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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE BAURU MARCELA MARTINI TAGLIANI Efeitos comparativos de diferentes géis à base de Cranberry e Proantocianidina sobre a dentina submetida à erosão: estudo in vitro BAURU 2015

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

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Page 1: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE BAURU

MARCELA MARTINI TAGLIANI

Efeitos comparativos de diferentes geacuteis agrave base de Cranberry

e Proantocianidina sobre a dentina submetida agrave erosatildeo

estudo in vitro

BAURU

2015

MARCELA MARTINI TAGLIANI

Efeitos comparativos de diferentes geacuteis agrave base de Cranberry

e Proantocianidina sobre a dentina submetida agrave erosatildeo

estudo in vitro

Tese apresentada agrave Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de Satildeo Paulo para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutora em Ciecircncias no Programa de Ciecircncias Odontoloacutegicas Aplicadas na aacuterea de concentraccedilatildeo Sauacutede Coletiva Orientador Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio

Versatildeo corrigida

BAURU

2015

Nota A versatildeo original desta tese encontra-se disponiacutevel no Serviccedilo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo da Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP

Tagliani Marcela Efeitos comparativos de diferentes geacuteis agrave base

de Cranberry e Proantocianidina sobre a dentina submetida agrave erosatildeo estudo in vitro Marcela Martini Tagliani ndash Bauru 2015

80p il 30cm

Tese (Doutorado) ndash Faculdade de Odontologia de Bauru Universidade de Satildeo Paulo

Orientador Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio

T128e

Autorizo exclusivamente para fins acadecircmicos e cientiacuteficos a reproduccedilatildeo total ou parcial desta tese por processos fotocopiadores e outros meios eletrocircnicos

Marcela Martini Tagliani

Data

DEDICATOacuteRIA

Dedico essa tese a Stella e Vivian minhas filhas

A Paulo e Eliana meus pais

Se eu pudesse novamente viver a minha vida na proacutexima trataria de cometer mais erros Natildeo tentaria ser tatildeo perfeito relaxaria mais seria mais tolo do que

tenho sido Na verdade bem poucas coisas levaria a seacuterio Seria menos higiecircnico Correria mais riscos viajaria mais contemplaria mais entardeceres subiria mais montanhas nadaria mais rios Iria a mais lugares onde nunca fui tomaria mais sorvetes e menos lentilha teria mais problemas reais e menos problemas imaginaacuterios Eu fui uma dessas pessoas que viveu sensata e profundamente cada minuto de sua vida claro que tive momentos de alegria Mas se eu pudesse voltar a viver trataria somente de ter bons momentos Porque se natildeo sabem disso eacute feita a vida soacute de momentos natildeo percam o agora Eu era um daqueles que nunca ia a parte alguma sem um termocircmetro uma bolsa de aacutegua quente um guarda-chuva e um paacutera-quedas e se voltasse a viver viajaria mais leve

Se eu pudesse voltar a viver comeccedilaria a andar descalccedilo no comeccedilo da primavera e continuaria assim ateacute o fim do outono Daria mais voltas na minha rua contemplaria mais amanheceres e brincaria com mais crianccedilas se tivesse outra vez uma vida pela frente Mas jaacute viram tenho 85 anos e estou morrendo

Autoria desconhecida

Filhas faccedilam suas vidas dignas de serem vividas Faccedilam o BEM ao

proacuteximo AMEM sem parcimocircnia sejam livres Amo vocecircs infinitamente e aleacutem

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Aos meus queridos orientadores

Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio Palavras satildeo poucas para agradecer o grande professor pesquisador orientador

mestre e liacuteder que o senhor foi para mim Muito obrigada por me acolher me ajudar

tanto por ser incriacutevel em sabedoria e conhecimento Um ser humano admiraacutevel

tambeacutem No tempo em que convivemos soacute vi o senhor brilhar muito aleacutem das

paredes da Faculdade O senhor vai muito muito longe Que sua jornada seja de

paz e alegrias dentro e fora da Universidade Muito obrigada pelos ensinamentos

oportunidade acolhimento e generosidade O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo

Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo seria possiacutevel

Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-graduando

ldquoIf you choose to use your status and influence to raise your voice on behalf of those who have no voice if you choose to identify not only with the powerful but with the powerless if you retain the ability to imagine yourself into the

lives of those who do not have your advantages then it will not only be your proud families who celebrate your existence but thousands and millions of people whose reality you have helped change We do not need magic to change the world we carry all the power we need inside ourselves already we have the power to imagine betterrdquo

excerpt from JK Rowling 2008 Harvard Commencement Speech

Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris Professor Lauris ter sido sua aluna e orientada foi uma grata surpresa que a vida

me concedeu Foi uma daacutediva O senhor eacute uma pessoa excepcional seu jeito

tranquilo de ser sua forma de encontrar soluccedilotildees capacidade de conciliar a

atividade docente com a diretoria do campus a facilidade que tem em ajudar as

pessoas Tudo isso me impressionou O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo Grande

professor pesquisador e liacuteder Muito obrigada pela chance por ter me aceitado

Muito obrigada pela oportunidade por ter me direcionado Muito obrigada por ter

mostrado tanta luz com bondade Por ter acreditado O senhor tem toda minha

admiraccedilatildeo Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo

seria possiacutevel Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-

graduando

ldquoI learned that people will forget what you said people will forget what you did but people will never forget how you made them feelrdquo

Maya Angelou

Ao Universo a Deus ldquoA mente eacute implacaacutevel O que vocecirc pensa vocecirc realizardquo

Buda

Newton meu amor

Obrigada por me apoiar e me amar de maneira tatildeo doce

Meu irmatildeo Luis Tagliani Neto

Depois de dez anos de formada ainda eacute o melhor dentista que jaacute conheci Agradeccedilo demais

seu carinho apoio e irmandade no maior sentido da palavra

ldquoLamor che move il sole e laltre stellerdquo

Dante Alighieri

Cristiane Silva

Para minha irmatilde desta e de outras vidas dedico essa oraccedilatildeo

ldquoDeus obrigado pois sei que nunca iraacute me desamparar mesmo nos momentos mais difiacuteceis da minha vida o Senhor sempre estaraacute presente Obrigado pelo amanhecer ele me mostra que sempre posso recomeccedilar Obrigado tambeacutem pelo anoitecer ele me faz lembrar que tudo nessa vida eacute passageiro e que nenhum momento da vida seja bom ou ruim duraraacute para semprerdquo

Chico Xavier

Eacute uma honra e um orgulho ser julgada pela senhora Prof Dra Cristiane Maria da Costa Silva

doutora em Sauacutede Coletiva Muito obrigada

Dr Celso Charuri

ldquoExiste um amor maior Existe uma bondade maior Existe um poder maior A nossa mente estaacute ligada com o Universo Noacutes natildeo somos uma parte isolada do Universo Noacutes estamos juntos com todas as partes Noacutes fazemos parte da mesma respiraccedilatildeo ndash a grande respiraccedilatildeo A nossa pequena respiraccedilatildeo pulmonar eacute apenas ilusoacuteria O nosso movimento eacute apenas ilusoacuterio O nosso real movimento eacute mental espiritual Eacute ateacute onde noacutes conseguimos ver do todo que nos cerca e do qual fazemos parterdquo

Celso Charuri excerto de palestra de 8 de Setembro de 1981

AGRADECIMENTOS

Agrave Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP

ldquoQuando era bem pequena eu e minha famiacutelia passeaacutevamos de carro em

frente agrave FOB quando disse um dia estudarei aqui As palavras tem poderrdquo

Ao diretor do campus Bauru Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris

Agrave diretora da FOBUSP Prof Dra Maria Aparecida Machado

Agrave comissatildeo de poacutes-graduaccedilatildeo da FOBUSP

Aos professores do departamento de Sauacutede Coletiva da FOBUSP em

especial Prof Dr Lauris Prof Dr Heitor Prof Dra Nilce Prof Dr Eliel e Prof

Dra Silvia

Ao querido Prof Dr Roosevelt muito obrigada pela presenccedila constante

Agrave Prof Dra Daniela Rios muito obrigada por sua ajuda atenccedilatildeo e

ensinamentos

Agrave Prof Dra Anuradha Prakki agradeccedilo o fornecimento do extrato de

Cranberry

Agrave Prof Dra Astrid Vono uma inspiraccedilatildeo

Aos funcionaacuterios do departamento de Sauacutede Coletiva e do laboratoacuterio

de bioquiacutemica em especial Telma e Larissa

Aos alunos do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica com os quais convivi durante o

desenvolvimento da pesquisa

Agrave Ana Ameacutelia Silva Santos Thame pela caprichosa contribuiccedilatildeo na

formataccedilatildeo da Tese

Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita

Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete

Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio

Fernandes

Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa

e ao Prof Dr Maacutercio Beloti

Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa

cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela

Faculdade

Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial

A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz

Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara

grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta

excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de

pesquisas

Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado

RESUMO

Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry

possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de

agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho

tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de

Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a

dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina

bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-

gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de

Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de

extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a

base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a

base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os

diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro

desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3

ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos

seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as

3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15

horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os

dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os

resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5

190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10

152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de

Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na

reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados

Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio

ABSTRACT

In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion

Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might

inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental

wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and

Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive

challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by

different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel

(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-

005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10

Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-

5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied

over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the

blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and

artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles

the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to

quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test

(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd

G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac

G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin

gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)

and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other

evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry

and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in

vitro

Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 11

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28

3 PROPOSICcedilAtildeO 31

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41

45 PERFILOMETRIA INICIAL 43

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45

49 CICLAGEM EROSIVA 45

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48

5 RESULTADOS 49

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51

6 DISCUSSAtildeO 53

7 CONCLUSAtildeO 59

REFEREcircNCIAS 63

APEcircNDICE 73

1 Introduccedilatildeo

1 Introduccedilatildeo 13

1 INTRODUCcedilAtildeO

A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste

dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos

principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007

GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo

dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido

feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO

1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al

2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)

Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da

estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al

2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT

2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como

a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de

dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por

exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo

do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos

extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados

como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo

comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI

JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)

Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do

esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do

dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes

amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos

consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de

exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave

presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al

1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de

soluccedilatildeo profissional

1 Introduccedilatildeo 14

Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos

pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia

regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite

crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia

doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002

BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia

pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a

siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)

Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena

como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de

natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com

os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de

vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO

SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)

Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos

(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo

excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias

de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE

1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese

inicial do paciente

Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado

por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do

esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato

(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas

colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de

superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ

SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o

esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al

2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)

A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa

concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio

foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)

favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

Referecircncias 65

REFEREcircNCIAS

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 2: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

MARCELA MARTINI TAGLIANI

Efeitos comparativos de diferentes geacuteis agrave base de Cranberry

e Proantocianidina sobre a dentina submetida agrave erosatildeo

estudo in vitro

Tese apresentada agrave Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de Satildeo Paulo para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutora em Ciecircncias no Programa de Ciecircncias Odontoloacutegicas Aplicadas na aacuterea de concentraccedilatildeo Sauacutede Coletiva Orientador Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio

Versatildeo corrigida

BAURU

2015

Nota A versatildeo original desta tese encontra-se disponiacutevel no Serviccedilo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo da Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP

Tagliani Marcela Efeitos comparativos de diferentes geacuteis agrave base

de Cranberry e Proantocianidina sobre a dentina submetida agrave erosatildeo estudo in vitro Marcela Martini Tagliani ndash Bauru 2015

80p il 30cm

Tese (Doutorado) ndash Faculdade de Odontologia de Bauru Universidade de Satildeo Paulo

Orientador Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio

T128e

Autorizo exclusivamente para fins acadecircmicos e cientiacuteficos a reproduccedilatildeo total ou parcial desta tese por processos fotocopiadores e outros meios eletrocircnicos

Marcela Martini Tagliani

Data

DEDICATOacuteRIA

Dedico essa tese a Stella e Vivian minhas filhas

A Paulo e Eliana meus pais

Se eu pudesse novamente viver a minha vida na proacutexima trataria de cometer mais erros Natildeo tentaria ser tatildeo perfeito relaxaria mais seria mais tolo do que

tenho sido Na verdade bem poucas coisas levaria a seacuterio Seria menos higiecircnico Correria mais riscos viajaria mais contemplaria mais entardeceres subiria mais montanhas nadaria mais rios Iria a mais lugares onde nunca fui tomaria mais sorvetes e menos lentilha teria mais problemas reais e menos problemas imaginaacuterios Eu fui uma dessas pessoas que viveu sensata e profundamente cada minuto de sua vida claro que tive momentos de alegria Mas se eu pudesse voltar a viver trataria somente de ter bons momentos Porque se natildeo sabem disso eacute feita a vida soacute de momentos natildeo percam o agora Eu era um daqueles que nunca ia a parte alguma sem um termocircmetro uma bolsa de aacutegua quente um guarda-chuva e um paacutera-quedas e se voltasse a viver viajaria mais leve

Se eu pudesse voltar a viver comeccedilaria a andar descalccedilo no comeccedilo da primavera e continuaria assim ateacute o fim do outono Daria mais voltas na minha rua contemplaria mais amanheceres e brincaria com mais crianccedilas se tivesse outra vez uma vida pela frente Mas jaacute viram tenho 85 anos e estou morrendo

Autoria desconhecida

Filhas faccedilam suas vidas dignas de serem vividas Faccedilam o BEM ao

proacuteximo AMEM sem parcimocircnia sejam livres Amo vocecircs infinitamente e aleacutem

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Aos meus queridos orientadores

Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio Palavras satildeo poucas para agradecer o grande professor pesquisador orientador

mestre e liacuteder que o senhor foi para mim Muito obrigada por me acolher me ajudar

tanto por ser incriacutevel em sabedoria e conhecimento Um ser humano admiraacutevel

tambeacutem No tempo em que convivemos soacute vi o senhor brilhar muito aleacutem das

paredes da Faculdade O senhor vai muito muito longe Que sua jornada seja de

paz e alegrias dentro e fora da Universidade Muito obrigada pelos ensinamentos

oportunidade acolhimento e generosidade O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo

Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo seria possiacutevel

Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-graduando

ldquoIf you choose to use your status and influence to raise your voice on behalf of those who have no voice if you choose to identify not only with the powerful but with the powerless if you retain the ability to imagine yourself into the

lives of those who do not have your advantages then it will not only be your proud families who celebrate your existence but thousands and millions of people whose reality you have helped change We do not need magic to change the world we carry all the power we need inside ourselves already we have the power to imagine betterrdquo

excerpt from JK Rowling 2008 Harvard Commencement Speech

Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris Professor Lauris ter sido sua aluna e orientada foi uma grata surpresa que a vida

me concedeu Foi uma daacutediva O senhor eacute uma pessoa excepcional seu jeito

tranquilo de ser sua forma de encontrar soluccedilotildees capacidade de conciliar a

atividade docente com a diretoria do campus a facilidade que tem em ajudar as

pessoas Tudo isso me impressionou O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo Grande

professor pesquisador e liacuteder Muito obrigada pela chance por ter me aceitado

Muito obrigada pela oportunidade por ter me direcionado Muito obrigada por ter

mostrado tanta luz com bondade Por ter acreditado O senhor tem toda minha

admiraccedilatildeo Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo

seria possiacutevel Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-

graduando

ldquoI learned that people will forget what you said people will forget what you did but people will never forget how you made them feelrdquo

Maya Angelou

Ao Universo a Deus ldquoA mente eacute implacaacutevel O que vocecirc pensa vocecirc realizardquo

Buda

Newton meu amor

Obrigada por me apoiar e me amar de maneira tatildeo doce

Meu irmatildeo Luis Tagliani Neto

Depois de dez anos de formada ainda eacute o melhor dentista que jaacute conheci Agradeccedilo demais

seu carinho apoio e irmandade no maior sentido da palavra

ldquoLamor che move il sole e laltre stellerdquo

Dante Alighieri

Cristiane Silva

Para minha irmatilde desta e de outras vidas dedico essa oraccedilatildeo

ldquoDeus obrigado pois sei que nunca iraacute me desamparar mesmo nos momentos mais difiacuteceis da minha vida o Senhor sempre estaraacute presente Obrigado pelo amanhecer ele me mostra que sempre posso recomeccedilar Obrigado tambeacutem pelo anoitecer ele me faz lembrar que tudo nessa vida eacute passageiro e que nenhum momento da vida seja bom ou ruim duraraacute para semprerdquo

Chico Xavier

Eacute uma honra e um orgulho ser julgada pela senhora Prof Dra Cristiane Maria da Costa Silva

doutora em Sauacutede Coletiva Muito obrigada

Dr Celso Charuri

ldquoExiste um amor maior Existe uma bondade maior Existe um poder maior A nossa mente estaacute ligada com o Universo Noacutes natildeo somos uma parte isolada do Universo Noacutes estamos juntos com todas as partes Noacutes fazemos parte da mesma respiraccedilatildeo ndash a grande respiraccedilatildeo A nossa pequena respiraccedilatildeo pulmonar eacute apenas ilusoacuteria O nosso movimento eacute apenas ilusoacuterio O nosso real movimento eacute mental espiritual Eacute ateacute onde noacutes conseguimos ver do todo que nos cerca e do qual fazemos parterdquo

Celso Charuri excerto de palestra de 8 de Setembro de 1981

AGRADECIMENTOS

Agrave Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP

ldquoQuando era bem pequena eu e minha famiacutelia passeaacutevamos de carro em

frente agrave FOB quando disse um dia estudarei aqui As palavras tem poderrdquo

Ao diretor do campus Bauru Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris

Agrave diretora da FOBUSP Prof Dra Maria Aparecida Machado

Agrave comissatildeo de poacutes-graduaccedilatildeo da FOBUSP

Aos professores do departamento de Sauacutede Coletiva da FOBUSP em

especial Prof Dr Lauris Prof Dr Heitor Prof Dra Nilce Prof Dr Eliel e Prof

Dra Silvia

Ao querido Prof Dr Roosevelt muito obrigada pela presenccedila constante

Agrave Prof Dra Daniela Rios muito obrigada por sua ajuda atenccedilatildeo e

ensinamentos

Agrave Prof Dra Anuradha Prakki agradeccedilo o fornecimento do extrato de

Cranberry

Agrave Prof Dra Astrid Vono uma inspiraccedilatildeo

Aos funcionaacuterios do departamento de Sauacutede Coletiva e do laboratoacuterio

de bioquiacutemica em especial Telma e Larissa

Aos alunos do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica com os quais convivi durante o

desenvolvimento da pesquisa

Agrave Ana Ameacutelia Silva Santos Thame pela caprichosa contribuiccedilatildeo na

formataccedilatildeo da Tese

Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita

Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete

Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio

Fernandes

Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa

e ao Prof Dr Maacutercio Beloti

Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa

cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela

Faculdade

Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial

A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz

Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara

grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta

excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de

pesquisas

Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado

RESUMO

Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry

possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de

agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho

tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de

Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a

dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina

bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-

gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de

Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de

extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a

base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a

base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os

diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro

desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3

ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos

seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as

3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15

horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os

dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os

resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5

190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10

152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de

Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na

reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados

Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio

ABSTRACT

In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion

Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might

inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental

wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and

Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive

challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by

different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel

(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-

005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10

Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-

5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied

over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the

blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and

artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles

the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to

quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test

(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd

G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac

G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin

gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)

and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other

evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry

and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in

vitro

Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 11

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28

3 PROPOSICcedilAtildeO 31

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41

45 PERFILOMETRIA INICIAL 43

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45

49 CICLAGEM EROSIVA 45

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48

5 RESULTADOS 49

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51

6 DISCUSSAtildeO 53

7 CONCLUSAtildeO 59

REFEREcircNCIAS 63

APEcircNDICE 73

1 Introduccedilatildeo

1 Introduccedilatildeo 13

1 INTRODUCcedilAtildeO

A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste

dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos

principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007

GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo

dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido

feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO

1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al

2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)

Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da

estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al

2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT

2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como

a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de

dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por

exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo

do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos

extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados

como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo

comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI

JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)

Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do

esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do

dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes

amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos

consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de

exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave

presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al

1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de

soluccedilatildeo profissional

1 Introduccedilatildeo 14

Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos

pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia

regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite

crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia

doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002

BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia

pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a

siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)

Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena

como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de

natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com

os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de

vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO

SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)

Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos

(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo

excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias

de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE

1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese

inicial do paciente

Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado

por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do

esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato

(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas

colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de

superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ

SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o

esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al

2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)

A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa

concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio

foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)

favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 3: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

