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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
AGNES DA SILVA LOPES OLIVEIRA
ANÁLISE DO HIPOCAMPO DURANTE A GÊNESE E DIFERENCIAÇÃO NEURAL
EM RATOS PROGRAMADOS PELA RESTRIÇÃO PROTEICA IN ÚTERO: ESTUDO
MOLECULAR DOS SUBCAMPOS ISOLADOS POR MICRODISSECÇÃO A LASER
CAMPINAS
2017
AGNES DA SILVA LOPES OLIVEIRA
ANÁLISE DO HIPOCAMPO DURANTE A GÊNESE E DIFERENCIAÇÃO NEURAL
EM RATOS PROGRAMADOS PELA RESTRIÇÃO PROTEICA IN ÚTERO: ESTUDO
MOLECULAR DOS SUBCAMPOS ISOLADOS POR MICRODISSECÇÃO A LASER
.
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. José Antônio Rocha Gontijo
Co-orientadora: Profa. Dra. Patrícia Aline Boer
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA: AGNES DA SILVA LOPES OLIVEIRA, E ORIENTADO PELO PROF. DR. JOSÉ ANTÔNIO ROCHA GONTIJO.
CAMPINAS
2017
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
AGNES DA SILVA LOPES OLIVEIRA
ORIENTADOR: José Antônio Rocha Gontijo
COORIENTADOR: Patrícia Aline Boer
MEMBROS:
1. PROF. DR. José Antônio Rocha Gontijo
2. PROF. DR. Rovena Clara Galvão Januário Engelberth
3. PROF. DR. Cleiton Lopes Aguiar
4. PROF. DR. Amilton dos Santos Júnior
5. PROF. DR. Paulo Dalgalarrondo
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: 28/07/2017
Dedicatória: Á minha família:
Pai, Mãe e irmão, por todo o apoio, carinho e ajuda, por me encorajar
nos momentos mais difíceis e sempre me incentivar.
Ao meu esposo, por todo amor e cuidado, por ser meu companheiro e
parceiro em todos os momentos, meu grande amor e incentivador!
Ao meu filho Arthur, que mesmo ainda não entendendo a dimensão
deste trabalho, foi e sempre será a minha grande motivação.
Agradecimentos
Ao meu Deus, por todo cuidado, por ter me permitido chegar até aqui e
ter me sustendo durante esta jornada.
Aos meus orientadores, Drª Patrícia Aline Boer e Dr. José Antonio
Rocha Gontijo. Vocês são espetaculares! Obrigada pela amizade, carinho
e compreensão em todos os momentos.
Ao Dr. André Vieira pela enorme contribuição neste trabalho
ensinando a técnica de microdissecção a laser e PCR.
A todos os alunos do Laboratório de Metabolismo Hidrossalino –
UNICAMP, pela pareceria de trabalho neste período. A Ize, que sempre
esteve pronta a ajudar.
A Helô, por toda atenção e prontidão em ajudar em todas as minhas
dúvidas teóricas e práticas. A Thaís, além de cunhada foi também
minha companheira de viagens nestes últimos dois anos, obrigada pela
parceria!
A Dani, minha amiga que a pós-graduação trouxe. Já são quase 10
anos... e agora mesmo a muitos km de distância ainda continua sendo
parceira! Obrigada por todo apoio na parte prática, intelectual e
principalmente emocional...Levarei sua amizade pela vida toda!
Ao Marco e Rosângela, que me adotaram como filha, obrigada pelo
apoio e por sempre me encorajar nos momentos mais difíceis.
Ás minhas cunhadas e cunhados, que são como irmãos, muito obrigada
pelo carinho.
Aos meus maravilhosos sobrinhos: Yasmin, Pedro Henrique, João
Guilherme e Maria Heloísa vocês são as pedrinhas preciosas em minha
vida.
A CAPES e FAPESP pelo auxílio financeiro.
Á todos os demais amigos, colegas e parentes aqui não mencionados, mas
que foram de grande importância ao me apoiarem nesta jornada.
RESUMO
Há diversas razões pelas quais têm se buscado o melhor entendimento de alterações
causadas pela programação fetal. Entre estas emerge o fato de que estas alterações
têm apresentado repercussões evidentes sobre a saúde de populações. Isto se deve
a manifestação de alterações no desenvolvimento ontogenético, vinculadas à
manifestação programada do desenvolvimento morfológico e funcional de órgãos e
sistemas. Considerando o fato de que o desenvolvimento estrutural do cérebro se
inicia nos primeiros dias do período embrionário e se estende durante os anos iniciais
de vida extrauterina, alterações durante períodos críticos do desenvolvimento pré- e
pós-natal podem ser altamente prejudiciais para o desenvolvimento desta estrutura.
O hipocampo é uma estrutura alvo para diversas alterações provenientes do ambiente
materno. Estudos têm mostrado que alterações durante o período pré-natal tiveram
influência sobre a neurogênese no hipocampo imaturo, bem como sobre a
remodelação de dendritos da região CA3, com possíveis repercussões
neurocognitivas. Adicionalmente, diferentes sistemas de neurotransmissores, bem
como alterações epigenéticas de moduladores do desenvolvimento neural, podem
estar implicados na causa ou consequência desta programação. Para tanto, é
importante conhecer quais períodos exatos nos quais o cérebro é susceptível a estas
influencias e qual a repercussão destes fatores sobre a estrutura hipocampal. Assim,
este trabalho teve como objetivo, avaliar os efeitos da restrição proteica materna sobre
a expressão de genes envolvidos no processo de diferenciação das sub-regiões
hipocampais bem como o número de células totais e neurônios em hipocampo de
ratos machos com 14 e 40 dias pós-natal. Ratas Wistar foram submetidas a dieta
hipoproteica durante toda a gestação. A prole de machos com 14 e 40 dias de vida
foram estudadas analisando-se as expressões de genes nos subcampos hipocampais
(CA1, CA3 e GD) associando possíveis alterações nestas áreas á respostas
encontradas nos modelos de restrição proteica gestacional comparadas àquelas
observadas em um grupo controle de mesma idade. Nossos resultados mostraram
que animais com 14 dias de vida, submetidos à restrição proteica gestacional
mostraram uma diminuição significativa na expressão de DCX no GD e em CA3,
5HT1A no GD e em CA1 e, aumento significativo de MR em CA3; além disso,
diminuição destes receptores no GD, associado a uma elevação de CDKN1C em CA1,
bem como de AT4 em CA1 e AT1 em CA3. Já com 40 dias observamos elevação
significativa da DCX no GD associada a diminuição de SOX nesta mesma região. Tais
resultados sugerem que o desenvolvimento de circuitos neuronais no hipocampo está
associado com a expressão distinta de genes nas diferentes regiões anatómicas do
hipocampo. Também, que a sequência de eventos incluindo proliferação celular,
migração e diferenciação estão associadas a esta expressão genica distinta. Além
disso, os danos morfológicos e funcionais hipocampais precoces, provenientes da
restrição proteica gestacional, podem estar relacionados a danos estruturais
temporários. Estes, entretanto, parecem ser revertidos por modificações na expressão
gênica que modulam a produção de proteínas e neurotransmissores envolvidos na
recuperação celular destas áreas cognitivas do hipocampo.
Palavras-chave: Desenvolvimento Fetal, Hipocampo, Neurogênese
ABSTRACT
There are several reasons why the best understanding of the changes caused by fetal
programming has been sought. Among these emerges the fact that these changes
have had evident repercussions on the health of populations. This is due to the
manifestation of changes in ontogenetic development, linked to the programmed
manifestation of the morphological and functional development of organs and systems.
Considering the fact that the brain structural development begins early during the
embryonic period and extends during the first years of extrauterine life, changes during
critical periods of pre- and postnatal development can be highly detrimental to the brain
development. The hippocampus is a target structure for several changes due maternal
environment. Studies have shown that changes during the prenatal period had
influence on neurogenesis in the immature hippocampus, as well as on the CA3 region
dendrites remodeling, with possible neurocognitive repercussions. In addition, different
neurotransmitter systems, as well as epigenetic alterations of neural development
modulators, may be implicated in the cause or consequence of this programming.
Therefore, it is important to know the exact periods in which the brain is susceptible to
these influences and the possible repercussions of these factors on the hippocampal
structure. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effects of maternal
protein restriction on the expression of genes involved in hippocampal sub regions’
differentiation process and on the number of total cells and neurons in hippocampus
of male rats at 14 and 40 days postnatal. Female Wistar rats were submitted to a low-
protein diet during the entire pregnancy. We evaluated the gene expression in the
hippocampal sub-regions (CA1, CA3, and DG) on male offspring with 14 and 40 days
of age, associating the alterations in these areas to the responses found in the
gestational protein restriction model compared to those observed in the matched
control group. Our results showed that 14-days-old animals submitted to gestational
protein restriction had significant decreased expression of DCX gene on DG and CA3
regions, decreased expression of 5HT1A on DG and CA1 regions and had a significant
increased expression of MR on CA3 region. Also, these animals had decreased
expression of 5HT1A and MR on DG and increased expression of CDKN1C on CA1
region, increased expression of AT4 on CA1 regions and increased expression of AT1
on CA3 region. 40-days-old animals had increased expression of DCX and decreased
expression of SOX on DG region. These results suggest that the hippocampal neuronal
circuits’ development is associated with the distinct genes expression in each
hippocampus anatomical regions. The sequence of events including cell proliferation,
migration and differentiation are also associated with these distinct genes expression.
Furthermore, early morphological and functional hippocampal damage due gestational
protein restriction may be related to temporary structural damage. However, these
temporary structural damages appear to be reversed by modifications in expression of
genes that modulate proteins and neurotransmitters synthesis involved in cellular
recovery of these hippocampal cognitive areas.
