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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

Departamento de Farmácia - Escola de Farmácia

Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas

Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos

Sub-área: Estudo e Desenvolvimento de Medicamentos

DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LIOFILIZADO QUE SE TRANSFORMA EM GEL

NO TRATO GASTRINTESTINAL E PROMOVE A ABSORÇÃO DE INSULINA NA

MUCOSA DO INTESTINO

Thaïs Seixas Certo

Orientador: Prof. Dr. José Mario Barichello

Ouro Preto – Minas Gerais – Brasil

Abril de 2013

THAÏS SEIXAS CERTO

DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LIOFILIZADO QUE SE TRANSFORMA EM GEL NO TRATO GASTRINTESTINAL E PROMOVE A ABSORÇÃO DE INSULINA NA

MUCOSA DO INTESTINO

Ouro Preto – Minas Gerais – Brasil

Abril de 2013

Dissertação, como requisito parcial, para obter o grau de mestre em Ciências Farmacêuticas, submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto. Orientador: Prof. Dr. José Mario Barichello - UFOP

Catalogação: [email protected]

C418d Certo, Thais Seixas.

Desenvolvimento de produto liofilizado que se transforma em gel no trato gastrintestinal e promove a absorção de insulina na mucosa do intestino [manuscrito] / Thais Seixas Certo – 2013.

xi, 77 f.: il. color.; grafs.; tabs. Orientador: Prof. Dr. José Mario Barichello. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Estudos e Desenvolvimento de Medicamentos.

1. Insulina- Teses. 2. Ácidos graxos - Ácido oleico - Teses. 3. Permeação - Agentes promotores - Teses. 4. Desidratação - Teses. 5. Hidratação - Teses. I. Barichello, José Mario. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Título.

CDU: 615.015:612.349

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Este trabalho contou com a colaboração de:

Acurácia Pharmaceutica

Mariana, Minas Gerais

Prof. Dr. Robson José de Cássia Franco Afonso

Laboratório de Cromatografia, Caracterização Molecular e Espectrometria de Massas –

LABMASSAS

DEQUI – ICEB – UFOP

Dedico este trabalho aos meus pais, irmão e amigos

que sempre me apoiaram e incentivaram para a conquista desta titulação

AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus pais por sempre estarem presentes na minha caminhada e apoiarem

minhas escolhas.

Ao meu irmão por ser tão amigo e companheiro.

Aos meus primos Victor, Cássio, Dê, Chris que souberam compreender a falta e foram

companheiros quando presentes.

Aos sempre amigos e conselheiros, Mari, Keilinha, Lidi, Monique e Lucas Mathias, que

compartilharam comigo anseios e conquistas.

Ao Evandro pela cumplicidade e paciência infinita.

Aos parceiros do mestrado Ana Paula Alves, Ana Paula de Battisti, Carol Licio, Karen,

Karime, Lorena, Pollyana, Shiara, Simone, Vanessa e Ricardo, que dividiram dúvidas e

conhecimentos.

Aos companheiros de bancada Débora, Gabriel, Júnia, Lucas Andrade e Mariana de Matos

por contribuírem com a minha aprendizagem.

Ao Leo, a Pati e a Mirela pela disposição em ajudar.

Ao professor Dr. José Mario Barichello, pela oportunidade e confiança depositada para condução

deste trabalho.

Aos professores da pós-graduação, por contribuírem com meu aprimoramento e pelos conselhos.

A todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

À encantadora Ouro Preto pelos dias de sol e pelos nublados também.

A Deus.

“Droit devant soi on ne peut pas aller bien loin”

“Je ne connais qu’une liberté, et c’est la liberté de l’esprit”

vii

RESUMO

O objetivo desse trabalho foi desenvolver um produto liofilizado a partir de soluções aquosas

micelares de Pluronic® F-127 (F127) contendo insulina (INS) e ácido oleico (AO). Espera-se que

este produto liofilizado se transforme em gel no trato gastrintestinal e promova a absorção de INS

na mucosa do intestino. Primeiramente avaliou-se o efeito de diferentes concentrações de F127 e

AO sobre a capacidade das soluções alcançarem o estado gel a 37 °C. O perfil de liberação de INS a

partir das formulações no estado gel foi avaliado in vitro em meio de dissolução tampão fosfato pH

7,4. A partir deste estudo, ajustes nas concentrações de F127 e AO foram feitos e dois produtos

liofilizados foram desenvolvidos. A reidratação do produto liofilizado, bem como, o perfil de

liberação de INS e o tamanho médio das micelas/partículas formadas no meio de dissolução (HCl

0,1M, tampão fosfato pH7,4, solução de sais biliares 0,1 e 1,0%) foram avaliados. Na parte final do

trabalho, cápsulas liofilizadas contendo INS e AO e diferentes concentrações de F127 e sais biliares

(SB) foram desenvolvidas. A reidratação e o perfil de liberação de INS em tampão fosfato pH 7,4 a

partir dos produtos liofilizados foram avaliados. De um modo geral, levando-se em conta o menor

tamanho encontrado para as micelas/partículas nos meios de dissolução contendo SB e uma

liberação da INS mais efetiva de algumas das formulações que as contém, acredita-se que a

presença desses sais, em formulações de F127, juntamente com a presença de ácidos graxos

insaturados são potenciais candidatos à administração de INS por via oral.

Palavras chave: Insulina; Pluronic F-127; Transição sol-gel; Ácido oleico; Sais biliares; Agentes

promotores de permeação; Liberação in vitro; Liofilização; Reidratação.

viii

ABSTRACT

The purpose of this study was to develop a lyophilized product from aqueous micellar

solutions of Pluronic® F-127 (F127) containing insulin (INS) and oleic acid (OA). This product is

expected to become a gel in the gastrointestinal tract and to promote the INS absorption in the

mucosa of the intestine. Firstly, solutions containing different concentrations of F127 and OA were

prepared, and their ability to reach the gel state at 37 °C was evaluated. The INS release profile of

gelled formulations were evaluated in vitro in phosphate buffer pH 7.4. From this study, adjusts in

the concentration of F127 and OA were done and two lyophilized formulations were developed.

The rehydration of the lyophilized product, as well as the INS release profile and the average size of

the micelles/particles in the dissolution media (HCl 0.1 M, phosphate buffer pH 7,4, bile salts

solution 0,1 and 1,0%) were evaluated. Finally, freeze-dried products containing INS and OA and

different concentrations of F127 and bile salts (BS) were developed. The rehydration and the INS

release profile from the lyophilized products in phosphate buffer pH 7.4 were evaluated. In resume,

considering the smaller size of micelles/particles formed in the dissolution media containing BS and

the most effective INS release from some formulations containing them, it is believed that the

combination of BS and unsaturated fatty acids within F127 formulations are potential candidates for

improving the intestinal absorption of INS orally administered.

Keywords: Insulin; Pluronic F-127; Sol-gel transition; Oleic acid; Bile salts; Permeation enhancing

agents; In vitro release; Lyophilization; Rehydration.

ix

SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

AO Ácido Oleico

Cols. Colaboradores

Conc. Concentração

D1 Diabetes tipo 1

D2 Diabetes tipo 2

EHL Equilíbrio hidrófilo – lipófilo

F127 Pluronic® F-127

F. Bras. V Farmacopeia Brasileira 5ª edição

FDA Food and Drugs Administration/Administração Federal de Alimentos e

Medicamentos

HCl Ácido Clorídrico

IDF International Diabetes Federation / Federação Internacional de Diabetes

INS Insulina

NaOH Hidróxido de Sódio

OE Óxido de etileno

OP Óxido de propileno

P12AO2 P representa o Pluronic® F-127 e AO o Ácido oleico, e o número seguinte à

abreviação significa a porcentagem p/p na formulação

P12SB1 P representa o Pluronic® F-127 e SB os Sais Biliares, e o número seguinte à

abreviação significa a porcentagem p/p na formulação

SB Sais Biliares

TF D, L - α – tocoferol

TGI Trato gastrointestinal

USP United States Pharmacopeia / Farmacopeia dos Estados Unidos

VO Via oral

VSC Via subcutânea

x

ÍNDICE DE TABELAS

Página

Tabela 1 Início e duração de ação aproximados das insulinas humanas e análogos

(Adaptado de Wannmacher, 2005)

20

Tabela 2 Formulações desenvolvidas, quantidades de seus constituintes e capacidade

de gelificação a 37 ºC

35

Tabela 3 P valor definido estatisticamente para avaliar a existência de diferença

significativa entre as médias de liberação de INS de cada formulação gel

39

Tabela 4 Equações das retas (Y) de regressão linear e respectivos coeficientes de

determinação (R²), definidos a partir do perfil de liberação total de insulina

após seis horas de ensaio

39

Tabela 5 Formulações desenvolvidas e variações de seus constituintes 42

Tabela 6 Meios de reidratação avaliados e os respectivos valores de pH 45

Tabela 7 Tamanho médio das micelas/partículas e índice de polidispersão obtidos a

partir da dissolução das cápsulas liofilizadas de P12AO2 e P16AO2 em

diferentes meios

54

Tabela 8 Formulações desenvolvidas e suas composições 59

xi

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Análogos de Insulina. Mudança na sequência dos aminoácidos -

Adaptadas de Hirch, 2005; Pavlic-Renar e cols., 2003 (PIRES; CHACRA,

2008).

21

Figura 2. Estrutura química do Ácido Oleico 25

Figura 3. Estrutura química básica dos sais biliares colato (R = OH) e deoxicolato

(R = H)

26

Figura 4. Copolímero em bloco Pluronic® F-127 – dois blocos hidrófilos de óxido

de etileno e um bloco hidrofóbico de oxido de propileno (KABANOV et

al. 2002, adaptado em Chem Draw, 2004)

26

Figura 5. Representação esquemática dos mecanismos de associação do Pluronic®

F-127 em água (DUMORTIER et al., 2006)

27

Figura 6. Representação esquemática do preparo das formulações 30

Figura 7. Representação esquemática do procedimento utilizado no estudo de

liberação da INS

31

Figura 8. Solução de F127 a 15% em tampão fosfato pH 7,4 a 4 °C 33

Figura 9. Adição e dispersão de tocoferol na solução de F127 a 15%: (A) TF sobre

a solução de F127; (B) dispersão do TF sob agitação magnética

moderada, (C) aspecto final após completa dispersão do TF

33

Figura 10. Adição e dispersão do ácido oleico na solução de F127 a 15% contendo

tocoferol. (A) película de ácido oleico sobre a solução de F127; (B)

dispersão do ácido oleico em banho de gelo (4 ºC) e, (C) aspecto da

dispersão na temperatura de 37° C quando o estado gel é alcançado

34

Figura 11. Aspecto final da formulação de F127 a 15% contendo tocoferol, ácido

oleico e insulina no estado gel a 37 °C

34

Figura 12. Cromatograma de um padrão de INS 36

Figura 13. Curva analítica utilizada no método de quantificação de INS 36

Figura 14. Perfil de quantificação da insulina a partir de tampão fosfato pH 7,4 em

diferentes tempos (média das amostras ± desvio padrão)

37

Figura 15. Perfis de insulina liberada a partir das formulações P12AO3 e P12AO5

(média das amostras ± desvio padrão)

37

xii

Página

Figura 16. Perfil de insulina liberada a partir das formulações P15AO5 e P15AO3

(média das amostras ± desvio padrão)

38

Figura 17. Estudo de reidratação das cápsulas P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em HCl

0,1 M no período de 60 minutos

46

Figura 18. Estudo de reidratação das cápsulas P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em

tampão pH 7,4 no período de 60 minutos

47

Figura 19. Reidratação de cápsulas de P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em diferentes

meios após 40 minutos

49

Figura 20. Quantidade de insulina liberada após duas horas em diferentes meios de

dissolução a partir de cápsulas liofilizadas de P12AO2 (média das

amostras ± desvio padrão)

52

Figura 21. Quantidade de insulina liberada após duas horas em diferentes meios de

dissolução a partir de cápsulas de P16AO2 liofilizadas (média das

amostras ± desvio padrão)

52

Figura 22. Reidratação de várias cápsulas liofilizadas em tampão pH 7,4 após 60

minutos

60

Figura 23. Perfil de liberação da insulina a partir de várias cápsulas liofilizadas em

tampão fosfato pH 7,4 (média ± desvio padrão)

61

SUMÁRIO Página

RESUMO vii

ABSTRACT viii

SÍMBOLOS E ABREVIATURAS ix

ÍNDICE DE TABELAS x

ÍNDICE DE FIGURAS xi

1. INTRODUÇÃO 15

2. OBJETIVOS 18

3. REVISÃO DE LITERATURA 19

CAPÍTULO 1 – DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE FORMULAÇÕES DE

PLURONIC® F-127 CONTENDO INSULINA E ÁCIDO OLÉICO 29

1.1. Material e Métodos 30

1.1.1. Material 30

1.1.2. Preparo das formulações 30

1.1.3. Formulações com capacidade de formar gel a 37°C 31

1.1.4. Estudo in vitro de liberação da INS 31

1.1.5. Quantificação da INS por CLAE/DAD 32

1.1.6. Análise Estatística 32

1.2. Resultados e Discussão 33


1.2.2. Formulações com capacidade de formar gel a 37°C 35

1.2.3. Estudo in vitro de liberação da INS a partir de hidrogéis de F127 e AO 35

1.3. Conclusão 40

CAPÍTULO 2 – LIOFILIZAÇÃO DE CÁPSULAS DE GELATINA CONTENDO

SOLUÇÕES DE F127, INSULINA E ÁCIDO OLÉICO E AVALIAÇÃO DO PRODUTO

LIOFILIZADO 41

2.1. Material e métodos 42

2.1.1. Material 42


2.1.3. Processo de Liofilização 43

2.1.4. Estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas 43

2.1.5. Estudo de liberação da INS in vitro a partir das cápsulas liofilizadas 43

Página

2.1.6. Análise do tamanho médio das micelas/partículas no meio de dissolução 44

2.1.7. Análise estatística 44

2.2. Resultados e discussão 45



2.2.3. Estudo in vitro de liberação da INS a partir das cápsulas liofilizadas 50

2.2.4. Análise de tamanho médio das micelas/partículas no meio de dissolução 53

2.3. Conclusão 56

CAPITULO 3 – LIOFILIZAÇÃO DE CÁPSULAS DE GELATINA CONTENDO SOLUÇÃO

DE F127, INSULINA, ÁCIDO OLÉICO E SAIS BILIARES E AVALIAÇÃO DO PRODUTO

LIOFILIZADO 57

3.1. Material e métodos 58

3.1.1. Material 58


3.1.3. Processo de Liofilização 58


3.1.5. Estudo in vitro de liberação da INS a partir das cápsulas liofilizadas 59

3.1.6. Análise estatística 59

3.2. Resultados e Discussão 60



3.2.3. Estudo in vitro de liberação da INS das cápsulas liofilizadas 61

3.3 Conclusão 63

4. CONCLUSÃO FINAL 64

5. REFERÊNCIAS 66

6. ANEXOS 76

6.1. Publicações 76

15

1. INTRODUÇÃO

A descoberta da insulina (INS) em 1921 promoveu uma revolução no tratamento do Diabetes

tipo 1 (D1). A doença que era considerada fatal tornou-se uma doença metabólica crônica

controlável. As contínuas pesquisas nessa área resultaram na produção de INS humana e no

desenvolvimento de análogos de INS, além do alto grau de pureza das preparações atuais

(CORONHO et al., 2001).