Nota A versatildeo original desta tese encontra-se disponiacutevel no Serviccedilo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo da Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP

Tagliani Marcela Efeitos comparativos de diferentes geacuteis agrave base

de Cranberry e Proantocianidina sobre a dentina submetida agrave erosatildeo estudo in vitro Marcela Martini Tagliani ndash Bauru 2015

80p il 30cm

Tese (Doutorado) ndash Faculdade de Odontologia de Bauru Universidade de Satildeo Paulo

Orientador Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio

T128e

Autorizo exclusivamente para fins acadecircmicos e cientiacuteficos a reproduccedilatildeo total ou parcial desta tese por processos fotocopiadores e outros meios eletrocircnicos

Marcela Martini Tagliani

Data

DEDICATOacuteRIA

Dedico essa tese a Stella e Vivian minhas filhas

A Paulo e Eliana meus pais

Se eu pudesse novamente viver a minha vida na proacutexima trataria de cometer mais erros Natildeo tentaria ser tatildeo perfeito relaxaria mais seria mais tolo do que

tenho sido Na verdade bem poucas coisas levaria a seacuterio Seria menos higiecircnico Correria mais riscos viajaria mais contemplaria mais entardeceres subiria mais montanhas nadaria mais rios Iria a mais lugares onde nunca fui tomaria mais sorvetes e menos lentilha teria mais problemas reais e menos problemas imaginaacuterios Eu fui uma dessas pessoas que viveu sensata e profundamente cada minuto de sua vida claro que tive momentos de alegria Mas se eu pudesse voltar a viver trataria somente de ter bons momentos Porque se natildeo sabem disso eacute feita a vida soacute de momentos natildeo percam o agora Eu era um daqueles que nunca ia a parte alguma sem um termocircmetro uma bolsa de aacutegua quente um guarda-chuva e um paacutera-quedas e se voltasse a viver viajaria mais leve

Se eu pudesse voltar a viver comeccedilaria a andar descalccedilo no comeccedilo da primavera e continuaria assim ateacute o fim do outono Daria mais voltas na minha rua contemplaria mais amanheceres e brincaria com mais crianccedilas se tivesse outra vez uma vida pela frente Mas jaacute viram tenho 85 anos e estou morrendo

Autoria desconhecida

Filhas faccedilam suas vidas dignas de serem vividas Faccedilam o BEM ao

proacuteximo AMEM sem parcimocircnia sejam livres Amo vocecircs infinitamente e aleacutem

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Aos meus queridos orientadores

Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio Palavras satildeo poucas para agradecer o grande professor pesquisador orientador

mestre e liacuteder que o senhor foi para mim Muito obrigada por me acolher me ajudar

tanto por ser incriacutevel em sabedoria e conhecimento Um ser humano admiraacutevel

tambeacutem No tempo em que convivemos soacute vi o senhor brilhar muito aleacutem das

paredes da Faculdade O senhor vai muito muito longe Que sua jornada seja de

paz e alegrias dentro e fora da Universidade Muito obrigada pelos ensinamentos

oportunidade acolhimento e generosidade O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo

Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo seria possiacutevel

Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-graduando

ldquoIf you choose to use your status and influence to raise your voice on behalf of those who have no voice if you choose to identify not only with the powerful but with the powerless if you retain the ability to imagine yourself into the

lives of those who do not have your advantages then it will not only be your proud families who celebrate your existence but thousands and millions of people whose reality you have helped change We do not need magic to change the world we carry all the power we need inside ourselves already we have the power to imagine betterrdquo

excerpt from JK Rowling 2008 Harvard Commencement Speech

Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris Professor Lauris ter sido sua aluna e orientada foi uma grata surpresa que a vida

me concedeu Foi uma daacutediva O senhor eacute uma pessoa excepcional seu jeito

tranquilo de ser sua forma de encontrar soluccedilotildees capacidade de conciliar a

atividade docente com a diretoria do campus a facilidade que tem em ajudar as

pessoas Tudo isso me impressionou O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo Grande

professor pesquisador e liacuteder Muito obrigada pela chance por ter me aceitado

Muito obrigada pela oportunidade por ter me direcionado Muito obrigada por ter

mostrado tanta luz com bondade Por ter acreditado O senhor tem toda minha

admiraccedilatildeo Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo

seria possiacutevel Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-

graduando

ldquoI learned that people will forget what you said people will forget what you did but people will never forget how you made them feelrdquo

Maya Angelou

Ao Universo a Deus ldquoA mente eacute implacaacutevel O que vocecirc pensa vocecirc realizardquo

Buda

Newton meu amor

Obrigada por me apoiar e me amar de maneira tatildeo doce

Meu irmatildeo Luis Tagliani Neto

Depois de dez anos de formada ainda eacute o melhor dentista que jaacute conheci Agradeccedilo demais

seu carinho apoio e irmandade no maior sentido da palavra

ldquoLamor che move il sole e laltre stellerdquo

Dante Alighieri

Cristiane Silva

Para minha irmatilde desta e de outras vidas dedico essa oraccedilatildeo

ldquoDeus obrigado pois sei que nunca iraacute me desamparar mesmo nos momentos mais difiacuteceis da minha vida o Senhor sempre estaraacute presente Obrigado pelo amanhecer ele me mostra que sempre posso recomeccedilar Obrigado tambeacutem pelo anoitecer ele me faz lembrar que tudo nessa vida eacute passageiro e que nenhum momento da vida seja bom ou ruim duraraacute para semprerdquo

Chico Xavier

Eacute uma honra e um orgulho ser julgada pela senhora Prof Dra Cristiane Maria da Costa Silva

doutora em Sauacutede Coletiva Muito obrigada

Dr Celso Charuri

ldquoExiste um amor maior Existe uma bondade maior Existe um poder maior A nossa mente estaacute ligada com o Universo Noacutes natildeo somos uma parte isolada do Universo Noacutes estamos juntos com todas as partes Noacutes fazemos parte da mesma respiraccedilatildeo ndash a grande respiraccedilatildeo A nossa pequena respiraccedilatildeo pulmonar eacute apenas ilusoacuteria O nosso movimento eacute apenas ilusoacuterio O nosso real movimento eacute mental espiritual Eacute ateacute onde noacutes conseguimos ver do todo que nos cerca e do qual fazemos parterdquo

Celso Charuri excerto de palestra de 8 de Setembro de 1981

AGRADECIMENTOS

Agrave Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP

ldquoQuando era bem pequena eu e minha famiacutelia passeaacutevamos de carro em

frente agrave FOB quando disse um dia estudarei aqui As palavras tem poderrdquo

Ao diretor do campus Bauru Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris

Agrave diretora da FOBUSP Prof Dra Maria Aparecida Machado

Agrave comissatildeo de poacutes-graduaccedilatildeo da FOBUSP

Aos professores do departamento de Sauacutede Coletiva da FOBUSP em

especial Prof Dr Lauris Prof Dr Heitor Prof Dra Nilce Prof Dr Eliel e Prof

Dra Silvia

Ao querido Prof Dr Roosevelt muito obrigada pela presenccedila constante

Agrave Prof Dra Daniela Rios muito obrigada por sua ajuda atenccedilatildeo e

ensinamentos

Agrave Prof Dra Anuradha Prakki agradeccedilo o fornecimento do extrato de

Cranberry

Agrave Prof Dra Astrid Vono uma inspiraccedilatildeo

Aos funcionaacuterios do departamento de Sauacutede Coletiva e do laboratoacuterio

de bioquiacutemica em especial Telma e Larissa

Aos alunos do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica com os quais convivi durante o

desenvolvimento da pesquisa

Agrave Ana Ameacutelia Silva Santos Thame pela caprichosa contribuiccedilatildeo na

formataccedilatildeo da Tese

Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita

Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete

Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio

Fernandes

Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa

e ao Prof Dr Maacutercio Beloti

Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa

cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela

Faculdade

Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial

A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz

Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara

grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta

excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de

pesquisas

Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado

RESUMO

Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry

possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de

agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho

tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de

Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a

dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina

bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-

gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de

Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de

extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a

base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a

base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os

diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro

desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3

ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos

seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as

3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15

horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os

dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os

resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5

190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10

152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de

Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na

reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados

Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio

ABSTRACT

In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion

Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might

inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental

wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and

Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive

challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by

different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel

(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-

005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10

Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-

5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied

over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the

blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and

artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles

the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to

quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test

(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd

G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac

G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin

gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)

and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other

evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry

and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in

vitro

Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 11

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28

3 PROPOSICcedilAtildeO 31

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41

45 PERFILOMETRIA INICIAL 43

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45

49 CICLAGEM EROSIVA 45

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48

5 RESULTADOS 49

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51

6 DISCUSSAtildeO 53

7 CONCLUSAtildeO 59

REFEREcircNCIAS 63

APEcircNDICE 73

1 Introduccedilatildeo

1 Introduccedilatildeo 13

1 INTRODUCcedilAtildeO

A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste

dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos

principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007

GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo

dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido

feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO

1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al

2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)

Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da

estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al

2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT

2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como

a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de

dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por

exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo

do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos

extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados

como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo

comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI

JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)

Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do

esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do

dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes

amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos

consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de

exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave

presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al

1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de

soluccedilatildeo profissional

1 Introduccedilatildeo 14

Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos

pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia

regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite

crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia

doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002

BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia

pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a

siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)

Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena

como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de

natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com

os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de

vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO

SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)

Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos

(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo

excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias

de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE

1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese

inicial do paciente

Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado

por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do

esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato

(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas

colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de

superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ

SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o

esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al

2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)

A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa

concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio

foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)

favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8

5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 4: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

DEDICATOacuteRIA

Dedico essa tese a Stella e Vivian minhas filhas

A Paulo e Eliana meus pais

Se eu pudesse novamente viver a minha vida na proacutexima trataria de cometer mais erros Natildeo tentaria ser tatildeo perfeito relaxaria mais seria mais tolo do que

tenho sido Na verdade bem poucas coisas levaria a seacuterio Seria menos higiecircnico Correria mais riscos viajaria mais contemplaria mais entardeceres subiria mais montanhas nadaria mais rios Iria a mais lugares onde nunca fui tomaria mais sorvetes e menos lentilha teria mais problemas reais e menos problemas imaginaacuterios Eu fui uma dessas pessoas que viveu sensata e profundamente cada minuto de sua vida claro que tive momentos de alegria Mas se eu pudesse voltar a viver trataria somente de ter bons momentos Porque se natildeo sabem disso eacute feita a vida soacute de momentos natildeo percam o agora Eu era um daqueles que nunca ia a parte alguma sem um termocircmetro uma bolsa de aacutegua quente um guarda-chuva e um paacutera-quedas e se voltasse a viver viajaria mais leve

Se eu pudesse voltar a viver comeccedilaria a andar descalccedilo no comeccedilo da primavera e continuaria assim ateacute o fim do outono Daria mais voltas na minha rua contemplaria mais amanheceres e brincaria com mais crianccedilas se tivesse outra vez uma vida pela frente Mas jaacute viram tenho 85 anos e estou morrendo

Autoria desconhecida

Filhas faccedilam suas vidas dignas de serem vividas Faccedilam o BEM ao

proacuteximo AMEM sem parcimocircnia sejam livres Amo vocecircs infinitamente e aleacutem

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Aos meus queridos orientadores

Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio Palavras satildeo poucas para agradecer o grande professor pesquisador orientador

mestre e liacuteder que o senhor foi para mim Muito obrigada por me acolher me ajudar

tanto por ser incriacutevel em sabedoria e conhecimento Um ser humano admiraacutevel

tambeacutem No tempo em que convivemos soacute vi o senhor brilhar muito aleacutem das

paredes da Faculdade O senhor vai muito muito longe Que sua jornada seja de

paz e alegrias dentro e fora da Universidade Muito obrigada pelos ensinamentos

oportunidade acolhimento e generosidade O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo

Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo seria possiacutevel

Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-graduando

ldquoIf you choose to use your status and influence to raise your voice on behalf of those who have no voice if you choose to identify not only with the powerful but with the powerless if you retain the ability to imagine yourself into the

lives of those who do not have your advantages then it will not only be your proud families who celebrate your existence but thousands and millions of people whose reality you have helped change We do not need magic to change the world we carry all the power we need inside ourselves already we have the power to imagine betterrdquo

excerpt from JK Rowling 2008 Harvard Commencement Speech

Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris Professor Lauris ter sido sua aluna e orientada foi uma grata surpresa que a vida

me concedeu Foi uma daacutediva O senhor eacute uma pessoa excepcional seu jeito

tranquilo de ser sua forma de encontrar soluccedilotildees capacidade de conciliar a

atividade docente com a diretoria do campus a facilidade que tem em ajudar as

pessoas Tudo isso me impressionou O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo Grande

professor pesquisador e liacuteder Muito obrigada pela chance por ter me aceitado

Muito obrigada pela oportunidade por ter me direcionado Muito obrigada por ter

mostrado tanta luz com bondade Por ter acreditado O senhor tem toda minha

admiraccedilatildeo Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo

seria possiacutevel Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-

graduando

ldquoI learned that people will forget what you said people will forget what you did but people will never forget how you made them feelrdquo

Maya Angelou

Ao Universo a Deus ldquoA mente eacute implacaacutevel O que vocecirc pensa vocecirc realizardquo

Buda

Newton meu amor

Obrigada por me apoiar e me amar de maneira tatildeo doce

Meu irmatildeo Luis Tagliani Neto

Depois de dez anos de formada ainda eacute o melhor dentista que jaacute conheci Agradeccedilo demais

seu carinho apoio e irmandade no maior sentido da palavra

ldquoLamor che move il sole e laltre stellerdquo

Dante Alighieri

Cristiane Silva

Para minha irmatilde desta e de outras vidas dedico essa oraccedilatildeo

ldquoDeus obrigado pois sei que nunca iraacute me desamparar mesmo nos momentos mais difiacuteceis da minha vida o Senhor sempre estaraacute presente Obrigado pelo amanhecer ele me mostra que sempre posso recomeccedilar Obrigado tambeacutem pelo anoitecer ele me faz lembrar que tudo nessa vida eacute passageiro e que nenhum momento da vida seja bom ou ruim duraraacute para semprerdquo

Chico Xavier

Eacute uma honra e um orgulho ser julgada pela senhora Prof Dra Cristiane Maria da Costa Silva

doutora em Sauacutede Coletiva Muito obrigada

Dr Celso Charuri

ldquoExiste um amor maior Existe uma bondade maior Existe um poder maior A nossa mente estaacute ligada com o Universo Noacutes natildeo somos uma parte isolada do Universo Noacutes estamos juntos com todas as partes Noacutes fazemos parte da mesma respiraccedilatildeo ndash a grande respiraccedilatildeo A nossa pequena respiraccedilatildeo pulmonar eacute apenas ilusoacuteria O nosso movimento eacute apenas ilusoacuterio O nosso real movimento eacute mental espiritual Eacute ateacute onde noacutes conseguimos ver do todo que nos cerca e do qual fazemos parterdquo

Celso Charuri excerto de palestra de 8 de Setembro de 1981

AGRADECIMENTOS

Agrave Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP

ldquoQuando era bem pequena eu e minha famiacutelia passeaacutevamos de carro em

frente agrave FOB quando disse um dia estudarei aqui As palavras tem poderrdquo

Ao diretor do campus Bauru Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris

Agrave diretora da FOBUSP Prof Dra Maria Aparecida Machado

Agrave comissatildeo de poacutes-graduaccedilatildeo da FOBUSP

Aos professores do departamento de Sauacutede Coletiva da FOBUSP em

especial Prof Dr Lauris Prof Dr Heitor Prof Dra Nilce Prof Dr Eliel e Prof

Dra Silvia

Ao querido Prof Dr Roosevelt muito obrigada pela presenccedila constante

Agrave Prof Dra Daniela Rios muito obrigada por sua ajuda atenccedilatildeo e

ensinamentos

Agrave Prof Dra Anuradha Prakki agradeccedilo o fornecimento do extrato de

Cranberry

Agrave Prof Dra Astrid Vono uma inspiraccedilatildeo

Aos funcionaacuterios do departamento de Sauacutede Coletiva e do laboratoacuterio

de bioquiacutemica em especial Telma e Larissa

Aos alunos do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica com os quais convivi durante o

desenvolvimento da pesquisa

Agrave Ana Ameacutelia Silva Santos Thame pela caprichosa contribuiccedilatildeo na

formataccedilatildeo da Tese

Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita

Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete

Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio

Fernandes

Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa

e ao Prof Dr Maacutercio Beloti

Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa

cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela

Faculdade

Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial

A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz

Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara

grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta

excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de

pesquisas

Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado

RESUMO

Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry

possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de

agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho

tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de

Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a

dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina

bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-

gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de

Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de

extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a

base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a

base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os

diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro

desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3

ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos

seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as

3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15

horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os

dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os

resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5

190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10

152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de

Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na

reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados

Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio

ABSTRACT

In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion

Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might

inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental

wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and

Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive

challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by

different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel

(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-

005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10

Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-

5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied

over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the

blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and

artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles

the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to

quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test

(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd

G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac

G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin

gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)

and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other

evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry

and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in

vitro

Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 11

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28

3 PROPOSICcedilAtildeO 31

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41

45 PERFILOMETRIA INICIAL 43

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45

49 CICLAGEM EROSIVA 45

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48

5 RESULTADOS 49

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51

6 DISCUSSAtildeO 53

7 CONCLUSAtildeO 59

REFEREcircNCIAS 63

APEcircNDICE 73

1 Introduccedilatildeo

1 Introduccedilatildeo 13

1 INTRODUCcedilAtildeO

A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste

dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos

principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007

GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo

dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido

feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO

1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al

2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)

Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da

estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al

2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT

2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como

a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de

dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por

exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo

do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos

extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados

como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo

comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI

JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)

Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do

esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do

dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes

amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos

consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de

exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave

presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al

1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de

soluccedilatildeo profissional

1 Introduccedilatildeo 14

Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos

pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia

regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite

crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia

doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002

BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia

pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a

siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)

Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena

como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de

natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com

os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de

vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO

SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)

Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos

(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo

excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias

de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE

1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese

inicial do paciente

Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado

por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do

esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato

(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas

colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de

superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ

SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o

esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al

2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)

A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa

concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio

foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)

favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6

3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114

4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8

5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 5: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Aos meus queridos orientadores

Prof Dr Heitor Marques Honoacuterio Palavras satildeo poucas para agradecer o grande professor pesquisador orientador

mestre e liacuteder que o senhor foi para mim Muito obrigada por me acolher me ajudar

tanto por ser incriacutevel em sabedoria e conhecimento Um ser humano admiraacutevel

tambeacutem No tempo em que convivemos soacute vi o senhor brilhar muito aleacutem das

paredes da Faculdade O senhor vai muito muito longe Que sua jornada seja de

paz e alegrias dentro e fora da Universidade Muito obrigada pelos ensinamentos

oportunidade acolhimento e generosidade O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo

Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo seria possiacutevel

Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-graduando

ldquoIf you choose to use your status and influence to raise your voice on behalf of those who have no voice if you choose to identify not only with the powerful but with the powerless if you retain the ability to imagine yourself into the

lives of those who do not have your advantages then it will not only be your proud families who celebrate your existence but thousands and millions of people whose reality you have helped change We do not need magic to change the world we carry all the power we need inside ourselves already we have the power to imagine betterrdquo

excerpt from JK Rowling 2008 Harvard Commencement Speech

Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris Professor Lauris ter sido sua aluna e orientada foi uma grata surpresa que a vida

me concedeu Foi uma daacutediva O senhor eacute uma pessoa excepcional seu jeito

tranquilo de ser sua forma de encontrar soluccedilotildees capacidade de conciliar a

atividade docente com a diretoria do campus a facilidade que tem em ajudar as

pessoas Tudo isso me impressionou O senhor tem toda minha admiraccedilatildeo Grande

professor pesquisador e liacuteder Muito obrigada pela chance por ter me aceitado

Muito obrigada pela oportunidade por ter me direcionado Muito obrigada por ter

mostrado tanta luz com bondade Por ter acreditado O senhor tem toda minha

admiraccedilatildeo Muito obrigada por ter me ajudado nessa trajetoacuteria sem o senhor natildeo

seria possiacutevel Ser sua (seu) orientada (o) eacute como um sonho para um poacutes-

graduando

ldquoI learned that people will forget what you said people will forget what you did but people will never forget how you made them feelrdquo