Keywords: Fetal Development, Hippocampus, Neurogenesis
Lista de Abreviaturas
ACTH- Hormônio adrenocorticotrófico
AT1R- Receptor de angiotensina II
AT2R- Receptor de angiotensina II
AT4- Receptor de angiotensina IV
Angio II- Angiotensina II
CRF- Fator liberador de corticotrofina
CA3- Corno de Amon 3
CA1- Corno de Amon 1
CDK- Ciclina dependente kinase
CA- Corno de Amon
DOHaD- Origem desenvolvimentista da saúde e da doença
DCX- Doublecortina
GR- Receptores de glicocorticóides
GD- Giro denteado
GC- Glicocorticóides
HHPA- Eixo hipocampo-hipotálamo-pituitária-adrenal
MR- Receptores de mineralocorticóides
MCL- Microdissecção e Captura a laser
MAP- Proteína associada a Microtúbulos
NP- Normal protein
NPCs- Células tronco neuronais
LTP- Potenciação de longa duração
LP- Low protein
SNC- Sistema Nervoso Central
SGZ- Zona Subventricular
SRA- Sistema Renina Angiotensina
5-HT- Serotonina
5-HT1A- Receptor de Serotonina 1A
11β HSD2- 11 beta-hidroxiesteróide- desidrogenase tipo 2
Lista de Figuras
Figura 1 Esquema representativo da função da 11ΒHSD2 placentária............ 15
Figura 2 Curva de desenvolvimento do SNC. .................................................. 18
Figura 3 Divisão funcional do hipocampo. ........................................................ 19
Figura 4 Análise da evolução do peso ............................................................. 34
Figura 5 Distância ano-genital dos machos. ..................................................... 34
Figura 6 Peso dos animais com 14 e 40 dias. .................................................. 35
Figura 7 Análise da massa do cérebro/massa corporal 14 e 40 dias ............... 35
Figura 8 Análise da massa do hipocampo 14 e 40 dias ................................... 36
Figura 9 Análise da massa do hipocampo/massa do cérebro 14 e 40 dias...... 36
Figura 10 Análise da massa do hipocampo/animal 14 e 40 dias ...................... 36
Figura 11 Análise da expressão gênica em CA1 .............................................. 37
Figura 12 Análise da expressão gênica em CA3 .............................................. 38
Figura 13 Análise da expressão gênica no GD ................................................ 39
Figura 14 Imunoístoquimica de GR – CA1 (14 DIAS) ...................................... 41
Figura 15 Imunoístoquimica de MR – CA3 e GD (14 DIAS) ............................. 42
Figura 16 Imunoístoquimica de DCX – CA3 e GD (14 DIAS) ........................... 42
Figura 17 Imunoístoquimica de DCX – GD, CA1 e CA3 (40 DIAS) .................. 43
Figura 18 Porcentagem de neurônios e outros tipos celulares 14 dias ............ 44
Figura 19 Porcentagem de neurônios e outros tipos celulares 40 dias ............ 44
Figura 20 Hipótese sobre a determinação das células hipocampais ............... 47
Figura 21 Esquema representando a maturação neuronal do GD ................... 48
Sumário
1.Introdução ..................................................................................................... 15
1.1 Mecanismos envolvidos na gênese da programação fetal ................... 15
1.2 Corticosteróides e seus receptores neurais ......................................... 16
1.3 Formação hipocampal e programação fetal ......................................... 18
1.4 Neurogênese hipocampal .................................................................... 21
1.5 Angiotensina e seus receptores neurais .............................................. 23
2. Justificativa e Objetivos ................................................................................ 25
3. Materiais e Métodos ..................................................................................... 27
2.1 Acasalamento e divisão dos grupos experimentais ............................. 27
3.2 Microdissecções a Laser ...................................................................... 28
3.3 Extrações de RNA total para análises de expressão gênica ................ 29
3.4 Análises da quantidade, qualidade e integridade do RNA total ........... 30
3.5 Sínteses de cDNA para avaliação de expressão de mRNAs ............... 30
3.6 RT-qPCR para avaliação da expressão dos mRNAs ........................... 31
3.7 Imunoistoquimica ................................................................................. 31
3.8 Fracionamento Isotrópico ..................................................................... 32
3.9 Análise Estatística ................................................................................ 33
4. Resultados ................................................................................................... 34
5. Discussão ..................................................................................................... 45
6. Conclusão .................................................................................................... 53
7. Referências Bibliográficas ............................................................................ 56
8. Anexos ......................................................................................................... 73
15
1. INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, um conjunto crescente de evidências tem sustentado a hipótese
de que distúrbios ocorridos em períodos críticos do desenvolvimento fetal podem
determinar alterações permanentes ou em longo prazo na fisiologia ou morfologia de
um determinado órgão (Ashton, 2000). Estas alterações caracterizam o conceito
conhecido como programação fetal, através do qual o feto pode ser programado
durante o desenvolvimento intrauterino para sobreviver a um ambiente adverso,
entretanto, exposto a circunstâncias pós-natais diversas, acabam por desenvolver
doenças na idade adulta (Barker, 1995). A exposição à desnutrição materna tem sido
o modelo mais extensamente estudado de programação fetal e, é utilizado para
entender a origem de algumas doenças na idade adulta (Langley-Evans, 1997;
Edwards et al., 2001). De acordo com essa teoria, alterações no estado nutricional
das mães promovem uma significativa redução da massa corporal fetal ao nascer,
elevando o risco de diabetes, doença cardiovascular e obesidade na vida adulta
(Langley-Evans, 1997). Autores têm demonstrado que a desnutrição durante a
gestação e/ou lactação promove o desenvolvimento de um fenótipo econômico na
prole adulta (Budge et al., 2005; Halles, 2001).
Sabe-se que o desenvolvimento estrutural do cérebro não é concluído no período
intrauterino, se estendendo para as primeiras fases da vida. Assim, alterações na
composição dietética durante períodos críticos do desenvolvimento pré- e pós-natal
podem modificar o desenvolvimento cerebral. Tais efeitos podem ser mediados por
alterações estruturais e funcionais, podendo promover diversos danos na idade
adulta, entre os quais, alterações metabólicas, cardiovasculares, distúrbios
neuropsiquiátricos e déficits cognitivos (Pistell et al., 2010).
Diversos agentes como fatores de crescimento, de transcrição e nutrientes podem
afetar permanentemente o desenvolvimento neural (Welberg e Seckl, 2001).
Particularmente os esteroides têm propriedades poderosas na programação neural
(Matsumoto e Arai, 1997).
1.1 Mecanismos envolvidos na gênese da programação fetal
Dentre os mecanismos envolvidos aquele mais estudado envolve a
superexposição fetal a elevadas concentrações de glicocorticoides maternos (Dodic
16
et al, 2002, Seckl, 1997, 2001). Em situação fisiológica, a concentração de
glicocorticoides fetal é menor que a materna. Isso ocorre devido a ação de uma
enzima placentária 11-β hidróxiesteroide desidrogenase tipo 2 (11β-HSD-2). Esta
enzima é responsável por catalisar a conversão do esteroide bioativo (corticosterona)
em seu metabólito inativo, 11-deidrocorticosterona, evitando assim que o feto fique
exposto aos níveis plasmáticos de corticoides maternos. Estudos demonstram que
animais expostos à restrição proteica pré-natal apresentam uma significativa redução
na atividade desta enzima no período final da gestação levando ao aumento da
transferência dos glicocorticoides maternos para o feto (Edwards et al, 1993, Seckl,
1994). Assim, a atividade da 11-βHSD-2 tem sido relacionada com a massa ponderal
fetal em ratos e em humanos.
Figura 1. Esquema representativo da função da 11-βHSD-2 placentária inativando os glicocorticoides
provenientes da circulação materna, garantindo a proteção do feto dos altos níveis de glicocorticoides
(adaptado de Drake et al, 2007)
Em humanos, a elevação dos níveis séricos de cortisol durante a gestação,
está relacionada ao aumento da incidência de desordens comportamentais durante a
infância. (King e Laplante, 2005; Laplante et al., 2004). Além disso, o baixo peso ao
nascer está associado à elevação dos níveis de cortisol no adulto, contribuindo para
o aumento do risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares bem como
hipertensão na vida adulta. (Kajantie et al., 2005; Syddall et al., 2005).
1.2 Corticosteroides e seus receptores neurais
A glândula adrenal é a principal fonte de produção de corticosteroides isto é:
cortisol, corticosterona e aldosterona. Como todos os hormônios esteroides, estas
17
moléculas de pequeno peso molecular (~300Da) são derivadas do colesterol e da
pregnolona após uma série de conversões enzimáticas (Appelezweig, 1969). A
síntese e secreção de cortisol (em humanos) e corticosterona (em roedores) é
modulada pela secreção do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), liberado pela
hipófise anterior, e cuja síntese e secreção são controladas pelo fator liberador de
corticotrofina (CRF) hipotalâmico (Whitnall, 1993). O controle da liberação de
corticosteroide pelo córtex da adrenal é complementado pelo mecanismo de
retroalimentação (feedback) negativo via receptores hipofisários, hipotalâmicos
(Whitnall, 1993) e hipocampais (Jacobson e Sapolsky, 1991; Knigge e Hays, 1963).
Os corticosteroides acessam facilmente o cérebro (McEwen et al, 1986). Sua
ação é mediada por receptores mineralo- (MR) e glicocorticoides (GR). Estes
receptores são membros da família de receptores nucleares de esteroides. Quando
dissociados de seus ligantes podem ser encontrados tanto no citosol quanto no núcleo
celular e, quando associados aos seus ligantes são transportados para o núcleo onde
se associam a proteínas co-ativadoras e liga-se a elementos de resposta a hormônio
(HRE), reprimindo ou ativando promotores da transcrição gênica (Galigniana et al,
2010). A afinidade do GR por cortisol e corticosterona é aproximadamente um décimo
da afinidade de MR para estes esteroides. Dessa forma, os MR são
predominantemente ocupados em períodos de baixa concentração de
corticosteroides, enquanto os GR só são ocupados quando ocorre aumento na
concentração deste hormônio (p.e., durante estresse ou condições patológicas) (de
Kloet, 1999; Joels e de Kloet, 1994; Joels et al, 1995; Reul e de Kloet, 1985).
Embora os GRs estejam presentes em diversas estruturas neurais existem, em
maior concentração no hipocampo, hipotálamo e tronco cerebral (Ahima e Harlan,
1991; Cintra et al, 1994; Fuxe et al, 1985). Já os MRs ocorrem somente no hipocampo
e em outras estruturas límbicas como amígdala medial, núcleos olfatórios e alguns
núcleos hipotalâmicos (Ahima et al, 1991; Van Eekelen, 1988).