Métodos não invasivos para administração de peptídeos, como a INS, na circulação sistêmica e,

consequentemente, na célula alvo ou órgão têm sido investigados, recebendo considerável atenção

da medicina e da indústria farmacêutica (BARICHELLO et al., 1999a), pois sua administração para

a circulação sistêmica geral promove a exposição de todos os tecidos a uma concentração igual de

INS, o que implica que o fígado receba apenas uma fração da dose injetada e que os músculos e

adipócitos respondam a dose injetada sem que a INS presente na circulação tenha sido monitorada

pelo fígado (SILVA et al., 2003).

Dentre as vias alternativas de administração de INS investigadas encontram-se as vias

pulmonar, oral, transdérmica, nasal, ocular e retal (SANTOS, 2000; OBACH; GUTERRES, 1999).

Entretanto, a VSC ainda continua sendo a principal via usada para o tratamento do D1 e, até o

momento, só a via pulmonar está clinicamente aprovada para substituí-la (SIEKMEIER;

SCHEUCH, 2008).

A administração via oral (VO) de INS seria a mais conveniente para obter a adesão dos

pacientes diabéticos ao tratamento, além de a passagem deste hormônio pelo fígado poder prevenir

ou limitar a hiperinsulinemia sistêmica e suas complicações, bastante comuns na aplicação

subcutânea (LEE, 1991). Porém seu alto peso molecular (~6 KDa) e sua baixa lipofilia são fatores

limitantes que carreiam a uma absorção muito baixa deste hormônio em mucosas. Este processo de

absorção através da mucosa gastrintestinal é dificultado ainda mais pela atividade proteolítica das

enzimas presentes no estômago e no intestino delgado (HOFFMAN; ZIV, 1997).

A administração de INS em mucosas sem o uso de promotores de absorção não produz

nenhuma mudança apreciável nas concentrações de INS no plasma (CALDWELL et al., 1982).

Entretanto o uso de surfactantes e ácidos biliares (ICHIKAWA et al., 1980), salicilatos

(NISHIHATA et al., 1981; LIVERSIDGE; NISHIHATA, 1985), derivados enamínicos

(NISHIHATA et al., 1985) e ácidos graxos insaturados e poli-insaturados (MORISHITA et

al.,1998; SUZUKI et al., 1998) na formulação demonstram aumentar sua absorção.

A classe dos promotores de absorção do tipo ácidos graxos tem a vantagem de serem

compostos endógenos presentes como lipídios da pele humana (LAMPE et al., 1983) e de

biomembranas (FISCHER, 1989), tendo sido também usados como agentes promotores de absorção

16

em sistemas de liberação de fármacos a nível pulmonar (WANG; HANSON, 1988) e intestinal

(MURANISHI, 1997; MORISHITA et al., 1998; SUZUKI et al., 1998). Assim como os sais

biliares (SB), que estão presentes na bile, produzida diariamente pelo fígado (DESSESSO;

JACOBSON, 2001; GUYTON; HALL, 2006) possuem a capacidade de emulsificar e solubilizar

fármacos hidrofóbicos e afetar a transferência dos hidrofílicos, melhorando sua biodisponibilidade

(MIKOV et al, 2006; CHUN et al., 2012).

A utilização de ácidos graxos insaturados, tais como ácido oleico (AO) e linoleico, como

promotores de absorção intestinal de INS em emulsões do tipo A/O/A foi demonstrado por

Morishita e cols. (1998). E os SB foram usados em estudos para aumentar a absorção da INS em

formulações a serem aplicadas via nasal (GORDON et al., 1985; DUCHATEAU et al., 1986).

Neste contexto, um sistema polimérico de interesse são os géis aquosos termo reversíveis de

Pluronic® F-127 (F127). F127 é um tensoativo não iônico cujas soluções aquosas a 20% ou mais

são líquidos micelares a baixas temperaturas, as quais se transformam em géis semirrígidos com o

aumento da temperatura acima de 25ºC (SCHMOLKA, 1991).

Sistemas poliméricos de F127 têm sido usados na liberação de fármacos para uso oftálmico

(MILLER; DONAVAN, 1982; DESAI; BLANCHARD, 1998), retal (CHOI et al.,1998; YONG et

al., 2006), parenteral (KATAKAM et al., 1997; BARICHELLO et al., 1999b, LIU et al., 2007),

transdérmico (LEE et al., 1997; SHIN et al., 1999; PILLAI; PANCHAGNULA, 2003) e nasal

(PISAL et al., 2004). F127 também tem sido usado como veículo na liberação controlada de anti-

inflamatórios (SHARMA; BHATIA, 2004), vancomicina (VEYRIES et al., 1999), lidocaína

(CHEN-CHOW; FRANK, 1981; PAAVOLA et al., 1998; RICCI et al., 2005), propanolol

(PANDIT; WANG, 1998), ceftiofur (ZHANG et al., 2002), interleucina-2 (JOHNSTON et al.,

1992), urease (PEC et al., 1992), deslorelina e GnRH (JAMES et al., 2002), hirudina recombinante

(LIU et al., 2007) e paclitaxel (NIE et al., 2011).

Estas peculiaridades do F127 combinadas às características dos ácidos graxos insaturados e

poli-insaturados resultaram num marcante efeito hipoglicêmico de INS após administração retal

(BARICHELLO et al., 1999a) e bucal (MORISHITA et al., 2001) em ratos normais, e o perfil de

liberação de INS in vitro foi reduzido (MORISHITA et al., 2001), indicando potencialidade para

tornarem-se formulações enterais de INS. Ainda, recentemente descobriu-se que a adição de ácidos

graxos, como o AO, induz a gelificação de soluções de F127 contendo menos de 20% de polímero.

Outro estudo de interesse foi o realizado por Mesiha e cols. (2002) em que formulações de

quilo artificial, contendo ácido palmítico, diferentes sais biliares e INS, foram preparadas e

administradas oralmente em coelhos. Os resultados demonstraram que a combinação de ácido

palmítico e SB promoveram maior absorção de INS, sendo o deoxicolato e o colato, os sais que

promoveram maior efeito hipoglicêmico.

17

Com base nesta descoberta e a partir dos resultados obtidos em que AO e SB interferem no

processo de liberação de INS e na absorção pela mucosa é possível desenvolver novas formulações

destes componentes em diferentes proporções, onde os agentes promotores de absorção interfiram

na liberação e absorção de INS. Os resultados encontrados podem levar a novas perspectivas para

testes farmacológicos de formulações que contenham INS, F127, AO e SB.

18

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivos gerais

O objetivo desta pesquisa foi desenvolver um produto liofilizado de INS a partir de soluções de

F127 contendo AO para administração oral.

2.2 Os objetivos específicos

• Desenvolver soluções de F127 contendo INS e AO;

• Avaliar o perfil de liberação de INS em tampão fosfato pH 7,4 a partir do estado gel de

formulações contendo diferentes conc. de F127 e AO;

• Desenvolver o produto liofilizado a partir de soluções de F127 contendo INS e AO;

• Avaliar a reidratação dos produtos liofilizados em diferentes meios de dissolução;

• Avaliar o perfil de liberação de INS a partir dos produtos liofilizados em diferentes

meios de dissolução;

• Avaliar o tamanho médio das micelas/partículas formadas nos meios de dissolução após

o processo de liberação da INS;

• Desenvolver produto liofilizado a partir de soluções de F127 contendo INS, AO e SB;

• Avaliar a reidratação dos produtos liofilizados em meio de dissolução tampão fosfato

pH 7,4;

• Avaliar o perfil de liberação de INS a partir dos produtos liofilizados em meio de

dissolução tampão fosfato pH 7,4.

19

3. REVISÃO DE LITERATURA

O diabetes é atualmente um problema importante de saúde pública tanto em países

desenvolvidos quanto em países em desenvolvimento. Os indivíduos portadores de diabetes no

Brasil correspondem a 9,7% da população nacional, sendo esse valor uma estimativa, já que o

diagnóstico requer exame de sangue, o que dificulta a realização de inquéritos. Mundialmente, a

prevalência é de 8,3% e 50% das pessoas com diabetes não são diagnosticadas (IDF, 2012).

Há estimativas de que, em 2030, a doença acometerá 12,3% da população brasileira, estando o

país entre os dez do mundo com a maior prevalência da doença em pessoas com idade entre 20 e 79

anos (WILD et al., 2004; SCHIMIDT et al., 2009; WHITING et al., 2011). Projeções globais

preveem um aumento de 51% da prevalência de diabetes na população mundial de 2011 até 2030

(IDF, 2012).

O diabetes é um dos principais causadores da insuficiência renal (25%) e cegueira no adulto

(28%), lidera as amputações (35%) e a impotência sexual, e constitui a causa mais frequente de

doenças crônicas na infância, estando associada, ainda, a arteriosclerose acelerada, a dislipidemia e

a doenças cardiovasculares. A grande maioria dos casos de diabetes pertence a duas categorias

patogenéticas, o diabetes tipo 1 (D1) e o diabetes tipo 2 (D2). O D1 apresenta deficiência absoluta

de INS, sendo, na grande maioria dos casos, essa deficiência causada por um processo autoimune.

O D1 compreende cerca de 8 a 10% dos casos de diabetes. Já o D2, que compreende a grande

maioria dos casos, é consequência de resistência insulínica associada à deficiência insulínica

(CORONHO et al., 2001).

Sintetizada e secretada pelas células β das ilhotas de Langerhans, inicialmente como um

precursor de cadeia simples, a INS é um hormônio responsável pela regulação da homeostasia da

glicose, ativando seus sistemas de transporte, sendo fígado, músculo e tecido adiposo os tecidos-

alvos. Suas ações anabólicas incluem estimular a utilização e armazenamento celular de glicose,

aminoácidos e ácidos graxos, enquanto que inibe processos catabólicos como degradação de

glicogênio, lipídeos e proteínas (GOODMAN; GILMAN, 2005).

A quantidade de glicose que pode se difundir para o interior da maioria das células do

organismo na ausência de INS, com exceção das células hepáticas e cerebrais, é muito pequena para

fornecer a porção normalmente necessária para o metabolismo energético. Sabendo-se que a glicose

é o único substrato utilizado pelo cérebro, pela retina e pelo epitélio germinativo das gônadas, a

concentração de glicose sanguínea deve-se manter em um nível suficientemente elevado para supri-

los com a energia requerida e não aumente excessivamente por poder causar desidratação celular,

perda de glicose através da urina, bem como diurese, e lesões em vasos sanguíneos (GUYTON;

HALL, 2006).

20

A descoberta da INS em 1921 promoveu uma revolução no tratamento do D1. A doença que

era considerada fatal tornou-se uma doença metabólica crônica controlável. O sucesso no uso

terapêutico de extratos de pâncreas bovino ocorreu pela primeira vez em 1922. Até 1980, insulinas

de origem animal, extraídas de pâncreas bovino e suíno, compunham as formulações disponíveis

comercialmente. Inicialmente eram muito impuras, causando reações imunológicas e variabilidades

na farmacodinâmica e farmacocinética (BORGOÑO; ZIMMAN, 2012), além de as estruturas

químicas diferirem em relação à INS humana em três e um aminoácidos, respectivamente.

As contínuas pesquisas nessa área resultaram na produção de INS humana recombinante, em

1978, e no desenvolvimento de análogos, desde 1980, além do alto grau de pureza das preparações

atuais (CORONHO et al., 2001; BORGOÑO; ZIMMAN, 2012). Mudanças estruturais na molécula

de INS (inversão, substituição ou adição de aminoácidos – Fig. 1) levaram a alterações

farmacocinéticas como absorção subcutânea mais rápida, mais rápido aumento da insulina

circulante, mais precoce início de resposta hipoglicêmica e menor duração de efeito (Tab. 1)

(WANNMACHER, 2005).

Tabela 1. Início e duração de ação aproximados das insulinas humanas e análogos (Adaptado de Wannmacher, 2005)

Preparação de insulina Início de ação Pico Duração da ação

Regular 30-60 min 2-4 h 6-10 horas

Humana inalável 5-15 min 1-2 h 6-8 horas

NPH/lenta 1-2 h 4-8h 10-20 horas

Lispro/asparte/glulisina 5-15 min 1-2h 4-6 horas

Glargina/detemir 1-2 h pouco pronunciado ~ 24 horas

A duração de ação normal é curta, de 4-8 horas, o que exige 2-4 injeções diárias para um

controle apropriado da doença (CHIEN, 1996; TREHAN; ALI, 1998). Apesar da existência de

formulações de duração prolongada, de 24-36 horas, a administração crônica parenteral causa

efeitos secundários nos locais de injeção, agravados pelo desconforto causado aos doentes, são eles

lipodistrofia, hiperinsulinemia, reações alérgicas e dor (RAMKISSOON-GANORKAR et al., 1999;

GOWTHAMARAJAN; KULKARNI, 2003), além de liberar na circulação sistêmica um excesso de

INS.

21

Figura 1. Análogos de Insulina. Mudança na sequência dos aminoácidos - Adaptadas de Hirsch, 2005; Pavlic-Renar e cols., 2003 (PIRES; CHACRA, 2008)

22

A insulinoterapia tem por objetivo a obtenção de níveis plasmáticos idênticos aos da secreção

fisiológica de indivíduos não diabéticos. As vias de administração parenteral, tais como:

subcutânea, intramuscular e intravenosa têm sido as vias de escolha para sua administração, o que

se traduz num grande inconveniente para o paciente e em algumas complicações associadas ao uso

contínuo e ao grande número de aplicações requeridas. Comparada à secreção fisiológica, a

administração subcutânea difere em dois aspectos importantes: a cinética não reproduz a rápida

elevação e declínio normais da secreção de INS em resposta à ingestão de nutrientes, e a INS

difunde-se na circulação periférica em vez de ser liberada na circulação porta; por conseguinte o

efeito direto da INS secretada sobre os processos metabólicos hepáticos é eliminado (GOODMAN;

GILMAN, 2005).