Maya Angelou

Ao Universo a Deus ldquoA mente eacute implacaacutevel O que vocecirc pensa vocecirc realizardquo

Buda

Newton meu amor

Obrigada por me apoiar e me amar de maneira tatildeo doce

Meu irmatildeo Luis Tagliani Neto

Depois de dez anos de formada ainda eacute o melhor dentista que jaacute conheci Agradeccedilo demais

seu carinho apoio e irmandade no maior sentido da palavra

ldquoLamor che move il sole e laltre stellerdquo

Dante Alighieri

Cristiane Silva

Para minha irmatilde desta e de outras vidas dedico essa oraccedilatildeo

ldquoDeus obrigado pois sei que nunca iraacute me desamparar mesmo nos momentos mais difiacuteceis da minha vida o Senhor sempre estaraacute presente Obrigado pelo amanhecer ele me mostra que sempre posso recomeccedilar Obrigado tambeacutem pelo anoitecer ele me faz lembrar que tudo nessa vida eacute passageiro e que nenhum momento da vida seja bom ou ruim duraraacute para semprerdquo

Chico Xavier

Eacute uma honra e um orgulho ser julgada pela senhora Prof Dra Cristiane Maria da Costa Silva

doutora em Sauacutede Coletiva Muito obrigada

Dr Celso Charuri

ldquoExiste um amor maior Existe uma bondade maior Existe um poder maior A nossa mente estaacute ligada com o Universo Noacutes natildeo somos uma parte isolada do Universo Noacutes estamos juntos com todas as partes Noacutes fazemos parte da mesma respiraccedilatildeo ndash a grande respiraccedilatildeo A nossa pequena respiraccedilatildeo pulmonar eacute apenas ilusoacuteria O nosso movimento eacute apenas ilusoacuterio O nosso real movimento eacute mental espiritual Eacute ateacute onde noacutes conseguimos ver do todo que nos cerca e do qual fazemos parterdquo

Celso Charuri excerto de palestra de 8 de Setembro de 1981

AGRADECIMENTOS

Agrave Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP

ldquoQuando era bem pequena eu e minha famiacutelia passeaacutevamos de carro em

frente agrave FOB quando disse um dia estudarei aqui As palavras tem poderrdquo

Ao diretor do campus Bauru Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris

Agrave diretora da FOBUSP Prof Dra Maria Aparecida Machado

Agrave comissatildeo de poacutes-graduaccedilatildeo da FOBUSP

Aos professores do departamento de Sauacutede Coletiva da FOBUSP em

especial Prof Dr Lauris Prof Dr Heitor Prof Dra Nilce Prof Dr Eliel e Prof

Dra Silvia

Ao querido Prof Dr Roosevelt muito obrigada pela presenccedila constante

Agrave Prof Dra Daniela Rios muito obrigada por sua ajuda atenccedilatildeo e

ensinamentos

Agrave Prof Dra Anuradha Prakki agradeccedilo o fornecimento do extrato de

Cranberry

Agrave Prof Dra Astrid Vono uma inspiraccedilatildeo

Aos funcionaacuterios do departamento de Sauacutede Coletiva e do laboratoacuterio

de bioquiacutemica em especial Telma e Larissa

Aos alunos do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica com os quais convivi durante o

desenvolvimento da pesquisa

Agrave Ana Ameacutelia Silva Santos Thame pela caprichosa contribuiccedilatildeo na

formataccedilatildeo da Tese

Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita

Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete

Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio

Fernandes

Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa

e ao Prof Dr Maacutercio Beloti

Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa

cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela

Faculdade

Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial

A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz

Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara

grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta

excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de

pesquisas

Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado

RESUMO

Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry

possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de

agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho

tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de

Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a

dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina

bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-

gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de

Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de

extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a

base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a

base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os

diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro

desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3

ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos

seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as

3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15

horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os

dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os

resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5

190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10

152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de

Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na

reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados

Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio

ABSTRACT

In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion

Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might

inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental

wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and

Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive

challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by

different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel

(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-

005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10

Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-

5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied

over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the

blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and

artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles

the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to

quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test

(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd

G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac

G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin

gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)

and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other

evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry

and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in

vitro

Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 11

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28

3 PROPOSICcedilAtildeO 31

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41

45 PERFILOMETRIA INICIAL 43

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45

49 CICLAGEM EROSIVA 45

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48

5 RESULTADOS 49

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51

6 DISCUSSAtildeO 53

7 CONCLUSAtildeO 59

REFEREcircNCIAS 63

APEcircNDICE 73

1 Introduccedilatildeo

1 Introduccedilatildeo 13

1 INTRODUCcedilAtildeO

A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste

dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos

principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007

GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo

dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido

feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO

1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al

2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)

Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da

estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al

2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT

2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como

a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de

dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por

exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo

do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos

extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados

como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo

comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI

JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)

Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do

esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do

dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes

amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos

consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de

exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave

presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al

1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de

soluccedilatildeo profissional

1 Introduccedilatildeo 14

Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos

pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia

regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite

crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia

doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002

BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia

pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a

siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)

Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena

como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de

natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com

os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de

vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO

SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)

Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos

(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo

excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias

de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE

1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese

inicial do paciente

Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado

por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do

esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato

(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas

colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de

superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ

SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o

esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al

2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)

A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa

concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio

foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)

favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 6: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

Ao Universo a Deus ldquoA mente eacute implacaacutevel O que vocecirc pensa vocecirc realizardquo

Buda

Newton meu amor

Obrigada por me apoiar e me amar de maneira tatildeo doce

Meu irmatildeo Luis Tagliani Neto

Depois de dez anos de formada ainda eacute o melhor dentista que jaacute conheci Agradeccedilo demais

seu carinho apoio e irmandade no maior sentido da palavra

ldquoLamor che move il sole e laltre stellerdquo

Dante Alighieri

Cristiane Silva

Para minha irmatilde desta e de outras vidas dedico essa oraccedilatildeo

ldquoDeus obrigado pois sei que nunca iraacute me desamparar mesmo nos momentos mais difiacuteceis da minha vida o Senhor sempre estaraacute presente Obrigado pelo amanhecer ele me mostra que sempre posso recomeccedilar Obrigado tambeacutem pelo anoitecer ele me faz lembrar que tudo nessa vida eacute passageiro e que nenhum momento da vida seja bom ou ruim duraraacute para semprerdquo

Chico Xavier

Eacute uma honra e um orgulho ser julgada pela senhora Prof Dra Cristiane Maria da Costa Silva

doutora em Sauacutede Coletiva Muito obrigada

Dr Celso Charuri

ldquoExiste um amor maior Existe uma bondade maior Existe um poder maior A nossa mente estaacute ligada com o Universo Noacutes natildeo somos uma parte isolada do Universo Noacutes estamos juntos com todas as partes Noacutes fazemos parte da mesma respiraccedilatildeo ndash a grande respiraccedilatildeo A nossa pequena respiraccedilatildeo pulmonar eacute apenas ilusoacuteria O nosso movimento eacute apenas ilusoacuterio O nosso real movimento eacute mental espiritual Eacute ateacute onde noacutes conseguimos ver do todo que nos cerca e do qual fazemos parterdquo

Celso Charuri excerto de palestra de 8 de Setembro de 1981

AGRADECIMENTOS

Agrave Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP

ldquoQuando era bem pequena eu e minha famiacutelia passeaacutevamos de carro em

frente agrave FOB quando disse um dia estudarei aqui As palavras tem poderrdquo

Ao diretor do campus Bauru Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris

Agrave diretora da FOBUSP Prof Dra Maria Aparecida Machado

Agrave comissatildeo de poacutes-graduaccedilatildeo da FOBUSP

Aos professores do departamento de Sauacutede Coletiva da FOBUSP em

especial Prof Dr Lauris Prof Dr Heitor Prof Dra Nilce Prof Dr Eliel e Prof

Dra Silvia

Ao querido Prof Dr Roosevelt muito obrigada pela presenccedila constante

Agrave Prof Dra Daniela Rios muito obrigada por sua ajuda atenccedilatildeo e

ensinamentos

Agrave Prof Dra Anuradha Prakki agradeccedilo o fornecimento do extrato de

Cranberry

Agrave Prof Dra Astrid Vono uma inspiraccedilatildeo

Aos funcionaacuterios do departamento de Sauacutede Coletiva e do laboratoacuterio

de bioquiacutemica em especial Telma e Larissa

Aos alunos do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica com os quais convivi durante o

desenvolvimento da pesquisa

Agrave Ana Ameacutelia Silva Santos Thame pela caprichosa contribuiccedilatildeo na

formataccedilatildeo da Tese

Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita

Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete

Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio

Fernandes

Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa

e ao Prof Dr Maacutercio Beloti

Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa

cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela

Faculdade

Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial

A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz

Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara

grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta

excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de

pesquisas

Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado

RESUMO

Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry

possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de

agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho

tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de

Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a

dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina

bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-

gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de

Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de

extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a

base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a

base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os

diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro

desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3

ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos

seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as

3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15

horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os

dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os

resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5

190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10

152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de

Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na

reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados

Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio

ABSTRACT

In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion

Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might

inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental

wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and

Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive

challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by

different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel

(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-

005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10

Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-

5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied

over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the

blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and

artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles

the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to

quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test

(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd

G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac

G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin

gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)

and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other

evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry

and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in

vitro

Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 11

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28

3 PROPOSICcedilAtildeO 31

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41

45 PERFILOMETRIA INICIAL 43

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45

49 CICLAGEM EROSIVA 45

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48

5 RESULTADOS 49

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51

6 DISCUSSAtildeO 53

7 CONCLUSAtildeO 59

REFEREcircNCIAS 63

APEcircNDICE 73

1 Introduccedilatildeo

1 Introduccedilatildeo 13

1 INTRODUCcedilAtildeO

A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste

dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos

principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007

GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo

dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido

feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO

1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al

2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)

Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da

estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al

2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT

2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como

a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de

dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por

exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo

do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos

extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados

como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo

comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI

JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)

Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do

esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do

dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes

amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos

consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de

exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave

presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al

1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de

soluccedilatildeo profissional

1 Introduccedilatildeo 14

Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos

pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia

regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite

crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia

doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002

BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia

pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a

siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)

Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena

como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de

natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com

os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de

vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO

SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)

Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos

(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo

excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias

de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE

1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese

inicial do paciente

Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado

por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do

esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato

(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas

colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de

superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ

SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o

esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al

2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)

A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa

concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio

foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)

favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

Referecircncias 65

REFEREcircNCIAS

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 7: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

AGRADECIMENTOS

Agrave Faculdade de Odontologia de Bauru ndash FOBUSP

ldquoQuando era bem pequena eu e minha famiacutelia passeaacutevamos de carro em

frente agrave FOB quando disse um dia estudarei aqui As palavras tem poderrdquo

Ao diretor do campus Bauru Prof Dr Joseacute Roberto Pereira Lauris

Agrave diretora da FOBUSP Prof Dra Maria Aparecida Machado

Agrave comissatildeo de poacutes-graduaccedilatildeo da FOBUSP

Aos professores do departamento de Sauacutede Coletiva da FOBUSP em

especial Prof Dr Lauris Prof Dr Heitor Prof Dra Nilce Prof Dr Eliel e Prof

Dra Silvia

Ao querido Prof Dr Roosevelt muito obrigada pela presenccedila constante

Agrave Prof Dra Daniela Rios muito obrigada por sua ajuda atenccedilatildeo e

ensinamentos

Agrave Prof Dra Anuradha Prakki agradeccedilo o fornecimento do extrato de

Cranberry

Agrave Prof Dra Astrid Vono uma inspiraccedilatildeo

Aos funcionaacuterios do departamento de Sauacutede Coletiva e do laboratoacuterio

de bioquiacutemica em especial Telma e Larissa

Aos alunos do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica com os quais convivi durante o

desenvolvimento da pesquisa

Agrave Ana Ameacutelia Silva Santos Thame pela caprichosa contribuiccedilatildeo na

formataccedilatildeo da Tese

Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita

Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete

Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio

Fernandes

Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa

e ao Prof Dr Maacutercio Beloti

Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa

cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela

Faculdade

Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial

A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz

Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara

grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta

excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de

pesquisas

Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado

RESUMO

Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry

possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de

agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho

tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de

Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a

dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina

bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-

gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de

Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de

extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a

base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a

base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os

diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro

desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3

ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos

seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as

3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15

horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os

dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os

resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5

190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10

152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de

Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na

reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados

Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio

ABSTRACT

In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion

Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might

inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental

wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and

Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive

challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by

different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel

(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-

005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10

Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-

5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied

over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the

blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and

artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles

the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to

quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test

(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd

G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac

G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin

gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)

and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other

evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry

and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in

vitro

Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 11

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28

3 PROPOSICcedilAtildeO 31

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41

45 PERFILOMETRIA INICIAL 43

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45

49 CICLAGEM EROSIVA 45

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48

5 RESULTADOS 49

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51

6 DISCUSSAtildeO 53

7 CONCLUSAtildeO 59

REFEREcircNCIAS 63

APEcircNDICE 73

1 Introduccedilatildeo

1 Introduccedilatildeo 13

1 INTRODUCcedilAtildeO

A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste

dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos

principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007

GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo

dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido

feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO

1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al

2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)

Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da

estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al

2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT

2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como

a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de

dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por

exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo

do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos

extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados

como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo

comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI

JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)

Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do

esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do

dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes

amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos

consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de

exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave

presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al

1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de

soluccedilatildeo profissional

1 Introduccedilatildeo 14

Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos

pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia

regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite

crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia

doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002

BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia

pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a

siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)

Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena

como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de

natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com

os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de

vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO

SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)

Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos

(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo

excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias

de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE

1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese

inicial do paciente

Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado

por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do

esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato

(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas

colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de

superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ

SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o

esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al

2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)

A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa

concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio

foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)

favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 8: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

Aos queridos Patriacutecia Valentim Luiza Valentim Maria Arantes Thalita

Franco Nataacutelia Mondelli Patriacutecia Mendonccedila Marcella Fasano Ligia Quinete

Newton Ribeiro Filho Amanda Beltramine Karen Fernandes Dr Antocircnio

Fernandes

Ao meu primeiro orientador grande super genial Prof Dr Adalberto Rosa

e ao Prof Dr Maacutercio Beloti

Prof Dra Alma Catirse inesqueciacutevel professora maravilhosa pessoa

cujos profundos ensinamentos foram mais fortes que o tempo e a passagem pela

Faculdade

Zilaacute Soucheff muito obrigada por ser tatildeo especial

A minhas professoras da residecircncia no HRACUSP Prof Dra Beatriz

Costa e Profa Dra Marcia Gomide em especial Prof Dra Cleide Carrara

grande pesquisadora querida competente inesqueciacutevel generosa altruiacutesta

excepcional orientadora Muito obrigada pelo apoio no desenvolvimento de

pesquisas

Aos meus generosos colegas de residecircncia mestrado e doutorado

RESUMO

Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry

possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de

agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho

tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de

Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a

dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina

bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-

gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de

Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de

extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a

base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a

base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os

diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro

desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3

ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos

seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as

3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15

horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os

dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os

resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5

190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10

152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de

Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na

reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados

Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio

ABSTRACT

In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion

Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might

inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental

wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and

Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive

challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by

different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel

(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-

005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10

Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-

5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied

over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the

blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and

artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles

the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to

quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test

(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd

G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac

G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin

gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)

and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other

evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry

and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in

vitro

Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 11

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28

3 PROPOSICcedilAtildeO 31

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41

45 PERFILOMETRIA INICIAL 43

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45

49 CICLAGEM EROSIVA 45

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48

5 RESULTADOS 49

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51

6 DISCUSSAtildeO 53

7 CONCLUSAtildeO 59

REFEREcircNCIAS 63

APEcircNDICE 73

1 Introduccedilatildeo

1 Introduccedilatildeo 13

1 INTRODUCcedilAtildeO

A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste

dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos

principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007

GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo

dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido

feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO

1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al

2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)

Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da

estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al

2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT

2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como

a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de

dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por

exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo

do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos

extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados

como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo

comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI

JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)

Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do

esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do

dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes

amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos

consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de

exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave

presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al

1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de

soluccedilatildeo profissional

1 Introduccedilatildeo 14

Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos

pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia

regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite

crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia

doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002

BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia

pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a

siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)

Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena

como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de

natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com

os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de

vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO

SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)

Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos

(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo

excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias

de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE

1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese

inicial do paciente

Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado

por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do

esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato

(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas

colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de

superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ

SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o

esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al

2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)

A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa

concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio

foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)

favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

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28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 9: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

RESUMO

Considerando que a Proantocianidina e outros componentes do Cranberry

possam inibir as metaloproteinases da dentina quando esta eacute exposta a accedilatildeo de

agentes erosivos e tal fato pode minimizar o desgaste dentinaacuterio o presente trabalho

tem como objetivo avaliar o efeito protetor in vitro de geacuteis agrave base de extrato de

Cranberry e Proantocianidina em diferentes concentraccedilotildees aplicados sobre a

dentina posteriormente submetida agrave erosatildeo Para tal 150 espeacutecimes de dentina

bovina (4 x 4 mm) foram confeccionados e igualmente divididos em 10 grupos G1-

gel de clorexidina a 0012 G2- gel placebo G3- gel a base de extrato de

Cranberry a 005 G4- gel a base de extrato de Cranberry a 1 G5- gel a base de

extrato de Cranberry a 5 G6- gel a base de extrato de Cranberry a 10 G7- gel a

base de Proantocianidina 005 G8- gel a base de Proantocianidina 1 G9- gel a

base de Proantocianidina 5 G10- gel a base de Proantocianidina 10 Os

diferentes geacuteis foram aplicados uma uacutenica vez sobre os espeacutecimes antes do primeiro

desafio erosivo durante 5 minutos Em seguida os espeacutecimes foram submetidos a 3

ciclagens erosivas seguidas (imersatildeo em bebida agrave base de Cola por 5 minutos

seguido de imersatildeo em saliva artificial por 3 horas) por dia durante 5 dias Apoacutes as

3 cilclagens erosivas diaacuterias os espeacutecimes foram mantidos em saliva artificial por 15

horas A perfilometria foi utilizada para quantificar o desgaste dentinaacuterio (microm) Os

dados foram analisados pelo teste ANOVA seguido do teste de Fisher (plt005) Os

resultados (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd G5

190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac G10

152 plusmn 25b) mostraram que o gel de Cranberry a 005 (G3) e gel de

Proantocianidina 10 (G10) apresentaram eficaacutecia estatisticamente significante na

reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria em comparaccedilatildeo aos outros grupos analisados

Palavras-chave Erosatildeo dentinaacuteria Cranberry Proantocianidina Desgaste dentaacuterio

ABSTRACT

In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion

Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might

inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental

wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and

Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive

challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by

different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel

(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-

005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10

Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-

5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied

over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the

blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and

artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles

the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to

quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test

(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd

G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac

G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin

gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)

and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other

evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry

and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in

vitro

Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 11

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28

3 PROPOSICcedilAtildeO 31

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41

45 PERFILOMETRIA INICIAL 43

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45

49 CICLAGEM EROSIVA 45

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48

5 RESULTADOS 49

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51

6 DISCUSSAtildeO 53

7 CONCLUSAtildeO 59

REFEREcircNCIAS 63

APEcircNDICE 73

1 Introduccedilatildeo

1 Introduccedilatildeo 13

1 INTRODUCcedilAtildeO

A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste

dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos

principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007

GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo

dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido

feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO

1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al

2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)

Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da

estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al

2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT

2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como

a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de

dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por

exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo

do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos

extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados

como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo

comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI

JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)

Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do

esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do

dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes

amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos

consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de

exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave

presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al

1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de

soluccedilatildeo profissional

1 Introduccedilatildeo 14

Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos

pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia

regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite

crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia

doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002

BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia

pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a

siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)

Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena

como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de

natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com

os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de

vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO

SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)

Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos

(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo

excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias

de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE

1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese

inicial do paciente

Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado

por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do

esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato

(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas

colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de

superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ

SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o

esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al

2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)

A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa

concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio

foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)

favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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Apecircndice 80

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16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

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24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

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28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 10: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

