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701
17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74
18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53
19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50
20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Aos meus queridos orientadores
Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio Palavras satildeo poucas para agradecer o grande professor pesquisador orientador
mestre e liacuteder que o senhor foi para mim Muito obrigada por me acolher me ajudar
tanto por ser incriacutevel em sabedoria e conhecimento Um ser humano admiraacutevel
tambeacutem No tempo em que convivemos soacute vi o senhor brilhar muito aleacutem das
paredes da Faculdade O senhor vai muito muito longe Que sua jornada seja de
paz e alegrias dentro e fora da Universidade Muito obrigada pelos ensinamentos
oportunidade acolhimento e generosidade O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo
Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo seria possiacutevel
Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-graduando
ldquoIf you choose to use your status and influence to raise your voice on behalf of those who have no voice if you choose to identify not only with the powerful but with the powerless if you retain the ability to imagine yourself into the
lives of those who do not have your advantages then it will not only be your proud families who celebrate your existence but thousands and millions of people whose reality you have helped change We do not need magic to change the world we carry all the power we need inside ourselves already we have the power to imagine betterrdquo
excerpt from JK Rowling 2008 Harvard Commencement Speech
Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris Professor Lauris ter sido sua aluna e orientada foi uma grata surpresa que a vida
me concedeu Foi uma daacutediva O senhor eacute uma pessoa excepcional seu jeito
tranquilo de ser sua forma de encontrar soluccedilotildees capacidade de conciliar a
atividade docente com a diretoria do campus a facilidade que tem em ajudar as
pessoas Tudo isso me impressionou O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo Grande
professor pesquisador e liacuteder Muito obrigada pela chance por ter me aceitado
Muito obrigada pela oportunidade por ter me direcionado Muito obrigada por ter
mostrado tanta luz com bondade Por ter acreditado O senhor tem toda minha
admiraccedilatildeo Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo
seria possiacutevel Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-
graduando
ldquoI learned that people will forget what you said people will forget what you did but people will never forget how you made them feelrdquo
Maya Angelou
Ao Universo a Deus ldquoA mente eacute implacaacutevel O que vocecirc pensa vocecirc realizardquo
Buda
Newton meu amor
Obrigada por me apoiar e me amar de maneira tatildeo doce
Meu irmatildeo Luis Tagliani Neto
Depois de dez anos de formada ainda eacute o melhor dentista que jaacute conheci Agradeccedilo demais
seu carinho apoio e irmandade no maior sentido da palavra
ldquoLamor che move il sole e laltre stellerdquo
Dante Alighieri
Cristiane Silva
Para minha irmatilde desta e de outras vidas dedico essa oraccedilatildeo
ldquoDeus obrigado pois sei que nunca iraacute me desamparar mesmo nos momentos mais difiacuteceis da minha vida o Senhor sempre estaraacute presente Obrigado pelo amanhecer ele me mostra que sempre posso recomeccedilar Obrigado tambeacutem pelo anoitecer ele me faz lembrar que tudo nessa vida eacute passageiro e que nenhum momento da vida seja bom ou ruim duraraacute para semprerdquo
Chico Xavier
Eacute uma honra e um orgulho ser julgada pela senhora Prof Dra Cristiane Maria da Costa Silva
doutora em Sauacutede Coletiva Muito obrigada
Dr Celso Charuri
ldquoExiste um amor maior Existe uma bondade maior Existe um poder maior A nossa mente estaacute ligada com o Universo Noacutes natildeo somos uma parte isolada do Universo Noacutes estamos juntos com todas as partes Noacutes fazemos parte da mesma respiraccedilatildeo ndash a grande respiraccedilatildeo A nossa pequena respiraccedilatildeo pulmonar eacute apenas ilusoacuteria O nosso movimento eacute apenas ilusoacuterio O nosso real movimento eacute mental espiritual Eacute ateacute onde noacutes conseguimos ver do todo que nos cerca e do qual fazemos parterdquo
Celso Charuri excerto de palestra de 8 de Setembro de 1981
AGRADECIMENTOS
Agrave Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP
ldquoQuando era bem pequena eu e minha famiacutelia passeaacutevamos de carro em
frente agrave FOB quando disse um dia estudarei aqui As palavras tem poderrdquo
Ao diretor do campus Bauru Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris
Agrave diretora da FOBUSP Prof Dra Maria Aparecida Machado
Agrave comissatildeo de poacutes-graduaccedilatildeo da FOBUSP
Aos professores do departamento de Sauacutede Coletiva da FOBUSP em
especial Prof Dr Lauris Prof Dr Heitor Prof Dra Nilce Prof Dr Eliel e Prof
Dra Silvia
Ao querido Prof Dr Roosevelt muito obrigada pela presenccedila constante
Agrave Prof Dra Daniela Rios muito obrigada por sua ajuda atenccedilatildeo e
ensinamentos
Agrave Prof Dra Anuradha Prakki agradeccedilo o fornecimento do extrato de
Cranberry
Agrave Prof Dra Astrid Vono uma inspiraccedilatildeo
Aos funcionaacuterios do departamento de Sauacutede Coletiva e do laboratoacuterio
de bioquiacutemica em especial Telma e Larissa
Aos alunos do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica com os quais convivi durante o
desenvolvimento da pesquisa
Agrave Ana Ameacutelia Silva Santos Thame pela caprichosa contribuiccedilatildeo na
formataccedilatildeo da Tese
Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita
Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete
Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio
Fernandes
Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa
e ao Prof Dr Maacutercio Beloti
Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa
cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela
Faculdade
Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial
A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz
Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara
grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta
excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de
pesquisas
Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado
RESUMO
Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry
possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de
agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho
tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de
Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a
dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina
bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-
gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de
Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de
extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a
base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a
base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os
diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro
desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3
ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos
seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as
3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15
horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os
dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os
resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5
190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10
152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de
Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na
reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados
Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio
ABSTRACT
In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion
Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might
inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental
wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and
Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive
challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by
different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel
(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-
005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10
Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-
5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied
over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the
blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and
artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles
the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to
quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test
(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd
G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac
G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin
gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)
and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other
evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry
and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in
vitro
Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28
3 PROPOSICcedilAtildeO 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41
45 PERFILOMETRIA INICIAL 43
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45
49 CICLAGEM EROSIVA 45
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48
5 RESULTADOS 49
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 59
REFEREcircNCIAS 63
APEcircNDICE 73
1 Introduccedilatildeo
1 Introduccedilatildeo 13
1 INTRODUCcedilAtildeO
A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste
dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos
principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007
GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo
dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido
feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO
1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al
2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)
Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da
estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al
2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT
2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como
a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de
dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por
exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo
do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos
extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados
como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo
comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI
JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)
Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do
esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do
dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes
amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos
consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de
exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave
presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al
1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de
soluccedilatildeo profissional
1 Introduccedilatildeo 14
Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos
pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia
regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite
crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia
doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002
BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia
pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a
siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)
Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena
como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de
natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com
os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de
vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO
SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)
Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos
(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo
excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias
de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE
1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese
inicial do paciente
Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado
por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do
esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato
(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas
colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de
superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ
SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o
esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al
2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)
A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa
concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio
foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)
favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
Referecircncias 65
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50
20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
Ao Universo a Deus ldquoA mente eacute implacaacutevel O que vocecirc pensa vocecirc realizardquo
Buda
Newton meu amor
Obrigada por me apoiar e me amar de maneira tatildeo doce
Meu irmatildeo Luis Tagliani Neto
Depois de dez anos de formada ainda eacute o melhor dentista que jaacute conheci Agradeccedilo demais
seu carinho apoio e irmandade no maior sentido da palavra
ldquoLamor che move il sole e laltre stellerdquo
Dante Alighieri
Cristiane Silva
Para minha irmatilde desta e de outras vidas dedico essa oraccedilatildeo
ldquoDeus obrigado pois sei que nunca iraacute me desamparar mesmo nos momentos mais difiacuteceis da minha vida o Senhor sempre estaraacute presente Obrigado pelo amanhecer ele me mostra que sempre posso recomeccedilar Obrigado tambeacutem pelo anoitecer ele me faz lembrar que tudo nessa vida eacute passageiro e que nenhum momento da vida seja bom ou ruim duraraacute para semprerdquo
Chico Xavier
Eacute uma honra e um orgulho ser julgada pela senhora Prof Dra Cristiane Maria da Costa Silva
doutora em Sauacutede Coletiva Muito obrigada
Dr Celso Charuri
ldquoExiste um amor maior Existe uma bondade maior Existe um poder maior A nossa mente estaacute ligada com o Universo Noacutes natildeo somos uma parte isolada do Universo Noacutes estamos juntos com todas as partes Noacutes fazemos parte da mesma respiraccedilatildeo ndash a grande respiraccedilatildeo A nossa pequena respiraccedilatildeo pulmonar eacute apenas ilusoacuteria O nosso movimento eacute apenas ilusoacuterio O nosso real movimento eacute mental espiritual Eacute ateacute onde noacutes conseguimos ver do todo que nos cerca e do qual fazemos parterdquo
Celso Charuri excerto de palestra de 8 de Setembro de 1981
AGRADECIMENTOS
Agrave Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP
ldquoQuando era bem pequena eu e minha famiacutelia passeaacutevamos de carro em
frente agrave FOB quando disse um dia estudarei aqui As palavras tem poderrdquo
Ao diretor do campus Bauru Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris
Agrave diretora da FOBUSP Prof Dra Maria Aparecida Machado
Agrave comissatildeo de poacutes-graduaccedilatildeo da FOBUSP
Aos professores do departamento de Sauacutede Coletiva da FOBUSP em
especial Prof Dr Lauris Prof Dr Heitor Prof Dra Nilce Prof Dr Eliel e Prof
Dra Silvia
Ao querido Prof Dr Roosevelt muito obrigada pela presenccedila constante
Agrave Prof Dra Daniela Rios muito obrigada por sua ajuda atenccedilatildeo e
ensinamentos
Agrave Prof Dra Anuradha Prakki agradeccedilo o fornecimento do extrato de
Cranberry
Agrave Prof Dra Astrid Vono uma inspiraccedilatildeo
Aos funcionaacuterios do departamento de Sauacutede Coletiva e do laboratoacuterio
de bioquiacutemica em especial Telma e Larissa
Aos alunos do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica com os quais convivi durante o
desenvolvimento da pesquisa
Agrave Ana Ameacutelia Silva Santos Thame pela caprichosa contribuiccedilatildeo na
formataccedilatildeo da Tese
Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita
Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete
Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio
Fernandes
Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa
e ao Prof Dr Maacutercio Beloti
Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa
cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela
Faculdade
Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial
A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz
Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara
grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta
excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de
pesquisas
Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado
RESUMO
Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry
possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de
agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho
tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de
Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a
dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina
bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-
gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de
Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de
extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a
base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a
base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os
diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro
desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3
ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos
seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as
3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15
horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os
dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os
resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5
190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10
152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de
Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na
reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados
Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio
ABSTRACT
In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion
Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might
inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental
wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and
Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive
challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by
different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel
(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-
005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10
Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-
5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied
over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the
blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and
artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles
the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to
quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test
(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd
G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac
G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin
gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)
and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other
evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry
and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in
vitro
Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28
3 PROPOSICcedilAtildeO 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41
45 PERFILOMETRIA INICIAL 43
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45
49 CICLAGEM EROSIVA 45
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48
5 RESULTADOS 49
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 59
REFEREcircNCIAS 63
APEcircNDICE 73
1 Introduccedilatildeo
1 Introduccedilatildeo 13
1 INTRODUCcedilAtildeO
A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste
dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos
principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007
GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo
dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido
feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO
1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al
2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)
Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da
estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al
2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT
2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como
a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de
dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por
exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo
do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos
extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados
como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo
comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI
JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)
Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do
esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do
dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes
amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos
consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de
exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave
presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al
1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de
soluccedilatildeo profissional
1 Introduccedilatildeo 14
Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos
pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia
regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite
crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia
doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002
BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia
pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a
siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)
Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena
como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de
natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com
os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de
vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO
SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)
Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos
(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo
excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias
de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE
1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese
inicial do paciente
Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado
por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do
esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato
(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas
colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de
superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ
SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o
esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al
2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)
A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa
concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio
foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)
favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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AGRADECIMENTOS
Agrave Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP
ldquoQuando era bem pequena eu e minha famiacutelia passeaacutevamos de carro em
frente agrave FOB quando disse um dia estudarei aqui As palavras tem poderrdquo
Ao diretor do campus Bauru Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris
Agrave diretora da FOBUSP Prof Dra Maria Aparecida Machado
Agrave comissatildeo de poacutes-graduaccedilatildeo da FOBUSP
Aos professores do departamento de Sauacutede Coletiva da FOBUSP em
especial Prof Dr Lauris Prof Dr Heitor Prof Dra Nilce Prof Dr Eliel e Prof
Dra Silvia
Ao querido Prof Dr Roosevelt muito obrigada pela presenccedila constante
Agrave Prof Dra Daniela Rios muito obrigada por sua ajuda atenccedilatildeo e
ensinamentos
Agrave Prof Dra Anuradha Prakki agradeccedilo o fornecimento do extrato de
Cranberry
Agrave Prof Dra Astrid Vono uma inspiraccedilatildeo
Aos funcionaacuterios do departamento de Sauacutede Coletiva e do laboratoacuterio
de bioquiacutemica em especial Telma e Larissa
Aos alunos do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica com os quais convivi durante o
desenvolvimento da pesquisa
Agrave Ana Ameacutelia Silva Santos Thame pela caprichosa contribuiccedilatildeo na
formataccedilatildeo da Tese
Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita
Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete
Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio
Fernandes
Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa
e ao Prof Dr Maacutercio Beloti
Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa
cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela
Faculdade
Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial
A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz
Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara
grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta
excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de
pesquisas
Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado
RESUMO
Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry
possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de
agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho
tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de
Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a
dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina
bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-
gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de
Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de
extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a
base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a
base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os
diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro
desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3
ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos
seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as
3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15
horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os
dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os
resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5
190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10
152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de
Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na
reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados
Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio
ABSTRACT
In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion
Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might
inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental
wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and
Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive
challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by
different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel
(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-
005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10
Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-
5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied
over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the
blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and
artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles
the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to
quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test
(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd
G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac
G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin
gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)
and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other
evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry
and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in
vitro
Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28
3 PROPOSICcedilAtildeO 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41
45 PERFILOMETRIA INICIAL 43
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45
49 CICLAGEM EROSIVA 45
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48
5 RESULTADOS 49
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 59
REFEREcircNCIAS 63
APEcircNDICE 73
1 Introduccedilatildeo
1 Introduccedilatildeo 13
1 INTRODUCcedilAtildeO
A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste
dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos
principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007
GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo
dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido
feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO
1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al
2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)
Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da
estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al
2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT
2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como
a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de
dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por
exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo
do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos
extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados
como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo
comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI
JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)
Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do
esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do
dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes
amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos
consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de
exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave
presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al
1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de
soluccedilatildeo profissional
1 Introduccedilatildeo 14
Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos
pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia
regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite
crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia
doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002
BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia
pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a
siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)
Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena
como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de
natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com
os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de
vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO
SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)
Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos
(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo
excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias
de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE
1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese
inicial do paciente
Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado
por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do
esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato
(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas
colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de
superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ
SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o
esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al
2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)
A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa
concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio
foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)
favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita
Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete
Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio
Fernandes
Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa
e ao Prof Dr Maacutercio Beloti
Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa
cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela
Faculdade
Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial
A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz
Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara
grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta
excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de
pesquisas
Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado
RESUMO
Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry
possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de
agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho
tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de
Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a
dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina
bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-
gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de
Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de
extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a
base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a
base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os
diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro
desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3
ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos
seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as
3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15
horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os
dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os
resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5
190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10
152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de
Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na
reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados
Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio
ABSTRACT
In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion
Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might
inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental
wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and
Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive
challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by
different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel
(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-
005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10
Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-
5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied
over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the
blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and
artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles
the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to
quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test
(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd
G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac
G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin
gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)
and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other
evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry
and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in
vitro
Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28
3 PROPOSICcedilAtildeO 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41
45 PERFILOMETRIA INICIAL 43
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45
49 CICLAGEM EROSIVA 45
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48
5 RESULTADOS 49
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 59
REFEREcircNCIAS 63
APEcircNDICE 73
1 Introduccedilatildeo
1 Introduccedilatildeo 13
1 INTRODUCcedilAtildeO
A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste
dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos
principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007
GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo
dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido
feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO
1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al
2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)
Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da
estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al
2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT
2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como
a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de
dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por
exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo
do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos
extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados
como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo
comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI
JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)
Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do
esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do
dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes
amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos
consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de
exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave
presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al
1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de
soluccedilatildeo profissional
1 Introduccedilatildeo 14
Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos
pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia
regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite
crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia
doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002
BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia
pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a
siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)
Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena
como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de
natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com
os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de
vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO
SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)
Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos
(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo
excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias
de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE
1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese
inicial do paciente
Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado
por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do
esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato
(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas
colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de
superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ
SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o
esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al
2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)
A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa
concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio
foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)
favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice 80
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RESUMO
Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry
possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de
agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho
tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de
Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a
dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina
bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-
gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de
Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de
extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a
base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a
base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os
diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro
desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3
ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos
seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as
3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15
horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os
dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os
resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5
190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10
152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de
Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na
reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados
Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio
ABSTRACT
In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion
Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might
inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental
wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and
Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive
challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by
different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel
(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-
005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10
Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-
5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied
over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the
blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and
artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles
the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to
quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test
(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd
G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac
G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin
gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)
and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other
evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry
and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in
vitro
Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28
3 PROPOSICcedilAtildeO 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41
45 PERFILOMETRIA INICIAL 43
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45
49 CICLAGEM EROSIVA 45
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48
5 RESULTADOS 49
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 59
REFEREcircNCIAS 63
APEcircNDICE 73
1 Introduccedilatildeo
1 Introduccedilatildeo 13
1 INTRODUCcedilAtildeO
A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste
dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos
principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007
GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo
dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido
feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO
1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al
2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)
Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da
estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al
2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT
2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como
a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de
dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por
exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo
do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos
extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados
como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo
comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI
JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)
Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do
esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do
dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes
amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos
consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de
exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave
presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al
1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de
soluccedilatildeo profissional
1 Introduccedilatildeo 14
Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos
pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia
regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite
crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia
doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002
BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia
pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a
siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)
Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena
como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de
natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com
os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de
vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO
SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)
Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos
(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo
excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias
de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE
1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese
inicial do paciente
Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado
por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do
esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato
(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas
colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de
superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ
SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o
esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al
2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)
A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa
concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio
foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)
favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice 80
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28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
ABSTRACT
In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion
Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might
inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental
wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and
Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive
challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by
different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel
(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-
005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10
Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-
5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied
over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the
blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and
artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles
the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to
quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test
(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd
G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac
G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin
gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)
and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other
evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry
and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in
vitro
Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28
3 PROPOSICcedilAtildeO 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41
45 PERFILOMETRIA INICIAL 43
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45
49 CICLAGEM EROSIVA 45
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48
5 RESULTADOS 49
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 59
REFEREcircNCIAS 63
APEcircNDICE 73
1 Introduccedilatildeo
1 Introduccedilatildeo 13
1 INTRODUCcedilAtildeO
A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste
dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos
principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007
GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo
dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido
feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO
1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al