A secreção de INS é rigorosamente regulada pela interação de nutrientes, hormônios

gastrointestinais, hormônios pancreáticos e neurotransmissores autônomos. Existe também uma

relação recíproca entre as taxas de secreção de INS e glucagon, já que este estimula a

gliconeogênese e aumenta a lipólise e, em contrapartida, limita a taxa de glicólise, auxiliando no

controle da glicemia, além de estimular a liberação somatostatina que pode inibir a secreção de INS

(GOODMAN; GILMAN, 2005).

A INS fisiológica é secretada diretamente para os vasos sanguíneos que a conduzem

imediatamente para a circulação porta-hepática, agindo, portanto, primeiramente no fígado. A INS

não metabolizada passa para a circulação geral, agindo sobre os outros tecidos, principalmente

músculos e adipócitos. Em contraste, a INS injetada por VSC expõe todos os outros tecidos a

concentrações iguais de INS, chegando ao fígado apenas uma fração da dose injetada e fazendo com

que os outros tecidos tenham uma super estimulação, associadas às complicações do diabetes

(SAFFRAN et al., 1997), fracassando o controle glicêmico duradouro em pacientes. Ensaios

clínicos têm demonstrado que um percentual significativo de pacientes deixa de alcançar o controle

glicêmico devido ao não cumprimento das instruções e das inúmeras reações indesejáveis

(PAMNANI, 2008).

Visando maior conforto aos pacientes diabéticos e maior disponibilidade de INS ao fígado a

fim de aproximar do controle glicêmico fisiológico, tem-se procurado desenvolver sistemas de

liberação por outras vias de administração à subcutânea (TREHAN; ALI, 1998). Assim, nos últimos

anos, métodos não invasivos para administração de peptídeos na circulação sistêmica vêm

recebendo considerável atenção da medicina e da indústria farmacêutica (BARICHELLO et al.,

1999a). Dentre as vias mais pesquisadas estão a pulmonar, a oral, a transdérmica, a nasal, a ocular e

a retal (OBACH; GUTERRES, 1999; SANTOS, 2000).

A via pulmonar é, até o momento, a única via aprovada clinicamente para substituir a VSC. A

INS humana inalável é de ação rápida sendo indicada para o uso pré prandial em pacientes

23

portadores de D1 e D2. Muito embora a biodisponibilidade da INS administrada por esta via seja

baixa (apenas 10% da INS via subcutânea) e o tratamento ser significativamente mais oneroso do

que com a INS injetável, tal fato tem sido contrabalançado com a melhor aceitação do tratamento da

INS pela via pulmonar, o que poderia ampliar a extensão do uso da INS por pacientes D2

(reduzindo os custos de produção) e, a longo prazo, as complicações diabéticas, devido a um melhor

controle e prevenção do diabetes (SIEKMEIER; SCHEUCH, 2008).

Os pacientes portadores de D2 geralmente iniciam o tratamento medicamentoso utilizando

hipoglicemiantes orais quando a glicemia não é controlada com dieta e atividade física. Esses

medicamentos podem agir aumentando a secreção de INS ou melhorando sua ação. Classificam-se

em: sulfoniluréias, que estimulam a secreção de INS; biguanidas, que aumentam a sensibilidade à

INS; inibidores da α-glicosidase, que diminuem a digestão de alguns carboidratos; metiglinidas, que

estimulam a secreção de INS; tiazolidinadionas, que aumentam a sensibilidade à INS das células

musculares e adiposas e suprime a gliconeogênese no fígado. Caso a glicemia não seja estabilizada

com a mudança no estilo de vida e a utilização de hipoglicemiantes orais a insulinoterapia é

recomendada (BRASIL, 2009).

A VO de administração seria a mais conveniente para obter a adesão dos pacientes diabéticos a

insulinoterapia, já que a passagem deste hormônio pelo fígado pode prevenir ou limitar a

hiperinsulinemia sistêmica e seus efeitos locais causados pela administração parenteral. Porém, é a

via que apresenta o maior número de dificuldades para o desenvolvimento de formulações, em

função das múltiplas e extensas barreiras à absorção (LEE, 1991).

A biodisponibilidade oral da maioria dos peptídeos e proteínas é menor que 1% (LEE, 1991).

Isso porque as moléculas são clivadas quando em contato com enzimas proteolíticas, pepsinas no

estômago e tripsina, quimotripsina e carboxipeptidases, secretadas pelo pâncreas no lúmen do

intestino delgado (SCHILLING; MITRA, 1991), perdendo a atividade fisiológica. E a camada

epitelial que reveste o TGI possui células rigidamente ligadas, o que impede o transporte

paracelular, além de conter enzimas digestivas e ser recoberta pelo glicocálix, barreiras química e

física, respectivamente, para o transporte de proteínas (CARINO; MATHIOWITZ, 1999).

A INS é uma molécula hidrofílica, portanto possui baixo coeficiente de partição em pH 7,4, e

baixa difusão passiva (<0,2%), em especial no duodeno (SILVA et al., 2003). Em cálculo de limite

superior para a absorção oral de INS, realizado em abordagem teórica por Sinko e cols. (1993),

assumindo-a estável no TGI, a extensão máxima de absorção obtida para o duodeno foi de 1,6% e

para o íleo de 13%. Se a degradação pelas enzimas α-quimotripsina e tripsina fosse considerada, a

extensão da absorção seria inferior ou igual a 1,2%. Portanto, embora a degradação da INS seja um

fator limitante, a permeabilidade intestinal extremamente baixa é o obstáculo principal à

administração oral. O desenvolvimento de uma formulação oral que proporcione biodisponibilidade

24

de 10 a 20% de INS revolucionaria o tratamento do diabetes, mesmo que não substituísse, apenas

complementasse a terapia parenteral (SCHILLING; MITRA, 1990).

Para aumentar a biodisponibilidade oral de fármacos peptídicos, várias estratégias estão sendo

utilizadas, como inibidores das enzimas proteolíticas, promotores da absorção, modificação química

e formulações farmacêuticas específicas, como sistemas de partículas, emulsões, sistemas de

liberação específica e sistemas bioadesivos (PUTNEY, 1999), além dos hidrogéis (NAKAMURA et

al., 2004). Na escolha do método a utilizar, deve-se considerar que os peptídeos são moléculas de

elevada labilidade, que em condições físico-químicas extremas podem sofrer desnaturação ou

agregação com perda da sua atividade (PUTNEY, 1999).

A administração de INS em mucosas sem o uso de promotores de absorção não produz

nenhuma mudança apreciável nas concentrações de INS no plasma (CALDWELL et al., 1982). A

permeabilidade epitelial da mucosa para fármacos peptídicos como a INS tem sido demonstrada

aumentar quando promotores de absorção tais como surfactantes (ICHIKAWA et al., 1980), ácidos

biliares (ICHIKAWA et al., 1980; MIKOV et al., 2006), salicilatos (NISHIHATA et al., 1981;

LIVERSIDGE et al., 1985), derivados enamínicos (NISHIHATA et al., 1985) e ácidos graxos

insaturados e poli-insaturados (MORISHITA et al., 1998; SUZUKI et al., 1998; BARICHELLO et

al., 1999a) são usados.

A classe dos promotores de absorção do tipo ácidos graxos insaturados tem a vantagem de

serem compostos endógenos presentes como lipídios da pele humana (LAMPE et al., 1983) e de

biomembranas (FISCHER, 1989), tendo sido também usados como agentes promotores de absorção

em sistemas de liberação de fármacos a nível pulmonar (WANG; HANSON, 1988) e intestinal

(MURANISHI, 1997; MORISHITA et al., 1998; SUZUKI et al., 1998) por aumentarem a liberdade

motora ou a fluidez da membrana fosfolipídica (GAY et al., 1989; MURANISHI, 1990; WANG et

al., 1994) . A utilização de ácidos graxos insaturados, tais como AO (Fig. 2) e linoleico, como

promotores de absorção intestinal de INS em emulsões do tipo A/O/A foi demonstrado por

Morishita e cols. (1998). Os resultados demonstraram que estes ácidos graxos contidos em

emulsões promoveram uma maior absorção de INS, sendo esta, predominantemente maior no reto

do que no cólon e no íleo. Num trabalho posterior, também usando uma emulsão do tipo A/O/A,

Suzuki e cols. (1998) relataram que ácidos graxos poli-insaturados de cadeias longas, tais como o

ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5) e o ácido docosaexaenoico (DHA, 22:6), foram promotores de

absorção mais efetivos de INS que os ácidos graxos de 18C (AO, linoleico e linolênico). Além

disso, as emulsões contendo DHA, as quais demonstraram um forte efeito hipoglicêmico, causaram

menos dano as membranas do que os outros ácidos graxos insaturados.

25

Figura 2. Estrutura química do Ácido Oleico

Mais recentemente, Morishita e cols. (2000) investigaram in situ em ratos normais, o efeito

farmacológico dose-dependente de INS (0, 10, 25 e 50 UI/Kg) em emulsões A/O/A contendo 2% de

ácidos graxos poli-insaturados (DHA, EPA ou AO). Os resultados, mais uma vez confirmaram que

emulsões A/O/A contendo ácidos graxos poli-insaturados, em especial DHA, tem potencial para

tornarem-se formulações enterais para INS (MORISHITA et al., 2000).

Os SB também são compostos endógenos sintetizados pelas células hepáticas a partir do

colesterol ingerido na dieta ou durante metabolismo de gorduras. Compõem a bile na conc. de 0,06

g/mL, quando armazenada na vesícula biliar, e são secretados diariamente no duodeno na faixa de

750 mL por dia (DESSESSO; JACOBSON, 2001; GUYTON; HALL, 2006) após a alimentação,

através das contrações duodenais e ação de hormônios como gastrina e serina, além da liberação de

colecistocinina (DAVIES et al., 2002). Possuem a capacidade de emulsificar e solubilizar fármacos

hidrofóbicos, melhorando sua biodisponibilidade por aumentar a taxa de dissolução no TGI, e

podem afetar a transferência de fármacos hidrofílicos dissolvidos através da barreira de absorção,

devido a interações entre os sais e a camada de muco nas membranas celulares (MIKOV et al.,

2006; CHUN et al., 2012).

Estudos realizados por Gordon e cols. (1985) e Duchateau e cols. (1986) utilizaram SB para

aumentar a absorção da INS em formulações a serem administradas via nasal. No primeiro trabalho,

obteve-se como resultado que o deoxicolato (Fig. 3) na formulação promove maior absorção de

INS; já no segundo, obteve-se como resultado que o colato (Fig. 3) foi o sal que promoveu maior

absorção da INS por essa via. Ambos os sais, encontravam-se entre os mais hidrofóbicos usados. Os

SB têm sido extensivamente estudados como promotores de permeação de diversos fármacos, a fim

de aumentar a penetração através de várias membranas biológicas, tais como a mucosa bucal

(SHIN; KIM, 2000), intestino (FRICKER et al., 1996) e córneas (MORIMOTO et al., 1987). Como

tensoativos biológicos, os SB, bem como outros surfactantes, podem induzir alterações de

membrana que aumentam sua permeabilidade (MIKOV et al., 2006), sendo o efeito diretamente

proporcional a sua hidrofobicidade (AKARE; MARTINEZ, 2005).

OH

O

26

Figura 3. Estrutura química básica dos sais biliares colato (R = OH) e deoxicolato (R = H)

Visando a administração de fármacos por diversas vias, incluindo a retal, a oftálmica, a tópica,

a injetável e a oral, preparações contendo Pluronic® F-127 (F127) foram estudadas (DUMORTIER

et al., 2006). F127 (Fig. 4) faz parte de uma família de copolímeros anfifílicos introduzidos no final

da década de 1950 que existem no estado sólido, líquido ou pasta, dependendo da porcentagem de

óxido de etileno (OE) e óxido de propileno (OP) que constituem o copolímero (DUMORTIER et

al., 2006). Alguns polímeros desta família são descritos nas farmacopeias americana e europeia

(ROWE et al., 2005) e são apresentados sob as fórmulas comerciais Pluronic®, Synperonic®,

Tetronic®, dentre outras (KABANOV et al., 2002).

Figura 4. Copolímero em bloco Pluronic® F-127 – dois blocos hidrófilos de óxido de etileno e um bloco hidrofóbico de oxido de propileno (KABANOV et al. 2002, adaptado em Chem Draw, 2004)

HO

CH3

R

OHCH3

O-

OH3C

HO

O

O

O H

CH3

100 65 100OE OEOP

27

F127 é um tensoativo não iônico com peso molecular em torno de 12.600 Daltons (TAKÁTS et

al., 2001), o qual é constituído de segmentos de copolímeros de OE e OP sob a fórmula é OE95-105 –

OP54-60 – OE95-105. A 22 °C, seu EHL (equilíbrio hidrófilo-lipófilo) é 22 (KABANOV et al., 2002),

portanto um componente hidrofílico. A Food and Drug Administration (FDA) classificou o F127

como inerte para diversos tipos de preparações, como: intravenosas, soluções orais, suspensões,

inalatórias, oftálmicas e tópicas (ROWE et al., 2005). Uma propriedade importante deste

copolímero é que suas soluções aquosas ≥ 20% são líquidos micelares a baixas temperaturas que se

transformam em géis semirrígidos com o aumento da temperatura acima de 25ºC (SCHMOLKA,

1991). Este fenômeno de transição sol-gel dependente de temperatura deve-se a interações entre

diferentes segmentos do copolímero (DUMORTIER et al., 2006). À medida que a temperatura

aumenta a porção hidrofóbica, OP, das moléculas se agrega em micelas devido à desidratação sendo

circundado pelas porções hidrofílicas, OE (JUHASZ et al., 1989). Uma representação esquemática

deste processo é apresentada na Fig. 5.

Figura 5. Representação esquemática dos mecanismos de associação do Pluronic® F-127 em água (DUMORTIER et al., 2006)

Este fenômeno de transição sol-gel dependente da temperatura possibilita às formulações

serem aplicadas na forma de soluções, transformando-se em um gel semirrígido conforme aquece

com a temperatura do organismo. Outras características importantes destes géis são dar estabilidade

a proteínas e peptídeos incorporados em suas matrizes, com completa recuperação de sua atividade

quando o gel é dissolvido em excesso de solução tampão (STRATTON et al., 1997), e a sua

tendência de aderir a superfícies, tais como, a pele (LEE et al., 1997), e a mucosa do intestino

(CHOI et al., 1998).

