UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE … · L73e Lino, Juliana Arcanjo Efeito protetor da amifostina na neuropatia sensitiva periférica experimental induzida por oxaliplatina

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

JULIANA ARCANJO LINO

EFEITO PROTETOR DA AMIFOSTINA NA NEUROPATIA SENSITIVA

PERIFÉRICA EXPERIMENTAL INDUZIDA POR OXALIPLATINA

FORTALEZA

2011




Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Farmacologia.

Orientador:

Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro

Co-orientadora:

Profa. Dra. Mariana Lima Vale

FORTALEZA

2011

L73e Lino, Ju liana Arcanjo

Efeito protetor da amifostina na neuropatia sensitiva periférica experimental induzida por oxalip latina / Juliana Arcanjo Lino. – Fortaleza, 2011.

133 f. : il.

Orientador: Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará. Programa de

Pós-Graduação em Farmacologia; Fortaleza-Ce, 2011.

1. Quimioterapia 2. Doenças do Sistema Nervoso Periférico 3.

Amifostina I. Ribeiro, Ronaldo de Albuquerque (Orient.) II. Título.

CDD: 615.58




Essa dissertação foi submetida como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre em Farmacologia, outorgado pela Universidade Federal do Ceará e encontra-se à disposição dos interessados na Biblioteca setorial da referida Universidade.

Data da aprovação: / /

BANCA EXAMINADORA

_________________________________________________

Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro (Orientador) Universidade Federal do Ceará (UFC)

________________________________________________

Prof. Dr. Thiago Mattar Cunha Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo (FMRP - USP)

________________________________________________

Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade Cunha Universidade Federal do Ceará (UFC)

Ao meu querido esposo Alberto, meu eterno companheiro, pelo amor, apoio e incentivo na concretização deste sonho, e pela paciência e compreensão nos momentos mais difíceis.

Aos meus pais, exemplos de força e dedicação, bases da minha educação, que semearam e cuidaram com atenção e carinho do meu crescimento pessoal e profissional.

Aos meus irmãos, Sara, Carolina e João André, que sempre estiveram ao meu lado e contribuíram com sua amizade e carinho.

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer primeiramente a Deus pelo dom da ciência e da sabedoria, e por sempre me iluminar em minhas grandes decisões; Meus sinceros agradecimentos ao Professor Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro, pela grande oportunidade oferecida, por ter acreditado em meu potencial e pela disponibilidade e orientação prestada; Agradeço a Professora Dra. Mariana Lima Vale, pela disponibilidade e pelos ensinamentos valiosos, tornando possível a realização desta pesquisa; À Professora Dra. Gerly Anne de Castro Brito, por sua colaboração nas leituras histológicas deste estudo; Ao corpo docente do curso de Pós-Graduação do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, pela formação e incentivo; Ao Professor Dr. Thiago Mattar Cunha, pela valiosa contribuição do desenvolvimento dessa pesquisa; Às técnicas de laboratório Tiara, Carol, Socorro e, em especial à Vandinha, pela presteza em sempre ajudar nos procedimentos experimentais da pesquisa; Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia Armando, Haroldo, Fernando, Carlos, Alana, Ana Paula e Márcia pela organização e manutenção do departamento; À Aura Rhanes, secretária da Pós-Graduação, pelas orientações acadêmicas e pela assistência prestada em todos os momentos; Aos amigos do LAFICA, especialmente Karoline Sabóia, Lívia Talita, Antoniella Gomes, Danielle Foschetti, Roberto César, Deysi Viviana, Caio Abner, Ana Paula Macêdo, Isabel Azevedo, Rosemayre Freire, Sabrina Carneiro, Pedro Soares, Renata Leitão, André Luiz, Jand-Venes Rolim e Larisse Luceti, pela amizade e companheirismo; À Natália Bitú, pelos ensinamentos e orientações na preparação para ingressar no mestrado; Aos alunos de iniciação científica Flávio, Aclerton, Ricardo e Anamaria, pela participação e colaboração em várias etapas do desenvolvimento dessa pesquisa;

À Renata Bessa, pela disponibilidade em compartilhar suas experiências e pela grande amizade conquistada ao longo desta caminhada; À amiga Adriana Lima pela valiosa amizade, carinho e atenção, e por se fazer sempre presente, mesmo quando ausente; Sou grata à amiga Denize Rousane, por sua disposição e responsabilidade em assumir alguns de meus compromissos, permitindo a realização desta pesquisa; Aos meus sogros Adiléa Maria e Alberto Furtado; aos meus cunhados Daniel, Heládio, Débora, Airton, Germana, André, Emanuel e Vívian; e aos meus sobrinhos, Rachel e Matheus, pela adorável convivência e pela compreensão nos momentos em que estive ausente; Aos meus queridos pais, João Lino e Ana Catarina, que me deram não somente a vida, mas principalmente a minha educação e condições de estudo; Aos meus irmãos Sara, Carolina e João André por sempre torcerem pelo meu sucesso; Ao meu esposo Alberto, amigo e confidente, por sempre acreditar em meus sonhos e me apoiar na concretização dos mesmos; Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq, pelo apoio financeiro durante os anos de curso.

A todos, meus sinceros votos de agradecimento.

“Os que esperam no Senhor renovarão as suas forças,

subirão com asas como águias, correrão e não se cansarão,

caminharão e não se fatigarão.”

(Isaías 40:31)

RESUMO

Efeito protetor da amifostina na neuropatia sensitiva periférica experimental induzida por oxaliplatina. Autora: Juliana Arcanjo Lino. Mestrado em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará. Defesa: 11 de março de 2011. Orientador: Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro. Co-orientadora: Profa. Dra. Mariana Lima Vale.

