UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE …repositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/322692/1/Kubota_Daniela_D.pdf · daniela kubota desenvolvimento e caracterizaÇÃo de formulaÇÕes

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

DANIELA KUBOTA

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE FORMULAÇÕES DO FÁRMACO

IMUNOSSUPRESSOR CICLOSPORINA A, EM NANOEMULSÃO

CAMPINAS

2016

DANIELA KUBOTA

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE FORMULAÇÕES DO FÁRMACO

IMUNOSSUPRESSOR CICLOSPORINA A, EM NANOEMULSÃO.

ORIENTADOR: PROF. Dr. FRANCISCO BENEDITO TEIXEIRA PESSINE

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA

ALUNA DANIELA KUBOTA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. FRANCISCO BENEDITO

TEIXEIRA PESSINE.

CAMPINAS

2016

Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de

Química da Universidade Estadual de Campinas,

como parte dos requisitos exigidos para obtenção

do título de Doutora em Ciências.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Francisco Benedito Teixeira Pessine (Orientador)

Profa. Dra. Iara de Fátima Gimenez (CCET –UFS)

Prof. Dr. Leonardo Fernandes Fraceto (UNESP - Sorocaba)

Profa. Dra. Márcia Miguel Castro Ferreira (IQ- UNICAMP)

Prof. Dr. René Alfonso Nome Silva (IQ - UNICAMP)

A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no

processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).

Este exemplar corresponde à redação final da Tese de

doutorado defendida pela aluna DANIELA KUBOTA,

aprovada pela Comissão Julgadora em 29 de março de

2016

Dedicatória

A meus pais, Vera Lúcia e Armando.

Houve um tempo em que se fazia ciência a partir de quatro elementos: água, terra,

fogo e ar. Naquele tempo não se sabia que é possível fazer qualquer coisa com

apenas dois: vontade e imaginação

(Oktar, 2003)

AGRADECIMENTOS

Primeiramente à minha família, por me apoiar sempre e pelo carinho

incondicional em todos os momentos. A todos os meus amigos que estiveram

presentes nessa fase de tantas mudanças na minha vida.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Francisco B.T.Pessine, a quem tenho imensa

admiração pela pessoa que pude conhecer nesse curto período. Obrigada por todos

os conselhos e auxílios. Sempre terei um grande carinho por esse Sr.

Aos meus queridos companheiros de laboratório: Ana Cláudia, Andreza,

Caio, Daniel, Francieli, Letícia, Luciana, Marcelo, Milene e Viviane por todas as

explicações, discussões e risadas. Em especial as minhas amigas Letícia e Milene

que sempre estiveram dispostas a me ajudar e auxiliar nos momentos de sufoco.

Vocês estiveram comigo do início ao fim.

Ao Prof. Dr. Nélson E. Durán por autorizar a utilização do equipamento

para medidas de Espalhamento Dinâmico de Luz ao longo de todo o trabalho.

À Profa. Dra. Míriam Dupas Hubinger FEA-Unicamp por autorizar a

utilização do equipamento para medidas de medidas de Espalhamento de Luz

durante o trabalho e à Dra. Vanessa pela gentileza com que sempre me atendeu.

Ao Dr. Ricardo Pereira por auxiliar nas análises de cromatografia líquida,

a Daniel Razzo pelo auxílio na obtenção das imagens através da Microscopia

Eletrônica de Varredura, aos técnicos do laboratório de ensino: Daniel, Divino e

Mírian. Aos demais funcionários do Instituto de Química.

Aos professores que fizeram parte da minha vida acadêmica, pessoas a

quem pude me inspirar e admirar e conseguir chegar até aqui. Espero inspirar outras

pessoas assim como vocês o fizeram comigo.

À banca examinadora pela gentileza de terem aceitado o convite.

À CAPES pela bolsa concedida.

RESUMO

Nanoemulsões consistem de uma fina dispersão de óleo em água, com diâmetro de

gotículas entre 50 e 600 nm. O objetivo desta pesquisa foi encapsular o fármaco

imunossupressor ciclosporina A (CsA) utilizando a nanoemulsão (NE) como sistema

carreador. Primeiramente foram realizados testes preliminares onde foram avaliados:

ordem de adição da fase orgânica e fase contínua, tipo de solvente e concentração

do triglicerídeo de cadeia média (TCM) e tensoativos. A partir desses testes ficou

definido que a fase orgânica seria vertida na fase contínua e que os solventes etanol

e etanol+acetona seriam utilizados. As NE foram preparadas pelos métodos de alta

energia de emulsificação (sonicador com ponteira), e pelo método de baixa energia

de emulsificação (emulsificação espontânea). Para o primeiro foram obtidas NE com

diâmetro médio na faixa 66,2±2,1nm a 130±7,9nm. Já para o segundo foi observado

diâmetros médios entre 197,7±9,5nm a 456,7±39,3nm. Para avaliar a influência do

tipo de óleo e tensoativos sobre o diâmetro de gotícula (φ), índice de polidispersão e

potencial Zeta, foi empregado um delineamento fatorial 22 para ambos os métodos.

Para o de alta energia de emulsificação os tensoativos mais adequados foram

Tween®20 e Lipoid®SL80-3 e o óleo o TCM na proporção de 1:1 ou 1:2 (m:m) de

tensoativo e óleo. Para o de baixa energia de emulsificação os tensoativos mais

adequados foram Tween®80 e Lipoid®SL80-3, sendo o óleo uma mistura de ácido

oleico e triglicerídeo de cadeia média na proporção de 1:1 (m:m). Após a definição

das formulações, para ambos os métodos, foram incorporados o glicerol, α-tocoferol

e o ajuste do pH foi feito com o objetivo de manter a integridade físico-química das

NE para uso parenteral. Também foi estudada adição 5% e 12% (m:m) de fármaco à

NE em relação à quantidade de óleo, sendo que 5% de CsA foi incorporado na

formulação obtida pelo método de alta energia de emulsificação (F1,F2 e F6) e 5 e

12% no método de baixa energia de emulsificação (ES9 e ES10) . Além disso, foram

realizados ensaios de estabilidade coloidal 4 °C, 25 °C e 45 °C, durante um período

de 30 dias, sendo observado que quando armazenadas a 4 °C, o processo de

Ostwald “ripening” foi retardado para ambos os métodos. Em seguida, a formulação

considerada mais promissora, em ambas as metodologias, foi submetida a um novo

teste de estabilidade por um período maior a 4ºC. As formulações obtidas por alta

energia de emulsificação permaneceram estáveis por um período de 210 dias,

enquanto as obtidas por baixa energia de emulsificação por 90 dias. O estudo de

eficiência de encapsulação (EE)% foi feito para as formulações F1, F2 e F6, sendo

encontrado ≈90%. Já as formulações ES9 e ES10 EE% foi de ≈65%. Diante dos

resultados apresentados, as formulações obtidas com o sonicador foram julgadas as

mais promissoras, frente às produzidas por emulsificação espontânea, visando à

produção de NE parenterais, sendo o melhor resultado para a F1 com diâmetro

médio de 71,08nm inicialmente e um crescimento ≈15% do seu diâmetro inicial após

210 dias de ensaio a 4ºC.

ABSTRACT

Nanoemulsion consists of a fine dispersion of oil in water with droplets of diameter

ranging from 50 to 600 nm. The objective of this research was to encapsulate the

drug immunosuppressant cyclosporin A nanoemulsion (NE) using as a carrier

system. First preliminary tests were realized they evaluated: order of addition of the

organic phase and continuous phase, solvent and concentration of medium-chain

triglycerides (MCT) and surfactants. From these tests it was determined that the

organic phase should to be added into the continuous phase and the solvent ethanol

+ acetone and ethanol would be used. The NE were prepared by high energy

emulsification methods (sonicator), and the method of low energy emulsification

(spontaneous emulsification). For the first were obtained nanoemulsion with average

droplets diameter ranging from 66.2 ± 2,1nm to 7,9nm ± 130. As for the second were

observed average doplets diameters between 197.7± 9,5nm the 456,7±39,3nm. To

evaluate the influence of the type of oil and surfactants on the droplet diameter (φ),

polydispersity index and Zeta potential, it was used a factorial design 22 for both

methods. For high energy emulsification most suitable surfactants Tween® 20 and

was Lipoid®SL80-3 oil and MCT in a ratio of 1: 1 or 1: 2 (w:w) of oil and surfactant.

For the of low energy emulsification the surfactants was Tween®80 and Lipoid®SL80-

3, the oil was a mixture of oleic acid and medium chain triglyceride in a ratio of 1: 1

(w: w) and the ratio the oil and the surfactant was 1:08 (w:w). After setting the

formulations for both methods were incorporated glycerol, α-tocopherol and was

made pH adjustment in order to maintain the physical and chemical integrity of the

NE for parenteral use. It was also studied adding 5% and 12% (w:w) drug at NE

relative to amount of oil, and 5% of CsA was incorporated into the formulation

obtained by high energy method of emulsification (F1, F2 and F6 ) and 5 to 12% in

the low energy method of emulsification (ES9 and ES10). Also, colloidal stability tests

were performed at 4 °C, 25 °C and 45 °C, for a period of 30 days been observed that

when stored at 4 °C, the process of Ostwald "ripening" was delayed for both

methods. After this first step of the stability test, the formulation considered the most

promising for both methodologies, it was subjected to a further stability test by a

longer period at 4 °C. The formulations obtained by high energy emulsification

method remained stable for a period of 210 days, and formulations obtained by the

method of low energy emulsification for 90 days. The study encapsulation efficiency

(EE).was performed to formulations F1, F2 and F6 encapsulation efficiency was

≈90%. Already ES9 and ES10 formulations EE was ≈65%. On the results presented,

the formulations obtained with the sonicator the most promising were judged,

compared to those produced by spontaneous emulsification, aiming at the production

of NE parenterals. The best result for F1 with an average diameter of 71,08nm

initially and ≈15% growth of its initial diameter after 210 days of testing at 4 °C.

Lista de Ilustrações

Figura 1. Emulsão: (a) água/óleo (a); (b) óleo/água (b) (adaptado de SARTORI

et al, 2010)...........................................................................................................

28

Figura 2. Estrutura química de fosfolipídios presentes nas lecitinas (adaptado

de WASHINGTON, 1996)....................................................................................

32

Figura 3. Estrutura química de Tween 80 e de Pluronic F68 (adaptado de

SIGMA ALDRICH®)..............................................................................................

33

Figura 4. Dispositivos usados na preparação das nanoemulsões usando alta

energia.................................................................................................................

35

Figura 5. Formação de nanoemulsões por emulsificação espontânea

(adaptado de McCLEMENTS, 2011)....................................................................

36

Figura 6. Representação esquemática do potencial Zeta (adaptado de

MALVERN, 2015).................................................................................................

38

Figura 7. Tipos de instabilidades que ocorrem em emulsões: separação

gravitacional, floculação, coalescência e Ostwald "ripening" (adaptado de

McClements, 2011)..............................................................................................

41

Figura 8. Ostwald "ripening"................................................................................. 42

Figura 9. Energia potencial em função da distância entre gotículas (adaptado

de DALTIN, 2011)................................................................................................

44

Figura 10. Tipos de estabilização de coloides: estérica e eletrostática............... 45

Figura 11. Estrutura química de Ciclosporina A (adaptado de BRUXEL et al,

2012)....................................................................................................................

48

Figura 12. Representação esquemática da preparação de NE pela técnica da

emulsificação espontânea....................................................................................

52

Figura 13. Representação esquemática da preparação de nanoemulsões pelo

método de alta energia de emulsificação usando sonicador com ponteira..........

53

Figura 14. Esquema da preparação das amostras para determinar o

percentual de Eficiência de Encapsulação de CsA nas NE.................................

70

Figura 15. (a) Mistura dos tensoativos P - F68 e Lipoid® S100; S100-3 e SL80-

3...........................................................................................................................

81

Figura 16. Mistura de tensoativos T20 e Lipoid® S100; S100-3 e SL80-

3...........................................................................................................................

82

Figura 17. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD; c) potencial Zeta,

durante 30 dias. Amostras F1 e F2, com e sem evaporação do

solvente................................................................................................................

92

Figura 18. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD; c) potencial Zeta

durante 30 dias. Amostras F6 e F7, com e sem evaporação do solvente...........

93


durante 120 dias. Amostras F1, F2, F6 e F7, com evaporação do solvente........

95


durante 30 dias. Amostras F2 e F6, a 4°C e 25°C...............................................

98

Figura 21. Distribuição do diâmetro médio obtida via espalhamento dinâmico

de luz. Amostras F2 e F6, a 4°C, após 30 dias....................................................

99

Figura 22. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1; 15;

30. Amostra F2 com CsA (adicionado antes ou depois da emulsificação) e

sem CsA.............................................................................................................

100

Figura 23. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1; 15;

30. Amostra F6 com CsA (adicionado antes ou depois da emulsificação) e

sem CsA.............................................................................................................

101

Figura 24. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, durante 30 dias.

Amostras F2 e F6, com CsA (adicionado antes ou depois da emulsificação)...

103

Figura 25. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, durante 120

dias. Amostras F2 e F6, com e sem glicerol e pH ajustado entre 6,5 e 7,0.......

105

Figura 26. a) Diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1 e 120. Amostras F2 e F6,

com e sem glicerol e pH ajustado entre 6,5 e 7,0..............................................

106

Figura 27. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, durante 120

dias. Amostras F2 e F6, com e sem glicerol e pH ajustado entre 6,0 a 6,88.....

107

Figura 28. a) Diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1 e 120. Amostras F2 e F6,

com e sem glicerol e pH ajustado entre 6,0 a 6,88............................................

108

Figura 29. Distribuição do diâmetro. Amostras F2 e F6 a 25°C, após 120

dias....................................................................................................................

110

Figura 30. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.

Amostra F2 a 4°C, 25°C e 45°C.........................................................................

112


Amostra F19 a 4°C, 25°C e 45°C.......................................................................

113


Amostra F27 a 4°C, 25°C e 45°C.......................................................................

114


Amostra F6 a 4°C, 25°C e 45°C.........................................................................

115


Amostra F20 a 4°C, 25°C e 45°C.......................................................................

116


Amostra F28 a 4°C, 25°C e 45°C.......................................................................

117


Amostra F29 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................

119


Amostra F30 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................

120


Amostra F31 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................

121


Amostra F32 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................

122


Amostra F33 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................

123


Amostra F34 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................

124


Amostra F35 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................

125


Amostra F36 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................

126


Amostra F37 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................

127

Figura 45. Distribuição do diâmetro. Amostra F35 a 4°C................................... 128

Figura 46. Distribuição de tamanho. Amostra F36 a 4°C................................... 128


Amostras F1, F2 e F6 com 5% (m:m) de CsA...................................................

130

Figura 48. Variação temporal do a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.

Amostras F1, F2 e F6 com 12% (m:m) de CsA.................................................

131


Amostra F1 com 10% de α-tocoferol..................................................................

133



134



135



136


Amostra F2, com 30% de α-tocoferol.................................................................

137


Amostra F6, com 30% de α-tocoferol, a 4°C......................................................

138


Amostras F1, F2 e F6, com 10% de α-tocoferol, a 4°C.....................................

140


Amostras ES1, ES2, ES3, ES4, ES5 e ES6, a 25°C.........................................

142


Amostras ES7, ES8, ES9, ES10 e PL, a 4°C....................................................

144

Figura 58 Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias.

Amostras ES7, ES8, ES9, ES10 e PL, a 25°C..................................................

145


Amostras ES7, ES8, ES9, ES10 e PL, a 45°C..................................................

146


Amostras ES11, ES12, ES13, ES14 e PL, a 4°C..............................................

149


Amostras ES11, ES12, ES13, ES14 e PL, a 25°C............................................

150


Amostras ES11, ES12, ES13, ES14 e PL, a 45°C............................................

151

Figura 63 Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias.

Amostras ES9, ES10, ES13 e ES14 com ácido oleico, a 4°C...........................

155


Amostras ES9, ES10, ES13 e ES14 com ácido oleico, a 25°C.........................

156


Amostras ES9, ES10, ES13 e ES14 com ácido oleico, a 45°C.........................

131


Amostras ES9 e ES10 com 12% de CsA, a 4°C................................................

133


Amostras ES9 (5% de CsA) e ES10 (12% de CsA), a 4°C................................

135

Figura 68. Distribuição do diâmetro médio de ES9 e ES10............................... 137

Figura 69. Curva de calibração da CsA obtida após análise das soluções

padrões do fármaco por CLAE...........................................................................

138

Figura 70. Cromatograma com o perfil do pico de absorção da ciclosporina A. 138

Figura 71. Micrografia dos cristais de ciclosporina A: a) CsA com um

aumento de 10000 vezes e b) CsA com um aumento de 4500 vezes...............

140

Figura 72. Micrografia das membranas de PVDF de 0,45µm: a) com aumento

de 200 vezes e b) com aumento de 2000 vezes...............................................

140

Figura 73. Micrografia da amostra F6 em membranas de PVDF de 0,45µm:

a) com aumento de 2000 vezes e b) com aumento de 500 vezes....................

141

Figura 74. Micrografia da amostra ES9 em membranas de PVDF de 0,45µm:

a) com aumento de 2000 vezes e b) com aumento de 500 vezes....................

141

Lista de tabelas

Tabela 1. Aplicações de tensoativos de acordo com o valor do BHL................ 46

Tabela 2. Composição das NE com Lipoid® 75S e Pluronic® F68 como

tensoativos..........................................................................................................

56

Tabela 3. Níveis relacionados ao tempo de sonicação e potência de

ultrassom para cada ensaio do planejamento experimental 22 com ponto

central (Plan.1)...................................................................................................

57

Tabela 4. Níveis relacionados ao tempo de sonicação e potência do


central (Plan. 2)..................................................................................................

57

Tabela 5. Valores de BHL dos tensoativos........................................................ 58

Tabela 6. Composição das NE seguindo os valores de BHL da mistura........... 58

Tabela 7. Níveis relacionados ao tempo de sonicação e potência do


central, para os tensoativos SL80-3 e T20.........................................................

58

Tabela 8. Níveis relacionados ao tempo e velocidade do dispersor para cada

ensaio do planejamento experimental 22 (Plan. 1).............................................

59

Tabela 9. Níveis relacionados ao tempo e velocidade do dispersor para cada

ensaio do planejamento 22 (Plan 2)....................................................................

61

Tabela 10. Composição das NE com etanol...................................................... 61

Tabela 11. Composição das NE com acetona:etanol (1:1) (v:v)........................ 62

Tabela 12. Composições das NE com e sem glicerol........................................ 63

Tabela 13. Composições das NE para o teste de estabilidade térmica............. 64

Tabela 14. Composições das NE produzidas mediante emulsificação

espontânea.........................................................................................................

65

Tabela 15. Níveis do planejamento para NE produzidas em etanol.................. 66

Tabela 16. Níveis do planejamento para NE produzidas em acetona e etanol. 67

Tabela 17. Composição das NE produzidas por emulsificação espontânea

com diferentes tensoativos não iônicos..............................................................

68

Tabela 18. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta.............................................. 73

Tabela 19. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta (formulações P1 e P2 com e

sem evaporação do solvente), nos dias 1 e 15..................................................

74

Tabela 20. Aspecto visual das NE e valores de BHL da mistura de

tensoativos..........................................................................................................

75

Tabela 21. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta (Plan 1)................................ 76


Tabela 23. Efeito do tipo de tensoativo não iônico na estabilidade das NE e

BHL da mistura de tensoativos...........................................................................

79

Tabela 24. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta de NE produzidas com

tensoativos T20/L80-3........................................................................................

83

Tabela 25. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta............................................. 85


Turrax (4000 rpm e 5 min)..................................................................................

86


Turrax 5000 rpm e 5 min....................................................................................

87



Tabela 30. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta.............................................. 89

Tabela 31. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta para NE com etanol, após 1

dia.......................................................................................................................

90

Tabela 32. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta para NE com

acetona/etanol (50:50, v:v), após 1 dia..............................................................

90

Tabela 33. Variação temporal do pH de F2 e F6, com e sem glicerol, a 4°C e

25°C....................................................................................................................

111

Tabela 34. Variação temporal do pH das amostras F1, F2 e F6, a 25°C.......... 139

Tabela 35. Resultados de NE produzidas em etanol por emulsificação

espontânea 1dia 25°C........................................................................................

147

Tabela 36. Resultados de NE produzidas na mistura acetona:etanol por

emulsificação espontânea 1dia a 25°C..............................................................

152

Tabela 37. Resultados de NE produzidas com ácido oleico.............................. 158

Tabela 38. Variação temporal do pH de ES9 (5%CsA) e ES10 (12%CsA), em

4°C por 90 dias..................................................................................................

162

Tabela 39. Determinação de EE(%) a 4°C......................................................... 165

Lista de Siglas e Abreviaturas

φ: Diâmetro médio

ζ: – Potencial Zeta

®: - Marca registrada

A/O: Água em Óleo

BHL: – Balanço Hidrofílico Lipofílico

CLAE: Cromatografia líquida de alta eficiência

col.: Colaboradores

CsA: Ciclosporina A

DLS: Espalhamento Dinâmico de Luz (Dynamic Light Scattering)

EE: Eficiência de encapsulação

FO: Fase orgânica

FA: Fase aquosa

HCL: Ácido clorídrico

IPD: Índice de polidispersidade

L-S100: Lipoid® S100

L-S100-3: Lipoid® S100-3

L-SL80-3: Lipoid® SL80-3

L-S75: Lipoid® S 75

MEV: Microscopia eletrônica de varredura

M1: Metodologia 1

M2: Metodologia 2

M3: Metodologia 3

mg: Miligrama

min.: Minuto

mL: Mililitro

m:m: Relação massa por massa

m:v: Relação massa por volume

NaOH: Hidróxido de sódio

NE: Nanoemulsão

nm: Nanômetro

O/A: Óleo em Água

PCS: Espectroscopia de Correlação de Fótons (Photon Correlation Spectroscopy)

P-F68: Pluronic® F68

pH: Potencial Hidrogeniônico

Plan.1: Planejamento 1

Plan.2: Planejamento 2

PVDF: Polivinilideno

Ps: Potência do sonicador

rpm: Rotação por minuto

S1: Metodologia 1, adotada no processo de emulsificação espontânea

S2: Metodologia 2, adotada no processo de emulsificação espontânea

T+TCM: Tensoativos mais triglicerídeo de cadeia média

T20: Polisorbato 20

T80: Polisorbato 80

TCM: Triglicerídeos de cadeia média

TCL: Triglicerídeos de cadeia longa

ts: Tempo de sonicação

UV/Vis: Ultravioleta-Visível

µg: Micrograma

U.A.: Unidade de Absorbância

v:v: Relação volume por volume

W: Watt

SUMÁRIO

I. INTRODUÇÃO 27

1.1. Emulsões parenterais.................................................................................. 27

1.2. Nanoemulsões para uso parenteral............................................................ 29

1.3. Composição e seleção de excipientes para nanoemulsões....................... 30

a) Óleos....................................................................................................... 30

b) Tensoativos............................................................................................. 31

Lecitinas............................................................................... 31

Tensoativos não iônicos....................................................... 32

Aditivos................................................................................. 33

1.4. Métodos de preparação.............................................................................. 33

a) Alta Energia............................................................................................. 34

Homogeneizadores ultrassônicos........................................ 34

b) Baixa energia........................................................................................... 35

Emulsificação espontânea.................................................... 36

1.5. Caracterização física de nanoemulsões..................................................... 37

a) Espectroscopia de correlação de fótons.................................................. 37

b) Potencial Zeta.......................................................................................... 38

c) pH............................................................................................................ 40

1.6. Fatores que interferem na estabilização..................................................... 40

1.6.1. Instabilidade e mecanismos de fragmentação......................................... 41

a) Separação gravitacional.......................................................................... 41

b) Floculação e coalescência....................................................................... 42

c) Ostwald "ripening"................................................................................... 42

1.6.2. Estabilidade de nanoemulsões................................................................ 43

Tipos de interação entre as gotículas................................... 43

1.6.3. Seleção de tensoativos............................................................................ 45

Balanço hidrofílico lipofílico (BHL)........................................ 45

Cálculo de BHL da mistura de tensoativos........................... 46

1.7. Otimização do processo de obtenção de nanoemulsões........................... 47

1.8. Ciclosporina A (CsA)................................................................................... 47

II. OBJETIVOS 49

2.1 Geral................................................................................................... 49

2.2 Específicos.......................................................................................... 49

III. PARTE EXPERIMENTAL 50

3.1 Reagentes e equipamentos....................................................................... 50

3.1.1 Equipamentos............................................................................................ 50

3.1.2 Reagentes............................................................................................... 50

3.2 Procedimentos......................................................................................... 51

3.2.1 Métodos de preparação das nanoemulsões 51

3.2.1.1 Método de baixa energia de emulsificação (técnica de emulsificação

espontânea Bouchemal e col., 2004).................................................................