Resultados positivos foram encontrados quando formulações contendo F127 e ácido delta-5-

aminolevulínico foram administradas oralmente no tratamento fotodinâmico de lesões no TGI,

devido à boa adesão da formulação ao esôfago e difusão eficiente do fármaco para a mucosa

28

(BOURRE et al., 2002). Uma absorção mais eficiente da INS em géis de F127 por iontoforese foi

observada, tanto ex-vivo quanto in-vivo, quando o ácido linoléico (um ácido graxo insaturado) está

presente na formulação (PILLAI; PANCHAGNULA, 2003).

Estas características peculiares de géis F127 combinadas a ácidos graxos insaturados

resultaram num marcante efeito hipoglicêmico de INS após administração retal (BARICHELLO et

al., 1999a) e bucal (MORISHITA et al., 2001) dos géis em ratos normais. Também foi observado

que o perfil de liberação de INS in vitro de géis F127 foi reduzido na presença de ácidos graxos

insaturados e poli-insaturados (MORISHITA et al., 2001). E em estudo realizado administrando

oralmente soluções contendo ácido palmítico, SB e INS promoveram maior absorção de INS em

coelhos, sendo o deoxicolato e o colato, os sais que promoveram maior efeito hipoglicêmico

(MESIHA et al., 2002).

CAPÍTULO 1

DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE

FORMULAÇÕES DE PLURONIC® F-127

CONTENDO INSULINA E ÁCIDO OLEICO

30

1.1. Material e Métodos

1.1.1. Material Pluronic® F-127 (F127), D,L-α-tocoferol (TF), ácido oleico (AO) e ácido trifluoroacético

foram adquiridos da Sigma Aldrich®, EUA. Dihidrogenofosfato de potássio,

hidrogenofosfatodissódico anidro, acetonitrila grau CLAE e cloreto de sódio (NaCl) foram

adquiridos da Merck®, Alemanha. Ácido clorídrico (HCl) solução titulante foi adquirida da Synth®,

Brasil, e hidróxido de sódio (NaOH) solução titulante foi adquirida da Cromoline®, Brasil. A

insulina humana (INS) foi gentilmente cedida pela Novonordisk®, Brasil.

1.1.2 Preparo das formulações

Uma quantidade precisamente pesada de F127 foi adicionada lentamente a um Becker contendo

tampão fosfato pH 7,4 mantido sob agitação magnética moderada e em banho de gelo (4-8ºC) até

completa dispersão do polímero (BARICHELLO et al., 1999b). A solução foi então mantida em

repouso em geladeira por 12 horas. TF (agente antioxidante) foi adicionado na conc. de 0,06% p/p e

disperso sob agitação vigorosa usando agitador magnético em temperatura ambiente. Após

completa dispersão do TF, adicionou-se o AO, o qual foi disperso sob agitação vigorosa usando

agitador magnético em banho de gelo. A INS (1,0 mg/g de solução) foi dissolvida em 100μL de

HCl 0,1M e incorporada à solução de F127. O HCl foi neutralizado pela adição de 100μL de NaOH

0,1M diretamente à solução de F127. Uma representação esquemática do preparo das formulações

está ilustrada na Fig. 6.

Figura 6. Representação esquemática do preparo das formulações

Adicionar ao Tampão Fosfato pH 7,4:

1º Pluronic F-127

2º D,L -α - tocoferol

3º Ácido Oleico

4º Insulina em HCl 0,1M

5º NaOH 0,1M

31

1.1.3. Formulações com capacidade de formar gel a 37ºC

A capacidade das soluções de F127 formar gel semirrígido foi determinada usando banho-

maria a 37ºC. Transferiu-se para tubos falcon (fundo chato e tampa de rosca) 3,0g das formulações

de F127 contendo INS (1,0 mg/g de gel) e em seguida foram colocados em banho de água a 37ºC

por 10 min. A formulação que não escorresse pela parede do tubo quando invertidas em 90° foi

considerada atingir o estado gel.

1.1.4. Estudo in vitro de liberação da INS

Um modelo de dissolução sem membrana foi usado para os estudos de liberação in vitro

(BARICHELLO et al., 1999c) para as formulações que formaram gel conforme subitem 1.1.3 deste

capítulo. Primeiramente pesou-se 3,0 g de gel contendo INS (1,0 mg/g de gel) em tubos falcon de

fundo chato e estes foram deixados em banho-maria a 37°C (Banho Dubnoff 304D, Nova Ética®,

Brasil) por 10 min. Em seguida, 1,0 mL de tampão fosfato pH 7,4, também a 37°C, foi

discretamente vertido sobre o gel e os tubos recolocados no banho-maria a 37ºC. Os tubos foram

então agitados horizontalmente (100 rpm) e, de hora em hora, o sobrenadante foi completamente

removido. Um mililitro de solução tampão foi recolocado de modo a manter as mesmas condições

por um período de até 6 horas. Os dados de liberação foram expressos como a média ± desvio

padrão. Os ensaios foram realizados em replicata para estimativa do erro experimental.

Figura 7. Representação esquemática do procedimento utilizado no estudo de liberação da INS

32

1.1.5. Quantificação da INS por CLAE/DAD

A quantificação da INS nas amostras obtidas do estudo de liberação foi realizada conforme

descrito anteriormente por Barichello e cols. (1999c) usando cromatografia líquida de alta eficiência

acoplada a detector DAD (CLAE/DAD). O equipamento foi Waters Alliance 2695 acoplado a

detector de Arranjo de Diodos DAD 2996. As análises foram feitas em comprimento de onda de

214 nm (USP35-NF30, 2012). A fase móvel composta de acetonitrila, solução de ácido

trifluoroacético 0,1% e NaCl, na proporção percentual de 69:31:0,58, respectivamente, foi eluída

num fluxo de 1,0 mL/min. em coluna C18 (Phenomenex®, Luna 5µ (2) 100Å 150x4,60mm) à

temperatura de 30 ºC. O volume de injeção da amostra foi fixado em 100 µL.

Para avaliar a linearidade do método analítico utilizado, antes da análise das alíquotas do

estudo de liberação, foram feitas leituras de padrões de INS nas concentrações de 5 até 200 µg/mL.

O preparo se deu a partir da diluição de 2 mg de INS em HCl 0,1M, sendo o volume completado

para 10,0 mL com tampão fosfato pH 7,4, seguido de diluições seriadas.

1.1.6. Análise estatística

O teste não paramétrico de Mann-Whitney foi realizado para avaliar a existência de diferença

significativa entre médias da quantidade cumulada de INS liberada das formulações géis após seis

horas do ensaio de liberação. Adotou-se o intervalo de confiança de 95% e as diferenças foram

consideradas significativas quando P<0,05. O software BioEstat® (2007) foi utilizado na análise

estatística.

33

1.2. Resultados e Discussão

1.2.1. Preparo das formulações

A partir da combinação de diferentes concentrações de F127 e AO foram obtidas oito

formulações (Tabela 2). Nesta etapa não foram avaliadas formulações de F127 a 20%, pois é sabido

que esta é a menor concentração de polímero capaz de formar gel, além de os géis de F127

contendo AO já terem sido avaliados in vitro e in vivo por Barichello e cols. (1999a e 1999b).

As figuras 8, 9, 10 e 11 representam a sequência de preparo da formulação de F127 a 15%. Na

Fig. 8 é possível observar o aspecto visual de uma solução de F127 em tampão fosfato pH 7,4 a

4ºC. Na Fig. 9 está representado o processo de adição e dispersão do TF na solução. Durante o

processo de dispersão de TF, a solução inicialmente adquire um aspecto levemente leitoso (Fig. 9B)

que passa a opalescente após completa dispersão do TF (Fig. 9C).

Figura 8. Solução de F127 a 15% em tampão fosfato pH 7,4 a 4 °C

Figura 9. Adição e dispersão de tocoferol na solução de F127 a 15%: (A) TF sobre a solução de F127; (B) dispersão do TF sob agitação magnética moderada, (C) aspecto final após completa

dispersão do TF

A

B

C

34

Na Fig. 10 está representado o processo de adição e dispersão de 3% de AO na solução de F127

a 15% contendo TF. Nesta etapa, o processo de dispersão do AO é realizado em banho de gelo

(~4ºC). Em poucos minutos a dispersão adquire um aspecto leitoso característica de uma emulsão

óleo em água (O/A) (Fig. 10B). Depois de concluído o processo de dispersão do AO, a transição do

estado sol-gel é alcançada por aquecimento da dispersão a 37 ºC em banho de água (Fig. 10C). A

dispersão passa de leitosa à transparente devido à solubilização do AO disperso nas micelas que são

formadas e darão origem ao estado gel da formulação.

Figura 10. Adição e dispersão do ácido oleico na solução de F127 a 15% contendo tocoferol. (A) película de ácido oleico sobre a solução de F127; (B) dispersão do ácido oleico em banho de gelo

(4ºC) e, (C) aspecto da dispersão na temperatura de 37 °C quando o estado gel é alcançado

A

B

C

Na Fig. 11 está representado o aspecto visual da solução de F127 contendo TF, AO e INS no

estado gel a 37ºC. A insulina é solubilizada em HCl 0,1 M é adicionada a solução de F127 logo

após a dispersão do AO e em banho de gelo (~ 4 ºC). Logo após é feita a neutralização com NaOH

0,1 M.

Figura 11. Aspecto final da formulação de F127 a 15% contendo tocoferol, ácido oleico e insulina no estado gel a 37 °C

35

1.2.2. Formulações com capacidade de formar gel a 37ºC

Na Tabela 2 estão descritas as formulações desenvolvidas, as respectivas quantidades de seus

constituintes e a capacidade destas formulações alcançarem o estado gel a 37 ºC. Todas as

formulações apresentaram-se como uma mistura homogênea e estável sem separação de fases. É

importante salientar que com a redução da conc. de F127 e com o aumento da conc. de AO, as

soluções de F127 apresentaram um aspecto leitoso mais intenso.

Tabela 2. Formulações desenvolvidas, quantidades de seus constituintes e capacidade de gelificação a 37 ºC

Formulação Conc. de F127 (%p/p) Conc. de AO (%p/p) Capacidade de formar gel a 37 ºC

P5AO3 5 3 Não

P5AO5 5 5 Não

P8AO3 8 3 Não

P8AO5 8 5 Não

P12AO3 12 3 Sim

P12AO5 12 5 Sim

P15AO3 15 3 Sim

P15AO5 15 5 Sim

Onde: P e F127 = Pluronic® F127 e AO = ácido oleico

Conforme observado na Tabela 2, soluções de F127 em conc. ≥ a 12% e contendo de 3 a 5% de

AO podem formar gel semirrígido a 37 ºC. É importante salientar que antes da adição de AO,

mesmo a 37 °C, a formulação contendo 12% de F127 permanece líquida e somente após a dição de

AO observa-se a gelificação. Por outro lado, soluções de F127 em conc. ≤ a 8% e contendo de 3 a

5% de AO não tem capacidade de formar gel semirrígido a 37 ºC. É sabido que soluções de F127

em concentrações inferiores a 20% não apresentam a habilidade de formar gel semirrígido em

temperaturas superiores a 25 °C (SCHMOLKA, 1991; JONES et al., 2009). Deste modo, o efeito

do AO na indução de gelificação de soluções de F127 contendo menos de 20% é um resultado

inédito. Entretanto, esta capacidade do AO interferir no processo de gelificação parece ser limitado

a conc. de F127 não inferiores a aproximadamente 12%.

1.2.3. Estudo in vitro de liberação da INS a partir de hidrogéis de F127 e AO

O estudo in vitro de liberação da INS foi realizado em quintuplicata com as formulações que

formaram gel a 37 ºC – P12AO3, P12AO5, P15AO3 e P15AO5 – com o objetivo de avaliar o efeito

36

que as diferentes composições exercem na liberação de INS a partir das formulações géis

desenvolvidas.

A Fig. 12 representa um cromatograma de INS obtido a partir de uma solução padrão. Como

observado, o tempo de retenção nos parâmetros adotados foi próximo de 6 minutos.

Figura 12. Cromatograma de um padrão de INS

A partir das áreas dos picos obtidos pelas diferentes concentrações de padrão fez-se uma

regressão linear e definiu-se a equação da reta, a partir da qual se calculou a quantidade de INS

liberada pelas amostras. Os valores dos coeficientes de correlação linear (r2) das regressões lineares

variaram de 0,9938 a 0,9996, o que nos indica validade da regressão. A Fig. 13 representa uma

curva analítica empregada na quantificação da INS.

Figura 13. Curva analítica utilizada no método de quantificação de INS

A Fig. 14 representa a quantificação de INS solubilizada em tampão fosfato pH 7,4 sob as

mesmas condições experimentais utilizadas no estudo de liberação in vitro. Os resultados indicam

y = 124017x - 152346 R² = 0,9996

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

0 25 50 75 100

Área

Concentração (mg/mL)

37

que não houve comprometimento na quantificação da INS, já que a porcentagem permanece

constante ao longo do tempo.

Figura 14. Perfil de quantificação da insulina a partir de tampão fosfato pH 7,4 em diferentes tempos (média das amostras ± desvio padrão)

A Fig. 15 representa a quantidade cumulada de INS liberada a partir dos géis P12AO3 e

P12AO5 em um período de seis horas. Observou-se que a quantidade cumulada de INS liberada

após seis horas a partir do gel P12AO3 (27,24 ± 2,21%) foi maior comparada a quantidade

cumulada de INS liberada a partir do gel P12AO5 (11,05 ± 1,48%).

Figura 15. Perfis de insulina liberada a partir das formulações P12AO3 e P12AO5 (média das amostras ± desvio padrão)

90

95

100

105

0 1 2 3 4 5 6

Insu

lina

quan

tific

ada

(%)

Tempo (horas)

0

10

20

30

0 1 2 3 4 5 6

Insu

lina

Libe

rada

(%)

Tempo (horas)

P12AO3 P12AO5

38

A Fig. 16 representa a quantidade cumulada de INS liberada a partir dos géis obtidos das

formulações P15AO3 e P15AO5 em um período de seis horas. Os resultados demonstraram que o

gel que possui maior quantidade de AO, P15AO5 (18,62 ± 0,42%), liberou menos INS comparado

ao que possui menor quantidade de AO, P15AO3 (27,78 ± 4,35%).