Oxaliplatina (OXL) é um agente platínico de 3ª geração com potente atividade citotóxica em diversos cânceres. Tem como toxicidade limitante uma neuropatia sensitiva periférica (NSP) de início agudo, tornando-se crônica com doses cumulativas. Amifostina (AMF) é um agente antioxidante de largo espectro, que vem sendo atualmente estudado na citoproteção dos efeitos adversos da radioterapia e quimioterapia do câncer. Esta pesquisa objetivou avaliar o efeito da AMF sobre a hiperalgesia mecânica plantar e alodinia térmica, assim como sobre as alterações histopatológicas e imunoexpressão de marcadores, tais como a proteína c-Fos, caspase 3, IL-1, nitrotirosina, NOSi, NOSn e NMDA, observadas na NSP experimental induzida por OXL. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal do Ceará, com o protocolo 27/08. Camundongos Swiss machos (25-35g) foram tratados com OXL (1mg/kg, i.v.) e pré-tratados com AMF (1, 5, 25, 50 ou 100mg/kg, s.c.) por 4,5 semanas, paralelamente aos testes nociceptivos. A alodínia térmica foi avaliada pelo teste de imersão da cauda em água fria (10ºC) e a hiperalgesia mecânica plantar pelo teste do Von Frey Eletrônico. Foi realizada a análise histopatológica e imunohistoquímica de amostras obtidas do corno dorsal da medula espinhal lombar dos animais em 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. Demonstrou-se que a OXL diminuiu significativamente o limiar nociceptivo mecânico e térmico, a partir do 21º dia (p<0,001) e 14º dia (p<0,01), respectivamente, quando comparados ao grupo controle. O tratamento com AMF inibiu esses efeitos em todas as doses testadas (p<0,001), sendo a dose de 25mg/kg aquela com efeito mais significativo. No teste do Rota-Rod não foi observada variação significativa entre os grupos, indicando ausência de comprometimento motor. Na análise histopatológica foram observados edema do tecido nervoso e atrofia dos neurônios nos animais tratados com OXL, o que não ocorreu nos animais pré-tratados com AMF. Observou-se a imunoexpressão importante de c-Fos, caspase 3, NOSn, NOSi e nitrotirosina nos animais tratados apenas com OXL, e uma imunoexpressão reduzida do receptor NMDA, quando comparado com o grupo controle. AMF reduziu a expressão de c-Fos e de nitrotrosina, mas não da caspase 3, NOSn e NOSi, e aumentou a expressão do receptor NMDA. Não houve imunoexpressão de IL-1 nos grupos testados. Embora preliminares, os dados sugerem que a AMF promoveu uma importante proteção nas alterações sensitivas da NSP induzida por OXL, desde que inibiu a hiperalgesia e a alodinia, além da imunoexpressão de c-Fos. Adicionalmente AMF promoveu importante ação protetora nas lesões teciduais, sendo capaz de exercer ação antioxidante e antiapoptótica, através da inibição da expressão de nitrotirosina e do aumento da expressão do receptor NMDA, respectivamente. Palavras-chave: Quimioterapia. Doenças do Sistema Nervoso Periférico. Amifostina.

ABSTRACT

Protective effect of amifostine upon experimental oxaliplatin-induced sensory peripheral neuropathy. Author: Juliana Arcanjo Lino. Post-graduation in Pharmacology. Department of Physiology and Pharmacology, Faculty of Medicine, Federal University of Ceará. Defense: March 11th 2011. Advised by Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro and co-advised by Dr. Mariana Lima Vale.

Oxaliplatin (OXP) is a third-generation platinum agent with potent cytotoxic activity in several cancers. Its limiting toxicity is a sensory peripheral neuropathy (SPN) of acute onset, which becomes chronic after cumulative doses. Amifostine (AMF) is a broad spectrum antioxidant and is currently being studied as a cell-protecting agent against the adverse effects of radiotherapy and chemotherapy in cancer patients. This study was aimed to evaluate the effect of AMF on plantar mechanical hyperalgesia and thermal allodynia, as well as on histopathological alterations and immune expression of markers such as c-Fos protein, caspase 3, IL-1, nitrotyrosine, iNOS, nNOS and NMDA, observed in experimental OXL-induced SPN. The study was approved by the Ethics Committee on Animal Research, Federal University of Ceará, through protocol 27/08. Male Swiss mice (25-35g) were treated with OXL (1 mg/kg, i.v.) and pre-treated with AMF (1, 5, 25, 50 or 100 mg/kg, s.c.) for 4,5 weeks, in addition to the performance of nociceptive tests. Thermal allodynia was evaluated by tail immersion in cold water (10ºC), and plantar mechanical hyperalgesia by the Electronic Von Frey test. The histopathological and immunohistochemical analysis of samples taken from the dorsal horn of the lumbar spinal cord of the animals was performed in 24 hours, 7, 14, 21 and 28 days. OXP significantly decreased mechanic and thermal nociceptive threshold since 21th day (p<0,001) and 14th day (p<0,01), respectively, when compared to control group. AMF treatment inhibited these effects in all doses tested (p<0,001), and the dose of 25mg/kg had the most significant effect. Locomotor impairment was not evidenced through Rota-Rod test. Furthermore, we observed edema and neurons atrophy in dorsal horn of OXP group, not showed in AMF group. OXP group had overexpression of c-Fos, caspase 3, nNOS, iNOS, and nitrotyrosine, but a reduced NMDA receptor expression when compared to control group. AMF group had hypoexpression of c-Fos and nitrotyrosine and increased NMDA receptor expression, but not altered caspase 3, nNOS and iNOS expression. There was no immunoexpression of IL-1 in the tested groups. Although preliminary, the data suggest that AMF promoted an important protection in OXL-induced SPN sensory changes, since it inhibited the hyperalgesia and allodynia, as well as the immunoexpression of c-Fos. Additionally AMF promoted significant protective action on tissue lesions, being able to exert antioxidant and antiapoptotic action by inhibiting the expression of nitrotyrosine and increasing expression of NMDA receptors, respectively. Keywords: Chemotherapy. Peripheral Nervous System Diseases. Amifostine.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Complexos platinos utilizados no tratamento do câncer 24

Figura 2 Expectativa de vida do câncer colorretal metastático 25

Figura 3 Mecanismo de ação da oxaliplatina 26

Figura 4 Mecanismos de alterações dos canais iônicos observados durante uma lesão nervosa

31

Figura 5 Principais vias envolvidas na dor neuropática e sítios potenciais de intervenção farmacológica

38

Figura 6 Estrutura química da amifostina 43

Figura 7 Mecanismo de ação da amifostina 44

Figura 8 Protocolo experimental para indução da neuropatia sensitiva periférica por oxaliplatina

58

Figura 9 Protocolo experimental para avaliação do efeito protetor da amifostina na neuropatia sensitiva periférica por oxaliplatina

59

Figura 10 Teste de hiperalgesia mecânica plantar 60

Figura 11 A) Perfusão intracardíaca B) Remoção da medula espinhal 62

Figura 12 Avaliação do desenvolvimento de hiperalgesia mecânica plantar induzida por oxaliplatina

67

Figura 13 Avaliação do desenvolvimento de alodinia térmica ao frio (10ºC) induzida por oxaliplatina

69

Figura 14 Efeito da amifostina sobre a hiperalgesia mecânica plantar induzida por oxaliplatina

71

Figura 15 Efeito da amifostina sobre a alodinia térmica ao frio (10ºC) induzida por oxaliplatina

73

Figura 16 Efeito da amifostina sobre a atividade motora forçada (Rota-Rod)

em camundongos tratados com oxaliplatina 75

Figura 17 Avaliação da média ponderal nos animais tratados com oxaliplatina e pré-tratados com amifostina

77

Figura 18 Curso temporal das alterações histopatológicas observadas na neuropatia sensitiva periférica por oxaliplatina

