UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEAR

PR-REITORIA DE PS-GRADUAO E PESQUISA

FACULDADE DE VETERINRIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS VETERINRIAS

KALINE DE MEDEIROS NASCIMENTO

COMPOSIO QUMICA E ATIVIDADE ANTIFNGICA DOS LEOS

ESSENCIAIS DE ESPCIES DE Piper FRENTE A CEPAS DE Candida

SPP.

FORTALEZA

2011

KALINE DE MEDEIROS NASCIMENTO

COMPOSIO QUMICA E ATIVIDADE ANTIFNGICA DOS LEOS

ESSENCIAIS DE ESPCIES DE Piper FRENTE A CEPAS DE Candida SPP.

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Cincias Veterinrias da

Faculdade de Veterinria da Universidade

Estadual do Cear, como requisito parcial para

a obteno do grau de Mestre em Cincias

Veterinrias.

rea de Concentrao: Reproduo e Sanidade

Animal.

Linha de Pesquisa: Reproduo e sanidade de

carnvoros, onvoros, herbvoros e aves.

Orientador: Prof. Dra. Selene Maia de Morais

FORTALEZA

2011

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao Universidade Estadual do Cear

Biblioteca Central Prof. Antnio Martins Filho

N244c Nascimento, Kaline de Medeiros

Composio qumica e atividade antifngica dos leos essenciais de espcies de Piper frente a cepas de Candida spp. / Kaline de Medeiros Nascimento. 2011.

81 f. : il. color., enc. ; 30 cm. Dissertao (Mestrado) Universidade Estadual do

Cear, Faculdade de Veterinria, Programa de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias, Curso de Mestrado Acadmico em Cincias Veterinrias, Fortaleza, 2011.

rea de Concentrao: Reproduo e Sanidade Animal. Orientao: Profa. Dra. Selene Maia de Morais. 1. Piper. 2. leos essenciais. 3. Candida spp. I. Ttulo.

CDD: 664

COMPOSIO QUMICA E ATIVIDADE ANTIFNGICA DOS LEOS

ESSENCIAIS DE ESPCIES DE Piper FRENTE A CEPAS DE Candida SPP.

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Cincias Veterinrias da

Faculdade de Veterinria da Universidade

Estadual do Cear, como requisito parcial para a

obteno do grau de Mestre em Cincias

Veterinrias.

Aprovada em: ____/ _____/ ______

Banca Examinadora

__________________________________________________

Prof. Dra. Selene Maia de Morais

Orientadora UECE

___________________________________________________

Prof. Dr. Helio Vitoriano Nobre Jnior

Co-orientador UFC

____________________________________________________

Dra. Eveline Solon Barreira Cavalcanti

Examinador-UECE

Ao meu noivo e famlia, por todo apoio e incentivo.

Dedico.

AGRADECIMENTOS

Deus toda a honra deste trabalho, porque sem Ele nada seria feito.

Universidade Estadual do Cear, atravs do Programa de Ps-Graduao em Cincias

Veterinrias, pela oportunidade de realizao desse curso.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico, pela concesso da

bolsa de estudos.

minha orientadora Selene Maia de Morais pela pacincia, ateno e por todo auxlio.

Ao Prof. Hlio Vitoriano Nobre Jnior pela contribuio na orientao dos testes biolgicos.

Aos alunos do Laboratrio de Produtos Naturais (LPN) da UECE, pelo apoio dado nos

momentos iniciais desta pesquisa.

Aos alunos do Laboratrio de Bioprospeco Experimental de Leveduras (LABEL) da UFC,

pela grande ajuda e pelos dias felizes que passamos.

Ao amigo Dr. Hemerson Iury Ferreira Magalhes pela dedicao e auxlio no

desenvolvimento desse trabalho.

minha famlia e ao meu noivo, pelo apoio e incentivo.

As minhas colegas de ps-graduao, em especial a amiga Mrley Barbosa, por toda fora e

companheirismo.

A minha querida prima, Joyce Nascimento, por me ajudar na concluso deste trabalho.

A todos, indistintamente, que contriburam para que eu pudesse concluir mais esta etapa.

"Voc quem decide o que vai ser eterno em

voc, no seu corao.

Deus nos d o dom de eternizar em ns o que

vale a pena, e esquecer definitivamente aquilo

que no vale".

Pe. Fbio de Melo

RESUMO

Ao longo das dcadas, a quantidade de informaes sobre recursos medicinais a partir do uso

de plantas das florestas tropicais aumentou significantemente. A regio amaznica do Brasil

devido sua grande diversidade biolgica de relevante importncia para descoberta de

substncias com potencial medicinal e principalmente em relao a este estudo, a atividade

antibacteriana. As drogas antifngicas sistmicas so em nmero bastante limitado e, alm

disso, apresentam efeitos colaterais que podem limitar sua utilizao, portanto importante a

procura de novas drogas antifngicas que apresentem maior segurana na sua utilizao e

menos efeitos colaterais. Dentre a bioproduo oriunda da Amaznia destaca-se a famlia

Piperaceae com distribuio principalmente pantropical que compreende 12 gneros e 1400

espcies. O gnero Piper o maior da famlia, com 700 espcies. Entre elas, h 170 espcies

que ocorrem no Brasil sendo utilizadas popularmente como renomados agente anti-sptico,

inseticida e antimicrobiano. O objetivo desse trabalho foi elucidar os componentes qumicos e

a atividade dos leos essenciais de espcies de Piper da Amaznia Brasileira contra cepas de

Candida spp. Folhas das espcies Piper marginatum, P. aleyreanum, P. dilatatum, P.

aduncum e P. alatabaccum foram coletados na floresta amaznica para a avaliao da

atividade antifngica contra nove cepas de Candida spp., incluindo trs cepas isoladas de

sangue com MICs elevados para o fluconazol. As cepas foram identificadas em

CHROMagar. Os leos essenciais foram obtidos por hidrodestilao e testados na faixa de 10

a 0,015 mg/mL pelo mtodo de microdiluio em caldo de acordo com o protocolo M27-A3.

As cepas de C. parapsilosis ATCC 22019 e ATCC 6258 foram utilizadas como controle. Os

principais componentes dos leos essenciais foram para P. marginatum foram: -copaeno e

3,4-(metilenodioxi) propiofenona, para P. aleyreanum: E-cariofileno e xido de cariofileno,

para P. dilatatum: -copaeno, xido de cariofileno, linoleato de metila e octadecanoato de

metila, por P. alatabaccum: E-cariofileno, spathulenol, metil linoleato e metil octadecanoate e

para P. aduncum: trans-isocroweacin, dill apiol e cis-isoelemicin. P. dilatatum foi o mais

ativo com MIC50 de 0,65 0,39 mg / mL. Os outros leos mostraram MIC50 variando de 1,55

0,77-2,10 0,75 mg / mL, confirmando a importncia dos leos essenciais de Piper como

alternativas naturais para o tratamento de infeces causadas por Candida spp.

ABSTRACT

Over the decades, the amount of resource information from the medicinal use of plants of

tropical forests has increased significantly. The Amazon region of Brazil, due to its great

biological diversity, is of great significance for the discovery of substances with medicinal

potential. The systemic antifungal drugs are very limited in number and, moreover, have side

effects that may limit its use, therefore it is important the search for new antifungal drugs safe

for the utilization. Among bioproduction coming from the Amazon, stands out the Piperaceae

family, with pantropical distribution, primarily comprising twelve genera and 1400 species.

The genus Piper is the largest family with 700 species. Among them there are 170 species

occurring in Brazil are popularly used as renowned antiseptic agent, insecticide and

antimicrobial. The aim of this study was to determine the chemical components and activity

of essential oils from Piper species of the Brazilian Amazon against strains of Candida spp.

Leaves of the species Piper marginatum, P. aleyreanum, P. dilatatum, P. aduncum and

P. alatabaccum were collected in the Amazon forest for evaluation of antifungal activity

against nine Candida spp. strains, including three strains isolated from blood and being

fluconazole-resistant. The strains were identified on CHROMagar. The essential oils were

obtained by hydrodistillation of plant leaves and tested in the range of 10 to 0.015 mg/mL by

broth microdilution method according to protocol M27-A3. The strains C. parapsilosis ATCC

22019 and ATCC 6258 were used as controls. The main components of the plant essential oils

were for P. marginatum: -copaene and 3,4-(methylenedioxy) propiophenone, for

P. aleyreanum: E-caryophyllene, caryophyllene oxide, for P. dilatatum: -copaene,

caryophyllene oxide, methyl linoleate, methyl octadecanoate, for P. alatabaccum: E-

caryophyllene, spathulenol, methyl linoleate, methyl octadecanoate and for P. aduncum:

trans-isocrowecin, dill apiol and cis-isoelemicin. P. dilatatum was the most active with MIC50

of 0.65 0.39 mg/mL and other showed MIC50 ranging from 1.55 0.77 to 2.10 0.75

mg/mL, demonstrating the importance of Piper essential oils as natural alternatives for the

treatment of infections caused by Candida spp.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Folhas de P. marginatum ....................................................................................... 20

Figura 2. Estrutura qumica do xido de cariofileno ............................................................ 21

Figura 3. Estrutura qumica do Isocariofileno ....................................................................... 21

Figura 4. Estrutura qumica do Espalutenol .......................................................................... 22

Figura 5. Folhas de P. dilatatum ........................................................................................... 22

Figura 6. Folhas de P. aduncum. .......................................................................................... 23

Figura 7. Colnia de colorao branca, superfcie lisa, textura glabrosa mida, caracterstica

das espcies de Candida ........................................................................................ 25

