I

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

O PAPEL DO POLIMORFISMO METABÓLICO DE GSTM1 E GSTT1

NA SUSCEPTIBILIDADE A NEFROPATIA DIABÉTICA

RAYANE MENDES DE LIMA

GOIÂNIA-GO

2016

II

RAYANE MENDES DE LIMA

O PAPEL DO POLIMORFISMO METABÓLICO DE GSTM1 E GSTT1

NA SUSCEPTIBILIDADE A NEFROPATIA DIABÉTICA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade Federal de

Goiás, como requisito parcial para obtenção do

título de Mestre em Ciências Biológicas.

Área de Concentração: Biologia Celular e Molecular Orientador: Prof. Dra. Angela Adamski da Silva

Reis

Co-orientadora: Prof. Dra. Aline Helena da Silva

Cruz

GOIÂNIA-GO

2016

III

RAYANE MENDES DE LIMA

O PAPEL DO POLIMORFISMO METABÓLICO DE GSTM1 E GSTT1

NA SUSCEPTIBILIDADE A NEFROPATIA DIABÉTICA

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________

Prof. Dra. Angela Adamski da Silva Reis

Universidade Federal de Goiás

_____________________________________________

Prof. Dr. Gustavo Rodrigues Pedrino

Universidade Federal de Goiás

Prof. Dra. Aline Helena da Silva Cruz

Faculdade Alfredo Nasser

Prof. Dr. Rodrigo da Silva Santos

Faculdade Alfredo Nasser

Aprovada em: 02/03/2016

IV

Dedico esse trabalho a Deus e a todos aqueles que me apoiaram durante essa longa e árdua jornada.

V

Agradecimentos

Gostaria de começar agradecendo a Deus, por me permitir chegar aonde

cheguei e por durante essa jornada ter colocado pessoas tão especiais em meu

caminho.

Meus pais também tiveram um papel de suma importância nesse caminho,

sempre me apoiaram mesmo naqueles momentos difíceis.

A minha orientadora, a professora Drª. Angela Adamski da Silva Reis, por

toda paciência, apoio, toda dedicação e por ter me mostrado o lado bom da

pesquisa e da docência, mesmo em meio a tantos obstáculos e dificuldades que

encontramos ao longo do caminho, ela nunca desistiu. Foi um honra ser sua

primeira aluna oficial de mestrado.

A minha co-orientadora Dra. Aline Helena da Silva Cruz e ao Dr. Rodrigo da

Silva Santos por compartilharem tantas historias e alegrias durante os experimentos

e por sua contribuição à minha formação como pesquisadora.

Aos meus colegas e amigos de laboratório, em especial a colombiana Ayda e

ao Thales, muito obrigada por tudo. Também aqueles que tiveram uma rápida

passagem, mas que de alguma forma contribuíram durante esse período, seja com

uma ideia ou apenas uma conversa no final de um experimento. Obrigada por me

apoiarem.

Aos funcionários e pacientes da Nefroclínica que me acolheram e permitiram

que eu participasse dessa família, da rotina e conhecer um pouquinho das suas

histórias.

Não poderia deixar de agradecer também as agências de fomento, CAPES e

FAPEG, permitindo que essa pesquisa fosse feita, financiando os materias do

laboratório e também permitiram que eu pudesse me dedicar integralmente a esse

projeto.

Aos meus amigos e namorado por aguentar minhas crises de ansiedade, que

eu sei que não foram poucas.

Aqui não caberiam todos os agradecimentos. De um modo geral, muito

obrigada a todos.

VI

“O importante é nunca parar de questionar. A curiosidade tem sua própria

razão para existir. Uma pessoa não pode deixar de se sentir reverente ao

contemplar os mistérios da eternidade, da vida, da maravilhosa estrutura da

realidade. Basta que a pessoa tente apenas compreender um pouco mais

desses mistérios a cada dia. Nunca perca uma sagrada curiosidade”.

Albert Einsten.

VII

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

LISTA DE ANEXOS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO

1.1. Diabetes Mellitus

1.2. Nefropatia diabética

1.3. Estresse oxidativo e a nefropatia diabética

1.4. Sistema Glutationa S-transferase

1.5. Polimorfismo de Deleção de GSTT1 e GSTM1 na nefropatia diabética

2. JUSTIFICATIVA

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

3.2. Objetivos Específicos

4. METODOLOGIA

5.1 Pacientes e Controles

5.2 Obtenção das Amostras

5.3 Extração e Quantificação de DNA

5.4 Análise do polimorfismo de deleção de GSTT1 e GSTM1

5.5 Análise Estatística

5. RESULTADOS

5.1. Distribuição genotípica e associação do polimorfismo de GSTT1 e

GSTM1 com DM2

5.2. Influência do polimorfismo de deleção de GSTT1 e GSTM1 sobre

variáveis clínicas e laboratoriais.

6. DISCUSSÃO

7. CONCLUSÃO

8. REFERÊNCIAS

ANEXOS

16

37

41

22

48

45

43

42

41

41

40

41

40

40

39

34

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22

50

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57

78

XIV

XIII

XII

XI

X

15

VIII

44

VIII

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ADA Associação Americana de Diabetes (American Diabetes Association)

AGEs Produtos Finais de Glicação Avançada

BRA Bloqueador de Receptor de Angiotensina

CAT Catalase

CDKAL1 Gene que codifica quinase dependente de ciclina 5 subunidade reguladora

associada a proteína 1

DCVs Doenças Cardiovasculares

DM Diabetes mellitus

DM 1 Diabetes mellitus tipo 1

DM 2 Diabetes mellitus tipo 2

DMG Diabetes mellitus gestacional

dNTP Desoxinucleotídio Trifosfato

DRC Doença Renal Crônica

EFDR Estágio Final de Doença Renal

EUA Excreção de Albumina Urinária

EROs Espécies Reativas do Oxigênio

FABP2 Proteína de Ligação de Ácidos Graxos 2

GLUT4 Transportador de Glicose Tipo 4

GSH Glutationa

GST Glutationa S-transferase

GSTM1 Isoforma M1 da família Glutationa S- transferase

GSTT1 Isoforma T1 da família Glutationa S-transferase

HAS Hipertensão Arterial Sistêmica

HbA1c Hemoglobina Glicada

HLA Antígeno Humano Leucocitário

IC95% Intervalo de Confiança 95%

IDF Federação Internacional de Diabetes (International Diabetes Federation)

IMC Índice de Massa Corpórea

JAK-STAT Janus Quinase e ativador de transcrição

IkB Inibidor de NFkB

MAO Monoamina Oxidase

MAPK Miogênico Ativador de Proteína quinase

IX

MHC Complexo de Histocompatibilidade principal

NDP Nicotinamida adenina difosfato

NADH Nicotinamida adenina difosfato reduzida

ND Nefropatia Diabética

NFkB Fator nuclear kB

OMS Organização Mundial da Saúde

OR Odds ratio

P Probabilidade

Pb Pares de base

PKC Proteína Quinase C

qPCR PCR em Tempo Real

RER Retículo Endoplasmático Rugoso

R.P.M. Rotações Por Minuto

SBD Sociedade Brasileira de Diabetes

SBEM Sociedade Brasileira de Endocrinologia e Metabologia

SLC30A8 Gene codificador da proteína transportadora de zinco (gene encodes zinc

transporter protein member 8)

SOD Superóxido Desmutase

SNPs Polimorfismo de Nucleotídeo Único (Single-Nucleotide Polymorphisms)

TCF7L2 Fator de Transcrição 7-semelhante a 2 (Transcription factor 7-like 2)

TGF β Fator transformador de crescimento β

TFG Taxa de Filtração Glomerular

χ2 Qui- quadrado

α-KGDH Alfa cetoglutarato desidrogenase

X

LISTA DE ANEXOS

ANEXO I – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

ANEXO II – Parecer do Comitê de Ética Institucional

ANEXO III – Formulário de Preenchimento de Dados de Pacientes

ANEXO IV – Formulário de Preenchimento de Dados de Controles

ANEXO V – Carta de submissão do artigo científico em revista qualis A1

87

83

81

78

91

XI

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema demonstrando o mecanismo da ação da insulina nos

diferentes tipos de diabetes.

Figura 2. Descrições de moléculas inflamatórias e vias de sinalização na

nefropatia diabética.

Figura 3. Representação esquemática do mecanismo que unifica as vias de

dano celular induzida pela hiperglicemia.

Figura 4. Esquema representativo da via dos polióis.

Figura 5. Desenho esquemático ilustrando a deleção de GSTM1.

Figura 6. Desenho esquemático ilustrando a deleção de GSTT1.

Figura 7. Curva de melting da qPCR multiplex (SYBR Green).

43

36

36

32

31

28

18

XII

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Estágios clínicos da nefropatia diabética

Tabela 2. GSTs citosólicas humanas

Tabela 3. Sequências de primers utilizados nas reações de amplificação por

qPCR multiplex

Tabela 4. Condições de termociclagem das reações de amplificação por

qPCR multiplex

Tabela 5. Características da população estudada e comparação entre os

grupos caso e controle

Tabela 6. Distribuição de frequências genotípicas para GSTM1 e GSTT1 na

população estudada e analise de risco para nefropatia diabética

Tabela 7. Distribuição das frequências genotipicas combinadas entre GSTM1

e GSTT1 nos grupos caso e controle e o risco para o desenvolvimento de

nefropatia diabética em pacientes em EFDR.

Tabela 8. Distribuição das frequências genotípicas de GSTT1 e GSTM1 e das

combinações genotípicas entre GSTT1 e GSTM1 nos grupos caso

e controle

Tabela 9. Associação entre genótipos nulos e presentes de GSTT1 com

variáveis clínicas em pacientes com DM2-EFRD.

Tabela 10. Associação entre genótipos nulos e presentes de GSTM1 com

variáveis clínicas em pacientes com DM2-EFRD.

26

35

42

42

44

46

47

47

48

49

XIII

RESUMO

A nefropatia diabética é a principal causa de Estágio Final de Doença Renal (ESRD)

em países desenvolvidos e evidências tem apontado o estresse oxidativo como

unificador de várias vias de dano celulares em condições de hiperglicemia, que

resultaria no desenvolvimento e complicações da doença. As glutationa-S-

transferases (GSTs) são uma família de enzimas multifuncionais que desempenham

um papel importante na desintoxicação celular e eliminação de numerosas

substâncias e também pode funcionar como um dos antioxidantes. O polimorfismo

genético de deleção nos genes GSTT1 e GSTM1, quando em homozigose,

apresentam ausência de atividade dessas isoformas, conhecido como genótipo nulo.

Procurando estabelecer uma possível relação entre nefropatia diabética e os

polimorfismos acima mencionados, foi feito um estudo por caso-controle e a

genotipagem por meio de PCR em tempo real (qPCR) e curva de melting. Dados

clínico-laboratoriais de 65 pacientes (diagnosticados com nefropatia diabética e que

estavam em hemodiálise) e 90 controles foram coletados, por meio de entrevistas e

consulta a prontuários (pacientes) e a resultados de exames recentes (controles).

Foi verificado que no grupo caso existe um risco associado ao polimorfismo de

deleção, onde o genótipo GSTT1-nulo (p=0,0230) provoca um risco aumentado de

aproximadamente 2,9 vezes em desenvolver a doença (nefropatia diabética) em

relação aos portadores do genótipo GSTT1-presente. Não houve associação de

GSTM1 (p=0,3860) com a susceptibilidade a doença na população estudada. A

análise da influência da deleção de GSTT1 e GSTM1 sobre as alterações

bioquímicas e clínicas no grupo caso não resultou em uma associação significativa

de nenhuma das variáveis clínicas analisadas. Estes resultados sugerem que o

polimorfismo de deleção de GSTT1 pode estar associado ao risco de

desenvolvimento da doença, mas não com as alterações bioquímicas que foram

analisadas. Novos estudos poderão esclarecer a relação desse polimorfismo com a

nefropatia diabética e auxiliar no tratamento desta doença.

Palavras-Chave: Diabete mellitus; Nefropatia diabética; Polimorfismos; GSTT1;

GSTM1.

XIV

ABSTRACT

Diabetic nephropathy is the leading cause of end-stage renal disease (ESRD) in

developed countries and in the literature shows as oxidative stress possibly

contributes to the development of the diseases. Glutathione S-transferases (GSTs)

are a family of multifunctional enzymes that play an important role in the cellular

detoxification and excretion of numerous substances and can also work as one of the

antioxidants. The genetic polymorphism of deletion in GSTT1 and GSTM1 gene,

when homozygous, show lack of activity of these isoforms, known as null genotype.

Looking for a possible relationship between diabetic nephropathy and polymorphisms

mentioned above, this study was made for the case-control and genotyping using

real-time PCR (qPCR) and melting curve. Clinical and laboratorial data of 65 patients

(diagnosed with diabetic nephropathy and were on hemodialysis) and 90 controls

were collected through interviews and consultation with medical records (patients)

and the results of recent surveys (controls). It was found that in the group if there is a

risk associated with deletion polymorphism, where the GSTT1-null genotype (p =

0,0230) causes an increased risk of about 2,9 times in developing the disease

(diabetic nephropathy) compared to carriers of the genotype GSTT1-present. There

was no association of GSTM1 (p = 0.3860) with susceptibility to disease in this

population. Analysis of the influence of the deletion of GSTT1 and GSTM1 about the

biochemical and clinical changes in the group case did not result in a significant

association in any of the clinical variables analyzed. These results suggest that the

GSTM1 deletion polymorphism may be associated with risk of developing the

disease, but not with the biochemical changes that were analyzed. Further studies

may clarify the relationship of this polymorphism with diabetic nephropathy and help

in the treatment of this disease.

Keywords: Diabetes mellitus; Diabetic nephropathy; Polymorphism; GSTT1;

GSTM1.

15

1. INTRODUÇÃO

O diabetes mellitus (DM) é considerado uma das principais síndromes de

evolução crônica que acometem o homem moderno em qualquer idade, condição

social e localização geográfica (revisado por Oliveira, 2004). E é definido como um

conjunto de doenças metabólicas caracterizadas por hiperglicemia decorrente de

problemas no mecanismo de produção e/ou ação da insulina em tecidos periféricos

(ADA, 2012).