79

Figura 19 Análise histopatológica do corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina

80

Figura 20 Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para c-Fos no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados apenas com oxaliplatina

83

Figura 21 Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para c-Fos no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina

84

Figura 22 Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para caspase 3 no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados apenas com oxaliplatina

85

Figura 23 Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para caspase 3 no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina

86

Figura 24 Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para IL-1 no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados apenas com oxaliplatina

87

Figura 25 Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para IL-1 no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina

88

Figura 26 Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para nitrotirosina no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados apenas com oxaliplatina

89

Figura 27 Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para nitrotirosina no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina

90

Figura 28 Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para NOSi no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados apenas com oxaliplatina

91

Figura 29

Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para NOSi no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina

92

Figura 30 Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para NOSn no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados apenas com oxaliplatina

93

Figura 31 Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para NOSn no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina

94

Figura 32 Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para o receptor NMDA no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados apenas com oxaliplatina

95

Figura 33 Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para o receptor NMDA no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina

96

Figura 34 Modelo hipotético do efeito protetor da amifostina na neuropatia sensitiva periférica experimental induzida por oxaliplatina

113

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Estimativas para o ano 2010 de número de casos novos por câncer, em homens e mulheres, segundo localização primária

21

Tabela 2 Características clínicas da neuropatia induzida por oxaliplatina 29

Tabela 3 Evolução da neurotoxicidade da oxaliplatina 34

Tabela 4 Citoprotetores disponíveis no Brasil 42

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

< Menor que

% Percentagem oC Graus Celsius

® Marca registrada

β beta

δ delta

µg micrograma

µm micrômetro

ACTH Hormônio Adrenocorticotrófico

AMF Amifostina

ANOVA Análise de Variância

Ca2+ Cálcio

CEPA Comitê de Ética em Pesquisa Animal

CGRP Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina

cm centímetros

CTR1 Cooper Transporter 1

CO2 Gás Carbônico

CIPN Neuropatia Periférica Induzida por Quimioterápicos

CTC NCI Critério de Toxicidade Comum - Instituto Nacional do Câncer

DAB Diaminobenzidina

DACH Diaminociclohexano

DNA Ácido Desoxirribonucléico

DOC Complexo de Oxaliplatina Desidratada

EPM Erro Padrão de Média

ERCC-1 Proteína de Reparo das Rupturas em Ligações Cruzada

ERK Proteína Quinase Regulada por Sinais Extracelulares

EUA Estados Unidos da América

FDA Food and Drug Administration

FOLFOX / FLOX 5-Fluorouracil, Oxaliplatina e Leucovorin

FU Fluorouracil

g gramas

G-CSF Fator Estimulador de Colônias Granulocitárias

GM-CSF Fator Estimulador de Colônia de Granulócitos e Macrófagos

GABA Ácido Gaba-Aminobutírico

GRD Gânglio da Raíz Dorsal

h hora

H+ Hidrogênio

H2O2 Peróxido de Hidrogênio

HCO3- Bicarbonato

H2PO4 Dihidrogênio Fosfato

HE Hematoxilina-Eosina

IASP Associação Internacional para Estudo da Dor

IL-1 Interleucina-1

INCA Instituto Nacional de Câncer

i.p. intraperitoneal

i.v. intravenosa

K+ Potássio

kg kilograma

LAFICA Laboratório de Farmacologia da Inflamação e do Câncer

L-NAME Nω-nitro-L-arginina metil éster

L-OHP Trans-I-diaminociclohexano oxalatoplatino

LV Leucovorin

M Molar

MAPK Proteína Quinase Ativada por Mitógeno

mETC Cadeia Transportadora de Elétrons Mitocondriais

MS Ministério da Saúde

Mg2+ Magnésio

mg miligramas

ml mililitros

m2 metro quadrado

min minutos

MM Mieloma Múltiplo

MMR Reparo de Má Combinação

NaCl Cloreto de Sódio

Na+ Sódio

NAP Neurônio Aferente Primário

NMDA Ácido N-Metil-D-Aspartato

NO Óxido Nítrico

NOSi Óxido Nítrico Sintase Induzível

NOSn Óxido Nítrico Sintase Neuronal

NOSe Óxido Nítrico Sintase Endotelial

NSP Neuropatia Sensitiva Periférica

O2 Oxigênio

ONOO- Peroxinitrito

OSNS Escala de Neurotoxicidade Específica da Oxaliplatina

OXL Oxaliplatina

PBS Solução Salina Tamponada

PBN Fenil-N-tert-butilnitrone

PFA Paraformaldeído

Pt Platino

Pt(dach)Cl2 Dicloro(1,2-diaminociclohexano)platino

Pt(dach)Cl Monocloro(1,2-diaminociclohexano)platino

RNA Ácido Ribonucléico

ROS Espécies Reativas de Oxigênio

RPM Rotações Por Minuto

s.c. subcutânea

SNC Sistema Nervoso Central

SNP Sistema Nervoso Periférico

SP Substância P

UFC Universidade Federal do Ceará

VEGF Fator de Crescimento Endotelial Vascular

WR Walter-Reed

SUMÁRIO

RESUMO ......................................................................................................................... 07 ABSTRACT ..................................................................................................................... 08 LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... 09 LISTA DE TABELAS .................................................................................................... 12 LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... 13 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 19

1.1 Câncer ................................................................................................................. 20 1.2 Compostos platinos ............................................................................................ 22 1.3 Oxaliplatina ......................................................................................................... 24

1.3.1 Mecanismo de ação da oxaliplatina ........................................................... 26 1.3.2 Mecanismo de resistência da oxaliplatina .................................................. 27 1.3.3 Farmacocinética da oxaliplatina ................................................................. 28 1.3.4 Efeitos colaterais da oxaliplatina ................................................................ 29 1.3.5 Neurotoxicidade associada à oxaliplatina .................................................. 30

1.4 Dor x Nocicepção ................................................................................................ 34 1.5 Dor neuropática .................................................................................................. 36

1.5.1 Fisiopatologia da dor neuropática .............................................................. 37 1.5.2 Tratamento da dor neuropática ................................................................... 39

1.6 Modelos experimentais de neuropatia periférica induzida por quimioterápicos ........................................................................................................ 40 1.7 Agentes citoprotetores ........................................................................................ 41 1.8 Amifostina ........................................................................................................... 43

1.8.1 Mecanismo de ação da amifostina ............................................................. 43 1.8.2 Farmacocinética da amifostina ................................................................... 45 1.8.3 Efeitos citoprotetores da amifostina ........................................................... 46 1.8.4 Toxicidades da amifostina .......................................................................... 48

1.9 Justificativa e caracterização do problema ...................................................... 49

2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 51

2.1 Objetivo geral ..................................................................................................... 52 2.2 Objetivos específicos .......................................................................................... 52

3. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 53

3.1 Animais ................................................................................................................ 54 3.2 Aspectos éticos .................................................................................................... 54 3.3 Ambientes ............................................................................................................ 54 3.4 Horário dos experimentos ................................................................................. 55 3.5 Observações clínicas ........................................................................................... 55 3.6 Aparelhos e instrumentos laboratoriais ........................................................... 55 3.7 Drogas, soluções e líquidos ................................................................................ 56 3.8 Protocolo experimental e desenho do estudo ................................................... 57

3.8.1 Indução da neuropatia sensitiva periférica por oxaliplatina ....................... 57 3.8.2 Avaliação do efeito protetor da amifostina na neuropatia sensitiva periférica induzida pela oxaliplatina ................................................................... 58

3.9 Testes para avaliação de hipernocicepção mecânica e térmica ...................... 59 3.9.1 Teste de hiperalgesia mecânica plantar ...................................................... 59 3.9.2 Teste de alodinia térmica ao frio ................................................................ 60 3.9.3 Teste do Rota-Rod ...................................................................................... 61

3.10 Coleta da medula espinhal lombar (L4-L5) ................................................... 61 3.11 Análise histopatológica .................................................................................... 62 3.12 Análise imunohistoquímica ............................................................................. 63 3.13 Análise estatística ............................................................................................. 64

4. RESULTADOS ........................................................................................................... 65

4.1 Estudo da neuropatia sensitiva periférica (OXL - 1mg/kg) ........................... 66 4.1.1 Avaliação do desenvolvimento de hiperalgesia mecânica plantar induzida por oxaliplatina ..................................................................................... 66 4.1.2 Avaliação do desenvolvimento de alodinia térmica ao frio (10oC) induzida por oxaliplatina ..................................................................................... 68

4.2 Curva dose-resposta para escolha da melhor dose de amifostina ................. 70 4.2.1 Efeito da amifostina sobre a hiperalgesia mecânica plantar induzida por oxaliplatina .......................................................................................................... 70 4.2.2 Efeito da amifostina sobre a alodinia térmica ao frio (10ºC) induzida por oxaliplatina .......................................................................................................... 72

4.3 Efeito da amifostina sobre a atividade motora forçada (Rota-Rod) em camundongos tratados com oxaliplatina ................................................................ 74 4.4 Avaliação da média ponderal nos animais tratados com oxaliplatina e pré-tratados com amifostina ........................................................................................... 76 4.5 Análise histopatológica do corno dorsal da medula espinhal lombar ........... 78 4.6 Avaliação de imunoexpressão de marcadores no corno dorsal da medula espinhal lombar ........................................................................................................ 81

5. DISCUSSÃO ................................................................................................................ 97 6. CONCLUSÃO ............................................................................................................. 114 REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 116

INTRODUÇÃO

Introdução

Efeito protetor da amifostina na neuropatia sensitiva periférica experimental induzida por oxaliplatina 20

1 INTRODUÇÃO

1.1 Câncer

Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 doenças que têm em comum

o crescimento desordenado de células, que invadem tecidos e órgãos. Dividindo-se

rapidamente, estas células tendem a ser muito agressivas e incontroláveis, determinando a

formação de tumores malignos, que podem espalhar-se para outras regiões do corpo. A

invasão destrutiva de órgãos normais por estas células, por extensão direta ou por

disseminação à distância, que pode ser através do sangue, linfa ou superfície serosa, leva a

perda de função dos órgãos atingidos e conseqüentemente a morte do organismo

(SCHOTTENFELD; BEEBE-DIMMER, 2006).

As causas de câncer são variadas, podendo ser externas ou internas ao organismo,

estando ambas inter-relacionadas. As causas externas relacionam-se ao meio ambiente e aos

hábitos ou costumes próprios de um ambiente social e cultural. As causas internas são, na

maioria das vezes, geneticamente pré-determinadas, estando ligadas à capacidade do

organismo de se defender das agressões externas. Esses fatores causais podem interagir de

várias formas, aumentando a probabilidade de transformações malignas nas células normais

(INCA, 2010).

O câncer pode surgir em qualquer parte do corpo, mas alguns órgãos são mais

afetados do que outros. Entre os mais afetados estão pulmão, mama, colo do útero, próstata,

cólon e reto, pele, estômago, esôfago, medula óssea e cavidade oral. Cada órgão, por sua vez,

pode ser afetado por tipos diferenciados de tumor, menos ou mais agressivos (INCA, 2010).

No contexto atual, o câncer configura-se um dos principais problemas de saúde

pública mundial. É uma doença crônico-degenerativa que afeta várias dimensões da vida

humana e causa importante impacto econômico na sociedade, necessitando de tratamento

especializado prolongado e oneroso. Além disso, é responsável pela redução do potencial de

trabalho humano e perda de muitas vidas (TONON; SECOLI; CAPONERO, 2007).

No Brasil, as estimativas para o ano de 2010 serão válidas também para o ano de

2011, e apontam para a ocorrência de 489.270 casos novos de câncer. Os tipos mais

incidentes, à exceção do câncer de pele do tipo não melanoma, são os cânceres de próstata e

Introdução


de pulmão no sexo masculino e os cânceres de mama e de colo do útero no sexo feminino

(Tabela 1), acompanhando o mesmo perfil da magnitude observada para a América Latina

(INCA, 2009).

Tabela 1- Estimativas para o ano 2010 de número de casos novos por câncer, em homens e mulheres, segundo localização primária

Fonte: Instituto Nacional de Câncer / Min istério da Saúde - INCA/MS

A terapia do câncer teve um extraordinário avanço durante a segunda metade do

século XX. Esse progresso pode ser atribuído a diversos fatores, tais como: a melhor

compreensão das causas e da história natural do câncer, a disponibilidade de tecnologias mais

aprimoradas para detecção e diagnóstico precoces, o melhor controle dos tumores primários

por meio de técnicas aperfeiçoadas de cirurgia e radioterapia e a descoberta de fármacos mais

efetivos (BRUCE et al., 2007).

O tratamento do câncer é um dos melhores exemplos de abordagem

multidisciplinar de tratamento na medicina. A cirurgia e a radioterapia ainda são

frequentemente a escolha primária do tratamento de pacientes com tumores malignos.

Contudo, sabendo-se que 60-70% dos pacientes com câncer irão desenvolver doença

metastática durante sua evolução, apesar do controle local deste câncer, para muitos pacientes,

o câncer tem sido considerado uma doença sistêmica, requerendo, assim, um tratamento

sistêmico. O desenvolvimento de uma terapia sistêmica nas últimas décadas tem, portanto,

Introdução


proporcionado um papel importante para os médicos oncologistas no tratamento de pacientes

com câncer. Os tipos de tratamentos sistêmicos disponíveis para os médicos oncologistas

estão continuamente se expandindo com novas terapias farmacológicas e biológicas

emergentes (VERWEIJ; NOOTER; STATER, 2002).