Figura 8. Micromorfologia mostrando clamidocondios de C. albicans ................................ 26

Figura 9. Placa de 96 poos e pipeta multicanal utilizadas na microdiluio em caldo...........27

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Distribuio geogrfica de espcies do Piper nos estados brasileiros e suas principais

indicaes na medicina popular ............................................................................ 17

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

L - Microlitros

- Alfa

- Beta

- Gama

- Para

CLAE - Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute

DMSO Dimetilsulfxido

EO- Essential oils

GC- gas cromatography

ISO - International Standard Organization

mg - Miligrama (s)

MIC- Minimum inhibitory concentration

mL - Mililitro (s)

MS- mass spectrometry

NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards

SUMRIO

1 INTRODUO 12

2 REVISO DE LITERATURA 14

2.1 Plantas Medicinais e o gnero Piper: breve histrico e perspectivas 14

2.2 Estudos qumicos e biolgicos das espcies de Piper estudadas nessa dissertao 20

2.2.1 P. marginatum 20

2.2.2 P. aleyreanum 21

2.2.3 P. dilatatum 21

2.2.4 P. aduncum 23

2.2.5 P. alatabaccum 24

2.3 Fungos e sua importncia na medicina veterinria 24

2.4 Mtodos de estudo da atividade antifngica in vitro 27

3 JUSTIFICATIVA 29

4 HIPTESE CIENTFICA 30

5 OBJETIVOS 31

5.1 Objetivo Geral 31

5.2 Objetivos Especficos 31

6 CAPTULO 1 32

7 CAPTULO 2 50

8 CONCLUSES GERAIS 67

9 PERSPECTIVAS 68

10 REFERNCIAS BILBIOGRFICAS 69

11 ANEXOS: Cromatografia gasosa dos leos essenciais estudados 77

12

1 INTRODUO

A procura por novos agentes antimicrobianos, a partir de plantas, intensa devido

resistncia dos microorganismos patognicos frente aos produtos sintticos (BAUTISTA-

BAOS et al., 2003). A resistncia aos antifngicos, clnica ou in vitro, pode ocorrer quando

clulas de fungos suscetveis passam a ser resistentes devido ao contato prvio com as drogas

ou inerente ao prprio microrganismo. (MORSCHHUSER, 2002)

Os produtos naturais tm sido muito utilizados como modelos para o

desenvolvimento de novos compostos antimicrobianos e os resultados apresentam grande

utilidade contra doenas fngicas (DENNING, 2002). O Brasil o pas com maior

diversidade gentica vegetal do mundo, contando com mais de 55.000 espcies catalogadas

(AZEVEDO & SILVA, 2006), frente a esta diversidade uma estratgia atual vem sendo

buscar mtodos alternativos para o controle de doenas e pestes, que visem causar menos

danos ao ambiente e a sade humana. (MOREIRA et al., 2004). Dentre os agentes

teraputicos provenientes das plantas com uso medicinal popular e cientfico, destacam-se os

leos essenciais. (COSTA et al., 2008)

Trabalhos desenvolvidos com leos essenciais, obtidos a partir de plantas

medicinais tm indicado atividade no controle de fitopatgenos, substituindo o uso de

pesticidas que em longo prazo causam impactos negativos para a sociedade e para o meio

ambiente devido poluio causada pelos resduos qumicos dos mesmos (MOREIRA et al.,

2004). Alguns exemplos so o leo essencial extrado de Caesulia axillaris com desempenho

superior a oito fungicidas sintticos e eficcia no controle da mancha foliar do arroz, causada

por Helminthosporium oryzae (AMADIOHA, 2000) e o leo de Piper aduncum com

comprovada ao inibitria contra vrios fitopatgenos destre eles Crinipellis perniciosa,

Phytophthora palmivora e Phytophthora capsici. (BASTOS & SILVA, 2002)

Muitas das espcies de Piper so usadas para fins curativos por diversas culturas,

tendo a sua constituio sido composta por amidas insaturadas, flavonides, lignanas,

aristolactamas, steres, de cadeias longas e curtas, terpenos, esterides, propenilfenois e

alcalides (PARMAR et al., 1997). O leo essencial das folhas de P. hispidum possui como

principais componentes -canfeno guaiene e -elemeno (FACUNDO et al., 1994). As folhas

de P. amalago so utilizadas no Mxico e no Brasil para aliviar dores estomacais e no

combate a diversas infeces. No estado da Paraba folhas e talos de P. marginatum e P.

13

tuberculatum so utilizados contra picada de cobra e como sedativos (GUIMARES &

GIORDANO, 2004). Na China, algumas prescries recomendam o uso das folhas de Piper

futokasura no tratamento de arritmias cardacas e da asma. Infuses das folhas de P. aduncum

e P. hispidum so utilizadas na Jamaica para o tratamento de dores estomacais. (PARMAR et

al. 1997). A espcie Piper aleyreanum, muito usada por populaes tradicionais e indgenas

da regio Amaznica, devido suas propriedades anestsica no alvio de dores (JOLY, 1998).

Piper carniconnectivum uma espcie encontrada na Amaznia, na regio norte do Brasil

sendo til como bioprodutora de leo essencial. (RIBEIRO et al, 1999)

A ao antimicrobiana dos leos essenciais, tanto in vitro como in vivo, tem

justificado a investigao sobre a medicina tradicional centrada na caracterizao de sua

atividade antimicrobiana. (AGARWAL et al., 2010)

Os antifngicos podem ser agrupados em trs classes baseados no seu ponto de

ao, inibidores da sntese do ergosterol (o principal esterol de fungos); polienos, que

interagem fisicoquimicamente com os esteris de membrana e inibidores da sntese de

protena (ARTHINGTON-SKAGGS et al., 1999). leos essenciais so relatados como

inibidores da sntese de ergosterol. (BARBOSA, 2010)

Neste trabalho foi avaliada a atividade antifngica dos leos essenciais P.

marginatum Jacq, P. aleyreanum C.DC., P. dilatatum L. C. Rich., P. aduncum L. e P.

alatabaccum Trel & Yuncker contra cepas de Candida spp, isoladas no Cear.

http://jmm.sgmjournals.org/cgi/content/full/55/10/1367#R4

14

2 REVISO DE LITERATURA

2.1 PLANTAS MEDICINAIS E O GNERO PIPER: BREVE HISTRICO E

PERSPECTIVAS

Iniciada antes da medicina moderna, a medicina tradicional definida pela

Organizao Mundial da Sade (OMS) como sendo a soma de todos os conhecimentos

tericos e prticos, explicveis ou no, utilizados para diagnstico, preveno e tratamentos

fsicos, mentais ou sociais, baseados exclusivamente na experincia e observao e

transmitidos verbalmente ou por escrito de uma gerao a outra. (PEREIRA, OLIVEIRA,

LEMOS, 2004)

As plantas medicinais tm sido utilizadas por milhares de anos como tratamento

alternativo para a cura de diversos males. A maioria da populao dos pases em

desenvolvimento ainda utiliza as plantas medicinais como principal fonte para suprir as suas

necessidades medicamentosas. Mesmo em pases industrializados, uma grande percentagem

dos produtos farmacuticos comercializados provm de produtos naturais e essa proporo

eleva-se em regies do mundo, como sia, frica e Amrica Latina, onde vive a maior parte

da populao mundial. (PIMENTA, 2008)

Em 1913 a Flora Mdica Brasiliense, ressalta a importncia de serem estudadas,

metdica e cientificamente, as plantas da Amaznia num trabalho conjunto de botnicos,

qumicos, bilogos, farmaclogos e clnicos. (MATTA, 1913)

No entanto, a atividade antimicrobiana das plantas comeou a ser estudada

somente na dcada de 1940 quando Osborn (1943), pesquisando a atividade, in vitro, de 2.300

plantas superiores, contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli, verificou que 63 gneros

continham substncias que inibiram o crescimento de um ou de ambos os microrganismos.

(SARTORI, 2005)

Bastos (1997) justificou que o leo essencial das folhas de P. aduncum foi efetivo

sobre a germinao de basidisporos e crescimento micelial de Crinipellis perniciosa.

Atualmente as espcies de Piper so classificadas como grandes produtoras de leos

essenciais. (SILVA & BASTOS 2007)

A famlia Piperaceae classificada entre as mais primitivas famlias entre as

angiospermas e compreende aproximadamente trs mil espcies distribudas em oito gneros

(DI STASI et al.,2002), dos quais se destacam os gneros Piper, Peperomia e Pothormorphe.

15

O gnero Piper possui por volta de 700 espcies distribudas em todas as regies tropicais do

mundo. (SILVA & BASTOS, 2007)

No Brasil, ocorrem cerca de 266 espcies do gnero Piper, das quais 13 espcies e

4 variedades foram descritas apenas no estado do Cear, embora praticamente todas tambm

ocorram em outros estados nacionais. Da Amaznia, vrias espcies j foram estudadas como

P. belte, P. nigrum, P. amapaense, P. duckei, P. bartlingianum e P. arboreum (GUIMARES

& GIORDANO, 2004). O quadro 1 sumariza a ocorrncia e as principais atividades

medicinais das diversas espcies do gnero Piper nos estados brasileiros. A maioria das

espcies deste gnero no tem valor econmico, embora apresentem uma grande importncia

ecolgica dentro do seu habitat natural, principalmente nas florestas midas. As folhas das

plantas do gnero Piper servem de alimento para uma srie de insetos herbvoros, enquanto

que os frutos amadurecidos nutrem uma variedade de animais frugvoros, por exemplo,

morcegos e pssaros (DYER et al., 2004). No entanto, algumas plantas do gnero Piper so

economicamente muito importantes. Um exemplo a espcie P. methysticum cujas razes so

fontes de kawa, substncia da classe das kavapironas, usada tradicionalmente na Polinsia

como uma bebida narctica, hoje, esta planta de interesse para as indstrias na formulao

de sedativos. Outras espcies complacentes como P. cubeba, P. longum e P. auritum so

usadas localmente como condimentos ou medicinais. (DYER et al., 2004).