2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)
Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da
estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al
2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT
2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como
a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de
dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por
exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo
do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos
extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados
como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo
comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI
JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)
Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do
esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do
dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes
amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos
consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de
exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave
presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al
1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de
soluccedilatildeo profissional
1 Introduccedilatildeo 14
Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos
pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia
regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite
crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia
doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002
BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia
pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a
siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)
Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena
como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de
natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com
os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de
vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO
SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)
Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos
(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo
excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias
de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE
1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese
inicial do paciente
Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado
por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do
esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato
(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas
colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de
superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ
SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o
esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al
2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)
A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa
concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio
foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)
favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 11
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28
3 PROPOSICcedilAtildeO 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41
45 PERFILOMETRIA INICIAL 43
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45
49 CICLAGEM EROSIVA 45
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48
5 RESULTADOS 49
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 59
REFEREcircNCIAS 63
APEcircNDICE 73
1 Introduccedilatildeo
1 Introduccedilatildeo 13
1 INTRODUCcedilAtildeO
A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste
dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos
principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007
GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo
dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido
feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO
1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al
2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)
Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da
estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al
2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT
2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como
a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de
dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por
exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo
do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos
extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados
como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo
comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI
JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)
Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do
esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do
dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes
amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos
consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de
exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave
presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al
1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de
soluccedilatildeo profissional
1 Introduccedilatildeo 14
Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos
pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia
regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite
crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia
doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002
BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia
pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a
siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)
Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena
como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de
natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com
os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de
vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO
SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)
Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos
(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo
excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias
de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE
1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese
inicial do paciente
Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado
por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do
esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato
(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas
colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de
superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ
SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o
esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al
2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)
A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa
concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio
foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)
favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice 80
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1 Introduccedilatildeo
1 Introduccedilatildeo 13
1 INTRODUCcedilAtildeO
A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste
dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos
principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007
GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo
dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido
feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO
1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al
2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)
Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da
estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al
2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT
2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como
a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de
dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por
exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo
do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos
extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados
como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo
comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI
JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)
Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do
esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do
dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes
amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos
consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de
exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave
presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al
1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de
soluccedilatildeo profissional
1 Introduccedilatildeo 14
Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos
pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia
regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite
crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia
doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002
BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia
pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a
siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)
Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena
como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de
natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com
os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de
vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO
SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)
Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos
(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo
excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias
de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE
1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese
inicial do paciente
Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado
por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do
esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato
(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas
colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de
superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ
SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o
esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al
2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)
A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa
concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio
foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)
favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
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et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
Referecircncias 65
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
1 Introduccedilatildeo 13
1 INTRODUCcedilAtildeO
A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste
dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos
principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007
GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo
dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido
feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO
1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al
2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)
Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da
estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al
2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT
2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como
a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de
dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por
exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo
do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos
extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados
como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo
comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI
JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)
Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do
esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do
dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes
amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos
consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de
exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave
presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al
1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de
soluccedilatildeo profissional
1 Introduccedilatildeo 14
Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos
pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia
regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite
crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia
doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002
BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia
pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a
siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)
Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena
como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de
natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com
os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de
vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO
SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)
Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos
(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo
excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias
de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE
1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese
inicial do paciente
Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado
por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do
esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato
(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas
colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de
superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ
SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o
esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al
2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)
A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa
concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio
foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)
favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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1 Introduccedilatildeo 14
Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos
pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia
regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite
crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia
doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002
BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia
pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a
siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)
Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena
como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de
natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com
os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de
vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO
SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)
Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos
(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo
excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias
de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE
1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese
inicial do paciente
Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado
por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do
esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato
(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas
colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de
superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ
SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o
esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al
2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)
A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa
concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio
foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)
favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
Referecircncias 65