Figura 16. Perfil de insulina liberada a partir das formulações P15AO5 e P15AO3 (média das amostras ± desvio padrão)

As formulações gelificadas de F127 são constituídas de grande número de micelas e canais

aquosos em que o fármaco incorporado pode ser liberado por: 1) difusão através dos canalículos

aquosos e/ou 2) erosão e dissolução da estrutura da matriz que constitui o gel. Uma maior conc. de

F127 diminui a distância entre as micelas, levando a um número maior de ligações cruzadas entre

os copolímeros vizinhos e em maior número por unidade de volume, diminuindo o calibre e

aumentando a tortuosidade dos canalículos por onde trafegará o fármaco durante sua liberação da

formulação (BHARDWAJ; BLANCHARD, 1996).

Pela análise da INS total liberada a partir de cada formulação observa-se que o efeito do AO de

reduzir a liberação de INS foi mais pronunciado na formulação contendo 12% de F127. Estudos

realizados por Morishita e cols. (2001) mostraram a redução da liberação in vitro de INS a partir de

géis de F127 a 20% contendo ácidos graxos insaturados e poli-insaturados, sendo justificada pela

redução no número e dimensões dos canais aquosos e pelo aumento da viscosidade da formulação,

interferindo nos processos de difusão do fármaco e erosão e dissolução da matriz. A análise

estatística, realizada após transformações matemáticas que demonstraram a não normalidade dos

dados, indicou a existência de diferença significativa (tabela 3) entre as médias da quantidade

cumulada de INS liberada das formulações P12AO3 e P12AO5, P15AO3 e P15AO5 e entre

0

10

20

30

0 1 2 3 4 5 6

Insu

lina

Libe

rada

(%)

Tempo (horas)

P15AO3 P15AO5

39

P12AO5 e P15AO5 após seis horas de ensaio, o que parece indicar que a variação da conc. de AO

influencia a liberação de INS nos ensaios in vitro.

Tabela 3. P valor definido estatisticamente para avaliar a existência de diferença significativa entre as médias de liberação de INS de cada formulação gel

P12AO3 P15AO5

P12AO5 0,0022 0,0411

P15AO3 0,5887 0,0022

Onde: P = Pluronic® F127 e AO = ácido oleico

A Tabela 4 apresenta as equações utilizadas para calcular as linhas de tendência linear e os

coeficientes de determinação a partir da porcentagem total de INS liberada após 6h de ensaio.

Baseado nos resultados obtidos, os coeficientes de determinação indicaram confiabilidade da

tendência e precisão da previsão.

Tabela 4. Equações das retas (Y) de regressão linear e respectivos coeficientes de determinação (R²), definidos a partir do perfil de liberação total de insulina após seis horas de ensaio

INS total liberada (%) Y R²

P12AO3 27,24 A = 4,561x + 0,211 0,999

P12AO5 11,05 A = 1,790x + 1,552 0,926

P15AO3 27,78 A = 4,604x + 0,540 0,998

P15AO5 18,62 A = 3,038x + 0,580 0,997

Onde: P = Pluronic® F127 e AO = ácido oleico

Muito embora a adição de altas concentrações de AO induza a gelificação de soluções contendo

concentrações de F127 inferiores a 20% e reduza a liberação de INS das formulações gel, estudos in

situ realizados por Morishita e cols. (2000) mostraram pequenos danos à mucosa retal e nenhum

dano ao tecido do cólon quando INS em emulsão múltipla A/O/A contendo 2% p/p de AO foi

administrada via retal, confirmando estudos histológicos prévios realizados por Suzuki e cols.

(1998). Deste modo, a conc. de AO a ser utilizada nas formulações deve ser escolhida com

precaução para evitar transtornos que possa limitar o estudo contínuo destas formulações in vitro.

40

1.3. Conclusão

Neste capítulo foi avaliada a influência da adição de AO sobre a capacidade de soluções de

F127 gelificarem em concentrações inferiores a 20% e sobre o perfil de liberação da INS a partir do

estado gel destas formulações. Os resultados obtidos neste estudo indicaram que altas concentrações

de AO (3 e 5%) induzem soluções de F127 contendo concentrações até 12% a gelificarem. O estudo

de liberação de INS a partir das formulações que gelificaram (P12AO3, P12AO5, P15AO3 e

P15AO5) demonstrou que o efeito do AO de reduzir a liberação de INS foi mais pronunciado na

formulação de F127 contendo 12%, e a análise estatística indicou haver diferença significativa entre

as quantidades de INS liberada entre P12AO3 e P12AO5, P15AO3 e P15AO5 e entre P12AO5 e

P15AO5 após seis horas de ensaio.

Como o objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de uma formulação oral que promove a

absorção da INS na mucosa do intestino, a conc. de AO selecionada para os trabalhos posteriores

foi de 2% p/p, visto que os danos à mucosa intestinal, local de liberação e absorção do fármaco,

poderiam comprometer a utilização desta formulação in vivo. Com a alteração na conc. de AO

definiu-se duas concentrações de F127, 12 e 16%. Pressupondo-se que a primeira conc. de F127 não

gelifique e que a segunda conc. de F127 gelifique a 37 °C, o comportamento destas formulações

após liofilização será avaliado.

CAPÍTULO 2

LIOFILIZAÇÃO DE CÁPSULAS DE GELATINA

CONTENDO SOLUÇÃO DE F127, INSULINA E

ÁCIDO OLÉICO E AVALIAÇÃO DO PRODUTO

LIOFILIZADO

42


2.1.1. Material

Pluronic® F-127 (F127), D,L-α-tocoferol (TF), ácido oleico (AO), sais biliares (SB) e ácido

trifluoroacético foram adquiridos da Sigma Aldrich®, EUA. Dihidrogenofosfato de potássio,


adquiridos da Merck®, Alemanha. Ácido clorídrico (HCl) foi adquirido da Synth®, Brasil, hidróxido

de sódio (NaOH) solução titulante foi adquirida da Cromoline®, Brasil, e corante Eritrosina foi

adquirida da Vetec®, Brasil. A insulina humana (INS) foi gentilmente cedida pela Novonordisk®,

Brasil, as cápsulas de gelatina dura (Catalent®, Brasil), tamanho 00, transparentes, foram

gentilmente cedidas pela Acurácia Pharmacêutica®.


As formulações descritas na tabela 5 foram preparadas conforme segue: uma quantidade

precisamente pesada de F127 foi adicionada lentamente a um Becker contendo tampão fosfato pH

7,4 mantido sob agitação magnética moderada e em banho de gelo (4-8 ºC) até completa dispersão

do polímero (BARICHELLO et al., 1999b). A solução foi então mantida em repouso em geladeira

por 12 horas. TF (agente antioxidante) foi adicionado na conc. de 0,06% p/p e disperso sob agitação

vigorosa usando agitador magnético em temperatura ambiente. Após completa dispersão do TF,

adicionou-se o AO, o qual foi disperso sob agitação vigorosa usando agitador magnético em banho

de gelo. INS (1,0 mg/g de solução) foi dissolvida em 100 μL de HCl 0,1 M e incorporada à solução

de F127. O HCl foi neutralizado pela adição de 100 μL de NaOH 0,1 M diretamente à solução de

F127. Quantidade suficiente de corante eritrosina para facilitar registro fotográfico dos ensaios foi

adicionada às formulações. Uma representação esquemática do preparo das formulações foi

ilustrada na Fig. 6. Após preparo, as soluções foram acondicionadas em cápsulas e pesadas. O peso

das cápsulas foi registrado antes e depois do enchimento para determinar a quantidade real de

solução acondicionada. As cápsulas foram então submetidas ao processo de liofilização conforme

descrito no tópico seguinte.

Tabela 5. Formulações desenvolvidas e variações de seus constituintes

Formulação Conc. de F127 (%p/p) Conc. de AO (%p/p)

P12AO2 12 2

P16AO2 16 2

Onde: P e F127= Pluronic® F-127 e AO = ácido oleico

43

2.1.3. Processo de Liofilização

As cápsulas contendo as formulações foram congeladas em Freezer -80 ºC (Forma -86C ULT

Freezer, Thermo Scientific®, Brasil) por um período de 20 minutos. As cápsulas congeladas foram

então transferidas para o liofilizador L101 (Liobrás®, Brasil) e liofilizadas em temperatura de -40°C

sob vácuo por aproximadamente 20 horas, tempo determinado experimentalmente seguindo

procedimento padrão descrito por Rey e May (1999).

2.1.4. Estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas

O estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas foi realizado em tubos falcon de fundo chato

de 12 mL contendo 5,0 mL de meio de reidratação para manter a cápsula totalmente submersa. O

estudo foi realizado em banho Dubnoff 304D (Nova Ética®, Brasil) ajustado a 37 ºC e sob agitação

horizontal constante de 75 rpm (KREYE et al., 2012). Fotos do processo de reidratação foram

tiradas em tempos determinados e comparados entre as formulações e meios testados.

Os meios de reidratação foram escolhidos baseado no Método A utilizado no estudo de

dissolução de formas farmacêuticas de liberação retardada, descrito na Farmacopéia Brasileira 5ª

ed. (F. Bras. V), em que se preconiza a utilização de meio ácido HCl 0,1 M e de tampão pH 6,8, os

quais simulam o faixa de pH do TGI. Optou-se pela utilização de tampão fosfato pH 7,4 ao invés de

tampão pH 6,8 pelo conhecimento prévio de que a INS é solúvel e estável nestas condições

(MORISHITA et al., 2002; MORISHITA et al., 2004; BARICHELLO et al., 1999b). Para

comparação, o processo de reidratação das cápsulas liofilizada também foi avaliado em outros

meios, tais como, água ultrapura e soluções aquosas de sais biliares a 0,1 (SB 0,1%) e 1,0% (SB

1,0%).

2.1.5. Estudo de liberação da INS in vitro a partir das cápsulas liofilizadas

Para o estudo de liberação da INS, cápsulas liofilizadas de pesos conhecidos (aproximadamente

0,8 g de formulação) foram colocadas em tubos falcon de fundo chato de 12 mL contendo 5,0 mL

de meio de dissolução para manter a cápsula totalmente submersa. Os meios utilizados no estudo de

liberação da INS foram os mesmos meios empregados no estudo de reidratação das cápsulas

liofilizadas. As amostras foram mantidas por 2 horas nos meios de dissolução HCl 0,1 M, tampão

fosfato pH 7,4, solução de SB a 0,1% e 1,0% ou água ultrapura. Ao final, uma alíquota de 1 mL foi

retirada e a INS foi quantificada conforme descrito no Capítulo 1, subitem 1.1.5. O estudo de

liberação das amostras foi realizado em triplicata.

44

2.1.6. Análise do tamanho médio das micelas/partículas no meio de dissolução

Para a determinação do tamanho médio das micelas/partículas presentes no meio de dissolução

após o estudo de liberação da INS in vitro, alíquotas forma coletadas ao final do estudo e diluídas

convenientemente com água ultrapura. Estas amostras diluídas foram colocadas em cubetas de

quartzo para leitura no equipamento Nanosizer N5 Submicron Particle Size Analyser (Beckman

Coulter®, EUA). O ângulo de espalhamento incidente foi de 90˚. As leituras foram feitas em

quadruplicatas e a análise com menor coeficiente de difusão foi desprezada. Os tamanhos médios

obtidos foram comparados entre as formulações e meios de dissolução avaliados.


Para avaliar a existência de diferença significativa entre as médias da quantidade de INS

liberada das cápsulas liofilizadas ANOVA simples com comparações múltiplas do Teste de Tukey-

Kramer, para comparar os ensaios realizados nos meios de dissolução HCl 0,1 M, tampão fosfato

pH 7,4, água ultrapura, soluções de SB 0,1 e 1,0%. O intervalo de confiança de 95% foi adotado e

as diferenças foram consideradas significativas quando P< 0,05. Os dados de liberação foram

expressos como a média ± desvio padrão. O software BioEstat® (2007) foi utilizado na avaliação

estatística.

45



Nesta parte do trabalho, a conc. de AO foi reduzida para 2 % baseado nos resultados descritos

por Morishita e cols. (2000), em que pequenos danos à mucosa retal e nenhum dano ao tecido do

cólon foram encontrados quando INS em emulsão múltipla A/O/A contendo 2% p/p de AO foi

administrada via retal.

Por saber que a conc. de polímero na formulação interfere no processo de reidratação

(ANDERSON et al., 2001), as conc. de F127 foram ajustadas com a finalidade de se obter uma

formulação que gelificasse (P16AO2) e outra que não gelificasse (P12AO2) na temperatura de

37ºC. Após a pesagem dentro das cápsulas as formulações apresentaram-se translúcidas quando em

temperatura ambiente e após o processo de liofilização o material apresentou-se como um pó branco

pegajoso.

Na combinação, avaliou-se o comportamento de reidratação e de liberação em diferentes meios

das formulações liofilizadas contendo diferentes concentrações de F127 e a mesma conc. de AO.


Na Tabela 6 estão descritos os meios utilizados no estudo de reidratação e os respectivos

valores de pH (pHmetro PHS-3B, PHtek®, Brasil).

Tabela 6. Meios de reidratação avaliados e os respectivos valores de pH

Solução pH

HCl 0,1 M 0,80

Tampão fosfato pH 7,4 7,40

H2O ultrapura 6,80

SB 0,1 % 6,00

SB 1,0 % 6,30

Na Fig. 17 foram coletadas as fotos que registram o processo de reidratação das cápsulas

liofilizadas P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em meio HCl 0,1 M no período de 60 minutos.

Na Fig. 17A, que apresenta o estudo de reidratação das cápsulas contendo 12% de F127, se

observa decorridos 5 min que o produto liofilizado foi quase todo reidratado dentro da cápsula,

deixando de ser esbranquiçado, como após a liofilização, e começando a apresentar aspecto gel,

sendo que o formato das cápsulas se mantém. Decorridos 15 minutos, são observadas duas massas

transparentes, uma localizada na superfície e outra no fundo do tubo, demonstrando que durante o

46

processo de reidratação do produto liofilizado, o estado gel é alcançado. Após 30 min., o meio de

reidratação se apresenta de forma homogênea caracterizando a completa reidratação/dissolução das

cápsulas liofilizadas, sendo o mesmo estado em que se apresenta o meio de reidratação no tempo de

60 min., ou ao final do estudo.