51

3.2.1.2 Método de alta energia de emulsificação, usando sonicador de

ponteira..........................................................................................................

52

3.3 Planejamentos fatoriais usados no desenvolvimento das nanoemulsões... 53

3.3.1 Planejamentos fatoriais 22......................................................................... 54

Formulações iniciais............................................................. 55

3.3.2 Preparação de NE utilizando Poloxamer 188 (Pluronic®F68) e lecitina

de soja (Lipoid®S75) como tensoativos..............................................................

55

3.3.2.1 Influência da ordem de adição da FO e FA e do tipo de solvente......... 55

3.3.2.2 Influência da concentração de tensoativos e TCM................................ 56

3.3.3 Preparação de NE usando sonicador com ponteira................................. 56

3.3.3.1 Influência do tempo de sonicação e potência do ultrassom.................. 56

3.4 Influência dos diferentes tensoativos na estabilidade das NE................ 58

3.4.1 Balanço Hidrofílico-Lipofílico (BHL)......................................................... 58

3.5 Otimização das NE obtidas pelo método de alta energia....................... 59

3.5.1 NE produzidas com lecitina SL80-3 e T 20 como tensoativos................ 59

3.5.2 Testes utilizando agitador magnético e UltraTurrax na pré-emulsão........ 59

3.5.2.1 Agitação magnética................................................................................ 60

3.5.2.2Homogeneizador UltraTurrax, com dispersor de policarbonato

(PC/PEEK-S25D-10G-KS).................................................................................

60

3.5.3 NE produzidas com homogeneizador Ultra-Turrax, com dispersor de

aço inox..............................................................................................................

60

3.5.3.1NE γ-2 e δ-2............................................................................................ 61

3.6 Influência da proporção de TCM:tensoativos e tipo de solvente................ 61

3.7 Influência da temperatura de armazenamento........................................... 61

3.8 Influência do método de incorporação do fármaco na NE......................... 62

3.9 Influência do pH e glicerol.......................................................................... 62

3.10 Estabilidade térmica................................................................................... 63

3.10.1 Influência do aumento da fase aquosa................................................... 64

3.11 Influência da incorporação de 5% ou 12% de CsA.................................... 64

3.12 Influência da incorporação de α-tocoferol.................................................. 64

3.13 NE obtidas mediante emulsificação espontânea....................................... 65

3.13.1 Influência da proporção TCM:tensoativos e tipo de solvente................. 65

3.13.2 Influência do tipo de tensoativo............................................................... 65

3.13.2.1 NE produzidas em etanol..................................................................... 65

3.13.2.2 NE produzidas em mistura de acetona e etanol.................................. 66

3.13.3 Influência da incorporação de 5 ou 12% de CsA.................................... 67

3.13.4 Influência da adição do ácido oleico....................................................... 67

3.14 Caracterização das NE......................................................................... 68

3.14.1 Determinação do pH............................................................................... 68

3.14.2 Obtenção do diâmetro médio das gotículas (φ, Z average) e índice de

polidispersão (IPD).............................................................................................

68

3.14.3 Obtenção do potencial Zeta (ζ mV)......................................................... 69

3.15 Determinação da quantidade de CsA presente nas NE.......................... 69

3.15.1 Condições experimentais........................................................................ 69

3.15.2 Curva analítica........................................................................................ 69

3.15.3 Eficiência de enscapsulação (EE)......................................................... 69

3.15.4 Microscopia eletrônica de varredura....................................................... 70

IV RESULTADOS E DISCUSSÃO 72

4. Preparação de NE com Poloxamer 188 (Pluronic® F68) e lecitina de soja

(Lipoid®S75).......................................................................................................

72

4.1 Influência da ordem de adição da fase orgânica (FO) e aquosa (FA) e do

tipo de solvente..................................................................................................

72

4.2 Influência da concentração de tensoativos e de TCM................................. 73

4.3 Preparação de NE usando sonicador com ponteira.................................... 75

4.3.1 Influência do tepo de sonicação e potência do ultrassom........................ 75

4.4 Influência do tipo de tensoativo na estabilidade das NE........................... 78

4.4.1 Balanço Hidrofílico-Lipofílico (BHL).......................................................... 78

4.5 Otimização da NE com SL80-3 e T20 como tensoativos produzidas pelo

método de alta energia......................................................................................

83

4.6 Influência da pré-emulsão nas propriedades da NE sonicada.................... 84

4.6.1 Agitação magnética................................................................................... 85

4.6.2Homogeneizador UltraTurrax, com dispersor de policarbonato

(PC/PEEK-S25D-10G-KS).................................................................................

85

4.6.3 NE produzidas com homogeneizador Ultra-Turrax, com dispersor de

aço inox..............................................................................................................

88

4.7 Influência da concentração de tensoativos................................................ 89

4.8 Influência da temperatura de armazenamento........................................... 96

4.9 Influência do método de incorporação da CsA na NE............................... 99

4.10 Influência do pH e de glicerol..................................................................... 104

4.11 Estabilidade térmica................................................................................... 111

4.11.1 Influência do aumento da fase aquosa................................................... 118

4.12 Influência da incorporação de 5% ou 12% de CsA.................................... 129

4.13 Influência da incorporação de α-tocoferol.................................................. 132

4.14 NE obtidas mediante emulsificação espontânea....................................... 141

4.14.1 Influência da proporção óleo :tensoativo................................................. 141

4.15 Influência do tipo de tensoativo................................................................. 143

4.15.1 NE produzidas em etanol ....................................................................... 144

4.15.2 NE produzidas em mistura de acetona:etanol........................................ 148

4.16 Influência da adição do ácido oleico.......................................................... 153

4.17 Influência da incorporação de 12% de CsA............................................... 158

4.18 Estudo de estabilidade das NE obtidas por emulsificação espontânea..... 160

4.19 Determinação da quantidade de CsA presente nas NE............................ 163

4.19.1 Curva de calibração para a CsA............................................................. 163

4.19.2 Determinação da eficiência de encapsulação......................................... 165

4.19.3 Microscopia Eletrônica de Varredura.................................................... 165

V. CONCLUSÃO 168

VI. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS 169

VII. REFERÊNCIAS 170

27

l. INTRODUÇÃO

O desenvolvimento de formulações farmacêuticas eficazes tem sido cada

vez mais pesquisado, pois estima-se que 70% dos fármacos altamente promissores

apresentam duas características que dificultam sua administração: alta massa molar

e elevada lipofilicidade. A baixa solubilidade de fármacos em água representa

grande limitação, pois reduz consideravelmente sua biodisponibilidade (KECK &

MULLER, 2006; SHAFIQ-un-NABI e col., 2007; GAO e col., 2008).

Com o propósito de aumentar a solubilidade desses fármacos e diminuir

possíveis efeitos colaterais, diversas estratégias têm sido estudadas, como adição

de tensoativos, de solventes orgânicos ou de tampões, uso de sistemas carreadores

como complexos de inclusão com ciclodextrinas, lipossomas, nanopartículas,

emulsões lipídicas, micro e nano dispersões, entre outras (YOUNG e col., 2003;

BRUXEL e col., 2012). No entanto, alguns desses sistemas apresentam restrições

quanto à biocompatibilidade, podem sofrer degradação (YOUNG e col., 2003;

BRUXEL e col., 2012), etc. Neste contexto, sistemas nanoparticulados lipídicos têm

se mostrado interessantes por apresentar várias vantagens, abordadas a seguir

(SILA e col., 2008).

1.1. Emulsões parenterais

Tradicionalmente, emulsões lipídicas são usadas para dispensar

fármacos pouco solúveis em água. Também são usadas como suprimento de

energia, especialmente em neonatos, em termos de ácidos graxos essenciais e

triglicérides. Um exemplo é o composto Intralipid®, primeira emulsão parenteral,

comercializada desde 1960, usada como fonte de calorias para pacientes

impossibilitados de se alimentar por via entérica (FLORENCE & ATWOOD, 2003).

Outro grande interesse no uso de emulsões lipídicas é a possibilidade de

melhorar a biodisponibilidade de fármacos com baixa solubilidade em água (JOSHI

& MULLER, 2009). Por exemplo, griseofulvina, um antifúngico, apresenta melhor

absorção oral quando em emulsão, pois esta possibilita aumento de sua

solubilidade. Outro exemplo é o uso do Intralipid® como veículo de fármacos

lipofílicos para uso intravenoso. Há também as emulsões Diazemuls® (Diazepam) e

28

Diprivan® (Propofol), são usadas como alternativa à solubilização desses fármacos

em sistemas micelares não iônicos (FLORENCE & ATWOOD, 2003; SILA-on, 2008;

JOSHI & MULLER, 2009; PRAKASH-U & THIAGARAJAN, 2011).

Shadkhan (1997) e Egito (2003) também relataram a utilização de

emulsões lipídicas como Intralipid® e Luprofudin® para infusão parenteral visando

redução da toxicidade de Anfotericina B, devido à baixa biodisponibilidade deste

fármaco.

Sistemas lipídicos permitem o aumento da biodisponibilidade de fármacos

lipofílicos, mas, além disso, tem vantagem de serem não tóxicos, pois fazem parte

de sua composição lipídios similares aos fisiológicos (HEURTAULT e col., 2003).

Em geral, emulsões lipídicas são sistemas heterogêneos onde um líquido

(fase interna) é disperso em outro (fase contínua) sob a forma de pequenas

gotículas. Para reduzir a tensão na interface entre esses dois líquidos imiscíveis, há

necessidade de um terceiro componente, o tensoativo, que também forma uma

barreira capaz de evitar coalescência das gotículas (FLOYD, 1999). Emulsões nas

quais a fase contínua é aquosa e a interna oleosa são conhecidas como emulsões

óleo em água (O/A) (Fig. 1b). Em caso oposto a emulsão é denominada água em

óleo (A/O) (Fig. 1a) (GERSHKOVICH e col., 2008).

Figura 1. Emulsão: (a) água/óleo; (b) óleo/água (adaptado de SARTORI e col.,

2010).

29

Para ser considerada uma emulsão eficaz e segura para infusão

parenteral, além das características já citadas, outros requisitos também são

necessários, como estabilidade físico-química e biológica, prolongado tempo na

circulação, ser biodegradável e ter diâmetro reduzido de gotículas. Este último

merece atenção especial, pois é fator crítico durante o desenvolvimento dessas

emulsões. Partículas >5µm são clinicamente inaceitáveis, pois podem causar efeitos

colaterais, como embolia pulmonar. Assim, é aconselhável que o diâmetro de

emulsões parenterais variarem entre 50nm à 1µm (JUMMA & MULLER, 1998;

FLODY, 1999; GERSHKOVICH e col., 2008).

1.2. Nanoemulsões para uso parenteral

Nanoemulsões constituem dispersão de óleo em água e apresentam

diâmetro de gotícula entre 50 e 600 nm (BOUCHEMAL col., 2004; TADROS e col.,

2004; SOLANS e col., 2005). São sistemas termodinamicamente instáveis, pois tem,

espontaneamente, tendência em separar fases, mas cineticamente estáveis

(GUTIÉRREZ e col., 2008; ANTON & VANDAMME, 2011). Esses sistemas possuem

algumas vantagens, como aumento da estabilidade, prevenindo cremeação,

floculação e coalescência, o fenômeno denominado Ostwald "ripening", que sozinho

governa o processo de desestabilização. Ainda se pode citar que o aumento da área

superficial das gotículas, devido à redução do diâmetro, aumenta a capacidade de

solubilizar grande quantidade de fármacos hidrofóbicos ou mesmo aqueles que não

são solúveis em alguns triglicerídeos ou em soluções com tensoativos

(CONSTANTINIDES e col., 2008; KOURNIATIS e col., 2010; ANTON &

VANDAMME, 2011).

As propriedades físico-químicas de nanoemulsões são influenciadas

pelas condições de emulsificação e pela composição (quali e quantitativa) das

formulações (BENITA & LEVY, 1993; MARTINI e col., 2007). A seleção mais

adequada dos excipientes usados na formulação depende do tipo de aplicação da

nanoemulsão. No caso de nanoemulsões para uso parenteral a seleção dos

componentes da formulação é importante, como será visto a seguir.

30

1.3. Composição e seleção de excipientes para nanoemulsões

Excipientes utilizados na preparação de nanoemulsões devem ser

biodegradáveis e bicompatíveis, prevenindo contra possíveis efeitos tóxicos e

irritantes. Geralmente estão presentes na formulação de nanoemulsões de três a

cinco componentes que formam a fase aquosa, a oleosa e a interface (BENITA &

LEVY, 1993; FLOYD, 1999; MAGALHÃES, 2000).

a) Óleos

Óleos utilizados para aplicações parenterais devem ser purificados para

remover compostos capazes de causar possíveis efeitos adversos. Podem ser de

origem vegetal ou semi-sintética, constituídos de triglicerídeos de cadeia média

(TCM) e longa (TCL). TCM têm vantagem de ser cerca de 100 vezes mais solúveis

em água que TCL, reduzindo efeitos colaterais quando a emulsão é injetada.

(BENITA & LEVY, 1993; FLOYD, 1999; FRONZA e col., 2004; TIWARI & AMIJI,

2007).

A escolha do óleo a ser empregado depende, primeiramente, da

solubilidade do fármaco a ser veiculado e das propriedades físico-químicas deste na

formulação (BOUCHEMAL e col., 2004; FRONZA e col., 2004). Por exemplo, óleos

com viscosidade elevada dificultam a preparação de nanoemulsões em

homogeneizadores de alta pressão, pois limitam a ruptura das gotículas, resultando

nanoemulsões com gotículas de diâmetros inadequados (McCLEMENTS & RAO,

2011).

Os principais óleos utilizados para esta finalidade são de soja, milho,

algodão, rícino, amendoim, gergelim, TCM, coco, esqualeno e oleato de etila

(BENITA & LEVY, 1993; JUMMA & MULLER, 1998; TIWARI & AMIJI, 2007), sendo

também empregadas misturas de TCM e TCL. Um exemplo é a emulsão

Lipofundin®, formada por mistura de 10% de TCM e 20% de TCL (em massa) que

torna essa emulsão uma fonte de energia facilmente metabolizável, devido à maior

solubilidade de TCM em meio aquoso. Nos estudos realizados por KELMANN.

(2007) formulações que continham misturas de óleo de rícino (TCL) com TCM

solubilizaram maior quantidade de carbamazepina, comparadas com as formulações

sem TCM.

31

b) Tensoativos

A presença de tensoativo na nanoemulsão aumenta a estabilidade em

longo prazo. Por isso a escolha do tensoativo (ou mistura de tensoativos) apropriado

é importante para obter nanoemulsões estáveis. Moléculas de tensoativos são

anfifílicas, pois apresentam uma região apolar (hidrofóbica) e outra polar (hidrofílica),

possibilitando adsorção na superfície das gotas de óleo, facilitando a dispersão em

meio aquoso e evitando agregação (FLORENCE & ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011;

McCLEMENTS & RAO, 2011).

Há grande variedade de tensoativos, mas um número restrito é aprovado

para uso parenteral em humanos. Os mais empregados são lecitinas (fosfolipídios),

copolímeros em bloco de polioxietileno e polioxiproprileno (Poloxamer®) e

monooleato de sorbitano etoxilado (Tween®) (BENITA & LEVY, 1993; JUMMA &

MULLER, 1998; FLOYD, 1999; BRUXEL e col., 2012).

Lecitinas

Os tensoativos mais utilizados na preparação de emulsões para uso

parenteral são as lecitinas (Fig. 2), pois apresentam grande biocompatibilidade, são

biodegradáveis e tem elevada pureza (BRUXEL e col., 2012). Podem ser de origem

animal (gema de ovo) ou vegetal (soja), sendo constituídas por mistura de

fosfolipídios, onde a fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina são neutras em pH 7 e a

fosfatidilserina e o ácido fosfatídico são negativas em pH 7. Embora estes 2 últimos

estejam presentes em pequena quantidade (2-5%, em massa) são suficientes para

conferir carga na superfície das gotículas (-40 a -60 mV), estabilizando a emulsão

(BENITA & LEVY, 1993; WASHINGTON, 1996; BRUXEL e col., 2012).

32

Figura 2. Estrutura química de fosfolipídios presentes nas lecitinas (adaptado de

WASHINGTON, 1996).

Tensoativos não iônicos

Tensoativos não iônicos, sintéticos, também são utilizados em

nanoemulsões, formam uma barreira estérica na interface, impedindo agregação das

gotículas, estabilizando o sistema. Os principais tensoativos não iônicos são os

derivados do polioxietileno e polioxiproprileno (Poloxâmer® 188 ou Pluronic® F68) e

os polioxietileno-sorbitanos (Tween®80 e 20) (FLOYD,1999; BRUXEL e col.,2012).

No estudo realizado por Bouchemal e col. (2004) para uma metodologia de

emulsificação espontânea, o uso do Pluronic® F68 associado com lecitina de soja

não hidrogenada estabilizou e reduz o diâmetro das gotículas, quando comparado

com sistemas com Tweens®. Já o estudo realizado por PRABHAKAR (2013),

também para uma metodologia de emulsificação espontânea, demonstrou que um

aumento da quantidade de Tween® 80 na formulação das nanoemulsões, reduziu o

diâmetro das gotículas de 237,0 ± 5,08 nm (sem adição do tensoativo) para 196,0 ±

3,54 nm (com adição de 1% m:v do tensoativo). A polidispersidade também foi

alterada de 0,245 ± 0,01 (sem tensoativo) para 0,068 ± 0,03 (com adição de 1% m:v

33

do tensoativo). Pode-se perceber que o uso desse tipo de tensoativo poderá

beneficiar ou não no diâmetro médio das gotículas, isso irá depender da

concentração e dos outros constituintes presentes na emulsão.

Figura 3. Estrutura química de Tween® 80 e de Pluronic® F68 (adaptado de SIGMA

ALDRICH®).

Aditivos

Aditivos são adicionados à formulação com objetivo de ajustar a

tonicidade e o pH. Glicerol (2% em massa) é utilizado como agente isotônico na

dispersão (MARTINI e col., 2007). Soluções aquosas de HCl e de NaOH são usadas

para ajustar o pH (6–8). Esse intervalo de pH é justificado pela compatibilidade

fisiológica e para prevenir hidrólise, indesejável, de fosfolipídios, do TCM e TCL. O

decréscimo do pH pode sugerir a presença de ácidos graxos livres provenientes da

hidrólise, indicando instabilidade (BENITA & LEVY, 1993; FLOYD, 1999;

HEURTAULT e col., 2003; FRONZA e col., 2004; BRUXEL e col., 2012).

1.4. Métodos de preparação

Nanoemulsões não se formam de maneira espontânea. É necessário o

aporte de energia mecânica, sendo usados métodos que envolvem energia baixa e

alta.

34

a) Alta Energia

Neste caso a amostra é processada em equipamentos capazes de

deformar e romper as gotículas, mediante aplicação de elevada força de

cisalhamento. Estes equipamentos compreendem homogeneizadores de alta

pressão, microfluidizadores, sonicadores e dispersores com alto grau de

cisalhamento (UltraTurrax®) (Fig. 4). Neste caso o experimentador tem um controle

maior sobre o diâmetro das gotículas (KOURNIATIS e col., 2010; LOVELYN &

ATTAMA, 2011). Existe, ainda, a tecnologia denominada SolEmuls® que consiste na

combinação do fármaco com emulsão já disponível no mercado, como o Intralipid®.

Mediante agitação em alta velocidade, combinada com ultrassom, forma-se uma

dispersão híbrida de gotículas de óleo e partículas de fármaco (BRUXEL e col.,

2012).

Homogeneizadores ultrassônicos

Empregam ultrassom gerando forças intensas, necessárias para romper

as gotas de óleo. Este sonicador contém um cristal de quartzo piezoelétrico que

expande e contrai em resposta à aplicação de um campo elétrico alternado. Estas

expansões/contrações são transferidas a uma ponteira de uma liga de titânio, imersa

na emulsão, gerando ondas sonoras que provocam cavitação produzindo

microbolhas que colapsam liberando enorme quantidade de energia, rompendo as

gotículas (PÉREZ e col.,2009; DALTIN, 2011; McCLEMENTS & RAO, 2011).

Para que a homogeneização seja eficiente e uniforme é importante

garantir que a emulsão fique tempo suficiente no sonicador. O tipo e a quantidade de

tensoativo presente também são parâmetros que influenciam a homogeneização. É

importante ressaltar que o sonicador deve ser usado com cautela, pois pode ocorrer

degradação de alguns componentes presentes na nanoemulsão, devido à alta

energia aplicada (McCLEMENTS & RAO; 2011).

35

Figura 4. Dispositivos usados na preparação das nanoemulsões usando alta

energia.

b) Baixa energia

A estratégia com emprego de baixa energia requer o entendimento do

comportamento das fases e as propriedades físico-químicas dos constituintes para

formar gotículas. Neste tipo de método estão compreendidos: emulsificação

espontânea, a transição de fases causada por alteração da composição e a

transição de fases causada pela temperatura (ANTON & VANDAMME, 2011;

LOVELYN & ATTAMA, 2011; KOROLEVA & YURTOV, 2012). Na transição de fases

a nanoemulsão é obtida alterando os parâmetros (temperatura e composição) que

afetam o balanço hidrofílico–lipofílico (IZQUIERDO e col., 2005; MORAIS e col.,

36

2006). Na emulsificação espontânea a nanoemulsão é formada pela difusão rápida

do solvente orgânico. Esta última tem recebido mais atenção, pois é facilmente feita

no laboratório, não requer equipamentos sofisticados, não usa altas temperaturas e

leva a formulações com tamanho reduzido de partículas (KELMANN e col., 2007;

ANTON & VANDAMME, 2011). Como esta foi uma das técnicas usadas nos

experimentos desta Tese, um esclarecimento mais detalhado será descrito a seguir.

Emulsificação espontânea

Neste caso o fármaco lipofílico é dissolvido em um solvente orgânico

juntamente com o óleo que constitui a fase interna e o tensoativo lipofílico. A fase

dispersante é formada pela água e pelo segundo tensoativo de natureza hidrofílica.

A fase orgânica é vertida, lentamente, sobre a fase aquosa, sob agitação mecânica

constante e em temperatura ambiente (Fig. 5). O solvente orgânico é removido por

evaporação à pressão reduzida (LOVELYN & ATTAMA, 2011; KOROLEVA &

YURTOV, 2012). Acredita-se que neste caso ocorram instabilidades na interface,

induzidas pela rápida difusão do solvente orgânico, reduzindo a tensão superficial e

resultando na dispersão e formação das gotículas. A dispersão ocorre, pois o

decréscimo da tensão superficial aumenta espontaneamente a área superficial na

interface (KELMANN e col., 2007; KOROLEVA & YURTOV, 2012).

Figura 5. Formação de nanoemulsões por emulsificação espontânea (adaptado de

McCLEMENTS, 2011).

37

1.5. Caracterização física de nanoemulsões

a) Espectroscopia de correlação de fótons

Várias técnicas podem ser usadas para determinar o diâmetro médio (φ) e

a distribuição de tamanho das gotículas. Entretanto, a mais utilizada é a

espectroscopia de correlação de fótons (Photon Correlation Spectroscopy–PCS),

também conhecido como espalhamento dinâmico de luz (Dynamic Light Scattering–

DLS) (HUNTER, 1996).