ABSTRACT

In vitro effect of Cranberry and proanthocyanidin on dentin erosion

Considering that Proanthocyanidin and other Cranberryrsquos components might

inhibit dentin metalloproteinases exposed to erosive agents and it can prevent dental

wear the aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and

Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive

challenge For this purpose 150 bovine root dentin blocks (4x4mm) were treated by

different gels and randomly divided into 10 groups G1- 0012 Chlorhexidine Gel

(positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3-

005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10

Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9-

5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied

over specimens once before the first erosive challenge for 5 minutes After that the

blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles (cola drink for 5 minutes and

artificial saliva for 3 hours each) per day during 5 days After 3 daily erosive cycles

the blocks were maintained in artificial saliva for 15 h Profilometry was used to

quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test

(plt005) Results (G1 156 plusmn 24b G2 231 plusmn 14e G3 151 plusmn 23b G4 204 plusmn 19cd

G5 190 plusmn 21ac G6 187 plusmn 14a G7 182 plusmn 16a G8 211 plusmn 12d G9 192 plusmn 26ac

G10 152 plusmn 25b) showed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin

gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1)

and these three groups showed statistically lowest wear when compared to all other

evaluated groups The results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry

and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in

vitro

Keywords Dentin erosion Cranberry Proanthocyanidin Matrix metalloproteinases

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 11

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28

3 PROPOSICcedilAtildeO 31

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41

45 PERFILOMETRIA INICIAL 43

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45

49 CICLAGEM EROSIVA 45

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48

5 RESULTADOS 49

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51

6 DISCUSSAtildeO 53

7 CONCLUSAtildeO 59

REFEREcircNCIAS 63

APEcircNDICE 73

1 Introduccedilatildeo

1 Introduccedilatildeo 13

1 INTRODUCcedilAtildeO

A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste

dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos

principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007

GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo

dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido

feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO

1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al

2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)

Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da

estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al

2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT

2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como

a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de

dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por

exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo

do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos

extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados

como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo

comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI

JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)

Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do

esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do

dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes

amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos

consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de

exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave

presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al

1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de

soluccedilatildeo profissional

1 Introduccedilatildeo 14

Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos

pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia

regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite

crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia

doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002

BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia

pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a

siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)

Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena

como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de

natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com

os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de

vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO

SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)

Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos

(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo

excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias

de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE

1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese

inicial do paciente

Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado

por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do

esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato

(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas

colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de

superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ

SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o

esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al

2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)

A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa

concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio

foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)

favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 11: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 11

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES 21

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY 28

3 PROPOSICcedilAtildeO 31

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 35

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 37

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 39

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA 40

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA 41

45 PERFILOMETRIA INICIAL 43

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 44

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES 45

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS 45

49 CICLAGEM EROSIVA 45

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA 47

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS 47

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 48

5 RESULTADOS 49

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE 51

6 DISCUSSAtildeO 53

7 CONCLUSAtildeO 59

REFEREcircNCIAS 63

APEcircNDICE 73

1 Introduccedilatildeo

1 Introduccedilatildeo 13

1 INTRODUCcedilAtildeO

A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste

dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos

principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007

GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo

dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido

feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO

1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al

2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)

Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da

estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al

2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT

2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como

a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de

dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por

exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo

do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos

extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados

como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo

comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI

JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)

Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do

esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do

dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes

amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos

consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de

exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave

presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al

1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de

soluccedilatildeo profissional

1 Introduccedilatildeo 14

Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos

pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia

regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite

crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia

doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002

BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia

pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a

siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)

Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena

como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de

natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com

os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de

vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO

SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)

Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos

(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo

excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias

de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE

1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese

inicial do paciente

Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado

por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do

esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato

(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas

colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de

superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ

SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o

esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al

2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)

A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa

concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio

foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)

favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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Apecircndice 80

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 12: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

1 Introduccedilatildeo

1 Introduccedilatildeo 13

1 INTRODUCcedilAtildeO

A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste

dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos

principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007

GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo

dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido

feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO

1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al

2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)

Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da

estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al

2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT

2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como

a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de

dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por

exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo

do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos

extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados

como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo

comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI

JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)

Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do

esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do

dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes

amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos

consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de

exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave

presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al

1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de

soluccedilatildeo profissional

1 Introduccedilatildeo 14

Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos

pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia

regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite

crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia

doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002

BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia

pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a

siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)

Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena

como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de

natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com

os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de

vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO

SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)

Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos

(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo

excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias

de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE

1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese

inicial do paciente

Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado

por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do

esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato

(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas

colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de

superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ

SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o

esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al

2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)

A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa

concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio

foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)

favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

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9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

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19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 13: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

1 Introduccedilatildeo 13

1 INTRODUCcedilAtildeO

A observaccedilatildeo do aumento da prevalecircncia de pacientes com desgaste

dentaacuterio ao redor do mundo tem chamado a atenccedilatildeo de pesquisadores e cliacutenicos

principalmente ao longo das uacuteltimas deacutecadas (GANSS 2006 RIOS et al 2007

GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) devido agrave estreita relaccedilatildeo dessa alteraccedilatildeo

dentaacuteria com a qualidade de vida dos pacientes Nesse contexto pesquisas tecircm sido

feitas objetivando trazer soluccedilotildees preventivas e curativas a essa patologia (ZERO

1996 RIOS et al 2007 HONOacuteRIO et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al

2010a KATO et al 2010a 2010b 2012 2014)

Por definiccedilatildeo o desgaste dentaacuterio eacute a perda micro e macroscoacutepica da

estrutura dental (ECCLES 1979 ZERO 1996 BARTLETT 2006 HONOacuteRIO et al

2008) Pode ser dividido em trecircs categorias erosatildeo atriccedilatildeo e abrasatildeo (BARTLETT

2006 GANSS 2006) Essa divisatildeo eacute aceita mundialmente A atriccedilatildeo eacute definida como

a perda superficial por conta de contatos dentaacuterios por exemplo no ranger de

dentes Jaacute a abrasatildeo eacute a perda superficial originada por forccedilas mecacircnicas por

exemplo a escovaccedilatildeo dentaacuteria com forccedila excessiva (IMFELD 1996) A erosatildeo alvo

do presente estudo eacute a perda de estrutura dental causada por fatores quiacutemicos

extriacutensecos eou intriacutensecos geralmente associados a fatores inter-relacionados

como composiccedilatildeo salivar frequecircncia de consumo de produto aacutecido e pH do mesmo

comportamento do indiviacuteduo entre outros (IMFELD 1996 ZERO 1996 LUSSI

JAEGGI ZERO 2004 KATO et al 2009)

Clinicamente a erosatildeo dental se manifesta com a diminuiccedilatildeo do brilho do

esmalte e alteraccedilatildeo anatocircmica (ALMEIDA e SILVA et al 2007) A coloraccedilatildeo do

dente tambeacutem sofre alteraccedilatildeo devido agrave perda do esmalte resultando em dentes

amarelados e perda de esteacutetica causa primaacuteria de queixa cliacutenica do paciente nos

consultoacuterios Casos severos de erosatildeo dentaacuteria podem estar acompanhados de

exposiccedilatildeo dentinaacuteria e essa condiccedilatildeo cliacutenica normalmente estaacute associada agrave

presenccedila de dor e hipersensibilidade (OrsquoSULLIVAN et al 1998 RYTOMAA et al

1998 RIOS et al 2007) outros motivos os quais motivam o paciente em busca de

soluccedilatildeo profissional

1 Introduccedilatildeo 14

Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos

pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia

regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite

crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia

doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002

BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia

pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a

siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)

Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena

como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de

natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com

os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de

vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO

SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)

Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos

(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo

excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias

de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE

1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese

inicial do paciente

Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado

por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do

esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato

(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas

colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de

superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ

SILVERSTONE 1985) Qualquer substacircncia aacutecida com pH inferior ao criacutetico para o

esmalte ou dentina pode dissolver os cristais de hidroxiapatita (BARRON et al

2003 GRIPPO SIMRING SCHREINER 2004)

A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa

concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio

foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)

favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 14: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

1 Introduccedilatildeo 14

Na erosatildeo os fatores intriacutensecos estatildeo associados aos aacutecidos produzidos

pelo proacuteprio organismo por exemplo em vocircmitos relacionados agrave bulimia e anorexia

regurgitaccedilatildeo frequente do suco gaacutestrico regurgitaccedilatildeo subcliacutenica devido agrave gastrite

crocircnica associada ao alcoolismo vocircmito crocircnico durante a gestaccedilatildeo xerostomia

doenccedila do refluxo gastroesofaacutegico (GANDARA TRUELOVE 1999 ALI et al 2002

BARRON et al 2003 BARBOSA et al 2009 PREETHA et al 2015) A xerostomia

pode ser provocada por patologias sistecircmicas tais como a diabetes mellitus e a

siacutendrome de Sjoumlgren (GANDARA TRUELOVE 1999)

Jaacute os fatores extriacutensecos se relacionam aos aacutecidos de origem exoacutegena

como haacutebitos dieteacuteticos relacionados a bebidas e alimentos aacutecidos Medicaccedilotildees de

natureza aacutecida tambeacutem podem provocar erosatildeo se estiverem em contato direto com

os dentes no momento da ingestatildeo como acontece por exemplo com pastilhas de

vitamina C (GANDARA TRUELOVE 1999) aspirina anfetaminas (GRIPPO

SIMRING SCHREINER 2004) e ecstasycocaiacutena (KAPILA KASHANI 1997)

Outros fatores extriacutensecos incluem a exposiccedilatildeo ambiental a agentes aacutecidos

(ZERO 1996 LUSSI JAEGGI ZERO 2004) como por exemplo a exposiccedilatildeo

excessiva a gases aacutecidos presentes em ambientes industriais tais quais induacutestrias

de baterias e aerossoacuteis aleacutem de trabalho em mineradoras (GANDARA TRUELOVE

1999) Todos os fatores devem ser avaliados e considerados durante a anamnese

inicial do paciente

Estruturalmente o componente mineral (inorgacircnico) da dentina eacute formado

por cristais de hidroxiapatita substituiacuteveis Poreacutem comparativamente aos cristais do

esmalte satildeo pobres em caacutelcio fosfato e soacutedio e ricos em magneacutesio e carbonato

(HICKS FLAITZ SILVERSTONE 1985) Encontrados sobre e entre as fibrilas

colaacutegenas os cristais da dentina satildeo menores permitindo uma maior aacuterea de

superfiacutecie que eacute mais susceptiacutevel ao ataque aacutecido (HICKS FLAITZ

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A dieta favoraacutevel agrave erosatildeo dentaacuteria inclui alimentos e bebidas com baixa

concentraccedilatildeo de iacuteons caacutelcio e fosfato Isso causa um desequiliacutebrio entre iacuteons caacutelcio

foacutesforo e fluacuteor em relaccedilatildeo agrave hidroxiapatita e fluorapatita (BARBOSA et al 2009)

favorecendo a dissoluccedilatildeo dos prismas de esmalte superficiais sem a formaccedilatildeo de

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6

3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114

4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8

5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 15: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

1 Introduccedilatildeo 15

uma nova superfiacutecie de fluoridroxiapatita como ocorre no mecanismo de

remineralizaccedilatildeo na caacuterie dentaacuteria (IMFELD 1996 HONOacuteRIO et al 2010a 2010b)

A composiccedilatildeo salivar possui papel determinante na instalaccedilatildeo e progressatildeo

da erosatildeo pois dentre outras funccedilotildees regula o equiliacutebrio do pH do meio para que

ocorra troca de iacuteons caacutelcio e fosfato (GANSS LUSSI SCHLUETER 2014) A erosatildeo

ocorre mesmo sem a presenccedila de bacteacuterias cariogecircnicas Entretanto eacute fundamental

a presenccedila regular de substacircncias aacutecidas em pH inferior agravequele em que o fluacuteor

consegue ativar o processo de remineralizaccedilatildeo (GANDARA TRUELOVE 1999

KATO et al 2010b GANSS LUSSI SCHLUETER 2014)

Ao contraacuterio do esmalte cuja matriz orgacircnica perfaz aproximadamente 05

a dentina conteacutem cerca de 20 de material orgacircnico e 12 de aacutegua

proporcionando um substrato melhor para a degradaccedilatildeo de bacteacuterias e proteinases

hospedeiras (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Esse material orgacircnico da dentina

(matriz orgacircnica) eacute composto 90 de fibrilas colaacutegenas (tipo I) e os 10 restantes

satildeo fosfoproteiacutenas da dentina proteoglicanas e glicosaminoglicanas (HICKS

FLAITZ SILVERSTONE 1985 PASHLEY et al 2004)

Dentre outros componentes como fatores de crescimento e proteiacutenas o

tecido dentinaacuterio orgacircnico tambeacutem conteacutem enzimas conhecidas como

metaloproteinases da matriz (MMPs) (KATO et al 2012) Na dentina foi verificado

que ocorrem principalmente os subtipos 2 8 e 9 das MMPs (KATO et al 2012

2014) A MMP-8 pode ser considerada a colagenase humana mais importante na

dentina e as MMP-2 e MMP-9 tecircm a funccedilatildeo de degradar o colaacutegeno em lesotildees de

caacuterie dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Quando haacute queda do pH por exemplo

durante o metabolismo bacteriano (caacuterie) ou ingestatildeo de bebidas aacutecidas as MMPs

tornam-se ativas Aleacutem disso jaacute se constatou que indiviacuteduos com alta concentraccedilatildeo

de MMPs salivares tecircm maior incidecircncia de caacuterie (TJAumlDERHANE et al 1998) A

degradaccedilatildeo quiacutemica da matriz dentinaacuteria ocorre especialmente pelas MMPs

presentes na dentina e saliva as quais podem ser ativadas em pH abaixo de 45

(SCHLUETER et al 2010 SHELLIS FEATHERSTONE LUSSI 2014 VIDAL et al

2014)

Componentes celulares as macromoleacuteculas da matriz extracelular (ECM)

satildeo importantes para o equiliacutebrio celular adequado na remodelaccedilatildeo

desenvolvimento e morfogecircnese teciduais ao longo da vida Essa remodelaccedilatildeo da

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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Apecircndice 80

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 16: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

1 Introduccedilatildeo 16

ECM pelas MMPs geralmente ocorre em um pH neutro As ceacutelulas do tecido

conjuntivo (ex fibroblastos osteoblastos e odontoblastos) sintetizam e secretam

MMPs na ECM Em condiccedilotildees normais as MMPs satildeo expressas apenas quando

necessaacuterias agrave remodelaccedilatildeo Poreacutem em patologias com significativa destruiccedilatildeo

tecidual como artrite reumatoide periodontite cacircncer e fibrose haacute uma expressatildeo

acentuada das MMPs (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Quimicamente a matriz

orgacircnica da dentina pode ser degradada por MMPs as quais mediam a quebra de

praticamente todas as moleacuteculas da ECM incluindo colaacutegeno nativo e desnaturado

(KATO et al 2010a 2010b)

Ainda natildeo haacute muitos estudos investigando o papel das MMPs na erosatildeo

dentaacuteria Supotildee-se que devam ocorrer mecanismos semelhantes aos que ocorrem

na caacuterie dentaacuteria (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006) Neste sentido a manutenccedilatildeo

da matriz orgacircnica de colaacutegeno da dentina erodida pode diminuir a intensidade de

progressatildeo de futuros desgastes erosivos e tal fato pode ser obtido por meio do uso

de inibidores das MMPs (CARRILHO et al 2007 KATO et al 2010a 2012) Sabe-

se que a taxa de desmineralizaccedilatildeo da dentina erosiva diminui ao passo que

aumenta a quantidade de colaacutegeno degradaacutevel pois a camada de matriz

desmineralizada serve como uma barreira contra a difusatildeo aacutecida reduzindo a

progressatildeo da erosatildeo (HARA et al 2005)

A respeito das MMPs a clorexidina tem sido amplamente testada e eacute

sugerida como uma ferramenta uacutetil na prevenccedilatildeo da degradaccedilatildeo de fibrilas de

colaacutegeno infiltradas por MMPs nas camadas hiacutebridas Poreacutem seus efeitos colaterais

tais como manchamento dos dentes perda de paladar entre outros natildeo permitem

sua utilizaccedilatildeo por um longo periacuteodo de tempo Dessa forma os pesquisadores

buscam uma alternativa a esse produto Os polifenois do chaacute verde especialmente

epigalocatequina-3-galato tambeacutem foram testados na promoccedilatildeo da atividade

inibitoacuteria contra MMPs distintas (CHAUSSAIN-MILLER et al 2006 CARRILHO et

al 2007 KATO et al 2009 2010a 2010b) O sulfato ferroso tambeacutem teve efeito

preventivo como inibidor de protease contra a erosatildeo dentinaacuteria (KATO et al

2010b)

Outros estudos demonstram a interaccedilatildeo das MMPs com os tecidos

dentinaacuterios Koli Saxena e Ogbureke (2015) publicaram um artigo no qual afirmam

que a MMP-20 eacute amplamente conhecida como especiacutefica do tecido dentaacuterio com a

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

Referecircncias 65

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 17: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

1 Introduccedilatildeo 17

expressatildeo limitada a tecidos duros Ela tambeacutem eacute necessaacuteria para a formaccedilatildeo do

esmalte Aleacutem disso a MMP 20 e MMP 2 processam a sialofosfoproteiacutena (DSPP) da

dentina em sialoproteiacutena da dentina fosfoproteiacutena da dentina e glicoproteiacutena da

dentina durante a formaccedilatildeo do dente

Pesquisas nas diversas aacutereas da medicina indicam benefiacutecios relacionados

aos polifenois do suco de Cranberry (Vacciniummacrocarpon) ou extratos da fruta

inclusive como inibidor das MMPs (DEacuteZIEL et al 2010 KONDO et al 2011)

As Cranberries Blueberries (mirtilos) maracujaacute ginko uvas chaacute verde chaacute

preto entre outras plantas possuem moleacuteculas de flavonoides Flavonoides (ou

bioflavonoides) eacute a designaccedilatildeo dada a um grupo de metaboacutelitos secundaacuterios da

classe dos polifenois moleacuteculas encontradas em certas espeacutecies vegetais

(HARBORNE MABRY MABRY 1975)

Dentre os flavonoides destacam-se as Proantocianidinas (PACs) (TEEL

1992) As PACs tecircm demonstrado serem inibidoras do estresse oxidativo celular e

carcinogecircnese quimicamente induzida (HOCMAN 1989) Aleacutem da varredura de

radicais livres e atividade antioxidante as PACs exibem atividades vasodilatadoras

anticarcinogecircnicas antialeacutergicas anti-inflamatoacuterias antibacterianas cardioprotetivas

imunoestimulantes antivirais e estrogecircnicas bem como inibidoras da enzima

fosfolipase A cicloxigenase e lipoxigenase (SALAH et al 1995 RICE-EVANS

MILLER 1996 EYDELNANT TUFENKJI 2008 CASTELLAN et al 2010 DEacuteZIEL

et al 2010 LOMBARDO BEDRAN PALOMARI SPOLIDORIO GRENIER 2015)

Gupta Bansal e Marwaha (2015) publicaram um estudo relacionado ao

Cranberry e seus efeitos na cavidade oral Nele constatou-se que o extrato desta

fruta foi altamente eficaz na reduccedilatildeo de S mutans bacteacuterias causadoras de caacuteries

atraveacutes de enxagues frequentes em crianccedilas

Especificamente as PACs do tipo A isoladas de Cranberries tecircm sido

implicadas nas propriedades anti-adererentes do suco de Cranberry (HOWELL et al

2005) Os efeitos das PACs do Cranberry natildeo satildeo especiacuteficos do substrato pois

agem tanto em tecidos bioloacutegicos (GUPTA et al 2007) quanto em materiais natildeo

bioloacutegicos como por exemplo em PVC (EYDELNANT TUFENKJI 2008)

Acredita-se que as PACs constituintes do extrato de Cranberry sejam a peccedila

chave no mecanismo inibitoacuterio das MMPs

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 18: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

1 Introduccedilatildeo 18

Diante do exposto este estudo in vitro visou testar um possiacutevel efeito

inibitoacuterio das MMPs dentinaacuterias Para tal geacuteis de diferentes concentraccedilotildees agrave base

de extrato de Cranberry e Proantocianidina foram aplicados sobre a dentina

previamente agrave accedilatildeo de um agente erosivo aacutecido e o efeito inibitoacuterio avaliado

considerando como principal variaacutevel de resposta o desgaste

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 19: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