Ao longo das últimas décadas, o número de agentes antineoplásicos tem crescido

exponencialmente e contribuído para o aumento da qualidade de vida e da sobrevida de

pacientes com inúmeros tipos de câncer. Entretanto, os pacientes passaram a sofrer com

efeitos adversos limitantes, como náuseas e vômitos, neutropenia, infecções, mucosites,

neuropatias, entre outros (AUTHIER et al., 2009).

Além de prejudicar a qualidade de vida dos pacientes, os efeitos adversos

relacionados à quimioterapia antineoplásica podem representar prejuízo à eficácia terapêutica,

pois são frequentes os atrasos em ciclos de tratamento subseqüentes, reduções de doses e

baixa aderência por parte dos pacientes (SONIS et al., 2004; RUBENSTEIN et al., 2004).

Nos últimos anos a qualidade de vida dos pacientes e a paliação dos sintomas,

sejam relacionados à doença ou ao tratamento, têm ganhado maior atenção por parte dos

oncologistas e pesquisadores, no intuito de diminuir os efeitos colaterais associados aos

agentes antineoplásicos.

1.2 Compostos platinos

Os agentes farmacológicos utilizados no tratamento do câncer incluem uma

grande variedade de compostos que atuam de diferentes formas, interferindo nos mecanismos

de sobrevivência, proliferação e migração celulares. Apesar do desenvolvimento dirigido no

sentido de torná- los capazes de ação seletiva sobre os tecidos neoplásicos, os agentes

atualmente disponíveis manifestam toxicidade significativa sobre os tecidos normais como

maior complicação do seu uso, devendo-se considerar criteriosamente o risco versus benefício

quando se opta pelo uso desses agentes (BITTENCOURT; BRUNSTEIN, 2004).

Os principais agentes antineoplásicos utilizados atualmente no tratamento do

câncer estão divididos em diferentes categorias, tais como: agentes alquilantes,

antimetabólitos, inibidores da topoisomerase, intercaladores, antimitóticos, hormonais e os

compostos de platina, que serão descritos a seguir (BARROWS, 2004).

Introdução


Os compostos platinos (Pt) representam uma classe importante de drogas

antitumorais, sendo largamente utilizados no tratamento de um amplo espectro de tumores

sólidos humanos. A cisplatina (cis-diaminodicloroplatino II) foi o primeiro composto platino

a ser desenvolvido clinicamente (ROSENBERG et al., 1969).

A molécula de cisplatina foi sintetizada pela primeira vez em 1844 e denominada

na época de cloreto de Peyrone, em homenagem à química Michele Peyrone. Em 1961,

Barnett Rosenberg observou que esse composto era capaz de inibir a divisão celular e relatou

a sua atividade inibitória sobre a divisão de Escherichia coli. Os efeitos inibitórios sobre a

replicação bacteriana foram atribuídos mais tarde à formação de compostos inorgânicos

contendo platina, na presença de íons amônio e cloreto, sugerindo que a cisplatina pudesse ter

características potenciais de um agente antineoplásico (ROSENBERG; VAN CAMP;

KRIGAS, 1965; ROSENBERG et al., 1969).

Em 1978 a cisplatina foi aprovada pela Food and Drug Administration (FDA) e

lançada no mercado com o nome de Platinol para tratamento de câncer testicular e ovariano

(KELLAND, 2007). O entusiasmo inicial causado pela descoberta de um novo agente

quimioterápico foi, no entanto, arrefecido com a observação de que a cisplatina, como a

maioria dos quimioterápicos, possuía vários efeitos tóxicos importantes, destacando-se a

toxicidade renal e gastrointestinal, a ototoxicidade e a neurotoxicidade. Em função destes

efeitos, seu uso, na época, foi restringido. Porém, em virtude de sua alta atividade citotóxica,

os testes clínicos continuaram, utilizando doses mais baixas, visando o desenvolvimento de

novos complexos platinos que mantivesse a atividade antineoplásica da cisplatina e reduzisse

seus efeitos tóxicos (DESOIZE; MADOULET, 2002; FONTES; ALMEIDA; NADER, 1997).

Então foi sintetizada a carboplatina (cis-diaminociclobutano-1,1-decarboxilato

platino II), um derivado platino de segunda geração, desenvolvida em Nova Jersey, passando

a ser utilizada a partir de 1980. O anel ciclobutano da molécula de carboplatina oferece uma

ligação mais estável do que os grupos de cloreto da cisplatina, favorecendo assim uma

diminuição na reatividade e na toxicidade da carboplatina. Apesar da semelhança com a

cisplatina, a carboplatina possui uma toxicidade renal e gastrointestinal diminuída, porém

apresentando a mielosupressão e a trombocitopenia como principais efeitos dose-limitantes

(KELLAND, 2007). É utilizada no tratamento do câncer de mama, de ovário e de pulmão

(LEBWOHL; CANETTA, 1998).

A eficácia desses compostos platinos na inibição do crescimento tumoral é

resultado da combinação de diversos fatores, incluindo a difusão através da membrana

Introdução


celular, o acúmulo nas células, a reatividade contra o ácido desoxirribonucléico (DNA)

nuclear e a inibição da capacidade celular em reparar os complexos de DNA (AHMAD,

2010). Porém, um grande problema associado a esses compostos consiste na resistência

tumoral. Com isso uma grande quantidade de análogos platinos tem sido sintetizada no intuito

de aumentar a atividade antitumoral, surgindo, então, a oxaliplatina (OXL), um agente platino

de terceira geração, que apresenta em sua estrutura o composto 1,2-DACH (1,2-

diaminociclohexano), relacionado com uma atividade citotóxica significativa em células

tumorais humanas, diferente da cisplatina e da carboplatina, e com uma resistência tumoral

diminuída (CHU, 2004; ARGYRIOU et al., 2008). A figura 1 representa a estrutura química

dos principais compostos derivados do platino.

Figura 1 - Complexos platinos utilizados no tratamento do câncer Fonte: McWHINNEY; GOLDBERG; McLEOD, 2009

1.3 Oxaliplatina

A OXL, um trans- l-diaminociclohexano oxalatoplatino (L-OHP), foi desenvolvida

em 1970 por Kidani, na Universidade de Nagoya, no Japão, como um dos vários compostos

1,2-DACH, na tentativa de se obter análogos platinos com índice terapêutico mais favorável

(LEVI et al., 2000).