Figura 17. Estudo de reidratação das cápsulas P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em HCl 0,1 M no período de 60 minutos

A

B

0’ 5’ 15’ 30’ 60’ Tempo (minutos)

Na Fig. 17B, que apresenta o estudo de reidratação das cápsulas contendo 16% de F127,

também foi possível observar parte do produto liofilizado já foi hidratado decorrido 5 min. do início

do ensaio, deixando de ser esbranquiçado, como após a liofilização, e apresentando aspecto gel, mas

a massa hidratada mantém o formato da cápsula. Aos 15 minutos, nota-se que o produto liofilizado

foi quase todo reidratado pelo meio HCl 0,1 M, e que a massa hidratada na forma de cápsulas deu

origem a várias massas menores dispersas na forma de gel no meio de hidratação. Após 30 min.,

ainda é possível notar a presença de bolhas de ar no meio de reidratação, as quais caracterizam a

existência de fragmentos do produto liofilizado reidratado no estado gel. Porém, no tempo de 60

min. não há mais vestígios da presença destes fragmentos neste meio de reidratação, demonstrado

que o estado gel foi completamente desfeito/dissolvido.

O estudo de reidratação é um passo importante para se conhecer as alterações na área de

superfície ocorridas na estrutura do gel de F127 ao ser liofilizado. Afinal, é durante a etapa de

47

congelamento que ocorre a formação dos cristais de gelo responsáveis pelo formato dos poros, pela

distribuição de tamanho dos poros e pela conexão entre as redes de poros da camada seca formada

pela sublimação da água (BOSS et al., 2004). Pela comparação das Fig. 17A e 17B observa-se que

a partir de 5 min. o produto liofilizado de F127 a 12% se reidrata/dissolve mais rapidamente que o

produto liofilizado de F127 a 16% em meio HCl 0,1 M. Estas diferenças foram ainda mais visíveis

após decorridos 15 e 30 min. do início do processo de reidratação, mostrando que a maior conc. de

polímero na formulação propicia uma reidratação mais lenta quando comparada a formulação de

menor conc. Este resultado evidencia que a maior conc. de polímero utilizada na preparação da

solução de F127 gera poros e conexões entre as redes de poros menores que dificultam a hidratação

do pó dentro das cápsulas (BOSS et al., 2004).

Na Fig. 18 foram coletadas as fotos que registram o processo de reidratação das cápsulas

liofilizadas P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em meio tampão pH 7,4 no período de 60 min.

Figura 18. Estudo de reidratação das cápsulas P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em tampão pH 7,4 no período de 60 minutos

Na Fig. 18A é apresentado o estudo de reidratação das cápsulas contendo 12 % de F127.

Decorridos 5 min. do início do estudo se observa que o produto liofilizado contido na cápsula

A

B

0’ 5’ 15’ 30’ 60’ Tempo (minutos)

48

encontra-se parcialmente reidratado, sendo possível visualizar a parte superficial mais translúcida.

Aos 15 min., o produto liofilizado contido na cápsula se encontra mais reidratado, sendo

nitidamente visível a presença de estrutura gel dentro da cápsula. Aos 30 min. se observa a

reidratação quase que completa do produto liofilizado e, de que a massa reidratada está se dividindo

e causando a perda de formato da cápsula. Aos 60 min. se observa a presença de uma pequena

estrutura/massa no estado gel, flutuando no meio de reidratação. Este comportamento comparado ao

observado em meio HCl 0,1 M demonstra uma reidratação mais lenta, que pode estar relacionada ao

pH do meio.

Na Fig. 18B é apresentado o estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas contendo 16 % de

F127. Aos 5 min. se observa que a reidratação do produto liofilizado contido na cápsula acontece de

maneira lenta. Aos 15 min. se observou que a reidratação do produto liofilizado aumentou, mas

ainda é possível visualizar uma massa mais esbranquiçada opaca, indicando que nem todo o

material foi reidratado/gelificado. Aos 30 min. quase todo o conteúdo da cápsula foi reidratado,

sendo observada a flotação da cápsula no meio de reidratação e a perda de formato da cápsula. No

tempo final do estudo (60 min.), o gel encontra-se praticamente dissolvido e observa-se a presença

de uma pequena estrutura/massa no estado gel flutuando no meio de reidratação.

A comparação das figuras 18A e 18B demonstra que o processo de reidratação das cápsulas

liofilizadas contendo 12% e 16% de F127 em meio tampão pH 7,4 se diferem ao longo do tempo

provavelmente devido à diferença de conc. de F127 na formulação, isto é esperado uma vez que

formulações com maior conc. de F127 dissolvem a uma velocidade menor do que as de menor conc.

(ZHOU; CHU, 1987; ZHOU; CHU, 1988; HVIDT et al., 1994; ANDERSON et al., 2001). Porém

ambas as formulações aos 60 min. encontram-se em condições semelhantes, em que se observa uma

pequena massa gelificada ainda não totalmente dissolvida.

A comparação dos resultados apresentados na Fig. 17 com os resultados apresentados na Fig.

18 demonstram claramente que em meio HCl 0,1 M o processo de reidratação ocorre mais

rapidamente do que no meio tampão fosfato pH 7,4. Este comportamento pode estar relacionado ao

ponto isolétrico da gelatina que compõe a cápsula. A gelatina é uma proteína obtida por hidrólise

parcial de colágeno (MOREIRA, 2004) e extraída de forma ácida, tipo A, ou alcalina, tipo B.

Ambos os tipos são cormercializados e possuem ponto isoelétrico diferentes, o primeiro de 7,0~9,0

e o segundo de 4,8~5,2 (MALLMANN, 2010) e é nessa mesma faixa de pH que apresentam a

camada de solvatação menos organizada, portanto menos solúveis. Com base nos valores de pH dos

meios de reidratação testados descritos na Tabela 6, a expectativa é de que a gelatina solubilize com

mais facilidade no meio de reidratação HCl 0,1 M (pH 0,8) do que em meio tampão fosfato pH 7,4,

porque o valor de pH do último está muito próximo dos pontos isoelétricos da gelatina. Desta

forma, pressupôs-se que os meios de reidratação possuem um papel importante não apenas na

49

solubilidade/reidratação dos componentes do produto liofilizado contido nas cápsulas, mas também,

na solubilização/reidratação da gelatina que constitui o invólucro.

Tendo em vista que estas formulações estão sendo desenvolvidas para liberação intestinal da

INS, avaliou-se também o processo de reidratação das cápsulas liofilizadas em meios aquosos

contendo SB nas concentrações de 0,1% e 1,0%. Os resultados deste ensaio foram comparados aos

resultados obtidos em meio HCl 0,1M, tampão pH 7,4 e água ultra purificada.

A Fig. 19 apresenta as fotos do processo de reidratação das cápsulas liofilizadas contendo

P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em diferentes meios após 40 minutos. O estudo de reidratação das

cápsulas liofilizadas contendo F127 a 12% (Fig. 19A) demonstrou que o processo de

reidratação/solubilização do produto liofilizado em água foi semelhante ao meio HCl 0,1 M,

enquanto que no tampão pH 7,4 o processo de reidratação ocorreu mais lentamente. Por outro lado,

nos meios aquosos contendo SB, o processo de reidratação foi caracterizado pelo aparecimento de

uma solução leitosa e pela presença de fragmentos da estrutura gel no meio de reidratação. O

aspecto leitoso foi mais intenso no meio de reidratação contendo SB na conc. de 1%.

Figura 19. Reidratação de cápsulas de P12AO2 (A) e P16AO2 (B) em diferentes meios após 40 minutos

A

B

H2O HCl 0,1 M pH 7,4 SB 0,1% SB 1,0%

50

O estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas contendo F127 a 16% (Fig. 19B) demonstrou

que o processo de reidratação/solubilização do produto liofilizado em água parece ser lento e

semelhante aos meios HCl 0,1 M e tampão pH 7,4. Por outro lado, nos meios contendo SB, o

processo de reidratação foi distinto dos outros meios e dependentes da conc. de SB. No meio

contendo SB a 0,1% foi observado o surgimento de duas fases, sendo a fase inferior com aspecto

gel com uma coloração vermelha opalescente intensa, enquanto a fase superior apresentou um

aspecto leitoso esbranquiçado. No meio contendo SB a 1,0%, o meio de reidratação apresentou um

aspecto opalescente rosado alternado com massas avermelhada com aspecto característico de gel.

Os resultados apresentados na Fig. 19 demonstram claramente que não apenas o pH do meio de

reidratação, mas também a presença de agentes emulsificantes tal como os SB são parâmetros

importantes a serem considerados no processo de reidratação/solubilidade/emulsificação dos

componentes da formulação (MANADAS et al., 2002).

Os SB são compostos emulsificantes presentes no lúmen intestinal, os quais são capazes de

melhorar a biodisponibilidade de fármacos hidrofóbicos por aumentar a taxa de

solubilização/dissolução destes no trato intestinal. Como tensoativos biológicos, podem induzir

alterações de membrana que aumentam a permeabilidade de várias substâncias (MIKOV et al.,

2006). Também podem afetar a transferência de fármacos hidrofílicos dissolvidos no meio através

da barreira de absorção, devido a interações que acontecem entre os sais e a camada de muco nas

membranas celulares (MIKOV et al., 2006; CHUN et al., 2012).

Desta forma, acredita-se que sob agitação suave (75 rpm) e à temperatura de 37 ºC, os SB, por

serem responsáveis pela emulsificação de partículas de gordura in vivo que auxiliam na absorção de

ácidos graxos, monoglicerídeos, colesterol entre outros lipídeos (DAVIES et al., 2002), promovam

a emulsificação do AO disperso no produto liofilizado de F127 contido nas cápsulas, dando um

aspecto leitoso ao meio de reidratação.

2.2.3. Estudo in vitro de liberação da INS a partir das cápsulas liofilizadas

O estudo de liberação in vitro permite avaliar o efeito que a formulação e suas diferentes

composições exercem na liberação da INS, bem como o efeito do meio de liberação, e assim

adequar a formulação ao objetivo de controlar a liberação do fármaco.

A Fig. 20 representa a quantidade de INS liberada no meio de dissolução HCl 0,1 M, tampão

fosfato pH 7,4, solução aquosa de SB 0,1% e 1,0% e água ultrapura a partir das cápsulas liofilizadas

de P12AO2 após duas horas.

Conforme observado na Fig. 20, a liberação de INS a partir da cápsula liofilizada de F127 a

12% foi consideravelmente influenciada pelo meio de dissolução. A presença de SB no meio de

dissolução interferiu significantemente na liberação da INS a partir das formulações, sendo esta

51

liberação menos pronunciada no meio que apresentava a menor conc. de SB (0,1%). Para cápsulas

liofilizadas de P12AO2, a ordem decrescente de liberação de INS nos meios de dissolução testados

foi: tampão pH 7,4 (60,61 ± 8,95%); HCl 0,1 M (58,62 ± 2,92%); água (46,20 ± 4,95%); SB 1,0 %

(33,69 ± 3,94%) e SB 0,1% (15,02 ± 4,04%). A existência de diferença significativa entre as

quantidades de INS liberada nos meios de dissolução, quando houve, está representada no gráfico.

A Fig. 21 representa a quantidade de INS liberada no meio de dissolução HCl 0,1 M, tampão

fosfato pH 7,4, solução aquosa de SB 0,1% e 1,0% e água ultrapura a partir das cápsulas liofilizadas

de P16AO2 após duas horas.

Para cápsulas liofilizadas de F127 a 16% (Fig. 21), a presença de SB no meio de dissolução

também influenciou negativamente a liberação da INS, sendo que a menor conc. de SB testada

promoveu o maior controle de liberação da INS. As cápsulas de P16AO2 também seguiram a

mesma ordem decrescente de liberação de INS descrito para as cápsulas de P12AO2: tampão pH

7,4 (61,53 ± 2,31%); HCl 0,1 M (43,75 ± 8,81%); água (42,19 ± 0,78%); SB 1,0 % (37,98 ± 1,99%)

e SB 0,1% (19,05 ± 1,64%). A existência de diferença significativa entre as quantidades de INS

liberada nos meios de dissolução, quando houve, está representada no gráfico.

A comparação dos resultados descritos nas Figs. 20 e 21 mostra que, em relação ao meio de

dissolução testado, a liberação de INS ocorreu em maior quantidade no meio de dissolução tampão

pH 7,4. Com relação às formulações de cápsulas liofilizadas testadas, a comparação dos resultados

mostra que F127 a 12% liberou mais INS do que F127 a 16% em quase todos os meios, com

exceção dos meios SB 1,0% e tampão pH 7,4.

Estes resultados demonstram que o processo de liofilização e o aumento da área superficial em

contato com o meio de dissolução, mesmo diante da diferença de conc. de F127 nas formulações e

do pH do meio, favoreceu a rápida reidratação das cápsulas e de seu conteúdo, promovendo uma

liberação semelhante entre as formulações (BOSS et al., 2004). Deste modo, a presença de AO

parece não ter interferir na liberação de INS a partir das cápsulas liofilizadas, do mesmo modo que

interferiu na liberação de INS a partir das formulações gel usando o método de dissolução sem

membrana (capítulo 1).

52

Figura 20. Quantidade de insulina liberada após duas horas em diferentes meios de dissolução a partir de cápsulas liofilizadas de P12AO2 (média das amostras ± desvio padrão)

Estatística: Diferença significativa entre os valores médios de INS liberada nos diferentes meios quando comparados a: (§) água purificada (H2O); (*) solução de SB 0,1%; (#) solução de SB 1%; (ŧ) HCl 0,1 M; (ж) pH 7,4.

Figura 21. Quantidade de insulina liberada após duas horas em diferentes meios de dissolução a partir de cápsulas de P16AO2 liofilizadas (média das amostras ± desvio padrão)

Estatística: Diferença significativa entre os valores médios de INS liberada nos diferentes meios quando comparados a: (§) água purificada (H2O); (*) solução de SB 0,1%; (#) solução de SB 1%; (ŧ) HCl 0,1 M; (ж) pH 7,4.

* #

ŧ # § ж

ŧ ж

*

* #

0

20

40

60

80

100

Insu

lina

Libe

rada

(%)

HCl 0,1M SB 0,1% SB 1,0% H2O pH 7,4

* # ж

ŧ § ж

ŧ ж

* ж

ŧ * # §

0

20

40

60

80

100

Insu

lina

Libe

rada

(%)

HCl 0,1M SB 0,1% SB 1,0% H2O pH 7,4

53

Entretanto, no produto liofilizado, esta relação poderá ser alterada em virtude (1) do aumento

da área superficial exposta ao meio de dissolução, (2) da solubilidade da cápsula de gelatina no

meio de dissolução, bem como, (3) da facilidade com que o meio de dissolução penetra pelos

microporos e canalículos formados pela união dos microporos. Como a área superficial das cápsulas

de gelatina é maior que a superior do gel exposta ao meio de dissolução, a liberação da INS a partir

das cápsulas liofilizadas será mais rápida. Com relação à solubilidade da gelatina, esta irá depender

do ponto isoelétrico (tipo A em pH 7,0~9,0 e tipo B em PH 4,8~5,2) da matéria-prima usada na

produção do invólucro, pois nessa mesma faixa de pH apresentará a camada de solvatação menos

organizada, portanto menos solúveis (MOREIRA, 2004; MALLMANN, 2010). Desta forma, meios

de dissolução ácidos acarretarão uma dissolução mais rápida da gelatina do que em meios de

dissolução com pH na faixa do ponto isoelétrico da gelatina.