O EGR-1 (Early growth response protein 1), é um fator de transcrição também
conhecido como Zif268 (zinc finger protein 225) ou NGFI-A (nerve growth factor-
induced protein A) é uma proteína nuclear codificada pelo gene EGR1. Fundamental
para a diferenciação, proliferação, plasticidade neuronal e exocitose sináptica, esta
18
proteína é expressa de forma heterogênea em diferentes regiões do cérebro, incluindo
hipocampo (Knapska e Kaczmarek, 2004).
1.3 Formação hipocampal e programação fetal
A formação hipocampal é um componente essencial do sistema límbico,
exercendo papel crucial nos processos de aprendizagem e memória, e apresentando
grande capacidade de plasticidade sináptica (Kim & Diamond, 2002).
Em seres humanos, o período de maior vulnerabilidade do SNC ocorre a partir do
segundo trimestre de gestação estendendo-se até o segundo ano de vida (Dobbing &
Sands, 1971). Em roedores, esta fase compreende do nascimento até a terceira
semana de vida, quando ocorre o desenvolvimento do hipocampo e cerebelo
(Morgane et al., 1993). No entanto, entre os dias 17 a 22 do período embrionário,
durante a ontogênese, já ocorre formação e organização de neurônios hipocampais
específicos (Bayer, 1980). Apenas 20% das células granulares hipocampais estão
presentes no rato ao nascer sendo que a neurogênese do GD (giro denteado) continua
até a fase adulta, porém com uma taxa cada vez menor ao longo do tempo (Altman &
Das, 1965).
19
Figura 2. Curvas de desenvolvimento do SNC em humanos e ratos (extraído de Morgane et al,
2002)
Anatomicamente, o hipocampo de mamíferos é composto de sub-regiões
distintas, com diversidade de forma e tamanho celular, conectividade, propriedades
eletrofisiológicas e susceptibilidade a insultos (Amaral, 1990; Storm-Mathisen et al
1990): o giro denteado (GD) e o Corno Ammonis (CA) (Scharfman, 2007). Ambas
regiões são estruturadas em camadas. A principal camada do GD é a camada granular
e do CA é a camada piramidal (Altman & Bayer, 1963)
Funcionalmente, o hipocampo pode ser dividido em duas regiões diferentes: o
hipocampo ventral e o dorsal. Enquanto a porção ventral está implicada primariamente
ao processamento emocional, a dorsal está ligada principalmente à memória e ao
aprendizado (Bannerman et al., 2004)
20
Figura 3. Divisão funcional do hipocampo (a) dorsal e (b) ventral (adaptado de Van den Hove et al,
2006)
Experimentos em roedores tem constituído a base para numerosas teorias
sobre o processamento da memória no hipocampo devido a notável similaridade
estrutural e funcional entre o hipocampo de humanos e roedores. (Nissinem et al,
2000)
Como já citado acima se trata de uma região que é alvo preferencial da ação
dos hormônios envolvidos na resposta ao estresse, e através da sua ação, esta área
cerebral é parte integrante do mecanismo de retroalimentação negativa no eixo HHPA.
(McEwen, 1999)
Tanto o estresse como a exposição aos glicocorticoides em uma fase inicial da
vida, têm sido associados a danos na aprendizagem e na memória (Huot et al., 2002),
bem como à atrofia do hipocampo. A plasticidade dos circuitos do hipocampo,
necessária para as suas funções na aprendizagem e memória, pode aumentar a sua
vulnerabilidade a várias agressões ambientais, incluindo situações de estresse (Aisa
et al., 2006).
Diversos estudos demonstram que perturbações ocorridas durante o
desenvolvimento do SNC causam graves alterações neurais fisiológicas e
morfológicas (Huang et al., 2003; Hoffmann et al., 2004, Hermel et al, 2001; Feoli et
al, 2006), além de alterações comportamentais (de Oliveira, 1985; Riul et al, 1999) e
atrasos em funções intelectuais e cognitivas (Barnes, 1976; Brozek, 1978, 1983;
Wainwright e Colombo, 2006).
Alterações nutricionais durante o período pré-natal têm influência sobre a neo-
neurogênese no hipocampo imaturo. Além disso, foram observados no hipocampo
atrofia de corpos neuronais, remodelamento dendrítico, além de morte neuronal e
gliose, especialmente nos dendritos apicais de CA3. Adicionalmente estes animais
21
apresentaram elevação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) e de corticosterona
circulante (Kehoe et al, 2001).
Tem sido sugerido que estes efeitos observados no hipocampo são
dependentes da ação de GC e da expressão de seus receptores, o que desencadearia
efeito em cascata alterando a produção de aminoácidos neuromoduladores que
participam da mediação neural à jusante do remodelamento dendrítico (Radley et al.,
2005).
Estudos recentes em nosso laboratório demonstraram que animais submetidos
somente a restrição proteica gestacional tiveram atrofia dos dendritos da região CA3
hipocampal (Lopes et al, 2013).
Adicionalmente, a exposição pré-natal a glicocorticoides influencia,
permanentemente, o desenvolvimento de sistemas de monoaminas e de outros
neurotransmissores (Muneoka Et Al., 1997; Slotkin et al., 1996), aumentando o risco
para alterações neurocomportamentais, bem como metabólicas e cardiovasculares
associadas a anormalidades de áreas específicas do sistema nervoso central (SNC).
Estas alterações centrais durante a ontogênese neural ainda são mal compreendidas.
1.4 Neurogênese Hipocampal
Em ratos, todos os principais neurônios das regiões CA são gerados no período
pré-natal (entre os dias 17 a 19). Os neurônios piramidais em CA1 e CA3 do
hipocampo tornam-se pós-mitóticos durante o desenvolvimento pós-natal precoce,
enquanto que as células granulares no giro dentado (DG) sofrem auto-renovação ao
longo da vida (Bayer, 1980a,b).
Após o nascimento, a neurogênese hipocampal (desde o nascimento até o
desmame, aproximadamente 21 dias) é necessária para o desenvolvimento total do
hipocampo (Altman & Bayer, 1990). Após este período de desenvolvimento, a matriz
estrutural do GD é formada, mas a zona subgranular (ZSG) do GD continua a gerar
novos neurônios ao longo da vida. A Doublecortina (DCX) é uma proteína endógena,
associada aos microtúbulos, importante para a migração neuronal (Plumpe et al,
2006), altamente expressa no início do desenvolvimento neuronal e diminui
gradualmente ao longo do desenvolvimento e na idade adulta. Adversidades durante
22
o período embrionário e inicio da vida pós-natal pode interromper esse padrão de
expressão ao longo da vida.
A ZSG do GD é uma região onde ocorre neurogênese ativa na idade adulta
(Gage, 2000). Os novos neurônios no adulto são originários de uma população de
células-tronco neuronais (NPCs) com características das células gliais, possuindo
corpos celulares na ZSG e processos radiais que se estendem para a camada celular
granular (CG) (Van Praag et al, 2002). Os neurônios gerados a partir de células
progenitoras neurais no hipocampo desempenham papel fundamental nos processos
de aprendizado e memória. O fator de transcrição SOX2 é um regulador de genes
ativados no início da diferenciação neuronal. Trata-se de um marcador de células-
tronco neural e sua função está associada com a pluripotência e auto-renovação das
células neurais (Alejandro et al, 2014). A superexpressão de SOX2 reprime a
diferenciação neuronal (Bani-Yaghoub M, et al. 2006) enquanto a baixa expressão
induz a saída do ciclo celular e a expressão de marcadores de diferenciação (Graham
et al, 2003).
Alguns estudos tem reportado o papel da serotonina como mediadora de
efeitos estruturais no cérebro durante o desenvolvimento e na idade adulta (Mazer et
al. 1997; Yan et al. 1997; Watanabe et al. 1992). Jacobs et al. (1998) verificaram que
a neurogênese no GD de mamíferos adultos é estimulada pela ativação de receptores
serotoninérgicos. A serotonina tem sido reconhecida por estimular a proliferação
celular (Fanburg e Lee 1997; Takuwa et al. 1989). O GD é uma região rica em
receptores 5HT1A (Azmitia et al. 1996). Um número considerável de evidências
sugere que 5HT pode estimular a produção de neurônios no GD. As condições
associadas à diminuição da produção das células granulares, como a desnutrição
(Debassio et al. 1996), envelhecimento (Kuhn et al., 1996; Gould et al.1999), altas
concentrações de corticosterona (Cameron e Gould, 1994), estresse (Gould et al.,
1997, 1998) e ativação do receptor NMDA (Cameron et al., 1995), também diminuem
a densidade de receptores 5HT1A, ou inibem a liberação de 5HT no GD (Blatt et al.
1994; Chalmers Et al. 1993; McKittrick et al. 1995; Nishimura et al. 1995).
Experimentos que estimulam a neurogenese, também levam ao aumento da
densidade de receptores 5HT1A ou a liberação de 5HT no GD (Hayakawa et al. 1994;
Burnet et al. 1995; Whitton et al. 1994; Kuroda et Al. 1994).
23
No desenvolvimento do SNC, existe uma variedade de mecanismos que
controlam a saída do ciclo celular encaminhando-se para o processo de diferenciação
durante a neurogênese. O inibidor de ciclina quinase independente (CDK) p57Kip2
controla a transição da proliferação para a diferenciação em muitos tecidos, inclusive
na região hipocampal. No sistema nervoso em desenvolvimento, a saída do ciclo
celular é acoplada à diferenciação neuronal (Ye et al, 2009). A proteína p57kip2 é
expressa em todo o eixo neural durante a neurogênese e exibe padrões especificos
de expressão de acordo com a região e com a idade (Smith, 2007).
Como demonstrado por Ji et al., (2005) em culturas de neurônios, o BDNF
apresenta uma ação modulatória sobre a diferenciação da arborização dendrítica
hipocampal evidenciada pelo aumento do número e espiculas dendríticas primárias
(Ji et al., 2005). Tem sido demonstrado que os níveis de BDNF no hipocampo eleva-
se progressivamente entre os dias 20 e 120 pós-natal, decrescendo gradualmente até
a idade adulta.