O princípio desta técnica está em calcular o valor do coeficiente de

difusão a partir das flutuações da intensidade da luz espalhada, causadas pelo

movimento Browniano. Partículas, quando em suspensão, apresentam movimento

Browniano e, dependendo da velocidade de difusão das partículas, ocorre variação

da intensidade da luz espalhada. A velocidade de difusão depende do diâmetro das

partículas, quanto menor o diâmetro, mais rapidamente elas se movem (HUNTER,

1996; JOSHI e col., 2008; CARDOSO, 2012). O diâmetro hidrodinâmico da partícula

(dH) pode ser determinado usando a relação de Stokes-Einstein (equação 1)

(MALVERN, 2012).

D =

(1)

onde k é a constante de Boltzmann, T é a temperatura absoluta, η a viscosidade do

solvente, RH

o raio hidrodinâmico e D o coeficiente de difusão.

No caso de nanoemulsões para uso parenteral o diâmetro médio das

gotículas e a distribuição de tamanhos são características importantes a serem

determinadas. O diâmetro deve ser compatível com o diâmetro dos vasos

sanguíneos. Gotículas com φ superior a 5 µm são clinicamente inaceitáveis, pois

podem causar embolia (BENITA & LEVY, 1993, FLOYD,1999).

O monitoramento temporal do diâmetro das gotículas também permite

verificar a estabilidade das nanoemulsões. Fenômenos como floculação,

coalescência, cremeação e separação de fases são indicativos de emulsões

instáveis (FLOYD, 1999; SCHAFFAZICK e col., 2003; BRUXEL e col., 2012).

38

b) Potencial Zeta

O potencial Zeta (ζ) é uma propriedade física de partículas em suspensão,

sendo utilizado para prever e controlar a estabilidade de emulsões (DALTIN, 2011;

MALVERN, 2015). O entendimento sobre o potencial Zeta depende do

conhecimento sobre a dupla camada elétrica. Grande parte de materiais particulados

adquirem carga elétrica superficial quando em contato com um líquido polar. Essa

carga influencia a distribuição espacial dos íons que estão próximos à superfície da

partícula, atraindo íons de carga oposta e repelindo íons de mesma carga. Isto faz

com que aumente a concentração de íons nessa região, sendo formada uma dupla

camada elétrica. Esta é constituída de uma região interna (camada de Stern), onde

os íons estão fortemente ligados à superfície, e uma região externa (camada difusa),

onde a distribuição de íons é determinada pelo equilíbrio entre as forças

eletrostáticas e o movimento térmico. O potencial Zeta é a medida do potencial

elétrico localizado no plano de cisalhamento (localizado entre a camada de Stern e

camada difusa). Sua medida é obtida a partir de fenômenos decorrentes da

movimentação das partículas em relação ao meio em que estão dispersas,

provocando o rompimento da dupla camada elétrica, no plano de cisalhamento (Fig.

6) (MORRISON & ROSS, 2002; DALTIN, 2011; MALVERN, 2015).

Figura 6. Representação esquemática do potencial Zeta (adaptado de DALTIN,

2011).

39

A técnica mais utilizada para determinação do potencial Zeta é a

eletroforese. Por meio dela determina-se a mobilidade eletroforética das partículas

no plano de cisalhamento. Ela é obtida da seguinte maneira: quando um campo

elétrico é aplicado, partículas carregadas são atraídas para o eletrodo de carga

oposta. A velocidade com que partícula se move sob ação de um campo elétrico

aplicado é a mobilidade eletroforética. Ela é convertida em potencial Zeta através da

equação de Henry.

UE =

( 2)

onde UE é a mobilidade eletroforética, ζ o potencial Zeta, ε a constante dielétrica, η a

viscosidade e f(κa) a função de Henry. Como o potencial Zeta comumente é medido

em meio aquoso, com uma concentração moderada de eletrólitos, f(κa) é 1,5 e se

refere à aproximação de Smoluchowski (HUNTER, 1996; DALTIN, 2011; MALVERN,

2015).

A magnitude do potencial Zeta pode indicar se um sistema é estável ou

não. Se as gotículas em suspensão tiverem valor (positivo ou negativo) alto do

potencial Zeta, as forças repulsivas superam as de London que atraem as gotículas

entre si e o sistema se mantém estável. Caso o valor de ζ seja pequeno, em modulo,

as forças de London superam as forças repulsivas e o sistema pode coalescer. Em

geral, é requerido que o potencial Zeta tenha um valor mínimo de 30 mV (em

módulo) para que o sistema se mantenha estável (DALTIN, 2011; MALVERN, 2015).

Desta forma, a estabilidade do sistema vai depender do balanço entre as

forças de atração (forças de van der Waals) e as de repulsão (proporcionadas pela

dupla camada elétrica). Se houver predomínio das forças de atração, as gotículas

irão se aproximar e o sistema irá coalescer. Caso o predomínio seja das forças de

repulsão as gotículas permanecerão cineticamente independentes e a emulsão será

estável (BENITA & LEVY, 1993; FRONZA e col., 2004; DALTIN, 2011; BRUXEL e

col., 2012).

A estabilização eletrostática pode ser promovida pela adsorção de

tensoativos iônicos à superfície das gotículas (BENITA & LEVY,1993; DALTIN, 2011;

MALVERN, 2015). No caso de nanoemulsões isto pode ser feito com lecitinas.

40

Fosfolipídios são componentes majoritários das lecitinas e são eles, na forma

ionizada (fosfatidilserina e o ácido fosfatídico em pH 7), que conferem à superfície

das gotículas alto valor do potencial Zeta (-40 a -60 mV) (WASHINGTON, 1996;

FLOYD, 1999; BRUXEL e col., 2012), estabilizando a nanoemulsão. Contudo, é

importante ressaltar que sistemas estabilizados com fosfolipídios podem ter o

potencial Zeta reduzido em meio ácido, pois as formas ionizadas desses fosfolipídios

só estão presentes em pH 7. Assim, a adição de aditivos que mantenham o pH da

nanoemulsão em aproximadamente 7 é necessária para manter a estabilidade das

nanoemulsões (FRONZA e col., 2004; KELMANN, 2006).

É importante destacar que o potencial Zeta reflete a estabilização

mediante forças eletrostáticas. Outro tipo de estabilização também pode acontecer:

a estabilização estérica, devido à adsorção de moléculas grandes de tensoativo à

superfície das gotículas, impedindo a agregação do sistema (SHAW, 1975;

WASHINGTON, 1996; DALTIN, 2011). A presença desse tipo de tensoativo nas

formulações de nanoemulsões pode reduzir os valores do potencial Zeta

(MARCATO e col., 2009), indicando, a princípio, nanoemulsões instáveis. Mas o tipo

de estabilidade observada para estes sistemas não é a de repulsão e sim a estérica.

c) pH

Nanoemulsões são física e quimicamente mais estáveis em pH 6,5 - 8,0.

Esses valores estão relacionados à taxa de hidrólise dos triglicerídeos e fosfolipídios

que, ao dissociar, formam ácidos graxos. A presença desses ácidos reduz o pH das

formulações, sendo empregados como indicadores de estabilidade em diferentes

condições de temperatura e armazenamento (FRONZA e col.,2006). O pH também é

indicativo de aplicabilidade para uso de nanoemulsões para administração

parenteral.

1.6. Fatores que interferem na estabilização

1.6.1. Instabilidade e mecanismos de fragmentação

Assim como as emulsões, nanoemulsões também são sistemas

metaestáveis e mostram tendência em separar fases ao longo do tempo, através de

diferentes mecanismos físico-químicos, incluindo a separação gravitacional,

41

floculação, coalescência, Ostwald "ripening" e degradação química (DALTIN, 2011;

McCLEMENTS & RAO; 2011).

a) Separação gravitacional

É a instabilidade mais frequente em emulsões e pode ocorrer de duas

formas: sedimentação e cremeação (Fig. 7), dependendo da diferença entre as

densidades das fases interna e contínua. Na cremeação as gotículas possuem

densidade menor que a da fase contínua e a emulsão se concentra acima do líquido.

Na sedimentação ocorre o contrário e a emulsão se concentra abaixo do líquido

(DALTIN, 2011; McCLEMENTS & RAO, 2011). A velocidade de

cremeação/sedimentação foi estudada por Stokes, que deduziu a equação para

cálculo da mesma, considerando gotículas esféricas em uma fase contínua:

Ʋ=

(3)

onde Ʋ é a velocidade de cremeação/sedimentação, r o raio da gotícula (sem

considerar a camada de tensoativo e solvatação da água), g a aceleração da

gravidade, Δρ a diferença de densidade entre as fases interna e contínua e η a

viscosidade da fase contínua.

Figura 7. Tipos de instabilidades que ocorrem em emulsões: separação

gravitacional, floculação, coalescência e Ostwald "ripening" (adaptado de

McCLEMENTS, 2011)

42

b) Floculação e coalescência

Nanoemulsões são mais estáveis que emulsões, pois tem menor

tendência em agregar devido à influência do pequeno diâmetro das gotículas.

Quando gotículas se aproximam ocorrem colisões, dependendo das forças de

atração e repulsão entre elas e da natureza da superfície, isso pode resultar em

agregação permanente ou não. Floculação e coalescência (Fig. 7) são fenômenos

onde há associação das gotículas. No primeiro as gotas se agrupam em flocos,

sendo o processo reversível (Fig. 7) e no segundo as gotículas se unem formando

gotas maiores e o processo é irreversível, desestabilizando o sistema inicial

(FLORENCE & ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011; McCLEMENTS & RAO, 2011).

c) Ostwald "ripening"

Neste fenômeno (Fig. 8) o diâmetro médio das gotículas aumenta ao

longo do tempo. Ele ocorre, pois gotículas pequenas tem grande área superficial,

alta pressão interna e dissolvem no meio. Essas moléculas resultantes depositam na

superfície das gotículas maiores, a qual tem pressão interna menor, aumentando de

tamanho (DALTIN, 2011; McCLEMENTS & RAO, 2011). O principal fator

responsável pelo Ostwald "ripening" é a solubilidade da fase oleosa (interna) na fase

contínua (externa). Se a fase interna for solúvel na contínua ocorrerá este fenômeno.

Ele dificilmente acontece em nanoemulsões preparadas com óleos pouco solúveis

na fase contínua e para evitá-lo pode-se adicionar moléculas apolares, insolúveis em

água, como os TLC's. Efeito similar é obtido com mistura de lipídios (DALTIN, 2011;

McCLEMENTS & RAO, 2011).

Figura 8. Ostwald "ripening".

43

1.6.2. Estabilidade de nanoemulsões

Tipos de interação entre as gotículas

Há cinco tipos de interações entre gotículas de nanoemulsões: 1) van der

Waals; (2) eletrostática; (3) estéricas (que dependem da geometria e conformação

das moléculas na interface das gotículas); 4) hidrofóbicas; 5) hidratação

(FLORENCE & ATWOOD, 2003; McCLEMENTS & RAO, 2011). Elas são

importantes para a compreensão dos processos que levam à estabilidade e

instabilidade das nanoemulsões.

As interações eletrostáticas de repulsão e de atração de van der Waals

foram estudadas por Deryagin e Landau e por Verwey e Overbeek, originando a

teoria DLVO da estabilidade coloidal (FLORENCE & ATWOOD, 2003).

As interações de van der Waals são sempre atrativas, seja em água ou

em outro solvente. Elas dependem da natureza da gotícula, da distância entre elas e

do meio em que se encontram. Estas interações podem ser reduzidas pela repulsão

eletrostática (FLORENCE & ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011).

A repulsão eletrostática ocorre entre as duplas camadas elétricas de

gotículas recobertas com tensoativos iônicos com mesma carga (Fig. 10). Ela

depende da distância entre as gotículas, do valor da carga total ou da densidade da

carga superficial das gotículas. Quanto maior o número de cargas na superfície de

cada gotícula, maior a barreira energética a ser vencida para coalescência e, assim,

maior a estabilidade da nanoemulsão (DALTIN, 2011).

A teoria DLVO propõe que a estabilidade de partículas em solução

depende do balanço entre as energias potenciais de repulsão (VR) e de atração (V

A)

(FLORENCE & ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011; MALVERN, 2015):

VT = VA + VR (4)

A Figura 9 mostra gráficos das energias mencionadas, em função da

distância entre as gotículas.

44

Figura 9. Energia potencial em função da distância entre gotículas

(adaptado de DALTIN, 2011).

Se as gotículas colidirem com energia suficiente para superar as

barreiras, as forças de atração serão suficientemente intensas para mantê-las

irreversivelmente unidas. Mas se as forças de repulsão forem suficientemente

elevadas isso não ocorrerá e o sistema coloidal manter-se-á estável (MORRISON &

ROSS, 2002; FLORENCE & ATWOOD, 2003; MALVERN, 2015).

Na distância correspondente ao mínimo secundário existe fraca adesão

entre as gotículas, ocorrendo floculação, fenômeno reversível. Neste caso os

agregados podem ser re-dispersos via agitação vigorosa. Na distância

correspondente ao mínimo primário ocorre coalescência, fenômeno irreversível

(FLORENCE & ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011).

Outro tipo de interação é a estérica, que envolve uso de tensoativos não

iônicos ou de polímeros que são adsorvidos à superfície das gotículas (Fig. 10),

constituindo uma barreira física. As cadeias longas dessas macromoléculas

impedem, estericamente, aproximação mútua das gotículas, reduzindo ou impedindo

coalescência (FLORENCE & ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011).

45

Figura 10. Tipos de estabilização de coloides: estérica e eletrostática.

1.6.3. Seleção de tensoativos

Balanço hidrofílico lipofílico (BHL)

Geralmente misturas de tensoativos formam sistemas mais estáveis que

tensoativos individuais. Possivelmente isso ocorre devido a formação de uma

película estabilizadora mais rígida. Apesar de todo o conhecimento acumulado sobre

teoria da estabilidade de coloides, na prática a seleção do par de tensoativos usados

nas formulações é feita de modo empírico, conforme proposta por Griffin (1949),

mediante o cálculo do parâmetro BHL dos tensoativos em solução. (FLORENCE &

ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011).

BHL é um número adimensional, com valor entre 1 e 50. Tensoativos com

46

pequenos valores de BHL tendem formar emulsões água/óleo e com grandes

valores tendem formar emulsões óleo/água (DALTIN, 2011).

Tabela 1. Aplicações de tensoativos de acordo com o valor do BHL

Aplicação BHL

Emulsionante de água em óleo 3-6

Umectante 7-9

Emulsionante de óleo em água 8-14

Detergente 9-13

Solubilizante 10-13

Dispersante de sólido em água Acima de 12

Adaptado de DALTIN, 2011

Cálculo de BHL da mistura de tensoativos

O valor de BHL para mistura de tensoativos A (hidrofílico) e B (lipofílico)

pode ser calculado usando a fração da massa correspondente ao tensoativo usado,

seguindo a equação 5:

BHL(mistura) = BHLA X 0,01A + BHLB X 0,01B (5)

A% + B% = 100% (6)

A escolha adequada da mistura de tensoativos pode ser feita preparando

uma série de emulsões contendo tensoativos com valores diferentes de BHL. Sabe-

se que a mistura de tensoativos com valores grandes e pequenos de BHL geram

emulsões mais estáveis. Experimentalmente, o valor ótimo de BHL está relacionado

à não ocorrência de separação de fases e cremeação. O valor de BHL pode ser

determinado por DLS, onde é observado o diâmetro médio das gotículas, que é

mínimo (FLORENCE & ATWOOD, 2003).

É importante ressaltar que o cálculo de BHL não é completamente

correto, pois a solubilidade de tensoativos depende da temperatura. Por exemplo, o

valor de BHL de tensoativos não iônicos diminui com aumento da temperatura

(FLORENCE & ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011). Outra desvantagem é a possível

47

alteração da solubilidade. Como o BHL mede o balanço da solubilidade em óleo e

água das moléculas do tensoativo, qualquer alteração no sistema pode afetar a

solubilidade. Em tensoativos não iônicos o aumento da temperatura reduz sua

solubilidade em água, por isso o BHL diminui. O inverso ocorre com tensoativos

iônicos (DALTIN, 2011).

O sistema também não considera a influência da concentração de

tensoativo. Altas concentrações podem provocar alterações reológicas, como

aumento da viscosidade (DALTIN, 2011).

1.7. Otimização do processo de obtenção de nanoemulsões

As características físico-químicas e as propriedades de nanoemulsões

são afetadas pela composição da formulação e pelas variáveis de preparação,

relacionadas à agitação ou emulsificação. As principais características a serem

otimizadas são a polidispersidade, o diâmetro e o potencial Zeta, indicativo da

estabilidade da formulação. Assim, foram feitos planejamentos fatoriais 22 para

identificar a melhor composição e parâmetros de preparação (GUTIÉRREZ e col.,

2008).

1.8. Ciclosporina A (CsA)

Ciclosporinas fazem parte de um grupo de oligopeptídeos cíclicos com

atividade imunossupressora, são pouco solúveis em água (0,04 mg/mL a 25 ºC), o

que dificulta a preparação de fórmulas injetáveis que contenham quantidade

terapêuticamente suficiente do fármaco. Na tentativa de solucionar a baixa

solubilidade aquosa de CsA, solventes orgânicos, como etanol e polioxietileno

(Cremophors), potencialmente tóxicos, são usados em suas formulações (PARIKH e

col., 1997).

Além de ser utilizada em pacientes submetidos a transplantes alogênicos

de órgãos, CsA também é indicada no tratamento de psoríase (LOPES, 2005),

dermatite atópica, olhos secos (em colírios), diabetes mellitus 1, etc. Neste último

caso, o tratamento se torna mais eficaz em crianças (BOUGNÈRES col., 1990),

desde que em doses elevadas, o que limita seu uso devido à toxicidade (PARIKH

col., 1997). Em estudo recente, visando diminuir a dose de CsA esta foi administrada

concomitantemente com metotrexato, sendo possível induzir remissão da diabetes

48

mellitus 1 (SOBEL e col., 2010).

Figura. 11. Estrutura química de Ciclosporina A (adaptado de BRUXEL e col., 2012).

49

II. OBJETIVOS

2.1 Geral

Desenvolver e caracterizar nanoemulsões contendo o fármaco

ciclosporina A, para administração parenteral.

2.2 Específicos

Desenvolver nanoemulsões pelo método de baixa energia de

emulsificação, usando a técnica de emulsificação espontânea;

Desenvolver nanoemulsões pelo método de alta energia de emulsificação,

usando sonicador com ponteira;

Verificar a influência de diferentes tensoativos e óleos utilizados nas

nanoemulsões e a quantidade de cada um, nas propriedades das

nanoemulsões;

Caracterizar as nanoemulsões quanto à distribuição do diâmetro das

gotículas, índice de polidispersidade e estabilidade;

Determinar a eficiência de encapsulação, teor de carregamento e perfil de

liberação da ciclosporina A, nas nanoemulsões;

Determinar as melhores condições para armazenagem das formulações.

50

III. PARTE EXPERIMENTAL

3.1. Reagentes e equipamentos

3.1.1 Equipamentos

Agitadores magnéticos IKA®, modelo Topolino.

Calorímetro diferencial DSC TA Instruments, modelo 2910.

Centrífuga Eppendorf®, modelo 5418.

Centrífuga Excelsa II Fanem®, modelo 206BL.

Cromatógrafo HPLC Agilent®, modelo

Difratômetro de Raios-X Shimadzu, modelo XRD7000

Estufa Binder FED240, com controle digital.

Evaporador rotatório Buchi® - Rotavapor®, modelo R-100

Microscópio eletrônico de varredura JEOL, modelo JSM 6360

pHmetro de bancada digital, Micronal®, modelo B474

Ultrassonicador de ponteira Branson Sonic Power Co., modelo Sonifier® B12

Homogeneizador Ultra-Turrax® IKA®, modelo T25, com elemento dispersor de aço

inox (S75N-25F) e elemento dispersor de policarbonato (PC/PEEK – S25D-10G-KS)

ZetaSizer Malvern® Instruments, modelo 300HS NanoZS

3.1.2 Reagentes

Ácido oleico (Synth®)

Acetona PA(Synth®)

Acetonitrila para HPLC (Tedia®)

Água deionizada (deionizador MilliQ® com membrana 0,22µm)

Alfa-tocoferol (Sigma-Aldrich®)

Ciclosporina A (Sigma-Aldrich®)

Etanol PA (Synth®)

Glicerol (Synth®)

Hidróxido de sódio (Vetec®)

Lecitina hidrogenada de soja SL80-3 (80% de fosfatidilcolina), lecitinas S100-3 (90%

de fosfatidilcolina e aglomerados) e S-PC-3 (98% de fosfatidilcolina) (Lipoid®)

51

Lecitinas de soja S75 (70% de fosfatidilcolina) e 100 (90% fosfatidilcolina e

aglomerados) (Lipoid®)

Metanol para HPLC (Tedia®)

Poloxamer 188/Pluronic® F68 (Sigma-Aldrich®)

Polisorbato 80 (TMAZ80)

Polisorbato 20 (TMAZ20)

Triglicerídeo de cadeia média Myritol® 318PH (Cognis-BASF®), com 95% de ácido

cáprico/caprílico

3.2 Procedimentos

3.2.1 Métodos de preparação das nanoemulsões

3.2.1.1 Método de baixa energia de emulsificação (técnica de emulsificação

espontânea BOUCHEMAL e col., 2004)

A técnica consistiu de três etapas. Na primeira foram preparadas duas

misturas, uma chamada de fase orgânica (FO) composta por um solvente miscível

em água, óleo, fármaco e tensoativo lipofílico (lecitina de soja) e outra, a fase

aquosa (FA) composta do tensoativo hidrofílico (não iônico), água e, se necessário,

algum adjuvante. Na segunda, a FO foi aquecida a 53°C até solubilização completa

da lecitina e adicionada lentamente à FA, sob agitação constante (600 rpm), usando

agitador mecânico, à temperatura ambiente, por 30 min. Após a nanoemulsão (NE)

formada, esta ficou em repouso por 15min . Na terceira etapa, a evaporação do

solvente foi realizada sob pressão reduzida. Finalmente foi feito o ajuste do pH entre

6,5 e 8,0, se necessário, com solução aquosa de NaOH 0,1M. Posteriormente as

amostras foram centrifugadas por 20 min, à 3200 rpm e estocadas em temperatura

adequada. A Figura 12 ilustra este método de preparação.

As quantidades exatas de cada componente presente na NE bem como

as condições experimentais estão na Tabela 2.

52

Figura 12. Representação esquemática da preparação de NE pela técnica da

emulsificação espontânea.

3.2.1.2 Método de alta energia de emulsificação, usando sonicador de ponteira

Foram também preparadas misturas FO e FA, ambas aquecidas

aproximadamente a 53°C. A FO foi lentamente vertida sob a FA, sob agitação

constante, utilizando agitador magnético (600 rpm) ou homogeneizador Ultra-Turrax®

com dispersor de policarbonato (PC/PEEK-S25D-10G-KS) por um período de tempo

e velocidade de rotação determinados. A temperatura foi mantida entre 53 e 63°C.

Em seguida, a mistura foi resfriada até temperatura ambiente; após 30 min esta

primeira emulsão foi colocada em banho com água a 10°C e homogeneizada

utilizando sonicador de alta potência. O tempo de sonicação e a percentagem de

potência utilizada foram determinados e estão descritas nos itens a seguir. Após ser

sonicada a amostra foi centrifugada por 20 min(3200 rpm), para eliminar partículas

de titânio desprendidas da ponteira. A evaporação do solvente foi feita sob pressão

reduzida e o pH final foi ajustado entre 6,5 e 8,0, se necessário, com solução aquosa

de NaOH 0,1 M. As NE foram estocadas em temperatura adequada. A Figura 13

ilustra este método de preparação.

1 - Aquecimento FO 53°C

2 – Adicionar B em A

lentamente. 4 – NE resfriar por 30 min

em temperatura ambiente

5 – Evaporação

do solvente

3 – Agitação mecânica em

temperatura ambiente

53

As quantidades de cada componente presente na NE e as condições

experimentais serão descritas nos próximos itens.

Figura 13. Representação esquemática da preparação de nanoemulsões pelo

método de alta energia de emulsificação usando sonicador com ponteira.

3.3 Planejamentos fatoriais usados no desenvolvimento das

nanoemulsões

Para obter nanoemulsões com diâmetro médio (φ) de gotículas, índice de

polidispersidade (IPD) e potencial Zeta (ζ) adequado, foram usados planejamentos

fatoriais 22 com triplicata no ponto central. Primeiramente foram estudadas as

condições experimentais do sonicador ou dos agitadores. Em seguida, foram feitos

planejamentos com diversos tipos de lecitina e tensoativos não iônicos.