Em trabalho realizado com treze plantas utilizadas na medicina popular para o

tratamento de doenas infecciosas P. regnellii apresentou atividade frente a Candida krusei e

C. tropicalis.(PESSINI, et al., 2003). Segundo Silva e Bastos (2007) leos essenciais de P.

callosum, P. marginatum var. anisatum, P. callosum e P. ebnckea tambm apresentaram

excelente atividade frente C. perniciosa.

Os leos essenciais constituem os elementos volteis contidos em muitos rgos

vegetais e esto relacionados com funes necessrias sobrevivncia vegetal, exercendo

papel fundamental na defesa contra microrganismos. (SIQUI et al., 2000)

Praticamente todos os leos essenciais constituem uma mistura de princpios

qumicos, muito complexa e variam amplamente em sua composio, sendo a maior parte

constituda principalmente de terpenos (MATOS et al., 1989). Devido a sua composio

variada, os leos essenciais demonstram uma variedade de aes farmacolgicas, tornando-os

potenciais fontes para o desenvolvimento de novas drogas. (AMARAL, 2004)

Nos ltimos anos a atividade antifngica de leos essenciais tem sido relatada

para diversas espcies, envolvendo principalmente as famlias Lamiaceae, Asteraceae,

Verbenaceae, Rutaceae, Lauraceae e Cupressaceae (ABAD et al., 2007). Na regio

16

Amaznica, tem-se uma das maiores biodiversidades, com um nmero satisfatrio de leos

essenciais e extratos utilizados, popularmente, no tratamento de infeces fngicas. Dentre as

diversas espcies merecem destaque Piper aduncum (pimenta-de-macaco) e Piper

hispidinervum (pimenta longa) (MENEZES, et al., 2009).

Neste trabalho foram utilizados os leos essenciais de Piper spp. para

determinao de sua atividade antifngica.

17

Quadro 1. Distribuio geogrfica de espcies de Piper nos estados brasileiros e as principais indicaes na medicina popular.

Espcies Distribuio Geogrfica Propriedades medicinais Referncias

Piper aduncum L.

Amazonas, Amap, Par,

Mato Grosso, Cear, Bahia,

Minas Gerais, Esprito Santo,

Rio de Janeiro, So Paulo e

Paran

As folhas so utilizadas sob a forma de ch

contra apatia intestinal e males estomacais.

So adstringentes e diurticos, sendo um

hemosttico poderoso usados em feridas,

lceras e leucorrias. Suas espigas curvas e

aromticas contm taninos, essncias e

resinas. A infuso das folhas usada como

estomquica, balsmica, adstrigente e

desobstruente do fgado.

SOUZA, 2008

Piper amalago (Jacq.)

Yunck.

Cear, Pernambuco, Bahia,

Minas Gerais, Rio de

Janeiro,

So Paulo, Paran, Santa

Catarina, Rio Grande do Sul

e Mato Grosso

Suas folhas so usadas sob a forma de

cataplasmas ou, atravs do cozimento, so

empregadas em banhos ou chs, devido suas

propriedades sudorferas acentuadas. So

teis ainda para os males do estmago. Os

frutos so estimulantes alm de serem

usados para o tratamento das cardialgias, no

tratamento de reumatismos.

PISSINATE, 2006

Piper arboreum Yunck.

Amazonas, Cear,

Pernambuco, Bahia, Rio de

Janeiro, So Paulo, Paran,

Santa Catarina, Rio Grande

do Sul e Mato Grosso

Sob a forma de ch e banhos aromticos a

planta usada contra reumatismos,

bronquites, resfriados e gripes fortes, sendo

ainda carminativa e emoliente. As folhas

tem leo de sabor picante, com aroma

semelhante ao do hortel-pimenta, sendo

empregadas como sudorficas e afrodisacas.

Tambm so utilizadas nas dores de

SILVA, 2002

18

garganta e dentes.

Piper bartlingianum Miq. Amazonas, Amap, Par,

Cear

No descritas GUIMARES &

GIORDANO, 2004

Piper carniconectivum L. Amazonas, Rondnia Usado na medicina popular. Bioprodutor de

leo essencial.

FACUNDO, 2006

Piper cernuum Vell.

Amazonas, Cear, Bahia,

Minas Gerais, Esprito

Santo, Rio de Janeiro, So

Paulo, Paran e Santa

Catarina

O suco das espigas, em aguardente, de uso

interno contra mordedura de cobra e o

bagao misturado com razes pode ser

aplicado sobre o ferimento produzido pelo

animal. A raiz considerada um

medicamento sialagogo e diurtico. O p

resultante das espigas secas til para

tratamento de gonorrias crnicas e

leucorrias.

GUIMARES &

GIORDANO, 2004

Piper crassinervium

Kunth

Amazonas, Cear, Minas

Gerais, Rio de Janeiro, So

Paulo, Paran e Santa

Catarina

No descritas GUIMARES &

GIORDANO, 2004

Piper dilatatum Rich.

Amazonas, Amap, Par,

Maranho, Pernambuco,

Bahia, Minas Gerais, So

Paulo, Paran, Santa Catarina

e Mato Grosso

Antiinflamatria e cicatrizante SANTOS, 2001

BASTOS, 2007

Piper divaricatum G.

Mey.

Amazonas, Amap, Par,

Cear, Pernambuco, Bahia,

Minas Gerais, Esprito

Santo, Rio de Janeiro e Mato

A raiz aromtica, de sabor forte,

semelhante ao do gengibre. As folhas e as

razes, quando em infuso, so empregadas

internamente contra dores reumticas e

PISSINATE, 2006

19

Grosso clicas, e, quando cozidas, so utilizadas sob

a forma de banhos antireumticos.

Piper hispidum Sw.

Amazonas, Par, Cear,

Pernambuco, Bahia, Rio de

Janeiro, Paran, Santa

Catarina e Mato Grosso

As folhas, as razes e os frutos so

adstrigentes, diurticos e estimulantes,

empregados como desobstruentes do fgado.

Tambm utilizada para deter hemorragias

traumticas. As folhas so utilizadas sob a

forma de banhos contra as hemorridas,

reumatismos e desinterias, quandofrescas

so usadas como emplastros em hernia de

umbigo de crianas, tendo o mesmo uso no

estado seco e reduzido a p, sendo ainda

consideradas hemostticas. Os frutos so

antiblenorrgicos.

PISSINATE, 2006

Piper marginatum Jacq.

Amazonas, Par, Cear,

Paraba e Pernambuco

Tambm usada sob a forma de ch,

considerada antiespasmdica para afeces

do fgado e do bao; segundo os ndios

quando amassadas, so utilizadas para

aliviar coceiras das picadas de insetos.

ALMEIDA, 2008

Piper rufipilum Yunck. Endmica no estado do Cear No descritas YUNCKER, 1966

Piper tuberculatum Jacq.

Amazonas, Par, Maranho,

Piau, Cear, Paraba,

Pernambuco, Rio de Janeiro

e Mato Grosso

No Cear conhecida como pimenta-de-

macaco ou pimenta-longa, considerada

planta medicinal como estimulante e

carminativa.

NAVICKIEN, 2000

20

2.2 ESTUDOS QUMICOS E BIOLGICOS DAS ESPCIES DE PIPER

ESTUDADAS NESTA DISSERTAO

2.2.1 P. marginatum Jacq

Fonte: www.discoverlife.org

Figura 1. Foto das folhas de P. marginatum

P. marginatum conhecida popularmente como caapeba cheirosa ou malvarisco.

As folhas so utilizadas na forma de infuso da raiz e da folha para o tratamento de dores em

geral, febre, gases, blenorragia, afeces do fgado e antdoto contra picada de cobra. Seus

frutos so usados como substitutos da pimenta-do-reino, utilizando-os como condimento

(ALMEIDA, 2008). J foram isolados das razes de P. marginatum l, 2-metoxi-4,5-

metilenodioxipropifenol e (E,E)-N-isobutil-2,4-octadienamida. A partir do extrato hexanico

dessa espcie foram isolados: 1-(1-Z-propenil)-2,4,6-trimetoxibenzeno e cido 3-farnesil-4-

hidroxibenzoico e do extrato clorofrmico foi isolado xido cariofileno (fig.2) (CHAVES,

2002). Em um recente estudo de populaes de P. marginatum de vrios ecossistemas da

Amaznia brasileira, (ANDRADE., et al. 2008) foi descrito sete quimiotipos com base nas

diferenas da composio do leo das folhas.