A OXL é a terceira geração de agentes platinos, com estrutura similar à cisplatina,

tendo demonstrado, em estudos pré-clínicos, um amplo espectro de atividade antitumoral em

linhas de células cancerosas humanas e toxicidade diferente da cisplatina e das drogas de

Cisplatina Carboplatina Oxaliplatina

Introdução


segunda geração como a carboplatina (KELLAND, 2007; ARGYRIOU et al., 2008). Seu

grupo 1,2-DACH veio substituir os grupos cis-diamino-Pt da cisplatina, demonstrando uma

maior potência contra células cancerosas, e requerendo menos complexos de DNA para

alcançar a mesma citotoxicidade (BURZ et al., 2008).

Por se distribuir em todas as células dos tecidos, exibe uma potente atividade

citotóxica em linhas de células cancerosas humanas. Atualmente a OXL, em associação com o

5-fluorouracil (5-FU) e o leucovorin (LV), nos protocolos FOLFOX ou FLOX, constitui um

dos esquemas de primeira linha para o tratamento do câncer colorretal metastático (DE

GRAMONT et al., 2000), além de também ser utilizada como primeira linha na quimioterapia

adjuvante (ANDRÉ et al., 2004). A incorporação da OXL ou do irinotecano à clássica

associação de 5-FU + LV tem aumentado a expectativa de vida de pacientes portadores de

câncer colorretal, conforme pode ser observado na figura 2. Recentemente estudos clínicos

confirmaram sua ação também em tumores resistentes à cisplatina, incluindo o câncer

gástrico, pancreático (LOUVET et al., 2002), ovariano (DIERAS et al., 2002), mamário e

pulmonar (PETIT et al., 2006).

Por se distribuir em todas as células dos tecidos, exibe uma potente atividade

citotóxica em linhas de células cancerosas humanas. Atualmente a OXL, em associação com o

5-fluorouracil (5-FU) e o leucovorin (LV), nos protocolos FOLFOX ou FLOX, constitui um

dos esquemas de primeira linha para o tratamento do câncer colorretal metastático (DE

GRAMONT et al., 2000), além de também ser utilizada como primeira linha na quimioterapia

adjuvante (ANDRÉ et al., 2004). A incorporação da OXL ou do irinotecano à clássica

associação de 5-FU + LV tem aumentado a expectativa de vida de pacientes portadores de

câncer colorretal, conforme podemos observar na figura 3 abaixo. Recentemente estudos

Figura 2 - Expectativa de vida do câncer colorretal metastático Fonte: CUTSEM; VERSLYPE; DEMEDTS, 2002; GOLDBERG et al., 2003; HURWITZ, 2003 Legenda : FU - Fluorouracil, LV - Leucovorin, OXL - Oxaliplat ina, VEGF - Fator de crescimento endotelial vascular

Sem drogas ativas Droga ativa (5-FU/LV)

Drogas ativas (5-FU/LV + OXL ou irinotecano)

Drogas ativas (5-FU/LV + OXL + irinotecano)

Drogas ativas + Anti-VEGF

~ 4-6 meses

~ 12-14 meses

~ 15 meses

~ 15-20 meses

0 6 12 18 24

20,3 meses

Introdução


1.3.1 Mecanismo de ação da oxaliplatina

A OXL exerce um efeito citotóxico de maneira semelhante a outros análogos

platinos. Esses compostos eliminam as células em todos os estágios do ciclo celular e, por

esta razão, são considerados ciclos-celulares não específicos. No momento em que a OXL

entra na corrente sanguínea, nucleófilos fracos como o bicarbonato do sangue (HCO 3-) e o

dihidrogênio fosfato (H2PO4) desacoplam seu grupamento oxalato, resultando na formação de

intermediários não-estáveis, que são rapidamente hidrolisados a espécies platinas, tais como o

dicloro(1,2-dach)platino (Pt(dach)Cl2) e o monocloro(1,2-dach)platino (Pt(dach)Cl), os quais

reagem instantaneamente com o DNA celular, proteínas e outras macromoléculas, resultando

em apoptose celular (CHU, 2004; FOLTINOVÁ et al., 2008), como pode ser observado na

figura 3 abaixo.

Figura 3 - Mecanismo de ação da oxaliplatina

Introdução


Portanto, a atividade antitumoral da OXL acredita-se resultar também das

interações do platino com o DNA, através da formação de complexos de Pt-DNA,

principalmente na posição N7 das bases de guanina no DNA, originando ligações cruzadas

intrafilamentares e interfilamentares, complexos entre guaninas adjacentes e complexos entre

adenina e guanina adjacentes (CHU, 2004; FOLTINOVÁ et al., 2008).

Os complexos de Pt-DNA formados podem afetar o metabolismo e a organização

espacial da célula, assim como os axônios e a bainha de mielina, os corpos celulares e as

células da glia (STILLMAN; CATA, 2006). Eles também podem interferir na duplicação do

DNA, através do bloqueio da enzima DNA polimerase, inibindo a transcrição do ácido

ribonucléico (RNA), resultando em bloqueio do ciclo celular e do reparo do DNA (NADIN et

al., 2006; CHO et al., 2008).

Apesar de a OXL apresentar um número inferior de complexos Pt-DNA com

relação a cisplatina e a carboplatina, os metabólitos 1,2-DACH-Pt produzidos pela OXL são

significativamente mais citotóxicos do que os metabólitos formados pela cisplatina e

carboplatina (PARK et al., 2008). Evidências sugerem que o 1,2-DACH formado pela OXL

liga-se de forma mais potente ao DNA, sendo capaz de fugir do reconhecimento pelo

complexo de enzimas de Reparo de Má Combinação (MMR).

1.3.2 Mecanismo de resistência da oxaliplatina

O tratamento quimioterápico pode ser ineficaz devido a uma baixa sensibilidade

das células malignas aos antineoplásicos utilizados (resistência intrínseca), ou devido à

“adaptação” da célula à droga, que pode surgir durante o tratamento (resistência extrínseca).

Vários mecanismos de resistência podem estar envolvidos neste processo, como: baixo

acúmulo de platino na célula devido sua baixa absorção; acentuado efluxo do platino para os

compartimentos entre as células; inativação por proteínas contendo grupos sulfidrila, como a

glutationa ou enzimas relacionadas com a glutationa; aumento do reparo de DNA com

expressão de enzimas-chaves, como as proteínas de reparo das rupturas em ligações cruzadas

(ERCCs-1); ou ainda aumento da tolerância aos complexos Pt-DNA (CHU, 2004;

FOLTINOVÁ et al., 2008; McWHINNEY; GOLDBERG; McLEOD, 2009).

Introdução


Alterações nos complexos MMR também podem conferir resistência aos agentes

platinos. Esses sistemas de reparo pós-replicação possuem uma maior afinidade pelos

complexos de cisplatina do que pela OXL, produzindo, assim, um maior número de mutações

espontâneas, aumentando a instabilidade celular, podendo levar até a morte celular. Com isso,

alterações na atividade do MMR são capazes de aumentar a resistência das células para a

cisplatina, mas não para a OXL (CHU, 2004; MEYERS et al., 2004; AHMAD, 2010).