2 – Adicionar B em A

lentamente

3 – Agitação com Turrax® ou mecânica a 53 – 63°C

4 – Solução resfriada a

10°C por 30 min

5 – Ultrassom banho a

10°C

1 - Aquecimento FO e FA

53°C

6 – Evaporação do solvente

54

3.3.1 Planejamentos fatoriais 22

Planejamentos experimentais são de grande utilidade em investigações

de formulações preliminares, pois com eles é possível verificar se determinados

fatores influenciam ou não nas respostas. São simples de serem executados,

podendo ser ampliados para planejamentos mais complexos. Na prática,

planejamentos fatoriais permitem realizar todas as combinações entre os níveis dos

fatores, possibilitando análise ampla para otimização das formulações. A principal

vantagem desses planejamentos é utilizar número reduzido de experimentos.

Para o desenvolvimento das nanoemulsões parenterais com CsA foram

empregados planejamentos fatoriais de dois níveis, com triplicata no ponto central. O

objetivo foi encontrar os melhores valores de φ, IPD e ζ que sejam aceitáveis para

nanoemulsões parenterais.

A modelagem inicial foi realizada supondo que as respostas fossem

ajustáveis a um modelo linear, dado pela equação 7:

ŷ = b0 + b1 x1 + b2 x2 (7)

onde b0, b1 e b2 são os estimadores dos parâmetros do modelo e x1 e x2 os fatores

codificados.

Para obtermos os valores de b0 , b1 e b2 foi usada a equação 8:

b = (XtX)-1 Xt y (8)

onde X é a matriz completa com os elementos (matriz com os coeficientes de

contraste +1, -1 ou 0), Xt é a matriz transposta e y o vetor coluna contendo os

diâmetros médios.

55

1 -1 -1

1 +1 -1

1 -1 +1

X = 1 +1 +1

1 0 0

1 0 0

1 0 0

Formulações iniciais

O método escolhido para iniciar os estudos foi o da emulsificação

espontânea (BOUCHEMAL e col., 2004), por ser de execução simples. Os

resultados obtidos nestes estudos serviram de base para o desenvolvimento das NE

produzidas pela metodologia de emulsificação com alta energia e a otimização das

formulações seguintes.

Testes preliminares

Para definir algumas etapas do processo antes de ser realizado o

planejamento experimental, foram realizados testes preliminares como as

formulações iniciais que vão do item 3.3.2 até 3.3.2.2.

3.3.2 Preparação de NE utilizando Poloxamer 188 (Pluronic®F68) e

lecitina de soja (Lipoid®S75) como tensoativos

3.3.2.1 Influência da ordem de adição da FO e FA e do tipo de solvente

NE foram preparadas utilizando a técnica de emulsificação espontânea

descrita no item 2.2.1. A ordem de adição da FO na FA foi testada e dois sistemas

foram propostos. No sistema S1 80 mL da FA (aquosa), contendo 0,136 g de

Poloxamer 188, foram adicionados lentamente à 40 mL da FO (etanol ou mistura de

etanol/acetona (1:1; v:v), com 0,4 g de TCM (Myritol® 318PH) e 0,086 g de lecitina

de soja, aquecida a 53°C até esta solubilizar. No sistema S2 a FO foi adicionada

56

lentamente à FA, mantendo constantes as demais condições. As NE foram feitas em

duplicata, estocadas por 7 dias a 25 °C e analisadas com relação a φ, IPD e ζ.

Poloxamer 188 será abreviado por P-F68 e a lecitina de soja Lipoid®S75

por LS75. Como triglicerídeo de cadeia média utilizado é o Myritol® 318PH este

sempre será representado por TCM.

3.3.2.2 Influência da concentração de tensoativos e TCM

NE foram preparadas utilizando a técnica de emulsificação espontânea

descrita no item 2.2.1. A FO, contendo etanol, lecitina de soja e TCM, foi aquecida a

53°C, até solubilização da lecitina, e adicionada lentamente à FA contendo P-F68,

sob agitação constante em agitador mecânico, à temperatura ambiente. As amostras

P1 e P2 foram estocadas por 15 dias e analisadas quanto à φ, IPD e ζ. Outras

amostras foram estocadas por 24 h e visualizadas quanto à separação de fases. Na

Tabela 2 estão indicadas as composições das NE.

Tabela 2. Composição das NE com L75S e P-F68 como tensoativos

Fase Componentes P1 P2 A1 A2 B1 B2 C1 C2

TCM %(m:v) 0,33 0,33 0,90 0,90 1,25 1,25 1,50 1,50

Orgânica LS75 %(m:v) 0,07 0,11 0,50 0,40 0,75 0,50 0,90 0,60

Etanol %(v:v) 20,0 20,0 19,6 19,6 19,5 19,5 19,4 19,4

Aquosa P-F68 %(m:v) 0,11 0,07 0,40 0,50 0,50 0,75 0,60 0,90

Água %(v:v) 79,5 79,5 78,4 78,4 78 78 77,6 77,6

Total T+TCM (%) 0,5 0,5 2,0 2,0 2,5 2,5 3,0 3,0

T+TCM (soma da massa total de tensoativos + óleo)

3.3.3 Preparação de NE usando sonicador com ponteira

3.3.3.1 Influência do tempo de sonicação e potência do ultrassom

A formulação escolhida para prosseguir nos estudos foi a C2, preparada

pelo método de alta energia de emulsificação (item 2.2.2). A FO, contendo 1,5%

(m:v) de TCM, 0,6% (m:v) de lecitina LS75 e 19,4% (v:v) de etanol, foi aquecida a

53°C. Paralelamente, FA, composta de P-F68, 0,9% (m:v) e 77,6% (v:v) de água, foi

57

aquecida à mesma temperatura. Mantendo esta entre 53 e 63°C, a FO foi

lentamente vertida sobre a FA, sob agitação magnética (600 rpm, 10 min). A mistura

final foi resfriada até temperatura ambiente e sonicada em banho com água a 10°C.

O solvente foi removido sob pressão reduzida e as amostras foram analisadas após

1 dia de estocagem a 25°C. As variáveis e os níveis do planejamento experimental

estão indicados nas Tabelas 3 e 4.

Tabela 3. Níveis relacionados ao tempo de sonicação e potência de ultrassom para

cada ensaio do planejamento experimental 22 com ponto central (Plan.1)

Níveis

Ensaio Tempo

x1

Potência

x2

Tempo

min

Potência

W

A -1 -1 5 200

B +1 -1 10 200

C -1 +1 5 400

D +1 +1 10 400

E1-E2-E3 0 0 7,5 300

Tabela 4. Níveis relacionados ao tempo de sonicação e a potência do ultrassom

para cada ensaio do planejamento experimental 22 com ponto central (Plan. 2)

Níveis

Ensaio Tempo

x1

Potência

x2

Tempo

min

Potência

W

F -1 -1 5 300

G +1 -1 15 300

H -1 +1 5 500

I +1 +1 15 500

J1-J2-J3 0 0 10 400

58

3.4 Influência dos diferentes tensoativos na estabilidade das NE

3.4.1 Balanço Hidrofílico-Lipofílico (BHL)

Foram preparadas NE seguindo a metodologia descrita no item 2.2.1. A

quantidade de tensoativos foi 3% (m:v). Os tensoativos lipofílicos escolhidos foram

as lecitinas de soja Lipoid®S100, Lipoid®S100-3 e Lipoid®SL80-3 e os tensoativos

hidrofílicos Polisorbato 20 (Tween®20) e P-F68. O valor de BHL de cada tensoativo

está na Tabela 5 e a proporção e o valor de BHL de cada mistura estão na Tabela 6.

Os cálculos de BHL da mistura seguiram as equações 5 e 6. As amostras foram

estocadas a 25°C e visualizadas após 1 dia, quanto à separação de fases.

Tabela 5. Valores de BHL dos tensoativos

Tensoativo Valor de BHL

P-F68 29

Polisorbato 20 16

Lecitinas 7

Tabela 6. Composição das NE seguindo os valores de BHL da mistura

Ensaio P-F68

%(m:v)

S100/S100-3/

SL80-3 %(m:v)

T20

%(m:v)

BHL (mistura) com P-F68 BHL (mistura) com T20

1 1,35 0,15 1,35 26,8 15,1

2 1,20 0,30 1,20 24,6 14,2

3 1,05 0,45 1,05 22,4 13,3

4 0,90 0,60 0,90 20,2 12,4

5 0,75 0,75 0,75 18,0 11,5

6 0,60 0,90 0,60 15,8 10,6

7 0,45 1,05 0,45 13,6 9,7

8 0,30 1,20 0,30 11,4 8,8

9 0,15 1,35 0,15 9,2 7,9

P-F68 (Pluronic® F68); S100 (Lipoid

® S100); S100-3 (Lipoid

® S100-3); SL80-3 (Lipoid

® SL80-3)

T20 (Polisorbato 20/Tween 20)

59

3.5 Otimização das NE obtidas pelo método de alta energia

3.5.1 NE produzidas com lecitina SL80-3 e T20 como tensoativos

A formulação 4, com lecitina SL80-3 e T20, foi selecionada para

prosseguir os estudos. NE foram produzidas pelo método de alta energia de

emulsificação (item 2.2.2). A FO, contendo 0,6% (m:v) da lecitina, 3% (m:v) de TCM

e 20% (v:v) de etanol, foi aquecida a 53°C e adicionada à FA com 0,9% (m:v) de T20

e 80% (v:v) de água, aquecida a 53°C, sob agitação magnética por 10 min. As

misturas foram resfriadas até temperatura ambiente e submetidas às condições

experimentais descritas na Tabela 7, em banho com água a 10°C. A remoção do

solvente foi feita à pressão reduzida. As amostras foram estocadas a 25°C. Os

resultados foram analisados quanto à φ, IPD e ζ, após 1 dia.

Tabela 7. Níveis relacionados ao tempo de sonicação e potência do ultrassom para

cada ensaio do planejamento experimental 22 com ponto central, para os tensoativos

SL80-3 e T20

Níveis

Ensaio Tempo

x1

Potência

x2

Tempo

min

Potência

W

L -1 -1 5 200

M +1 -1 10 200

N -1 +1 5 400

O +1 +1 10 400

P1-P2-P3 0 0 7,5 300

3.5.2 Testes utilizando agitador magnético e UltraTurrax na pré-

emulsão

Com objetivo de verificar se a etapa da pré-emulsão influencia no produto

final, foram testados dois tipos de agitação.

60

3.5.2.1 Agitação magnética

NE foram preparadas segundo descrito no item 2.2.2. A FO, contendo

0,6% (m:v) da lecitina SL80-3, 3% (m:v) de TCM e 20% (v:v) de etanol, foi aquecida

a 53°C e adicionada à FA com 0,9% (m:v) de T20 e 80% (v:v) de água e aquecida a

53°C, sob agitação magnética durante 20 min. O ponto central corresponde a manter

os 10 min na pré-emulsão. As misturas foram resfriadas até temperatura ambiente e

submetidas às condições experimentais descritas na Tabela 7, em banho com água

a 10°C. A remoção do solvente foi feita à pressão reduzida. As amostras foram

estocadas a 25°C e os resultados analisados quanto à φ, IPD e ζ, após 1 dia.

3.5.2.2 Homogeneizador UltraTurrax, com dispersor de policarbonato

(PC/PEEK-S25D-10G-KS)

NE foram preparadas segundo descrito no item 2.2.2. A FO, contendo

0,6% (m:v) da lecitina SL80-3, 3% (m:v) de TCM e 20% (v:v) de etanol, foi aquecida

a 53°C e adicionada à FA com 0,9% (m:v) de T20 e 80% (v:v) de água e aquecida a

53°C, sob agitação de 4000 ou 5000 rpm por 5 min. O ponto central manteve os 10

min com agitador magnético. As misturas foram resfriadas até temperatura ambiente

e submetidas às condições experimentais descrita na Tabela 7, em banho com água

a 10°C. A remoção do solvente foi feita sob pressão reduzida. As amostras foram

feitas em duplicata e estocadas a 25°C. Os resultados foram analisados quanto à φ,

IPD e ζ, após 1 dia.

3.5.3 NE produzidas com homogeneizador Ultra-Turrax, com dispersor

de aço inox (S75N-25F)

Foram preparadas duas fases: a FO, contendo 0,6% (m:v) da lecitina

SL80-3, 3% (m:v) de TCM e 20% (v:v) de etanol, foi aquecida a 53°C e adicionada à

FA com 0,9% (m:v) de T20 e 80% (v:v) de água e aquecida a 53°C, sob agitação

constante. O tempo de agitação e a velocidade de rotação do Ultra-Turrax estão

descritos nas Tabelas 8 e 9. A mistura foi resfriada até temperatura ambiente e o

solvente removido à pressão reduzida. As amostras foram feitas em duplicata e

estocadas a 25°C. Os resultados foram analisados quanto à φ, IPD e ζ, após 1 dia.

61

Tabela 8. Níveis relacionados ao tempo e velocidade do dispersor para cada ensaio

do planejamento experimental 22 (Plan 1)

Níveis

Ensaio Tempo

x1

Velocidade

x2

Tempo

min

Velocidade

Rpm

α1 -1 -1 5 3500

β1 +1 -1 10 3500

γ1 -1 +1 5 4500

δ1 +1 +1 10 4500

Tabela 9. Níveis relacionados ao tempo e velocidade do dispersor para cada ensaio

do planejamento 22 (Plan 2)

Níveis

Ensaio Tempo

x1

Velocidade

x2

Tempo

min

Velocidade

Rpm

α2 -1 -1 5 5500

β2 +1 -1 10 5500

γ2 -1 +1 5 6500

δ2 +1 +1 10 6500

3.5.3.1 NE γ2 e δ2

As NE γ2 e δ2, sonicadas por 10 min a potência de 400 W, foram

estocadas a 25°C e analisadas quanto à φ, IPD e ζ, após 1 dia.

3.6 Influência da proporção de TCM:tensoativos e tipo de solvente

Foram preparadas NE como descrito no item 2.2.2, sonicando durante 10

min, a 400 W. As proporções de TCM:tensoativo foram 1:1; 1:2; 1:3 e 1:4% (m:m).

Os solventes usados foram etanol ou mistura de etanol e acetona na proporção de

1:1% (v:v). As NE foram analisadas antes e depois da evaporação do solvente,

quanto à φ, IPD e ζ, a cada 7 dias, durante 30 dias. As composições das NE em

62

etanol e etanol:acetona estão nas Tabelas 10 e 11. As amostras foram feitas em

duplicata.

Tabela 10. Composição das NE com etanol

Ensaio TCM/

Tensoativo

TCM

%(m:v)

L-SL80-3

%(m:v)

T20

%(m:v)

Etanol

%(v:v)

Água

%(v:v)

F1 1:1 5 2 3 18 72

F2 1:2 5 4 6 17 68

F3 1:3 5 6 9 16 64

F4 1:4 5 8 12 15 60

TCM (Myritol® 318PH); L-SL80-3 (Lipoid

®SL80-3); T20 (Polisorbato 20)

Tabela 11. Composição das NE com acetona:etanol (1:1) (v:v)

Ensaio TCM/

Tensoativo

TCM

%(m:v)

L-SL80-3

%(m:v)

T20

%(m:v)

Et/Ac

%(v:v)

Água

%(v:v)

F6 1:1 5 2 3 18 72

F7 1:2 5 4 6 17 68

F8 1:3 5 6 9 16 64

F9 1:4 5 8 12 15 60



3.7 Influência da temperatura de armazenamento

Foram feitos ensaios de armazenamento a 4 °C e 25 °C. As amostras F2

e F6 foram feitas em duplicata e verificadas quanto à φ, IPD e ζ a cada 15 dias,

durante 30 dias.

3.8 Influência do método de incorporação do fármaco na NE

NE foram preparadas com 5% (m:m) de CsA em relação à quantidade de

TCM. Duas metodologias foram abordadas; em uma delas o fármaco foi solubilizado

no TCM antes da emulsificação, compondo a fase orgânica, e em outra o fármaco foi

incorporado após emulsificação (com NE já pronta). As amostras foram feitas em

63

duplicata, estocadas a 25°C e analisadas quanto à φ, IPD e ζ, a cada 15 dias,

durante 30 dias.

3.9 Influência do pH e glicerol

NE foram preparadas com 2,25% (m:v) de glicerol. O pH das amostras

variou entre 6,5 e 8,0. Para o ajuste do pH foi usada solução aquosa de NaOH 0,1M.

As amostras foram feitas em duplicata, estocadas a 4 °C e 25 °C e analisadas

quanto à φ, IPD e pH, a cada 30 dias, durante 180 dias. A composição de cada NE

está Tabela 12.

Tabela 12. Composições das NE com e sem glicerol

Fase composição F2-1 F2-2 F6-1 F6-2

TCM %(m:v) 5 5 5 5

orgânica L-SL80-3 %(m:v) 4 4 2 2

Etanol %(v:v) 17 17 9 9

T20 %(m:v) 6 6 3 3

CsA%(m:m)* 5 5 5 5

aquosa Glicerol %(m:v) - 2,25 - 2,25

Água %(v:v) 68 68 72 72

Acetona %(v:v) - - 9 9



*em relação à quantidade de óleo

3.10 Estabilidade térmica

NE foram preparadas como descrito no item 2.2.2, usando tempo de

sonicação 10 min e 400 W de potência. As amostras (em duplicata) foram mantidas

a 4 °C, 25 °C e 45 °C. Além da temperatura, também foi estudada a influência do

tipo e quantidade de tensoativo e tipo de solvente na estabilidade da NE. Os

tensoativos usados foram lecitina SL80-3, P-F68, T20 e Polisorbato 80 (Tween®80),

nas quantidades de 1:1 ou 1:2% (m:m). A análise quanto à φ, IPD e pH foi feita a

cada 15 dias, durante 30 dias. Na segunda etapa, com amostras mantidas a 4°C,

64

foram feitas as mesmas análises, a cada 30 dias, durante 120 dias. As formulações

estão na Tabela 13.

Tabela 13. Composições das NE para o teste de estabilidade térmica

Fase composição F2 F6 F19 F20 F27 F28

TCM %(m:v) 5 5 5 5 5 5

orgânica L-SL80-3 %(m:v) 4 2 4 2 4 2

Etanol %(v:v) 17 9 17 9 17 9

T20 %(m:v) 6 3 - - - -

T80 %(m:v) - - 6 3 - -

P-F68 %(m:v) - - - - 6 3

CsA% (m:m)* 5 5 5 5 5 5

aquosa Glicerol %(m:v) 2,25- 2,25 2,25 2,25 2,25 2,25

Água %(v:v) 68 72 68 72 68 72

Acetona %(v:v) - 9 - 9 - 9

* em relação à quantidade de óleo

3.10.1 Influência do aumento da fase aquosa

Este experimento foi feito baseado no item 3.9, mas o volume de água

usado foi 80mL e o do solvente foi 20mL.

3.11 Influência da incorporação de 5% ou 12% de CsA

NE foram preparadas como descrito no item 2.2.2, empregando tempo de

sonicação 10 min e 400W de potência.. Foram incorporados 5 ou 12% (m:m) de

CsA, em relação à quantidade de TCM, nas formulações F1, F2 e F6 (Tabelas 10 e

12). As amostras (em duplicata), foram mantidas a 4 °C, 25 °C e 45 °C e analisadas

a cada 15 dias, durante 30 dias, quanto à φ, IPD e pH.

3.12 Influência da incorporação de α-tocoferol

NE foram preparadas como descrito no item 2.2.2. Foram incorporados 10

e 30% (m:m) de α-tocoferol em relação à quantidade de TCM, nas formulações F1,

F2 e F6. As amostras, em duplicata, foram mantidas a 4 °C, 25 °C e 45 °C e

65

analisadas a cada 7 dias, durante 30 dias, quanto à φ, IPD e pH. Depois o ensaio

prosseguiu por mais 120 dias, determinando φ, IPD e pH a cada 30 dias.

3.13 NE obtidas mediante emulsificação espontânea

Com os resultados descritos nos itens anteriores, outros experimentos

foram feitos usando emulsificação à baixa energia.

3.13.1 Influência da proporção TCM:tensoativos e tipo de solvente

NE foram preparadas utilizando a técnica de emulsificação espontânea,

descrita no item 2.2.1. As proporções de TCM:tensoativo foram 1:0,8 e 1:0,5. A FO,

contendo etanol ou mistura de etanol e acetona (1:1, v:v), lecitina SL80-3 e TCM

318PH foi aquecida a 53°C, até solubilização da lecitina, e adicionada lentamente à

FA composta por água, Polisorbato 20 e glicerol, sob agitação magnética (600 rpm),

à temperatura ambiente. As amostras foram estocadas por 15 dias e analisadas a

cada 7 dias a 25 °C e analisadas quanto à φ, IPD e ζ. Na Tabela 14 estão as

composições das NE.

Tabela 14. Composições das NE produzidas mediante emulsificação espontânea

Fase composição ES1 ES2 ES-3 ES4 ES5 ES6

TCM %(m:v) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

orgânica L-SL80-3 %(m:v) 0,13 0,13 0,13 0,13 0,09 0,09

Etanol %(v:v) 33 16,5 33 16,5 33 16,5

T20 %(m:v) 0,25 0,25 0,13 0,13 0,16 0,16

aquosa Glicerol %(m:v) 2,25- 2,25 2,25 2,25 2,25- 2,25

Água %(v:v) 67 67 67 67 67 67

Acetona %(v:v) - 16,5 - 16,5 - 16,5



3.13.2 Influência do tipo de tensoativo

3.13.2.1 NE produzidas em etanol

66

A formulação usada neste ensaio foi a ES1. A FO contendo etanol,

lecitina SL80-3 ou PC-3, TCM e CsA 5% (m:m), em relação à quantidade de óleo, foi

aquecida a 53°C, até solubilização da lecitina, e adicionada lentamente à FA (água,

glicerol e Polisorbato 20 ou 80), sob agitação magnética (600 rpm), à temperatura

ambiente. As amostras foram estocadas a 4, 25 e 45°C por 15 dias e analisadas a

cada 7 dias, quanto à φ, IPD, ζ e pH. Na Tabela 15 estão indicados os níveis e os

fatores usados.

Tabela 15. Níveis do planejamento para NE produzidas em etanol

Níveis

Ensaio Polisorbato Lecitina Lecitina

Polisorbato

F7 -1 -1 L-PC-3 T20

F8 +1 -1 L-PC-3 T80

F9 -1 +1 L-SL80-3 T20

F10 +1 +1 L-SL80-3 T80

PL1-PL2 0 0 L-SL80-3 T20

L-PC3 (Lipoid®PC-3); L-SL80-3 (Lipoid

®SL80-3); T20 (Polisorbato 20); T80 (Polisorbato 80); PL sem

CsA

3.13.2.2 NE produzidas em mistura de acetona e etanol

A formulação usada neste ensaio foi a ES2, preparada utilizando

emulsificação espontânea (item 2.2.1). A FO, contendo mistura de acetona/etanol

(1:1) % (v:v), lecitina SL80-3 ou PC-3, TCM 318PH e a CsA 5% (m:v) em relação à

quantidade de TCM, foi aquecida a 53°C, até solubilização da lecitina, e adicionada

lentamente à FA (água, glicerol e Polisorbato 20 ou 80), sob agitação magnética

(600 rpm), à temperatura ambiente. As amostras foram estocadas a 4 °C, 25 °C e 45

°C por 15 dias e analisadas, a cada 7 dias, em relação à φ, IPD, ζ e pH. Na Tabela

16 estão indicados os níveis e os fatores usados.

67

Tabela 16. Níveis do planejamento para NE produzidas em acetona e etanol

Níveis

Ensaio Polisorbato Lecitina Lecitina

Polisorbato

F11 -1 -1 L-PC-3 T20

F12 +1 -1 L-PC-3 T80

F13 -1 +1 L-SL80-3 T20

F14 +1 +1 L-SL80-3 T80

P1-P2 0 0 L-Sl80-3 T20

L-PC (Lipoid®PC-3); L-SL80-3 (Lipoid

®SL80-3); T20 (Polisorbato 20); T80 (Polisorbato 80); P: sem

CsA

3.13.3 Influência da incorporação de 5 ou 12% de CsA

NE foram preparadas como descrito no item 2.2.1, sendo incorporados 5

ou 12% (m:m) de CsA (nas formulações ES1 e ES2), em relação à quantidade de

TCM, conforme indicado nas Tabelas 15 e 16. As amostras, feitas em duplicata e

mantidas a 4 °C, 25 °C e 45 °C, foram analisadas a cada 15 dias, durante 30 dias,

quanto à φ e IPD.