21

O

H

CH3

CH2H CH3

CH3

Figura 2. Estrutura qumica do xido de cariofileno

2.2.2 P. aleyreanum C.DC

A espcie P. aleyreanum conhecida pelas populaes indgenas como pani

nixpu sendo utilizada para a sade dos dentes; os Kaxinaw dizem que seu sumo os

fortalece e protege (MCCALLUM, 1996). Em estudo realizado sobre a composio qumica

das folhas dessa espcie por FACUNDO & MORAIS (2003) foram relatados para a mesma

como componentes majoritrios galangina, 2- metoxi-4,5-metilenodioxipropifenol e

sitosterol, sendo este o primeiro relato da ocorrncia de galangina no gnero Piper; Galangina

foi previamenteisolado de brotos de Populus nigra (EGGER et al., 1969) e de folhas de

Castanea sativa (BASILE et al., 2000). -pineno, isocaryophylleno (fig.3) e -cariofileno

tambm j foram encontrados na composio qumica do leo essencial de P. aleyreanum

(FACUNDO, 2007). No foram encontrados outros relatos na literatura para P. aleyreanum

CH3

CH2

OHCH3

Figura 3. Estrutura qumica do Isocariofileno

2.2.3 P. dilatatum Rich

Piper dilatatum um arbusto de 1-2 m de altura, conhecida popularmente como

pariparoba-murta e pau-de-junta suas folhas tm ao antiinflamatria e cicatrizante,

aliviando crises de bronquite e asma, lceras, reumatismos e hemorridas, e suas razes so

usadas no tratamento de odontalgias. Em estudo comparando a atividade fungitxica de leo

22

essencial de 10 espcies de Piper coletadas na regio Amaznica, sobre o crescimento

micelial e a germinao de basidisporos de Crinipellis perniciosa e sobre o crescimento

micelial de Phytophthora palmivora e P. capsici o leo de P. dilatatum foi o mais eficiente.

Na composio do leo essencial de P.dilatatum j foi relatada a presena de cis--ocimeno,

-cariofileno, germacreno D, espatulenol (fig.4) e xido de cariofileno (fig.2) (BASTOS

2007, SANTOS, 2001).

CH3CH3

OHCH3

H

CH2

Figura 4. Estrutura qumica do Espatulenol

Fonte: floradobrasil.jbrj.gov.br

Figura 5. Fotografia das folhas de P. dilatatum

23

2.2.4 P. aduncum

um arbusto de ampla distribuio tropical, com ocorrncia em solos areno-

argilosos, conhecido popularmente como pimenta-de-macaco e aperta-ruo. Esta espcie

considerada uma planta oportunista que invade reas desflorestadas aps explorao de

madeira, de alta rusticidade e elevada resistncia s mudanas climticas. O uso medicinal de

pimenta-de-macaco tem sido relatado: em doenas ginecolgicas e desordens intestinais

(SOUZA, 2008), como diurtico, antiblenorrgico, carminativo, excitante digestivo, para

males do fgado, no combate a erisipela e tratamento de ulceras crnicas (COIMBRA, 1994).

Extratos orgnicos das folhas de P. aduncum apresentaram atividades moluscicida, citotxica

e antibacteriana, para as quais se associou a presena de dihidrochalconas e derivados

prenilados do cido benzico (ORJALA et al., 1993 & 1994).

Fonte: botanical.com

Figura 6. Folhas de P. aduncum

O leo essencial de P. aduncum foi testado contra o fungo Clinipellis perniciosa,

conhecido como vassoura-de-bruxa, responsvel por ataque patognico ao cacau e cupuau.

Na concentrao de 50 a 100 ppm inibiu 100% o crescimento e a germinao deste fungo

(BASTOS, 1997). O leo essencial de P. aduncum apresentou atividade inseticida e larvicida

contra insetos fitfagos e mosquitos transmissores de dengue e malria, eliminando-os

24

totalmente em baixas concentraes (SOUTO, 2006). Em sua composio qumica esto

Dilapiol, piperitona, terpinen-4-ol e -terpineno. (MAIA, 2000)

2.2.5 P. alatabaccum Trel & Yuncker

P. alatabaccum Trel & Yuncker (Piperaceae), conhecida pelo nome vernculo

''Joo brandinho'', uma espcie que ocorre na regio amaznica no norte do Brasil

(RIBEIRO et al., 1999). Na composio dessa espcie esto N-(3,4,5-

trimethoxydihydrocinnamoyl-D3-pyridin-2-one, Piplartine, N-(3,4,5-trimethoxycinnamoyl-

D3- pyridin-2-one, Piperovatine (N-isobutil-6-p-methoxyphenylsorbamide) e 5,5,7-

trimethoxy-3,4-methylenedioxyflavone. Este o primeiro relato de 5,5,7-Trimethoxy-3,4-

methylenedioxyflavone no gnero Piper (FACUNDO et al., 2003). No foram encontrados

na literatura outros relatos para P. alatabaccum.

2.3 FUNGOS E SUA IMPORTNCIA NA MEDICINA VETERINRIA

Os fungos apresentam semelhana s clulas hospedeiras, sendo assim, a

elaborao de estratgias teraputicas especficas dirigidas contra o parasita e atxicas para o

hospedeiro se tornam difceis. Os mesmos so eucariticos, com ncleo bem definido

circundado por uma membrana nuclear; uma membrana celular que contm lipdeos,

glicoprotenas e esteris; parede celular; mitocndrias; aparelho de Golgi; ribossomos ligados

ao retculo endoplasmtico e um citoesqueleto constitudo por microtbulos, microfilamentos

e filamentos intermedirios. (SCHAECHTER et al., 2002). De acordo com sua morfologia os

fungos podem ser classificados em filamentosos, leveduras e dimrficos. (SIDRIM &

ROCHA, 2004)

As micoses podem ser classificadas, segundo os tecidos e rgos atingidos em:

micoses superficiais, de localizao nas camadas mais superficiais da pele ou dos plos;

micoses cutneas ou dermatomicoses, localizadas na pele, no plo ou nas unhas; micoses

subcutneas; micoses sistmicas ou profundas atingindo, principalmente, rgos internos e

vsceras, e as micoses oportunistas que atingem os pacientes imunocomprometidos por

doena de base, como cncer, diabetes, ou aqueles que so submetidos a tratamentos com uso

de corticoidoterapia, imunossupressores e antibioticoterapia. (TRABULSI et al., 2004)

25

As dermatofitoses so micoses superficiais que se localizam nas zonas planas e

intertriginosas da pele (LACAZ et al., 2002), e so produzidas por fungos especializados,

denominados dermatfitos, os quais tm a habilidade de degradar a queratina e transform-la

em material nutritivo para seu crescimento (SIDRIM & ROCHA, 2004). No Cear, as

espcies mais envolvidas em dermatofitoses so o T. rubrum seguido pelo T. tonsurans, M.

canis, T. mentagrophytes e E. floccosum. (BRILHANTE et al., 2000)

As enfermidades micticas tm importncia distinta dentro das enfermidades

veterinrias devido ao seu potencial zoontico (NAKAMURA et al., 1999).O sucesso no

tratamento pode estar relacionado ao conhecimento do patgeno, e por conseqncia, do seu

perfil ecolgico. (VIEIRA, 2009)

Fungos leveduriformes possuem importncia veterinria, como espcies dos

gneros Candida e Malassezia. O gnero Candida composto por fungos leveduriformes

hialinos, que apresentam duas formas de reproduo: assexuada ou anamorfa e sexuada ou

teleomorfa. Taxonomicamente so enquadradas dentro do grupo dos ascomicetos, visto que, a

reproduo sexuada caracterizada pela produo de ascos. (SIDRIM & ROCHA, 2004)

As espcies de Candida apresentam colnias de colorao branca, superfcie lisa

ou levemente rugosa e textura glabrosa mida (MORETTI et al., 2004), que crescem bem

dentro de 48 horas, entre temperaturas de 25 e 37C (SIDRIM & ROCHA, 2004).

Fonte: NASCIMENTO, 2011

Figura 7. Colnia de colorao branca, superfcie lisa, textura glabrosa mida, caracterstica

das espcies de Candida

Com relao microscopia, lminas preparadas diretamente a partir de um

fragmento da colnia ou de uma amostra clnica positiva, permitem a visualizao apenas de

estruturas unicelulares, denominadas blastocondeos, que podem estar isoladas ou

26

apresentando brotamento. Desta forma, torna-se necessrio a realizao de microcultivo em

placa de Petri, para melhor visualizao da disposio das estruturas fngicas tpicas de cada

espcie, sendo este, na maioria das vezes, suficiente para identificar o microrganismo.

(MORETTI et al., 2004)

Fonte: BRITO, 2005.

Figura 8. Micromorfologia mostrando clamidocondios de Candida albicans

Candida albicans causa 5060% das todas as candidemias diagnosticadas seguida

de C. parapsilosis (10-20%) e C. tropicalis (6-7%). Infeces da corrente sangunea por

Candida spp. apresentam uma mortalidade elevada e so responsveis pelo aumento dos

custos hospitalares. (ALFONSO et al., 2010)

Infeces em animais causadas por Candida spp. so freqentes (MULLER et al.,

2002) e no Brasil a presena de C. albicans foi detectada em bovinos com otite (DUARTE et

al., 2001) e em casos de dermatomicoses em ces (RAPOSO et al., 1996). Alm de C.

albicans, as espcies mais prevalentes so C. parapsilosis e C. guilliermondii, tendo sido

relatadas como responsveis por dermatomicoses em ces. (MULLER et al., 2002)

Candida spp. um habitante normal do trato gastrintestinal das aves, sendo a

espcie mais comumente isolada nesses animais. Entretanto o desequilbrio populacional

dessas leveduras leva ao aparecimento de problemas no sistema digestivo, podendo infectar

tambm o sistema reprodutivo, olhos e tornar-se sistmica. (GODOY, 2001).

A candidase em aves apresenta como sintomatologia dispnia, anorexia,

prostrao, regurgitao, vmito, diarria, perda de peso, inglvio dilatado, esofagite e

27

espessamento da parede do esfago. Casos raros e graves podem provocar deformidades no

bico. (BRAGA et al., 2007).