1.5 Angiotensina e seus receptores neurais
Um dos sistemas que pode ser alterado pela programação fetal é o sistema
renina-angiotensina (SRA). Componentes funcionais do SRA (angiotensinogênio,
peptidases, angiotensinas e proteínas receptoras específicas) foram descritos e têm
sido cada vez mais estudados expandindo o elenco das possíveis funções desse
sistema, onde a Ang II também pode ser considerada como neurotransmissor ou
neuromodulador ativando receptores AT1 e receptores AT2 em várias regiões do
encéfalo (Wright e Harding, 2013). Nesse contexto, estudos clínicos têm evidenciado
o envolvimento do SRA nas doenças relacionadas ao estresse (Yang et al., 1996).
Além disso, vem sendo proposto que o uso de bloqueadores de Ang II
(antagonistas de receptor AT1) tem efeitos neuroprotetores, não só por evitar os
efeitos neurotóxicos provocados pela Ang II, mas também pela sua interação com os
seus receptores de membrana e os mecanismos de transdução de sinal (Saavedra,
2011). O papel da Ang II no aprendizado e memória também tem sido investigado.
Alguns autores mostraram que a Ang II melhora a cognição (Belcheva et al., 2000;
Braszko, 2002) enquanto que outros pesquisadores mostraram que pode ter efeitos
amnésicos possivelmente associados à inibição da potenciação de longa duração
24
(LTP) no hipocampo (Denny et al., 1991) via receptor AT1 (Wayner et al., 1993). No
entanto, o efeito primeiramente atribuído à Ang II, em melhorar a memória, ocorreria
devido a sua metabolização e conversão em Ang IV (Braszko et al., 2006) já que a
ativação de receptores AT4, no hipocampo, aumentam a transmissão sináptica e a
LTP (Kramár et al., 39 2001). Além disso, a angiotensina II estimula a atividade
neuronal vasopressinérgica, que está associada à síntese de dopamina e
noradrenalina, e a processos comportamentais incluindo cognição (Gard, 2002).
25
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
Como citado anteriormente, a formação hipocampal é uma estrutura complexa
formada por diferentes subcampos: CA1, CA2, CA3, CA4 e GD (Duvernoy et al., 2005;
Insausti e Amaral, 2012). Embora ainda pouco conhecidas, tais regiões são distintas
quanto à função e composição celular, além de que as divisões anteroposteriores ao
longo do eixo horizontal do hipocampo, também diferem em relação as suas funções
relacionadas a aspectos emocionais, memória e aprendizagem. Tendo isto em conta,
este trabalho procurou definir de modo minucioso, a composição celular em
hipocampo total bem como a expressão gênica de diferentes sub-regiões. Com este
objetivo utilizamos a técnica de Microdissecção e Captura a Laser (MCL). Trata-se de
uma técnica desenvolvida em 1996, por pesquisadores do National Cancer Institute
dos EUA (Emmert-Buck et al, 1996) que tornou-se amplamente utilizada como uma
ferramenta na pesquisa biomédica, potencializando o uso de técnicas morfométricas
já existentes. A MCL permite a aquisição de populações puras de células ou tecidos
de determinadas regiões microscópicas. Possui reduzida probabilidade de
contaminação, por possuir baixo índice de manipulação o que evita problemas
relacionados à heterogeneidade do tecido (Emmert-Buck et al, 1996, Murray e Curran,
2005, Pietersen et al, 2011). As análises foram feitas em três diferentes regiões do
hipocampo: CA1, CA3 e GD no hipocampo dorsal.
Considerando o fato de que o desenvolvimento estrutural do cérebro começa
nos primeiros dias do período embrionário e se estende até as primeiras semanas e
os primeiros anos de vida, respectivamente, em roedores e seres humanos, as
mudanças no desenvolvimento perinatal (pré-natal e pós-natal precoce) podem ser
altamente adversos ao neurodesenvolvimento morfológico e funcional. Em ratos,
todos os principais neurônios das regiões CA tem origem no período pré-natal (entre
os dias 17 a 19 pré-natal). Os neurônios piramidais em CA1 e CA3 do hipocampo
tornam-se pós-mitóticos durante o desenvolvimento pós-natal precoce, enquanto que
as células granulares no giro dentado (DG) sofrem auto-renovação ao longo da vida
(Bayer, 1980a,b), pela presença local de células tronco. Desta forma, em decorrência
das possíveis alterações que podem advir de fatores adversos perinatais, é
extremamente importante elucidar os efeitos e modificações ocorridas durante o
período fetal e embrionário, no sentido de prenunciar doenças na infância, juventude
26
e idade adulta ou abrir a possibilidade de intervenções durante esta fase crítica como
forma preventiva.
Objetivo Geral
Desta forma, o objetivo geral deste trabalho foi estudar em ratos machos com
14 e 40 dias de vida provenientes de mães submetidas ou não a restrição proteica
gestacional, a expressão de genes envolvidos no processo de diferenciação das sub-
regiões hipocampais bem como o número de células totais e neurônios em hipocampo
total.
Objetivos Específicos
Em hipocampos microdissecados, avaliar e expressão diferencial em cada uma das
subregiões (CA1, CA3 e GD) dos seguintes genes: BDNF – Fator Neurotrófico
Derivado do Cérebro; SOX2 – Fator de Transcrição SRY (sex determining region Y)-
box 2; NR3C1 (GR-Receptor de Glicocorticoide); NR3C2 (MR-Receptor de
Mineralocorticóide); AGTR1 (AT1– Receptor de Angiotensina II); LNPEP (AT4 -
Receptor de Angiotensina IV); DCX – Doublecortina; Egr-1 – Regulador de
Transcrição - Early Growth Response I; HTR1 (5HT1A – Receptor de Serotonina 1A);
CDKN1C (p57) – Inibidor de Kinases dependente da Ciclina;
Avaliar a expressão proteica dos genes que tiveram a expressão alterada;
Avaliar através da técnica de fracionamento isotrópico a quantidade de neurônios e
células totais na região hipocampal.
27
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Acasalamento e divisão dos grupos experimentais
Ratos Wistar fêmeas, após o período de adaptação às condições ambientais
de Biotério, foram submetidas ao acasalamento e, após constatação da presença de
espermatozoides no lavado vaginal, passaram a ser alimentadas com ração padrão
para roedores (NP - normal protein, 17% de proteína, dieta basal) ou com ração
hipoprotéica (LP – low protein, 6% de proteína) (veja a composição das rações na
Tabela1). Imediatamente após o nascimento, retornou-se a ração padrão e os animais
foram pesados e aferidas as distâncias ano-genitais. Todas as proles foram reduzidas
de forma a ser constituídas somente por 8 filhotes/ninhada e, posteriormente foram
divididos em dois grupos experimentais:
Grupo 1 - Com 14 dias de vida apenas os machos da prole foram eutanasiados e os
cérebros coletados e imersos em PFA 4% por 24 horas e posteriormente
armazenados em álcool 70% para a técnica de imunoistoquimica. Para a técnica de
microdissecção, os mesmos foram imediatamente imersos em N-Hexano, congelados
em gelo seco e armazenados em -80ºC.
Grupo 2 - Com 40 dias de vida apenas os machos da prole foram eutanasiados e os
cérebros coletados e imersos em PFA 4% por 24 horas e posteriormente
armazenados em álcool 70% para a técnica de imunoistoquimica. Para a técnica de
microdissecção, os mesmos foram imediatamente imersos em N-Hexano, congelados
em gelo seco e armazenados em -80ºC.
INGREDIENTES NORMAL PROTEIN
17%
LOW PROTEIN 6%
Amido de milho 410,10 484,80
Caseína 188,90 66,70
Amido dextrinizado 130,50 159,00
Sacarose 100,00 121,00
Óleo de soja 70,00 70,00
Celulose microcristalina 50,00 50,00
Mix mineral AIN 93 35,00 35,00
Mix vit AIN 93 10,00 10,00
28
Tabela
1. Itens que compõe a dieta. Quantidade para 1kg
3.2 Microdissecções a laser
Para a técnica de microdissecção, o material foi coletado e imediatamente congelado
em gelo seco imerso em N-Hexano. Foram realizadas secções de 60µm em criostato
e os cortes aderidos em lâminas (Arcturus PEN Membrane Glass Slides) os quais
foram desidratados sobre refrigeração, corados com cresyl e então submetidos à
microdissecção a laser. As lâminas foram então colocadas no microscópio e com a
utilização da objetiva de 5x foi selecionada a região a ser microdissecada para
posterior corte através do laser. Foram microdissecadas as regiões CA1, CA3 e Giro
Denteado de todas as amostras de hipocampo (n=5) de cada grupo experimental.
Totalizando aproximadamente 10 lâminas por animal. Após a realização do corte, com
o auxílio de uma lupa, a região microdissecada foi transferida para tubos estéril para
processamento para RT-qPCR.
L cistina 3,0 3,0
Bi tartarato de colina 2,5 2,5
BHT 0,014 0,014
29
Foto 1. Equipamento de microdissecção a laser
Foto 2. Delineamento da região a ser cortada
Foto 3. Região selecionada sendo cortada pelo laser
3.3 Extrações de RNA total para análises de expressão gênica
O RNA total foi extraído das amostras das regiões hipocampais microdissecadas
(CA1, CA3 e GD) através do método de extração com Trizol, baseado no protocolo
desenvolvido e revisado por Chomczynski & Sacchi (Chomczynski & Sacchi, 2006).
O Trizol é uma mistura de fenol, guanidina-isotiocianato e corante vermelho que
permite a identificação da fase orgânica, que não interage com os ácidos nucléicos.