2 Revisatildeo de Literatura

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

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20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 20: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

2 Revisatildeo de Literatura 21

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

O presente capiacutetulo teraacute uma divisatildeo em toacutepicos relacionados Nele

diversos artigos publicados foram resumidos de maneira a permitir uma anaacutelise

panoracircmica do cenaacuterio atual destes toacutepicos frente agrave literatura cientiacutefica mundial

21 EROSAtildeO DENTINA MMPs E SEUS INIBIDORES

No presente ano Comar et al (2015) avaliaram o efeito de vernizes

fluoretados na progressatildeo da erosatildeo dentaacuteria in vitro Comparam-se amostras com

um verniz placebo sem verniz com verniz tratado com fluoreto de titacircnio (TIF4) e

com fluoreto de soacutedio (NaF) separadamente As amostras foram submetidas a

desafio erosivo e por fim calculou-se a quantidade de desgaste das amostras No

caso da dentina a mediccedilatildeo final foi realizada com ou sem a presenccedila de matriz

orgacircnica desmineralizada Os resultados evidenciaram que vernizes de TIF4 e NaF

reduziram o desgaste de esmalte de forma significativa As mesmas diferenccedilas

foram encontradas para a dentina tanto na presenccedila como na ausecircncia de matriz

orgacircnica Os autores concluem que ambos vernizes de TIF4 e NaF foram igualmente

eficientes na reduccedilatildeo da progressatildeo da erosatildeo in vitro

O papel das metaloproteinases da matriz (MMPs) na erosatildeo dentaacuteria e os

efeitos protetores de inibidores de MMPs foram revisados por Buzalaf Kato e

Hannas (2012) Sabe-se que as MMPs estatildeo presentes tanto na saliva quanto na

dentina Elas tecircm papel fundamental na progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria A remoccedilatildeo

enzimaacutetica da matriz orgacircnica pelas MMPs aumenta o processo de

desmineralizaccedilatildeo uma vez que a matriz orgacircnica desmineralizada se aparenta

impedir a difusatildeo aciacutedica apoacutes um desafio erosivo Estudos recentes in vitro e in situ

apresentaram prospectos positivos no papel de inibidores de MMPs contra a erosatildeo

Os inibidores testados foram chaacute verde galato-epigalocatequina (EGCC) sulfato

ferroso e clorexidina Esta uacuteltima destacou-se no papel protetivo Inclusive observou-

se que a proteccedilatildeo foi duradoura e pocircde ser contiacutenua por ateacute 10 dias apoacutes severos

desafios erosivos in situ Esses achados satildeo relevantes na busca de soluccedilotildees

terapecircuticas para a prevenccedilatildeo e contra a progressatildeo da erosatildeo dentinaacuteria

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6

3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114

4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8

5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

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8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 21: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

2 Revisatildeo de Literatura 22

Outra pesquisa investigou se a reduccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica

desmineralizada (DOM) pelo tratamento com inibidores de proteases (PI) eacute efetiva

contra a perda da matriz dentinaacuteria Para isso dentina bovina foi desmineralizada e

tratada com aacutecido ciacutetrico (pH 23) por 36 horas Na sequecircncia os espeacutecimes foram

tartados com geacuteis contendo galato-3-epigalocatequina (EGCG) clorexidina (CHX ndash

0012) FeSO4 (1mM) NaF (123) ou placebo (sem princiacutepio ativo) Na sequecircncia

os espeacutecimes foram armazenados em saliva artificial por 5 dias com adiccedilatildeo de

colagenase (Clostridium histolyticum 100 UmL) A degradaccedilatildeo do colaacutegeno foi

analisada pela concentraccedilatildeo de hidroxiprolina (HYP) nas soluccedilotildees incubadas e a

perda da matriz dentinaacuteria foi avaliada por perfilometria O tratamento com geacuteis

contendo EGCG CHX e FeSO4 levaram agrave diminuiccedilatildeo significativa de concentraccedilotildees

de HYP na soluccedilatildeo e perda de matriz dentinaacuteria quando comparados a outros

tratamentos Estes resultados sugerem fortemente que os efeitos preventivos das

proteases testadas contra erosatildeo dentinaacuteria satildeo decorrentes de sua habilidade em

reduzir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (KATO et al 2012)

Tao et al (2015) analisaram o status quo da erosatildeo dental em crianccedilas de 3

a 6 anos de idade da proviacutencia de Shangai na China Foram aplicados questionaacuterio

e exame cliacutenico nessa pesquisa a qual demonstrou que de um total de 1837

crianccedilas escolhidas aleatoriamente a erosatildeo estava presente em 151 delas A

maior prevalecircncia de 17 foi encontrada no grupo de 4 anos e a menor de 12

no grupo de 3 anos de idade Eles natildeo encontraram diferenccedilas estatisticamente

significantes entre os grupos analisados Poreacutem foi constatado que a ocorrecircncia de

erosatildeo dental foi influenciada por haacutebitos de consumo de vinagre cafeacute e chaacute aleacutem

do local de nascimento da crianccedila o niacutevel educacional da matildee e regurgitaccedilatildeo

(plt005) Eles sugerem o estabelecimento de um padratildeo unificado de diagnoacutestico

para futuras investigaccedilotildees epidemioloacutegicas

Preetha et al (2015) encontraram uma relaccedilatildeo positiva entre doenccedila de

refluxo gastroesofaacutegico e erosatildeo dental De 100 pacientes analisados 11

apresentavam dentes erodidos Notou-se uma relaccedilatildeo inversa entre o pH salivar e a

duraccedilatildeo da doenccedila bem como seu grau de severidade Pacientes com erosatildeo

tambeacutem apresentaram alteraccedilotildees nas mucosas orais Concluiu-se que quanto mais

severa e de maior duraccedilatildeo a doenccedila de refluxo mais potenciais satildeo os danos aos

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 22: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

2 Revisatildeo de Literatura 23

tecidos moles estruturas dentais e pH salivar enquanto a forma mais branda da

doenccedila natildeo necessariamente causa esses efeitos colaterais

Lussi e Carvalho (2015) publicaram um artigo enfatizando a necessidade de

diferentes linhas de tratamento com fluoretos da doenccedila caacuterie versus erosatildeo Elas

alegam que os requerimentos na prevenccedilatildeo de caacuterie e erosatildeo satildeo diferentes pois

natildeo haacute aacuterea coberta no processo erosivo como haacute em lesotildees cariosas

subsuperficiais Desta forma o mecanismo protetor do fluoreto no processo erosivo

eacute limitado agrave superfiacutecie ou perto da camada superficial do esmalte Elas sugerem que

outras substacircncias possam aumentar a precipitaccedilatildeo de fosfatos de caacutelcio na

superfiacutecie do esmalte protegendo-a de impactos adicionais aacutecidos Aleacutem disso

sugerem que a combinaccedilatildeo de fluoretos com agentes protetores como metais

polivalentes ou poliacutemeros tem prospectos ainda mais positivos

Barbosa Kato e Buzalaf (2011) estudaram o efeito da suplementaccedilatildeo de

refrigerantes com extrato de chaacute verde no potencial erosivo destes contra a dentina

Para tal foram testados alguns refrigerantes brasileiros Coca-Cola Kuat Guaranaacute

Sprite e Coca-Cola light Para cada bebida testada os grupos foram divididos em

dois metade com suplementaccedilatildeo de extrato de chaacute verde e a outra metade sem

(controle) Na sequecircncia os espeacutecimes foram submetidos a ciclos de pH alternando

estados de des-remineralizaccedilatildeo em um dia Para cada ciclo amostras foram imersas

em bebida pura ou suplementada com o extrato e depois em saliva artificial Para

anaacutelise das superfiacutecies utilizou-se perfilometria Os resultados demonstraram que

Sprite levou agrave maior perda superficial de dentina enquanto a Coca-Cola light agrave

menor A suplementaccedilatildeo com extrato de chaacute verde reduziu a perda superficial entre

15 a 40 mas a diferenccedila foi significante apenas para o refrigerante Coca-Cola

Hemingway et al (2006) investigaram como a perda de esmalte dental

devido a erosatildeo e ao ciclo de erosatildeoabrasatildeo depende da composiccedilatildeo de refrescos

e particularmente se a espessura da camada erosiva amolecida eacute uma funccedilatildeo da

composiccedilatildeo da bebida Para tal eles escolheram seis entre as mais populares

bebidas do Reino Unido suco de maccedilatilde suco de laranja refresco agrave base de maccedilatilde

refresco agrave base de laranja refresco agrave base de Cranberry e refresco agrave base de

groselha denominado toothkind ou ldquonatildeo prejudicial aos dentesrdquo Amostras do grupo

A (n=36) foram expostas agraves bebidas a 36degC por seis periacuteodos consecutivos de 10

minutos Amostras do grupo B (n=36) foram submetidas alternadamente agrave erosatildeo e

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

Referecircncias 65

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 23: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

2 Revisatildeo de Literatura 24

escovaccedilatildeo por seis vezes A perda de esmalte foi medida usando perfilometria

oacuteptica Os resultados indicam que houve perda significante de esmalte para todas as

bebidas testadas A erosatildeo estava correlacionada ao pH e concentraccedilatildeo de caacutelcio

do meio Para o grupo B houve perda adicional de tecido devido agrave escovaccedilatildeo para

todas as bebidas Desta forma foi demonstrado que houve maior perda de esmalte

quando houve erosatildeo e subsequente abrasatildeo sendo que a composiccedilatildeo do meio

erosivo foi determinante da quantidade de tecido amolecido removido pela

escovaccedilatildeo

Moezizadeh e Alimi (2014) publicaram um estudo em que compararam o

efeito de enxaguatoacuterio com fluoreto de soacutedio 02 e pasta de fosfato de caacutelcio

adicionada de fosfopeptiacutedio de caseiacutena amorfo (CPP-ACP) na prevenccedilatildeo de erosatildeo

dentinaacuteria Para tal superfiacutecies de preacute-molares hiacutegidos foram polidas e preacute-tratadas

com mousse dental (contendo CPP-ACP ndash grupo A) enxaguante bucal de fluoreto

de soacutedio a 02 (grupo B) sem tratamento (controle - grupo C) As amostras foram

expostas a Coca-Cola por 4 vezes ao dia por trecircs dias armazenadas em saliva

artificial e avaliadas por perfilometria Os resultados mostraram que a erosatildeo nos

grupos A e B foi menor do que no grupo controle sendo que o grupo submetido agrave

preacute-tratamento com enxaguatoacuterio contendo fluoreto de soacutedio foi o mais efetivo na

prevenccedilatildeo da erosatildeo

No mesmo ano Darda et al (2014) publicaram um estudo no qual avaliaram

os efeitos do EDTA a 17 na remoccedilatildeo da smear layer a na erosatildeo da estrutura

dentinaacuteria apoacutes irrigaccedilatildeo de 1 ou 10 minutos Foram utilizados molares mandibulares

humanos e os testes foram realizados nos canais mesiobucais dos mesmos Apoacutes

instrumentaccedilatildeo os canais forma submetidos agrave avaliaccedilatildeo por microscopia eletrocircnica

(SEM) depois agrave irrigaccedilatildeo e novamente agrave SEM Os autores concluem que um tempo

superior a 1 minuto natildeo deve ser utilizado nos tratamentos endodocircnticos e que a

aplicaccedilatildeo de 10 minutos de EDTA causou excessiva erosatildeo dentinaacuteria peri e

intertubular

Zandim-Barcelos et al (2015) avaliaram se a aplicaccedilatildeo de um gel com alta

concentraccedilatildeo de fluoretos poderia aumentar a remineralizaccedilatildeo de espeacutecimes com

lesotildees dentinaacuterias subsuperficiais armazenadas em substitutos salivares Para tal

utilizaram-se espeacutecimes de dentina bovina desmineralizada as quais foram

armazenadas em aacutegua mineral (W) Glandosane (G ndash saliva artificial) ou saliva em

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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Apecircndice 80

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 24: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

2 Revisatildeo de Literatura 25

natura modificada (SN) Diferentes tratamentos foram realizados duas vezes ao dia

sem tratamento enxaguatoacuterio Elmex Sensitive (E) gel ProSchmelz (Germany - P)

dentifriacutecio Duraphat (D) e combinaccedilotildees de ED PD e EPD As diferenccedilas na perda

mineral foram avaliadas atraveacutes de microradiografia transversal apoacutes 2 e 5 semanas

Os resultados indicaram que a aplicaccedilatildeo toacutepica de geacuteis com elevadas concentraccedilotildees

de fluoreto reduziu a perda mineral induzida por G mas resultou em erosatildeo nas

superfiacutecies dos espeacutecimes O produto ProSchmelz natildeo demonstrou efeitos beneacuteficos

em combinaccedilatildeo com SN na remineralizaccedilatildeo das lesotildees de dentina subsuperficiais

Dentro das limitaccedilotildees do estudo in vitro concluiu-se que a utilizaccedilatildeo de geacuteis com

alta concentraccedilatildeo de fluoreto natildeo promoveu efeitos adicionais na remineralizaccedilatildeo

subsuperficial de lesotildees de dentina quando combinados com substitutos salivares ao

serem comparados a produtos com baixa concentraccedilatildeo de fluoreto

Um estudo de Ozcan et al (2015) testou se o tratamento da dentina

desmineralizada com aacutecido poliacriacutelico (PAA) teria algum efeito ativador ou inibidor

nas metaloproteinases da matriz de dentina (MMPs) ou catepsina K (CAT-K) Para

tal amostras de dentina foram completamente desmineralizadas com EDTA e

depois mergulhadas em diferentes soluccedilotildees a serem testadas aacutecido fosfoacuterico 37

(PA) PA + 2 de cloreto de benzalcocircnio (BAC) PA + 2 de gluconato de

clorexidina (CHX) 10 PAA PAA+BAC ou PAA+CHX por 20 segundos O controle

utilizado foram amostras sem tratamento Todas as amostras foram incubadas em

fluido corpoacutereo simulado (SBF) por uma semana e a perda de massa seca foi

avaliada Chegou-se agrave conclusatildeo de que a dentina desmineralizada tratada com

PAA a 10 ativou a CAT-K mais do que o PA a 37 a CHX parece ser uma melhor

inibidora de MMPs e CAT-K do que o BAC a 2

Francisconi-dos-Rios et al (2015) avaliaram o efeito de soluccedilotildees de

clorexidina (CHX) na forccedila de uniatildeo da resina composta agrave dentina erodida por 6

meses usando dentina normal como controle Dentinas erodidas de terceiros

molares extraiacutedos foram submetidas agrave erosatildeo por refrigerante agrave base de cola

Depois de tratados aplicou-se Adper Single Bond 2 nos espeacutecimes e construiu-se

blocos de resina Filtek Z350 sobre os corpos de prova Os espeacutecimes foram

seccionados e testados imediatamente ou apoacutes 6 meses A forccedila de uniatildeo dos

espeacutecimes erodidos sempre foi significativamente menor do que os de dentina natildeo

erodidos A aplicaccedilatildeo de soluccedilotildees de clorexidina natildeo teve efeito imediato mas apoacutes

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

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19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 25: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

2 Revisatildeo de Literatura 26

os 6 meses a CHX a 2 preveniu a ruptura abrupta da uniatildeo dentinamaterial a

ambas dentinas erodida ou natildeo

Ganss Klimek e Schlueter (2014) investigaram o potencial experimental

preventivo de erosatildeoabrasatildeo de dentifriacutecios de fluoreto de soacutedio (NaF) e fluoreto de

amida (AmF)NaFSnCl2quitosano em comparaccedilatildeo a placebo e gel de SnF2 e o

impacto da matriz desmineralizada nos efeitos do dentifriacutecio A fim de se produzir

uma ordem comparaacutevel de perda tecidual erosatildeo foi realizada com aacutecido ciacutetrico sob

um protocolo especiacutefico A intervenccedilatildeo foi realizada por imersatildeo das amostras em

dentifriacutecios Metade das amostras adicionalmente foi escovada por 15 s Utilizou-se

perfilometria para calcular a perda tecidual Em relaccedilatildeo ao placebo os autores

concluem que o NaF natildeo teve efeitos significativos a formulaccedilatildeo de

AmFNaFSnCl2quitosano significativamente reduziu a perda dentinaacuteria entre 20 a

25 exceto quando aplicado sem escovaccedilatildeo na presenccedila de matriz orgacircnica Os

autores concluem que os efeitos das formulaccedilotildees foram similares tanto na presenccedila

quanto na ausecircncia de matriz orgacircnica Aleacutem disso formulaccedilotildees contendo

Sn(2+)F(-) tecircm potencial de reduccedilatildeo da erosatildeo e abrasatildeo mesmo na ausecircncia de

colaacutegeno desmineralizado

A capacidade do fluoreto (F) de prevenir a caacuterie dentaacuteria eacute bem conhecida

mas sua capacidade de inibir metaloproteinases da matriz (MMPs) as quais tambeacutem

ajudariam a prevenir caacuterie dentinaacuteria ainda natildeo havia sido investigada Entatildeo Kato

et al (2014) propuseram um estudo o qual verificou a capacidade do fluacuteor de inibir

as gelatinases humanas salivares purificadas MMPs-2 e -9 Para tal coletou-se

saliva de dez indiviacuteduos saudaacuteveis A saliva foi centrifugada e os sobrenadantes

foram levados para zimografia Entatildeo fluoreto de soacutedio (50-275 ppm F) foi

adicionado na incubaccedilatildeo A reversibilidade da inibiccedilatildeo das metaloproteinases foi

testada pela adiccedilatildeo de ainda mais F Os resultados indicaram que o F diminuiu as

atividades de MMPs salivares em efeito dose-resposta As gelatinases purificadas

foram completamente inibidas por 200 ppm F e a MMP-9 salivar por 275 ppm de F

A inibiccedilatildeo foi parcialmente irreversiacutevel de 250 a 1500 ppm de F mas irreversiacutevel a

5000 ppm Este foi o primeiro trabalho a investigar a capacidade do NaF em inibir

completamente as MMPs

Ghisi et al (2015) avaliaram os efeitos do Sterilox uma aacutegua superoxidada

hipoclorito de soacutedio a 2 e 5 e EDTA a 17 sobre os componentes orgacircnicos e

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

Referecircncias 65

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 26: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

2 Revisatildeo de Literatura 27

inorgacircnicos da dentina A soluccedilatildeo quiacutemica de hipoclorito de soacutedio a 5 teve um

maior efeito no componente orgacircnico da dentina em aacuterea e profundidade do que a

mesma substacircncia a 2 As soluccedilotildees quiacutemicas de Hipoclorito a 5 + EDTA e de

ambos hipocloritos + EDTA causaram a maior alteraccedilatildeo na matriz orgacircnica

colagenosa A desmineralizaccedilatildeo foi observada em todos os grupos nos quais o

EDTA foi usado sendo que aacutereas de erosatildeo e tuacutebulos dentinaacuterios abertos foram

detectados apenas quando as soluccedilotildees foram combinadas com hipoclorito de soacutedio

Charone et al (2014) estudaram o efeito de biguanidas (polihexametileno

biguanida ndash PHMB) e clorexidina (CHX) na erosatildeo dentinaacuteria devido agrave possiacutevel

influecircncia na degradaccedilatildeo enzimaacutetica da matriz orgacircnica desmineralizada Para tal

foram preparados espeacutecimes de dentina bovina de acordo com os grupos de estudo

e os mesmos foram submetidos a ciclos de des-remineralizaccedilatildeo (soluccedilatildeo de aacutecido

ciacutetrico) por 6 dias Na sequecircncia as amostras foram tratadas com aacutegua destilada

(controle negativo) clorexidina 012 (controle positivo) PHMB 007 e um produto

comercial Sanifill Perio Premiumtrade (007 PHMB mais 005 NaF) ou soluccedilatildeo de F

005 por um minuto e entatildeo submetidas a desafio enzimaacutetico por 10 minutos

utilizando uma colagenase bacteriana (Clostridium hystoliticum 100 μgml) A perda

dentinaacuteria foi calculada utilizando-se perfilometria (μm) diariamente Os resultados

indicam que a perda de dentina progrediu de forma significativa para todos os

grupos durante os 6 dias Apoacutes o terceiro dia os grupos de Sanifill PerioPremiumtrade