A histria natural das doenas causadas por leveduras mais bem compreendida

luz da susceptibilidade do hospedeiro. O indivduo normal apresenta mecanismos de defesa

inespecficos e especficos, tais como barreiras anatmicas e fisiolgicas, resposta

inflamatria e resposta imunolgica, que, juntos, representam obstculo ao estabelecimento da

infeco fngica. (VIEIRA, 2009)

2.4 MTODOS DE ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIFNGICA IN VITRO

A fim de determinar a potncia de um antibitico em soluo, sua concentrao

em lquidos e tecidos corporais e a sensibilidade de um determinado microrganismo a

concentraes conhecidas deste antibitico a atividade antifngica medida in vitro.

(JAWETZ et al., 2005)

O Clinical Latoratory Standards Institute (CLSI, anteriormente denominado

National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS) nos Estados Unidos a

entidade responsvel pela normatizao de tcnicas de laboratrio clnico que padronizou os

testes de sensibilidade de fungos para drogas antimicticas, definindo variveis como mtodo

e preparao de inculo, composio e pH do meio a ser utilizado, temperatura e tempo de

incubao e determinao dos critrios de leitura do teste. (VIEIRA, 2009)

O primeiro mtodo padronizado pelo CLSI (1992) foi a macrodiluio em caldo,

porm, por tratar-se de mtodo laborioso e de difcil execuo em laboratrios de rotina,

houve a busca de mtodos alternativos. Entre os mais estudados, citam-se a microdiluio em

caldo com bons resultados e, mais recentemente, o Etest.

Fonte: NASCIMENTO, 2011

Figura 9. Placa de 96 poos e pipeta multicanal utilizadas na microdiluio em caldo

28

A microdiluio em placa, realizada segundo parmetros do CLSI, alm da maior

facilidade na sua execuo, permite a anlise de grande nmero de amostras, com economia

de material. (SIDRIM & ROCHA, 2004)

Outros procedimentos, tais como o mtodo de difuso em cavidade gar, apesar

de no ser padronizado pelo CLSI, possibilita anlises qualitativas, permitindo-se fazer uma

comparao da eficincia da droga testada com outra droga utilizada como referncia. Estudos

posteriores so necessrios para determinao da concentrao inibitria mnima (MIC) in

vitro, para que seja possvel correlacionar com resultados in vivo.

29

3 JUSTIFICATIVA

O aumento da incidncia de infeces causadas por fungos nas clinicas veterinrias,

juntamente com a resistncia que estes agentes tm desenvolvido aos antimicrobianos, tem

levado a uma busca constante por alternativas teraputicas eficazes que possam oferecer

melhores opes de tratamento. No Norte e Nordeste do Brasil varias plantas so utilizadas

pela populao para o tratamento de diversas enfermidades, principalmente em locais mais

carentes. Para o seu uso em larga escala, no entanto, estudos que comprovem essas atividades

fazem-se necessrios. Deste modo, um estudo detalhado a cerca da atividade antifngica dos

leos essenciais de espcies do gnero Piper entre essas, P. marginatum Jacq, P. aleyreanum

C.DC., P. dilatatum L. C. Rich., P. aduncum L. e P. alatabaccum Trel & Yuncker

importante para sua validao como provveis substncias com atividade contra fungos

frequentemente isolados de animais em clinicas veterinrias.

30

4 HIPTESE CIENTFICA

Os leos essenciais de P. marginatum Jacq, P. aleyreanum C.DC., P. dilatatum L.

C. Rich., P. aduncum L. e P. alatabaccum Trel & Yuncker possuem atividade contra cepas de

Candida spp.

31

5 OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

Determinar a constituio qumica e avaliar a atividade antifngica in vitro dos

leos essenciais de Piper da Amaznia Brasileira contra cepas de Candida spp, isoladas no

Cear.

5.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Determinar a composio qumica dos leos essenciais de P. marginatum, P.

aleyreanum, P. dilatatum, P. aduncum e P. alatabaccum por cromatografia gasosa

acoplada a espectrometria de massa.

Avaliar a atividade antifngica dos leos essenciais de P. marginatum, P. aleyreanum,

P. dilatatum, P. aduncum e P. alatabaccum pelo mtodo de microdiluio em caldo

contra fungos do gnero Candida.

32

6 CAPTULO 1

Composio qumica e efeito anticandida de leos essenciais de Piper spp.

da Amaznia Brasileira

Chemical composition and anticandidal effect of essential oils of Piper spp. from

Brazilian Amazon

Peridico: Journal of Ethnopharmacology (Submetido em 18 de Novembro de 2011)

33

Resumo

O gnero Piper tem 170 espcies no Brasil, a maioria contem terpenos e compostos fenlicos

com atividade antimicrobiana. Folhas das espcies Piper marginatum, P. aleyreanum, P.

dilatatum, P. aduncum e P. alatabaccum foram coletados na floresta amaznica para a

avaliao da atividade antifngica contra nove cepas de Candida spp., incluindo trs cepas

isoladas do sangue com MICs elevados para o fluconazol. As cepas foram identificadas em

CHROMagar. Os leos essenciais foram testados na faixa de 10 a 0,015 mg/mL pelo mtodo

de microdiluio em caldo de acordo com o protocolo M27-A3. As cepas de C. parapsilosis

ATCC 22019 e ATCC 6258 foram utilizadas como controle. Os principais componentes para

P. marginatum foram: -copaeno e 3,4-(methylenedioxy) propiophenone, para P.

aleyreanum: E-cariofileno e xido de cariofileno, para P. dilatatum: -copaeno, xido de

cariofileno, metil linoleato e metil octadecanoato, por P. alatabaccum: E-cariofileno,

spathulenol, metil linoleato e metil octadecanoate e para P. aduncum: trans-isocrowecin, dill

apiol e cis-isoelemicin. P. dilatatum foi o mais ativo com MIC50 de 0,65 0,39 mg / mL. Os

outros leos mostraram MIC50 variando de 1,55 0,77-2,10 0,75 mg / mL, demonstrando a

importncia dos leos essenciais de Piper como alternativas naturais para o tratamento de

infeces causadas por Candida spp.

34

Chemical composition and anticandidal effect of essential oils of Piper spp. from

Brazilian Amazon

Kaline de M. Nascimentoa,b

, Valdir A. Facundoc, Laudir G. Ballico

c, Daniella Karini S. Lima

c,

Bruno C. Cavalcantie, Daniel P. Bezerra

f, Manoel O. de Moraes

e, Ceclia R. da Silva

d,

Hemerson Iury F. Magalhesd, Hlio V. Nobre Jnior

d, Selene M. de Morais

a,b,*

aCourse of Chemistry, Cear State University, Fortaleza, Cear, Brazil.

bVeterinary Science Post Graduation Programam, Cear State University, Fortaleza, Cear,

Brazil.

cDepartment of Chemistry, Federal University of Rondnia

dLaboratory of Bioprospection and Experiments in Yeast (LABEL) Department of Clinical

and Toxicological Analysis, College of Pharmacy, Federal University of Cear.

eDepartment of Physiology and Pharmacology, Federal University of Cear, Fortaleza, CE,

Brazil.

fDepartment of Physiology, Federal University of Sergipe, Aracaju, SE, Brazil;

*Corresponding author at: Course of Chemistry, Avenida Parajana 1700, Campus do Itaperi,

60740-000 Fortaleza, Ce, Brazil. Tel: +55 85 31019933.

E-mail address:selenemaiademorais@gmail.com(S.M. de Morais)

35

1. Introduction

The Piperaceae family out stands among the biodiversity of the Amazon forest with

mainly a pantropical distribution, comprising twelve genera and 1400 species. The genus

Piper is the largest Family with 700 species. Among them are 170 species, which occur in

Brazil. Most species are fast growing and popularly used as antiseptic, insecticidal and

antimicrobial agents (Fazolin et al., 2007, Duarte et al., 2007). In the Amazon Rainforest,

many of the native tribes use P. aduncum (matico) leaves as an antiseptic and wound healing.

In Peru, it was used for stopping hemorrhages and treating ulcers, and in European practice in

the treatment of diseases of the genitals and urinary organs and for treatment of haemostasis

and dysentery in Colombian ethnobotany (Rali et al., 2007). Piper marginatum is reputed in

the Brazilian folk medicine for its analgesic / antiinflammatory, hemostatic and skin wound-

healing properties (DAngelo et al., 1997).

Chemical studies showed that the genus Piper has many components, including

unsaturated amides, flavonoids, lignans, aristolactams, long and short chain esters, essential

oils, steroids and alkaloids (Facundo et al., 2005). The antimicrobial activity of essential

oils, both in vitro and in vivo, has justified the research on these plant components for

microbial infections (Agarwal et al., 2010)

Candidiasis is present in humans and animals and can affect mucous membranes and

mucocutaneous junctions or places where humidity is persistent. It causes papular, pustular

dermatitis or ulcerative and as well exudative external otitis. Candida albicans is yeast found

in mucocutaneous regions, genital and digestive tract of mammals and birds, being an

opportunistic pathogen producing more frequently stomatitis and vaginitis, but it could reach

the skin, fingernails, respiratory tract and lead to septicemia, depending on the degree of

immunosuppression of the individual. In dogs, candidiasis can also present as septicemia with

http://en.wikipedia.org/wiki/Amazon_Rainforesthttp://en.wikipedia.org/wiki/Urinary_system

36

lesions in the muscles, bones and skin and is caused by various species of Candida (Raposo et

al., 1996). Candida albicans causes 50-60% of all diagnosed candidemia followed by

C. parapsilosis (10-20%) and C. tropicalis (6.7%). Bloodstream infections by Candida spp.

have a high mortality and are responsible for increasing hospital costs (Alfonso et al., 2010).