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
1 Introduccedilatildeo 15
uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de
remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)
A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo
da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que
ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo
ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental
a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor
consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999
KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)
Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05
a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua
proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases
hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina
(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes
satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS
FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)
Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o
tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como
metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado
que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012
2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na
dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de
caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo
durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs
tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo
de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A
degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs
presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45
(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al
2014)
Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)
satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo
desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da
1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice 80
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1 Introduccedilatildeo 16
ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido
conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam
MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando
necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo
tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo
acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz
orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de
praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado
(KATO et al 2010a 2010b)
Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo
dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem
na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo
da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de
progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso
de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-
se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que
aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz
desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a
progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)
A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute
sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de
colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais
tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem
sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores
buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente
epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade
inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et
al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito
preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al
2010b)
Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos
dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam
que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a
1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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1 Introduccedilatildeo 17
expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do
esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da
dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da
dentina durante a formaccedilatildeo do dente
Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados
aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta
inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)
As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute
preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou
bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da
classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais
(HARBORNE MABRY MABRY 1975)
Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL
1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e
carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de
radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras
anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas
imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima
fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS
MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL
et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)
Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao
Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta
fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries
atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas
Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido
implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al
2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois
agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo
bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)
Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila
chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs
1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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1 Introduccedilatildeo 18
Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito
inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base
de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina
previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado
considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste
2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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2 Revisatildeo de Literatura
2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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2 Revisatildeo de Literatura 21
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele
diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise
panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial
21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES
No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes
fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com
um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e
com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a
desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No
caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz
orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF
reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas
foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz
orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente
eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro
O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os
efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e
Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na
dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo
enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de
desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta
impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ
apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo
Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato
ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-
se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos
desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees
terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria
2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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2 Revisatildeo de Literatura 22
Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica
desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva
contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e
tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram
tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash
0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia
os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de
colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi
analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a
perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis
contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees
de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros
tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das
proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em
reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)
Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3
a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio
e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837
crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A
maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12
no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de
erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem
do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo
(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico
para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas
Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de
refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11
apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a
duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo
tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais
severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos
2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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2 Revisatildeo de Literatura 23
tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da
doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais
Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de
diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas
alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois
natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas
subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo
eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que
outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na
superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso
sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais
polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos
Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de
refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina
Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute
Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em
dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem
(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando
estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas
em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para
anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que
Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave
menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre
15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola
Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental
devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos
e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da
composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares
bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde
refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de
groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo
A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10
minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e
2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice 80
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2 Revisatildeo de Literatura 24
escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria
oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as
bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio
do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para
todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte
quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio
erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela
escovaccedilatildeo
Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o
efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio
adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo
dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas
com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto
de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram
expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva
artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos
grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave
preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na
prevenccedilatildeo da erosatildeo
No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram
os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura
dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares
humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes
instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica
(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo
superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a
aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e
intertubular
Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta
concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com
lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal
utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram
armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
REFERENCES
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11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16
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14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96
Apecircndice 80
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25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
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27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
2 Revisatildeo de Literatura 25
natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia
sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)
dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda
mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas
Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees
de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas
superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos
em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais
Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com
alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo
subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao
serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto
Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina
desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor
nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para
tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e
depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37
(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de
clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle
utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em
fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi
avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com
PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor
inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2
Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de
clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6
meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros
molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola
Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se
blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram
seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos
espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo
erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes
2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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2 Revisatildeo de Literatura 26
os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a
ambas dentinas erodida ou natildeo
Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental
preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de
amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o
impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir
uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob
um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em
dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se
perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores
concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de
AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a
25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os
autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila
quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo
Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de
colaacutegeno desmineralizado
A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida
mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem
ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato
et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir
as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se
saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes
foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi
adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi
testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as
atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas
foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F
A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a
5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir
completamente as MMPs
Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada
hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice 80
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28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
2 Revisatildeo de Literatura 27
inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um
maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a
mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de
ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica
colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o
EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram
detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio
Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno
biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel
influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal
foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo
e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido
ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada
(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto
comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F
005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos
utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda
dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados
indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os
grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade
CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do
sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou
um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura
na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das
metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de
uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases
e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na
dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias
de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a
preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de
melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina
2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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2 Revisatildeo de Literatura 28
Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs
flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal
utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo
com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os
espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo
ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade
(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com
flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com
flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na
seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que
em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e
portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia
Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos
Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas
com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram
utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que
propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser
alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito
provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA
22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY
Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais
benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os
componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles
inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus
mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo
glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade
bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe
a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam
a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do
Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de
2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
REFERENCES
1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107
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Apecircndice 80
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2 Revisatildeo de Literatura 29
periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser
incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a
prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal
Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila
periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram
neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir
eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e
formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a
produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da
matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem
interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente
etioloacutegico causador da periodontite crocircnica
Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de
Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser
adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito
antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees
Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade
antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C
albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo
Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para
investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em
Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas
concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que
extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida
enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente
Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do
Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de
Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina
artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs
derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina
(RANE et al 2014)
Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade
oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a
2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice 80
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2 Revisatildeo de Literatura 30
Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina
(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-
37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa
oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e
fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-
PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias
natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de
diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois
naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de
vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram
resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas
periodontais
Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos
promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a
Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo
in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como
suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio
3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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3 Proposiccedilatildeo
3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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3 Proposiccedilatildeo 33
3 PROPOSICcedilAtildeO
Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a
dentina submetida agrave erosatildeo
Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula
natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados
na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida
4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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4 Materiais e Meacutetodos
4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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4 Materiais e Meacutetodos 37
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de
Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos
Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005
1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo
(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)
Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5
minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um
ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os
10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos
de dentina bovina
Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma
G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle
Positivo)
G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)
G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 005
G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 1
G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 5
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
Referecircncias 65
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
4 Materiais e Meacutetodos 38
G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry
a 10
G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
005
G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
1
G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
5
G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada
previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a
10
Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave
anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria
observando-se o perfil de desgaste
A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que
todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por
esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a
realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de
movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise
perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
Referecircncias 65
REFEREcircNCIAS
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
4 Materiais e Meacutetodos 39
Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho
42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila
Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico
Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente
estudo
Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos
de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo
de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo
o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes
A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se
obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e
utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
Referecircncias 65
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
4 Materiais e Meacutetodos 40
et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute
publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos
quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica
(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a
confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade
de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a
dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa
Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o
auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica
Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo
SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda
Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes
O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr
Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para
facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte
A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET
LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos
diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec
Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de
diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com
velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo
de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos
discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh
concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e
o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual
resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm
43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA
Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para
tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de
4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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4 Materiais e Meacutetodos 41
acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina
externa (coberta por cemento) voltada para baixo
Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4
Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e
concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de
carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com
aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo
da espessura do bloco
Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram
limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas
mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas
sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-
60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute
a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo
44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS
ESPEacuteCIMES DE DENTINA
A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um
microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um
computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a
anaacutelise das imagens
O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo
KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada
por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees
com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie
com uma distacircncia de 100 microm entre elas
Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que
aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango
correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e
4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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4 Materiais e Meacutetodos 42
consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico
feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo
KHN= Cc
Sendo KHN = valor de dureza Knoop
C (constante) = 14230
c = 25 gramas
d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo
Figura 2 - Ponta tipo Knoop
Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza
d2
4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
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APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
REFERENCES
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Apecircndice 80