Durante a homogeneização das amostras, o Trizol preserva a integridade do RNA
enquanto favorece a lise celular e a dissolução dos componentes celulares. A adição
30
de clorofórmio, seguida de centrifugação, promove aumento na eficiência na
desnaturação das proteínas. Após a centrifugação ocorre separação da solução em
três fases distintas: a fase superior, aquosa e límpida, a fase intermediária e a fase
inferior, orgânica de cor avermelhada. O RNA permanece exclusivamente na fase
aquosa. Após transferir a fase aquosa, o RNA é recuperado pela precipitação com
sucessivos ciclos de lavagem com álcool isopropílico e centrifugação. O RNA extraído
por este método é livre de contaminação com DNA e proteínas.
3.4 Análises da quantidade, qualidade e integridade do RNA total
A quantidade e a qualidade do RNA total obtido após a extração foram
avaliadas por espectrofotometria utilizando a placa para microvolumes Take3 e o
equipamento Epoch (BioTek®), através de medidas de absorbância em 230 nm
(A230), 260 nm (A260) e em 280 nm (A280). A medida de absorbância em 230 nm
permite inferir a respeito de possíveis contaminantes da amostra. A medida de
absorbância em 260 nm é específica para ácidos nucléicos e, portanto, é possível
medir a concentração de RNA extraído. A medida de absorbância em 280 nm permite
inferir a respeito de possível contaminação com proteínas. Assim, a partir da relação
entre as absorbâncias A260/A280 e A260/A230 a qualidade e a pureza da amostra
podem ser avaliadas. Para RNAs puros, a razão entre A260/A280 deve ser maior que
1,8 e a razão entre A260/A230 deve ser estar ente 2,0 e 2,2 (Sambrook et al., 1989;
Manchester, 1996).
3.5 Sínteses de cDNA para avaliação da expressão de mRNAs
A síntese de cDNA para a avaliação da expressão de mRNAS foi realizada
utilizando o SuperScript VILO Master Mix – Thermo Scientific.
Foram utilizadas amostras de CA1, CA3 e GD de cinco animais de cada grupo
experimental (NP e LP – 14 dias e NP e LP – 40 dias) provenientes de diferentes
progenitoras.
Para cada amostra de RNA total foram utilizados 4μl de Master Mix, 500ng de
amostra de RNA e completou-se com água até o volume do 20μl.
A solução final resultante foi rapidamente centrifugada e então incubada,
utilizando o equipamento Veriti® Thermal Cycler (Life Technologies, EUA), nas
seguintes condições: 25°C por 10 minutos, 37°C por 120 minutos, seguido da
31
inativação da transcriptase reversa a 85°C por 5 minutos e do resfriamento das
amostras a 4°C.
3.6 RT-qPCR para avaliação da expressão dos mRNAs
Cada amostra de cDNA obtida na etapa anterior foi analisada com ensaios de
PCR em tempo real contendo primers Exxtend específicos e o PowerUp SYBR Green
Master Mix A25742.
Os ciclos da PCR foram realizados no equipamento StepOne Plus (Life
Technologies, EUA) sob as seguintes condições: 50°C por 2 minutos, 95°C por 20
segundos, seguidos de 40 ciclos de 95°C por 1 segundo e 60°C por 20 segundos.
Os valores de Ct foram calculados utilizando a configuração automática de
baseline e de threshold. Para a análise da expressão dos mRNAs, a expressão gênica
foi normalizada por controle endógeno (LSM1 e SSR2. Cada amostra foi analisada
em triplicata e quantificada pelo método do ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001). O ΔCt
foi calculado pela subtração do valor de Ct de cada amostra pelo respectivo valor de
Ct do controle endógeno. Cada ΔCt foi então subtraído pela média aritmética dos
valores de Ct do grupo controle (ΔΔCt). A expressão relativa foi então calculada pela
equação 2(-ΔΔCt). O resultado final foi representado como proporção do grupo controle.
Todos os experimentos de RT-qPCR foram realizados seguindo as orientações
do MIQE: minimum information for publication of quantitative real-time PCR
experiments (Bustin et al., 2009).
3.7 Imunoistoquimica
Os animais (NP, n=5 e LP, n=5) foram anestesiados com Isofluorano e o nível
de anestesia controlado pelo monitoramento do reflexo corneal. A perfusão foi
realizada com o auxílio de uma bomba de perfusão mantendo-se a pressão média de
120 mmHg, sendo cada animal perfundido 15 minutos com solução salina
heparinizada a 5% em temperatura ambiente e 20 minutos com solução de
paraformaldeído a 4%em tampão fosfato 0,1M pH 7,4.
Após perfusão, os encéfalos foram fixados por imersão na mesma solução por
24 horas. O material foi incluído em paraplast e posteriormente, os cérebros foram
então cortados em micrótomo obtendo-se cortes com 5 µm de espessura.
Selecionaram-se as regiões que continham o hipocampo e nestas lâminas foi
realizada a desparafinização, seguido pela inibição da peroxidase endógena e
32
bloqueio com solução bloqueadora (leite em pó desnatado 5% em PBS). Os cortes
foram, então, incubados com os anticorpos primários, os quais foram diluídos em BSA
1%. Os cortes permaneceram incubados nesta solução overnight, sob refrigeração.
Posteriormente, foram lavados com PBS (3 vezes com intervalos de 5 minutos) e
expostos ao anticorpo secundário específico, conjugado com peroxidase, durante 2
horas à temperatura ambiente. Após lavagens sucessivas com PBS, a revelação foi
feita com DAB, os cortes montados em lâminas silanizadas, contra corados com
hematoxilina e, após secarem, foi realizada desidratação e montagem com lamínula.
A análise das lâminas foi realizada em microscópio óptico e foto-documentados
com auxílio de câmera CCD-IRIS (Sony).
3.8 Fracionamentos Isotrópico
Estimativa do número total de núcleos de neurônios
Para estimar o número total de neurônios os animais foram anestesiados no
14º ou 40º dia de vida com Isofluorano e perfundidos com solução salina 0,9% e
paraformoldeído (PFA) a 4%. Depois os cérebros foram removidos e os hipocampos
foram macrodissecados, pesados e imersos em álcool 70%.
Após esta etapa homogenizou-se manualmente 20 vezes a solução por
tombamento, imediatamente uma alíquota de 1,5 ml foi retirada e centrifugada por 3’
a 6000 rpm o sobrenadante foi descartado e o pellet foi suspendido para 1ml com
PBS. Esta lavagem (processo de centrifugação e re-suspenção do pellet) foi realizada
3x.
Após a última lavagem o pellet foi suspendido e incubado a temperatura
ambiente por 2h com anti-NeuN igG (1:200 EM pbs; Chemicon, Temeluca, CA).
Posteriormente, a alíquota foi lavada 3x e os núcleos foram incubados com anticorpo
secundário, Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG 3 (y3) (1:200 em 40% PBS, 10 ngs
(Normal Goat Serum) e 50% DAPI) por 2h, novamente os núcleos de neurônios foram
lavados e suspendidos em 200ul de PBS para contagem dos núcleos de neurônios
em microscópio de fluorescência.
Após homogenização mecânica uma alíquota de 10ul foi lançada na câmara de
Neubauer aguardou-se por 5’ e então fez-se a leitura, contando-se primeiramente os
núcleos marcados com DAPI, pois este reagente marca todos os núcleos
indiscriminadamente (endotélio, células da glia, neurônios), em seguida trocou-se o
33
filtro azul do microscópio pelo filtro verde e realizou-se a contagem dos núcleos
marcados com Alexa 555 que marca apenas núcleos de neurônios. A contagem do
núcleo de neurônio só foi considerada valida para aquelas marcações (DAPI e Alexa
555) que se sobrepunham.
3.9 Análise Estatística
Os dados foram submetidos ao teste t de Student. Os resultados foram
expressos como média ± Desvio Padrão e considerado significativo quando p<0,05
34
4. RESULTADOS
Em relação à evolução do peso das mães durante a gestação, nós observamos
que as fêmeas que consumiram ração hipoproteica apresentaram redução
significativa do peso corporal na 2ª e 3ª semana gestacional. Ao nascimento os
animais do grupo LP apresentaram redução significativa no peso dos machos
(Figura 4).
Figura 4. Análise da evolução do peso das mães durante a gestação (n=8 p<0,0001,
ANOVA Two-Way) e peso ao nascer dos filhotes machos (NP, n=106; LP, n=105)
Teste t.
Nos neonatos da prole de machos observamos aumento significativo da
distancia ano-genital nos animais do grupo LP (Figura 5).
Figura 5. Análise da distancia Ano-genital dos machos (NP, n=20; LP, n=38) Teste t
35
A massa dos machos da prole LP foi recuperada no 14º dia de vida e se
manteve semelhante aos animais do grupo NP até o 40º dia de vida (Figura 6). As
massas do cérebro e do hipocampo dos animais LP não foram alteradas mesmo
quando corrigidas pela massa do animal (figuras 7 e 8) ou pela do cérebro, no caso
do hipocampo (Figura 9).
Figura 6. Análise do peso dos machos com 14 (A - NP, n=12; LP, n=7) e 40 dias (B –
n=12; LP, n=11) Teste t.
Figura 7. Análise da massa do cérebro normalizada pela massa corporal com 14 dias
e 40 dias de vida. (n=5) Teste t.
36
Figura 8. Análise da massa do hipocampo com 14 e 40 dias de vida. (n=5) Teste t.
Figura 9. Análise da massa do hipocampo normalizada pela massa do cérebro com
14 e 40 dias de vida. (n=5) Teste t.
Figura 10. Análise da massa do hipocampo normalizada pela massa do animal com
14 e 40 dias de vida. (n=5) Teste t
37
A análise da expressão gênica em subcampos microdissecados do hipocampo
dorsal de animais com 14 dias de vida, revelou aumento dos RNAm para GR e AT4,
em CA1 de animais do grupo LP, comparativamente aos NP (Figura 11). Também
em CA1 observamos em LP redução significativa do RNAm de 5-HT1A no 14º dia de
vida (Figura 11). No 40º dia de vida a expressão gênica da maioria das proteínas
estudadas foi reduzida na região CA1 dos animais NP e LP, comparativamente àquela
observada no 14º dia de vida (Figura 11). Quando comparamos NP e LP quanto a
expressão dos RNAm estudados no 40º dia de vida, não observamos alterações
significativas em CA1 (Figura 11).