Essas alterações metabólicas, com destaque para dislipidemia e hipertensão

arterial sistêmica podem levar ao desenvolvimento de complicações micro e

macrovasculares, com acometimento de olhos, rins, nervos, coração e artérias

(ADA, 2013), destacando a complicação denominada de nefropatia diabética (ND),

uma das principais complicações microvasculares decorrentes da DM, sendo uma

importante causa de Insuficiência Renal Crônica (IRD).

A patogênese e a evolução da ND estão relacionadas a vários fatores, como

por exemplo, as alterações hemodinâmicas. A presença de fatores genéticos

predisponentes associados com essas alterações, bem como a glicemia não

controlada, corpos cetônicos, hormônio de crescimento, ingestão protéica, sistema

renina-angiotensina entre outros, acarretariam no desenvolvimento de lesões

glomerulares (Moreira et al., 2008).

Estudos têm tentado fazer uma triagem de genes candidatos para melhor

identificar a susceptibilidade genética (Huo et al., 2015; Ma et al., 2015; Dabhi et al.,

2015; Zhou et al., 2015; Rhee, 2015; Houldsworth et al., 2015). Por ser uma doença

multifatorial, vários genes estão envolvidos na gênese da doença, entre eles,

destacam-se o polimorfismo de inserção / deleção do gene da Enzima conversora

de angiotensina (ECA) e o gene das enzimas que auxiliam na eliminação do

estresse oxidativo, como por exemplo, as Glutationas S-tranferase (GSTs), que tem

demonstrado resultados controversos em diferentes populações.

O estresse oxidativo tem sido estudado na susceptibilidade no

desenvolvimento e progressão da ND por ser um unificador de várias vias de dano

celulares em condições de hiperglicemia, entre elas o aumento da ativação das vias

de polióis, aumento da formação dos Produtos Avançados de Glicação (AGEs),

aumento da ativação da proteína quinase C (PKC) entre outros (Brownlee, 2001).

16

Existem vários mecanismos que tentam promover a defesa celular contra o

estresse oxidativo, entre eles podemos destacar as enzimas superóxido desmutase

(SOD), catalase (CAT) e o sistema glutationa, que tem como componente as GSTs

(Ukkola et al., 2001; Meister, 1994).

Estudos realizados por Doney et al. (2005) demonstraram um aumento do

risco de morbidade e mortalidade cardiovascular, sendo essa caracterizada como

uma progressão da ND em pacientes com DM, com os polimorfismos de deleção no

gene que codifica a isoforma Glutationa S-transferase-Theta (GSTT1) na população

escocesa, enquanto Kim et al em 2005 encontrou associação entre o genótipo

GSTM1-nulo na população coreana.

A necessidade desse estudo consiste em que há poucos dados da população

brasileira, mais especificamente na população goianiense, relacionando esses

polimorfismos com o desenvolvimento da ND. Na literatura observamos dados

conflitantes em diferentes populações da participação desses polimorfismos e o

desenvolvimento dessa patologia. A fisiopatologia e os fatores genéticos que

envolvem essa doença, ainda não são completamente esclarecidos, por se tratar de

uma progressão que depende de vários fatores, destacando assim a necessidade de

estudos nessa área para uma melhor compreensão, permitindo assim um

prognóstico definido a esses pacientes.

1.1. Diabetes Mellitus

O DM é conceituado pelo Ministério da Saúde como um grupo de doenças

metabólicas que resultam da dificuldade de excreção ou atividade da insulina,

envolvendo mecanismos nocivos específicos, como a destruição das células beta

pancreáticas, resistência à ação da insulina e distúrbios na sua secreção (Brasil,

2006).

O DM configura-se atualmente como uma epidemia mundial, despertando o

interesse de muitos profissionais de saúde e da população em geral. É considerada

uma patologia crônica, traduzindo-se em um grande desafio para os sistemas de

saúde de todo o mundo. Esse número crescente de indivíduos diabéticos deve-se ao

crescimento e envelhecimento populacional, maior urbanização, crescente

prevalência de obesidade e sedentarismo, e também da maior sobrevida de

pacientes com DM (Diretrizes da Sociedade Brasileira de Diabetes, 2015). Além

17

disso, têm sido observado uma crescente proporção de pessoas afetadas em grupos

etários mais jovens (International Diabetes Federation, 2013).

Cerca de 8,3% da população mundial têm DM, sendo que 46% das pessoas

no mundo não sabem que a possui (International Diabetes Federation, 2013). De

acordo com a 6ª edição do Atlas de Diabetes da International Diabetes Federation

(IDF) de 2014, no Brasil os casos de diabetes em indivíduos na faixa etária de 20 a

79 anos ultrapassam 11 milhões de pessoas e ainda que aproximadamente 3,2

milhões de pessoas nessa mesma faixa etária apresentam a doença, mas não foram

diagnosticadas. Os mesmos autores descrevem que quase 120 mil pessoas morrem

por complicações decorrentes da doença, sendo que 41,7% dessas mortes

relacionadas à doença são em pacientes abaixo de 60 anos.

Existe uma dificuldade para realizar essa estimativa, porque na declaração de

óbito não é mencionado a DM como a causa da morte, e sim as suas complicações,

particularmente as cardiovasculares e cerebrovasculares. De acordo com o

Ministério da Saúde a cidade brasileira onde foi identificado o menor percentual da

população com diabetes é Palmas com 2,7% da população, seguida por Goiânia (4,1%)

e Manaus (4,2%) que estão na segunda e terceira posição, respectivamente, com os

menores índices (Brasil, 2012).

Atualmente, essa patologia é classificada conforme a etiologia. A classificação

da Organização Mundial da Saúde (OMS) e da Associação Americana de Diabetes

(ADA) inclui, basicamente, quatro classes clínicas: diabetes mellitus tipo 1 (DM 1),

diabetes mellitus tipo 2 (DM 2), diabetes mellitus gestacional (DMG) e outros tipos

específicos de diabetes. Ainda existem duas categorias referidas como pré-diabetes,

que são a glicemia de jejum alterada e a tolerância diminuída à glicose, que não são

entidades clínicas, mas consideradas como fatores de risco para o desenvolvimento

de DM e doenças cardiovasculares (DCVs) (SBD, 2014).

A figura 1 demostra o mecanismo de ação do hormônio insulina nos

diferentes tipos de diabetes.

18

Figura 1. Esquema demonstrando o mecanismo da ação da insulina nos diferentes tipos de

diabetes. Na situação normal, o hormônio insulina é produzido normalmente pelas células beta pancreáticas e reconhecido pelos seus receptores nas células. A diabetes do tipo 1 ocorre quando o corpo não consegue produzir insulina suficiente ou não consegue utilizar a insulina de forma eficaz. Em contra partida, na diabetes do tipo 2 e na diabetes gestacional, a secreção da insulina é normal, mas existe uma deficiência nos receptores celulares, que levará ao aumento dos níveis plasmáticos de glicose. Sigla: GLUT4 – Transportador de Glicose Tipo 4.

A insulina humana é um hormônio peptídico produzido pelas células β

pancreáticas, e é constituída por duas cadeias de resíduos de aminoácidos. A sua

síntese tem início no retículo endoplasmático rugoso (RER), na forma de pré-insulina

(Greco & Stabenfeldt, 2007; Martin & Crump, 2003), que após perder o peptídeo

sinal durante a passagem pela membrana do retículo origina a proinsulina (Martin &

Crump, 2003), molécula esta constituída pelas cadeias A e B da insulina ligadas pelo

peptídeo C (Andrade & Marco, 2006; Azevedo, 2006). A conversão em insulina

ocorre por remoção proteolítica do peptídeo C, ficando ambos armazenados no

interior de grânulos de secreção das células β pancreáticas (Andrade & Marco,

2006).

19

O processo de secreção tem como estímulo mais importante a concentração

da glicose no interstício, sendo que o aumento da glicemia (níveis de glicose no

sangue) causa a elevação da secreção de insulina, que irá agir em diferentes

tecidos do organismo permitindo a entrada de glicose, resultando em uma

diminuição da glicemia (Machado et al., 2012).

A pessoa sem DM tem uma produção normal desse hormônio pelas células

beta pancreáticas. Em pacientes com DM 1, não ocorre uma produção normal ou o

corpo não consegue utilizar a insulina, levando o aumento de glicose na corrente

sanguínea ocasionando assim, danos em outros tecidos. Já na DM 2, existe uma

produção normal ou em alguns casos um defeito na secreção de insulina, mas as

células não conseguem fazer o transporte da glicose para o seu interior, por um

defeito na ação desse hormônio o que, assim como na DM 1, vai levar a um

aumento dos níveis plasmáticos de glicose.

A DM 1 está presente em 5% a 10% dos casos (ADA, 2012). Na maioria das

vezes, a destruição das células beta-pancreáticas ocorre por um mecanismo de

autoimunidade, porém existem situações em que não há evidências deste processo

sendo, portanto, caracterizado como forma idiopática do DM 1 (ADA, 2012). As

razões para o crescente número de pessoas que desenvolvem a doença continuam

desconhecidas, mas acredita-se que envolvam fatores de risco ambientais, causas

genéticas, alimentação ou infecções virais.

A DM 1 tem seu desenvolvimento repentino, tendo como alguns sintomas:

sede anormal e boca seca, micção frequente, falta de energia e cansaço extremo,

aumento do apetite, perda repentina de peso, visão borrada, entre outros. Pessoas

diagnosticadas com essa patologia podem levar uma vida normal e saudável através

da combinação de uma terapia diária de insulina, dieta saudável, prática de exercício

físico regular e disciplina do paciente.

A DM 2 apresenta prevalência de 90% a 95% dos casos de DM, geralmente

atingindo adultos, mas tem-se observado um crescente número de crianças e

adolescentes diagnosticados (ADA, 2012). As razões para o desenvolvimento da

doença continuam desconhecidas, tendo vários fatores de risco, que incluem:

obesidade, dieta, sedentarismo, idade avançada, histórico na família entre outros.

O indivíduo portador desse tipo de diabetes desenvolve resistência à ação da

insulina, isso ocorre quando as células não usam a insulina para transportar a

glicose para o meio intracelular. O pancrêas em um primeiro momento aumenta a

20

produção desse hôrmonio, com o tempo, a quantidade produzida não é suficiente,

aumentando os níveis plasmáticos de glicose (NIH, 2013). Muitas pessoas com DM

2 permanecem desconhecedoras da doença, pois os sintomas podem demorar a

aparecer ou serem identificados, sendo somente diagnosticados quando

complicações decorrentes da doença já foram desencadeadas.

A American Diabetes Association (ADA) também menciona que grande parte

dos pacientes com essa forma de DM apresenta sobrepeso (Índice de Massa

Corpórea em kg/m2, IMC: 25 a 29,9) ou obesidade (IMC: 30 a 34,9), sendo estes

fatores contribuintes para a diminuição da sensibilidade à insulina nos tecidos

periféricos.

Na DMG a mulher desenvolve resistência à insulina em consequência dos

altos níveis de glicose durante a gravidez. Tende a ocorrer por volta da 24ª semana

de gravidez, tendo como consequência o bloqueio da ação da insulina, sendo

induzido provavelmente pelos hormônios produzidos pela placenta (ADA, 2013).

O risco para o bebê não é tão grave como para aqueles cuja mãe tenha DM 1

ou DM 2 antes da gravidez. No entanto, o diabetes gestacional não controlado

podem desenvolver consequências graves para a mãe e o seu neonato como:

macrossomia (excesso de peso de recém-nascidos), trauma ao nascimento,

icterícia, cesariana prematura e pré-eclâmpsia (aumento repentino da pressão

sanguínea) (National Institute of Health Consensus Development Conference

Statement, 2013; Crowther et al., 2005). Após o parto, 15-50% das mulheres, podem

desenvolver DM2 (Practice Bulletin, 2013), além do que as crianças e adolescentes

com macrossomia tem um risco aumentado em desenvolver diabetes e obesidade

(Wei et al., 2007; Hillier et al., 2007).

Atualmente são três os critérios definidos pela American Diabetes Association

(ADA, 2013) para o diagnostico de DM com utilização da glicemia: sintomas de

poliúria (aumento na produção de urina), polidipsia (sede excessiva) e perda de

peso acrescidos de glicemia casual > 200 mg/dl a; glicemia de jejum ≥ 126 mg/dl (7

mmol/l)b e o teste de glicemia após duas horas pós-sobrecarga de 75 g de glicose

anidra > 200 mg/dl ou quando a hemoglobina glicada (HbA1c) é ≥ 6,5% para

a: Compreende-se por glicemia casual aquela realizada a qualquer hora do dia, independentemente do horário das refeições; b: Em caso de pequenas elevações da glicemia, o diagnostico deve ser confirmado pela repetição do teste em outro dia;

21

indivíduos com alto risco para o desenvolvimento de diabetes adota-se HbA1c entre

5,7% e 6,4%.

Muitas das complicações do diabetes podem ser de origem microvascular

(devido a danos aos pequenos vasos sanguíneos) e macrovasculares (devido a

danos em vasos de grande calibre) (Melendez-Ramirez et al., 2010). O principal

determinante dessas complicações é a hiperglicemia sustentada, que acarreta

anormalidades bioquímicas e estruturais de olhos, rins, coração, vasos sanguíneos e

nervos periféricos (Aguiar et al., 2007).

As complicações microvasculares em longo prazo incluem retinopatia com perda

potencial de visão, sendo esta a principal causa de cegueira adquirida na população;

nefropatia diabética (principal causa de insuficiência renal crônica e hemodiálise em

nosso país); neuropatia periférica com risco de úlceras nos pés e amputações; e

neuropatia autonômica causando sintomas gastrointestinais, geniturinários,

cardiovasculares, e disfunções sexuais. Esses pacientes também apresentam uma

incidência de aterosclerose aumentada e anormalidades do metabolismo de

lipoproteínas (ADA, 2014).