The systemic antifungal drugs are very limited in number and, moreover, have side effects

that may difficult its use, then, the discovery of new antifungal drugs should be pursued

continuously (Dolan et al., 2009).

Essential oil from plants are targets for achieving this goal, therefore this study was

designed to evaluate the antifungal activity of essential oils from Piper species of the

Brazilian Amazon forest against strains of Candida spp to justify its popular use in microbial

infection diseases.

2. Materials and methods

2.1. Plant materials and isolation of essential oil

The leaves of the species P. marginatum Jacq, P. aleyreanum C.DC., P. dilatatum L. C.

Rich., P. aduncum L. and P. alatabaccum Trel & Yuncker were collected between nine and

eleven hours of january 2010, from a native population in an area of abandoned pasture,

starting the regeneration of the forest, located 15 km from the capital Porto Velho, Rondonia.

The botanical identifications were made by botanist Dr. Jos Gomes from the herbarium of

the National Institute for Amazon Research, where a voucher specimen is stored under the

numbers 223344 for P. marginatum, 223303 for P. aleyreanum, 211724 for P. dilatatum,

221713 for P. aduncum and 211711 for P. alatabaccum. Essential oils (EO) were extracted

from fresh leaves by hydrodistillation for four hours in a Clevenger type apparatus. The oil

37

was dried over anhydrous sodium sulfate and, after filtration, stored at 4C until analysis.

2.2. Identification of essential oil components

The EO was analyzed by gas chromatography / mass spectrometry (GC/MS) to identify

their components. GC/MS was performed using a Hewlett-Packard 5971 instrument

employing C; the following conditions: column (30 m x 0,25 mm); carrier gas: He (1

mL/min); injector temperature: 250C; detector temperature: 200C; column temperature: 35-

180C at 4C/min then 180-250C at 10C/min; mass spectra: electron impact 70 eV.

Identification of the chemical components was based on the comparison of their mass spectral

with the National Institute for Standard Technology NIST62 library, comparison of

calculated retention indexes with literature values as described by Adams (2007).

2.3 Determination of anticandidal activity

Nine strains of Candida spp. were selected for testing (1 C. albicans, 3 C. tropicalis

and 5 C. parapsilosis), 3 of which were resistant to fluconazole. These strains are the most

commonly isolated from fungal infections in Cear State, Northeastern Brazil. The strains

were isolated from blood samples between 2009 and 2010 and belong to the Collection of

Yeasts of LABEL / FF / UFC (Laboratory of Bioprospection and Experiments in Yeast,

Faculty of Pharmacy, Federal University of Cear). Strains were inoculated on potato

agar (HiMed Mumbai-India) and incubated at 37 C/24 h. They were then plated on

CHROMagar Candida (HiMed Mumbai-India) to assess purity. The identification was made

by micromorphology on rice agar Tween 80, germ tube production, fermentation and

assimilation of carbohydrates as well as molecular tests. (Medrano et al., 2006; Menezes et

al., 2009)

38

Susceptibility tests of Candida spp. essential oils were performed according to protocol

M27-A3 by the method of microdilution in RPMI medium (pH 7.0) buffered with MOPS in

96-well plates. Each essential oil was weighed (160 mg) and dissolved in 4.0 mL of DMSO.

The solution was diluted in RPMI and the concentration of DMSO was not > 1%. The range

tested was from 10 to 0.018 mg/mL. The strains were exposed to EO and incubated at

37C/24 h. The MIC of EO was the lowest concentration that caused a reduction of 50% and

90% in of Candida spp. compared with the control. The strains C. parapsilosis ATCC 22019

and C. krusei ATCC 6258 were used as controls (CLSI, 2008a; CLSI, 2008b; Kiraz et al.,

2010). We used recently revised CLSI CBP values to identify strains of Candida resistant to

the fluconazole MIC results at > 4g/mL were defined as resistant for C. albicans, C.

parapsilosis, and C. tropicalis (Pfaller et al., 2010a,b; Pfaller et al., 2011).

2.4. Statistical analysis

The antifungal activity evaluated by broth microdilution method was expressed as mean

SD of MIC50 and MIC90, using a GraphPrism Program. The differences among the oils were

evaluated by Tukeys test with the significance level set at 5%. Retention indexes expressed

were calculated by linear regression using Kovats indexes of a hydrocarbon homologous

series, using the software Origin.

Results

Among the studied Piper species, a great diversity was found among the chemical

components. The structures of main compounds found in the oils are shown in Figure 1. For

the species P. aleyreanum, the major components were caryophyllene oxide (25.48%), E-

caryophyllene (15.11%) and limonene (6.28%). The species P. marginatum showed high

39

concentrations of 3,4-(methylenedioxy)propiophenone (27.08%), -copaene (23.98%) and E-

anethole (7.90%). For the species P. aduncum the major componentes were trans-isocrowecin

(32.02%), apiole (29.51%) and cis-isoelemicin (8.04%). The major componentes of P.

alatabaccum were methyl stearate (20.90%), methyl linoleate (17.90%), spathulenol (13.64%)

and E-caryophyllene (11.96%). For the species P. dilatatum the substances caryophyllene

oxide (22.62%), methyl stearate (19.79%) and methyl linoleate (18.31%) were the

components that prevailed as shown in Table 1.

Essential oils of Piper species from Amazon region showed the following MIC50

means: 0.37 0.1 mg/mL for P. dilatatum, which was the most active when evaluated by

Tukeys test, and 1.05 0.37 mg/mL for P. marginatum, 0.81 0.33 mg/mL for Piper

aleyreanum, 0.96 0.7 for P. aduncum and 0.90 0.45 for P. alatabacum. Besides P.

dilatatum, other essential oils did not show statistical differences in their antifungal activity

(Table 2).

3. Discussion

Candida spp. yeasts are usually isolated from biological samples and the amount of

available drugs is extremely limited. Pharmacological alternatives are needed to combat this

common infection. In addition to this, there are strains resistant to traditional antifungal

agents. Candida albicans is the major human and animal fungal pathogen and the effect of

antifungals essential oils from plants on this yeast is well known, many can be used in

conventional therapy, because the number of available antifungal agents is quite limited.

(Agarwal et al., 2010)

The epidemiology of systemic fungal infections (SFI) is changing, Candida albicans

yeast is still the most important, however, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis and C.

krusei have been increasingly isolated and in some studies go beyond the isolation of C.

40

albicans. (Menezes, 2009; Diekma et al., 2009; Horn et al., 2009; Gomes et al., 2010;

Rodrguez et al., 2010; Sellami et al., 2011). In Cear the Candida spp. most commonly

isolated are C. albicans, C. tropicalis and C. parapsilosis (Menezes et al., 2009; Gomes et al.,

2010; Vasconcelos et al., 2011) were then chosen to perform the tests with essential oils

of Piper spp.

The main prescription antifungals for the treatment of IFS are fluconazole and

amphotericin (Horn et al., 2009). Candida spp. resistant to fluconazole have been detected in

various parts of the world (Pfaller et al., 2008; Pfaller et al., 2010b). Fluconazole is an

inexpensive drug with few side effects used in the treatment of infections caused by Candida

spp. The antifungal resistance has been found in several studies around the world, especially

resistance to fluconazole. In this study it was used strains of Candida spp. with elevated MICs

to fluconazole.

All oils showed activity against Candida spp. Essential oils are known to contain a

cocktail of natural monoterpenes, sesquiterpenes and hydrocarbons, with a variety of

functional groups that lead to an antifungal activity as described by Moreira (2004). The Piper

species are currently classified as major producers of essential oils (Silva et al, 2007).

The studied Piper species showed a great diversity of chemical components. Among

tested oils, the statistical comparison of anticandidal activities showed P. dilatatum as the

more active (Figure 2) with MIC50 in the range of 0.15-0.60 mg/mL as displayed in Table 2.

For P. dilatatum the main constituents are -copaene, cayophyllene oxide, methyl linoleate

and methyl stearate. Caryophyllene oxide, an oxygenated sesquiterpenoid, well known as

preservative in food, drugs and cosmetics, has been tested in vitro as an antifungal against

dermatophytes. Its antifungal activity has been compared to ciclopiroxolamine and

sulconazole, commonly used in onychomycosis treatment (Yang et al., 1999). Ten alkyl fatty

acid esters (AFAEs) were tested for in vivo antifungal activity against five plant diseases such

41

as rice blast, rice sheath blight, tomato gray mold, tomato late blight and barley powdery

mildew. Some AFAEs showed the most control efficacy against barley powdery mildew

among the tested plant diseases. Methyl and ethyl palmitates, methyl and ethyl oleates, methyl

linoleate, and methyl linolenate demonstrated both curative and protective activities against

barley powdery mildew (Choi et al., 2010). The essential oil of Piper diospyrifolium showed

as main constituent -copaene (47.73%), nevertheless the oil did not display antifungal

activity (Morandim et al., 2010). Taking into account the above information, caryophyllene

oxide and alkyl fatty acid esters probably respond for the antifungal activity of P. dilatatum.

The major constituents of P. aduncum oil were trans-isocrowecin, dill apiole and cis-

isoelemicin. In the study of other Piper species made by Morandim et al. (2010), P.

solmsianum showed the best activity and the major compound was E-isoelemicin (53.45%).

Rali et al. (2007) demonstrated the insecticidal activity of dill apoile against malaria mosquito

vector. Therefore, main compounds of P. aduncum essential oil, dill apiole and E-isoelemicin,

could be responsible for its antifungal activity.