Dados da literatura indicam que o aumento da conc. de F127 aumenta o tamanho das micelas e

da polidispersão das mesmas, sendo que tais modificações são uma consequência das interações

entre cadeias de polioxietileno de micelas adjacentes, formando unidades multimoleculares

(ATTWOOD et al., 1985). Desta forma, o diâmetro dos microporos e dos canalículos formados

pelos microporos após o processo de liofilização dependerão principalmente da concentração de

F127 utilizada, de modo que quanto maior a conc. de F127, maior será a dificuldade do meio de

reidratação penetrar por canalículos mais estreitos e tortuosos (GILBERT et al., 1986).

Estes fatores podem, no somatório, acelerar a liberação de INS a partir de cápsulas liofilizadas

de tal modo que o aumento na taxa de difusão do fármaco e na taxa de dissolução da estrutura da

matriz liofilizada ou do gel reconstituído possa ofuscar o efeito da conc. de F127, bem como da

presença de AO, os quais foram fundamentados no controle de liberação INS em formulações no

estado gel. Desta maneira, diferença estatisticamente significativa entre as quantidades de INS

liberada a partir das cápsulas liofilizadas de F127 a 12% e 16% só foi observado no meio de

dissolução HCl 0,1 M (P = 0,0022).

2.2.4. Análise do tamanho médio das micelas/partículas no meio de dissolução

Na Tabela 7 são apresentadas as formulações, os meios de dissolução, os tamanhos médios das

micelas/partículas e o índice de polidispersão relativos às amostras coletadas ao final do estudo de

liberação da INS.

Pelo fato de a medida do tamanho ser realizada após o procedimento de dissolução das

cápsulas, diluindo-se uma quantidade do meio em água, é importante salientar que em seu conteúdo

há uma mistura de partículas, tanto das formulações em si – AO, TF, INS, F127 e cápsula de

gelatina – como dos componentes do meio de dissolução – SB – podendo estar separados ou

agregados uns aos outros.

54

Tabela 7. Tamanho médio das micelas/partículas e índice de polidispersão obtidos a partir da

dissolução das cápsulas liofilizadas de P12AO2 e P16AO2 em diferentes meios

Onde: a: tamanho médio das partículas (média + desvio padrão); b: índice de polidispersão (média + desvio padrão), n = 3.

De acordo com a Tabela 7, nota-se que os tamanhos médios das micelas/partículas presente no

meio de dissolução contendo SB 0,1% apresentaram o menor tamanho de partícula. É importante

notar que, o aumento da conc. de SB de 0,1 para 1,0 % no meio de dissolução aumentou o tamanho

médio das micelas/partículas das cápsulas liofilizadas de P12AO2 em mais de 8x e das cápsulas

liofilizadas de P16AO2 em mais de 6x. De um modo geral, o tamanho médio das micelas/partículas

observado nos meios de dissolução das cápsulas P12AO2 foram maiores do que para as cápsulas

P16AO2, sendo que ambas as formulações seguiram a ordem crescente SB 0,1%, água, SB 1,0% e

HCl 0,1 M. Para uma discussão mais completa, seria necessário o tamanho médio das

partículas/micelas em meio de dissolução tampão pH 7,4, porém problemas de ordem técnica

impediram a análise.

O tamanho das partículas/micelas é um fator inerente à permeação em membranas biológicas

(MÄLKIÄ et al., 2004). Morishita e cols. (2004) observaram que quanto menor a micropartícula de

uma matriz polímerica carreadora de INS melhor a adesão à mucosa do intestino, devido ao

aumento da área de contato e proteção contra degradação enzimática, e melhor é sua absorção no

intestino delgado, aumentando a biodisponibilidade e o efeito hipoglicêmico.

Acredita-se que a presença de SB no meio de liberação tenha auxiliado na emulsificação do

AO, levando a formação de pequenas vesículas/micelas mistas. Um mecanismo complexo e

subjacente à ação das micelas mistas envolve a redução da integridade da membrana, a facilitação

do transporte transcelular e o aumento da difusão das junções paracelulares, por aumento dos poros

da membrana intestinal e dissociação oligomérica da INS (SILVA et al., 2003).

Cápsula Meio de dissolução

Tamanho médio da partícula a (nm)

Índice de Polidispersão b

P12AO2

H2O 98,23 + 26,09 1,16 + 0,36

HCl 0,1 M 1151,77 + 146,76 1,60 + 0,22

SB 0,1% 63,93 + 3,20 0,98 + 0,04

SB 1,0% 514,45 + 53,81 1,09 + 0,10

P16AO2

H2O 38,9 0 + 1,57 0,96 + 0,22

HCl 0,1 M 713,55 + 2,89 1,38 + 0,11

SB 0,1% 41,15 + 3,86 0,96 + 0,07

SB 1,0% 252,00 + 94,46 1,75 + 0,36

55

Neste sentido, baseado nos resultados descritos e em estudos realizados previamente onde: 1) a

permeabilidade epitelial da mucosa, para fármacos peptídicos como a INS, foi demonstrada

aumentar quando promotores de absorção como ácidos graxos são utilizados (MORISHITA et al.,

1998; SUZUKI et al. 1998; BARICHELLO et al., 1999a); 2) que a adição de SB à formulação

aumenta a permeabilidade intestinal, oral, transdérmica, ocular, nasal, retal e pulmonar (MIKOV et

al., 2006) e, 3) que o efeito hipoglicêmico da INS foi demonstrado melhorar quando SB e ácidos

graxos são combinados (MESIHA et al., 1994; MESIHA et al., 2002), propôs-se estudar o efeito da

adição de SB às formulações estudadas neste capitulo por meio do estudo de reidratação e de

liberação da INS in vitro a partir de cápsulas liofilizadas.

56

2.3. Conclusão

Neste capítulo foram desenvolvidas duas formulações de F127 contendo INS e AO e avaliada a

influência do processo de liofilização sobre a reidratação do produto liofilizado, o perfil de

liberação de INS e o tamanho médio das micelas/partículas formadas no meio, utilizando diferentes

meios de dissolução.

Os resultados indicaram que a liofilização de cápsulas contendo F127, AO e INS nas

concentrações de 12 ou 16% interfere nos processos de reidratação, e consequentemente, de

liberação, pois foi durante a etapa de congelamento que ocorreu a formação de cristais de gelo

responsáveis pelo formato dos poros, pela distribuição de tamanho dos poros e pela conexão entre

as redes de poros da camada seca formada pela sublimação da água, que modificou a superfície de

contato do pó dentro das cápsulas e interferiu na hidratação.

Em relação aos meios de dissolução foi observado que o pH pode interferir no processo de

dissolução do invólucro de gelatina e, por conseguinte, interferir na velocidade de reidratação do

produto liofilizado, sendo que em pHs próximos do ponto isoelétrico, a gelatina apresenta a camada

de solvatação menos organizada, portanto menos solúveis, retardando o processo de reidratação do

produto.

A adição de agente emulsificante tal como SB, mimetizando condições do trato intestinal, não

apenas resultou em uma redução da liberação de INS das formulações liofilizadas contendo 12 e

16% de F127, como também proporcionou a formação de micelas/partículas de tamanho menor no

meio de dissolução, o qual pode ser um fator decisivo na permeação da INS através da membrana

do intestino.

Deste modo, a partir dos resultados descritos neste capítulo surgiu a ideia de desenvolver uma

formulação liofilizada contendo SB para estudo de reidratação e liberação in vitro de INS.

CAPÍTULO 3

LIOFILIZAÇÃO DE CÁPSULAS DE GELATINA

CONTENDO SOLUÇÃO DE F127, INSULINA,

ÁCIDO OLEICO E SAIS BILIARES E AVALIAÇÃO

DO PRODUTO LIOFILIZADO

58


3.1.1. Material

Pluronic® F-127 (F127), D,L-α-tocoferol (TF), ácido oleico (AO), sais biliares (SB) e ácido

trifluoroacético foram adquiridos da Sigma Aldrich®, EUA. Dihidrogenofosfato de potássio,


adquiridos da Merck®, Alemanha. Ácido clorídrico (HCl) foi adquirido da Synth®, Brasil, hidróxido

de sódio (NaOH) solução titulante foi adquirida da Cromoline®, Brasil, e corante Eritrosina foi

adquirida da Vetec®, Brasil. A insulina humana (INS) foi gentilmente cedida pela Novonordisk®,

Brasil, as cápsulas de gelatina dura (Catalent®, Brasil), tamanho 00, transparentes, foram

gentilmente cedidas pela Acurácia Pharmacêutica®.


As formulações descritas na Tabela 10 foram preparadas conforme segue: uma quantidade

precisamente pesada de F127 foi adicionada lentamente a um Becker contendo tampão fosfato pH

7,4 mantido sob agitação magnética moderada e em banho de gelo (4-8 ºC) até completa dispersão

do polímero (BARICHELLO et al., 1999b). A solução foi então mantida em repouso em geladeira

por 12 horas. TF (agente antioxidante) foi adicionado na conc. de 0,06% p/p e disperso sob agitação

vigorosa usando agitador magnético em temperatura ambiente. Após completa dispersão do TF, os

SB foram adicionados na conc. de 1,0% p/p até completa solubilização. O AO foi adicionado na

sequência na conc. de 2% p/p e disperso sob agitação vigorosa usando agitador magnético em

banho de gelo. A INS (1,0 mg/g de solução) foi dissolvida em 100 μL de HCl 0,1 M e incorporada à

solução de F127. O HCl foi neutralizado pela adição de 100 μL de NaOH 0,1 M diretamente à

solução de F127. Quantidade suficiente de corante eritrosina para facilitar registro fotográfico dos

ensaios foi adicionada as formulações. Uma representação esquemática do preparo das formulações

foi apresentada na Fig. 5. Após preparo, as soluções foram acondicionadas em cápsulas e pesadas.

O peso das cápsulas foi registrado antes e depois do enchimento para determinar a quantidade real

de solução acondicionada. As cápsulas foram então submetidas ao processo de liofilização

conforme descrito abaixo. Na Tabela 10 estão descritas as formulações e suas composições.

3.1.3. Processo de Liofilização

As cápsulas contendo as formulações foram congeladas em Freezer -80 ºC (Forma -86C ULT

Freezer, Thermo Scientific®, Brasil) por um período de 20 minutos. As cápsulas congeladas foram

então transferidas para o liofilizador L101 (Liobrás®, Brasil) e liofilizadas em temperatura de -40°C

59

sob vácuo por aproximadamente 20 horas, tempo determinado experimentalmente seguindo

procedimento padrão descrito por Rey e May (1999).

Tabela 8. Formulações desenvolvidas e suas composições

Formulação Conc. de F-127(%p/p) Conc. de SB (%p/p)

P12SB0 12 0

P16SB0 16 0

P20SB0 20 0

P12SB1 12 1

P16SB1 16 1

P20SB1 20 1

Onde: P ou F127 = Pluronic® F127 e SB = Sais Biliares


O estudo de reidratação das cápsulas liofilizadas foi realizado em tubos falcon de fundo chato

de 12 mL contendo 5,0 mL de meio de reidratação para manter a cápsula totalmente submersa. O

meio reidratação utilizado foi tampão pH 7,4. O estudo foi realizado em banho Dubnoff 304D

(Nova Ética®, Brasil) ajustado a 37 ºC e sob agitação horizontal constante de 75 rpm (KREYE et

al., 2012). Fotos do processo de reidratação foram tiradas aos 60 minutos e comparadas entre as

formulações.


Para o estudo de liberação da INS, cápsulas liofilizadas de pesos conhecidos (aproximadamente

0,8 g de formulação) foram colocadas em tubos falcon de fundo chato de 12 mL contendo 5,0 mL

de meio de dissolução para manter a cápsula totalmente submersa. As amostras foram mantidas por

uma hora no meio de dissolução tampão fosfato pH 7,4. Ao final, uma alíquota de 1 mL foi retirada

e a INS foi quantificada conforme descrito no Capítulo 1, subitem 1.1.5. O estudo de liberação das

cápsulas liofilizadas foi realizado em triplicata.


O Teste t de Student não pareado foi realizado para avaliar a existência de diferença

significativa entre médias da quantidade cumulada de INS liberada das cápsulas liofilizadas após 1

hora do ensaio de liberação. Adotou-se o intervalo de confiança de 95% e as diferenças foram

consideradas significativas para P< 0,05. Os dados de liberação foram expressos como a média ±

desvio padrão. O software BioEstat® (2007) foi utilizado na análise estatística.

60



Assim como as formulações preparadas no capítulo 1, os géis obtidos a partir de P12SB0,

P16SB0 e P20SB0 são soluções micelares fluidas em temperaturas entre 4 e 8 °C, aumentando a

viscosidade com o aumento da temperatura até gelificação acima de 25 °C, e a coloração altera de

opaca à translúcida conforme incorporação do AO ao F127 com o aumento da temperatura.

As formulações contendo SB – P12SB1, P16SB1 e P20SB1 – são mais viscosas em

temperaturas entre 4 e 8 °C quando comparadas às formulações que não os contém, mas com o

aumento da temperatura acima de 25 °C a consistência do gel é menos rígida, sendo que a

opacidade não diminui acentuadamente.

Todas as formulações preparadas neste capítulo, após a liofilização, apresentaram o mesmo

aspecto: pó branco e pegajoso. E foram submetidas ao estudo de reidratação e liberação em tampão

pH 7,4.


A figura 22 representa o processo de reidratação das cápsulas liofilizadas em tampão pH 7,4

após 60 minutos.

Figura 22. Reidratação de várias cápsulas liofilizadas em tampão pH 7,4 após 60 minutos

P12SB0 P12SB1 P16SB0 P16SB1 P20SB0 P20SB1

Na fig. 22 é possível observar que as cápsulas liofilizadas contendo F127 a 12% e 16% sem SB

reidrataram/solubilizaram quase que por completo em meio tampão pH 7,4 após 60 min, não sendo

visualizada a presença de fragmentos no estado gel. Já as cápsulas liofilizadas contendo F127 a 20%

encontram-se em estado de reidratação, sendo observado um grande fragmento na forma gel com

pontos esbranquiçados no seu interior, indicando que nem todo o material foi reidratado. Uma

61

possível explicação seria a de que os canalículos formados na maior conc. de F127 são pequenos, e

a água, ao penetrá-los, promove a hidratação das cadeias de polietileno responsáveis pela formação

do estado gel. Se o estado gel é alcançado, o diâmetro destes canalículos irá diminuir, reduzindo

ainda mais o fluxo de água para o interior da cápsula, retardando assim o processo de reidratação do

pó na área mais central da cápsula.