As principais complicações macrovasculares incluem: doença arterial

periférica (representa a principal causa de amputação não traumática na população

adulta, decorrente de um mau controle glicêmico e o hábito do tabagismo) e doença

arterial coronariana (pode manifestar-se por episódios de angina e por infarto agudo

do miocárdio constituindo-se a principal causa de morte nos pacientes diabéticos)

(SBEM, 2015).

Embora ainda as causas de desenvolvimento de DM 2 não são conhecidos,

há vários fatores de risco importantes, que podem ser divididos em dois grupos:

fatores de risco modificáveis, que são aqueles possíveis de controlar, e os fatores de

risco não modificáveis, ou seja, aqueles que não se pode controlar (SBD, 2001).

Nos fatores de risco modificáveis podemos destacar a hipertensão arterial,

obesidade, privação de sono e o sedentarismo (Cercato et al., 2004; Brasil, 2006).

Entre os não modificáveis estão as doenças do pâncreas ou doenças endócrinas,

que levará a problemas na produção ou na eficácia da insulina, e a predisposição

genética (Marks & Raskin, 2000; James et al., 2007; Schwarz et al., 2008; Sanz et

al., 2010; Sinclair et al., 2011;).

Já se sabe que a DM 1 tem herança mendeliana a partir de genes do

Complexo Humano de Histocompatibilidade (MHC), incluindo HLA e outros genes

22

(Maahs et al., 2010). No entanto, o DM 2 ainda precisa de identificação dos

componentes genéticos. A identificação de genes susceptíveis para DM 2 tem sido

investigada, em geral por meio de estudos populacionais caso-controle,

comparando-se a frequência de determinado alelo entre as populações doente e

sadia.

Neste sentido, recentes avanços no entendimento da base genética e na

suceptibilidade da DM 2 revelaram a participação de novos genes e de

Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs) associados a esse risco (Farbstein et

al., 2010; Sladek et al., 2007; Taylor et al., 2007) como o gene TCF7L2, que é o

responsável por codificar o fator de transcrição 4, que está envolvido no

desenvolvimento e função das células beta pancreáticas, afetando o metabolismo de

glicose (Prunier et al., 2004; Lyssenko et al., 2007; Liu et al., 2015 ); e o gene

CDKAL1 onde a perda funcional desse gene resultaria em defeitos na tradução das

proteínas, causando uma síntese anormal de insulina que provocaria um estresse no

retículo endoplasmático das células beta pancreáticas (Tuerxunyiming et al., 2015) e

o grupo de Peng et al (2013) em sua meta analise concluíram que o polimorfismo

rs7754840 relacionado a esse gene aumenta o risco de DM2.

Também podemos citar o gene SLC30A8 que possiu a função de codificar um

fator transportador de zinco, apresentando um importante papel na síntese e

secreção de insulina (Chimienti et al., 2005), podendo estar associado ao

desenvolvimento de DM por afetar a atividade das células beta pancreáticas

(Chimienti et al., 2006), sendo o polimorfismo rs13266634 associado ao risco de

DM2 nas populações asiáticas, européias e africanas (Fan et al., 2016).

Vários polimorfismos de genes responsáveis pela alteração hemodinâmica,

endotelial, pressão sanguínea intraglomerular e exposição ao estresse oxidativo

estão associados às complicações microvasculares da DM 2 que levam a disfunção,

dano ou falência de vários órgãos, incluindo nosso objeto de estudo, a ND.

1.2. Nefropatia diabética

A DM foi listada como a principal causa de insuficiência renal mundial, em

44% de todos os novos casos em 2011, sendo que aproximadamente 230 mil

pessoas de todas as idades com falência renal decorrentes da diabetes,

necessitaram de diálise crônica ou de transplante renal, nos Estados Unidos, e 7 de

23

cada 10 novos casos de EFDR tiveram como principal causa a DM (National

Diabetes Statistics Report, 2014). De acordo com a Sociedade Brasileira de

Diabetes (SBD), essa complicação é considerada progressiva e irreversível,

atingindo até 80% dos diabéticos (Diretrizes da Sociedade Brasileira de Diabetes,

2009). Em relação ao diagnóstico da doença renal primária, os mais frequentes, em

2013, foram hipertensão arterial (35%) e diabetes (30%) (Sesso et al., 2014).

Em seus estudos, Murussi et al. (2008), destaca a necessidade de se

identificar as lesões renais de maneira precoce, o que permite um prognóstico mais

favorável, do que naqueles casos em que o diagnóstico acontece quando o paciente

já se encontra em fases mais avançadas. Ele ainda propõe a realização do exame

de excreção urinária de albumina (EUA) anualmente, o que iria ajudar na detecção e

em um melhor prognóstico do estágio no qual aquele paciente se encontra.

A ADA em 2012 lançou suas recomendações para a triagem da ND, entre

elas podemos destacar o aperfeiçoamento do controle glicêmico e da pressão

arterial, o que permitiria reduzir o risco ou retardar a progressão da doença; a

realização do teste anual para avaliar a EUA, e a medida da creatinina séricab pelo

menos anualmente em todos os adultos com DM, independente do grau de EUA.

Em relação ao tratamento eles propõem uma redução do consumo de

proteínas em pacientes com DM, principalmente aqueles que apresentam DRC; e a

continuação do monitoramento da EUA para avaliar a resposta terapêutica e

progressão da doença, além da utilização de inibidores de ECAc (IECA) ou

Bloqueadores dos Receptores da Angiotensinac (BRAs) em pacientes não graves

com micro ou macroalbuminúria (ADA, 2012).

Esses medicamentos são usados por evidências demonstrarem um

retardamento na progressão da ND, por ajudar no controle da pressão sanguínea e

diminuir a quantidade de proteína excretada pela urina, através da inibição da ação

da angiotensina II nos receptores AT1, resultando na diminuição da pressão de

filtração intraglomerular (Kunz et al., 2008; Montero et al., 2015). Apesar de

possuírem mecanismo de ação diferentes, os IECAS diminuindo a produção de

angiotensina II e os BRAs impedindo a ligação desse peptídeo aos receptores AT1,

b Deve ser utilizado para estimar a taxa de filtração glomerular (TFG) e fase o nível de doença renal crônica (DRC), se estiver presente; c Importante que se monitore níveis séricos de creatinina e potássio para que não desenvolva um aumento da creatinina e hipercalemia;

24

o que em condições normais resulta em vasoconstrição e consequente aumento da

pressão sanguínea (Hilgers & Mann, 2002; Brenner et al., 2001).

Em estudos in vitro e em animais observou-se uma redução da expansão

mesangial, glomeruloesclerose, inflamação e fibrose tubulointersticial, por meio do

bloqueia do sistema Renina-angiotensina-aldosterona (Yamagishi & Matsui, 2010;

Doi et al., 2008; Liao et al., 2003;).

Um estudo mostrou que o aumento da albumina excretada na urina em

pacientes diabéticos, aumenta em 50 vezes os riscos de óbito comparado com

aqueles pacientes que não desenvolveram nefropatia, afirmando ainda a

participação de fatores genéticos e não genéticos, destacando a glicemia alterada,

hipertensão arterial sistêmica (HAS) e as dislipidemias (Alves et al., 2011).

De acordo com Mogensen et al., (1983) a ND pode ser caracterizada por

cinco estágios clínicos. Estes estágios são classificados com base nos valores da

taxa de filtração glomerular (TFG), EUA, e a pressão sanguínea sistêmica. As lesões

estruturais discretas no parênquima renal e na vasculatura geralmente tornam-se

mais grave com o avanço dos estágios clínicos, mas o diagnóstico geralmente é

feito por motivos clínicos, sem a necessidade de biopsia renal.

A fase I em pacientes com DM 1 é caracterizado por nefromegalia e

hipertrofia glomerular, que são seguidos por vasodilatação da arteríola aferente,

hiperperfusão renal e hiperfiltração glomerular. Microscopicamente, há

espessamento das membranas basais glomerulares e tubulares. A taxa de excreção

de albumina nesta fase é normal (30 mg / dia ou, 20 µg / min), mas, ocasionalmente,

pode existir um aumento transitório ("microalbuminúria transitória"). Tipicamente não

existe aumento da pressão arterial, porém ele pode ocorrer (140/90 mm Hg) e a TFG

é aumentada em 20 a 40%, podendo ser ainda mais elevada em casos em que não

existe o controle glicêmico (Rigalleau, et al., 2010). Em pacientes com DM 2 pode se

observar nefromegalia e hiperfiltração (Nelson et al., 1997).

Na fase II ou nefropatia incipiente ou latente é definida pelo aparecimento de

microalbuminúria (UAE de 30 a 300 mg / dia ou 20 a 200 g / min), sendo quase

sempre acompanhada por um aumento da pressão arterial (140 / 90 mm Hg), tanto

em pacientes com DM 1 como com DM 2 (Mogensen et al., 1995). Uma das

possíveis causas para o aumento da EUA é a hipertensão renovascular. Mesmo

durante esta fase clinicamente "silenciosa" da doença, pode existir uma significativa

expansão da matriz mesangial ou glomeruloesclerose difusa, espessamento das

25

membranas basais glomerulares e tubulares e algum grau de perda de podócitos,

sendo que a TFG permanece elevada ou pode diminuir para valores "normais" (100

120 ml / min) (revisado em Sheldon et al., 2013).

A fase III é caracterizada pelo desenvolvimento de proteinúria evidente

(excreção total de proteína de 0,500 mg / dia) ou microalbuminúria (EUA 300 mg / d)

(Mogensen et al., 1995). No tipo 1 isso ocorre após uma média de 15 anos de

diabetes. A hipertensão é quase sempre presente, e um controle pobre pode levar a

um declínio de TFG. Observa-se na biópsia renal glomeruloesclerose difusa e/ou

nodular, perda de podócitos com áreas focais, hialinose arteriolar, nas aferentes e

eferentes, e graus variados de fibrose túbulo-intersticial. A ampliação progressiva do

mesângio glomerular provoca uma redução na área de superfície de filtração

glomerular (Mauer et al., 1984). Existe uma perda nefrótica devido à fibrose túbulo-

intersticial sendo esta uma das principais causas da redução da TFG. No doente não

tratado, a TFG cai a uma taxa de cerca de 1 ml / min / mês, mas esta taxa de queda

pode variar significativamente de doente para doente (Sheldon et al., 2013). À

medida que a TFG cai, a creatinina no soro pode permanecer normal ou ser

ligeiramente elevada (Sheldon et al., 2013).

Na fase IV, os pacientes não tratados evoluem para um quadro de nefropatia

avançada, caracterizado por proteinúria nefrótica (3,5 g / d), uma piora da

hipertensão que se torna difícil de controlar, e um declínio progressivo da TFG. Na

verdade, a nefropatia diabética é a causa mais comum da síndrome nefrótica na

população adulta. Lesões vasculares e do parênquima se tornam mais graves. A

taxa de declínio da TFG é constante ao longo de um período de meses, mas é

variável de paciente para paciente e depende do grau de elevação da pressão

sanguínea, bem como a quantidade de EUA (Sheldon et al., 2013).

A fase V é a fase final, onde ocorre a evolução para um quadro de

insuficiência renal progressiva, com diminuição da TFG para 15 ml / min ou inferior.

O tempo médio de progressão para o estágio final de doença renal (EFDR) a partir

do momento do diagnóstico de diabetes é de cerca de 20 a 30 anos, com um curso

mais rápido em pacientes com hipertensão não controlada e / ou proteinúria grave.

Muitos pacientes, especialmente aqueles com DM2, ao atingirem o quadro de IRC

têm o risco aumentado de mortalidade por problemas cardiovascular (Sheldon et al.,

2013). A Tabela 1, sumariza os 5 estágios da ND.

26

Tabela 1. Estágios clínicos da nefropatia diabética

TFG, Taxa de filtração glomerular; EUA, Excreção urinaria de albumina; EFDR, estágio final de doença renal.

Os custos para a saúde associados a essa patologia são enormes, por isso

na maioria dos casos o prognóstico pode ser desfavorável, apesar dos avanços

médicos no tratamento de doenças renais e cardiovasculares. Por exemplo, o

diabético com proteinúria tem de duas a quatro vezes maiores risco de morbidade e

mortalidade por doenças cardiovasculares (Hemmelgarn et al.,2010). Mesmo com

diálise crônica, a taxa de morte cardíaca de pacientes diabéticos é

aproximadamente 50% maior do que os pacientes não diabéticos. Já foi observado

que o risco de desenvolver essa complicação varia com a etnia (Remuzzi et al.,

2002).

Indivíduos afro-americanos, nativos americanos, asiáticos e hispânicos são

mais propensos ao desenvolvimento de DM 2 e ND do que os brancos não

hispânicos, indicando uma possível associação de fatores genéticos que podem

influenciar diretamente o desenvolvimento e a progressão da doença. Um suporte

para a transmissão genética é um estudo experimental mostrando que a medula

vermelha derivada de células mesangiais de doadores foram capaz de transmitir ND

dos doadores com DM 2 (camundongos db/db) para camundongos naive

normoglicêmicos (Zheng et al., 2004).

Entre os mecanismos de lesão renal relacionado à hiperglicemia crônica,

estão a glicação não enzimática e as alterações na via dos polióis. Os produtos de

glicação não enzimática podem causar alterações quantitativas e qualitativas nos

componentes da matriz extracelular, contribuindo para a ocorrência final de oclusão

glomerular (Murussi et al., 2003). A hiperglicemia promove também um aumento da

atividade dos polióis. Nessa via, a glicose é reduzida a sorbitol sob ação da aldose

27

redutase. O acúmulo do sorbitol ocasionaria estresse hiperosmótico para as células,

diminuição do mioinositol intracelular e da atividade da ATPase Na+/K+ dependente,

ocasionando dano celular (Murussi et al., 2003).