The oil of P. marginatum showed MIC50 varying between 0.30-1.25 mg/mL. The

essential oil of P. marginatum showed as main constituents alpha-copaene and 3,4-

(methylenedioxy) propiophenone and (E)-anethole. The antifungal activity could be related to

(E)-anethole and minor compounds -pinene, -pinene E-ocimene and E-caryophyllene

(Huang et al., 2010; Moreira et al, 2007).

In conclusion, the Piperaceae family presents several species from Amazon forest used

in popular medicine in diseases caused by fungi, which use can be justified by the presence of

essential oils with antifungal activity and therefore could be pointed out as therapeutic

alternatives for the treatment of fungal infections caused by Candida spp.

42

Acknowledgements

This work was supported by the National Scientific and Technological Research

Council (CNPq), the Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nivel Superior

(CAPES) and Fundao Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientfico (FUNCAP).

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47

Table I: Chemical composition of essential oils of Brazilian Amazon Piper spp. species

Concentration (% peak area)

Component RI* Pa Pm Pad Pal Pd

-pinene 939 4.94 2.46 1.57 - -

Camphene 954 - 1.02 - - -

Sabinene 975 0.62 - - - -

-pinene 979 4.99 2.27 1.55 - -

Limonene 1029 6.28 - - -

-ocimene 1050 - 4.27 - - -

Z-ocimenone 1229 - - 1.88 - -

E-ocimenone 1238 - - 3.86 - -

E-anethole 1285 - 7.9 - - -

Safrole 1287 - - 3.29 - -

-cubebene 1351 - - - - 5.69

-copaene 1377 5.28 23.98 - - 18.16

-Bourbonene 1388 1.12 - - - -

-Elemene 1391 5.37 0.95 - 5.57 -

3,4-(methylenodioxi)-propiophenone 1404 - 27.08 - - -

E-Caryophyllene 1419 15.11 2.28 2.15 11.96 -

Aromadendrene 1441 2.20 - - - -

-Humulene 1455 2.11 - 0.58 - -

Germancrene D 1485 - - 1.04 - -

-selinene 1490 - 4.06 - 6.82 -

Valencene 1496 - - - 5.70 -

-selinene 1498 - 0.59 - - -

Bicyclogermacrene 1500 - - - 5.82 -

-Cadinene 1514 0.79 - - - -

Myristicin 1519 - - 6.08 - -

-Cadinene 1523 1.02 - - - -

Elemol 1550 - 2.51 - - -

Trans-isocrowecin 1553 - - 32.02 - -

Cis-isoelemicin 1570 - - 8.04 - -

Spathulenol 1578 4.8 - 0.92 13.64 7.48

Caryophyllene oxide 1583 25.48 - 0.64 5.98 22.62

Dill apiole 1620 - - 29.51 - -

Methyl palmitate 1921 - - - 5.54 -

Methyl hexadecanoate 1922 - - - - 7.95

Methyl linoleate 2096 - - 4.50 17.90 18.31

Methyl octadecanoate 2125 - - - 20.90 19.79

*RI: Kovats indices, calculated by linear regression. Pa - Piper aleyreanum, Pm - Piper

marginatum, Pd - Piper dilatatum, Pad - Piper aduncum, Pal - Piper alatabacum.

48

Table II: Anticandidal effect of essential oils from Piper spp after 48 hours.

Candida FLU

(g/ml)

Pm

(mg/mL)

Pa

(mg/mL)

Pd

(mg/mL)

Pad

(mg/mL)

Pal

(mg/mL)

MIC50 MIC90 MIC50 MIC90 MIC50 MIC90 MIC50 MIC90 MIC50 MIC90 MIC50 MIC90

C. tropicalis 1.00 2.00 - - - - - - - - - -

C. tropicalis 0.50 1.00 1.25 2.50 - - 0.60 0.30 2.50 5.00 - -

C. tropicalis 2.00 4.00 1.25 2.50 - - 0.30 0.60 0.60 1.25 0.60 1.25

C. albicans 1.00 2.00 1.25 2.50 0.60 1.25 0.30 0.60 0.60 1.25 0.60 1.25

C. parapsilosis 4.00 8.00 0.60 1.20 1.25 2.50 0.15 0.30 1.25 2.50 1.25 1.25

C. parapsilosis 4.00 8.00 1.25 2.50 1.25 2.50 0.60 1.25 1.25 2.50

1.25 2.50

C. parapsilosis 2.00 4.00 0.30 0.60 0.60 1.25 0.15 0.30 0.30 0.60

0.15 0.30

C. parapsilosis 1.00 2.00 1.25 2.50 0.60 0.60 0.60 1.25 0.60 1.25 1.25 2.50

C. parapsilosis 8.00 16.0 1.25 2.50 0.60 1.20 0.30 0.60 0.60 1.25 1.25 2.50

GM 1.91 3.70 0.95 1.91 0.77 2.03 0.33 0.56 0.79 1.61 0.75 1.37

Mean SD (MIC50) 1.05 0.37a 0.81 0.33a 0.37 0.19b 0.96 0.7a 0.90 0.45a

Mean SD (MIC90) 2.10 0.75a 1.55 0.77a 0.65 0.39b 1.95 1.39a 1.65 1.86a

FLU - Fluconazol, Pa - Piper aleyreanum, Pm - Piper marginatum, Pd - Piper dilatatum, Pad - Piper aduncum, Pal - Piper alatabacum.

(-) Not growth. GM geometric media. Same small letters mean no significant diferences between columns at p < 0.05.

49

O

H

CH3

H

CH2 CH3

CH3 CH3

CH3

HH

H

CH3

CH3

O

O

CH2

O

CH3

Caryophyllene oxide - copaene Z-iso croweacin

O

O

O

CH3

O

CH3

CH2

CH3CH3

OHCH3

H

CH2

CH3

O

O CH3

Apiole Spathulenol Methyl linoleate

Figure 1: Chemical structures of main compounds of the essential oils of Piper species

50

7 CAPTULO 2

Antifungal activity of Piper essential oils from Amazon against Candida tropicalis strains

isolated

from poultry in Brazil

Atividade antifngica de leos essenciais de Piper da Amaznia contra cepas de Candida

tropicalis isoladas de aves brasileiras

Peridico: Veterinary Microbiology (Submetido em 18 de Novembro de 2011)

51

Resumo

Neste trabalho foi avaliada a composio qumica e a atividade antifngica dos leos

essenciais de Piper marginatum, P. aleyreanum, P. dilatatum, P. aduncum e P. alatabaccum

oriundos da Amaznia contra cepas de Candida tropicalis isoladas de aves domsticas

brasileiras. O projeto foi submetido e aprovado pelo Comit de tica para o Uso de Animais

da Universidade Estadual do Cear. A anlise qumica dos leos foi feita por cromatografia

gasosa acoplada espectrometria de massa (CG/EM). Foram utilizadas 16 aves entre elas 04

marrecos, 01 galo e 11 galinhas. Foi relizada coleta de secreo da microbiota oral das aves

com utilizao de swab descartvel. Os leos essenciais foram testados na faixa de 10 a 0,015

mg/ml pelo mtodo de microdiluio em caldo de acordo com o protocolo M27-A3. O MIC

do OE foi a menor concentrao que causou uma reduo de 50% e 90% de C. tropicalis

comparado com o controle. Para a espcie P. aleyreanum, os componentes principais foram

xido de cariofileno (25,48%), E-cariofileno (15,11%) e limoneno (6,28%). A espcie P.

marginatum mostrou altas concentraes de metil eugenol (27,08%), -copaeno (23,98%) e

E-anetol (7,90%). Para a espcie P. aduncum os componentes principais foram trans-

isocrowecin (32,02%), apiole (29,51%) e cis-isoelemicin (8,04%). Os componentes principais

para P. alatabaccum foram metil octadecanoate (20,90%), metil linoleato (17,90%),

spathulenol (13,64%) e E-cariofileno (11,96%). Para a espcie P. dilatatum prevaleceram as

substncias xido de cariofileno (22,62%), metil-octadecanoate (19,79%) e metil linoleato

(18,31%). De acordo com o clculo das mdias geomtricas para atividade com MIC50 os

leos essenciais de espcies de Piper da Amaznia mostraram os seguintes resultados: P.

dilatatum que foi o mais ativo a MG foi 278, para as espcies P. aleyreanum, P. marginatum,

P. aduncum e P. alatabaccum as GMs foram respectivamente 703, 1340, 786 e 650. Todos

os leos mostraram atividade contra Candida tropicalis.

52

Antifungal activity of Piper essential oils from Amazon against Candida tropicalis strains

isolated from poultry in Brazil.

Kaline de Medeiros Nascimento1,2

, Valdir Alves Facundo3, Laudir Gorje Ballico

3, Daniella

Karini Souza Lima3, Danielle Silveira Macedo

5, Manoel Odorico de Moraes

5 Bruno Colho

Cavalcanti5, Ceclia Rocha da Silva

4, Hemerson Iury Ferreira Magalhes

4, Hlio Vitoriano

Nobre Jnior4, Selene Maia de Morais

1,2*

1 Course of Chemistry, Cear State University, AV. Paranjana Itaperi Campus, 1700, CEP

60740-000, Fortaleza, Cear, Brazil.

2 Veterinary Science Post Graduation Program, Ceara State University ; Paranjana Avenue, 1700

of the Campus, Itaperi, 000-60740 Fortaleza , Cear, Brazil

3Department of Chemistry, Federal University of Rondnia

4Department of Clinical and Toxicological Analysis, School of Pharmacy, Laboratory of

Bioprospection and Experiments in Yeast (LABEL), Federal University of Cear, EC, Brazil.