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4 Materiais e Meacutetodos 43
Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um
ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5
endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor
dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes
de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade
45 PERFILOMETRIA INICIAL
Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas
marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)
objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees
tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo
do desgaste final
Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre
uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura
e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime
para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle
nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2
mm de largura
Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da
marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador
contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na
sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime
Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra
foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e
125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral
Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi
utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees
previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra
para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final
(Figura 4)
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice 80
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27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
4 Materiais e Meacutetodos 44
Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime
46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru
Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol
metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do
princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)
(Figura 5)
O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de
Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade
de Toronto no Canadaacute
Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento
4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
Referecircncias
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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4 Materiais e Meacutetodos 45
47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES
Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos
contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo
de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)
Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes
48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS
Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez
(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os
fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo
sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com
cotonete
49 CICLAGEM EROSIVA
Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias
consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de
lavagem com aacutegua deionizada por 20s
4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice 80
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4 Materiais e Meacutetodos 46
desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL
por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente
e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas
em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de
EVA
lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em
Coca-Colareg
reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de
saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e
Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g
NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose
0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7
Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva
artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)
Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva
4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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4 Materiais e Meacutetodos 47
Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida
410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA
Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes
cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as
mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)
Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro
411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS
Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram
obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de
4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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4 Materiais e Meacutetodos 48
cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas
sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis
alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)
Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo
412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das
variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de
Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)
Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises
estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system
110 (Stat Soft Inc)
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice 80
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26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
5 Resultados
5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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5 Resultados 51
5 RESULTADOS
51 ANAacuteLISE DE DESGASTE
O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila
estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste
Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry
(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)
promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando
comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012
Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando
comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)
O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os
grupos estudados (plt005)
Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados
GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO
G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b
G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e
G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b
G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd
G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac
G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a
G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a
G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d
G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac
G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b
Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice 80
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26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
5 Resultados 52
Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos
Mean MeanplusmnSD Min-Max
G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10
GRUPO
10
12
14
16
18
20
22
24
26D
ES
GA
ST
E fin
al
6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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6 Discussatildeo
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5
6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9
7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9
8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74
9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72
10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23
11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16
12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4
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Apecircndice 80
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20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
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27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
6 Discussatildeo 55
6 DISCUSSAtildeO
O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo
dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em
diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente
nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de
colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados
sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e
Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um
potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria
Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para
avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios
trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se
obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in
situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI
2014)
Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)
publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de
materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou
mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos
materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor
testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a
resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute
mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material
como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares
Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos
como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila
de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)
Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios
ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de
inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo
padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi
6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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6 Discussatildeo 56
proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo
tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob
uso profissional em terapecircuticas diversas
A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo
no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo
e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos
dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees
propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo
de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica
de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a
Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e
estruturais do esmalte dental
O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3
vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram
realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma
vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido
(KATO et al 2009)
Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a
desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das
fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o
pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas
pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)
Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o
paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido
erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que
para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A
erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de
fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo
dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de
iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH
A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em
soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees
6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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6 Discussatildeo 57
aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride
(BARBOUR LUSSI 2014)
De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo
dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva
de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-
resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com
a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos
Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por
quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se
estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes
Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de
Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de
MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por
exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o
efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF
MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo
Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que
natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND
2014)
Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados
indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou
mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo
fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado
tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade
exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas
Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123
NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e
Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de
ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados
A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial
inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice 80
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28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
6 Discussatildeo 58
inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta
forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle
positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio
Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste
dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35
valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma
interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo
Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de
30 a 40
Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de
Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um
agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a
prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos
especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em
inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada
7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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7 Conclusatildeo
7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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7 Conclusatildeo 61
7 CONCLUSAtildeO
Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que
houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base
de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste
da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo
(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de
clorexidina
estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente
formulada
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
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Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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1996104(2)162-77
Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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Apecircndice 80
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Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
REFERENCES
1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107
2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6
3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114
4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8
5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5
6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9
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8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74
9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72
10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23
11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16
12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4
13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54