1.3.3 Farmacocinética da oxaliplatina

A OXL apresenta uma meia-vida plasmática muito curta, provavelmente em

decorrência de sua rápida captação pelos tecidos e de sua reatividade. As concentrações

plasmáticas máximas variam de 1 a 1,5µg de platina/ml para pacientes que recebem 80 a

130mg/m2 por via intravenosa (i.v.). Em seguida essas concentrações declinam com meia-

vida inicial de 0,28 horas (h) (BRUCE et al., 2007).

Ela é largamente distribuída para a maioria dos tecidos, com um volume de

distribuição mais elevado do que a cisplatina. Após 2-5h de infusão de OXL, 40% do platino

se liga de forma irreversível às hemácias, formando produtos não tóxicos. Os 30% restantes

do platino se liga ás proteínas do plasma, e os outros 30% corresponde ao platino ultrafiltrado.

Este último possui a droga ativa, ou seja, a OXL intacta, representando, assim, o maior

componente citotóxico (CHU, 2004; JERREMALM; WALLIN; EHRSSON, 2009).

Com relação ao metabolismo, a OXL faz uma extensa conversão não enzimática

para ativar espécies citotóxicas, semelhante ao observado com a cisplatina e a carboplatina.

Essa é uma reação aquosa que ocorre na presença de cloreto e água, levando a formação dos

complexos Pt(dach)Cl, Pt(dach)Cl2 e complexo de OXL desidratada (DOC), sendo esses

produtos mais citotóxicos do que a OXL, dentro da célula (JERREMALM; WALLIN;

EHRSSON, 2009). Somente uma pequena fração da droga (<2%) é eliminada nas fezes,

sendo a maior parte excretada pelos rins, com mais de 50% pela urina (CHU, 2004).

Introdução


1.3.4 Efeitos colaterais da oxaliplatina

Recentes avanços no desenvolvimento e na administração de quimioterápicos em

doenças malignas têm levado a um aumento significativo na sobrevida de pacientes e

promessas de retorno para suas atividades normais. Contudo, uma variedade de efeitos tóxicos

tem crescido concomitantemente com o progresso da terapia antitumoral (AUTHIER et al.,

2009).

Enquanto a OXL está associada a um efeito hematotóxico, nefrotóxico e ototóxico

insignificantes, a neurotoxicidade representa a principal toxicidade dose- limitante do seu

tratamento. A neurotoxicidade induzida pela OXL pode se apresentar de duas maneiras

distintas: uma forma aguda e transitória, que aparece geralmente durante ou nas primeiras

horas após a infusão da OXL; e uma forma dose- limitante, caracterizada por uma neuropatia

sensitiva cumulativa (ARGYRIOU et al., 2008). As principais características clínicas da

neuropatia associada à OXL estão resumidas na tabela 2 abaixo:

Tabela 2 - Características clínicas da neuropatia induzida por oxaliplatina

Oxaliplatina

Agudo Crônico

Incidência 85-95% Graus 3/4 em 16%

Dose limite de toxicidade Não Sim

Sintomas Parestesia, disestesia Parestesia, disestesia, ataxia sensorial

Localização Extremidades, perioral Extremidades

Ativação Exposição ao frio Nada sugerido

Sintomas motores Espasmos musculares raros Nenhum

Início Agudo Demorado

Recuperação Rápida, completa Devagar, mas completa

Dependência de modulação Sim Provavelmente não

Outros Disestesias faringolaringeal Nenhuma

Fonte: GROTHEY, 2003

Introdução


Os sintomas iniciais consistem em parestesias distais e periorais, que podem se

desenvolver durante ou logo após sua infusão em mais de 90% dos pacientes. Também podem

ocorrer sintomas como câimbras, espasmos tetânicos, miotonias, laringoespasmo, náuseas,

vômitos, diarréia, febre, reações de hipersensibilidade, fadiga e fibrose pulmonar. Esses

sintomas podem afetar as atividades da vida diária dos pacientes em até meses ou anos após a

descontinuação do tratamento (PELTIER; RUSSELL, 2002; KIERNAN, 2007).

1.3.5 Neurotoxicidade associada à oxaliplatina

A neurotoxicidade representa um importante e potencial efeito adverso do

tratamento com OXL, podendo limitar o número de ciclos do tratamento, reduzir a

tolerabilidade ao tratamento e, com isso, levar a sua descontinuidade (VELASCO; BRUNA,

2010). Seus efeitos tardios podem influenciar de forma negativa a qualidade de vida dos

pacientes (PARK et al., 2009b). A FDA demonstrou que mais de 70% dos pacientes que

fazem tratamento com OXL são afetados por algum grau de neuropatia sensitiva periférica

(NSP). E com isso, a neurotoxicidade, e não a progressão do tumor termina por ser a causa

mais comum de descontinuação do tratamento (McWHINNEY; GOLDBERG; McLEOD,

2009).

Embora a OXL e a cisplatina sejam capazes de induzir uma NSP, somente a OXL

está associada a um espectro único de sintomas neurológicos agudos e limitantes. A

neurotoxicidade aguda ocorre em 85-95% dos pacientes que fazem tratamento com OXL,

desenvolvendo-se imediatamente após a infusão da droga, sendo caracterizada pela

exacerbação ao frio, parestesias, miotonias, espasmos musculares e fasciculações, podendo

também ocorrer disestesias faringolaringeais, com dificuldade de respiração e deglutição em

1-2% dos pacientes (SCHIFF; WEN; VAN DEN BENT, 2009). Os pacientes descrevem as

parestesias como sensações de formigamento nas mãos, pés, região perioral e garganta. Esses

sintomas apresentam início rápido, ocorrendo durante ou logo após a infusão de OXL,

podendo ser reversíveis dentro de algumas horas ou alguns dias. Doses cumulativas maiores

de OXL podem induzir uma NSP dose-limitante, levando a uma ataxia sensitiva e

comprometimento funcional (SAIF; REARDON, 2005; PARK et al., 2009a; SAKURAI et

al., 2009).

Introdução


A neuropatia aguda é peculiar da OXL e pode estar associada a uma

hiperexcitabilidade nervosa periférica sensitiva, sugerindo uma base farmacológica, e não

estrutural, para os sintomas agudos. Estudos in vitro demonstraram que a OXL age

diretamente nos canais de sódio (Na+) e potássio (K+), levando a uma ativação ectópica e

espontânea dos potenciais de ação das unidades motoras e mudança na expressão desses

canais iônicos (WEBSTER et al., 2005; ARGYRIOU et al., 2008; PARK et al., 2009b;

SAKURAI et al., 2009). A figura 4 representa os mecanismos de alterações dos canais iônicos

observados durante uma lesão nervosa, caracterizado por alterações na sensibilização central,

aumento da atividade ectópica de potenciais sensitivos, liberação de neurotransmissores,

atividade anormal dos canais iônicos e reorganização sináptica.