Figura 11. Análise da expressão gênica na região CA1 do hipocampo dorsal de ratos
dos grupos NP e LP com 14 e 40 dias de vida (Teste t).
38
Em CA3 de animais do grupo LP, comparativamente aos NP, no 14º dia de vida
observamos aumento significativo dos RNAm de MR e AT1 e redução significativa de
DCX (figura 12). Assim como observado em CA1, no 40º dia de vida a expressão
gênica da maioria das proteínas estudadas foi reduzida na região CA3 dos animais
NP e LP, comparativamente àquela observada no 14º dia de vida (Figura 12).
Entretanto, tanto em NP quanto em LP a expressão de BDNF e SOX2 é
significativamente aumentada em CA3 no 40º dia comparativamente ao 14º (Figura
12). Quando comparamos NP e LP quanto a expressão dos RNAm estudados no 40º
dia de vida, também em CA3 não observamos alterações significativas (Figura 12).
Figura 12. Análise da expressão gênica na região CA3 no hipocampo dorsal de ratos
dos grupos NP e LP com 14 e 40 dias de vida (Teste t).
39
Já no GD dos animais do grupo LP, comparativamente aos NP, no 14º dia de
vida observamos redução significativa dos RNAm que codificam MR, DCX e 5-HT1A
(figura 13). Contrariamente ao que foi observado em CA1 e em CA3, no 40º dia de
vida a expressão gênica das proteínas estudadas foi aumentada no GD dos animais
NP e LP, comparativamente àquela observada no 14º dia de vida (Figura 13). Assim
como observado em CA1 e CA3, quando comparamos NP e LP quanto a expressão
dos RNAm estudados no 40º dia de vida, no GD não observamos alterações
significativas na maioria das proteínas estudadas entretanto, a expressão de SOX2
foi significativamente reduzida e de DCX significativamente aumentada (Figura 13).
Figura 13. Análise da expressão gênica na região GD no hipocampo dorsal de ratos
dos grupos NP e LP com 14 e 40 dias de vida (Teste t).
40
Tabela 2. Porcentagens das alterações encontradas nos RNAm estudados, com setas
representando aumento ou diminuição da expressão nas regiões CA1, CA3 e GD do
hipocampo dorsal. Em negrito temos as alterações observadas em LP
comparativamente a NP. Os valores que não estão em negrito correspondem à
variação de expressão entre o 14º e 40º dia de vida nos animais NP e nos LP. As
células verdes representam alterações estatisticamente significativas quando usado o
Teste t.
CA1 CA3 GD
NP/LP NP LP NP/LP NP LP NP/LP NP LP
14D
40D 14/40
14/40 14D 40D 14/40 14/40
14D
40D 14/40 14/40
BDNF 31%
68%
48%
49%
48%
31%
8.210%
10.938
%
3%
36%
350%
492%
SOX2
1%
58%
74%
89%
62%
13%
1.279%
3.048%
16%
68%
6.732%
2.475%
GR 27%
72%
25%
1%
37%
7%
95%
91%
6%
15%
347%
381%
MR 53%
44%
93%
92%
81%
12%
94%
97%
87%
7%
133%
1.593%
AT4 36%
35%
69%
85%
5%
3%
94%
94%
27%
54%
65%
249%
DCX 1%
67%
73%
91%
29%
9%
94%
92%
50%
462%
221%
3.511%
5HT1A 30%
38%
62%
24%
17%
24%
93%
92%
58%
5%
16%
160%
EGR1 13%
38%
76%
87%
0,70%
9%
94%
94%
37%
63%
256%
325%
CDK1NC 57%
22%
78%
83%
7%
18%
12%
182%
288%
AT1
109%
74%
94%
95%
22%
41
Com relação às proteínas, cujos genes apresentaram alterações significativas
de expressão, nós avaliamos as variações quanto à localização e conteúdo de
algumas em CA1, CA3 e GD do hipocampo dorsal dos animais NP e LP. Os resultados
demonstram não ter havido regulação pós-transcricionais revertendo as alterações
observadas na avaliação da expressão gênica.
Desta forma, no 14º dia de vida a imunoreatividade para GR em CA1,
apresentou-se significativamente aumentada em LP comparativamente àquela obtida
em NP (Figura 14).
Figura 14. As micrografias mostram a imunomarcação de GR na região CA1 do
hipocampo dorsal de animais NP e LP com 14 dias de vida. Observe a localização
preferencialmente nuclear deste receptor, característica de receptores de esteróides.
A Análise quantitativa da área marcada revela aumento significativo desta proteína
em LP (Teste t, n=5).
Em relação à imunomarcação de MR observamos aumento em CA3 e
diminuição no GD (Figura 15). Já em relação à expressão de DCX, observamos que
42
tanto no GD quanto em CA3, a expressão foi significativamente menor nos animais
do grupo LP (Figura 16).
Figura 15. As micrografias mostram a imunomarcação de MR nas regiões CA3 e GD
do hipocampo dorsal de animais NP e LP com 14 dias de vida. A Análise quantitativa
da área marcada revela aumento significativo desta proteína em CA3 e redução
significativa no GD em LP, comparativamente a NP (Teste t, n=5).
Figura 16. As micrografias mostram a imunomarcação de DCX nas regiões CA3 e GD
do hipocampo dorsal de animais NP e LP com 14 dias de vida. A análise quantitativa
43
da área marcada revela redução significativa desta proteína em LP,
comparativamente a NP (Teste t, n=5).
No hipocampo dorsal dos animais LP com 40 dias de vida observamos
aumento significativo na expressão de DCX em todas as sub-regiões (Figura 17).
Figura 17. Imunolocalização de DCX no hipocampo dorsal de animais NP e LP com
40 dias de vida. A análise quantitativa da área marcada revela aumento significativo
desta proteína em LP, comparativamente a NP (Teste t, n=5).
Através da técnica de fracionamento isotrópico observamos que não houve
diferença significativa no número de células totais nem de neurônios nos hipocampos
dos animais estudados, independentemente do grupo experimental. No entanto,
observamos que os animais do grupo LP com 14 dias de vida, apresentam 61% de
neurônios enquanto que o grupo NP apresentou apenas 23% de neurônios (Figura
18).
44
Os resultados obtidos pela quantificação do número total de células e neurônios
demonstraram que os animais do grupo LP com 14 dias de vida apresentam maior
quantidade de neurônios em relação às células da glia e endoteliais e em relação aos
animais do grupo NP.
Figura 18. Porcentagem de neurônios e outros tipos celulares hipocampais em
animais NP e LP com 14 dias de vida (Teste T, n=3).
Já no 40º dia de vida não observamos diferenças na proporção de tipos
celulares quando comparamos os resultados obtidos para NP e LP (Figura 19).
Adicionalmente, observamos que nos dois grupos estudados há menor quantidade de
neurônios que a observada para outros tipos celulares do hipocampo.
Figura 19. Porcentagem de neurônios e outros tipos celulares hipocampais em
animais NP e LP com 40 dias de vida (Teste T, n=3).
NP LP
NP LP
45
5. DISCUSSÃO
Como já exposto, a nutrição fetal exerce papel fundamental no desenvolvimento
cerebral, particularmente no período final da gestação (Nyaradi at al, 2013). Além disso,
existem evidencias que as alterações nutricionais durante o período gestacional podem
levar a graves consequências no desenvolvimento neural bem como na regulação da
expressão gênica, na plasticidade, na arborização dendrítica, na sinaptogênese e no
processo de mielinização neuronal (Black, 2008). Inúmeros trabalhos experimentais
têm demonstrado que a desnutrição proteica, quando imposta em estágios iniciais da
vida, produz diversas alterações morfológicas e neuroquímicas no SNC (Lopes et al,
2013, Lewis et al, 1979, Wiggins et al, 1984, Almeida, 1987, Morgane, 2002) que,
habitualmente, vem acompanhadas por modificações na massa corporal dos animais
ao nascimento (Mesquita et al, 2010).
A formação hipocampal tem sido alvo de estudos em face à sua conhecida
característica de intensa plasticidade que efetivamente, repercute em sua função de
regulação de processos cognitivos. Dessa forma, o presente estudo buscou avaliar os
efeitos da restrição proteica gestacional bem como da incompatibilidade com o
ambiente pós-natal, com o retorno ao aporte normoproteico, no desenvolvimento do
hipocampo.
Os resultados do presente estudo confirmam a significativa redução da massa
corporal dos animais do grupo LP ao nascer e a recuperação do peso no 14º dia de
vida caracterizando a ocorrência de catch-up growth como previamente descrito pelo
nosso grupo, neste modelo de restrição proteica gestacional (Mesquita et al, 2010,
Lopes et al, 2013). Além disso, nós também observamos aumento na distância ano-
genital nos machos da prole que sofreu restrição proteica gestacional. Zambrano et al
(2005) já haviam observado este aumento da distância ano-genital na prole de fêmeas
que sofreram restrição proteica gestacional. Neste estudo, fêmeas com 19 dias de
gestação apresentaram aumento significativo na concentração plasmática de
progesterona, corticosterona, estradiol e testosterona. Tanto estes quanto outros
autores aventam a possibilidade de que a exposição aos esteroides maternos possa
ser um fator determinante, dentre outros, para este aumento da distância ano-genital
nestes modelos (Hotchkiss et al., 2007).
O desenvolvimento de circuitos neuronais requer uma sequência de eventos
incluindo proliferação celular, migração, diferenciação e sinaptogênese. O hipocampo
46
é uma estrutura, em camadas, que se desenvolve seguindo estes passos (Forster et al,
2006). Em ratos, esse padrão é induzido a partir da embriogênese, e os novos
neurônios possuem propriedades intrínsecas que permitem definir e estabelecer
fenótipos na idade adulta (Deguchi et al, 2011). Assim, tanto o momento quanto a forma
dos neurônios do hipocampo têm origem e exercerá influências nas suas propriedades
e funções durante a infância, a juventude, na maturidade e no envelhecimento.