Novas vias para o desenvolvimento da ND envolvem processos inflamatórios

devido à hiperglicemia, sistema renina-angiotensina e stress oxidativo, envolvendo

uma infiltração renal com monócitos e linfócitos que aumentam a produção de

citocina pró-inflamatória, espécies reativas de oxigênio e danos nos tecidos (Duran-

Salgado & Rubio-Guerra, 2014; Kitada et al., 2014), resultando em uma maior

resposta inflamatória levando a lesão celular e fibrose do tecido do órgão (Figura 2).

28

Figura 2. Descrições de moléculas inflamatórias e vias de sinalização na nefropatia

diabética. Alterações promovidas pela diabetes agem nas células renais e ativam diversas cascatas de sinalizações intracelulares. A via da cinase lkB leva a ativação da NFkB. A via da MAPK controla a expressão do fator de crescimento endotelial vascular em células renais, sendo essencial na regulação de diversos processos celulares, como a inflamação, transcrição, ativação ou localização de proteínas individuais, e diferenciação celular. A sinalização promovida pela JAK-STAT medeia os efeitos dos fatores de crescimento, citocinas e angiotensina II, que resulta na expressão e ativação de TGF-β, produção de colágeno e fibronectina, e estimulação do crescimento de células mesangiais glomerulares e em células tubulointersticiais. A ativação destas vias resulta em infiltração de células inflamatórias, que aumenta e mantem o processo inflamatório nos rins, resultando no desenvolvimento e progressão de nefropatia diabética. Além disso, tem-se o aumento da proteinúria. Abreviaturas: IkB, inibidor de NFkB; JAK-STAT, Janus quinase e ativador de transcrição; MAPK, mitógeno ativadora de proteína quinase; NFkB, fator nuclear kB; TGF β, fator transformador de crescimento β.

1.3. Estresse oxidativo e a nefropatia diabética

Em células eucarióticas as espécies reativas de oxigênio (EROs) são

produzidos como uma consequência do metabolismo normal (Cossarizza et al.,

2009). Em condições fisiológicas normais, estes prooxidantes são contrabalançados

por mecanismos celulares antioxidantes. O estresse oxidativo é definido em geral

como o excesso de formação e / ou remoção insuficiente de moléculas altamente

reativas, tais como os EROs (Maritim et al., 2003), ou seja, irá existir um

desequilíbrio entre os pro-oxidantes e antioxidantes podendo resultar em lesões.

29

As EROs contribuem para a patogênese de várias doenças crônicas, incluindo DM

(Baynes, 1991).

A defesa antioxidante pode atuar basicamente em três níveis: 1) prevenção,

que consiste em mecanismos de proteção contra a formação de espécies reativas,

como a produção de pigmentos, a exemplo da melanina, e a quelação de metais por

proteínas, como a ferritina; 2) interceptação, envolvendo mecanismos enzimáticos

(peroxidases, catalases) e não enzimáticos (vitaminas) de desativação por interação

direta com os agentes potencialmente danosos; e 3) reparo, através da restituição

ou substituição do componente lesado, o que envolve a ação de sistemas

multienzimáticos especializados (Sies, 1993). Portanto, antioxidante pode ser

definido como qualquer substância que, quando presente em baixa concentração

comparada à do substrato oxidável, regenera o substrato ou previne

significativamente a oxidação do mesmo (Halliwell, 2000).

É bem documentado que o estresse oxidativo está aumentado em condições

diabéticas (Odetti et al., 1999; Davi et al., 1999; Telci et al., 2000; Ceriello et al.,

2002; Evans et al., 2002; Rahman, 2007) e provavelmente está envolvido na

disfunção das células β pancreáticas em particular, uma vez que estas células são

mais sensíveis ao esforço citotóxico em função de expressarem baixos níveis de

enzimas antioxidantes, como catalase e superóxido dismutase (Eizirik et al., 1996;

Tiedge et al., 1997; Robertson et al., 2003).

Desta forma, as células β apresentam maior risco de dano oxidativo do que

outros tecidos, tendo sido observado que o estresse oxidativo contribui na

diminuição da produção de insulina e destruição das células β (Eizirik et al., 1996;

Tiedge et al., 1997; Robertson et al., 2003). Isso sugere que o estresse oxidativo

aumentado possa desempenhar um papel relevante na patogênese do DM2 e

também no desenvolvimento das complicações clínicas relacionadas à doença

(Evans et al., 2002; Wang et al., 2006; Bid et al., 2010, Reis et al., 2011).

A geração de EROs tem recebido muita atenção no que diz respeito ao início

das complicações diabéticas microvasculares, incluindo a doença renal (Koya et al.,

2003). Como defendido por Brownlee (2001), o aumento da geração de EROs

envolve o aumento oxidativo mitocondrial, bem como diminuição da sua eliminação.

Existe certo número de fontes celulares que geram quantidades consideráveis de

EROs, sendo a mitocôndria a responsável pela geração intracelular dessas espécies

30

reativas, possuindo pelo menos 10 locais diferentes capazes de gerar EROs

(Cossarizza et al., 2009; Turrens, 2003).

Além da importante contribuição da cadeia transportadora de elétrons, uma

enzima do espaço intermembranar (p66Shc), a enzima de membrana monoamina

oxidase (MAO) (Migliaccio et al., 2006), a α-cetoglutarato desidrogenase (α-KGDH) e

o complexo enzimático do ciclo de Krebs, são capazes de alterar o pH da matriz

mitocondrial e o potencial de membrana (Sinha et al, 2013), podendo também

conferir efeitos consideráveis sobre a produção total de EROs celular (Pal et al.,

2013; Bhattacharyya et al., 2012).

A glicólise que ocorre intracelularmente resulta na produção de NADH e

piruvato. O NADH e o FADH2 mitocondrial fornecem energia para a produção de

ATP através da fosforilação oxidativa por meio da cadeia transportadora de elétrons.

Em resposta a elevação dos níveis extracelulares de glicose, as células endoteliais

geram EROs intracelular principalmente via NADH e FADH2 mitocondrial que são

gerados a partir do piruvato citosólico (Du et al., 2000). Os estudos em células

mesangiais humanas têm mostrado uma série de mudanças similares relacionadas

à geração de EROs mitocondrial (Kiritoshi et al., 2003).

O estresse oxidativo é considerado o elemento unificador das vias de dano

celulares, causados pela hiperglicemia, sendo as principais vias de danos: aumento

da ativação da via do poliol, aumento da formação dos produtos finais de glicação

avançada (AGEs), aumento da ativação da proteína quinase C e da via da

hexoamina (Figura 3).

31

Figura 3. Representação esquemática do mecanismo que unifica as vias de dano celular

induzida pela hiperglicemia. O excesso de radical superóxido (O2-) inibe parcialmente o

GAPDH, que resulta no aumento dos metabólitos formados antes da ação do GAPDH. Esses metabólitos são responsáveis pelo dano celular que existe em condições de hiperglicemia, aumentando a geração de O2

-. Siglas: NADPH- nicotinamida adenina difosfato reduzida, NADP - nicotinamida adenina difosfato, GAPDH - gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, PKC – proteína quinase C, AGE – produtos finais de glicação avançada, Udp-GlcNAC – UDP-N-acetilglucosamina.

O aumento da ativação da via do polióis envolvendo o metabolismo da glicose

em experiências in vitro com células mesangiais, foi possível verificar que a atividade

da aldose-redutase (AR) aumenta (Henry et al., 1999). Enquanto que nas células

tubulares proximais esta atividade permanece inalterada, embora na presença de

NADPH, a aldose redutase catalise a redução de glicose para formar sorbitol na

fração citosólica (Lee & Chung, 1999).

Como podemos ver na Figura 4, o sorbitol sofre então um metabolismo

subsequente para formar frutose pela ação da enzima sorbitol desidrogenase,

usando NAD+ como cofator. Um elevado nível de sorbitol afeta a atividade de Na+ /

K+ - ATPase, que por sua vez resulta em disfunção do túbulo renal (disfunção

tubular proximal) (Dunlop, 2000; Manna et al., 2009;. Das & Sil, 2012). Acumulação

de sorbitol também resulta em uma redução de Na + / K + - ATPase nos glomérulos e

afeta a taxa de filtração glomerular, por causar um estresse osmótico, devido a baixa

difusibilidade do sorbitol (Brownlee, 2001). A Aldose redutase altera a atividade da

32

proteína kinase C (PKC) e da MAPK e aumenta a produção de fator de necrose

tumoral α (TNF-α).

Figura 4. Esquema representativo da via dos polióis, A hiperglicemia, com consequente

aumento de EROS leva a um aumento na ativação da aldose redutase. O aumento do fluxo pela via dos polióis, induzido pelo aumento de EROs, determina maior conversão de glicose a sorbitol, reduzindo NADPH e glutationa (antioxidante intracelular), aumentando assim o estresse oxidativo induzido pela hiperglicemia (Adaptado de Brownlee, 2001). Sigla: SDH- Sorbitol desidrogenase.

A ativação da PKC, induzido pelo aumento de síntese de novo diacilglicerol,

causa a diminuição da produção de óxido nítrico (NO), alteração na expressão de

fatores de crescimento, como o TGF-β1, que no quadro de hiperglicemia induz

aumento da matriz extracelular em células mesangiais e glomérulos (Bertoluci et al.,

1996; Murphy et al., 1999); ativação do fator de transcrição NFΚβ (aumenta a

transcrição de várias proteínas, incluindo o fator de crescimento do endotélio

vascular e moléculas de adesão como a ICAM-1) (Goldin et al., 2006; Yan et al.,

1994), e da enzima NADPH oxidase, sendo essa última a responsável por catalisar

a formação do radical superóxido (Brownlee, 2005; El-Benna et al., 2005).

Na via envolvendo o aumento da formação dos AGEs, sabe-se que a

membrana basal glomerular, as células mesangiais, os podócitos e as células

tubulares renais acumulam altos níveis de AGEs, sendo descritos três mecanismo

que podem danificar as células: modificações de proteínas intracelulares,

principalmente as envolvidas na regulação da transcrição gênica (Brownle, 2005); a

possibilidade de difusão para o meio extracelular dos precursores de AGE e que

33

levam a uma modificação das moléculas da matriz extracelular próxima (McLellan et

al., 1994), resultando assim, em uma alteração da sinalização entre a matriz e a

célula levando a uma disfunção celular; e o mecanismo que implica que os

precursores de AGE podem difundir para fora da célula e modificar proteínas

circulantes no sangue, tais como a albumina (Brownle, 2005).

Já na superativação da via da hexoamina, a glicose é convertida em frutose-

6-fosfato que será transformada em N-acetilglicosamina-6-fosfato. A sua conversão

em UDP-N-acetilglicosamina irá resultar em alterações patológicas na expressão

gênica, aumentando produção de citocinas inflamatórias e fatores de transcrição (Du

et al., 2000).

O estresse oxidativo também tem sido claramente observado em vários

modelos animais de doença renal diabética. Observou-se que animais tratados com

estreptozotocina, uma nitroamida utilizada como indutora de diabetes em animais,

que nos rins desses animais diabéticos, a produção de EROs ocorre através de um

número de diferentes processos, tais como a auto oxidação de glicose, AGEs,

atividade da xantina oxidase, deficiência na cadeia respiratória mitocondrial,

NADPH-oxidase e óxido nítrico sintase (Forbes et al., 2008).

A inibição de EROs com ácido α lipoíco (Melhem et al., 2002) ou através de

super expressão da superóxido desmutase citosólica (DeRubertis et al., 2004)

previne a doença renal decorrentes da diabetes em modelos de roedores. Tem sido

observado que a geração de EROs mitocondrial ocorre nas células endoteliais e

esse mecanismo provavelmente desempenha um importante papel na disfunção

endotelial generalizada na diabetes, incluindo o desenvolvimento da albuminúria.

Estudos identificaram uma nova forma de NADPH-oxidase no rim, a NOX-4, (Geiszt

et al., 2000), que sofre um aumento na regulação em modelos animais de doença

renal diabética (Etoh et al., 2003).

A administração de inibidores de NOX-4 tem mostrado uma diminuição na

hipertrofia glomerular e também resultou em uma diminuição da expressão de

fibronectina no córtex renal, mais não nos glomérulos. Além disso, NADPH oxidases

foram localizadas em podócitos e as isoformas NOX-1 e NOX-4 sofreram um

aumento em meio hiperglicêmico, tanto in vitro como in vivo (Eid et al., 2009). Sendo

assim, o estresse oxidativo pode estar contribuindo para as alterações patológicas

na ND, incluindo a perda de podócitos e a albuminúria. A fonte subcelular de EROs

na doença renal diabética ainda precisa ser esclarecida, e o papel da inibição das

34

vias de geração de EROs abrem caminho para uma linha de pesquisa que pode

ajudar a ditar terapias futuras para pacientes que desenvolverem o quadro de ND.

1.4. Sistema Glutationa S-transferase

As glutationa-S-transferase (GST) é uma família de enzimas multigênicas que

desintoxicam reativos eletrofílicos, produtos do estresse oxidativo e compostos

conhecidos ou suspeitos de serem cancerígenos através da conjugação com GSH

(Hayes et al., 2005). As GSTs apresentam uma ampla distribuição intracelular,

sendo localizada na mitocôndria (GSTA1), citosol (alfa, mu, pi, e zeta) e ligadas as

membranas celulares (MGST1) (Aniya & Imaizumi, 2011; Li et al., 2011). Estudos

recentes mostraram que a expressão de GSTA4 sofre uma regulação negativa

seletiva nos tecidos adiposos em camundongos obesos insulino resistentes e na

resistência à insulina associada à obesidade humana (Curtis et al., 2010). A função

mitocondrial em adipócitos de camundongos magros ou obesos com genótipo

GSTA4 nulo foi significantemente comprometida quando comparado com o grupo

controle que apresentava genótipo presente e foi acompanhado por um aumento na

produção do ânion superóxido.