Por outro lado, a reidratação das cápsulas liofilizadas contendo SB parece ocorrer mais

lentamente sendo observada a presença de material ainda não reidratado em todas as concentrações

de F127 avaliadas. Na fig. 22 se observa que o tamanho da massa não reidratada/gelificada presente

foi proporcional e independente da conc. de F127 presente. Esta observação pode ser um indicativo

de que nas cápsulas liofilizadas contendo SB o processo de reidratação envolva outros mecanismos

além da conc. de F127 presente na formulação.


O estudo de liberação foi realizado em meio de dissolução tampão fosfato pH 7,4, escolhido

por solubilizar a INS e mantê-la estável (MORISHITA et al., 2002; MORISHITA et al., 2004;

BARICHELLO et al., 1999b). Pode-se observar o efeito da conc. de F127 na taxa de liberação de

INS, como nos ensaios de liberação realizados nos capítulos 1 deste trabalho, e a interferência da

presença de SB na formulação liofilizada.

A Fig. 23 apresenta os perfis de liberação da INS a partir de várias cápsulas liofilizadas em

tampão fosfato pH 7,4.

Figura 23. Perfil de liberação da insulina a partir de várias cápsulas liofilizadas em tampão fosfato pH 7,4 (média ± desvio padrão)

Estatística: Diferença significativa entre os valores médios de INS liberada nos diferentes meios quando comparados a: (*) P12SB0; (#) P12SB1; (ж) P16SB1; (ŧ) P20SB0; (§) P20SB1.

ŧ

∞ ŧ

∞ ŧ

* # ж ∞

ŧ

0

20

40

60

80

100

Insu

lina

Libe

rada

(%)

P12SB0 P12SB1 P16SB0 P16SB1 P20SB0 P20SB1

62

Hecht e Hoffmann (1994) relataram que um surfactante iônico como o lauril sulfato de sódio

pode suprimir a formação de micelas de F127. Mais recentemente, este fenômeno também foi

observado em presença de sais biliares (TORCELLO-GÓMEZ et al., 2013). Deste modo, a

quantidade expressiva de INS liberada a partir das cápsulas liofilizadas contendo F127 a 20% e SB,

pode ter ocorrido via supressão da capacidade de micelização das moléculas de F127 que

constituem a parede dos microporos e dos canalículos formados pela união dos microporos,

tornando o mecanismo de liberação da INS independente da conc. de F127. A não formação de

micelas também pode ter influenciado na menor reidratação das formulações contendo SB (fig. 22),

afinal isso contribui com a desorganização das moléculas no sistema micelar ,o que dificulta a

permeação de água para o interior do produto liofilizado.

Estas observações estão em acordo com os resultados do estudo de reidratação destas

formulações mencionadas no subitem anterior, visto que nem todas se encontravam no mesmo

estado de reidratação após 40 min. Do contrário, a liberação de INS a partir das cápsulas liofilizadas

sem SB será regido pela viscosidade do sistema, sendo o coeficiente de difusão do fármaco

inversamente proporcional a conc. de F127 presente nas formulações (PANDIT; WANG, 1998).

Os métodos de reidratação e liberação para as formulações preparadas neste capítulo se diferem

apenas em relação ao tempo definido para registro das fotos (40 min) e amostragem para

quantificação (60 min), pois durante os ensaios de reidratação observou-se que aos 40 min as

formulações contendo ou não SB apresentavam-se em diferentes estágios de reidratação e ao final

dos 60 min apresentavam-se pouco mais reidratadas. As formulações sem SB apresentavam-se com

aspecto gel e a parte inferior do tubo apresentava-se um pouco mais densa, devido a hidratação,

gelificação e dispersão do produto liofilizado, enquanto que as formulações contendo SB observa-se

a cápsula praticamente reidratada, mas parte do produto liofilizado ainda íntegro no fundo do tubo,

sendo a parte externa translúcida, indicando a reidratação, enquanto a parte interna ainda opaca,

indicando que ainda não está totalmente reidratada.

Esperava-se que com a menor reidratação observada, a quantidade de INS liberada fosse

inferior a partir das formulações contendo SB em relação às formulações que não contêm. Porém a

não formação de micelas indicou que a INS estava, em sua maioria, livre no meio de dissolução, por

isso observa-se uma maior liberação a partir das formulações que contêm SB.

63

3.3. Conclusão

Neste capítulo foram desenvolvidas cápsulas liofilizadas contendo INS e AO e diferentes

concentrações de F127 e SB, e avaliada a influência do processo de liofilização e da conc. de SB e

F127 sobre a reidratação do produto liofilizado e o perfil de liberação de INS em tampão fosfato pH

7,4.

Os resultados indicaram que a presença de SB retardou o processo de reidratação das cápsulas

liofilizadas contendo 12 e 16% de F127 comparado às cápsulas liofilizadas de mesma conc. de F127

que não continha SB, o que pode ser um indicativo de que outros mecanismos, além do efeito da

conc. de F127, podem estar operando no processo de reidratação das cápsulas liofilizadas contendo

SB.

Em relação ao perfil de liberação de INS em meio tampão fosfato pH 7,4 foi observado que a

presença de SB na formulação acelerou o processo de liberação de INS a partir das cápsulas

liofilizada contendo F127 a 20%, tornando o mecanismo de liberação de INS independente da conc.

de F127.

Levando-se em conta o menor tamanho encontrado para as micelas/partículas nos meios de

dissolução contendo SB e uma liberação da INS mais efetiva de algumas das formulações que as

contém, acredita-se que a presença desses sais, em formulações de P407, juntamente com a

presença de ácidos graxos insaturados são potenciais candidatos à administração de INS por via

oral.

64

4. CONCLUSÃO FINAL

Neste estudo foram avaliadas: a influência da adição de AO sobre a capacidade de soluções de

F127 gelificarem em concentrações inferiores a 20% e sobre o perfil de liberação da INS a partir

destas formulações em estado gel; a influência do processo de liofilização de soluções de F127,

contendo AO e INS, que gelificam ou não, sobre a reidratação do produto liofilizado, o perfil de

liberação de INS e o tamanho médio das micelas/partículas formadas no meio, utilizando diferentes

meios de dissolução; e a influência da adição de SB às formulações de F127 contendo AO e INS,

sobre a reidratação do produto liofilizado e o perfil de liberação de INS em tampão fosfato pH 7,4.

Os resultados obtidos indicaram que altas concentrações de AO (3 e 5%) induzem soluções de

F127 contendo concentrações até 12% a gelificarem. O estudo de liberação de INS a partir das

formulações que gelificaram (P12AO3, P12AO5, P15AO3 e P15AO5) demonstrou que o efeito do

AO de reduzir a liberação de INS foi mais pronunciado na formulação de F127 contendo 12%.

Como o principal objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de uma formulação oral que

promove a absorção da INS na mucosa do intestino, a conc. de AO selecionada para os estudos

seguintes foi de 2% p/p, visto que os danos à mucosa intestinal, local de liberação e absorção do

fármaco, poderiam comprometer a utilização desta formulação in vivo. Com a alteração na conc. de

AO definiu-se duas concentrações de F127, 12 e 16%.

A liofilização de cápsulas contendo F127, AO e INS nas concentrações de 12 ou 16% interfere

nos processos de reidratação, e consequentemente, de liberação, pois foi durante a etapa de

congelamento que ocorreu a formação de cristais de gelo responsáveis pelo formato dos poros, pela

distribuição de tamanho dos poros e pela conexão entre as redes de poros da camada seca formada

pela sublimação da água, que modificou a superfície de contato do pó dentro das cápsulas e

interferiu na hidratação.

Em relação aos meios de dissolução foi observado que o pH pode interferir no processo de

dissolução do invólucro de gelatina e, por conseguinte, interferir na velocidade de reidratação do

produto liofilizado, sendo que em pHs próximos do ponto isoelétrico, a gelatina apresenta a camada

de solvatação menos organizada, portanto menos solúveis, retardando o processo de reidratação do

produto; e a adição de agente emulsificante tal como SB, mimetizando condições do trato intestinal,

não apenas resultou em uma redução da liberação de INS das formulações liofilizadas contendo 12

e 16% de F127, como também proporcionou a formação de micelas/partículas de tamanho menor

no meio de dissolução, o qual pode ser um fator decisivo na permeação da INS através da

membrana do intestino.

A partir destes resultados desenvolveu-se uma formulação liofilizada contendo SB para estudo

de reidratação e liberação in vitro de INS.

65

A presença de SB retardou o processo de reidratação das cápsulas liofilizadas contendo 12 e

16% de F127 comparado às cápsulas liofilizadas de mesma conc. de F127 que não continha SB, o

que pode ser um indicativo de que outros mecanismos, além do efeito da conc. de F127, podem

estar operando no processo de reidratação das cápsulas liofilizadas contendo SB.

Em relação ao perfil de liberação de INS em meio tampão fosfato pH 7,4 foi observado que a

presença de SB na formulação acelerou o processo de liberação de INS a partir das cápsulas

liofilizada contendo F127 a 20%, tornando o mecanismo de liberação de INS independente da conc.

de F127.

Levando-se em conta o menor tamanho encontrado para as micelas/partículas nos meios de

dissolução contendo SB e uma liberação da INS mais efetiva de algumas das formulações que as

contém, acredita-se que a presença desses sais, em formulações de F127, juntamente com a

presença de ácidos graxos insaturados são potenciais candidatos à administração de INS por via

oral.

66

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76

6. ANEXOS

6.1. Publicações

• SALVE, Débora A. K.; FARIA, Kenia C. S. ; CERTO, Thaïs S.; BARICHELLO, José M.

“AVALIAÇÃO DO EFEITO DE ADITIVO FARMACÊUTICO NA LIBERAÇÃO DE

INSULINA DE GÉIS DE POLOXAMERO 407”, apresentado no XIX Seminário de Iniciação

Científica – UFOP, realizado de 09 a 11 de novembro de 2011, em Ouro Preto, MG, Brasil.

• CERTO, Thaïs S.; SALVE, Débora A. K.; GOMES, Helena M.; FARIA, Kenia C. S.;

OLIVEIRA, Júnia G.; BERTOL, Charise D.; GUGEL, Luciana; LORENCETI, Geanine,

BORGHETTI, Greice S.; SOARES, Luiz A. L.; BARICHELLO, José M.“EFEITO DO ACIDO

OLEICO NA TRANSIÇÃO SOL-GEL DE SOLUÇÕES DE PLURONIC F-127”, no I Simpósio

Farmacêutico – Ensino, Pesquisa e Inovação, realizado de 30 de outubro a 3 de novembro de

2011, em Juiz de Fora, MG, Brasil.

• Júnia Graziela Oliveira; Débora Aiko Kurane de Salve; Thaïs Seixas Certo; Ana Paula de

Battisti Ribeiro; Gabriel Silva Marques Borges. “DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO

LIOFILIZADO PARA ADMINISTRAÇÃO ORAL DA INSULINA NO TRATAMENTO DO

DIABETES” apresentado na 64ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira para o Progresso da

Ciência, realizado de 22 a 27 de julho de 2012, em São Luís do Maranhão, MA, Brasil.

• FERREIRA, Lucas A.; CERTO, T. S.; BORGES, Gabriel S. M.; SANTOS, Gabriela O.;

BARICHELLO, José M. “ESTUDO DA FLUORESCÊNCIA DE HIDROGÉIS MICELARES

DE POLOXAMERO 407 PARA USO NO TRATAMENTO DA LEISHMANIOSE

TEGUMENTAR” apresentado à 1ª Semana de Ciências Farmacêuticas, CCA-UFES, realizado

de 29 de agosto a 1º de setembro de 2012, em Alegre, ES, Brasil.

• Thaïs Seixas Certo; Júnia Graziela Oliveira; Lucas Andrade Ferreira, Gabriel Silva Marques

Borges; Charise D. Bertol; GeanineLorenceti, Greice S. Borghetti; Luiz A. L. Soares; José M.

Barichello. “EFFECT OF OLEIC ACID ON THE RELATIVE GEL VISCOSITY OF

SOLUTIONS OF PLUNORIC® F-127”, no V Simpósio Internacional de Pós Graduação e

Pesquisa - SINPOSPq, realizado de 12 a 14 de setembro de 2012, em Ribeirão Preto, SP,

Brasil.

• SANTOS, Gabriela O.; BARICHELLO, José M.; CERTO; Thaïs S.; GOMES, Helena M.;

BORGES, Gabriel S. M.; ANDRADE, Lucas F.; OLIVEIRA, Júnia G.

“DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA CLAE/UV PARA

DETERMINAÇÃO DO ÁCIDO OLÉICO EM CÁPSULAS CONTENDO PRODUTO

LIOFILIZADO DE INSULINA PARA O TRATAMENTO DO DIABETES”, apresentado no

XX Seminário de Iniciação Científica – UFOP, realizado de 07 a 09 de novembro de 2012, em

Ouro Preto, MG, Brasil .

77

• OLIVEIRA, Júnia G.; CERTO, Thaïs S.; MATOS, Mariana B.; BARICHELLO, José M.;

BORGES, Garbriel S. M.; FERRREIRA, Lucas A. “AVALIAÇÃO DO EFEITO DE SAIS

BILIARES NA RECONSTITUIÇÃO DE PRODUTO LIOFILIZADO DE INSULINA”,

apresentado no XX Seminário de Iniciação Científica – UFOP, realizado de 07 a 09 de

novembro de 2012, em Ouro Preto, MG, Brasil.

• SANTOS, Gabriela O.; BARICHELLO, José M.; CERTO; BORGES, Gabriel S. M.;

ANDRADE, Lucas F.; Thaïs S.; GOMES, Helena M.; OLIVEIRA, Júnia G.

“DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO LIOFILIZADO QUE SE TRANSFORMA EM GEL

NO TRATO GASTRINTESTINAL E PROMOVE A ABSORÇÃO DE INSULINA NA

MUCOSA DO INTESTINO”, apresentado no XX Seminário de Iniciação Científica – UFOP,

realizado de 07 a 09 de novembro de 2012, em Ouro Preto, MG, Brasil.

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