Bayer (1980) descreveu que na fase pós-natal de roedores, células
precursoras se acumulam em uma matriz de proliferação no hilo do GD e o pico de
proliferação nesta matriz ocorre entre o 3º e 10º dia pós-natal. Entretanto, alguns
consideram que a proliferação cessa em roedores, no 7º dia pós-natal (Vadodaria
e Gage, 2014). Entre o 21º e o 28º dia pós-natal esta matriz desaparece e o nicho
neurogênico permanece confinado à ZSG (Altman e Bayer, 1990b).
Durante a neurogênese as células precursoras passam por diferentes
estágios até se diferenciarem em neurônios e expressam proteínas diferentes, o que
torna possível distingui-las. Inicialmente, as células tronco tipo 1 e tipo 2a e 2b
expressam SOX2, sendo que o tipo 2b passa a expressar também DCX. As células
tronco do tipo 3 não expressam mais SOX2 sendo distinguido pela expressão apenas
de DCX até o estágio de neurônio imaturo que, por sua vez, passa a expressar também
NEuN. No neurônio maduro já não encontramos DCX, mas sim a expressão de NEuN
(Figura 20).
SOX 2 é um fator de transcrição essencial para manter a auto-renovação ou
pluripotência de células-tronco. Relatos na literatura mostram que a regulação negativa
de SOX2 induz saída de neurônios do ciclo celular (fase proliferativa) e a expressão de
marcadores de diferenciação (Graham et al, 2003) enquanto que a superexpressão de
SOX2 reprime a diferenciação neuronal (Bani-Yaghoub, 2006). Dessa forma, a inibição
da sinalização pela SOX2 resulta na delaminação de células progenitoras neurais da
ZSG estando associada com perda de marcadores de células progenitoras (células
tronco) e o aparecimento de marcadores de diferenciação neuronal precoce (Graham
et al, 2003).
47
Figura 20. Esquema representando a maturação neuronal na ZSG (modificado de
http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/44047/title/Neurogenesis-in-the-
Mammalian-Brain/. Baseada em VARELA-NALLAR e INESTROSA, 2013).
DCX é uma proteína associada a microtúbulos (MAP), importante para a
migração e diferenciação de neurônios (Kappeler et al, 2006; Koizumi et al, 2006;
Francis et al, 1999; Glesson et al, 1999). É amplamente expressa no SNC de mamíferos
e, em ratos, sua expressão se inicia no 10,5º dia embrionário. O início da expressão de
DCX corresponde, portanto, aos estágios iniciais da neurogênese, quando os neurônios
neocorticais destinados ao córtex em desenvolvimento tem origem e iniciam seu
processo de migração (Caviness et al., 1997). No entanto, a expressão de DCX não se
limita a este período, ela também é expressa em neurônios em diferenciação em outras
fases do desenvolvimento (Francis et al, 1999).
Nossos resultados demonstram que no 14º dia de vida não ocorreram
alterações significativas na expressão de SOX2 nas regiões hipocampais estudades
em LP comparativamente a prole NP. Já a expressão de DCX é reduzida
significativamente (~50%), no GD de animais do grupo LP no 14º dia de vida.
Entretanto, embora não tenhamos observado diferença significativa no número de
células do hipocampo entre os grupos NP e LP, o número de neurônios maduros em
Neurônio maduro
Neurônio imaturo
Neuroblástotipo 2b
Precursor neural tipo 2a
Célula tronco neural tipo 1
Neurônio hipocampal
Zona subgranular(ZSG)
Camada granular
CA1
GD
CA3
48
LP foi 38% maior que o observado em NP no 14º dia de vida. Desta forma, podemos
supor que em animais da prole LP, os processos de proliferação e diferenciação foram
estimulados pelo aumento do aporte proteico pós-natal (retorno á dieta normoprotéica
no pós-natal), resultando na elevação do número de neurônios no 14º dia de vida
(Figura 21). Esta aceleração no crescimento corresponde ao período de catch-up
growth observado em nosso modelo.
Figura 21. Hipótese sobre as diferenças encontradas em LP comparativamente a NP. Em azul temos o
time course dos processos de diferenciação no hipocampo de animais NP. Primeiro ocorre proliferação
das células tronco, seguido pelo período de determinação. O período de determinação indica que a
potência da célula foi restrita ao seu destino. A partir de então, estas células migram até o 21º dia de vida
e desenvolvem suas ramificações dendríticas e integrações sinápticas. Representado em vermelho
temos as alterações supostas em LP frente aos nossos resultados (Baseado em Vadodaria e Gage,
2014).
No 40º dia pós-natal os animais LP, apresentam redução significativa (68%) do
RNAm para SOX2 no GD do hipocampo dorsal indicando redução de células tronco.
Paralelamente, observa-se aumento significativamente exacerbado (462%) no RNAm
de DCX no GD indicando intensificação dos processos de migração e diferenciação.
Podemos supor que após o 40º dia de vida, há uma redução de células tronco seguida
por uma elevação no número de neurônios no GD. Devemos salientar que esta
acentuada diferenciação de neurônios pode ser o fator determinante da redução de
células tronco na ZSG do GD. Como dito acima, a ZSG é a principal fonte de células
granulares produzidas no início da vida e na idade adulta, devendo ser mantido o
número apropriado de células precursoras para a neurogênese ao longo da vida.
Assim, podemos reiterar a hipotese de que o observado aumento da expressão
de DCX em animais com 40 dias de idade decorra de mecanismos compensatórios
induzidos pela expressiva redução na formação de novos neurônios em um período
Dias após
nascimento0 7 14 21 28 40
ProliferaçãoIntegração Sináptica
Determinação Migração
MigraçãoIntegração Sináptica
Proliferação
Determinação
NP
LP
catch-up growth
49
pré-natal, adjunto a exposição da prole a restrição nutricional. Este fato deve ser
considerado, uma vez que encontramos número aumentado de neurônios nos animais
com 14 dias de vida.
O BDNF é um fator de crescimento que é dinamicamente expresso no cérebro
durante todo o período de desenvolvimento perinatal, regulando a diferenciação
neuronal e a plasticidade sináptica; estudos prévios têm demonstrado que a expressão
de BDNF aumenta a partir do 10º dia pós-natal atingindo seu pico no 30º dia e um platô
no 45º dia pós-natal (Dincheva et al, 2016). No presente estudo, foi evidenciado que na
região CA3 e no GD do hipocampo dorsal, os animais LP apresentam aumento na
expressão de RNAm para BNDF, sendo que em CA3 esta elevação foi 2.728% maior
que aquele observado em animais NP. Entretanto, na idade adulta (16 semanas de
vida) estes animais apresentam redução no comprimento dendrítico dos neurônios da
região CA3 (Lopes et al., 2013) indicando que este estímulo não interferiu
favoravelmente prevenindo danos às conexões neurais futuras.
Nos ratos, durante as duas primeiras semanas pós-natal, ocorre quiescencia
adrenocortical sendo este denominado de “período não responsivo ao estresse”, no
qual os níveis de esteróides adrenais estão fisiologicamente baixos permitindo a
elevação da taxa de produção de células granulares característica neste período
(Sapolsky e Meaney 1986; Schlessinger et al. 1975).
No final da primeira semana de vida o número de MR chega ao mesmo padrão
encontrado em adultos. Já a quantidade de GR nas primeiras semanas de vida é de
~30% daquela encontrada em adultos (Bohn et al., 1994; Vazquez et al., 1998). Tanto
GR quanto MR são altamente expressos apresentando ontogênese complexa que
acompanha o desenvolvimento intrincado do cérebro.
Munier et al. (2012) estudaram a expressão de MR bem como seu papel na
sobrevivência de células tronco embrionárias diferenciadas in vitro em neurônios.
Durante a diferenciação a expressão de MR aumentou cinco vezes e foi mantida
elevada nos neurônios derivados destas células (Munier et al., 2010). Tanto as células
tronco quanto os neurônios diferenciados também expressam GR, fato importante, já
que GR tem papel indispensável na transcrição dependente de MR e que são formados
heterocomplexos GR-MR necessários para o tráfego nuclear eficiente de MR (Tsugita
et al., 2009). A deleção global de MR, mas não de GR, em camundongos provoca
redução no número de células granulares hipocampais (Gass et al., 2000). Munier et
50
al. (2012) concluíram que o MR é marcador de diferenciação e sobrevivência neuronal
(Munier et al., 2012).
Baseando-se na literatura podemos inferir que, nos animais LP com 14 dias de
vida, o aumento de MR (81%) em CA3 induz diferenciação de células tronco em
neurônios maduros enquanto que a redução deste receptor (87%) no GD leva a
redução de células granulares. No 40º dia de vida observamos número similar de
neurônios no hipocampo de animais NP e LP e desta forma, ocorre perda de neurônios
entre o 14º e 40º dia de vida em LP.
Outro fator importante e que tem sido mostrado como modulador relevante da
neurogenese é a 5-hidroxitriptamina (serotonina). Diversos estudos têm demonstrado
que a redução dos níveis serotoninérgicos e/ou do número de receptores
serotoninérgicos causam uma redução da neurogênese do hipocampo como
consequência de alterações nas células precursoras hipocampais e na diferenciação
destas em neurônios (Banasr et al., 2004; Brezun e Daszuta, 2000; Duman et al.,
2000; Encinas et al., 2006; Malberg et al., 2000; Marcussen et al., 2008; Nibuya et al.,
1996; Santarelli et al., 2003). Além disso, estudos tem buscado elucidar a influência
específica da serotonina e sua homeostase nos diferentes estágios de maturação do
desenvolvimento neuronal no hipocampo (Encinas et al., 2006; Klempin et al., 2010).
Nossos resultados demonstraram diminuição significativa na expressão gênica do
receptor 5-HT1A nas regiões CA1(30%) e no GD (58%) nos animais do grupo LP com
14 dias de vida. Novamente temos fatores envolvidos na redução da neurogênese.
No desenvolvimento do sistema nervoso central, existe uma variedade de
mecanismos que controlam a saída do ciclo celular e consequentemente, o
direcionamento das células para a diferenciação durante a neurogênese. Um inibidor
de ciclina-quinase independente (CDK), p57Kip2, controla a transição da proliferação
para a diferenciação em muitos tecidos, incluindo a região hipocampal. Nossos
resultados demonstraram aumento significativo, de cerca de 157%, na expressão de
CDKN1C/p57kip2 na região CA1 nos animais do grupo LP com 14 dias de vida.