A família de enzimas da GST é expressa como várias isoformas codificadas

por uma variedade de genes distribuídos amplamente em diferentes cromossomos

(Strange et al., 2001; Xu et al., 1998). Além disso, a maioria destes loci genéticos

são conhecidos por terem formas polimórficas dos genes (Seidegard et al., 1998;

Pemble et al., 1994). Alguns estudos têm mostrado que polimorfismos nos genes da

GST podem conduzir a alterações na expressão da enzima, quer qualitativamente

ou quantitativamente (Zhong et al., 2006) e, portanto, podem tornar os indivíduos

susceptíveis a várias doenças, incluindo nefropatias.

São classificadas com base em seu ponto isoelétrico, na similaridade da

sequência de aminoácidos e especificidade por substrato. Atualmente são

conhecidas oito classes de GSTs citosólicas humanas: Alpha, Kappa, Mµ, Omega,

Pi, Sigma, Theta e Zeta (Strange et al., 2001; Nebert & Vasiliou, 2004; Mcilwaim et

al., 2006) (Tabela 2).

35

Tabela 2 - GSTs citosólicas humanas

Classe Gene Localização Cromossômica

Alpha (α) GSTA1 6p12

GSTA2 6p12.2

GSTA3 6p12

GSTA4 6p12

GSTA5 6p12.1

Kappa (κ) GSTK1 7q35

Mu (μ) GSTM1 1p13.3

GSTM2 1p13

GSTM3 1p13.3

GSTM4 1p13.3

GSTM5 1p13.3

Omega (ω) GSTO1 10q25.1

GSTO2 10q25.1

Pi (π) GSTP1 11q13

Sigma (σ) GSTS1 4q21-22

Theta (θ) GSTT1 22q11.2

GSTT2 22q11.2

Zeta (z) GSTZ1 14q24.3

Adaptado de Mcilwaim et al, 2006.

Tanto GSTT1, quanto GSTM1 apresentam polimorfismo genético

caracterizado por deleção total do gene, resultando no genótipo homozigoto nulo

(GSTT1-nulo e GSTM1-nulo), caracterizado pela ausência de atividade enzimática

destas isoformas (Arruda et al., 1998; Koch et al., 2010; Reis, 2010). A deleção

aparentemente resulta de trocas homólogas desiguais envolvendo regiões

flanqueadoras contendo sequências com alta identidade (Figuras 5 e 6), que foram

36

identificadas como regiões de deleção/junção do genótipo nulo (Xu et al., 1998;

Sprenger et al., 2000; Parl, 2005; Reis, 2010). A deleção em homozigose do gene

GSTM1 é observada em frequências que variam de 20 a 70% nas diferentes

populações, enquanto que para o gene GSTT1 esta variação é de 11 a 38% (Arruda

et al., 1998; Kalaralo et al., 2006; Bid et al., 2010).

Figura 5. Desenho esquemático ilustrando a deleção de GSTM1. São mostradas as posições relativas dos genes da classe Mu de GST, no cromossomo 1p, e a representação do alelo selvagem e mutante do gene GSTM1 (Reis et al., 2010).

Figura 6. Desenho esquemático ilustrando a deleção de GSTT1. São mostradas as posições dos genes da classe Theta de GST, no cromossomo 22q, e a representação do alelo selvagem e mutante do gene GSTT1 (Reis et al., 2010).

Deve-se destacar que os alelos funcionais de GSTM1 são ativos na

destoxificação de diversas substâncias presentes na fumaça do cigarro, como

monohalometanos, óxido de etileno, certos epóxidos dos hidrocarbonetos

aromáticos policíclicos e outros produtos de combustão, que são agentes oxidantes

potencialmente genotóxicos (Hayes & Pulford, 1995). As atividades relacionadas

com a GSTT1 em experimentos com eritrócitos humanos incubados com

diclorometano (DCM) mostraram que o genótipo nulo impede a conjugação com a

37

GSH, sendo, portanto não conjugadores (Kempkes et al., 1996). Também foi

observada uma atividade de peroxidade contra hidro peróxidos de fosfolipídios

(Hurst et al., 1998), hidro peróxido de cumeno (Meyer et al., 1991), mas essa

atividade não se estenderia a produtos secundários da peroxidação de lipídios

(Whittington et al., 1999).

De forma que o polimorfismo de deleção destas isoformas tem sido associado

a vários tipos de doenças em correlação com o hábito de fumar, com ênfase em

estudos de susceptibilidade ao câncer (Bell et al., 1993; London, et al., 2000;

Habdous et al., 2004; Lima-Jr et al., 2008).

Diante do exposto, pode-se demonstrar que a ausência de uma ou mais

formas de GST pode tornar a célula mais susceptível ao estresse químico e

oxidativo, os quais podem levar à disfunção celular, tornando de grande relevância a

caracterização da influência do polimorfismo de deleção de GSTT1 e GSTM1 no

risco e progressão de doenças (Wang et al., 2006; Zhang et al., 2014).

1.5. Polimorfismo de Deleção de GSTT1 e GSTM1 na nefropatia diabética

Dados da literatura demostram a associação do genótipo GSTM1 e GSTT1

nulo com diferentes doenças. Embora a maioria dos estudos iniciais concentrou-se

em seu papel no câncer, alguns autores têm mostrado a associação desses

polimorfismos genéticos em doenças multifatoriais e metabólicas, recebendo

destaque para a diabetes mellitus e suas complicações, como a nefropatia diabética

(Fujita et al., 2000; Yang et al., 2004; Kim et al., 2005; Manfredi et al., 2009; Koch et

al., 2010).

A identificação de genes marcadores de susceptibilidade a doenças tem sido

realizada, em geral, por meio de estudos caso-controle, comparando-se as

frequências de um determinado gene polimórfico entre as populações doente e

sadia (Reis, 2010). Esses genótipos, GSTM1 e GSTT1, são os que têm recebido

uma maior atenção, pois se sabe que esses genes quando apresentam o genótipo

de deleção (nulo) vai acarretar a uma não produção dessas isoformas da enzima.

Além disso, a prevalência de GSTM1 e GSTT1 nulos tem mostrado uma grande

variabilidade em diferentes grupos populacionais. Resultados de diferentes

populações asiáticas variam em relação à presença desses genótipos e a relação

com os casos de ND (Fujita et al., 2000; Yang et al., 2004; Kim et al., 2005). Na

38

população indiana ao avaliar a relação entre o polimorfismo no gene da GST e a

susceptibilidade ao EFDR, encontraram associação significativa para os genótipos

GSTM1-nulo como GSTT1-nulo (Agrawal et al., 2007).

Nos estudos realizados por Fujita et al (2000) na população japonesa em

pacientes com DM2, não foi encontrado associação entre o polimorfismo de deleção

no gene GSTM1 com a nefropatia diabética, enquanto Yang et al (2004) estabeleceu

que o genótipo GSTT1 nulo consiste em um fator de risco para o desenvolvimento

de ND na população chinesa estudada.

Em 2009, Datta et al., (2009) estudaram os polimorfismos no gene GST e

sugeriram que os genótipos GSTM1 e GSTT1 presente parecem ter um papel

protetor no desenvolvimento e progressão da ND em pacientes com DM2, enquanto

que os genótipos GSTM1 e GSTT1 nulos apareceram como fatores de risco para o

desenvolvimento dessa doença nesses mesmos pacientes.

Estudos realizados por Suvakov et al., em 2012 encontraram um risco

aumentado de desenvolvimento de EFDR e uma maior susceptibilidade ao estresse

oxidativo em pacientes que estavam em hemodiálise e possuíam o do genótipo

GSTM1 nulo. A presença do genótipo GSTT1 nulo nesses pacientes também

apresentou uma influência significativa nos danos resultantes da oxidação, mas não

tanto quanto o genótipo GSTM1.

É necessário que haja uma maior quantidade de estudos na população

brasileira para a susceptibilidade causada pelo polimorfismo de deleção dessas

isoformas descritas e a associação com a ND, já que podemos observar uma

quantidade significativa de dados que variam entre as etnias e as características

interindividuais.

39

2. JUSTIFICATIVA

Há evidências suficientes apoiando o conceito de susceptibilidade genética

para a nefropatia em pacientes com diabetes. Com o crescente aumento de

indivíduos portadores dessa doença existe uma maior necessidade de pesquisa que

permitam a descoberta de variantes genéticas que sustentem essa susceptibilidade,

o que poderia render importantes insights sobre essa condição.

O fato de pacientes diabéticos continuarem a desenvolver essa complicação,

mesmo na ausência dos fatores já conhecidos como o controle glicêmico, pressão

arterial, concentração de colesterol, e uma dieta proteica restritiva, levanta a

importância de mais estudos genéticos em diferentes grupos populacionais.

A participação do estresse oxidativo na fisiopatologia dessa complicação tem

sido bastante discutida na literatura, existindo ainda a necessidade de distinguir os

fatores que participariam desse desequilíbrio. As isoformas GSTM1 e GSTT1 são

candidatas por participarem do processo de detoxificação de radicais livres e o

polimorfismo genético que elas sofrem acarretarem a um genótipo nulo, ou seja, a

não produção dessas enzimas.

Essas descobertas permitiriam a identificação de pacientes com risco de

nefropatia logo após o diagnóstico de diabetes, em vez de mais tarde, quando o

prognóstico se torna ainda mais desfavorável a esses pacientes. Em segundo lugar,

a necessidade da descoberta de novos genes associados a uma susceptibilidade

aumentada ao desenvolvimento e progressão dessa complicação, ajudando assim

um melhor entendimento das vias relacionadas e ao desenvolvimento de novas

terapias, acarretando assim uma melhora nas condições de vida desses pacientes e

diminuindo os gastos em tratamentos caros como a diálise.

40

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Avaliar a associação dos polimorfismos de deleção dos genes GSTM1 e

GSTT1 com a susceptibilidade no desenvolvimento de nefropatia diabética na

população goianiense.

3.2. Objetivos específicos

Estabelecer as frequências alélicas e genotípicas dos genes GSTT1 e GSTM1 na

população estudada;

Correlacionar o polimorfismo dos genes GSTM1 e GSTT1 com a susceptibilidade

no desenvolvimento de nefropatia diabética;

Avaliar a influência do polimorfismo dos genes GSTM1 e GSTT1 com os

parâmetros clínicos;

41

4. METODOLOGIA

4.1. Pacientes e Controles

Para estabelecer os perfis alélicos dos genes GSTT1 e GSTM1 o grupo

amostral foi constituído por 155 amostras no total, sendo os grupos classificados em

caso e controle. O grupo caso foi constituído de 65 pacientes diagnosticados e

acompanhados pelo Serviço de Endocrinologia do Hospital das Clínicas da

Universidade Federal de Goiás (UFG) e de pacientes da Nefroclínica Goiânia que

foram diagnosticados com nefropatia diabética e encontravam-se em tratamento de

hemodiálise. O grupo controle foi constituído de 90 indivíduos saudáveis

selecionados da população geral de nossa região.

A participação individual no presente estudo teve caráter voluntário para

ambos, casos e controles, na qual a participação foi voluntária e todos os

participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido [Anexo I]. Para

a realização do presente estudo obteve-se o parecer favorável do Comitê de Ética

institucional (Nº195/11 datado de 27 de Junho de 2011) [Anexo II]. Dados

demográficos e clínico-laboratoriais (relativos a condições de saúde gerais,

acometimento por doenças, hábitos de consumo de bebidas alcoólicas e tabagismo,

entre outros) foram obtidos por meio de entrevistas e consulta a prontuários

(pacientes) [Anexo III] e a resultados de exames laboratoriais (controles) [Anexo IV].

4.2. Obtenção das Amostras

A coleta de amostra dos pacientes participantes foi realizada no Hospital das

Clínicas da UFG durante as visitas para acompanhamento e na Nefroclinica, clínica

colaboradora do estudo situada em Goiânia-GO, durante o procedimento de diálise.

As amostras dos controles foram obtidas durante a realização de exames de rotina

no Laboratório da Área de Saúde da Pontifícia Universidade Católica de Goiás

(PUC-GO). Destas, foram coletados 4 mL de sangue periférico em tubos a vácuo

heparinizados, sendo posteriormente preservados a -20°C, para posterior extração

de DNA.

4.3. Extração e Quantificação de DNA

A extração e purificação de DNA das amostras obtidas foram realizadas com

uso do kit comercial de extração PureLink™ Genomic DNA Mini Kit, seguindo o

42

protocolo sugerido pelo fabricante (Invitrogen - Carlsbad, CA, USA). As amostras de

DNA foram quantificadas em espectrofotômetro NanoDrop (Thermo Scientific®) e em

seguida foram diluídas com Água Milli-Q Estéril resultando em uma concentração

final de 10 ng/μL para a análise dos polimorfismos de GSTT1 e GSTM1 utilizando a

técnica de amplificação por PCR em tempo real (qPCR).

4.4. Análise do polimorfismo de deleção de GSTT1 e GSTM1

Na genotipagem dos polimorfismos de GSTT1 e GSTM1 por ensaios de

qPCR multiplex foi utilizado o fluoróforo SYBR ®

Green I, com discriminação dos

genótipos nulo e presente por análise das curvas de melting geradas após as

reações de amplificação. Os primers utilizados foram previamente sugeridos por

Voso et al., 2002, sendo o primer reverse de GSTT1 sugerido por Marín et al. (2010)

(tabela 3). Foi realizada a coamplificação da região RH92600, uma região de

microssatélite de 135pb localizado em 6q13, usada como controle endógeno da

reação, para validar os genótipos nulos. As condições de ciclagem podem ser

observadas na tabela 4.

Tabela 3 - Sequências de primers utilizados nas reações de amplificação por qPCR

multiplex

Primer Sequência 5’→3’ Amplicon (pb)

GSTM1 F-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C R-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G

215

GSTT1 F-TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC R-GGA AAA GGG TAC AGA CTG GGG A

257

RH92600 F-GCA ATT CCG CAT TTA ATT CAT GG R-AAA CAG GCC ACG TAA AGC AAC

135

Tabela 4 - Condições de termociclagem das reações de amplificação por qPCR multiplex

Ciclagem Etapas Temperatura (°C) Tempo

Início Desnaturação 95 10 min. Desnaturação 95 10 s 33 Ciclos Anelamento 60 20 s Extensão 72 25 s

Foi utilizado um volume final de 25 μL nas reações, contendo

aproximadamente 10 ng de DNA das amostras previamente quantificadas e diluídas,

43

0,3 μM de cada primer GSTT1, 0,4 μM de cada primer GSTM1 e 0,5 μM de cada

primer RH92600 (Tabela 3), 1X de SYBR ® Green qPCR Master Mix (Fermentas®),

com adição de 1,5 mM de MgCl2. A programação para realização da curva de

melting foi: 95°C por 10 segundos, 65°C por 1 minuto e aumento para 95°C, com 5

aquisições por °C. A figura 7 demonstra a curva de melting para a caracterização

dos genótipos de GSTT1 e GSTM1.