5Department of Physiology and Pharmacology, Federal University of Cear, Fortaleza, CE,

Brazil

*Corresponding author at: Course of Chemistry, Avenida Parajana 1700, Campus do Itaperi,

60740-000 Fortaleza, Ce, Brazil. Tel: +55 85 31019933.

E-mail address:selenemaiademorais@gmail.com(S.M. de Morais)

53

Abstract

The increasing incidence of infections caused by fungi in domestic birds, along with the

resistance that these antimicrobial agents have developed, has led to constant search for

effective alternative treatment that may offer better treatment option. The essential oil of five

Piper species grown in the Amazon forest were extracted and tested against Candida

tropicalis the main fungus present in poultry oral microbiota. The essential oils of Piper

species showed a great diversity of chemical components such as sesquiterpenes, aromatic

compounds and fatty acid methyl esters. Among tested oils Piper dilatatum showed the best

MIC50 with activity in the range of 18-600 g/ml. The main constituents of P. dilatatum are -

copaene, cayophyllene oxide, methyl linoleate and methyl octadecanoate. Piperaceae Family

contains several species rich in essential oils with antifungal potential, which could be

therapeutic alternatives for the treatment of fungal infections that attack domestic birds caused

by C. tropicalis.

Keywords: Piper, essential oil, candidiasis, birds

54

Introduction

Candida tropicalis is one of the predominant species between the not-albicans related to

candidemia (Alfonso et al., 2010) and it is usually found in the gastrointestinal tract of birds,

being one of the species most commonly isolated in these animals, however the population

imbalance of these yeasts causes problems in the digestive tract, and may also infect the

reproductive tract and eye, as well as become systemic (Shrubsole-Cockwill, 2010). Rare and

serious cases can cause deformities in beak causing the bird to not use it appropriately

difficulting or even preventing normal feeding (Osrio, 2007; Godoy, 2001).

The increasing incidence of infections caused by fungi in domestic birds, along with the

resistance that these antimicrobial agents have developed, has led to constant search for

effective treatment alternatives that may offer better treatment options (Bautista-Baos et al.,

2003).

The Amazon region of Brazil presents a great plant genetic potential, therefore, a

relevant value for the discovery of substances with medicinal activity (Azevedo et al., 2006;

Lucena et al., 2007; Teklehaymanot et al., 2007).

Piperaceae Family which comprises 12 genres and 1400 species with mainly a

pantropical distribution stands out among the bioproduction which come from Amazon. The

genre Piper is the largest of the family, with 700 species. Between them, there are 170 species

that occur in Brazil. The Piperaceae is represented by herbs, lianas, shrubs, and rarely by trees

(Andrade et al., 2008).

Piper amalago leaves are used in Mexico and in Brazil to relieve stomach pains and

fight various infections. In the State of Paraba, leaves and stalks of Piper marginatum and

Piper tuberculatum are used against snake bite and as a sedative (Guimares et al., 2004).

Chemical studies showed that the Piper genus has many components, including flavonoids,

unsaturated amides, lignans, aristolactams, long and short chain esters, terpenes, steroids and

55

alkaloids (Facundo et al., 2005). Terpenes and phenolic compounds in general are responsible

for the antimicrobial activity demonstrated in vegetable oils. The antimicrobial activity of

essential oils in vitro, both and in vivo, has justified the research on traditional medicine

focused on the characterization of its antimicrobial activity (Agarwal et al., 2010).

This work evaluated the antifungal activity of essential oils of P. marginatum Jacq, P.

aleyreanum C. DC., P. dilatatum L. C. Rich., P. aduncum L. and P. alatabaccum Trel &

Yuncker against Candida tropicalis strains obtained from domestic birds.

Materials and methods

Plant materials and isolation of essential oil

The leaves of the species P. marginatum, P. aleyreanum, P. dilatatum, P. aduncum and,

P. alatabaccum were collected from the native population in an area of abandoned pasture,

where started the regeneration of the forest, located 15 km from the capital, Porto Velho,

Rondonia. The botanical identifications were made in the herbarium of the National Institute

for Amazon Research, where the voucher specimen is stored under the numbers 223344 for P.

marginatum, 223303 for P. aleyreanum, 211724 for P. dilatatum, 221713 for P. aduncum and

211711 for P. alatabaccum. Essential oils (EO) from fresh leaves were extracted by

hydrodistillation for four hours in a Clevenger type apparatus (Craveiro et al., 1976). The oil

was dried over anhydrous sodium sulfate and, after filtration, stored at 4 C until and analyzed.

Identification of oil components

The oils were analyzed by gas cromatography-mass spectrometry (GC/MS) to identify

their components. GC/MS was performed using a Hewlett-Packard 5971 instrument

employing C; the following conditions: column (30 m x 0.25 mm); carrier gas: He (1 ml/min);

injector temperature: 250 C; detector temperature: 200c; column temperature: 35-180 C at

56

4 C/min then 180-250 C at 10 C/min; mass spectra: electron impact 70 eV. Identification

of the chemical components was based on the comparison of their mass spectral with the

National Institute for Standard Technology NIST62 library and comparison of calculated

retention indexes with literature values (Adams, 2007).

Fungal strains

16 birds were used including teal (4), cock (1) and hen (11). The project was submitted

to the Ethics Committee for the use of domestic animals of the University of Cear State

under number 11044867-7/29 and approved in August 25, 2011. Collection of

microorganisms of oral microbiota secretion collection of birds was carried out with use of

disposable swab. The material collected was sown in potato agar (Himedia Mumbai-India) in

test tubes previously prepared. Then they were sown on CHROMagar Candida (Himedia

Mumbai-India) to assess purity. The identification was done via commercial system

Auxacolor and confirmed by rice agar micromorphology (Medrano et al.; 2006; Menezes et

al.; 2009).

Anticandidal activity

C. tropicalis strains, isolated from poultry oral microbiota, were selected for testing.

The strains were inoculated in potato dextrose agar (Himedia Mumbai-India) and incubated at

37oC /24 h and sensitivity testing of strains of C. tropicalis essential oils was carried out in

accordance with the M27-A3 Protocol, by the method of microdiluition in RPMI broth (pH

7.0), buffered with MOPS in 96-well plates. Each EO (160 mg) was weighed and dissolved in

DMSO (1.0 ml). The solution was diluted in RPMI medium and DMSO concentration was

not higher than 1%. The range tested varied from 10.000 to 18 g/ml. The strains were

exposed to EO and incubated at 35C /24 h. The MIC of the EO was the lowest concentration

57

that caused a 50% reduction of Candida growth spp. when compared with the control. The

strains C. parapsilosis ATCC 22019 and C. krusei ATCC 6258 were used as controls (CLSI,

2008a; CLSI, 2008b; Kiraz et al.; 2010).

Results

The studied Piper species showed a great diversity among chemical components. The

essential oil composition of these species was displayed in Table 1. For the species P.

aleyreanum, the major components were caryophyllene oxide (25.48%), caryophyllene

(15.11%) and-limonene (6.28%). The species P. marginatum showed high concentrations of

methyl eugenol (27.08%) -copaene (23.98%) and E-anethole (7.90%). For the species P.

aduncum the major components were trans-isocrowecin (32.02%), apiole (29.51%) and cis-

isoelemicin (8.04%). The major components of P. alatabaccum were methyl octadecanoate

(20.90%), methyl linoleate (17.90%), spathulenol (13.64%) and-caryophyllene (11.96%). For

the species P. dilatatum the substances caryophyllene oxide (22.62%), methyl octadecanoate

(19.79%)-and methyl linoleate (18.31%) were the components that prevailed.

Piper essential oils of species from the Amazon region showed the following MIC50

means: 278 g/ml for P. dilatatum, the most active when evaluated by Tukey's test, and 1340

g/ml for P. marginatum, 703 g/ml for P. aleyreanum, 786 g/ml for P. aduncum and 650

g/ml for P. alatabacum. Besides P. dilatatum, other essential oils did not show statistical

differences in their antifungal activity.

Discussion

In animals as in humans, mycosis is an opportunistic infection frequently becoming a

clinical problem despite improvements in veterinary medical technology and prevention.

Deep mycoses such as candidiasis, have been reported in farm animals such as cows, horses

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and pigs and pets such as birds, dogs and cats. The diagnosis of these diseases is often based

on clinical signs, and on abnormal histological and mycological findings. Due to contact with

people, animals may represent a source of fungal infections in human being therefore

alternatives for the control of these infections are relevant to this public health problem

(Ishibashi et al., 2010).

Candida spp. yeasts are usually isolated from biological samples and the amount of

available drugs is extremely limited. Pharmacological alternatives are needed to combat this

common infection. In addition to this, there are strains resistant to traditional antifungal

agents. The effect of antifungal essential oils from plants on this yeast is well known, and

many have been used in conventional therapy (Agarwal et al., 2010).

Candida spp. is part of the normal intestinal microbiota of healthy birds and is typically

found in the upper gastrointestinal tract, primarily the oropharynx, crop, and esophagus

(Samour et al., 2002; Velasco, 2000). C. tropicalis is an opportunistic diploid fungus, with a

worldwide distribution, and is one the primary cause of candidiasis, which is often associated

with immunosuppression. It is often isolated from poultry droppings; however the lack of

specific care with cleaning breeding enables fungal species get contact with the oral cavity of

birds (Shrubsole-Cockwill, 2010; Hublek, 2004). In this study we evaluated the antifungal

activity of Piper spp. against strains of C. tropicalis from domestic birds.

All oils showed activity against C. tropicalis. Essential oils are known to contain a

cocktail of natural monoterpenes, sesquiterpenes and hydro