3.13.4 Influência da adição do ácido oleico

NE foram preparadas como descrito no item 2.2.1. As formulações

escolhidas para este ensaio foram F9 e F10 com etanol como solvente e as

formulações F14 e F15 com mistura de acetona/etanol (1:1) (v:v). Para este teste foi

feita mistura entre TCM e ácido oleico (1:1; m:m), sendo o total do óleo de 0,5%

(m:v). Outras duas formulações, descritas na Tabela 16, foram estudadas com

Poloxamer. As amostras foram estocadas a 4 °C, durante 15 dias, analisadas a cada

7 dias quanto à φ e IPD.

68

Tabela 17. Composição das NE produzidas por emulsificação espontânea com

diferentes tensoativos não iônicos

Fase composição F25 F26 F9 F10 F13 F14

TCM %(m/v) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

ÁcOleico %(m/v) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

orgânica L-SL80-3 %(m/v) 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13

Etanol %(v/v) 16,5 33 33 33 16,5 16,5

CsA %(m/m)* 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025

T20 %(m/v) - - 0,25 - 0,25 -

T80 %(m/v) - - - 0,25 - 0,25

P-F68 %(m/v) 0,25 0,25 - - - -

aquosa Glicerol %(m/v) 2,25 2,25 2,25 2,25 2,25 2,25

Agua %(v/v) 67 67 67 67 67 67

Acetona %(v/v) 16,5 - - - 16,5 16,5


®SL80-3); P-F68 (Pluronic

®F68)

3.14 Caracterização das NE

3.14.1 Determinação do pH

O pH de cada amostra foi medido com pHmetro calibrado com tampões

(Synth®) de pH 4 e pH 7, a 25°C.

3.14.2 Obtenção do diâmetro médio das gotículas (φ, Z average) e índice

de polidispersidade (IPD)

O diâmetro médio das NE foi determinado por espectroscopia de

correlação de fótons (PCS) utilizando o equipamento Zetasizer® 300HS (Malvern®

Instruments) a um ângulo fixo de 90° e 25°C. 25 µL de cada amostra foram diluídos

em 1 mL de água deionizada. Os resultados foram fornecidos como diâmetro médio

(avaliado pela intensidade). O valor máximo aceitável para o IPD foi 0,25 (MULLER

et al, 2004).

69

3.14.3 Obtenção do potencial Zeta (ζ)

O potencial Zeta foi determinado por espalhamento dinâmico de luz e

análise da mobilidade eletroforética, usando a lei de Henry. 25 µL de cada amostra

foram diluídos em 1 mL de água deionizada e as medidas realizadas em

equipamento Zetasizer® 300HS, a 25 °C.

3.15 Determinação da quantidade de CsA presente nas NE

3.15.1 Condições experimentais

A quantidade de CsA presente nas amostras foi determinada mediante

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), em cromatógrafo Agilent®, com

detector de UV/Vis em 210 nm, coluna Zorbax® eclipse plus C18 (150 x 4,6 mm, 5

µm; Agilent®) e volume de injeção 20 µL. A fase móvel foi mistura de acetonitrila,

metanol e água (50:35:15) % (v:v), eluição em modo isocrático, em fluxo de 1

mL/min a 50 °C.

3.15.2 Curva analítica

A curva analítica foi construída com soluções de CsA em acetonitrila, com

a massa variando entre 1,25 e 10 µg. As amostras foram feitas em triplicata.

3.15.3 Eficiência de enscapsulação (EE)

O fármaco encapsulado foi quantificado por CLAE. A eficiência de

encapsulação (EE) foi calculada com a equação 9:

EE(%) =

x100 (9)

onde EE é a eficiência de encapsulação, fencaps é a quantidade de fármaco

encapsulado e ftotal a quantidade de fármaco total na amostra.

Para determinar fencaps primeiramente uma alíquota da NE foi filtrada em

membrana, não estéril, de PVDF, com diâmetro de poro 0,45 µm ((Millex HV-

Milipore®). Desse filtrado foi retirada uma alíquota de 100 µL e diluída em 1 mL de

acetonitrila. Para determinar ftotal 100 µL da NE foram diluídos em 1 mL de

acetonitrila.

70

Todas as soluções preparadas foram feitas em triplicata, filtradas em

membrana de PVDF com poros de diâmetro 0,45 µm (Millex HV-Milipore®) e

injetadas no cromatógrafo. A Figura 14 ilustra o procedimento para determinação da

EE%.

Figura 14. Esquema da preparação das amostras para determinar o percentual de

Eficiência de Encapsulação de CsA nas NE.

3.15.4 Microscopia eletrônica de varredura

A microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi utilizada com objetivo de

verificar a presença de fármaco livre na formulação. Após filtração essas membranas

foram secas e colocadas sobre uma fita de carbono no porta amostras. Elas foram

NE

Filtração

PVDF 0,45µm

100µL

Completar com 1mL de

acetonitrila

Centrifugação

14000 rpm por

30 min

Filtração

0,45µm

Determinação de fencaps

1mL

Determinação de ftotal

Completar com 1mL de

acetonitrila

100µL

Análise por CLAE

71

revestidas com ouro, utilizando metalizador MED 20 Coating Systems (Bal-Tec),

operando a 20 mA, 50 mTorr, durante 160 min. Para fins de comparação, amostras

de CsA retidas nas membranas também foram analisadas.

72

IV.RESULTADOS E DISCUSSÃO

4 Preparação de NE com P-F68 e lecitina de soja (Lipoid®S75)

4.1 Influência da ordem de adição da fase orgânica (FO) e aquosa

(FA) e do tipo de solvente

Na obtenção de nanoemulsões via emulsificação espontânea, geralmente

a fase orgânica (óleo, fármaco e tensoativo lipofílico) é vertida na fase aquosa

(tensoativo hidrofílico e água), formando gotículas com φ satisfatório para aplicação

parenteral (YU e col., 1993; BOUCHEMAL e col., 2004; KELMANN e col., 2007).

Schalbart (2010) mostrou que a ordem de adição dos componentes influencia as

propriedades físico-químicas e estabilidade de NE com tetradecano, Tween®60 e

Span®60. Ele fixou a quantidade de tensoativo e de óleo e adotou três metodologias

para produzir NE. Na primeira (M1) a fase aquosa é vertida na orgânica e todos os

tensoativos são dissolvidos no óleo. Na segunda (M2) a fase orgânica é vertida na

aquosa, um dos tensoativos é dissolvido no óleo e o outro em água e na terceira

(M3) todos os constituintes são misturados juntos. O resultado do estudo de

Schalbart demonstrou que para M2, as amostras obtidas não foram estáveis,

havendo separação de fases e as amostras obtidas com M3 foram satisfatórias em

termos do diâmetro médio das gotículas (206±11 nm) e estabilidade (10 meses,

286±32 nm).

Ao longo deste texto, para reduzir a frequência de palavras repetidas, o

diâmetro médio será, em várias ocasiões, substituído pelo símbolo φ, o Índice de

Polidispersidade pela sigla IPD, o potencial Zeta pelo símbolo ζ e o Lipoid® S75 por

LS75.

Nesta Tese foi estudada se a ordem de adição dos componentes altera o

φ, IPD, ζ e a estabilidade (comprovada por separação de fases) das NE. Os

resultados estão na Tabela 18.

73

Tabela 18. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta

S1 (etanol) S2 (etanol) S1 (acetona) S2 (acetona)

φ (nm) 480,8±61,5 139,9±5,4 3979,3±168 149,1±11,4

IPD 0,55±0,02 0,15±0,02 1,0±0,0 0,11±0,02

ζ (mV) -41,2±5,8 -31,3±12,2 -34,9±5,4 -0,8±0,2

A principal característica do solvente usado na emulsificação espontânea

é ser miscível com a fase contínua (água) (BOUCHEMAL e col., 2004), sendo

escolhidos etanol e acetona, na proporção 50:50 (v:v). O solvente influenciou de

modo diferente nas propriedades das NE, dependendo do método S1 ou S2. No S2

as NE ficaram estáveis, não apresentaram agregados e nem separação de fases

durante 7 dias, a 25 °C. Quanto ao φ das gotículas, não houve diferenças

significativas (139,9±5,4 nm em etanol e 149,1 ±11,4 nm em acetona), concordando

com trabalhos de YU e col. (1993), BOUCHEMAL e col. (2004) e KELMANN e col.

(2007).

No método S1 as diferenças foram expressivas para φ (480,8±61,5 nm em

etanol e 3979,3 ±168 nm em acetona) e para a estabilidade (houve separação de

fases), se comparadas com os resultados obtidos no método S2. Isso pode ter

ocorrido porque em S1 a difusão do solvente, possivelmente, foi mais lenta que no S2

(YU e col., 1993; KELMANN e col., 2007).

4.2 Influência da concentração de tensoativos e de TCM

Inicialmente foi avaliado se a remoção do solvente e o tipo de tensoativo

(lipofílico ou hidrofílico, dependendo do valor de BHL) podem afetar as propriedades

das NE (amostras P1 e P2). Depois foram estudados os efeitos causados pelo

aumento da quantidade de tensoativos e de óleo (T+TCM), em relação à de água e

o tipo de tensoativo (amostras A1 a C2).

Os métodos escolhidos para preparar as NE envolvem uso de solvente e

sua retirada pode ocasionar instabilidade ou variação do φ das gotículas. Nas NE

obtidas não foi observada separação de fases ou cremeação, demonstrando serem

estáveis (15 dias, com e sem evaporação do solvente). Contudo, foram notadas

74

mudanças em φ, IPD e ζ (Tabela 19). As formulações obtidas com evaporação do

solvente apresentaram gotículas com diâmetros menores em comparação com as

NE sem evaporação do solvente. Também foi observado que, quanto menos P-F68

for usado na formulação, gotículas com diâmetros menores são obtidas

(BOUCHEMAL e col., 2004).

Tabela 19. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta (formulações P1 e P2 com e sem

evaporação do solvente), nos dias 1 e 15

Com evaporação Sem evaporação

For φ

nm

IPD ζ

mV

φ

nm

IPD ζ

mV

BHL

P1

dia 1

151,9±10,0 0,14±0,02 -14,1±1,6 278,1±20,9 0,27±0,04 -2,8±0,3 20,2

P2

dia 1

150,9±8,6 0,15±0,00 -22,6±5,0 184,6±21,6 0,20±0,04 -1,8±0,5 15,8

P1

dia 15

158,3±2,4 0,13±0,00 -24,6±1,8 226,5±12,9 0,24±0,01 -1,6±0,4 20,2

P2

dia 15

155,8±4,6 0,17±0,00 -25,1±1,8 192,4±10,0 0,15±0,00 -24,2±0,5 15,8

Com os resultados da Tabela 19 pode-se variar de 2% a 3% (m:m) a

quantidade de TCM mais mistura de tensoativos (Tabela 2) (IZQUIERDO e col.,

2005; NABI e col., 2007; AZEEM e col., 2009).

A Tabela 20 mostra que os valores de BHL da mistura de tensoativos

somente foram significativos quando houve aumento da sua quantidade e a de TCM.

Para valores de 0,5% (m:v, TCM+T, amostras P1 e P2) e 2,0% (amostras A1 e A2)

não houve separação de fases. Desta forma, para essas quantidades de tensoativos

mais TCM o valor de BHL pouco influenciou na estabilidade das nanoemulsões. Já

para um valor >2,0% o BHL é importante. Foi observado que para as amostras B1 e

C1 (com menor quantidade de P-F68 e BHL 15,8) ocorreu separação de fases, ao

contrário do observado para as amostras B2 e C2 (BHL 20,2). Alguns estudos

75

relatam que a presença de P-F68 estabiliza melhor as nanoemulsões (LEVY &

BENITA, 1989; BOUCHEMAL e col., 2004; PÉREZ e col., 2009; GÓMEZ e col.,

2014). A formulação escolhida para prosseguir nos estudos foi a C2.

Tabela 20. Aspecto visual das NE e valores de BHL da mistura de tensoativos

For Aspecto visual Separação de fases BHL

A1 leitoso não 16,8

A2 leitoso não 19,2

B1 leitoso separação 2 fases 15,8

B2 leitoso não 20,2

C1 leitoso separação 2 fases 15,8

C2 leitoso não 20,2

4.3 Preparação de NE usando sonicador com ponteira

4.3.1 Influência do tempo de sonicação e potência do ultrassom

Este experimento foi realizado objetivando otimizar a formulação C2. O

sonicador com ponteira foi escolhido por usar pouca quantidade de amostra e ser de

fácil operação. Este aparelho gera ondas mecânicas (frequência 20 kHz, potência

máxima 1000 W) que fragmentam, por cavitação, as gotas (CHANDRAPALA e col.,

2012; GHOSH e col., 2013; TANG e col. 2013, SONOMECHANICS, 2014).

Para obter NE com gotículas de menor diâmetro e maior estabilidade foi

feito planejamento experimental (Plan 1) com dois fatores (tempo de sonicação, tS, e

potência do ultrassom, PS) e dois níveis (tS 5 e 10 min., PS 200 e 400 W) e um ponto

central (tS 7 min, PS 300 W), cujo ensaio foi realizado em triplicata.

Os resultados do Plan 1 (Tabela 21) mostram que o aumento de tS e de

PS reduziu o diâmetro das gotículas. A amostra D apresentou o menor φ (51,77 nm),

com tS 10 min e 400 W, resultado também observado por Tang e col. (2013) e Gosh

e col. (2013).

76

Tabela 21. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta (Plan 1)

amostra tS

x1

PS

x2

φ

nm

IPD ζ

Mv

A -1 -1 117,1 0,434 -8,8

B +1 -1 104,4 0,424 -0,12

C -1 +1 61,56 0,233 -0,696

D +1 +1 51,77 0,245 -0,232

E 0 0 80,45 0,270 -0,229

E 0 0 85,76 0,341 -0,382

E 0 0 86,93 0,323 -0,960

Também foi observado que o fator x2 (PS) exerce maior influência no

diâmetro e IPD como ocorreram nas amostras B e D, que diferem apenas na PS.

A modelagem inicial foi feita ajustando os dados experimentais por um

modelo linear. As respostas analisadas no Plan 1 foram φ e IPD (equações 11 e 12):

φ: ŷ = 84 - 5,72x1 - 27,04x2 (11)

IPD: ŷ = 0,324 + 0,0005x1 - 0,1x2 (12)

Para verificar se os efeitos eram estatisticamente significativos (95% de

confiança) foi obtida a estimativa do erro-padrão, a partir dos três ensaios repetidos

do ponto central. Segundo Barros e col. (2010) um efeito cujo valor absoluto for

superior ao obtido pela equação 13 é considerado significativo.

t2 x s(efeito) (13)

onde t2 é dado pela distribuição "t" de Student e s(efeito) é o desvio padrão do efeito.

Para φ: t2 x s(efeito) = 4,303 x 3,45 = 14,84. Este resultado indica que

apenas PS é significativa , concordando com os dados da Tabela 21.

77

Para IPD: t2 x s(efeito) = 4,303 x 0,04 = 0,17. O resultado indica que os

efeitos não são significativos.

Com objetivo de melhorar os valores de IPD e ζ foi feito novo

planejamento (Plan 2), com os mesmos fatores (tS e PS) e dois níveis (5 e 15 min,

300 e 500 W) e um ponto central (10 min, 400 W). O ensaio foi realizado em

triplicata.

Os resultados (Tabela 22) mostraram que o fator x2 (PS) teve grande

influência nos valores de IPD. As amostras H (IPD 0,042) e I (IPD 0,052)

apresentaram os menores valores de IPD, quando PS estava no nível mais elevado.

Também foi notado que para PS <500 W os valores de IPD foram maiores que 0,200

e para ζ não foram observadas melhorias.

No Plan 1, um aumento no nível de tS e PS reduziu o diâmetro e no Plan 2

foi observado o contrário. Para a amostra I, na qual os fatores estão nos níveis mais

elevados (15 min, 500 W) φ = 172,8 nm. Para o ponto central (10 min, 400 W), o

diâmetro médio foi 66,57 nm, sendo observado que o aumento dos níveis dos

fatores aumentou φ. Segundo Kentish e col. (2008) esse efeito, chamado over-

processing, aumenta o diâmetro das gotas por causa da maior potência das ondas

sonoras, podendo haver coalescência.


amostra Tempo

x1

Potência

x2

φ

nm

IPD Ζ

mV

F -1 -1 109,7 0,243 -4,93

G +1 -1 101,4 0,338 -1,92

H -1 +1 180,9 0,042 -5,6

I +1 +1 172,8 0,052 -1,5

J 0 0 61,98 0,363 -1,26

J 0 0 50,8 0,229 -0,02

J 0 0 86,93 0,323 -0,96

78

Por outro lado, pode ter ocorrido instabilidade no filme interfacial formado,

devido à maior potência do ultrassom. É importante saber que a alta energia de

sonicação pode causar decomposição térmica de componentes da amostra

(KOROLEVA & YURTOV, 2012). Não houve separação de fases, mas aumento do

diâmetro das gotículas, causado, possivelmente, por instabilidade no filme

interfacial.

No Plan 2 as respostas analisadas também foram φ e IPD (equações 14 e

15):

φ: ŷ = 109,2 - 4,1x1 +35,65x2 (14)

IPD: ŷ = 0,227 + 0,026x1 - 0,12x2 (15)

Para φ: t2 x s(efeito) = 4,303 x 3,45 = 14,84, apenas a potência é

significativa.

Para IPD: t2 x s(efeito) = 4,303 x 0,04 = 0,17,os efeitos não são

significativos.

Plan 1 favoreceu o φ das gotículas, que são menores, e Plan 2 favoreceu

o IPD, cujos valores são ≈0,200.

Ficou evidente que cada planejamento melhora apenas uma das

respostas e ao tentar melhorar uma delas a outra fica comprometida. Diante disso,

outras estratégias foram adotadas para obter NE adequadas para administração

parenteral.

4.4. Influência do tipo de tensoativo na estabilidade das NE

4.4.1 Balanço Hidrofílico-Lipofílico (BHL)

Este experimento foi realizado com objetivo de investigar o impacto de

outros tensoativos não iônicos na estabilidade das NE. Estas foram obtidas

combinando um tensoativo hidrofílico e outro lipofílico. O valor BHL é utilizado como

referência inicial para seleção de tensoativos adequados à produção de emulsões

estáveis (BOUCHEMAL e col., 2004; MORAIS e col., 2006; SABERI e col., 2013).

79

Segundo Morais e col. (2006) um valor adequado de BHL para uma emulsão deve

ser similar ao requerido para solubilizar o óleo usado na emulsão.

Foram preparadas NE com quantidade fixa de óleo e de tensoativo (1,5%

m:v, para ambos). A quantidade de cada tensoativo está na Tabela 6 e os resultados

deste experimento na Tabela 23.

Tabela 23. Efeito do tipo de tensoativo não iônico na estabilidade das NE e BHL da

mistura de tensoativos

P-F68/

S100

P-F68/

S100-3

P-F68/

SL80-3

T20/

S100

T20/

S100-3

T20/

SL80-3

BHL (mistura)

com F68

BHL (mistura)

com T20

1 SP SP E SP SP E 26,8 15,1

2 SP SP E SP SP E 24,6 14,2

3 SP SP E SP SP E 22,4 13,3

4 SP SP E SP SP E 20,2 12,4

5 SP SP E SP E E 18,0 11,5

6 SP E E E E E 15,8 10,6

7 SP E E E E E 13,6 9,7

8 SP E E E E E 11,4 8,8

9 SP E E SP E E 9,2 7,9

SP: Separa fases; E: Emulsão estável; P-F68 (Pluronic® F68); S100 (Lipoid

® S100); S100-3 (Lipoid

®

S100-3); SL80-3 (Lipoid®

SL80-3); T20(Polisorbato 20)

As amostras foram acompanhadas por 24 h. Os sistemas que continham

lecitinas hidrogenadas (SL80-3 e S100-3) (Fig. 15 a,c; Fig. 16 a,c) apresentaram

maior número de amostras estáveis, sendo que com a lecitina SL80-3 todas as

amostras foram estáveis. Já amostras com lecitina não hidrogenada (Fig. 15 b; Fig.

16 b), a quebra das emulsões foi observada em todas das amostras com P-

F68/S100 e na maioria das amostras com T20/S100, após 2 h. Em virtude disto tais

amostras não são adequadas à finalidade pretendida. Segundo Washington (1996)

lecitinas hidrogenadas tendem produzir emulsões mais estáveis, pois não sofrem

degradação facilmente.

Também foi observado que formulações contendo lecitina acima de

0,75% (m:v) são viscosas e não viáveis para administração parenteral. As amostras

80

com valores BHL diferentes do valor BHL do óleo utilizado (Myritol® 318PH; BHL 10)

apresentaram-se estáveis e instáveis. Isso demonstra que a estabilidade da emulsão

depende muito mais dos tipos de tensoativos usados que do valor de BHL da

mistura de tensoativos. É importante considerar que o BHL é definido apenas para

um único tensoativo a 25°C e não considera suas possíveis interações com água e

óleo presentes no sistema (IZQUIERDO e col., 2005).

A mistura de tensoativos escolhida para prosseguir os estudos foi

T20/SL80-3 (ensaio 4) pois apresentou melhor estabilidade, além de ser menos

viscosa.

81

Figura 15. (a) Mistura dos tensoativos P F68 e LS100; LS100-3 e L-SL80-3.

(a) Mistura dos tensoativos F68/SL80-3

(b) Mistura dos tensoativos F68/S100

(c) Mistura dos tensoativos F68/S100-3

82

Figura 16. Mistura de tensoativos T20 e LS100; LS100-3 e LSL80-3.

Mistura dos tensoativos T20/SL80-3

(b) Mistura dos tensoativos T20/S100

(c) Mistura dos tensoativos T20/S100-3

83

4.5 Otimização da NE com SL80-3 e T20 como tensoativos

produzidas pelo método de alta energia

Foi usado planejamento fatorial análogo ao descrito no item 4.3.1. Os

níveis de cada fator estão na Tabela 7, sendo obtidos φ, IPD e ζ (Tabela 24).

Tabela 24. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta de NE produzidas com tensoativos

T20/L80-3

Tempo

x1

Potência

x2

φ

nm

IPD ζ

mV

L -1 -1 229,2 0,22 -39,1

M +1 -1 195,6 0,23 -42,7

N -1 +1 130,1 0,11 -20,8

O +1 +1 122,8 0,12 -9,9

P 0 0 175,3 0,12 -47,7

P 0 0 154,2 0,15 -31,1

P 0 0 152,1 0,15 -23,3

Como no estudo anterior, o fator x2 (PS) influi mais que x1 (ts) nas respostas,

conforme se observa para as amostras M e O. A mistura de tensoativos T20/SL80-3

aumentou o diâmetro médio das gotículas, concordando com trabalhos de

Bouchemal e col. (2004) e Saberi e col. (2013). No trabalho de Parikh e col. (1997)

foram produzidas NE com ciclosporina A para administração parenteral, contendo

1% (m:m) de T20 e 2% (m:m) de lecitina de ovo sendo obtidas gotículas com φ 129

±27 nm, e a formulação manteve-se estável. Os menores diâmetros médios foram

obtidos para as amostras N e O, com valores próximos aos obtidos por Parikh e col.

(1997).

Também foram observados valores de IPD <0,250 e do potencial Zeta

abaixo de -30 mV, com exceção da amostra O, com potencial Zeta de -9,9 mV. Para

as NE propostas neste estudo os valores de ζ devem ser <-30 mV, o que indica boa

estabilidade para as emulsões (KELMANN e col., 2007). Os resultados (Tabela 24)

84

mostram que as NE com T20/LS80-3 apresentam ζ <-30 mV (amostras L, M e P),

contrário do observado com a mistura P-F68/L-S75, para a qual ζ ≈0 mV. Estes

resultados são devidos à lecitina SL80-3. É conhecido que lecitinas possuem carga

negativa (grupo fosfato), devida principalmente ao ácido fosfatídico (BENITA &

LEVY, 1993; WASHINGTON, 1996; KELMANN e col., 2007). Possivelmente a

lecitina SL80-3 possui quantidade maior de ácido fosfatídico que a lecitina 75S.