CHX e PHMB reduziram a erosatildeo dentinaacuteria comparados ao controle Ao final do

sexto dia constatou-se que o enxaguante bucal Sanifill Perio Premiumtrade apresentou

um bom potencial na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Longhi et al (2015) publicaram um artigo que objetivou analisar a literatura

na degradaccedilatildeo da interface adesiva particularmente no papel das

metaloproteinases na degradaccedilatildeo hidroliacutetica da matriz de colaacutegeno na interface de

uniatildeo Foi feita uma revisatildeo no MEDLINE com as palavras-chave metaloproteinases

e uniatildeo de dentina e degradaccedilatildeo Eles constatam que as enzimas colagenoliacuteticas na

dentina mineralizada tecircm comprovadamente tido um papel importante nas patologias

de tecido duro dentaacuterio aleacutem da degradaccedilatildeo da camada hiacutebrida Concluem que a

preservaccedilatildeo da integridade da matriz colagecircnica eacute a chave nas tentativas de

melhorar a durabilidade de uniatildeo da dentina

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

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9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 27: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

2 Revisatildeo de Literatura 28

Epasinghe et al (2014) compararam os efeitos biomecacircnicos de trecircs

flavonoides dentre eles a Proantocianidina na dentina desmineralizada Para tal

utilizaram dentes molares humanos seccionados e dividiram em 3 grupos de acordo

com os tratamentos Proantocianidina a 65 quercetina 65 e naringina 65 Os

espeacutecimes foram testados em tempos progressivos que variaram de momentacircneo

ateacute no maacuteximo 4 horas Os resultados indicaram que tanto o moacutedulo de elasticidade

(MOE) como a forccedila de resistecircncia agrave traccedilatildeo foram afetados pelo tratamento com

flavonoides e pelo tempo de tratamento Eles ressaltam que o tratamento com

flavonoides melhorou as propriedades mecacircnicas da dentina desmineralizada na

seguinte ordem Proantocianidina gt quercetinagt naringina A conclusatildeo deles eacute que

em termos biomecacircnicos a Proantocianidina foi mais efetiva do que os outros e

portanto melhoraria terapias preventivas e terapecircuticas na odontologia

Seguindo essa linha de pesquisa com Proantocianidina e seus efeitos

Castellan et al (2011) caracterizaram as propriedade da matriz dentinaacuteria tratadas

com dois agentes de ligaccedilatildeo ricos em Proantocianidina (PA) Para tal tambeacutem foram

utilizados dentes molares humanos Apoacutes a anaacutelise dos resultados concluem que

propriedades mecacircnicas melhoradas e estabilidade da matriz dentinaacuteria podem ser

alcanccediladas pelo uso de agentes cross-linkers ricos em Proantocianidina muito

provavelmente pela formaccedilatildeo de um complexo colaacutegeno-PA

22 ESTUDOS RELACIONADOS Agrave CRANBERRY

Bodet et al (2008) publicaram uma revisatildeo a respeito dos potenciais

benefiacutecios da Cranberry para a sauacutede bucal De acordo com este grupo os

componentes da Cranberry satildeo potencialmente anti-cariogecircnicos uma vez que eles

inibem a produccedilatildeo aacutecida a adesatildeo e formaccedilatildeo do biofilme por Streptococcus

mutans Aleacutem disso outros componentes da fruta alteram proteiacutenas de ligaccedilatildeo

glucano enzimas extracelulares produccedilatildeo de carboidrato e hidrofobicidade

bacteriana Em relaccedilatildeo a doenccedilas periodontais a mesma fraccedilatildeo de Cranberry inibe

a resposta inflamatoacuteria do hospedeiro produccedilatildeo e atividade de enzimas que causam

a destruiccedilatildeo da matriz extracelular a formaccedilatildeo do biofilme e aderecircncia do

Porphyromonas gingivalis aleacutem das atividades proteoliacuteticas e coagregaccedilatildeo de

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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Apecircndice 80

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 28: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

2 Revisatildeo de Literatura 29

periodontopatoacutegenos O grupo sugere ainda que uma fraccedilatildeo da Cranberry pode ser

incorporada agrave enxaguatoacuterios bucais e dentifriacutecios bem como a geacuteis e tiras para a

prevenccedilatildeo eou tratamento de doenccedilas orais incluindo caacuterie e doenccedila periodontal

Os potenciais benefiacutecios dos polifenois de Cranberry para doenccedila

periodontal e caacuterie foram estudados por Bonifait e Grenier (2010) Eles constataram

neste estudo que os polifenois de Cranberry aparentam ter potencial para prevenir

eou tratar a caacuterie dental atraveacutes da inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de aacutecidos orgacircnicos e

formaccedilatildeo de biofilmes e tambeacutem a reduccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria bem como a

produccedilatildeo e atividade de enzimas proteoliacuteticas contribuindo para a destruiccedilatildeo da

matriz extracelular na doenccedila periodontal Os polifenois de Cranberry tambeacutem

interferiram em vaacuterias atividades do Porphyromonas gingivalis o maior agente

etioloacutegico causador da periodontite crocircnica

Resultados promissores tambeacutem foram encontrados na utilizaccedilatildeo de

Cranberry para prevenir biofilmes de Candida oral (GIRARDOT et al 2014) Ao ser

adicionado ao meio de cultura o extrato de Cranberry mostrou um efeito

antiaderente significativo contra Candida spp quando em baixas concentraccedilotildees

Ademais o preacute-tratamento superficial com esse extrato induziu uma atividade

antiaderente contra leveduras de C glabrata e uma atividade antiobiofilme contra C

albicans Essa atividade foi dependente de concentraccedilatildeo tempo e compressatildeo

Posteriormente utilizou-se um teste anti-adesatildeo fotoquiacutemico bioguiado para

investigar a adesatildeo Os resultados mostraram que trecircs subfraccedilotildees repletas em

Proantocianidinas apresentaram uma atividade antiaderente em baixas

concentraccedilotildees do extrato Portanto esse estudo demonstrou pela primeira vez que

extratos de Cranberry podem prevenir a formaccedilatildeo de biofilmes de Candida

enaltecendo o potencial da fruta como agente antiaderente

Ainda no tema mas especificamente utilizando-se as Proantocianidina do

Cranberry estudou-se o papel preventivo das PACs no mecanismo antiaderente de

Candida albicans Para tal utilizou-se incubaccedilatildeo de biofilmes do fungo em urina

artificial Os resultados mostraram uma excelente atividade antiaderente das PACs

derivadas da Cranberry contra a formaccedilatildeo de biofilmes de C albicans na urina

(RANE et al 2014)

Voltando a estudos focando a accedilatildeo de Cranberry em tecidos da cavidade

oral Lombardo Bedran Palomari Spolidorio e Grenier (2015) hipotetizaram que a

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

Referecircncias 65

REFEREcircNCIAS

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 29: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

2 Revisatildeo de Literatura 30

Proantocianidina do tipo A do Cranberry (AC-PACs) e a galato-3-epigalocatequina

(EGCG) agem em sinergia com o peptiacutedeo humano antimicrobiano catelicidina (LL-

37) a fim de reduzir a secreccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios por ceacutelulas da mucosa

oral Para tal foi desenvolvido um modelo de cultura de ceacutelulas epiteliais gengivais e

fibroblastos as quais foram tratadas com concentraccedilotildees natildeo citotoacutexicas de AC-

PACs EGCG e LL-37 isoladas ou combinadas Eles relatam que essas substacircncias

natildeo tiveram efeito na regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de MMPs mas inibiram a secreccedilatildeo de

diversas citocinas O grupo concluiu que a combinaccedilatildeo de LL-37 e polifenois

naturais do Cranberry e chaacute verde agiu em sinergia para reduzir a secreccedilatildeo de

vaacuterias citocinas no modelo de cultura proposto Tais combinaccedilotildees demonstraram

resultados promissores como terapias adjuntas no tratamento de doenccedilas

periodontais

Portanto frente agraves pesquisas acima relacionadas pressupomos efeitos

promissores tanto do extrato da fruta Cranberry quando de um de seus polifenois a

Proantocianidina na reduccedilatildeo do desgaste erosivo Desta forma um primeiro estudo

in vitro torna-se crucial como iniacutecio das investigaccedilotildees dessas substacircncias bem como

suas interaccedilotildees com o tecido dentinaacuterio

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

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4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8

5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 30: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

3 Proposiccedilatildeo

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6

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5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

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9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 31: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

3 Proposiccedilatildeo 33

3 PROPOSICcedilAtildeO

Este estudo se propocircs a avaliar por meio da perfilometria o efeito de

diferentes concentraccedilotildees de geacuteis agrave base de Cranberry e Proantocianidina sobre a

dentina submetida agrave erosatildeo

Para este fim foi elaborada a seguinte hipoacutetese nula

natildeo haacute diferenccedila nos dados perfilomeacutetricos entre os 10 grupos avaliados

na minimizaccedilatildeo dos efeitos erosivos provocados por uma bebida aacutecida

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

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14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

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23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 32: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

4 Materiais e Meacutetodos

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Schmalz G Hiller KA Nunez LJ Stoll J Weis K Permeability characteristics of bovine and human dentin under different pretreatment conditions J Endod 200127(1)23-30

Shellis RP Featherstone JD Lussi A Understanding the chemistry of dental erosion Monogr Oral Sci 20142563-79

Tao DY Hao G Lu HX Tian Y Feng XP Dental erosion among children aged 3-6 years and its associated indicators J Public Health Dent In press 2015

Teel RW Antimutagenic effects of polyphenolic compounds Castonguay A Cancer Lett 199266(2)107-13

Tjaumlderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions J Dent Res 199877(8)1622-9

Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin J Dent Res 201493(3)269-74

Wataha JC Predicting clinical biological responses to dental materials Dent Mater 201228(1)23-40

Wegehaupt F Gries D Wiegand A Attin T Is bovine dentine an appropriate substitute for human dentine in erosionabrasion tests J Oral Rehabil 200835(5)390-4

Referecircncias 71

Zandim-Barcelos DL Kielbassa AM Sampaio JE Tschoppe P Saliva substitutes in combination with high-fluoride gel on dentin remineralization Clin Oral Investig 201519(2)289-97

Zero DT Etiology of dental erosion ndash extrinsic factors Eur J Oral Sci

1996104(2)162-77

Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 33: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

4 Materiais e Meacutetodos 37

4 MATERIAIS E MEacuteTODOS

41 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo in vitro avaliou o efeito de diferentes concentraccedilotildees de geacuteis de

Proantocianidina e Cranberry aplicados sobre a dentina por meio de dez grupos

Os dois princiacutepios ativos foram avaliados em quatro concentraccedilotildees (005

1 5 e 10) Completaram os grupos aqueles considerados controle positivo

(gel clorexidina 0012) e negativo (gel placebo com nenhum princiacutepio ativo)

Todos os geacuteis foram aplicados sobre as superfiacutecies dos espeacutecimes por 5

minutos Um total de 150 fragmentos de dentina radicular bovina apoacutes um

ordenamento planejado conforme a dureza foram aleatoriamente divididos entre os

10 grupos de estudo Desta forma para cada grupo foram utilizados 15 fragmentos

de dentina bovina

Os 10 grupos foram distribuiacutedos da seguinte forma

G1 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de clorexidina (Controle

Positivo)

G2 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica placebo (Controle Negativo)

G3 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 005

G4 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 1

G5 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 5

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 34: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

4 Materiais e Meacutetodos 38

G6 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de extrato de Cranberry

a 10

G7 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

005

G8 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

1

G9 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

5

G10 - Accedilatildeo da bebida aacutecida (Coca-Colareg) sobre a dentina bovina tratada

previamente com gel de aplicaccedilatildeo toacutepica agrave base de Proantocianidina a

10

Apoacutes o periacuteodo experimental in vitro o fragmento dentaacuterio foi submetido agrave

anaacutelise quantitativa do desgaste dos fragmentos por meio de teste de perfilometria

observando-se o perfil de desgaste

A referecircncia de dentina hiacutegida de cada espeacutecime foi mantida uma vez que

todos os blocos de dentina tiveram dois terccedilos de suas superfiacutecies protegidas por

esmalte cosmeacutetico para obtenccedilatildeo de aacutereas controle condiccedilatildeo imprescindiacutevel para a

realizaccedilatildeo da perfilometria Aleacutem disso as medidas precisas dos eixos de

movimentaccedilatildeo (eixos X e Y) do perfilocircmetro foram fielmente mantidas na anaacutelise

perfilomeacutetrica preacutevia e posterior agrave etapa experimental (Figura 1)

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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Apecircndice 80

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 35: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

4 Materiais e Meacutetodos 39

Figura 1 - Fluxograma ilustrando o delineamento experimental do trabalho

42 PREPARO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Aproximadamente 200 dentes incisivos bovinos extraiacutedos de gado da raccedila

Nelore com idade meacutedia de 36 meses abatidos para consumo no Frigoriacutefico

Vangeacutelio Mondelli Ltda em Bauru SP foram inicialmente utilizados no presente

estudo

Os incisivos foram limpos com curetas periodontais para remover resiacuteduos

de tecido gengival aderido agrave superfiacutecie e posteriormente armazenados em soluccedilatildeo

de cloreto de soacutedio e timol a 01 (pH 70) Os dentes ficaram imersos durante todo

o periacuteodo de preparo dos espeacutecimes

A escolha do substrato bovino ocorre em funccedilatildeo da grande dificuldade de se

obter dentes humanos para pesquisas cientiacuteficas Esse substrato tem sido aceito e

utilizado em diversas pesquisas sobre erosatildeo dentaacuteria (RIOS et al 2006 HONOacuteRIO

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 36: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

4 Materiais e Meacutetodos 40

et al 2008 KATO et al 2009 HONOacuteRIO et al 2010a KATO et al 2010a) Haacute

publicaccedilotildees as quais caracterizaram similaridades entre dentes humanos e bovinos

quanto agrave morfologia fisiologia (SCHMALZ et al 2001) e estrutura mecacircnica

(WEGEHAUPT et al 2008) O grupo de Kato et al (2010a 2010b) conferiram a

confiabilidade desse substrato para estudos envolvendo erosatildeo dentaacuteria e atividade

de metaloproteinases Assim face agrave facilidade de obtenccedilatildeo e ao acima exposto a

dentina bovina foi o substrato de eleiccedilatildeo para a presente pesquisa

Primeiramente foram removidas as raiacutezes dos incisivos bovinos com o

auxiacutelio de um torno para polimento odontoloacutegico adaptado para corte (Faacutebrica

Nacional de Motores Monofaacutesicos Nevoni Seacuterie 16223 Tipo TG13 Satildeo Paulo

SP) e um disco diamantado Diaflex-F (Wilcos do Brasil Induacutestria e Comeacutercio Ltda

Petroacutepolis RJ) sendo feita uma secccedilatildeo na porccedilatildeo cervical dos dentes

O proacuteximo passo foi fixar a amostra com godiva termoativada (Kerr

Corporation USA) ao centro de uma base de acriacutelico cristal (40 X 40 X 5 mm) para

facilitar a adaptaccedilatildeo na maacutequina de corte

A placa de acriacutelico foi acoplada a um aparelho de corte de precisatildeo ISOMET

LowSpeedSaw (Bulher Ltda Lake Bluff IL USA) e com o auxiacutelio de dois discos

diamantados dupla face (XLI 2205 high concentration 102 X 03 X 127 mm Extec

Corp Enfield CT USA Ref 12205) e um espaccedilador de accedilo inoxidaacutevel (7 cm de

diacircmetro 4 mm de espessura e orifiacutecio central de 13 cm) entre os discos com

velocidade de 300 rpm refrigerado com aacutegua deionizada colocados em um acircngulo

de 90o em relaccedilatildeo ao longo eixo do dente no sentido meacutesio-distal foram obtidos

discos de raiz Apoacutes com dois discos diamantados dupla face (XLI 2205 ldquohigh

concentrationrdquo 102 X 03 X 12 7 mm Extec CorpEnfield CT USA Ref 12205) e

o espaccedilador de 4 mm foi realizado um corte do disco no sentido vestiacutebulo-lingual

resultando em dois espeacutecimes de dentina de 4 X 4 mm

43 PLANIFICACcedilAtildeO E POLIMENTO DOS ESPEacuteCIMES DE DENTINA

Os blocos de dentina foram na sequecircncia submetidos agrave planificaccedilatildeo Para

tal foram novamente fixados com cera de enceramento progressivo em bases de

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 37: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

4 Materiais e Meacutetodos 41

acriacutelico de 30 mm de diacircmetro por 8 mm de espessura com a superfiacutecie de dentina

externa (coberta por cemento) voltada para baixo

Os espeacutecimes foram planificados em uma Politriz Metalograacutefica (APL 4

Arotec Cotia SP) com sistema muacuteltiplo capaz de realizar o polimento automaacutetico e

concomitante de seis corpos de prova por turno Para tal foi utilizada uma lixa de

carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (ExtecCorp) sob refrigeraccedilatildeo constante com

aacutegua em baixa velocidade durante um periacuteodo de 10 a 30 segundos dependendo

da espessura do bloco

Em seguida os blocos foram removidos das placas acriacutelicas e estas foram

limpas e tiveram resiacuteduos de cera eliminados Entatildeo as amostras foram refixadas

mas no sentido inverso (cemento voltado para cima) Foram utilizadas

sequencialmente as lixas de carbeto de siliacutecio de granulaccedilatildeo 320 (10-20s) 600 (30-

60s) e 1200 (cerca de 5 m) (ExtecCorp) em baixa velocidade sob refrigeraccedilatildeo ateacute

a obtenccedilatildeo de uma superfiacutecie de dentina com aspecto viacutetreo

44 AVALIACcedilAtildeO DA MICRODUREZA SUPERFICIAL E SELECcedilAtildeO DOS

ESPEacuteCIMES DE DENTINA

A microdureza superficial inicial da dentina foi avaliada utilizando-se um

microdurocircmetro (HMV-2000 Shimadzu CorporationJapan) acoplado a um

computador e software especiacutefico (Cams ndash Win ndash New Age IndustriesUSA) para a

anaacutelise das imagens

O proacuteprio sistema dispotildee de um penetrador diamantado piramidal tipo

KNOOP (Figura 2) Foi configurado paracircmetro de carga estaacutetica de 25 g aplicada

por 5 segundos Em cada amostra foram realizadas cinco endentaccedilotildees (marcaccedilotildees

com o penetrador) aleatoacuterias (Figura 3) englobando diferentes aacutereas da superfiacutecie

com uma distacircncia de 100 microm entre elas

Para medir as endentaccedilotildees realizadas duas marcas pontilhadas que

aparecem na tela do computador iratildeo se sobrepor aos veacutertices agudos do losango

correspondente agrave endentaccedilatildeo determinando o comprimento da maior diagonal e

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin J Dent Res 201493(3)269-74

Wataha JC Predicting clinical biological responses to dental materials Dent Mater 201228(1)23-40

Wegehaupt F Gries D Wiegand A Attin T Is bovine dentine an appropriate substitute for human dentine in erosionabrasion tests J Oral Rehabil 200835(5)390-4

Referecircncias 71

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Zero DT Etiology of dental erosion ndash extrinsic factors Eur J Oral Sci

1996104(2)162-77

Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

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14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

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22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

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27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 38: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

4 Materiais e Meacutetodos 42

consequentemente os resultados da dureza KNOOP atraveacutes do caacutelculo automaacutetico

feito pelo software da seguinte equaccedilatildeo

KHN= Cc

Sendo KHN = valor de dureza Knoop

C (constante) = 14230

c = 25 gramas

d = comprimento da maior diagonal da endentaccedilatildeo

Figura 2 - Ponta tipo Knoop

Figura 3 - Imagem em maior aumento da endentaccedilatildeo feita para avaliaccedilatildeo de microdureza

d2

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

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5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

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9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 39: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

4 Materiais e Meacutetodos 43

Foram selecionados apoacutes esta etapa 200 espeacutecimes de dentina Apoacutes um

ordenamento dos espeacutecimes pelo valor meacutedio de dureza (meacutedia entre as 5

endentaccedilotildees de cada espeacutecime) foram descartados os 25 espeacutecimes de menor

dureza e os 25 espeacutecimes de maior dureza Assim foram descartados 50 espeacutecimes

de dentina Utilizou-se a randomizaccedilatildeo estratificada para tal finalidade