14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96
Apecircndice 80
15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32
16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701
17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74
18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53
19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50
20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
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Zero DT Etiology of dental erosion ndash extrinsic factors Eur J Oral Sci
1996104(2)162-77
Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32
16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701
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18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53
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1996104(2)162-77
Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
REFERENCES
1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107
2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6
3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114
4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8
5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5
6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9
7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9
8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74
9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72
10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23
11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16
12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4
13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54
14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96
Apecircndice 80
15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32
16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701
17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74
18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53
19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50
20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
Apecircndice
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
REFERENCES
1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107
2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6
3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114
4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8
5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5
6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9
7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9
8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74
9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72
10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23
11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16
12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4
13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54
14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96
Apecircndice 80
15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32
16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701
17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74
18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53
19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50
20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
Apecircndice 75
APEcircNDICE A
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani
1 Ana Paula Boteon
2 Brunna M Ferrairo
3 Anuradha Prakki
4
Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris
1 Daniela Rios
1
1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -
University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil
3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-
ON Canada
5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP
Brazil
Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear
Corresponding Author
Heitor Marques Honoacuterio
Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)
Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health
Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria
ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil
Telephone 00-55-14-32358256
Fax 00-55-14-3223-4679
e-mail heitorhonoriouspbr
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
REFERENCES
1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107
2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6
3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114
4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8
5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5
6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9
7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9
8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74
9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72
10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23
11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16
12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4
13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54
14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96
Apecircndice 80
15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32
16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701
17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74
18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53
19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50
20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
Apecircndice 76
In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion
ABSTRACT
Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro
1 INTRODUCTION
Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has
different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization
mechanism23
The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen
increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing
the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can
contribute to the progression of dentin wear45
This chemical degradation occurs specially by matrix
metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops
below 456-8
Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation
decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several
agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate
confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12
Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of
hydrolytic enzymes (MMPs)13-16
Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-
proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718
In
addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation
increasing mechanical properties and reducing water absorption1920
Recently a study showed that
PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21
Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin
erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry
extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion
2 MATERIAL AND METHODS
21 Experimental design
This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on
150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
REFERENCES
1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107
2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6
3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114
4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8
5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5
6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9
7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9
8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74
9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72
10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23
11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16
12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4
13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54
14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96
Apecircndice 80
15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32
16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701
17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74
18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53
19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50
20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
Apecircndice 77
G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry
gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5
Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for
5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry
22 Sample Preparation
Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine
incisors as reported in previous studies2223
Specimens were selected and allocated to groups
according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation
Tokyo Japan) and stratified randomization
23 Treatment and erosive cycling
The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive
challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for
the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product
CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were
subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the
immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant
motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per
sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial
saliva24
24 Profilometric Analysis
The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic
layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully
removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces
using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline
surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen
Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two
external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces
for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric
analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was
quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by
calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the
dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to
match the respective baseline and final profiles
25 Statistical Analysis
The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by
Fishers test The level of significance was set at 5
3 RESULTS
The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis
revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar
prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In
addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
REFERENCES
1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107
2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6
3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114
4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8
5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5
6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9
7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9
8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74
9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72
10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23
11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16
12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4
13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54
14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96
Apecircndice 80
15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32
16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701
17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74
18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53
19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50
20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9
Apecircndice 78
(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied
groups (plt005)
Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups
GROUPS MEAN plusmn SD
G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b
G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e
G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b
G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd
G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac
G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a
G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a
G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d
G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac
G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b
Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)
4 DISCUSSION
Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such
as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients
however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after
each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for
frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin
were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-
esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25
Thus an erosive
time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation
When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH
24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which
might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during
the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective
effect lasts for predicting the time need for professional reapplication
The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not
show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel
with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other
studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use
of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1
and 9 in periodontal disease for instance15
was effective in the reduction of dentin erosion This effect
might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26
In addition none of the
studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action
on the de- and remineralization process26
Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash
like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27
and in the study reported here the focus
was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some
evidence9-12
that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation
although Ganss et al28
found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active
ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as
positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of
erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910
The effect on dentin
Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
REFERENCES
1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107
2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6
3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114
4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8
5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5
6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9
7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9
8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74
9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72
10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23
11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16
12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4
13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54
14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96
Apecircndice 80
15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32
16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701
17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74
18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53
19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50
20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73
21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8
22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6
23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8
24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50
25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31
26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52
27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43
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Apecircndice 79
wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to
0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023
Before
Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is
necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular
studies
5 CONCLUSION
Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing
wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during
dentin erosion
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