Os dados experimentais (Tabela 24) foram ajustados por um modelo

linear (equações 16 a 18).

φ: ŷ = 165,6 - 10,2x1 - 43x2 (16)

IPD: ŷ = 0,157 + 0,005x1 - 0,06x2 (17)

ζ: ŷ = -30,7 + 1,82x1 + 12,78x2 (18)

Na equação 16: t2 x s(efeito) = 4,303 x 12,83 = 55,20. Portanto, nenhum

efeito é significativo.

Para IPD: t2 x s(efeito) = 4,303 x 0,017 = 0,07. Assim de acordo com a

equação 17, os efeitos não são significativos, pois são <0,07. Mas, como

mencionado, a Potência influenciou os valores de IPD.

Para ζ: t2 x s(efeito) = 4,303 x 12,5 = 16,8, sendo que esse valor

demonstra que os efeitos não foram significativos.

Uma solução para este problema seria ajustar os dados da Tabela 24

com outros modelos lineares ou aumentar o número de experimentos para aumentar

o número de graus de liberdade. Isso não foi feito, pois o objetivo deste estudo era

apenas melhorar os valores de IPD e potencial Zeta, o que foi conseguido.

4.6. Influência da pré-emulsão nas propriedades da NE sonicada

Alguns estudos mostram que a pré-emulsificação é passo importante

quando se utiliza ultrassom, pois a fragmentação das gotas requer grande

quantidade de energia (TANG e col., 2013). Assim é necessário preparar uma pré-

emulsão usando homogeneizador antes sonicar as amostras. Além do mais, alguns

85

estudos propõem que a utilização do T20 na formulação das NE pode gerar valores

elevados de IPD (BOUCHEMAL e col., 2004; SABERI e col., 2013).

Com objetivo de reduzir a população de gotículas maiores que 500 nm e

IPD < 0,25 dois tipos de misturadores foram testados na pré-emulsão. Os

experimentos a seguir seguem o mesmo planejamento fatorial descrito no ítem 4.4 e

os níveis de cada fator estão na Tabela 7.

4.6.1 Agitação magnética

Aumento do tempo de agitação de 10 para 20 min, mantendo a velocidade de

rotação em 600 rpm.


20 min 10 min

Tempo

x1

Potência

x2

φ

nm

IPD ζ

mV

φ

nm

IPD Ζ

mV

Q -1 -1 230,6 0,35 -47,6 229,2 0,22 -39,1

R +1 -1 242,7 0,23 -49,1 195,6 0,23 -42,7

S -1 +1 131,7 0,15 -34,5 130,1 0,11 -20,8

T +1 +1 104,5 0,09 -9,7 122,8 0,12 -9,9

U 0 0 169,9 0,14 -39,3 175,3 0,12 -47,7

U 0 0 176,3 0,16 -44,8 154,2 0,15 -31,1

U 0 0 157,3 0,14 -31,4 152,1 0,15 -23,3

O aumento do tempo de agitação não modificou muito as propriedades

físico-químicas analisadas, apenas houve pequena redução do diâmetro médio e

IPD para amostra T.

4.6.2 Homogeneizador UltraTurrax, com dispersor de policarbonato

(PC/PEEK-S25D-10G-KS)

Nestes experimentos foi utilizado homogeneizador Turrax com alto poder

de cisalhamento. Este equipamento possui um rotor que gira dentro um cilindro

86

provido de fendas (estator), contra o qual o fluido que se deseja emulsionar é

projetado. A energia devida à rotação e o impacto das partículas em alta velocidade

no estator cisalha as gotas, reduzindo seu diâmetro. Geralmente esta emulsão

primária forma gotículas com diâmetro reduzido (ALMEIDA e col., 2008; COSTA,

2009).

Como no planejamento fatorial mencionado no item 4.5, o fator x2

(Potência) tem maior influência que o fator x1 (tempo). Para a amostra W na qual os

dois fatores possuem os níveis mais elevados (+1;+1) são obtidas gotículas menores

(φ 102 nm) (Tabela 26).

O uso do Turrax produz pré-emulsão com menor diâmetro de gotículas

em relação às preparadas com agitador mecânico, conforme se observa para as

amostras V e X (Turrax) e as amostras Q e R (agitador mecânico). As pré-emulsões

preparadas com Turrax, depois de sonicadas, produziram NE com menor φ que as

preparadas com agitador mecânico. Para as amostras Q e W (níveis -1;-1) essas

diferenças foram expressivas, sendo encontrado φ 230 nm para primeira e 201,3 nm

para a segunda e IPD 0,35 para a amostra Q e 0,29 para amostra W. O aumento na

velocidade de rotação de 4000 para 5000 rpm poderia reduzir ainda mais o diâmetro

médio e o IPD, mas isso não ocorreu.

Tabela 26. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta de NE produzidas com Turrax

(4000 rpm e 5 min)

Tempo

x1

Potência

x2

Φ

nm

IPD ζ

mV

V -1 -1 201,3 0,29 -42,2

X +1 -1 214,3 0,17 -44,8

Z -1 +1 151,1 0,21 -38,2

W +1 +1 102,0 0,16 -36,1

Y 0 0 154,4 0,11 -40,4

Y 0 0 161,4 0,15 -41,5

Y 0 0 201,6 0,31 -41,8

87

No segundo ensaio (Tabela 27) era esperado que o aumento na

velocidade de rotação reduzisse φ e IPD, mas isso não ocorreu. O aumento da

velocidade pode dificultar a difusão das moléculas de tensoativo, diminuindo a

quantidade de tensoativo na interface óleo-água e resultando no aumento φ e IPD

(SABERI e col., 2013; TANG e col., 2013).

Os menores valores de φ foram os das amostras Z-2 (155,3 nm) e W-2

(144,4 nm), sendo a Potência o fator que mais influenciou nessa resposta e os

maiores para as amostras V-2 e X-2, nas quais a Potência do ultrassom foi menor.

Tabela 27. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta de NE produzidas com Turrax 5000

rpm e 5 min

Tempo

x1

Potência

x2

φ

nm

IPD ζ

mV

V-2 -1 -1 230,6 0,38 -44,6

X-2 +1 -1 197,7 0,32 -41,6

Z-2 -1 +1 155,3 0,25 -28,3

W-2 +1 +1 144,4 0,25 -28,6

Y-2 0 0 179,4 0,23 -39,6

Y-2 0 0 165,5 0,26 -39,7

Y-2 0 0 176,5 0,23 -39,4

Como o objetivo deste experimento foi selecionar a melhor metodologia

de preparo das pré-emulsões, os resultados mostram que velocidade menor (4000

rpm) produz pré-emulsão que, depois de sonicada, favorece a produção de NE com

φ e IPD aceitáveis para administração parenteral.

Este experimento, juntamente com o descrito no item 4.3.1, mostra que

aumento da velocidade de cisalhamento (e/ou potência de sonicação) nem sempre

reduz φ. Com o propósito de investigar como o Turrax afetava φ e IPD das pré-

emulsões, foi feito o experimento a seguir.

88

4.6.3 NE produzidas com homogeneizador Ultra-Turrax, com dispersor

de aço inox (S75N-25F)

No item 4.6.2 foi relatado que preparar pré-emulsão com velocidade de

rotação muito grande aumenta φ e IPD das gotículas. O objetivo deste experimento

foi verificar o limite em que esta velocidade pode influenciar esses parâmetros. Foi

utilizado dispersor de aço inox (com maior poder de cisalhamento) e sem que a pré-

emulsão fosse sonicada. Os planejamentos, fatores e níveis estão nas Tabelas 8 e 9

e os resultados nas Tabelas 28 e 29.


Tempo

x1

Velocidade

x2

média φ

nm

média IPD média ζ

mV

α1 -1 -1 376,2±7,3 0,46±0,01 -42,5±1,8

β1 1 -1 370,4±25,9 0,46±0,01 -42,2±1,9

γ1 -1 1 550,1±3,9 0,62±0,01 -45,3±2,6

δ1 1 1 510,4±27,4 0,54±0,01 -45,6±1,0


Tempo

x1

Velocidade

x2

média φ

nm

média IPD

média ζ

mV

α2 -1 -1 534,4±45,9 0,52±0,04 -59,3±4,5

β2 1 -1 497,6±0,5 0,49±0,01 -47,6±5,2

γ2 -1 1 1087,6±576,1 0,82±0,25 -58,6±2

δ2 1 1 739,8±51,1 0,68±0,03 -58,5±1,4

No Plan 2 (Tabela 9) foram usadas velocidades de rotação maiores que

no Plan 1 (Tabela 8). Os maiores diâmetros médios das gotículas estão na Tabela

29 e os menores na Tabela 28. Também foi observado que além do fator x2 o x1

influencia φ e IPD, sendo que menor tempo de cisalhamento resulta em diâmetros

89

médios e IPD maiores. No Plan 1, amostras α (376,2±7,3 nm; IPD 0,46±0,01) e γ

(550,1±3,9 nm; IPD 0,62±0,01) e no Plan 2 amostras α-2 (534,4±45,9 nm; IPD

0,52±0,04) e γ2 (1087,6±576,1 nm; IPD 0,82±0,25) comprovam que o aumento na

velocidade de cisalhamento aumenta φ e IPD.

As amostras α e γ foram escolhidas para serem sonicadas (10 min/400 W,

Tabela 30). Apesar da amostra β apresentar melhor resultado que a γ ela foi

descartada, pois os valores dos parâmetros mencionados estavam muito próximos

aos da amostra α.


φ

nm

IPDI ζ

mV

α3 103,5±3,9 0,09±0,05 -25,4±2,3

γ3 132,6±19,5 0,25±0,01 -11,4±7,0

As amostras α3 e γ3 tiveram os diâmetros médios e IPD de suas gotículas

reduzidos, próximos das amostras Z e W. O uso dispersor de aço inox ou de

policarbonato resultou em NE com φ e IPD similares e que embora a pré-

emulsificação seja importante é o sonicador que define, de fato, o resultado final.

Uma propriedade que foi alterada pelo dispersor de aço foi o potencial

Zeta, que teve seu valor reduzido em relação aos das amostras obtidas com

dispersor de policarbonato.

4.7 Influência da concentração de tensoativos

Este experimento estudou os efeitos que o aumento da concentração dos

tensoativos provoca no diâmetro médio, no IPD e no potencial Zeta das gotículas. As

NE mencionadas no ítem anterior tinham 1,5% (m:v) de tensoativos e quantidade de

óleo fixa em 1,5% (m:v). Como o objetivo era encapsular CsA, julgou-se que seria

melhor aumentar a quantidade de óleo. Esta foi fixada em 5% (m:v) e a massa de

tensoativos variou de acordo com a proporção adotada (Tabelas 10 e 11). Foram

feitos dois conjuntos de experimentos, o primeiro (Tabela 10) tem como solvente

90

etanol e o segundo (Tabela 11) uma mistura de etanol e acetona (50:50, v:v). Os

resultados estão nas Tabelas 31 e 32 e Figuras 18 e 19.

Tabela 31. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta para NE com etanol, após 1 dia

com evaporação sem evaporação

φ

nm

IPD ζ

mV

φ

nm

IPD Ζ

mV

F1 130,6±7,9 0,246±0,040 -11,2±2,2 114,9±11,2 0,281±0,034 -1,6±0,7

F2 113,5±4,2 0,292±0,044 -13,1±2,7 136,8±57,4 0,239±0,020 -33,8±0,8

F3 - - - 206,8±21,6 0,234±0,020 -22,6±1,0

F4 - - - 197,3±91,3 0,227±0,051 -17,1±2,8

F5 - - - - - -

Tabela 32. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta para NE com acetona/etanol

(50:50, v:v), após 1 dia

com evaporação sem evaporação

φ

nm

IPD ζ

mV

φ

nm

IPD Ζ

mV

F6 66,2±2,1 0,19±0,01 -5,1±5 149,5±39,5 0,11±0,02 -23±12,9

F7 73,5±2,6 0,33±0,14 -5,2±1 60,6 ±1,2 0,27±0,03 -3,4±2,6

F8 - - - - - -

F9 - - - - - -

F10 - - - - - -

O aumento da concentração do tensoativos trouxe várias situações

diferentes. Para as amostras com acetona/etanol (Tabela 32) o aumento da

concentração de tensoativos reduziu o diâmetro médio (amostras sem evaporação),

concordando com estudos de Ghosh e col.(2013) e Saberi e col. (2013). Porém, nas

amostras com etanol (Tabela 30) foi observado aumento do φ (amostras sem

evaporação). Segundo Saberi e col. (2013) isso ocorre porque aparece uma fase

91

líquido cristalina altamente viscosa, tornando mais difícil a ruptura na interface óleo-

água.

Visualmente observa-se que a viscosidade aumentou com a concentração

do tensoativo, razão pela qual as formulações F3 (1:3), F4 (1:4), F8 (1:3) e F9(1:4)

foram descartadas. Com aumento da concentração do tensoativo as moléculas de

água solvatam as de tensoativo aumentando a viscosidade da emulsão (GHOSH e

col., 2013), limitando a formação de gotículas (TANG e col., 2013). Isto ocorre nas

amostras sem evaporação (Tabela 31).

As NE foram avaliadas antes e após a retirada do solvente, pois um

aumento da concentração de TCM e tensoativos pode alterar a estabilidade da

interface óleo/água após retirada do solvente. Os resultados mostram, para

avaliação após 1 dia de ensaio, que a retirada dos solventes altera φ, mas de modo

diferente do que foi descrito no ítem 4.2. As amostras foram monitoradas durante 30

dias, sendo notado que as amostras com e sem evaporação seguem a mesma

tendência: há um crescimento menor até 15 dias e a partir daí um crescimento maior

para as amostras da Figura 17a que para as da Figura 18a. Para o IPD, as amostras

com etanol (Fig. 17b) apresentaram valores mais próximos e a retirada do solvente

não influencia IPD. Nas amostras (Fig. 18b), com mistura de acetona e etanol, os

valores de IPD são bem diferentes, evidenciando que a evaporação do solvente

influência esse parâmetro.

92


durante 30 dias. Amostras F1 e F2, com e sem evaporação do

solvente.

a

0 5 10 15 20 25 30

50

100

150

200

250

300

F1 eva

F2 eva

F1 n-eva

F2 n-eva

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo dias

b

0 5 10 15 20 25 30

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

F1 eva

F2 eva

F1 n-eva

F2 n-eva

IPD

tempo dias

c

0 5 10 15 20 25 30

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

po

ten

cia

l ze

ta (

mV

)

tempo dias

F1 eva

F2 eva

F1 n-eva

F2 n-eva

93

Figura 18. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD; c) potencial Zeta

durante 30 dias. Amostras F6 e F7, com e sem evaporação do solvente.

a

0 5 10 15 20 25 30

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

diâm

etro

méd

io (

nm)

tempo dias

F6 eva

F7 eva

F6 n-eva

F7 n-eva

b

0 5 10 15 20 25 30

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

IPD

tempo dias

F6 eva

F7 eva

F6 n-eva

F7 n-eva

c

0 5 10 15 20 25 30

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10

pote

ncia

l zet

a (m

V)

tempo dias

F6 eva

F7 eva

F6 n-eva

F7 n-eva

94

As amostras foram avaliadas até 120 dias (Fig. 19) após serem

preparadas. Para φ (Fig. 19a) foi notado aumento para F2 e menor aumento para

F6. Para F1 poucas variações foram observadas. A amostra F7 foi descartada, pois

houve quebra da emulsão após 90 dias. Quanto ao IPD (Fig. 19b) resultados

melhores foram obtidos e após 90 dias houve estabilização do mesmo para todas as

amostras. Para o potencial Zeta (Fig. 19c) não houve melhoria como observado nos

experimentos anteriores, embora não tenha ocorrido separação de fases.

95


durante 120 dias. Amostras F1, F2, F6 e F7, com evaporação do

solvente.

a

0 20 40 60 80 100 120

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo dias

F6

F7

F1

F2

b

0 20 40 60 80 100 120

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

IPD

tempo dias

F6

F7

F1

F2

c

0 20 40 60 80 100 120

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

po

ten

cia

l ze

ta (

mV

)

tempo dias

F6

F7

F1

F2

96

4.8 Influência da temperatura de armazenamento

Diante do resultado obtido para φ no item anterior, foi investigada se a

temperatura de armazenamento (25 °C e 4 °C) poderia influenciar temporalmente o

crescimento das gotículas. As formulações escolhidas para este experimento foram

a F2, na qual a quantidade de tensoativo é o dobro da de óleo (TCM:T; 1:2), para a

qual foram obtidos φ maiores, e a F6 com a mesma proporção de tensoativo e óleo

(TCM:T; 1:1), com valores menores de φ.

Na Figura. 20a estão os valores de φ. A temperatura influencia o

crescimento das gotículas e a 4 °C esse fenômeno é menos pronunciado. Os perfis

temporais de crescimento do diâmetro das gotículas são semelhantes,

principalmente o da amostra F2 a 4 °C e 25 °C, mas a 4 °C o crescimento foi

retardado, sendo observado diâmetro de 90 nm no dia 1 e 99,6 nm no dia 30

(crescimento ≈11%). Para a amostra F6 os valores de φ a 25 °C foram similares aos

da amostra F2 a 4 °C, mostrando que para F6 a influência da temperatura é menor

(Fig. 21 a), pois a 4 °C o diâmetro das gotículas foi de 81,1 nm (dia 1) para 91,6 nm

(dia 30 dias), aumentando ≈13% e a 25 °C φ variou de 84,2 nm (dia 1) a 95,6 nm

(dia 30), aumentando ≈14%.

Estes resultados indicam que a emulsão com maior concentração de

tensoativo é menos estável. Vários fenômenos podem estar relacionados com esse

aumento: floculação, coalescência e Ostwald “ripening”. Segundo Saberi e col.

(2013) floculação e coalescência aumentam IPD, mas isto não foi observado (Fig.

21) para as duas formulações. Já Ostwald “ripening” pode ter ocorrido nas

formulações. Em F6, em ambas as temperaturas, as gotículas são inicialmente

menores e aumentam ≈13% (4 °C) e ≈14% (25 °C) após 30 dias. Possivelmente as

diferenças na pressão de Laplace entre as gotículas e a fase contínua provocaram

este aumento. Para a amostra F2 o tensoativo pode estar em excesso originando

micelas que ficam agregadas às gotículas. O fenômeno de Ostwald “ripening” pode

ocorrer ou promover agregação das gotículas, aumentando φ. O aumento da

temperatura favoreceu esse processo para a amostra F2, pois a 25 °C o diâmetro foi

96,5 nm (dia 1) para 115,9 nm (dia 30, crescimento ≈21%) e a 4 °C de 90 nm (dia 1)

para 99,6 nm (dia 30, variação ≈11%).

97

O comportamento de F2 e F6 analisadas neste experimento justifica o

crescimento pronunciado do φ das gotículas de F2 no experimento descrito no item

4.7.

Quanto ao IPD (Fig. 20b) e potencial Zeta (Fig. 20c) não foram

observadas diferenças significativas.

98


durante 30 dias. Amostras F2 e F6, a 4°C e 25°C.

c

0 5 10 15 20 25 30

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

pote

ncia

l zet

a (m

V)

tempo dias

F2 - 25°C

F6 - 25°C

F2 - 4°C

F6 - 4°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,11

0,12

0,13

0,14

0,15

0,16

0,17

0,18

0,19

0,20

0,21

0,22

0,23

0,24

0,25

0,26

0,27

IPD

tempos dias

F2 - 25°C

F6 - 25°C

F2 - 4°C

F6 - 4°C

a

0 5 10 15 20 25 30

70

80

90

100

110

120

130

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo dias

F2 - 25°C

F6 - 25°C

F2 - 4°C

F6 - 4°C

99

Figura 21. Distribuição do diâmetro médio obtida via espalhamento dinâmico de luz.

Amostras F2 e F6, a 4°C, após 30 dias.

4.9 Influência do método de incorporação da CsA na NE

O principal objetivo deste projeto foi produzir NE, carregadas com CsA,

com gotículas de menor φ e distribuição de tamanhos a mais estreita possível. Para

investigar o efeito do método de incorporação do fármaco nas propriedades das NE

sonicadas, foram adotados dois métodos. No primeiro, o fármaco foi dissolvido na

fase orgânica antes da emulsificação (F_antes) e, em outro, uma solução

100

concentrada do fármaco foi adicionada diretamente na NE previamente preparada

(F_depois). Os resultados estão nas Figuras. 22, 23 e 24.

Figura 22. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1; 15; 30.

Amostra F2 com CsA (adicionado antes ou depois da emulsificação) e

sem CsA.

a

b

101

b

Figura 23. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1; 15; 30.

Amostra F6 com CsA (adicionado antes ou depois da emulsificação) e

sem CsA.

Como pode ser visto nas Figuras 22a e 23a, φ foi alterado pela presença

da CsA. Para F2 preparada pelo método F_antes o φ foi inicialmente menor que o

da NE sem fármaco. Para F6 foi observado pequena diferença entre as NE. Como

a

b

102

no método F_antes toda pré-emulsão, que contém fármaco, é sonicada, duas

situações podem levar à redução do diâmetro. Uma é que o fármaco pode estar

localizado na interface óleo/água, reduzindo a tensão interfacial e o diâmetro das

gotículas (SILA e col., 2008). Outra é que a energia do ultrassom reduziu o diâmetro.

Para F2 (Fig. 22a) a primeira situação pode ter ocorrido e pode ser que parte do

fármaco esteja localizado nas gotículas, pois a amostra F2_antes mostrou o mesmo

crescimento do φ de F2 sem CsA, além dos valores de IPD (Fig. 22b) estarem

próximos. Para F6 (Fig. 23a) a segunda situação é mais provável, pois inicialmente

as gotículas existentes em F6_antes estavam pouco maiores que as de F6 sem CsA

e, ao longo do ensaio, F6_antes não exibiu o mesmo crescimento de diâmetro de F6

sem CsA, sendo os valores de φ de F6_antes maiores.

É importante saber que quando incorporado em emulsão lipidica o

fármaco pode se localizar nas gotículas de óleo, na interface, nas estruturas dos

tensoativos e na fase aquosa e esta localização influencia suas propriedades, devido

às interações de suas moléculas com as demais, afetando inclusive sua

estabilidade (SILA e col., 2008; TANG e col., 2013).

Adicionando CsA após a emulsificação (Fig. 22a; Fig. 23a) verifica-se

aumento considerável do φ ao longo de 30 dias, mostrando que as NE eram

instáveis. Isso ocorre pois esse método envolve a mistura da solução concentrada

do fármaco diretamente na NE, sem emprego de alta energia. Assim, quantidade

menor de moléculas de fármaco pode residir na interface óleo/água (SILA e col.,

2008), havendo quantidade maior de fármaco na emulsão, podendo interagir com

outros componentes, desestabilizando a NE, conforme evidenciado pelo aumento do

IPD (Fig. 22b e 23b).

O método usado na preparação da amostra F_antes é melhor, pois

produz NE mais estáveis, com menores valores de diâmetro que os obtidos para a

amostra F_depois (Fig. 24a), tanto para F2 como para F6. Quanto ao IPD, há pouca

variação ao longo de 30 dias tanto para F2_antes como F6_antes, mas F6_antes

possui valores menores que 0,25 (Fig. 24b).

103

b


Amostras F2 e F6, com CsA (adicionado antes ou depois da

emulsificação).

a

0 5 10 15 20 25 30

0

100

200

300

400

500

600

diâ

me

tro

m

éd

io (

nm

)

tempo (dias)

F2 - antes

F2 - depois

F6 - antes

F6 - depois

b

0 5 10 15 20 25 30

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

IPD

tempo (dias)

F2 - antes

F2 - depois

F6 - antes

F6 - depois

104

4.10 Influência do pH e de glicerol

O uso de aditivos na formulação de emulsões parenterais é necessário

para que o pH e a tonicidade fiquem próximos aos valores fisiológicos (BENITA &

LEVY, 1993). Glicerol é usado como agente isotônico (BENITA & LEVY, 1993;

JUMMA & MULLER, 1998) e o pH é ajustado (entre 6,5 e 8,5) com soluções

aquosas de NaOH ou HCl (BENITA & LEVY, 1993; KELMANN e col., 2007).