45 PERFILOMETRIA INICIAL

Antes das leituras de superfiacutecies com o perfilocircmetro foram realizadas duas

marcaccedilotildees com a lacircmina de bisturi nuacutemero 11 (Embramac Itapira SP Brasil)

objetivando delimitar as duas aacutereas controle e teste Aleacutem disso estas marcaccedilotildees

tambeacutem permitiram a exata sobreposiccedilatildeo dos perfis inicial e final para a mensuraccedilatildeo

do desgaste final

Para este procedimento foi utilizado um guia de resina composta sobre

uma matriz bipartida com as dimensotildees de 2 mm de largura 15 mm de espessura

e 25 cm de comprimento Este guia foi pressionado ao centro de cada espeacutecime

para a realizaccedilatildeo das marcaccedilotildees Desta maneira obtivemos duas aacutereas de controle

nas extremidades do espeacutecime (1 mm cada) e ao centro uma aacuterea de teste com 2

mm de largura

Na avaliaccedilatildeo da superfiacutecie inicial da dentina foi utilizado o perfilocircmetro da

marca Mahr (Marsurf GD 25 Goumlttingen Germany) acoplado a um computador

contendo um software (Mahrsurf XCR 20) especiacutefico para obtenccedilatildeo das imagens Na

sequecircncia uma sonda apalpadora esfeacuterica percorreu toda a superfiacutecie do espeacutecime

Essa leitura resultou em uma imagem graacutefica relativa agrave superfiacutecie Para cada amostra

foram efetuadas cinco leituras a distacircncias preacute-determinadas de 225 2 175 15 e

125 microm A sonda percorreu 35 mm em cada uma das leituras no sentido lateral

Um dispositivo de accedilo inox nas mesmas dimensotildees da base acriacutelica foi

utilizado para a adaptaccedilatildeo do espeacutecime no perfilocircmetro Dadas configuraccedilotildees

previamente relatadas dos eixos X e Y foi marcada a porccedilatildeo inferior da amostra

para posicionaacute-la identicamente nas duas anaacutelises do perfil ou seja inicial e final

(Figura 4)

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 40: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

4 Materiais e Meacutetodos 44

Figura 4 - Ponta apalpadora e dispositivo adaptador do espeacutecime

46 PREPARACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram especialmente manipulados para este experimento (Bauru

Foacutermulas) e todos tiveram a mesma composiccedilatildeo base (hidrocelulose propilenoglicol

metilparabeno imidazolidinilureacuteia e aacutegua deionizada) exceto pela presenccedila do

princiacutepio ativo respectivo de cada grupo teste e do controle positivo (clorexidina)

(Figura 5)

O extrato de Cranberry utilizado para a confecccedilatildeo dos geacuteis agrave base de

Cranberry foi gentilmente cedido pela Prof Dra Anuradha Prakki da Universidade

de Toronto no Canadaacute

Figura 5 - Geacuteis manipulados especialmente para o experimento

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

Referecircncias 65

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 41: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

4 Materiais e Meacutetodos 45

47 PROTECcedilAtildeO DOS ESPEacuteCIMES

Um esmalte cosmeacutetico foi utilizado para proteger as laterais dos fragmentos

contra o ataque aacutecido (desafio erosivo) promovido no experimento e para obtenccedilatildeo

de superfiacutecies de referecircncia nos perfis (Figura 6)

Figura 6 - Proteccedilatildeo dos espeacutecimes

48 APLICACcedilAtildeO DOS GEacuteIS

Os geacuteis foram aplicados apenas pelo pesquisador responsaacutevel e uma uacutenica vez

(pela manhatilde) antes do iniacutecio dos desafios erosivos in vitro Os geacuteis foram aplicados sobre os

fragmentos por meio de uma fina camada utilizando-se um microbrush permanecendo

sobre os espeacutecimes por 5 minutos Em seguida foram cuidadosamente removidos com

cotonete

49 CICLAGEM EROSIVA

Os espeacutecimes foram submetidos agrave ciclagem de pH erosiva durante 5 dias

consecutivos Cada dia de ciclagem compreende trecircs ciclos de

lavagem com aacutegua deionizada por 20s

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

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11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

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18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 42: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

4 Materiais e Meacutetodos 46

desmineralizaccedilatildeo por bebida aacutecida Coca-Colareg em um volume de 32 mL

por amostra (480 mL total) durante 5 minutos sob temperatura ambiente

e recipiente plaacutestico (tipo Tupperwarereg) As amostras foram encaixadas

em um dispositivo especialmente confeccionado para o experimento de

EVA

lavagem com aacutegua deionizada por 20s findo o tempo de imersatildeo em

Coca-Colareg

reimersatildeo em recipiente plaacutestico contendo o mesmo volume (480 mL) de

saliva artificial A saliva utilizada foi preconizada por Klimek Hellwig e

Ahrens (1982) e conteacutem 033g KH2PO4 034g Na2HPO4 127g KCl 016g

NaSCN 058g NaCl 017g CaCl216g NH4Cl 02g ureacuteia 003g glucose

0002g aacutecido ascoacuterbico pH 7

Ao final de cada dia os espeacutecimes permaneceram imersos em saliva

artificial ateacute o dia seguinte (Figura 7 e 8)

Figura 7 - Preparo para ciclagem erosiva

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 43: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

4 Materiais e Meacutetodos 47

Figura 8 - Imersatildeo dos espeacutecimes em bebida aacutecida

410 PERFILOMETRIA APOacuteS CICLAGEM EROSIVA

Terminada a etapa de ciclagem os espeacutecimes tiveram os esmaltes

cosmeacuteticos removidos e foram novamente analisados no perfilocircmetro sob as

mesmas condiccedilotildees e paracircmetros (Figura 9)

Figura 9 - Ilustraccedilatildeo esquemaacutetica mostrando a quantificaccedilatildeo do desgaste pelo perfilocircmetro

411 AVALIACcedilAtildeO DOS PERFIS

Os valores referentes ao desgaste provocado apoacutes a ciclagem erosiva foram

obtidos por meio da sobreposiccedilatildeo dos graacuteficos referentes aos perfis inicial e final de

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 44: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

4 Materiais e Meacutetodos 48

cada espeacutecime Foi calculada a diferenccedila entre os valores obtidos nas

sobreposiccedilotildees inicial e final para a obtenccedilatildeo dos dados relativos agraves possiacuteveis

alteraccedilotildees superficiais apoacutes o experimento (Figura 10)

Figura 10 - Desgaste dos espeacutecimes testados ocasionado pela erosatildeo

412 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade das

variacircncias Sendo obedecidas estas premissas foi aplicado o teste de Anaacutelise de

Variacircncia seguido do teste de Fisher para a variaacutevel de resposta testada (desgaste)

Foi adotado um niacutevel de significacircncia de 5 Para a realizaccedilatildeo destas anaacutelises

estatiacutesticas foi utilizado o programa STATISTICA data analysis software system

110 (Stat Soft Inc)

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 45: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

5 Resultados

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 46: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

5 Resultados 51

5 RESULTADOS

51 ANAacuteLISE DE DESGASTE

O teste de Anaacutelise de Variacircncia (ANOVA) mostrou haver diferenccedila

estatisticamente significativa entre os grupos com relaccedilatildeo ao desgaste

Posteriormente o teste de Fisher permitiu verificar que o gel de Cranberry

(G3) na concentraccedilatildeo de 005 e o gel de Proantocianidina a 10 (G10)

promoveram prevenccedilatildeo de desgaste similares contra a perda dentinaacuteria quando

comparadas ao G1 controle positivo o gel de clorexidina a 012

Aleacutem disso esses trecircs grupos apresentaram menor perda dentinaacuteria quando

comparados a todos os outros grupos avaliados (plt005)

O controle negativo (G2) mostrou a maior perda dentinaacuteria dentre todos os

grupos estudados (plt005)

Tabela 1 - Meacutedia plusmn desvio padratildeo de perda dentinaacuteria (microm) para os grupos estudados

GRUPOS MEacuteDIA plusmn DESVIO PADRAtildeO

G1- 0012 Gel de clorexidina 156 plusmn 24b

G2- Gel Placebo 231 plusmn 14e

G3- Gel Cranberry 005 151 plusmn 23b

G4- Gel Cranberry 1 204 plusmn 19cd

G5- Gel Cranberry 5 190 plusmn 21ac

G6- Gel Cranberry 10 187 plusmn 14a

G7- Gel Proantocianidina 005 182 plusmn 16a

G8- Gel Proantocianidina 1 211 plusmn 12d

G9- Gel Proantocianidina 5 192 plusmn 26ac

G10- Gel Proantocianidina 10 152 plusmn 25b

Letras diferentes significam diferenccedilas significativas entre os grupos (ANOVA e Fisherrsquos Test plt005)

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 47: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

5 Resultados 52

Figura 11 - Valores de meacutedia e desvio-padratildeo dos diferentes grupos

Mean MeanplusmnSD Min-Max

G1-CLX G2-PLA G3-CR05 G4-CR1 G5-CR5 G6-CR10 G7-PA05 G8-PA1 G9-PA5 G10-PA10

GRUPO

10

12

14

16

18

20

22

24

26D

ES

GA

ST

E fin

al

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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Apecircndice 80

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 48: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

6 Discussatildeo

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 49: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

6 Discussatildeo 55

6 DISCUSSAtildeO

O presente estudo in vitro avaliou o potencial inibitoacuterio de MMPs na erosatildeo

dentinaacuteria provocada por uma bebida aacutecida Para tal foram utilizados geacuteis em

diferentes concentraccedilotildees com princiacutepios ativos de Cranberry e um polifenol existente

nesta fruta a Proantocianidina usada isoladamente Embora a degradaccedilatildeo de

colaacutegeno natildeo possa ser medida diretamente dentro deste protocolo os resultados

sugerem que a inibiccedilatildeo das MMPs pelo extrato de Cranberry 005 e

Proantocianidina 10 em niacuteveis comparados aos da clorexidina possa ser um

potencial mecanismo de accedilatildeo na reduccedilatildeo da perda dentinaacuteria

Os modelos de estudo in vitro satildeo fundamentais como primeiro passo para

avaliar a interaccedilatildeo entre os agentes quiacutemicos e os tecidos bioloacutegicos Haacute vaacuterios

trabalhos publicados enaltecendo a importacircncia dos testes laboratoriais a fim de se

obter paracircmetros iniciais de faacutermacos e demais substacircncias para futuros estudos in

situ inclusive para erosatildeo dentinaacuteria (HONOacuteRIO et al 2008 BARBOUR LUSSI

2014)

Por outro lado sabe-se que haacute limitaccedilotildees nos testes in vitro Wataha (2012)

publicou uma revisatildeo acerca dos diferentes modelos experimentais para estudo de

materiais odontoloacutegicos Ainda haacute controveacutersias sobre como testes in vitro ou

mesmo em animais deveriam ser utilizados para avaliar a seguranccedila bioloacutegica dos

materiais para uso cliacutenico objetivo final das pesquisas De acordo com o autor

testes cliacutenicos controlados continuam sendo a melhor medida isolada para testar a

resposta a materiais mas mesmo esses tecircm suas limitaccedilotildees significativas e satildeo ateacute

mais inuacuteteis para identificar os mecanismos que moldam a performance do material

como propriedades biomecacircnicas e biomoleculares

Desta forma os estudos in vitro ainda satildeo utilizados e mundialmente aceitos

como primeira estrateacutegia para compreender o papel prever e monitorar a seguranccedila

de novos biomateriais e faacutermacos (WATAHA 2012 BARBOUR LUSSI 2014)

Neste estudo optou-se pela utilizaccedilatildeo de geacuteis para testar os princiacutepios

ativos Os geacuteis tem sido testados haacute alguns anos em experimentos como veiacuteculos de

inibidores de proteases (KATO et al 2010a 2010b) a fim de facilitar a aplicaccedilatildeo

padronizaccedilatildeo do tempo e contato do princiacutepio ativo com a dentina Desta forma foi

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 50: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

6 Discussatildeo 56

proposto o tempo de 5 minutos de aplicaccedilatildeo dos geacuteis de modo que esse mesmo

tempo de accedilatildeo possa ser futuramente adotado em consultoacuterios odontoloacutegicos sob

uso profissional em terapecircuticas diversas

A escolha da bebida aacutecida Coca-Colareg para a realizaccedilatildeo do desafio erosivo

no presente estudo deu-se por vaacuterios motivos Por ser industrializada a composiccedilatildeo

e o pH satildeo constantes diminuindo-se dessa forma os vieses nas anaacutelises dos

dados Os refrigerantes de Cola possuem pH de 24 Esse pH oferece condiccedilotildees

propiacutecias agrave desmineralizaccedilatildeo perda de iacuteons caacutelcio e fosfato inorgacircnico Um estudo

de Leme et al (2011) cujos dados foram obtidos por meio de microscopia eletrocircnica

de varredura concluiu que dentre as diversas bebidas cotidianas pesquisadas a

Coca-Colareg alterou de forma mais intensa as caracteriacutesticas morfoloacutegicas e

estruturais do esmalte dental

O ciclo erosivo foi realizado com imersatildeo em bebida aacutecida por 5 minutos 3

vezes ao dia por 5 dias totalizando 75 minutos As imersotildees em saliva foram

realizadas a cada 3 horas para potencializar a degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria uma

vez que o baixo pH da bebida pode ter induzido a ativaccedilatildeo de MMPs deste tecido

(KATO et al 2009)

Eacute sabido que uma vez ocorrendo a queda do pH haacute por conseguinte a

desmineralizaccedilatildeo do componente inorgacircnico da dentina Isso leva agrave exposiccedilatildeo das

fibrilas colaacutegenas e das MMPs teciduais e em seguida agrave ativaccedilatildeo destas Quando o

pH salivar volta agrave neutralidade (pH=70) haacute a degradaccedilatildeo das fibrilas colaacutegenas

pelas MMPs (MAGALHAtildeES et al 2009b)

Barbour e Lussi (2014) publicaram um artigo no qual afirmam que o pH eacute o

paracircmetro singular mais importante ao determinar a taxa de dissoluccedilatildeo de um tecido

erosivo Deve-se considerar entretanto vaacuterios fatores nesse processo Eacute sabido que

para a doenccedila caacuterie haacute um pH criacutetico mas o mesmo natildeo ocorre para a erosatildeo A

erosatildeo pode progredir tanto em um pH aacutecido quanto em alto pH na ausecircncia de

fatores atenuantes Soluccedilotildees supersaturadas de caacutelcio e fosfato natildeo causaratildeo

dissoluccedilatildeo do esmalte ou dentina significando que em concentraccedilotildees suficientes de

iacuteons a erosatildeo natildeo ocorre mesmo em baixo pH

A adiccedilatildeo de caacutelcio eacute mais efetiva que de fosfato para reduzir a erosatildeo em

soluccedilotildees aacutecidas A temperatura tambeacutem eacute um fator fiacutesico significativo para soluccedilotildees

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 51: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

6 Discussatildeo 57

aciacutedicas quanto maior a temperatura mais rapidamente a erosatildeo progride

(BARBOUR LUSSI 2014)

De fato todos os geacuteis testados nesse estudo in vitro minimizaram a erosatildeo

dentinaacuteria As informaccedilotildees obtidas permitiram verificar que concentraccedilatildeo progressiva

de extrato de Cranberry e Proantocianidina natildeo apresentaram um efeito dose-

resposta O gel de Cranberry com a menor (005) e o gel de Proantocianidina com

a maior (10) concentraccedilotildees promoveram menores desgastes estatisticamente

significantes em relaccedilatildeo aos demais grupos

Extrapolando para a praacutetica cliacutenica os estudos futuros deveratildeo avaliar por

quanto tempo esses geacuteis seratildeo efetivos na reduccedilatildeo da erosatildeo a fim de se

estabelecer protocolos cliacutenicos de utilizaccedilatildeo nos pacientes

Os resultados pelo estudo obtidos indicam que o uso de Cranberry e de

Proantocianidina os quais jaacute satildeo conhecidos pela atividade cataliacutetica inibitoacuteria de

MMP1 e MMP9 em doenccedilas periodontais (LA HOWELL GRENIER 2009) por

exemplo tambeacutem satildeo eficientes na reduccedilatildeo da erosatildeo dentinaacuteria Supotildee-se que o

efeito seja devido agrave preservaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada (BUZALAF

MAGALHAtildeES WIEGAND 2014) e natildeo pelo impedimento da ocorrecircncia da erosatildeo

Ainda nenhum desses geacuteis foi capaz de prevenir a erosatildeo dentinaacuteria sugerindo que

natildeo atuam no processo des-remineralizaccedilatildeo (BUZALAF MAGALHAtildeES WIEGAND

2014)

Um estudo de Huysmans Young e Ganss (2014) encontrou dados

indicando que o fluoreto pode promover a formaccedilatildeo de uma camada do tipo CaF2 ou

mesmo uma cobertura superficial plena em iacuteons metaacutelicos o que fez com que natildeo

fosse utilizado um gel de fluoreto como grupo controle neste estudo Este cuidado

tornou possiacutevel realizar a pesquisa focada nos componentes com capacidade

exclusiva de inibir enzimas colagenoliacuteticas

Outrossim haacute evidecircncia (KATO et al 2009 2010a) de que o gel de 123

NaF reduz a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica embora a equipe de Ganss Klimek e

Schlueter (2014) relate que a matriz por si soacute natildeo influencia o modo de accedilatildeo de

ingredientes ativos em dentifriacutecios fluoretados

A clorexidina por outro lado foi relatada em estudos como potencial

inibidora direta e indireta de MMPs tanto pela prevenccedilatildeo de erosatildeo quanto na

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 52: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

6 Discussatildeo 58

inibiccedilatildeo da degradaccedilatildeo da matriz dentinaacuteria (KATO et al 2010a 2012) Desta

forma considerando-se essas propriedades a escolha da clorexidina como controle

positivo eacute ideal para comparaccedilatildeo quantitativa da perda de tecido dentinaacuterio

Nossos resultados indicam que o percentual de reduccedilatildeo do desgaste

dentinaacuterio para os grupos Cranberry a 005 e Proantocianidina a 10 foi de 35

valor estatisticamente semelhante grupo controle positivo (clorexidina) De forma

interessante dados similares foram previamente encontrados em um estudo

Magalhatildees et al (2009a) no qual a clorexidina reduziu o desgaste dentinaacuterio de

30 a 40

Assim apesar dos resultados mostrarem dados promissores para os geacuteis de

Cranberry e Proantocianidina na minimizaccedilatildeo do desgaste da dentina exposta a um

agente erosivo antes que estes sejam definitivamente considerados para a

prevenccedilatildeo da evoluccedilatildeo de lesotildees de erosatildeo em dentina futuros estudos

especialmente moleculares deveratildeo ser realizados para avaliar sua habilidade em

inibir a degradaccedilatildeo da matriz orgacircnica desmineralizada

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 53: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

7 Conclusatildeo

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 54: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

7 Conclusatildeo 61

7 CONCLUSAtildeO

Apoacutes a anaacutelise dos resultados pode-se concluir que

houve uma eficaacutecia estatisticamente significante dos geacuteis ativos agrave base

de Cranberry 005 e de Proantocianidina 10 na reduccedilatildeo do desgaste

da dentina submetida agrave erosatildeo dentinaacuteria em relaccedilatildeo ao grupo placebo

(controle negativo) e equivalente ao controle positivo com gel agrave base de

clorexidina

estes resultados permitem a rejeiccedilatildeo da hipoacutetese nula inicialmente

formulada

Referecircncias

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 55: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 56: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 57: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 58: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
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Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

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Rane HS Bernardo SM Howell AB Lee SA Cranberry derived proanthocyanidins prevent formation of Candida albicans biofilms in artificial urinethrough biofilm-and adherence-specific mechanisms J Antimicrob Chemother 201469(2)428-36

Rice-Evans CA Miller NJ Antioxidant activities of flavonoids as bioactive components of food Biochem Soc Trans 199624(3)90-5

Referecircncias 70

Rios D Honoacuterio HM Magalhatildees AC Delbem AC Machado MA Silva SM et al Effect of salivary stimulation on erosion of human and bovine enamel subjected or not to subsequent abrasion an in situex vivo study Caries Res 200640(3)218-23

Rios D Magalhatildees AC Honoacuterio HM Buzalaf MA Lauris JR Machado MA The prevalence of deciduous tooth wear in six-year-old children and its relationship with potential explanatory factors Oral Health Prev Dent 20075(3)167-71

Rytomaa I Jarvinen V Kanerva R Heinonen OP Bulimia and tooth erosion Acta Odontol Scand 199856(1)36-40

Salah N Miller NJ Paganga G Tijburg L Bolwell GP Rice-Evans C Polyphenolic flavanols as scavengers of aqueous phase radicals and as chain-breaking antioxidants Arch Biochem Biophys 1995322(2)339-46

Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Arch Oral Biol 201055(4)294-9

Schmalz G Hiller KA Nunez LJ Stoll J Weis K Permeability characteristics of bovine and human dentin under different pretreatment conditions J Endod 200127(1)23-30