Figura 7. Curva de melting da qPCR multiplex (SYBR Green). Os picos correspondem aos genótipos presentes de GSTM1 (77,5°C), GSTT1 (82,5°C) e RH92600 (74°C). A ausência dos picos correspondentes a GSTM1 e/ou GSTT1, na presença do controle endógeno (RH92600), permite a identificação dos respectivos genótipos nulos.

4.5. Análise Estatística

Foi empregado o software BioEstat® versão 5.3 (disponível para download no

link: http://www.mamiraua.org.br/pt-br/downloads/programas/bioestat-versao-53/). O

teste do qui-quadrado foi utilizado para comparar as frequências genotípicas, tendo

sido aplicado o teste exato de Fisher quando necessário.

O cálculo de Odds Ratio, com intervalo de confiança 95%, foi utilizado para

avaliar o genótipo de risco e a susceptibilidade a nefropatia diabética, por regressão

logística múltipla com controle de fatores de confundimento relacionados à

distribuição por sexo, hábito de fumar e etilismo.

O teste t foi empregado para comparar as variáveis clínicas entre os grupos

analisados. O valor de p ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significante.

44

5. RESULTADOS

Foram avaliadas características clínico-laboratoriais na população estudada,

os resultados obtidos estão demonstrados na tabela 5. O grupo caso foi constituído

por 65 pacientes (33 masculinas e 32 femininos) que se encontrava em EFDR e em

tratamento de hemodiálise, sendo que a média de idade dos indivíduos foi de

aproximadamente 62,3 anos, foram encontrados valores médios significativos

alterados para as variáveis clinico laboratoriais analisadas no grupo caso quando

comparado com o grupo controle. O grupo controle foi composto de 90 indivíduos

(51 masculinos e 39 femininos), apresentando 61,5 anos como média de idade entre

os participantes desse grupo. Foi feita uma avaliação dos níveis de glicose,

creatinina e da taxa de filtração glomerular.

Tabela 5. Características da população estudada e comparação entre os grupos

caso e controle.

Dados são reportados como média ± desvio padrão. Análise estatística por teste t ou teste do Qui-quadrado. *Diferença significativa entre os grupos (p ≤ 0,05). #TFG- Taxa de Filtração Glomerular estimado pela formula de Cockcroft-Gault.

A análise estatística da distribuição por sexo e idade não apresentou

diferenças significativas, indicando que há homogeneidade entre os grupos

estudados. A proporção de indivíduos fumantes e etilistas também não apresentou

Variáveis Caso (N=65) Controle (N=90) P

Sexo (M/F) 33/32 51/39 0.5729

Idade (anos) 62.43 ± 10.66 61.52 ± 9.43 0.5763

IMC (kg/m²) 26.04 ± 4.73 27.35 ± 5.19 0.1087

Glicemia de jejum 197.45 ± 85.47 88.23 ± 8.76 < 0.0001*

Creatinina (mg/dl) 5.79 ± 3.97 0.75 ± 0.20 < 0.0001*

TFG# (ml/min) 39.94 ± 49.87 108.05 ± 18.02 < 0.0001*

Etilismo (S/N) 28/37 34/56 0.6182

Tabagismo (S/N) 13/52 26/64 0.2842

45

diferenças significativas entre os dois grupos pela comparação realizada pelo teste

do qui-quadrado.

5.1. Distribuição genotípica e associação do polimorfismo de GSTT1 e

GSTM1

Um total de 155 indivíduos (sendo 65 pacientes e 90 controles) foram

genotipados para o polimorfismo de deleção das duas isoformas de GST. Nos

pacientes nefropatas, a frequência de GSTM1-nulo foi de 32,3% e de GSTT1-nulo

foi de 24,6%. No grupo controle as frequências foram de 42,2% e 11,1%

respectivamente (Tabela 6).

No grupo caso, a frequência de GSTT1-nulo foi significativamente mais

elevada do que nos controles (p = 0,0230), já para GSTM1 não houve diferença

significativa (0,3860) na distribuição de genótipos nulos e presente entre os grupos

caso e controle (Tabela 6).

A distribuição por sexo, tabagismo e etilismo foram as variáveis de

confundimento utilizadas na análise por regressão logística múltipla, havendo

homogeneidade na distribuição por sexo, tabagismo e etilismo entre os grupos em

todas as análises realizadas.

Foi verificado na análise de risco associado ao polimorfismo de deleção, que

o genótipo GSTT1-nulo (p=0,0230) provoca um risco aumentado de

aproximadamente 2.9 vezes em desenvolver a doença (nefropatia diabética) em

relação aos portadores do genótipo GSTT1-presente. Não houve associação de

GSTM1 (p=0.3860) com a susceptibilidade a doença na população estudada.

46

Tabela 6. Distribuição de frequências genotípicas para GSTM1 e GSTT1 na

população estudada e analise de risco para nefropatia diabética.

Caso Controle

Genótipo n (%) n (%) OR (IC 95%) P

GSTM1

Presente (+) 44 (67.7) 52 (57.8) 0.73 (0.37-1.47) 0.3860

Nulo (-) 21 (32.3) 38 (42.2)

GSTT1

Presente (+) 49 (75.4) 80 (88.9) 2.88 (1.16 - 7.17) 0.0230*

Nulo (-) 16 (24.6) 10 (11.1)

Total 65 (100) 90 (100)

Analise por regressão logística múltipla para obter valores ajustados de odds ratio (OD) e intervalos de confiança (95%IC). *Diferença significativa entre os grupos (p ≤ 0,05).

Foi verificada uma baixa frequência de indivíduos com genótipo duplo nulo (- /

-), tanto no grupo caso (4,6%), quanto no grupo controle (3,3%), com predominância

de indivíduos com genótipo duplo presente (+ / +) nos dois grupos (47,7% e 50%,

respectivamente).

Na análise dos genótipos combinados de GSTT1 e GSTM1 por regressão

logística múltipla foi verificado que a combinação de GSTT1-nulo com GSTM1-

presente (- / +) conferiu um risco aumentado de 3.5 vezes ao desenvolvimento da

doença. As demais combinações genotípicas não trouxeram associações

significativas (Tabela 7).

47

Tabela 7. Distribuição das frequências genotipicas combinadas entre GSTM1 e

GSTT1 nos grupos caso e controle e o risco para o desenvolvimento de nefropatia

diabética em pacientes em EFDR.

Genótipo Caso Controle

GSTT1/GSTM1 n (%) n (%) OR (IC 95%) P

(+ / +) 31 (47.7) 45 (50.0) 1 (Reference) ---------

(- / +) 13 (20.0) 7 (7.8) 3.48 (1.13 – 10.70) 0.0294*

(+ / -) 18 (27.7) 35 (38.9) 0.75 (0.36 – 1.57) 0.4391

(- / -) 3 (4.6) 3 (3.3) 1.64 (0.29 – 9.35) 0.5782

Total 65 (100) 90 (100)

Analises por regressão logistica multipla para obter valores ajustados de odds ratio (OR) e intervalos de confiança (95%IC). *Diferença significativa entre os grupos (p ≤ 0,05). Obs.: Resultado significativo de (- / +) devido apenas à deleção de GSTT1.

Com a aplicação de teste do qui-quadrado, observamos que houve diferença

significativa na distribuição de genótipos nulos e presente de GSTT1 entre os grupos

caso e controle (p = 0,045). Tendo-se observado uma maior frequência de indivíduos

com genótipo GSTT1-nulo no grupo caso (24.6%) em relação ao grupo controle

(11.1%). Não houve diferença significativa na distribuição genotípica para GSTM1

entre os dois grupos (Tabela 8).

Tabela 8. Distribuição das frequências genotípicas de GSTT1 e GSTM1 e das

combinações genotípicas entre GSTT1 e GSTM1 nos grupos caso e controle.

Genótipo Caso n (%)

Controle n (%)

X² GL p

GSTM1

Presente

44 (67.7) 52 (57.8)

1.181 1 0.2771 Nulo 21 (32.3) 38 (42.2)

Total 65 (100,0) 90 (100)

GSTT1

Presente

49 (75.4) 80 (88.9)

4.010 1 0.0452* Nulo 16 (24.6) 10 (11.1)

Total 65 (100,0) 90 (100)

Análise estatística por teste do qui-quadrado e intervalo de confiança obtidos por regressão logística múltipla. *Diferença significativa entre os grupos (p ≤ 0,05).

48

5.2. Influência do polimorfismo de deleção de GSTT1 e GSTM1 sobre

variáveis clínicas e laboratoriais.

Também foi feita uma analise da influência da deleção de GSTT1 e GSTM1

sobre as alterações clínicas e bioquímicas no grupo de pacientes estudados pela

comparação entre os indivíduos com genótipo nulo e genótipo presente (Tabela 9 e

Tabela 10). Observou-se que não ocorreram diferenças significativas quanto à

distribuição por sexo, tabagismo e etilismo entre os grupos, inferindo assim que há

homogeneidade entre os pacientes estudados para a comparação das variáveis

analisadas.

Com relação ao polimorfismo de GSTT1, não houve associação significativa

de nenhuma das variáveis clínicas analisadas com os genótipos nulos e presente

(Tabela 9), apesar de esse polimorfismo ter apresentado diferença significativa

quando comparado com o grupo controle.

Em relação ao genótipo GSTM1 não foram observadas diferenças

significativas tanto nas análises comparando grupo controle com grupo de pacientes,

como nas analises estatísticas das variáveis clínicas (Tabela 10).

Tabela 9. Associação entre genótipos nulos e presentes de GSTT1 com variáveis

clínicas em pacientes com nefropatia diabética.

GSTT1 Presente (N = 49) Nulo (N = 16) P

Sexo (M/F) 23/26 10/6 0.4278

Idade (anos) 63.47 ± 10.42 59.25 ± 11.08 0.1709

IMC (kg/m²) 26.38 ± 4.59 24.98 ± 5.14 0.3071

Glicemia de jejum (mg/dl) 189.44 ± 74.21 220.93 ± 112.28 0.2374

Creatinina (mg/dl) 5.34 ± 3.82 7.19 ± 4.24 0.1053

TFG# (ml/min) 44.05 ± 51.38 27.34 ± 44.03 0.2475

Etilismo (+/-) 10/39 3/13 1.0000

Tabagismo (+/-) 20/29 8/8 0.7238

Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. A análise estatística pelo teste t, qui-quadrado ou teste exato de Fisher. Nível de significância (p ≤0,05). # TFG-Taxa de filtração glomerular estimada pela formula de Cockcroft-Gault.

49

Tabela 10. Associação entre genótipos nulos e presentes de GSTM1 com variáveis

clínicas em pacientes com Nefropatia diabética.

GSTM1 Presente (N = 44) Nulo (N = 21) P

Sexo (M/F) 24/20 9/12 0.5377

Idade (anos) 62.32 ± 10.64 62.67 ± 10.97 0.9030

IMC (kg/m²) 26.45 ± 4.91 25.17 ± 4.29 0.3133

Glicemia de jejum (mg/dl) 199.58 ± 86.38 193.42 ± 85.93 0.8020

Creatinina (mg/dl) 5.99 ± 3.99 5.37 ± 4.01 0.5596

TFG# (ml/min) 40.87 ± 52.77 37.98 ± 44.34 0.8290

Etilismo (+/-) 22/22 6/19 0.0630

Tabagismo (+/-) 8/36 5/16 0.7416

Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. A análise estatística pelo teste t, qui-quadrado ou teste exato de Fisher. Nível de significância (p ≤0,05). # TFG-Taxa de filtração glomerular estimada pela formula de Cockcroft-Gault.

50

6. DISCUSSÃO

A ND caracteriza-se por ser uma das principais complicações microvasculares

da DM, sendo uma das principais causas do estágio final de doença renal (EFRD)

(Tuttle et al., 2014). Em um levantamento feito pela União Européia estimou que os

custos de tratamentos destinados a pacientes em EFDR seria de aproximadamente

51 mil euros no primeiro ano por indivíduo (Haller et al., 2011). Na literatura

observamos dados controversos em diferentes populações a respeito dos fatores

genéticos que estariam associados à susceptibilidade e evolução para estágios

clínicos mais avançados dessa patologia.

A patogênese da ND tem o envolvimento de vários fatores, incluindo

alterações hemodinâmicas e metabólicas, e o estresse oxidativo. Mecanismos

bioquímicos, como a alteração na via dos polióis, a formação de espécies reativas

de oxigênio e a formação dos AGEs, têm sido propostos para explicar as alterações

estruturais e funcionais relacionados com o quadro de hiperglicemia sustentada nos

tecidos vasculares, com indícios de que a capacidade endógena antioxidante nesses

indivíduos esteja prejudicada, o que dificultaria a remoção desses radicais livres

formados (Santini et al., 1997).

As GSTs constituem uma família de enzimas que têm grande importância na

defesa aos danos oxidativos, assim como na biotransformação de xenobióticos

(Koch et al., 2010; Reis, 2010), destacando as isoformas GSTT1 e GSTM1 que

apresentam polimorfismo de deleção, o que resulta na ausência de atividade

enzimática (London et al., 2000). Os membros da família das GSTs possuem assim,

um papel importante no mecanismo de defesa que neutralizam alterações

bioquímicas que ocorrem durante o estado urêmico, agindo tanto na conjugação

com a glutationa como na atividade antioxidante enzimática (Simic et al., 2009;

Hayes & Strange, 1995).