Emulsões parenterais tem pH adequado para manter a homeostasia do

organismo e minimizar hidrólise dos TCM, TCL e das lecitinas (BENITA & LEVY,

1993; HANEFELD e col., 2011).

No início dos trabalhos desta Tese, o pH variava entre 3 e 5,8 mas não foi

ajustado, pois havia interesse de encontrar as condições mais adequadas à

obtenção de NE estáveis, com gotículas homogêneas e com diâmetro de gotículas

adequado à administração parenteral.

Uma propriedade afetada pelo pH é o potencial Zeta. Desta forma seria

necessário mensurá-lo, mas devido a resultados inconsistentes ele não foi

analisado. Como o objetivo era mensurar o potencial Zeta para avaliar a estabilidade

do sistema, julgou-se que a estabilidade da emulsão seria por conta dos tensoativos

não iônicos, ao qual promovem a estabilidade por efeito estérico e não por repulsão

(DALTIN, 2012; KOROLEVA e col., 2012).

Nestes experimentos as amostras foram estocadas a 4 °C e 25 °C e

monitoradas após 1 e 120 dias. Os resultados estão nas Figuras 25 a 29.

105


Amostras F2 e F6, com e sem glicerol e pH ajustado entre 6,0 a 6,88

a

0 20 40 60 80 100 120

40

60

80

100

120

140

160

180

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F2_sem glicerol 4C

F2_glicerol

F6_sem glicerol

F6_glicerol

b

0 20 40 60 80 100 120

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

IPD

tempos (dias)

F2_sem glicerol 4C

F2_glicerol

F6_sem glicerol

F6_glicerol

106

Figura 26. a) Diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1 e 120. Amostras F2 e F6, com e

sem glicerol e pH ajustado entre 6,0 e 6,88

a

b

107


Amostras F2 e F6, com e sem glicerol e pH ajustado entre 6,0 a 6,88

a

0 20 40 60 80 100 120

40

60

80

100

120

140

160

180

200

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F2_sem glicerol 25C

F2_glicerol

F6_sem glicerol

F6_glicerol

b

0 20 40 60 80 100 120

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

IPD

tempo (dias)

F2_sem glicerol 25C

F2_glicerol

F6_sem glicerol

F6_glicerol

108

Figura 28. a) Diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1 e 120. Amostras F2 e F6, com e

sem glicerol e pH ajustado entre 6,0 a 6,88

A adição do glicerol pode influenciar φ e IPD. Em estudo realizado por

Saberi e col. (2013), o aumento de 0 a 50% de glicerol em NE com tensoativo não

iônico reduziu o tamanho das gotículas de 140 nm (sem glicerol) para 55 nm (com

a

b

109

glicerol), mas em concentrações de glicerol ≤20% (em massa), o diâmetro aumenta

com a concentração de tensoativo.

As Figuras 25 a 29 mostram a influência do glicerol no φ e IPD. A adição

de glicerol aumentou pouco o diâmetro das gotículas em todas as formulações,

sendo os maiores diâmetros os de F2, com exceção da amostra F6 a 4 °C. Em F2,

com maior concentração de tensoativos, a presença do glicerol retardou o

crescimento das gotículas. Sem glicerol o diâmetro variou de 89,8 nm (dia 1) para

124 nm (dia 120), aumento de ≈40%, e com glicerol variou de 94,4 nm (dia 1) para

118,7 (dia 120), aumento de ≈26% (Fig. 25a). Para F6, com menor concentração de

tensoativo, a presença do glicerol aumentou o diâmetro. Sem glicerol o diâmetro foi

de 87,5 nm (dia 1) para 113 nm (dia 120), variação de ≈30% e, com glicerol, foi de

77,9 nm (dia 1) para 116,6 nm (dia 120), variando ≈50% (Fig. 26a).

Após 120 dias, houve redução do IPD. A 4 °C esta redução foi pequena

(Fig. 26b e 28b), para amostras com e sem glicerol e a 25 °C (dia 120) as diferenças

de IPD foram maiores (amostras com e sem glicerol), sendo que para F6, a 25 °C

(dia 120), com glicerol 0,22 e sem glicerol 0,17 (Fig. 29).

Nas Figuras 25a-b e 27a-b observa-se que o diâmetro das gotículas das

amostras a 25 °C é maior após 90 dias e o IPD após 60 dias. A 4 °C o diâmetro é

mantido depois de 60 dias e o IPD depois de 90 dias.

110

Figura 29. Distribuição do diâmetro. Amostra F6 a 25°C, após 120 dias.

O pH também foi monitorado ao longo de 120 dias (Tabela 33).

111

Tabela 33. Variação temporal do pH de F2 e F6, com e sem glicerol, a 4°C e 25°C

4°C 25°C

1 dia

F2_sem glicerol 6,62±0,02 6,22±0,02

F2_glicerol 6,53±0,03 6,06±0,04

120 dias

F2_sem glicerol 6,24±0,06 5,51±0,04

F2_glicerol 6,30±0,02 5,87±0,06

1 dia

F6_sem glicerol 6,88±-0,02 6,61±0,02

F6_glicerol 6,57±0,01 6,55±0,02

120 dias

F6_sem glicerol 6,41±0,11 5,06±0,09

F6_glicerol 6,00±0,09 5,53±0,08

O pH de uma nanoemulsão é indicativo de sua estabilidade. A redução do

pH indica a presença de ácidos graxos livres gerados na hidrólise dos triglicerídeos.

Daftary e col. (2011) e Bruxel e col. (2012) observaram coalescência de gotículas de

NE quando o pH diminuiu. Na Tabela 32 observa-se redução do pH com o tempo,

sendo que a 25 °C a diminuição foi maior que a 4 °C, para as duas amostras,

independente da presença de glicerol.

4.11 Estabilidade térmica

A estabilidade da emulsão depende da rigidez e estabilidade do filme

formado pelo tensoativo sobre a superfície das gotículas. Para estimar a estabilidade

térmica das nanoemulsões, embora em condições distintas das de armazenamento,

foi realizado teste de "stress". Temperaturas elevadas diminuem a viscosidade e a

estabilidade da emulsão, mas temperaturas baixas também têm efeitos adversos

nessa estabilidade. Quando a temperatura é menor que a de transição de fase do

tensoativo, aumenta a rigidez do filme formado por ele, pois o filme está na fase gel,

mais rígida que a líquida cristalina. O resfriamento também diminui a repulsão

112

eletrostática entre as gotículas e o movimento browniano, reduzindo a frequência e

intensidade das colisões entre as gotículas (MULLER, 1990).

Diante dos resultados descritos no item 4.10 foi necessário investigar

outros tensoativos não iônicos para melhorar a estabilidade das NE contendo SL80-

3. Foram usados T80 e o P-F68. O T20 foi adotado como referência. As

temperaturas foram 4 °C, 25 °C e 45 °C e os resultados estão nas Figuras. 30 a 35.

Figura 30. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F2 a

4°C, 25°C e 45°C.

b

0 5 10 15 20 25 30

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

IPD

tempo (dias)

F2_4°C

F2_25°C

F2_45°C

z

a

0 5 10 15 20 25 30

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F2_4°C

F2_25°C

F2_45°C

113

Figura 31. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F19

a 4°C, 25°C e 45°C.

b

0 5 10 15 20 25 30

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

IPD

tempo (dias)

F19_4°C

F19_25°C

F19_45°C

a

0 5 10 15 20 25 30

60

80

100

120

140

160

diâm

etro

méd

io (

nm)

tempo (dias)

F19_4°C

F19_25°C

F19_45°C

114


a 4°C, 25°C e 45°C.

a

0 5 10 15 20 25 30

80

100

120

140

160

180

200

220

diâm

etro

méd

io (

nm)

tempo (dias)

F27_4°C

F27_25°C

F27_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

0,26

0,28

0,30

0,32

IPD

tempo (dias)

F27_4°C

F27_25°C

F27_45°C

115

Figura 33. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F6 a

4°C, 25°C e 45°C.

a

0 5 10 15 20 25 30

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

diâm

etro

méd

io (

nm)

tempo (dias)

F6_4°C

F6_25°C

F6_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,10

0,11

0,12

0,13

0,14

0,15

0,16

0,17

0,18

0,19

0,20

0,21

0,22

0,23

0,24

0,25

0,26

0,27

0,28

0,29

IPD

tempo (dias)

F6_4°C

F6_25°C

F6_45°C

116

a


a 4°C, 25°C e 45°C.

b

0 5 10 15 20 25 30

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

IPD

tempo (dias)

F20_4°C

F20_25°C

F20_45°C

a

0 5 10 15 20 25 30

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F20_4°C

F20_25°C

F20_45°C

117


a 4°C, 25°C e 45°C.

a

0 5 10 15 20 25 30

90

100

110

120

130

140

150

160

170

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F28_4°C

F28_25°C

F28_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

0,26

IPD

tempo (dias)

F28_4°C

F28_25°C

F28_45°C

118

Todas as amostras quando expostas a 45 °C ficaram instáveis, havendo

crescimento das gotículas após um mês de armazenamento. Para as formulações

com proporção 1:2 (TCM:T, m:m) de tensoativo, o diâmetro aumentou com a

temperatura de turvação do tensoativo, sendo maior (≈98%) para F27 (com P-F68,

temperatura de turvação ≈100 °C) e menor (≈45%) para F2 (com T20, temperatura

de turvação 76 °C). Para as amostras com proporção 1:1 (TCM:T, m:m) de

tensoativo este aumento não foi observado, mas o crescimento de φ foi menor

(≈50%) para a amostra F28 (com P-F68). Tensoativos não iônicos, quando em

temperatura elevada, sofrem desidratação da cabeça hidrofílica e a agregação é

facilitada, havendo coalescência e instabilidade da amostra, também por causa do

aumento do movimento Browniano (MORAIS e col., 2006; SABERI e col., 2013).

Quanto à influência do tipo de tensoativo na estabilidade da NE foi

verificado que em presença de T80 e P-F68 o crescimento do diâmetro foi maior,

dependendo da concentração do tensoativo. Para as amostras, a 25°C, com maior

concentração (TCM:T, 1:2, m:m) o aumento foi ≈33%, para T80 ≈35% para P-F68.

Para as amostras com menor concentração (TCM:T, 1:1, m:m) o aumento foi ≈22%

para T80 e ≈30% para F68, a 25 °C. Nesta temperatura houve aumento de ≈23%

para F2 e ≈18% para F6, ambas com T20. A formulação F6 foi a que manteve menor

diâmetro e estabilidade e a F2 o menor IPD.

4.11.1 Influência do aumento da fase aquosa

O objetivo deste experimento foi melhorar a estabilidade das NE. Em

estudo realizado por Saberi e col. (2013) foi observado que a diluição prévia do

glicerol antes da emulsificação originou NE mais estáveis. Nesta Tese também foi

feita prévia diluição do glicerol em 3 mL de água. Os resultados estão nas Figuras

37 a 47.

O primeiro conjunto de amostras (Fig. 36-38) foi obtido com as mesmas

proporções de F2 (TCM:T, 1:2, m:m) e solvente etanol, o segundo conjunto (Fig. 39-

41) tem as mesmas proporções que a F6 (TCM:T, 1:1, m:m) e solvente

acetona:etanol (1:1, v:v) e o terceiro conjunto (Fig. 42-44) tem as mesmas

proporções de F1 (TCM:T, 1:1, m:m) e solvente etanol.

119


a 4°C, 25°C, 45°C.

a

0 5 10 15 20 25 30

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F29_4°C

F29_25°C

F29_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

IPD

tempo (dias)

F29_4°C

F29_25°C

F29_45°C

120


a 4 °C, 25 °C, 45 °C.

a

0 5 10 15 20 25 30

-100

0

100

200

300

400

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F30_4°C

F30_25°C

F30_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

0,85

0,90

IPD

tempo (dias)

F30_4°C

F30_25°C

F30_45°C

121


a 4 °C, 25 °C, 45 °C.

a

0 5 10 15 20 25 30

50

100

150

200

250

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F31_4°C

F31_25°C

F31_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

IPD

tempo (dias)

F31_4°C

F31_25°C

F31_45°C

122


a 4 °C, 25 °C, 45 °C.

a

0 5 10 15 20 25 30

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F32_4°C

F32_25°C

F32_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

IPD

tempo (dias)

F32_4°C

F32_25°C

F32_45°C

123


a 4 °C, 25 °C, 45 °C.

b

0 5 10 15 20 25 30

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

0,26

0,28

0,30

0,32

0,34

0,36

0,38

0,40

0,42

0,44

IPD

tempo dias

F33_4°C

F33_25°C

F33_45°C

a

0 5 10 15 20 25 30

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F33_4°C

F33_25°C

F33_45°C

124


a 4 °C, 25 °C, 45 °C.

a

0 5 10 15 20 25 30

60

70

80

90

100

110

120

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F34_4°C

F34_25°C

F34_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

0,26

0,28

0,30

IPD

tempo (dias)

F34_4°C

F34_25°C

F34_45°C

125


a 4 °C, 25 °C, 45 °C.

a

0 5 10 15 20 25 30

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F35_4°C

F35_25°C

F35_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

IPD

tempo (dias)

F35_4°C

F35_25°C

F35_45°C

126


a 4 °C, 25 °C, 45 °C.

a

0 5 10 15 20 25 30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F36_4°C

F36_25°C

F36_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

IPD

tempo (dias)

F36_4°C

F36_25°C

F36_45°C

127


a 4 °C, 25 °C, 45 °C.

b

0 5 10 15 20 25 30

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

0,26

0,28

0,30

0,32

0,34

0,36

0,38

0,40

0,42

IPD

tempo (dias)

F37_4°C

F37_25°C

F37_45°C

a

0 5 10 15 20 25 30

80

100

120

140

160

180

200

220

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F37_4°C

F37_25°C

F37_45°C

128

Para as amostras com P-F68 (F31, F34, F36) o crescimento do diâmetro

foi ≈85% (25 °C) e ≈170% (4 °C). A amostra F29 a 45 °C teve aumento de ≈230% no

diâmetro. As formulações F32, F33, F35 e F36 (com TCM/T (1:1, m:m) tiveram os

menores crescimentos do diâmetro, independente do tipo de solvente. As

formulações com T20 e T80 apresentaram os melhores resultados quando a NE foi

diluída. A distribuição do diâmetro é multimodal (Fig. 45 e 46).

Figura 45. Distribuição do diâmetro. Amostra F35 a 4 °C.

Figura 46. Distribuição do diâmetro. Amostra F36 a 4 °C.

129

4.12 Influência da incorporação de 5% ou 12% de CsA

O objetivo deste estudo foi verificar se uma adição maior de CsA alteraria o

filme interfacial. No item 4.9 foram descritos experimentos incorporando 5% (m:m)

de CsA em relação ao óleo, sem glicerol. Novo teste foi realizado, sendo

incorporados 5 e 12% (m:m) em relação ao óleo. Optou-se por manter T20 como

tensoativo, apesar das gotículas terem apresentado diâmetro maior que aquelas

com T80. Foi usada a mesma metodologia descrita no item 4.9, sendo o fármaco

incorporado antes da emulsificação. Os resultados estão nas Figuras 47 e 48.

130

Figura 47. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostras F1,

F2 e F6 com 5% (m:m) de CsA.

a

0 5 10 15 20 25 30

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F2 %5 CsA

F1

F6

b

0 5 10 15 20 25 30

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

IPD

tempo (dias)

F2 5% CsA

F1

F6

131

Figura 48. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostras F1,

F2 e F6 com 12% (m:m) de CsA.

a

0 5 10 15 20 25 30

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F2 12% CsA

F1

F6

b

0 5 10 15 20 25 30

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

IPD

tempo (dias)

F2 12% CsA

F1

F6

132

Em todas as formulações houve incremento do diâmetro das gotículas,

sendo que adição de 12% de CsA resultou em diâmetro maiores que a de 5%. Além

disso, as nanoemulsões apresentaram distribuição multimodal. A adição de 5% de

CsA produziu NE com IPD (Fig. 47b) melhor que com 12% de CsA (Fig.48b).

Quanto à influência da concentração do tensoativo, as formulações que

tinham a menor concentração produziram NE (amostras F1 e F6) com gotículas

menores, sendo que para F6 a distribuição do diâmetro foi mais regular que para F2.

4.13 Influência da incorporação de α-tocoferol

Devido aos resultados obtidos nos itens 4.10 (relativos ao pH) e 4.1.1

(estabilidade térmica), foi necessário adicionar acetato de α-tocoferol, antioxidante

utilizado em formulações contendo fosfolipídios e óleos vegetais (BENITA & LEVY,

1993; HANEFELD e col., 2011). As moléculas de α-tocoferol podem ficar adsorvidas

na interface óleo-água, diminuindo a tensão interfacial (TEO e col., 2010).

As formulações escolhidas para este estudo foram F1, F2 e F6. F2 foi

mantida, pois apresenta o pior resultado e serve de comparação para as outras

formulações. As formulações F1 e F2 diferem no tipo de solvente empregado e

proporção de óleo:tensoativo. α-tocoferol pode agir como tensoativo e a presença de

diferentes solventes pode alterar suas propriedades. Foram adicionados 10 e 30%

(m:m) de α-tocoferol em relação à quantidade óleo utilizada e monitorados, durante

30 dias, o diâmetro e o IPD das gotículas (Fig. 49-55).

133


com 10% de α-tocoferol.

a

0 5 10 15 20 25 30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F1_4°C

F1_25°C

F1_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

IPD

tempo (dias)

F1_4°C

F1_25°C

F1_45°C

134



a

0 5 10 15 20 25 30

20

40

60

80

100

120

140

160

180

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F2_4°C

F2_25°C

F2_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

IPD

tempo (dias)

F2_4°C

F2_25°C

F2_45°C

135



a

0 5 10 15 20 25 30

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F6_4°C

F6_25°C

F6_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

IPD

tempo (dias)

F6_4°C

F6_25°C

F6_45°C

136



a

0 5 10 15 20 25 30

70

75

80

85

90

95

100

105

110

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F1_4°C

F1_25°C

F1_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

IPD

tempo (dias)

F1_4°C

F1_25°C

F1_45°C

137

Figura 53. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F2,


b

0 5 10 15 20 25 30

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

IPD

tempo (dias)

F2_4°C

F2_25°C

F2_45°C

a

0 5 10 15 20 25 30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F2_4°C

F2_25°C

F2_45°C

138

Figura 54. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F6,

com 30% de α-tocoferol, a 4 °C.

a

0 5 10 15 20 25 30

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

F6_4°C

F6_25°C

F6_45°C

b

0 5 10 15 20 25 30

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

IPD

tempo (dias)

F6_4°C

F6_25°C

F6_45°C

139

A presença do α-tocoferol inibiu o aumento do diâmetro. Foi observado

aumento de ≈20% para as amostras a 25°C e ≈30% a 35%, a 45 °C os valores

chegaram ≈98%. Para amostras a 4 °C os valores variaram de ≈15 a 22%. Esses

resultados foram obtidos para amostras com 10% e 30% de α-tocoferol. O pH

também foi monitorado e pequenas variações foram observadas (Tabela 34).

Tabela 34. Variação temporal do pH das amostras F1, F2 e F6, a 25 °C

amostra pH 25°C

dia 1 dia 30

10% α-tocoferol

F1 7,23±0,05 6,97±0,05

F2 6,73±-0,02 6,38±0,09

F6 6,64±0,03 5,61±0,1

30% α-tocoferol

F1 6,66±0,03 6,64±0,1

F2 6,50±0,04 5,91±0,3

F6 6,55±0,01 6,01±0,7

140

Figura 55. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 210 dias. Amostras

F1, F2 e F6, com 10% de α-tocoferol, a 4 °C.

a

0 50 100 150 200 250

40

50

60

70

80

90

100

110

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dia)

F1 4°C

F2

F6

b

0 50 100 150 200 250

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

IPD

tempo (dias)

F1 4°C

F2

F6

141

Estes resultados mostram que as gotículas tem crescimento acelerado

até 30 dias e depois pouco variam. Foi observado crescimento de ≈16% para F1,

≈14% para F2 e ≈17% para F6 (Fig. 55a). Os valores de IPD finais foram <0,25 e o

pH ficou entre 6,04 e 6,4.

4.14 NE obtidas mediante emulsificação espontânea

4.14.1 Influência da proporção óleo:tensoativo

Nos primeiros testes a concentração de óleo foi fixada em 5% (m:v) e a

soma dos tensoativos lipofílico e hidrofílico em 5% (m:v) (KELMANN et al., 2007).

Isso permitiria trabalhar com as mesmas concentrações de óleo e tensoativo usadas

nas NE obtidas com o ultrassom. Mas essas concentrações produziram NE instáveis

após 8h. Isso demonstrou que a proporção solvente:óleo não estavam adequadas.

Anton & Vandamme (2009) relatam que para obter nanoemulsões pela metodologia

de emulsificação espontânea, a proporção de solvente em relação ao óleo deve ser

extremamente elevada, por exemplo, deve-se usar uma pequeníssima percentagem

de óleo na fase orgânica antes da mistura. Desta forma, a quantidade de óleo usada

foi 0,5% (m:v), uma quantidade dez vezes menor do que a usada nas NE obtidas

com o ultrassom. Definida a quantidade de óleo estudou-se a influência da

proporção óleo:tensoativos, bem como o tipo de solvente, no diâmetro das gotículas.

Os resultados estão dispostos na Figura. 56.

142


ES1, ES2, ES3, ES4, ES5 e ES6, a 25 °C.

a

ES1 ES2 ES3 ES4 ES5 ES6

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

diآm

etr

o m

éd

io (

nm

)

1dia 25°C

15 dias

b

ES1 ES2 ES3 ES4 ES5 ES6

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

IPD

1 dia 25°C

15 dias

143

A proporção inicial de óleo:tensoativo (dia 1) não demonstrou diferenças

relevantes. A diferença observada foi em relação à proporção entre os tensoativos,

onde as amostras ES5 e ES6 (TCM:T, 1:0,5), que apresentam quantidade menor de

lecitina, produziram NE com diâmetros maiores (478,7±52,8 nm, ES5 dia 1 e

744,1nm ±38,2,ES6, dia 1). Outra diferença observada foi em relação ao tipo de

solvente utilizado; a presença do etanol resultou em NE com diâmetros menores

(ES1 247,1±22,8 nm e ES3 254,0±18,3 nm, dia 1) em comparação com a mistura

etanol/acetona ( 284,5±9,2 nm, ES2 e ES4 299,0±4,0 nm, ES4 dia 1) (Fig. 56a), nas

mesmas proporções de óleo/tensoativo.

Depois de 15 dias as diferenças observadas foram significativas. As

amostras ES4, ES5 e ES6 foram descartadas, pois o diâmetro e o IPD evoluíram

para 1000 nm (Fig. 56a) e IPD de 1,0 (Fig. 56b), o que provocou separação de

fases. Já as outras amostras não apresentaram separação de fases, mas tiveram

crescimento considerável das gotículas, sendo para ES1 ≈26%, ES2 ≈57% e ES3

≈58%, indicando que são instáveis embora não tenha sido observada floculação e

cremeação.

Quanto ao IPD, para as amostras com etanol foram notados inicialmente

valores mais próximos de 0,25 (Fig. 56b), onde para ES1 (0,225 ±0,03) e ES3 (0,21

±0,05) com etanol e ES2 (0,35 ±0) mistura acetona/etanol para 1 dia de ensaio.

Após o término do experimento houve redução para ES1 de ≈6,2% (0,225 para 0,21)

e ES2 de ≈22% (0,35 para 0,27). Para ES3 houve aumento de ≈10,5% (0,21 para

0,23).

As amostras escolhidas para prosseguir os estudos foram a ES1 e a ES2,

apesar de ES2 ter apresentado crescimento de ≈57% para o diâmetro e redução do

IPD, demonstrando que a proporção 1:0,8 (óleo:tensoativo) parece ser adequada.