Considerando o fato de que CDKN1C/p57kip2 é um regulador negativo da proliferação
celular podemos inferir que nesta região e neste período de tempo, possa estar
ocorrendo supressão da proliferação celular seguida de diferenciação neuronal.
Desde 1986, quando os estudos de Barker e Osmond definiram o conceito da
origem desenvolvimentista da saúde e da doença (DOHaD) durante a vida
embrionária/fetal, ficou estabelecido que o sistema renina angiotensina (RAS) também
51
está envolvido nas respostas de órgãos e sistema a programação fetal induzida por
diferentes agentes adversos. A partir de então, estudos sobre a participação deste
sistema na programação fetal têm sido realizados (Fitzsimons, 1998; Paol et al, 2006).
Progressos recentes têm demonstrado a importância do RAS, tanto no
desenvolvimento fetal quanto no período pós-natal, em modelos de programação fetal.
A participação do RAS em situações de estresse tem sido demonstrada em
vários estudos avaliando a expressão, o número e a localização dos receptores de
angiotensina II no SNC. Estas evidências são claramente estabelecidas com a
demonstração de que a inibição da conversão de angiotensina I em angiotensina II
atenua não somente a resposta hormonal e simpatoadrenal ao estresse induzido, mas
também, a atividade de centros corticais superiores reduzindo a ansiedade em roedores
(para revisão ver Saavedra et al, 2011).
Sabendo que o bloqueio do receptor AT1 afeta significativamente a
concentração de CRF e que este está envolvido no controle regulatório cognitivo e
comportamental nós avaliamos a expressão dos AT1R no hipocampo de animais. O
estudo mostrou um expressivo aumento de AT1-RNAm (209%) na região CA3 nos
animais do grupo LP com 14 dias de vida. Paralelamente, evidenciou aumento
significativo em RNAm-AT4 em CA1 nos animais com 14 dias de vida. Em estudo prévio
realizado por Kramár e colaboradores (2001) foi demonstrado que a ativação de
receptores AT4 melhoram a transmissão sináptica e a atividade LTP nas células
piramidais na região CA1.
Os resultados deste trabalho sugerem o comprometimento do processo da
neurogênese nos animais cujas mais foram submetidas a redução do aporte proteico.
No entanto, é possível que a reposição proteica no pós-natal imediato, de maneira
inédita, mostre um uma elevação da diferenciação neuronal, presumivelmente como
decorrência de mecanismos compensatórios induzidos pela restauração dietética e
hipoteticamente associados ao fenômeno de catch-up growth.
Tomando em conjunto o presente estudo com resultados prévios de nosso
laboratório, tais como atrofia de neurônios hipocampais em animais adultos, sem
comprometimento de tarefas de memória e aprendizado hipocampo-dependentes,
pode-se inferir que os danos morfológicos e funcionais hipocampais precoces,
provenientes da restrição proteica gestacional, estejam relacionados a danos
52
estruturais temporários. Estes, entretanto, parecem ser revertidos por modificações na
expressão gênica que modulam a produção de proteínas e neurotransmissores
envolvidos na recuperação celular destas áreas cognitivas do hipocampo. O presente
estudo suporta a teoria do “cérebro egoísta” como um paradigma estabelecendo que,
para se manter estável o fornecimento de energia e a atividade funcional, o cérebro
modula o metabolismo intermediário em tecidos periféricos regulando tanto a alocação
quanto a ingestão de nutrientes. Assim, apresenta-se nesta tese uma ampliação desta
teoria, sugerindo que a despeito de alterações metabólicas e cardiovasculares
periféricas observadas neste modelo experimental, as modificações morfológicas e
funcionais temporárias hipocampais decorrentes de situações adversas perinatais,
podem ser eficientemente revertidas por mecanismos compensatórios neuro-genéticas
e neuro-humorais. Tomando os resultados e inferências acima descritas, a teoria do
cérebro egoísta pode ser expandida, para a recuperação de áreas comportamentais
essenciais do SNC (dentre os quais o hipocampo), fundamentais para manutenção da
memória e aprendizagem e, consequentemente para manutenção da espécie. Estas
conclusões são sustentadas, pelo menos em parte, por trabalhos de James Nairne
(2007), responsável pelo Adaptive Memory Lab da Universidade de Purdue (USA)
e Josefa Pandeirada, investigadora do Departamento de Educação e Psicologia da
Universidade do Alabama, que propõem explicar as funções da memória durante o
processo evolutivo de várias espécies, incluindo seres humanos. Testes em
laboratório confirmaram que a memória "funciona muito bem" em cenários de
sobrevivência, como busca por comida, abrigo e proteção de predadores. Vários
grupos de voluntários, cuja memória foi testada em várias circunstâncias adversas,
ao longo dos últimos anos, confirmam tal tese. O estudo da memória tem sido
pautado por uma análise estruturalista e funcional, focada na identificação dos
diferentes componentes da memória e na exploração do modo como estes operam.
Embora esta seja uma forma de investigação importante, porque efetivamente dá a
conhecer muito sobre o seu funcionamento, a descura em questões fundamentais
relacionadas ás funções que a memória desempenha na sobrevivência das
espécies precisam avançar.
53
6. CONCLUSÃO
O presente estudo confirmou:
Resultados prévios mostrando uma significativa redução da massa corporal
dos animais do grupo LP ao nascer e a recuperação desta massa no 14º dia
de vida, caracterizando o fenômeno conhecido como catch-up growth neste
modelo experimental de restrição proteica gestacional; Além disso, o presente
estudo também mostrou uma elevação da distância ano-genital nos machos da
prole que sofreu restrição proteica gestacional.
O estudo também mostrou que o desenvolvimento de circuitos neuronais no
hipocampo está associado com a expressão distinta de genes nas diferentes
regiões anatômicas do hipocampo. Também, que a sequência de eventos
incluindo proliferação celular, migração e diferenciação estão associados a
expressão genica distinta;
Assim, nossos resultados demonstram que:
1. No 14o. dia pós-natal uma elevação significativa da expressão de SOX2 nas regiões
hipocampais de LP comparativamente a prole NP. Este aumento é associado à
significativa redução de DCX (~50%), no GD de animais do grupo LP no 14º dia de
vida.
2. Estas alterações estão associadas a modificações no número de neurônios maduros
em LP, 38% maior que o observado em NP no 14º dia de vida.
3. No 40º dia pós-natal os animais LP, apresentam redução significativa (68%) do mRNA
para SOX2 no GD do hipocampo dorsal indicando redução de células tronco.
4. Paralelamente, observa-se aumento significativamente exacerbado (462%) no RNAm
de DCX no GD indicando intensificação dos processos de migração e diferenciação.
5. Este resultado permite supor que após o 40º dia de vida, há uma redução de células
tronco seguida por uma elevação no número de neurônios maduros no GD.
6. O BDNF é um fator de crescimento que é dinamicamente expresso no cérebro durante
todo o período de desenvolvimento perinatal, regulando a diferenciação neuronal e a
plasticidade sináptica; No presente estudo, foi evidenciado a participação deste fator
54
que na região CA3 e no GD do hipocampo dorsal, os animais LP apresentam aumento
na expressão de RNAm para BNDF, sendo que em CA3 esta elevação foi 2.728%
maior que aquele observado em animais NP. Este achado sugere um forte estímulo a
diferenciação neuronal nos animais LP no período pós-natal.
7. Neste sentido o presente estudo indica pelo menos em parte o envolvimento da
expressão de CDKN1C/p57kip2 uma vez que demonstrou aumento significativo (~de
cerca de 157%) na região CA1 nos animais do grupo LP com 14 dias de vida.
Considerando o fato de que CDKN1C/p57kip2 é um regulador negativo da proliferação
celular podemos inferir que nesta região e neste período de tempo, possa estar
ocorrendo supressão da proliferação celular, seguida de diferenciação neuronal.
Todos estes fenômenos podem ser modulados por:
Receptores centrais de corticosteroides uma vez que animais LP com 14 dias
de vida apresentam aumento de MR (81%) em CA3 sendo que este está
envolvido na diferenciação de células tronco em neurônios maduros enquanto
que a redução deste receptor (87%) no GD leva a redução de células
granulares.
No 40º dia de vida o presente estudo mostrou um número similar de neurônios
no hipocampo de animais NP e LP o que sugere uma perda expressiva de
neurônios entre o 14º e 40º dia de vida em LP.
Nossos resultados demonstraram diminuição significativa na expressão gênica
do receptor 5-HT1A nas regiões CA1(30%) e no GD (58%) nos animais do
grupo LP com 14 dias de vida. Novamente temos fatores envolvidos na
redução da neurogênese.
Sabendo-se do envolvimento dos receptores AT1 no controle regulatório
cognitivo e comportamental, o estudo avaliou a expressão dos AT1R e AT4R
no hipocampo de animais. Os resultados mostraram um expressivo aumento
de AT1-RNAm (209%) na região CA3 nos animais do grupo LP com 14 dias de
vida, paralelamente, a elevação de mRNAm-AT4 em CA1 nos animais com 14
dias de vida. Podemos sugerir que a ativação de receptores AT4 pode estar
envolvida na melhoria da transmissão sináptica pós-natal das células
piramidais na região CA1 da prole LP.
55
Este estudo sugere que os danos morfológicos e funcionais hipocampais precoces,
provenientes da restrição proteica gestacional, podem estar relacionados a danos
estruturais temporários. Estes, entretanto, parecem ser revertidos por modificações na
expressão gênica que modulam a produção de proteínas e neurotransmissores
envolvidos na recuperação celular destas áreas cognitivas do hipocampo. O presente
estudo suporta a teoria do “cérebro egoísta” e, propõe uma ampliação desta teoria,
sugerindo que a despeito de alterações metabólicas e cardiovasculares periféricas
observadas neste modelo experimental, as modificações morfológicas e funcionais
temporárias hipocampais decorrentes de situações adversas perinatais, podem ser
eficientemente revertidas por mecanismos compensatórios neuro-genéticas e neuro-
humorais.
56
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