No presente estudo, foi feita uma análise do polimorfismo envolvendo esses

genes e a susceptibilidade em desenvolver ND em pacientes que se encontravam

em tratamento de hemodiálise, sendo encontrado um risco aumentado de 2,9 vezes

em desenvolver a doença para os portadores do genótipo GSTT1-nulo, resultado

esse confirmado com a análise dos genótipos combinados, onde GSTM1-presente

não reduziu o efeito de GSTT1-nulo sobre o risco a desenvolver nefropatia.

51

Na comparação entre os grupos caso e controle, o achado de diferenças

significativas nas variáveis clínicas analisadas (RFG, creatinina e glicemia), pode ser

explicado pelo elevado grau de descompensação metabólica dos pacientes

envolvidos no estudo. Os níveis tão alterados de creatinina podem ser explicados

por serem pacientes que se encontram em hemodiálise, ou seja, já apresentam um

grau avançado de lesão renal, e sabe-se que uma pessoa que apresenta nível alto

desse elemento no sangue, significa que a função dos rins já está cerca de 50%

comprometida. Em relação ao TFG, este foi estimado pela fórmula matemática que

leva em consideração os níveis de creatinina, peso e idade, e novamente por serem

pacientes que se encontram em um estágio avançado de doença renal, existe uma

diminuição dessa taxa.

O TFG foi estimado pela fórmula de Cockcroft-Gault, que não representa o

TFG real com a mesma fidelidade de outros métodos, como o clearance de inulina

(Stevens et al., 2006). Um dos problemas que recebe destaque na utilização de

fórmulas para o cáculo do TFG em pacientes diabéticos é a não detecção da fase

preococe de ND, por essa razão TFG menores que 90 mL/min já podem representar

perda da função renal (KDOQI Clinical Practice Guidelines, 2007).

Entre os polimorfismos estudados e analisados neste trabalho, apenas o

genótipo GSTT1 nulo apresentou uma associação significativa em desenvolver o

quadro de ND em pacientes que estavam em hemodiálise, em relação aos

portadores do genótipo GSTT1-presente. Estes dados vão de acordo com os

encontrados na literatura, onde o genótipo GSTT1 duplo nulo apresentou um fator

de risco para desenvolvimento de EFDR em pacientes diabéticos em Taiwan, não

sendo encontrada associação entre a deleção homozigótica de GSTM1 nesses

pacientes (Yang et al., 2004). Vojtková et al. (2013), encontrou o mesmo risco ao se

comparar GSTT1 nulo com M1 presente em crianças e adolescentes eslovacas

portadores de DM1.

Fujita et al. (2000), sugeriu que o genótipo nulo de GSTM1 não contribui para

o desenvolvimento da nefropatia diabética em pacientes com DM2 na população

japonesa. Datta et al. (2010), também estabeleceram a existência de influências do

genótipo GSTT1 nulo com um maior risco para o desenvolvimento de doença renal

terminal. Agrawal et al, relatou que os genótipos GSTP1-313 e os alelos de GSTM1

e GSTT1 são considerados fatores de risco predisponentes, mas não esclareceram

se os pacientes em EFDR eram diabéticos.

52

Estudo realizado por Orhan et al., (2014) para avaliar a participação desses

polimorfismos com o risco aumentado no desenvolvimento de DM em gestantes não

encontraram resultados estatisticamente significativos, concluindo que os genes

GSTM1 e GSTT1 não influenciariam na DMG, além disso a presença de uma das

isoformas não apresentou efeito protetor contra a ocorrência da doença.

Suvakov et al. (2012) encontrou em seus estudos que o nível de proteção

contra o estresse oxidativo na síndrome urêmica é influência pelos polimorfismos

nos genes de GSTs (A1, M1, P1 e T1), que determinam a quantidade e/ou atividade

dessas enzimas, que agem nos hidro peróxidos orgânicos e em compostos

prejudiciais que se acumulam no organismo. Lin et al. (2009) mostraram que

pacientes em hemodiálise com o genótipo GSTM1 nulo são mais vulneráveis aos

danos oxidativos e possuem maior risco de morte em comparação com aqueles que

possuem GSTM1 presente, resultado esse que não foi encontrado em nossos

estudos, possivelmente pelo fato de o n utilizado em nosso estudo ser mais limitado

do que o usado por Lin et al., (2009) (488 pacientes com insuficiência renal

recebendo tratamento de hemodiálise, sendo que destes 164 tinham como causa a

nefropatia diabética).

Ainda relacionado com o polimorfismo de GSTM1, estudos com resveratrol,

um polifenol que tem mostrado possuir efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e

efeitos cardioprotetores, (Miller & Rice-Evans, 1995; Hung et al., 2000; Das et al.,

2005) realizados por Jiang et al., (2013) em ratos com diabetes induzidos por

estreptozina e que apresentavam excreção urinária de proteínas aumentada e

alterações renais compatíveis com os estágios iniciais de ND, tratados com essa

substância mostraram redução na excreção de proteínas comparados com ratos

diabéticos não tratados.

Além disso, os seus resultados mostraram que a expressão de GSTM em

ratos diabéticos foi significantemente maior do que no grupo controle, sendo que,

com o tratamento com resveratrol a expressão de GSTM voltou aos níveis normais,

resultado semelhante ao encontrado por Fujita et al., (2001). Também foi observada

a ação dessa substância na redução da glicose plasmática, creatinina e uma

atenuação a hipertrofia renal em ratos, sugerindo que o mecanismo de regulação

negativa na expressão de GSTM pode ser uma das vias envolvidas no papel

renoprotetor do resveratrol. Apesar de não termos encontrado associação

significativa com o polimorfismo dessa isoforma no nosso estudo, não podemos

53

descartar a sua participação. Talvez essa associação não foi observada por o grupo

amostral ser pequeno, ou por serem pacientes que já se encontravam em estágios

clínicos mais avançadas da ND e não nos estágios inicias, o que poderia prejudicar

esse mecanismo de regulação.

Na análise de risco foi observada uma frequência mais elevada do genótipo

GSTT1-nulo (24,6%) no grupo caso do que em indivíduos não diabéticos do grupo

controle (11,1%). Aqueles que apresentam o genótipo de risco possuem uma

predisposição aumentada à doença de aproximadamente 2,9 vezes (p = 0.0230).

Portanto, os indivíduos podem apresentar defesas antioxidantes diminuídas quando

esta isoforma está deletada. Estes resultados sugerem que o polimorfismo de

deleção do gene GSTT1 pode desempenhar um papel importante na patogênese do

ND corroborando com os resultados achados nos estudos já citados.

Em relação ao polimorfismo de GSTM1, não foram encontradas diferenças

estatisticamente significativas nas proporções dos genótipos nulos entre os grupos

caso (32,3%) e controle (42,2%). Também foi verificado que não houve associação

da deleção de GSTM1 com a susceptibilidade a ND. Estes resultados estão de

acordo com estudo realizado por Fujita et al., (2000) na população japonesa (foi

utilizado um n de 105 pacientes com ND), que em seus estudos encontraram que a

frequência do genotipo nulo não foi significantemente maior no grupo de pacientes

com ND do que no grupo de pacientes sem, sugerindo assim que esse genótipo não

contribui para o desenvolvimento da doença.

As análises feitas por regressão logística múltipla indicaram que a

combinação GSTT1-nulo com GSTM1-presente (- / +) conferiu um risco aumentado

de 3.5 vezes ao desenvolvimento da doença. Porém, a análise log-linear não

mostrou haver contribuição do polimorfismo GSTM1 na susceptibilidade ao

desenvolvimento da ND (p = 0.386), portanto GSTM1-presente não é capaz de

suprir a falta causada pela deleção de GSTT1, já que podemos observar um risco

elevado de se desenvolver a doença.

Datta et al., (2010), em seus estudos, encontrou que entre a população

indiana saudável o aumento do estresse oxidativo leva a um aumento na expressão

de GST com o aumento dos genótipos GSTM1+/GSTT1+ comparado com outros

genótipos que também apresentam polimorfismo de deleção, implicando assim a

existência de mecanismos compensatórios. Ainda observaram que em pacientes

com doença crônica renal, esses genótipos presentes não são capazes de promover

54

esse mecanismo compensatório com o aumento do estresse oxidativo, indicando

assim um importante papel dos rins na atividade normal de GST.

E meta-análise publicada por Orlewski & Orlewska (2015) mostrou que os

indivíduos com os genótipos GSTM1-nulo ou GSTM1-nulo / GSTT1-nulo

apresentaram um risco significativamente aumentado de desenvolverem ND quando

comparados com indivíduos que não possuem estes genótipos, porém GSTT1 nulo

versus presente parece não estar relacionado associado à susceptibilidade em

desenvolver a doença. Além disso, foi encontrado um risco aumentado em

desenvolver a doença em indivíduos com o polimorfismo nulo para os dois genes em

comparação com indivíduos portadores do genótipo presente, sugerindo que pode a

existência de certos genótipos combinados pode aumentar o risco, do que apenas

um deles (Orlewski & Orlewska, 2015).

Nas análises de associação de variáveis clínico-laboratoriais com os

polimorfismos estudados não foram encontradas associações estatisticamente

significativas em nenhuma das variáveis analisadas com os genótipos nulos e

presente de GSTT1 e GSTM1. Pinheiro et al. (2013) em seus estudos estabeleceu

uma relação do genótipo GSTM1 nulo em pacientes com DM2, com aumento

significativo de Hb1c, glicemia de jejum e pressão arterial mais não com o risco de

desenvolver a DM2. Esses mesmos autores encontraram uma relação do genótipo

GSTT1 nulo em componentes do perfil lipídico. O fato de não termos encontrado

diferença significativa pode estar relacionado com o fato de serem pacientes que se

encontram em um estágio avançado de ND e não podemos descartar a

possibilidade de que os genótipos nulos podem estar influenciando em outras

variáveis que não foram analisadas.

Apesar do número reduzido de indivíduos no grupo caso, estes resultados

podem ser úteis, considerando poucos estudos que tratam do mesmo tema na

população brasileira, especificamente na região e Goiânia. Além disso, os resultados

que apresentaram níveis de significância são compatíveis com outros dados

apresentados na literatura. Destacamos ainda a necessidade de maiores estudos

visando esclarecer a relação entre esse polimorfismo e a susceptibilidade no

desenvolvimento da doença e o estresse oxidativo.

Os resultados obtidos em nosso trabalho sugerem que GSTT1 pode ser

considerado como um potencial marcador genético para auxiliar na identificação de

indivíduos com susceptibilidade aumentada em desenvolver ND e os estágios

55

avançados da doença. Os mecanismos que atuam nessa susceptibilidade e a

relação existente com o estresse oxidativo ainda necessitam de novos estudos para

uma melhor compreensão destes mecanismos. Portanto, os resultados obtidos no

presente trabalho proporcionam um direcionamento para novas pesquisas

relacionadas ao estudo da associação do polimorfismo de deleção de GSTT1 e a

ND. E consequentemente, melhorias no tratamento e prevenção da ND.

56

7. CONCLUSÃO

Este estudo mostrou evidências de que o polimorfismo de deleção da

isoforma T1 do sistema GST pode desempenhar um papel importante na

susceptibilidade no desenvolvimento de ND. As seguintes associações foram feitas:

1) GSTT1 teve influência sobre a susceptibilidade a ND, sendo que o genótipo

GSTT1-nulo provocou um risco aumentado de 2,9 vezes à doença;

2) GSTM1 não apresentou associação com a susceptibilidade a ND;

3) A análise dos genótipos combinados de GSTT1 e GSTM1 mostrou que o

genótipo GSTM1-presente não reduz o efeito da deleção de GSTT1 sobre o

risco à doença;

4) GSTT1-nulo com GSTM1-presente (- / +) conferiu um risco aumentado de 3.5

vezes ao desenvolvimento da doença

5) GSTT1-nulo e GSTM1-nulo não mostrou associação significativa com as

variáveis clinicas analisada;

Podemos concluir diante disso que o polimorfismo de deleção envolvendo o

genótipo GSTT1 pode ser considerado como um potencial marcador na identificação

de indivíduos com risco aumentado para o desenvolvimento de ND, mas não possui

influência nos parâmetros analisados nos portadores dessa complicação decorrente

da DM.

57

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78

ANEXO I – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Você está sendo convidado (a) para participar, como voluntário, em pesquisa.

Após ser esclarecido (a) sobre as informações a seguir e no caso de aceitar fazer parte do

estudo, assine ao final deste documento. Você deverá assinar duas vias, uma delas é sua e

a outra é do pesquisador responsável. Em caso de dúvidas sobre a pesquisa, você poderá

entrar em contato com o pesquisador responsável, Profª Drª Angela Adamski da Silva Reis

no telefone (62) 3521 1078.

INFORMAÇOES IMPORTANTES QUE VOCÊ DEVE SABER SOBRE A PESQUISA

A pesquisa é intitulada “Avaliação clínica e molecular do polimorfismo genético

na susceptibilidade às complicações do Diabetes mellitus" e tem como objetivo o

estudo da susceptibilidade genética às complicações do diabetes: nefropatia (insuficiência

renal), retinopatia (perda da visão) e cardiopatia (doenças cardiovasculares) comparado ao

grupo controle (pessoas saudáveis). O presente documento lhe será aplicado por um

pesquisador. Caso concorde em participar somente uma amostra de sangue será coletada

por integrantes da pesquisa. Desta forma a pesquisa não lhe causará nenhum prejuízo à

sua saúde. Todo material perfuro-cortante (Seringa + agulha) é descartável sem nenhum

risco de transmissibilidade de doenças infecto-contagiosa.

Não haverá nenhum tipo de despesa para participar desta pesquisa, bem como

nada será pago por sua participação. Ao participar desta pesquisa você não terá nenhum

benefício direto. Entretanto, esperamos que este estudo traga informações importantes

sobre às complicações do Diabetes, de forma que o conhecimento que será construído a

partir desta pesquisa possa auxiliar no diagnóstico precoce de outros pacientes. Sua

participação será limitada ao uso da amostra obtida durante a coleta de sangue, sendo que

os resultados lhe serão informados caso o voluntário solicite ao laboratório por meio do

telefone de contato já citado.