4.15 Influência do tipo de tensoativo

Devido aos valores de IPD e o crescimento acelerado do diâmetro médio

foram testados novos tensoativos com objetivo de melhorar esses parâmetros. Os

experimentos a seguir investigaram a influência que o tipo de tensoativo usado teria

no diâmetro médio inicial das gotículas e IPD das NE.

144

4.15.1 NE produzidas em etanol

Neste experimento foi utilizada a formulação ES1 como referência, sendo

adicionados 5% (m:m) de CsA, em relação à quantidade de óleo, para as quatro

primeira formulações e com a amostra PL sem CsA. As amostras foram feitas em

duplicata e armazenadas a 4 °C, 25 °C e 45 °C. Os resultados estão nas Figuras 57

a 59 e Tabela 35.


ES7, ES8, ES9, ES10 e PL, a 4 °C.

a

ES7 ES8 ES9 ES10 PL

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

1 dia 4 ؛C

15 dias

b

ES7 ES8 ES9 ES10 PL

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

IPD

1dia 4 ؛C

15 dias

145


ES7, ES8, ES9, ES10 e PL, a 25 °C.

a

ES7 ES8 ES9 ES10 PL

0

200

400

600

800

1000

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

1dia 25 ؛C

15 dias

b

ES7 ES8 ES9 ES10 PL

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

IPD

1 dia 25 ؛C

15 dias

146


ES7, ES8, ES9, ES10 e PL, a 45 °C

a

ES7 ES8 ES9 ES10 PL

0

200

400

600

800

1000d

iâm

etr

o m

éd

io (

nm

)

1 dia 45 ؛C

15 dias

b

ES7 ES8 ES9 ES10 PL

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

IPD

1 dia 45 ؛C

15 dias

147

Tabela 35. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta para NE produzidas em etanol por

emulsificação espontânea, após 1dia, a 25 °C

Ensaio polisorbato

x1

lecitina

x2

média φ

nm

média

IPD

ES7 T20 L-PC-3 242,3 ±10,9 0,161±0,05

ES8 T80 L-PC-3 372,5±58,5 0,244±0,02

ES9 T20 L-SL80-3 197,7±9,5 0,155±0,07

ES10 T80 L-SL80-3 215,6±2,5 0,176±0,03

PL T20 L-SL80-3 188,8±13,4 0,194±0,01

Foi notado que o diâmetro inicial possui uma dependência maior ao tipo

de lecitina usada que ao tipo de tensoativo não iônico. Isso pode ser confirmado

quando analisamos as amostras ES7 e ES9 (Tabela 35), onde o mesmo tensoativo

(T20) não iônico é usado, mas com diferentes lecitinas. Para a primeira foi usada a

lecitina L-PC-3 sendo encontrado maior diâmetro (242,3±10,9 nm, dia 1, 25 °C).

Para a amostra ES9, com lecitina L-SL80-3, o diâmetro médio das gotículas foi

197,7±9,5 nm (dia 1, 25 °C). Também é observada pequena diferença entre os

resultados obtidos com os tensoativos não iônicos. Comparando as amostras ES9 e

ES10 (Tabela 35), onde a mesma lecitina estava presente, mas com diferentes

tensoativos não iônicos, foi observado pequeno aumento para ES10 com T80

(215,6±2,5 nm, dia 1, 25 °C) e para ES9, com T20, foi encontrado um diâmetro

médio menor (197,7±9,5 nm, dia 1, 25 °C).

A temperatura de armazenamento também teve efeito significativo em

todas as amostras, como pode ser observado nas Figuras 57a, 58a e 59a. Houve

aumento considerável no diâmetro das gotículas, principalmente para as amostras

com L-PC-3, depois de 15 dias de armazenamento. O diâmetro médio em ES8

aumentou ≈57,2% a 4 °C (262 nm inicialmente para 411,8 nm), ≈170% a 25 °C

(372,5 nm inicialmente para 1000 nm) e ≈173% a 45 °C (267,1 nm inicialmente para

1000 nm). Neste último o valor não é confiável, pois o aparelho somente detecta até

partículas com diâametro até 1000 nm de maneira confiável. Para a amostra ES10

(L-SL80-3) o aumento foi de ≈12% a 4 °C (196,3 nm inicialmente para 219,3 nm),

148

≈23% a 25 °C (215,6 nm inicialmente para 264,7 nm) e ≈125% a 45 °C (238,6 nm

inicialmente para 534,9 nm). Isso demonstra que a L-SL80-3 estabiliza um pouco

mais as NE que L-PC-3, pois T80 estava presente nas duas NE. Também foi notado

que o resfriamento das amostras retarda o crescimento do diâmetro médio e a

elevação de temperatura (45 °C) tem efeito contrário. É importante considerar que o

fenômeno de Ostwald ”ripening” pode ser acelerado pela temperatura, pois o

aumento desta aumenta a solubilidade do óleo na fase aquosa. Assim, a 45 °C,

possivelmente, houve aumento desse fenômeno, resultando em aumento mais

significativo do diâmetro das gotículas.

A distribuição de tamanho foi monomodal para todas as amostras durante

os 15 dias de armazenamento. Percebeu-se, também, que os valores de IPD foram

afetados pela temperatura de armazenamento. A 4 °C as amostras ES7 e ES8

mantiveram IPD em ≈0,300 em 15 dias. Em 25 °C e 45 °C notou-se aumento

considerável ao término do ensaio (IPD 1,0), indicando instabilidade dessas NE

após 15 dias. Para as amostras ES9 (redução de ≈61%), ES10 (redução ≈52%) e PL

(redução ≈12%) uma redução considerável foi notada a 45 °C (Fig. 59b), e em 25 °C

a redução foi ≈25 (Fig. 58b) (ES9 e ES10) e a 4 °C ≈14% (Fig. 57b) (ES9 e ES10).

Outro fator analisado foi a influência do fármaco. Na formulação PL não

havia CsA. Essa amostra apresentou baixo crescimento de diâmetro, ≈16% a 45 °C

e a 4 °C não foi observado crescimento significativo, e as amostras permaneceram

estáveis. Desta forma, a presença do fármaco reduziu a estabilidade das NE, sendo

que, ele pode ter interagido com componentes presentes na NE.

Os resultados deste experimento sugerem que o crescimento do diâmetro

médio é devido ao fenômeno de Ostwald “ripening”, sendo mais pronunciado para as

amostras com lecitina L-PC-3 e a 45 °C. As amostras ES7 e ES8 após 15 dias

revelaram-se extremamente instáveis, ocorrendo separação de fases em 25 °C e 45

°C. Assim, a lecitina L-PC-3 não estabiliza, de modo eficaz, NE produzidas via

emulsificação espontânea.

4.15.2 NE produzidas em mistura de acetona:etanol

Neste experimento foi utilizada a formulação ES2 como referência, sendo

adicionados 5% (m:m) de CsA, em relação à quantidade de óleo, para as quatro

primeira formulações. Somente a amostra PL não contém CsA. As amostras foram

149

feitas em duplicata e armazenadas a 4 °C, 25 °C e 45 °C. Os resultados estão nas

Figuras 60 a 61 e Tabela 36.


ES11, ES12, ES13, ES14 e PL, a 4 °C

a

ES11 ES12 ES13 ES14 PL

0

100

200

300

400

500

600

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

1 dia 4°C

15 dias

b


0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

IPD

1 dia 4°C

15 dias

150


ES11, ES12, ES13, ES14 e PL, a 25 °C.

a


0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

1 dia 25°C

15 dias

b


0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

IPD

1 dia 25°C

15 dias

151


ES11, ES12, ES13, ES14 e PL, a 45 °C.

a


0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

1 dia 45°C

15 dias

b


0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

IPD

1 dia 45°C

15 dias

152

Tabela 36. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta para NE produzidas na mistura

acetona:etanol, por emulsificação espontânea, após 1 dia, a 25 °C

Ensaio polisorbato

x1

lecitina

x2

média φ

nm

média

IPD

ES11 T20 L-PC-3 456,7± 39,3 0,32± 0,04

ES12 T80 L-PC-3 352,7± 5,8 0,35± 0,01

ES13 T20 L-SL80-3 363,2± 44,3 0,27± 0,07

ES14 T80 L-SL80-3 250,2± 10,2 0,24± 0,01

PL T20 L-SL80-3 177,7± 1,0 0,21± 0,02

A troca de solvente aumentou o diâmetro das gotículas, e os valores de

IPD (Tabela 36). Isso pode ser devido à acetona não solubilizar lecitinas, dificultando

a difusão do solvente e a formação das nanogotas.

Quanto ao tipo de lecitina empregada, assim como no experimento

relatado no item 4.15.1, existe, também, uma dependência maior do diâmetro inicial

com o tipo de lecitina. Analisando as amostras com diferentes lecitinas, mas com

mesmo tensoativo (T20), como a ES11 (L-PC-3) e a ES13 (L-80-3), nota-se que a

primeira tem maior diâmetro de gotas ( 456,7± 39,3 nm; dia 1, 25 °C) e a segunda

diâmetro menor (363,2± 44,3 nm; dia 1, 25 °C). Mas há uma pequena diferença entre

os tensoativos não iônicos: T80 produziu NE com os menores diâmetros ( ES12

352,7± 5,8 nm; dia 1, 25°C; ES14 250,2 ± 10,2 nm; dia 1, 25 °C), diferente dos

resultados citados no item 4.15.1.

A temperatura de armazenamento exerceu efeito significativo nas

amostras ES11 e ES12, onde a lecitina L-PC-3 estava presente. Houve crescimento

das gotículas de ≈122% para ES11 a 45 °C e de ≈111% para ES2 a 45 °C. A 25 °C

o crescimento foi de ≈86% para ES11 e ≈53% para ES12 (Figuras 61a e 62a). Após

os 15 dias essas NE apresentaram separação de fases e apenas a 4 °C (Fig. 60a)

elas se mantiveram-se estáveis. As amostras ES13 e ES14 (L-SL80-3) foram menos

sensíveis às mudanças de temperatura, tanto que o crescimento do diâmetro a 45

°C para ES13 foi de ≈17% (343,7 nm inicialmente para 402 nm) e para ES14 de

153

≈33% (263 nm inicialmente para 350,4 nm), mesmo resultado mostrado no item

4.15.1.

Como podemos notar, a presença da lecitina L-SL80-3 estabiliza um

pouco mais as NE que a L-PC-3, o resfriamento retarda o crescimento e a elevação

da temperatura aumenta o tamanho das gotículas. Como descrito no item 4.15.1 o

fenômeno de Ostwald ”ripening” é acelerado com aumento da temperatura e

retardado em temperaturas mais baixas.

A distribuição de tamanho das gotículas de cada amostra monomodal

durante 15 dias de armazenamento e os valores de IPD foram afetados pela

temperatura de armazenamento e pela mudança do solvente. A troca de solvente

resultou inicialmente num aumento de IPD, sendo observados valores entre 0,25 e

0,5 (ES11, ES12, ES13 e ES14). Assim, como nos experimentos relatados no item

4.15.1, as amostras com a lecitina L-PC-3, mostraram-se instáveis a 25 °C e 45 °C,

pois o IPD evoluiu para 0,7 (ES11) e 1,0 de IPD (ES12), após os 15 dias. Apenas a

4 °C essas formulações ficaram estáveis. Foi observada redução do IPD ao longo do

ensaio para ES13 (redução de ≈15%) e ES14 (redução ≈12%) a 45 °C (Fig. 62b) a

25 °C a redução foi de ≈38% (ES13) e ≈11% (ES14) (Fig. 61b) e 4 °C de ≈1%

(ES13) e ≈30% (ES14) (Fig. 60b).

Outro fator analisado foi à influência do fármaco. Na formulação PL não

havia CsA., essa amostra apresentou crescimento de diâmetro, ≈16% a 45 °C e a 4

°C houve crescimento de ≈4%, isso demonstra que a ausência do fármaco resulta

em amostras mais estáveis, e que sua presença na formulação reduz a estabilidade

das NE.

Os resultados deste experimento também sugerem que o crescimento do

diâmetro das NE é devido ao fenômeno de Ostwald “ripening”, sendo mais

pronunciado para as amostras com lecitina L-PC-3 e a 45 °C. As amostras ES11 e

ES12 após 15 dias ficaram muito instáveis, ocorrendo separação de fases a 25 °C e

a 45 °C. Portanto, a lecitina L-PC-3 não estabiliza, de maneira eficaz, as NE

produzidas mediante emulsificação espontânea

4.16 Influência da adição do ácido oleico

Os resultados citados no item 4.15.1 mostram que etanol produziu

gotículas com diâmetro e IPD menores, embora menos estáveis, pois a 45 °C a

154

média do crescimento do diâmetro das gotículas foi de ≈176%, já para as amostras

do item 4.15.2 foi observado um diâmetro maior, bem como um IPD. A média do

crescimento do diâmetro das gotículas foi de ≈71% a 45°C.

Para tentar solucionar o problema na estabilidade das NE foi adicionado

ácido oleico às formulações. As formulações escolhidas foram ES9, ES10, ES13 e

ES14. Para as duas primeiras o objetivo foi melhorar a estabilidade e para as duas

ultimas, além da estabilidade, conseguir reduzir o diâmetro médio das gotículas e o

IPD.

Segundo Levy e col.(1994) a presença do ácido oleico aumenta as

propriedades mecânicas do filme interfacial devido à existência de interações

intermoleculares entre o fosfolipídio, ácido oleico e P-F68, aumentando a

estabilidade em até 24 meses (LEVY e col., 1991, 1994).

Foi feita mistura entre TCM e ácido oleico (50:50%, m:m) totalizando 0,5%

(m:v) de óleo presente na NE. As formulações foram armazenadas a 4 °C, 25 °C e

45 °C e analisadas por 15 dias. Os resultados estão nas Figuras 63, 64 e 65 e

Tabela 37.

155


ES9, ES10, ES13 e ES14 com ácido oleico, a 4 °C.

a

ES9 ES10 ES13 ES14

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

1 dia 4°C

15 dias

b

ES9 ES10 ES13 ES14

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

IPD

1 dia 4°C

15 dias

156



a

ES9 ES10 ES13 ES14

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

1 dia 25°C

15 dias

b

ES9 ES10 ES13 ES14

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

IPD

I

1 dia 25°C

15 dias

157



a

ES9 ES10 ES13 ES14

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

1dia 45°C

15 dias

b

ES9 ES10 ES13 ES14

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

IPD

1 dia 45°C

15 dias

158

Tabela 37. Diâmetro médio para NE produzidas com ácido oleico

1dia 15dias

Ensaio 4°C 25°C 45°C 4°C 25°C 45°C

ES9 156± 25,3 148,9±6,8 164,9±5,5 163,7±25,0 169,2±1,2 184,4±0,7

ES10 176,6± 18,5 173,5±1,0 184,3±4,5 200,4±6,2 191,7±25,8 224,7±12,0

ES13 174,9± 13,7 179,2±8,0 219,1±18,4 202,8±1,3 208,2±6,2 224,7±10,6

ES14 193,2± 2,8 187,4±8,5 414,4±49,2 229±11,3 214,6±6,1 556,0±2,6

A adição do ácido oleico produziu NE com diâmetros menores,

comparando com as mesmas formulações onde este estava ausente (Tabela 37),

sendo que para formulação ES13 o diâmetro foi 179 nm (dia 1, 25 °C) com o ácido

oleico e 363,2 nm (dia 1, 25 °C) somente com TCM. Possivelmente isso ocorreu,

pois o ácido oleico pode agir como co-tensoativo e reduzir a tensão interfacial e, em

consequência, o tamanho das gotículas é reduzido.

A influência do tempo de armazenamento em diferentes temperaturas

também foi avaliada. Para ES9 o aumento do diâmetro foi ≈5% (4 °C), ≈14% (25 °C)

e ≈12% (45 °C), para ES10 ≈14% (4 °C), ≈10% (25 °C) e ≈21% (45 °C), para ES13

≈16% (4 °C), ≈16% (25 °C) e ≈3% (45 °C) e para ES14 ≈18% (4 °C), ≈14% (25 °C) e

≈34% (45 °C), sendo os aumentos causados pelo fenômeno de Ostwald "ripening".

Quanto ao IPD valores abaixo de 0,23 para as amostras ES9, ES10 e

ES13, mas para ES14 a 45 °C os valores foram acima de 0,3, reduzindo a 0, 26

após 15 dias. As amostras escolhidas para os próximos testes foram a ES9 e ES10,

pois a 4 °C e 25 °C elas apresentaram menor em comparação à ES13 e ES14.

4.17 Influência da incorporação de 12% de CsA

Foi investigado o impacto da adição de concentração maior de fármaco

na estabilidade e diâmetro médio das gotículas. As amostras ES9 e ES10 com CsA

12% (m:m) em relação a quantidade de óleo, foram armazenadas a 4 °C e

analisadas por 30 dias. O resultado está na Figura 66.

159

Figura 66. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias. Amostras ES9

e ES10 com 12% de CsA, a 4 °C.

a

ES9_CsA ES10_CsA

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

1 dia 4°C

15dias

30 dias

b

ES9_CsA ES10_CsA

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

0,26

0,28

0,30

IPD

1dia 4°C

15 dias

30 dias

160

Como pode ser observado a adição de CsA causou aumento de ≈30%

(em 30 dias) no diâmetro médio das gotículas para ES9 (>300 nm), reduzindo a

estabilidade das NE. Para ES10 a adição do fármaco não produziu NE com

diâmetros maiores que 200 nm, sendo observado aumento de ≈5% ao longo de 30

dias.

Quanto ao IPD (Fig. 66b) para ES9 os valores estavam em ≈0,2, com

pequeno aumento ao longo de 30 dias e para ES10 houve redução dos valores de

IPD ao longo de 30 dias.

4.18 Estudo de estabilidade das NE obtidas por emulsificação

espontânea

As amostras ES9 e ES10 foram armazenadas a 4 °C e avaliadas durante

90 dias quanto ao φ, IPD e pH. Como ES9 era instável com 12% (m:m) de CsA,

adicionou-se a essa formulação 5% (m:m). Para ES10 foram adicionados 12%

(m:m). Os resultados estão na Figura 67 e Tabela 38.

161

Figura 67. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 90 dias. Amostras ES9

(5% de CsA) e ES10 (12% de CsA), a 4 °C.

b

0 20 40 60 80 100

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

0,26

0,28

IPD

tempo (dias)

ES9 4°C

ES10

a

0 20 40 60 80 100

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

diâ

me

tro

mé

dio

(n

m)

tempo (dias)

ES9 4°C

ES10

162

Tabela 38. Variação temporal do pH de ES9 (5% CsA) e ES10 (12% CsA), a 4 °C

por 90 dias.

amostra pH 4°C

1 dia 90 dias

ES9 7,3±0,01 7,2±0,01

ES10 7,2±0,01 7,1±0,01

A formulação ES10 é mais estável que a ES9, pois ao longo de 90 dias o

diâmetro das gotículas de ES10 Figura 67a, para a qual o diâmetro médio inicial foi

173,4±4 nm e após 90 dias de 171,6±1nm. Quanto ao IPD (Fig. 67b) houve uma

redução de ≈18% (de 0,17 para 0,14), demonstrando que esta NE ficou homogênea

nos 90 dias. Apesar de ES9 inicialmente produzir NE com diâmetro de gotícula

menor (160,6±2,4 nm) ao longo do experimento ela foi menos estável que a ES10

(Fig. 67a), sendo que ao final foi encontrado um diâmetro médio de 203,5±31,7 nm,

aumentando ≈27%. A distribuição do diâmetro médio apresentou comportamento

parecido com a de ES10, mas com redução de ≈51% (de 0,20 para 0,1).

Ao término do ensaio, ambas as formulações apresentaram distribuição

bimodal do diâmetro médio (Fig. 68), indicando instabilidade das amostras. A

formulação ES10 foi escolhida para prosseguir nos estudos.

163

Figura 68. Distribuição do diâmetro médio das gotículas das amostras de ES9 e

ES10.

4.19 Determinação da quantidade de CsA presente nas NE

4.19.1 Curva de calibração para a CsA

A curva analítica construída para avaliação da linearidade do método

analítico apresentou coeficiente de correlação de 0,9999 após análise de regressão

linear de cinco pontos (Fig. 69). A equação da reta obtida da análise de regressão

linear foi: y = 93,80 + 1726,62 x e o tempo de retenção médio encontrado foi 7 min

(Fig. 70). A partir da curva de calibração é possível calcular a concentração de CsA

na NE.

164

Figura 69. Curva de calibração da CsA.

Figura 70. Cromatograma da ciclosporina A .

0 2 4 6 8 10 12

2,0x103

4,0x103

6,0x103

8,0x103

1,0x104

1,2x104

1,4x104

1,6x104

1,8x104

Are

a (

mU

A)

Y = 93,80 + 1726,62X

r2= 0,9999

massa de CsA(g)

165

4.19.2 Determinação da eficiência de encapsulação

Após determinar a curva analítica foi obtida a equação da reta que

permite quantificar o teor de CsA nas formulações (Tabela 39).

Tabela 39. Eficiência de Encapsulação (EE%) das formulações a 4 °C

EE(%)

Amostra Dia 1 90 dias

F1 91,55±1,76 89,5±11,59

F2 86,65±10,11 89,45±15,62

F6 99,15±0,21 79,95±0,63

ES9 67,25±0,35 66,67±0,45

ES10 62,00±0,42 61,10±0,84

Observa-se que as nanoemulsões produzidas com ultrassom

apresentaram eficiência de encapsulação maiores que as produzidas por

emulsificação espontânea. Os valores da eficiência de encapsulação (cerca de 80%)

pouco variam ao longo do tempo. Apenas para a amostra F6 houve redução

considerável. Isso indica que, para quase todas as amostras, a maior parte do

fármaco presente está na fase lipídica, podendo estar na superfície ou dentro da

matriz lipídica.

4.19.3 Microscopia Eletrônica de Varredura

Nos experimentos citados no item 4.19.2 as NE foram filtradas em

membranas de PVDF (diâmetro de por 0,45 µm). Essas membranas foram

analisadas por MEV a fim de verificar a presença ou ausência do fármaco (Figuras

71 a 74).

166

Figura 71. Micrografia dos cristais de ciclosporina A: a) CsA, aumento 10000X; b)

CsA; aumento 4500X.

Figura 72. Micrografia das membranas de PVDF: a) aumento 200X; b) aumento

2000X.

167

Figura 73. Micrografia da amostra F6 em membranas de PVDF: a) aumento

2000X;b) aumento 500X.

Figura 74. Micrografia da amostra ES9 em membranas de PVDF: a) aumento 2000X;

b) aumento 500X.

Foi observado para todas as amostras a presença de fármaco nas

membranas

168

V. CONCLUSÃO

Vários fatores contribuem para alteração do diâmetro das gotículas, IPD e

estabilidade das NE

Diferentes tensoativos causam diferentes alterações no tamanho, índice

de polidispersidade e potencial Zeta das gotículas. O cálculo do Balanço Hidrofílico-

Lipofílico serviu como orientação para identificar a proporção de cada

tensoativo na formulação, sendo a mistura T20/L + SL80-3 a melhor.

Outro fator importante foi a concentração total de tensoativos e sua

proporção em relação à de óleo. Inicialmente as formulações F1 e F6, com menor

concentração e proporção 1:1 (T:TCM), foram as mais estáveis, mas a adição de α-

tocoferol e do fármaco tornou-as menos estáveis.

A estabilidade das amostras F1, F2 e F6 foram fortemente afetadas pela

temperatura de armazenamento

Foi possível preparar NE através de metodologias com alta e baixa

energia de emulsificação mas apenas as formulações obtidas mediante sonificação

apresentaram alta eficiência de encapsulação .A formulação, contendo ciclosporina

A, mais adequada para aplicação parenteral foi a F1, mas serão necessários testes

in vitro e in vivo , comparando o desempenho da mesma com a formulação

disponível no mercado.

169

VI. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Os seguintes trabalhos são propostos para dar continuidade ao tema

abordado:

Realização de Microscopia de Transmissão para análise da morfologia das

gotículas;

Realização de ensaios para determinação da eficiência in vitro e in vivo das

formulações de nanoemulsões desenvolvidas;

Encapsular a CsA em sistemas de nanoestruturados.

170

VII. REFERÊNCIAS

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