Shellis RP Featherstone JD Lussi A Understanding the chemistry of dental erosion Monogr Oral Sci 20142563-79

Tao DY Hao G Lu HX Tian Y Feng XP Dental erosion among children aged 3-6 years and its associated indicators J Public Health Dent In press 2015

Teel RW Antimutagenic effects of polyphenolic compounds Castonguay A Cancer Lett 199266(2)107-13

Tjaumlderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions J Dent Res 199877(8)1622-9

Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin J Dent Res 201493(3)269-74

Wataha JC Predicting clinical biological responses to dental materials Dent Mater 201228(1)23-40

Wegehaupt F Gries D Wiegand A Attin T Is bovine dentine an appropriate substitute for human dentine in erosionabrasion tests J Oral Rehabil 200835(5)390-4

Referecircncias 71

Zandim-Barcelos DL Kielbassa AM Sampaio JE Tschoppe P Saliva substitutes in combination with high-fluoride gel on dentin remineralization Clin Oral Investig 201519(2)289-97

Zero DT Etiology of dental erosion ndash extrinsic factors Eur J Oral Sci

1996104(2)162-77

Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6

3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114

4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8

5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

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22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 61: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

Referecircncias 70

Rios D Honoacuterio HM Magalhatildees AC Delbem AC Machado MA Silva SM et al Effect of salivary stimulation on erosion of human and bovine enamel subjected or not to subsequent abrasion an in situex vivo study Caries Res 200640(3)218-23

Rios D Magalhatildees AC Honoacuterio HM Buzalaf MA Lauris JR Machado MA The prevalence of deciduous tooth wear in six-year-old children and its relationship with potential explanatory factors Oral Health Prev Dent 20075(3)167-71

Rytomaa I Jarvinen V Kanerva R Heinonen OP Bulimia and tooth erosion Acta Odontol Scand 199856(1)36-40

Salah N Miller NJ Paganga G Tijburg L Bolwell GP Rice-Evans C Polyphenolic flavanols as scavengers of aqueous phase radicals and as chain-breaking antioxidants Arch Biochem Biophys 1995322(2)339-46

Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Arch Oral Biol 201055(4)294-9

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Tjaumlderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions J Dent Res 199877(8)1622-9

Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin J Dent Res 201493(3)269-74

Wataha JC Predicting clinical biological responses to dental materials Dent Mater 201228(1)23-40

Wegehaupt F Gries D Wiegand A Attin T Is bovine dentine an appropriate substitute for human dentine in erosionabrasion tests J Oral Rehabil 200835(5)390-4

Referecircncias 71

Zandim-Barcelos DL Kielbassa AM Sampaio JE Tschoppe P Saliva substitutes in combination with high-fluoride gel on dentin remineralization Clin Oral Investig 201519(2)289-97

Zero DT Etiology of dental erosion ndash extrinsic factors Eur J Oral Sci

1996104(2)162-77

Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6

3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114

4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8

5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 62: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

Referecircncias 71

Zandim-Barcelos DL Kielbassa AM Sampaio JE Tschoppe P Saliva substitutes in combination with high-fluoride gel on dentin remineralization Clin Oral Investig 201519(2)289-97

Zero DT Etiology of dental erosion ndash extrinsic factors Eur J Oral Sci

1996104(2)162-77

Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6

3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114

4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8

5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 63: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

Apecircndice

Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6

3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114

4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8

5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
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Apecircndice 75

APEcircNDICE A

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Short Title Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

Heitor M Honoacuterio1 Marcela M Tagliani

1 Ana Paula Boteon

2 Brunna M Ferrairo

3 Anuradha Prakki

4

Mariacutelia Afonso Rabelo Buzalaf5 Joseacute Roberto P Lauris

1 Daniela Rios

1

1Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

2Department of Restorative Dentistry Endodontics and Dental Materials Bauru School of Dentistry -

University of Satildeo Paulo Bauru-SP Brazil

3Department of Prosthetic Dentistry Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

4Department of Clinical Sciences (Restorative) Faculty of Dentistry - University of Toronto Toronto-

ON Canada

5Department of Biological Science Bauru School of Dentistry - University of Satildeo Paulo Bauru-SP

Brazil

Keywords Collagen Dentin Erosion Preventive dentistry and Wear

Corresponding Author

Heitor Marques Honoacuterio

Bauru School of Dentistry- University of Satildeo Paulo (FOB-USP)

Department of Pediatric Dentistry Orthodontics and Public Health

Alameda Octaacutevio Pinheiro Brisola 9-75 Vila Universitaacuteria

ZIP CODE 17012-901 Bauru- SP Brazil

Telephone 00-55-14-32358256

Fax 00-55-14-3223-4679

e-mail heitorhonoriouspbr

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6

3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114

4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8

5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 65: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

Apecircndice 76

In vitro effect of Cranberry and Proanthocyanidin on dentin erosion

ABSTRACT

Objectives The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels used in different concentrations on dentin before an erosive challenge Methods For this purpose 150 bovine root dentin blocks were randomly divided into 10 groups and treated by different gels G1- 0012 Chlorhexidine Gel (positive control) G2- Placebo gel with no active principle (negative control) G3- 005 Cranberry gel G4- 1 Cranberry gel G5- 5 Cranberry gel G6- 10 Cranberry gel G7- 005 Proanthocyanidin gel G8- 1 Proanthocyanidin gel G9- 5 Proanthocyanidin gel and G10- 10 Proanthocyanidin gel The gels were applied over dentin blocks one time before the first erosive challenge for 5 minutes After that the blocks were subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Profilometry was used to quantify the dentin wear (microm) Data were analyzed by ANOVA and Fishers test (plt005) Results 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) presented similar results when compared to positive control group (G1) and these three groups showed the statistically lowest wear when compared to all other evaluated groups Conclusions Results of this study suggest a significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing wear of dentin subjected to dental erosion in vitro

1 INTRODUCTION

Besides dental enamel dentin may also be affected by erosive agents However dentin has

different composition when compared to enamel1 which results in more complex demineralization

mechanism23

The dentin erosive demineralization rate decreases when the amount of degradable collagen

increases because the demineralized matrix layer serves as a barrier against acids diffusion reducing

the erosion progression4 However the organic matrix can be chemically degraded which can

contribute to the progression of dentin wear45

This chemical degradation occurs specially by matrix

metalloproteinases (MMPs) present in dentin and saliva which can be activated when local pH drops

below 456-8

Thus the application of MMP inhibitors aims to reduce exposed organic matrix degradation

decreasing dentin loss in case of subsequent erosive challenges Some studies evaluated several

agents such as chlorhexidine compounds present in green tea (EGCG) and ferrous sulphate

confirming the preventive effect of protease inhibitors against dentin erosion9-12

Studies in many areas showed that Cranberryrsquos polyphenols could also inhibit the activity of

hydrolytic enzymes (MMPs)13-16

Proanthocyanidin (PA) is one of the Cranberry polyphenols The anti-

proteolytic effect of PA by means of resin-dentin bonding durability showed positive results1718

In

addition the demineralized dentin treated with PA-based agents decreased collagenase degradation

increasing mechanical properties and reducing water absorption1920

Recently a study showed that

PA was able to inactivate more than 89 of the total active MMPs in dentin21

Whereas the effect of Cranberry and Proanthocyanidin might favor the reduction of dentin

erosion the aim of this in vitro study is to evaluate the role of different gel concentrations of Cranberry

extract and Proanthocyanidin-rich extract on preventing dentin erosion

2 MATERIAL AND METHODS

21 Experimental design

This in vitro study evaluated the effect of Cranberry and Proanthocyanidin gels applied on

150 dentin specimens randomly and equally divided among 10 groups [G1 0012 chlorhexidine gel

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6

3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114

4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8

5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
Page 66: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE … · ... na próxima trataria de cometer mais erros. Não tentaria ser ... não percam o agora. Eu era um daqueles que nunca ia a parte

Apecircndice 77

G2 placebo gel (no active agent) G3 005 Cranberry gel G4 1 Cranberry gel G5 5 Cranberry

gel G6 10 Cranberry gel G7 005 Proanthocyanidin gel G8 1 Proanthocyanidin gel G9 5

Proanthocyanidin gel and G10 10 Proanthocyanidin gel] The erosive challenge was conducted for

5 days The response variable was depth of wear (surface loss) measured by means of profilometry

22 Sample Preparation

Two hundred root dentin specimens (4 X 4 X 3 mm) were prepared from extracted bovine

incisors as reported in previous studies2223

Specimens were selected and allocated to groups

according to surface hardness (Knoop diamond 25 g 10 sec HMV-2000 Shimadzu Corporation

Tokyo Japan) and stratified randomization

23 Treatment and erosive cycling

The gels from different groups were applied over specimens one time before the first erosive

challenge for 5 minutes All gel formulations presented essentially the same composition9 except for

the active vehicle of each group [0012 Chlorhexidine Cranberry (Shaanxi MR Natural Product

CoLtd) and Proanthocyanidin (95 proanthocyanidin Changsha NutraMax Inc)] Specimens were

subjected to 3 sequential erosive cycles per day during 5 days Each cycle consisted of the

immersion of the specimens in cola drink (176 mL per sample) for 5 minutes at 25ordmC under constant

motion followed by rinsing with deionized water (20s) and immersion in artificial saliva (176 mL per

sample) for 2 h At the end of each day the samples were stored overnight (15 hours) in artificial

saliva24

24 Profilometric Analysis

The dentin samples were maintained wet until the analysis to avoid shrinkage of the organic

layer Immediately before the profilometric measurement only the excess of water was carefully

removed with filter paper Prior to treatment identification marks were made on the sample surfaces

using a scalpel which allowed for accurate repositioning of the stylus Subsequently five baseline

surface profiles were obtained from all the samples using a profilometer (MarSurf GD 25 Goumlttingen

Germany) at certain distances from the edge 225 20 175 15 and 125 microm The marks and two

external thirds of the dentin surface were covered with nail varnish in order to allow reference surfaces

for wear analysis After five days of erosive cycling the nail varnish was removed and profilometric

analysis was performed again at the same sites as the baseline measurements The dentin loss was

quantitatively determined using specific software (MarSurf XCR 20 Goumlttingen Germany) by

calculating the average depth of the eroded surface relative to the baseline surface profiles Since the

dentin samples could be precisely repositioned in the wells of the profilometer it was possible to

match the respective baseline and final profiles

25 Statistical Analysis

The groups were compared using One Way Analysis of Variance (ANOVA) followed by

Fishers test The level of significance was set at 5

3 RESULTS

The mean wear data of the studied groups are shown in Table 1 The statistical analysis

revealed that 005 Cranberry gel (G3) and 10 Proanthocyanidin gel (G10) promoted similar

prevention against dentin loss when compared to 0012 chlorhexidine (G1) the positive control In

addition these groups showed lower dentin loss when compared to all other evaluated groups

Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6

3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114

4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8

5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
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Apecircndice 78

(plt005) Negative control group (G2) showed the significantly highest dentin loss among the studied

groups (plt005)

Table 1 - Mean (plusmnSD) of dentin loss (microm) for the studied groups

GROUPS MEAN plusmn SD

G1- 0012 Chlorhexidine Gel 156 plusmn 24b

G2- Placebo Gel 231 plusmn 14e

G3- 005 Cranberry Gel 151 plusmn 23b

G4- 1 Cranberry Gel 204 plusmn 19cd

G5- 5 Cranberry Gel 190 plusmn 21ac

G6- 10 Cranberry Gel 187 plusmn 14a

G7- 005 Proanthocyanidin Gel 182 plusmn 16a

G8- 1 Proanthocyanidin Gel 211 plusmn 12d

G9- 5 Proanthocyanidin Gel 192 plusmn 26ac

G10- 10 Proanthocyanidin Gel 152 plusmn 25b

Different letters mean statistical differences between groups (ANOVA and Fisherrsquos Test plt005)

4 DISCUSSION

Protease inhibitors have been studied for dentin erosion therapy in different vehicles such

as rinsing solutions or gels for topical application Rinsing solutions are for home use by patients

however their application is not practical since it is necessary to rinse the solutions immediately after

each erosive challenge On the other hand gels are for professional use presuming no need for

frequent application In the present study different concentrations of Cranberry and proanthocyanidin

were tested as gels with single application before an erosive challenge of 5 days In gastro-

esophageal reflux patients the pH drops below 55 for 43 minutes during 24 hours25

Thus an erosive

time of about 4 minutes with HCl (pH 30) might simulate one day of erosion on a clinical situation

When extrapolating this simulation to the present cycling protocol even knowing that cola drink (pH

24) is an extrinsic acid the dentin was subjected to erosion for 75 minutes (3 x 5 min x 5 days) which

might simulate 18 or more in vivo days All the tested gels were able to minimize dentin wear during

the studied period However on future studies it is important to evaluate how long the gels protective

effect lasts for predicting the time need for professional reapplication

The gels containing progressive concentrations of Cranberry and proanthocyanidin did not

show a dose-response effect The Cranberry gel with the lowest (005) and the proanthocyanidin gel

with the highest concentration (10) promoted statistically less dentin wear compared to the other

studied concentrations Independently of concentration the results reported here indicate that the use

of Cranberry and proanthocyanidin that are known for their ability to inhibit catalytic activity of MMP 1

and 9 in periodontal disease for instance15

was effective in the reduction of dentin erosion This effect

might be due to the preservation of the demineralised organic matrix itself26

In addition none of the

studied gels were able to prevent dentin wear occurrence suggesting that they do not present action

on the de- and remineralization process26

Fluoride gel was not used as control because fluoride can promote the formation of a CaF2 ndash

like layer or an acid-resistant coating of metal-rich surface27

and in the study reported here the focus

was on assessing compounds only with the ability to inhibit collagenolytic enzymes There is some

evidence9-12

that the gel containing 123 NaF can reduce demineralized organic matrix degradation

although Ganss et al28

found that the matrix per se does not influence the mode of action of the active

ingredients in fluoridated toothpastes Taking these aspects into account chlorhexidine was used as

positive control since there are studies showing indirect and direct inhibition of MMP by prevention of

erosive dentin loss and inhibition of dentin matrix degradation respectively910

The effect on dentin

Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6

3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114

4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8

5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
  • APEcircNDICE
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Apecircndice 79

wear reduction of 005 Cranberry and 10 Proanthocyanidin was around 35 which was similar to

0012 Chlorhexidine Rinses with Chlorhexidine also reduced dentin wear around 30-4023

Before

Cranberry and proanthocyanidin can be considered for dentin erosion treatment further research is

necessary to address their ability to inhibit demineralized organic matrix degradation using molecular

studies

5 CONCLUSION

Results showed significant efficacy of Cranberry and Proanthocyanidin gels in preventing

wear of dentin subjected to dental erosion in vitro suggesting possible MMPs inhibitory effect during

dentin erosion

REFERENCES

1 Ganss C Lussi A Schlueter N The histological features and physical properties of eroded dental hard tissues Monographs in oral science 20142599-107

2 Buzalaf MA Kato MT Hannas AR The role of matrix metalloproteinases in dental erosion Advances in dental research 201224(2)72-6

3 Buzalaf MA Pessan JP Honorio HM ten Cate JM Mechanisms of action of fluoride for caries control Monographs in oral science 20112297-114

4 Hara AT Ando M Cury JA Serra MC Gonzalez-Cabezas C Zero DT Influence of the organic matrix on root dentine erosion by citric acid Caries research 200539(2)134-8

5 Ganss C Klimek J Starck C Quantitative analysis of the impact of the organic matrix on the fluoride effect on erosion progression in human dentine using longitudinal microradiography Archives of oral biology 200449(11)931-5

6 Schlueter N Hardt M Klimek J Ganss C Influence of the digestive enzymes trypsin and pepsin in vitro on the progression of erosion in dentine Archives of oral biology 201055(4)294-9

7 Tjaderhane L Larjava H Sorsa T Uitto VJ Larmas M Salo T The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions Journal of dental research 199877(8)1622-9

8 Vidal CM Tjaderhane L Scaffa PM Tersariol IL Pashley D Nader HB et al Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin Journal of dental research 201493(3)269-74

9 Kato MT Leite AL Hannas AR Buzalaf MA Gels containing MMP inhibitors prevent dental erosion in situ Journal of dental research 201089(5)468-72

10 Kato MT Leite AL Hannas AR Calabria MP Magalhaes AC Pereira JC et al Impact of protease inhibitors on dentin matrix degradation by collagenase Journal of dental research 201291(12)1119-23

11 Kato MT Leite AL Hannas AR Oliveira RC Pereira JC Tjaderhane L et al Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion Caries research 201044(3)309-16

12 Kato MT Magalhaes AC Rios D Hannas AR Attin T Buzalaf MA Protective effect of green tea on dentin erosion and abrasion Journal of applied oral science revista FOB 200917(6)560-4

13 Deacuteziel BA Patel K Neto C Gottschall-Pass K Hurta RA Proanthocyanidins from the American Cranberry (Vaccinium macrocarpon) inhibit matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 activity in human prostate cancer cells via alterations in multiple cellular signalling pathways Journal of cellular biochemistry 2010111(3)742-54

14 Kondo M MacKinnon SL Craft CC Matchett MD Hurta RA Neto CC Ursolic acid and its esters occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells Journal of the science of food and agriculture 201191(5)789-96

Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
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  • ABSTRACT
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  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
  • 7 CONCLUSAtildeO
  • REFEREcircNCIAS
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Apecircndice 80

15 La VD Howell AB Grenier D Cranberry proanthocyanidins inhibit MMP production and activity Journal of dental research 200988(7)627-32

16 Ruel G Pomerleau S Couture P Lemieux S Lamarche B Couillard C Plasma matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels are reduced following low-calorie Cranberry juice supplementation in men Journal of the American College of Nutrition 200928(6)694-701

17 Liu RR Fang M Zhang L Tang CF Dou Q Chen JH Anti-proteolytic capacity and bonding durability of proanthocyanidin-biomodified demineralized dentin matrix International journal of oral science 20146(3)168-74

18 Nagpal R Manuja N Pandit IK Effect of proanthocyanidin treatment on the bonding effectiveness of adhesive restorations in pulp chamber The Journal of clinical pediatric dentistry 201338(1)49-53

19 Castellan CS Bedran-Russo AK Karol S Pereira PN Long-term stability of dentin matrix following treatment with various natural collagen cross-linkers Journal of the mechanical behavior of biomedical materials 20114(7)1343-50

20 Castellan CS Pereira PN Grande RH Bedran-Russo AK Mechanical characterization of proanthocyanidin-dentin matrix interaction Dental materials official publication of the Academy of Dental Materials 201026(10)968-73

21 Scheffel DL Hebling J Scheffel RH Agee K Turco G de Souza Costa CA et al Inactivation of matrix-bound matrix metalloproteinases by cross-linking agents in acid-etched dentin Operative dentistry 201439(2)152-8

22 Magalhaes AC Rios D Moino AL Wiegand A Attin T Buzalaf MA Effect of different concentrations of fluoride in dentifrices on dentin erosion subjected or not to abrasion in situex vivo Caries research 200842(2)112-6

23 Magalhaes AC Wiegand A Rios D Hannas A Attin T Buzalaf MA Chlorhexidine and green tea extract reduce dentin erosion and abrasion in situ Journal of dentistry 200937(12)994-8

24 Attin T Zirkel C Hellwig E Brushing abrasion of eroded dentin after application of sodium fluoride solutions Caries research 199832(5)344-50

25 Bartlett DW Evans DF Anggiansah A Smith BG A study of the association between gastro-oesophageal reflux and palatal dental erosion British dental journal 1996181(4)125-31

26 Buzalaf MA Magalhaes AC Wiegand A Alternatives to fluoride in the prevention and treatment of dental erosion Monographs in oral science 201425244-52

27 Huysmans MC Young A Ganss C The role of fluoride in erosion therapy Monographs in oral science 201425230-43

28 Ganss C Klimek J Schlueter N Erosionabrasion-preventing potential of NaF and FSnchitosan toothpastes in dentine and impact of the organic matrix Caries research 201448(2)163-9

  • CAPA
  • DEDICATOacuteRIA E AGRADECIMENTOS
  • RESUMO
  • ABSTRACT
  • SUMAacuteRIO
  • 1 INTRODUCcedilAtildeO
  • 2 REVISAtildeO DE LITERATURA
  • 3 PROPOSICcedilAtildeO
  • 4 MATERIAL E MEacuteTODOS
  • 5 RESULTADOS
  • 6 DISCUSSAtildeO
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