Todas as informações coletadas neste estudo são estritamente confidenciais.

Somente os pesquisadores terão conhecimento dos dados. Você tem liberdade de se

recusar a continuar participando em qualquer fase da pesquisa, sem qualquer prejuízo. Sua

amostra e dados clínicos serão utilizados apenas para este estudo e não serão

armazenados para futuros estudos.

Profª Drª Angela Adamski da Silva Reis Coordenadora da Pesquisa

79

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO INFORMADO PARA INVESTIGAÇÃO

Dados de identificação ( ) Paciente ( ) Controle

Título do Projeto: Avaliação clínica e molecular do polimorfismo genético na susceptibilidade às complicações do diabetes mellitus Pesquisadora Responsável: Profa. Dra. Angela Adamski da Silva Reis Nome do voluntário: _______________________________________________

Telefone: ____________________________ Celular: ____________________

Idade: _______ anos R.G. _______________ Org. Exp. __________ Responsável legal (quando for o caso): _______________________________ Grau de parentesco: ____________________________________ R.G. Responsável legal: _________________________ Org. Exp. __________ 1. Este projeto tem o objetivo de avaliar clínica e molecularmente a susceptibilidade genética

nas complicações do Diabetes mellitus, nefropatia diabética.

2. Para tanto será necessário realizar os seguintes procedimentos:

- responder um questionário sobre seus hábitos de vida (com entrevistador);

- doação de 10 mL de amostra de sangue periférico (coletada por especialista)

3. Os procedimentos da pesquisa oferecem risco mínimo de ocorrência de algum dano

imediato ou tardio para o paciente (poderá ocorrer hematomas locais após a coleta de

sangue).

4. Sua amostra de sangue será testada com testes de DNA para avaliação a

susceptibilidade ao diabetes mellitus e/ou suas complicações clínicas.

5. A participação no estudo não acarretará custos para você e não será disponível nenhuma

compensação financeira.

6. Você será esclarecido (a) sobre a pesquisa em qualquer aspecto que desejar. Você é

livre para recusar-se a participar, retirar seu consentimento ou interromper a participação a

qualquer momento. A sua participação é voluntária e a recusa em participar não irá acarretar

qualquer penalidade ou perda em seu atendimento.

O(s) pesquisador(es) irá(ão) tratar a sua identidade com padrões profissionais de

sigilo e as informações colhidas serão utilizadas somente para fins científicos. Os resultados

da pesquisa serão entregues para você e permanecerão confidenciais. Seu nome ou o

material que indique a sua participação não será liberado sem a sua permissão. Você não

será identificado(a) em nenhuma publicação que possa resultar deste estudo.

80

Eu,_________________________________________________________________

_, RG nº _____________________ Org. Exp. __________ declaro ter sido

suficientemente esclarecido sobre os propósitos do estudo, os procedimentos a

serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de

esclarecimentos permanentes. Estou ciente de que todas as informações prestadas

durante a entrevista serão de caráter confidencial e os dados colhidos serão

utilizados somente para fins científicos. Concordo voluntariamente em participar

desta pesquisa, sendo que poderei retirar o meu consentimento a qualquer

momento, antes ou durante o mesmo, sem prejuízo ou perda de qualquer benefício

que eu possa ter adquirido durante o atendimento neste Serviço.

Ou,

Eu,_________________________________________________________________

_, RG nº__________________ Org. Exp. __________, responsável legal

por_____________________________________________________________

_____________________________________, RG nº ___________________, Org.

Exp. __________ declaro ter sido informado e concordo com a participação, como

voluntário, no projeto de pesquisa acima descrito.

Goiânia, _____ de ____________ de _______

___________________________________________________ Nome e assinatura do paciente ou seu responsável legal

______________________________________________________ Nome e assinatura do responsável por obter o consentimento

Assinatura Dactiloscópica :

81

ANEXO II – Parecer do Comitê de Ética Institucional

82

83

ANEXO III - Formulário de Preenchimento de Dados de Pacientes

Avaliação clínica e molecular, estilo de vida e hábitos alimentares de pacientes

com nefropatia diabética.

ENTREVISTA

INICIAIS: ________________ Data ________________ Nº ___________ DADOS PESSOAIS:

Nome: _______________________________________________________________ Data de nascimento:____/____/____ Idade: _____ Sexo:______________ Documento de Identidade:_____________________ Org. Exp. ___________ CPF: ________________ Profissão: _______________________________ Estado Civil: ______________________ Endereço:

_______________________________________________________________

Bairro: _____________________ Cidade: _____________ Estado: _______

CEP: _______________ Telefone: _______________ Celular: ____________ Naturalidade: _______________________ Nacionalidade: _______________ DADOS CLÍNICOS: Pressão Arterial: __________________ Classificação: _________________

Valores de Referência

Sistólica mmHg Diastólica mmHg

Ideal <120 <80

Alterada <130 <85

Hipertensão acima de 140 acima de 90 Anotações relevantes:

___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

_______________________________________________________

84

Exames Clínicos: (obtidos pelo médico colaborador)

Exames clínicos Resultados Valores Referência

Glicose 70 - 99 mg/dL Triglicérides até 150 mg/dL

Colesterol desejável até 200 mg/dL

limítrofe 200 - 239

elevado acima 230 mg / dL HDL Acima de 50mg/dL

LDL inferior a 130 mg /dL

limítrofe 130-160 mg / dL

elevado acima 160 mg/dL

VLDL 2 a 35 mg/dL Hemoglobina Glicada 4.0 a 6.0 %

TGO Masculino: até 37 U/L

Feminino: até 31 U/L

TGP Masculino: até 41 U/L

Feminino: até 31 U/L Creatinina Masculino: 0,7 a 1,3 mg/dL

Feminino: 0,6 a 1,1 mg/dL Peso Corporal : ______________ Classificação IMC: __________________ Cálculo de Índice de Massa Corporal: IMC = __peso (Kg) altura 2

Questões a serem questionadas ao paciente (feitas pelo entrevistador)

1. Há quanto tempo é diabético? ______________, ano do diagnóstico_______

2. Possui familiares com diabetes?

( ) Não ( ) Sim, Qual grau de parentesco? ________________________

Observação: ______________________________________________________________________________________________________________________________

2. Uso de medicamentos

Para pressão arterial: ( ) Não ( ) Sim, qual? ____________________

Quem receitou o medicamento? (especialidade médico)___________________

Há quanto tempo utiliza? ___________________________________________

IMC Classificação Obesidade (grau)

Menor que 18,5

Magreza

0

Entre 18,5 e 24,9

Normal

0

Entre 25,0 e 29,9

Sobrepeso

I

Entre 30,0 e 39,9

Obesidade

II

Maior que 40,0

Obesidade Grave

III

85

Quais outros medicamentos utiliza?

( ) Analgésicos ( ) antibióticos ( ) anti-inflamatórios ( ) outro -

Qual?______________________

Para qual indicação clínica? Por quanto tempo?

___________________________________________________________________

___________________________________________________________

3. É fumante? ( ) Sim ( ) Não Se sim, por quanto tempo? _________

Já fumou?

( ) Sim ( ) Não

Se sim, por quanto tempo fumou?______________

Há quanto tempo parou de fumar?____________

4. Faz uso de bebida alcoólica? ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ____________

Se sim, qual a frequência? ( )Diariamente ( )Socialmente ( ) Ocasionalmente

5. Possuía alguma doença antes do diagnóstico de diabetes? ( ) Sim ( ) Não Qual (is)? ______________________________ 6. Consumo de água. Quantos copos bebe de água diariamente? ___________

Possui alguma disfunção renal? ( ) sim ( ) não

Qual? ____________________ Há quanto tempo? ______________________

7.Utiliza algum sapato especial?

( ) sim ( ) não

Se sim, qual motivo? ______________________________________________

8. Hábitos alimentares.

Foi indicado a fazer dieta alimentar pelo médico? ( ) sim ( ) não Achou dificuldade em fazer a dieta alimentar ? ( ) sim ( ) não

por quê?________________________________________________________

9. Atividade física

Fazia atividade física antes do diagnóstico de diabetes? ( ) sim ( ) não

Qual? _____________________ Há quanto tempo? _____________________

Faz atividade física atualmente? ( ) sim ( ) não

86

Qual? __________________ Periodicidade? ___________________________

Só começou a fazer atividade física depois do diagnóstico? ( ) sim ( ) não

Foi recomendado pelo médico? ( ) sim ( ) não

Anotações Relevantes:

___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________________

___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________________

Data, ___________________ Local de Coleta:__________________________

Nome do Responsável pelo preenchimento do questionário e assinatura:

_______________________________________________________________

DADOS MOLECULARES (Análise no laboratório)

Polimorfismo Genótipo PCR em tempo real

GSTM1

GSTT1

87

ANEXO IV - Formulário de Preenchimento de Dados de Controles

Avaliação clínica e molecular, estilo de vida e hábitos alimentares de

indivíduos do grupo controle.

ENTREVISTA

INICIAIS: ________________ Data ________________ Nº ___________ DADOS PESSOAIS:

Nome: _______________________________________________________________ Data de nascimento:____/____/____ Idade: _____ Sexo:______________ Documento de Identidade:_____________________ Org. Exp. ___________ CPF: ________________ Profissão: _______________________________ Estado Civil: ______________________ Endereço:

_______________________________________________________________

Bairro: _____________________ Cidade: _____________ Estado: _______

CEP: _______________ Telefone: _______________ Celular: ____________ Naturalidade: _______________________ Nacionalidade: _______________ DADOS CLÍNICOS: Pressão Arterial: __________________ Classificação: _________________

Valores de Referência

Sistólica mmHg Diastólica mmHg

Ideal <120 <80

Alterada <130 <85

Hipertensão acima de 140 acima de 90

88

Exames Clínicos: (obtidos pelo médico colaborador)

Exames clínicos Resultados Valores Referência

Glicose 70 - 99 mg/dL Triglicérides até 150 mg/dL

Colesterol desejável até 200 mg/dL

limítrofe 200 - 239

elevado acima 230 mg / dL HDL Acima de 50mg/dL

LDL inferior a 130 mg /dL

limítrofe 130-160 mg / dL

elevado acima 160 mg/dL

VLDL 2 a 35 mg/dL Hemoglobina Glicada 4.0 a 6.0 %

TGO Masculino: até 37 U/L

Feminino: até 31 U/L

TGP Masculino: até 41 U/L

Feminino: até 31 U/L Creatinina Masculino: 0,7 a 1,3 mg/dL

Feminino: 0,6 a 1,1 mg/dL Peso Corporal : ______________ Classificação IMC: __________________ Cálculo de Índice de Massa Corporal: IMC = __peso (Kg) altura 2

Questões a serem questionadas ao paciente (feitas pelo entrevistador)

1. Há quanto tempo é diabético? ______________, ano do diagnóstico_______

2. Possui familiares com diabetes?

( ) Não ( ) Sim, Qual grau de parentesco? ________________________

Observação: ______________________________________________________________________________________________________________________________

2. Uso de medicamentos

Para pressão arterial: ( ) Não ( ) Sim, qual? ____________________

Quem receitou o medicamento? (especialidade médico)___________________

Há quanto tempo utiliza? ___________________________________________

IMC Classificação Obesidade (grau)

Menor que 18,5

Magreza

0

Entre 18,5 e 24,9

Normal

0

Entre 25,0 e 29,9

Sobrepeso

I

Entre 30,0 e 39,9

Obesidade

II

Maior que 40,0

Obesidade Grave

III

89

Quais outros medicamentos utiliza?

( ) Analgésicos ( ) antibióticos ( ) anti-inflamatórios ( ) outro -

Qual?______________________

Para qual indicação clínica? Por quanto tempo?

___________________________________________________________________

___________________________________________________________

3. É fumante? ( ) Sim ( ) Não Se sim, por quanto tempo? _________

Já fumou?

( ) Sim ( ) Não

Se sim, por quanto tempo fumou?______________

Há quanto tempo parou de fumar?____________

4. Faz uso de bebida alcoólica? ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ____________

Se sim, qual a frequência? ( )Diariamente ( )Socialmente ( ) Ocasionalmente

5. Possuía alguma doença antes do diagnóstico de diabetes? ( ) Sim ( ) Não Qual (is)? ______________________________ 6. Consumo de água. Quantos copos bebe de água diariamente? ___________

Possui alguma disfunção renal? ( ) sim ( ) não

Qual? ____________________ Há quanto tempo? ______________________

7.Utiliza algum sapato especial?

( ) sim ( ) não

Se sim, qual motivo? ______________________________________________

8. Hábitos alimentares.

Consumo Quantidade Tipo Período

Doces

Carnes

Legumes e verduras

Frutas

Carboidratos e derivados

Outros (quais?)

Foi indicado a fazer dieta alimentar pelo médico? ( ) sim ( ) não Achou dificuldade em fazer a dieta alimentar ? ( ) sim ( ) não

por quê?________________________________________________________

Período: todos os dias =1 ; 1 a 3 vezes semana =2 4 a 6 vezes semana = 3 não consome = 4

90

9. Atividade física

Fazia atividade física antes do diagnóstico de diabetes? ( ) sim ( ) não

Qual? _____________________ Há quanto tempo? _____________________

Faz atividade física atualmente? ( ) sim ( ) não

Qual? __________________ Periodicidade? ___________________________

Só começou a fazer atividade física depois do diagnóstico? ( ) sim ( ) não

Foi recomendado pelo médico? ( ) sim ( ) não

Anotações Relevantes:

___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________________

___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

_______________________________________________________

_______________________________________________________________

Data, ___________________ Local de Coleta:__________________________

Nome do Responsável pelo preenchimento do questionário e assinatura:

_______________________________________________________________

DADOS MOLECULARES (Análise no laboratório)

Polimorfismo Genótipo PCR em tempo real

GSTM1

GSTT1

91

ANEXO V – Carta de submissão do artigo em revista qualis A1