Figura 4 - Mecanismos de alterações dos canais iônicos observados durante uma lesão nervosa Fonte: Adaptado de Scholz; Woolf, 2002. Legenda: Nav - Canais de Cálcio, Kv - Canais de Potássio, NT - Neurotransmissores

Estudos recentes demonstraram ainda que a neuropatia aguda por OXL também

poderia estar associada à quelação de cálcio (Ca2+), magnésio (Mg2+) e Na+ pelo oxalato, um

dos metabólitos da OXL, que está associado com a hiperalgesia ao frio, na fase inicial da

Introdução


neuropatia induzida pela OXL (GROLLEAU et al., 2001; SAKURAI et al., 2009;

STUBBLEFIELD et al., 2009).

Joseph et al. (2008) demonstraram que nos primeiros estágios do

desenvolvimento da neuropatia aguda induzida por OXL, fibras nociceptivas periféricas são

lesadas por estresse oxidativo e que substâncias antioxidantes são capazes de prevenir esse

efeito. Esses mesmos autores sugeriram que o fenômeno pode ser um dos eventos iniciais que

podem levar ao desenvolvimento dos sintomas sensitivos relacionados à neurotoxicidade

induzida pela OXL.

A neuropatia crônica induzida por OXL ocorre em 10-20% dos pacientes que

recebem doses maiores que 750 a 850mg/m2 (GROTHEY, 2003; PARK et al., 2009a). Os

sintomas, puramente sensitivos, consistem em parestesias e disestesias distais, de duração

prolongada, progredindo com alterações sensitivas periféricas, ataxia sensitiva, alteração

proprioceptiva e déficit funcional, levando a limitações nas atividades de vida diária do

paciente. Esses sintomas geralmente persistem entre os ciclos de tratamento e aumentam de

intensidade com as doses cumulativas. Diferente da neuropatia aguda, os sintomas da

neuropatia crônica não são exacerbados pelo frio (GROTHEY, 2005; SAIF, REARDON,

2005). Eles podem ser parcialmente reversíveis em 80% dos pacientes, e completamente

reversíveis em 40% deles, em até 6-8 meses após a descontinuação do tratamento com OXL

(ARGYRIOU et al., 2008). Essas evidências, no entanto, são contrastadas com a prática

clínica, onde muitos oncologistas afirmam que essa neuropatia nem sempre é reversível,

podendo se prolongar por um tempo maior do que 8 meses.

A neuropatia crônica induzida por OXL ainda é pouco estudada, no que diz

respeito aos seus aspectos celulares e moleculares, entretanto, alguns autores têm sugerido

que o fenômeno possa ser resultado do metabolismo celular e transporte axoplasmático

diminuídos, levando ao acúmulo de compostos de Pt no gânglio da raíz dorsal (GRD). O

exame histológico da neuropatia induzida por OXL, em modelos animais, revela perda axonal

com atrofia de uma subpopulação específica de células do GRD, os nociceptores IB-4

positivos (JOSEPH et al., 2008), sugerindo, assim, que a neuropatia deve ser melhor descrita

como uma neuropatia sensitiva periférica (ARGYRIOU et al., 2008).

A neuropatia crônica induzida por OXL é responsável pelo aparecimento de

alterações morfológicas e estruturais nas células neuronais, tais como lesões nos corpos

celulares (CAVALETTI et al., 2001), alterações do núcleo e do nucléolo (CAVALETTI et

Introdução


al., 2001; McKEAGE et al., 2001), atrofia dos neurônios do GRD (JAMIESON et al., 2005) e

morte celular (TA et al., 2006).

No estudo de Sakurai et al. (2009) foi demonstrado que os dois compostos

resultantes da metabolização da OXL, o oxalato e o Pt(dach)Cl2 apresentam papéis diferentes

na neurotoxicidade induzida pela OXL. Enquanto o oxalato está associado à quelação do Ca2+

extracelular, aumentando a entrada de Na+ nos neurônios, na fase inicial da neuropatia, o

Pt(dach)Cl2 está associado com a alodinia mecânica induzida pela OXL, que pode ocorrer

devido a neurotoxicidade do platino, causando todas as alterações morfológicas associadas

com a ligação Pt-DNA na neuropatia crônica, como lesões dos corpos celulares, alterações no

núcleo e nucléolo, atrofia dos neurônios do GRD e morte celular.

Estudos mais recentes de Ali (2009) e Liu et al. (2009) demonstraram ainda que o

“cooper transporter 1” (CTR1), uma proteína de membrana de alta afinidade, localizada em

uma subpopulação de neurônios dos GRD, estão envolvidos no transporte de agentes platinos,

através de alterações na absorção e toxicidade dessas drogas pelos neurônios que expressam o

CTR1, levando ao acúmulo neuronal de platino e neurotoxicidade.

Kann e Kovács (2007) e Argyriou et al. (2008) demonstraram que o dano

mitocondrial induzido pela OXL também pode ser o causador da neuropatia periférica. O

dano no consumo celular de oxigênio (O2) mitocondrial é uma medida de citotoxicidade da

droga. Em um estudo in vitro, Goodisman et al. (2006) comparou o consumo celular de O2

mitocondrial entre a cisplatina, OXL e carboplatina, demonstrando que, apesar da diferença

do acúmulo de platino no DNA entre a OXL e a cisplatina, a OXL exibiu uma citotoxicidade

similar ou maior, indicando que as lesões induzidas pela OXL são mais potentes do que

aquelas causadas pela cisplatina.

Alguns estudos ainda demonstraram haver uma relação entre a neuropatia aguda e

crônica associada à OXL, sugerindo que a modulação aguda da excitabilidade axonal é capaz

de induzir uma degeneração axonal sensitiva, através de alterações na função dos canais de

Na+, provocando uma cascata de eventos, que culminará no excesso de influxo de Ca2+ e

degeneração axonal, caracterizando, assim, a neuropatia crônica (PARK et al., 2009b).

Frequentemente escalas de graduação clínica são utilizadas para determinar a

evolução e a severidade de sintomas neurotóxicos induzidos por quimioterápicos, sendo mais

comumente utilizado o Critério de Toxicidade Comum do Instituto Nacional de Câncer (CTC

NCI) como pode ser observado na tabela 3:

Introdução


Tabela 3 - Evolução da neurotoxicidade da oxaliplatina

GRAU 1 GRAU 2 GRAU 3

NCI Assintomática: Perda de

reflexos do tendão pro-fundo ou parestesia (incluindo formigamen-to), mas não interferindo na função

Alteração sensitiva ou parestesia (incluindo for-migamento), interferindo na função, mas sem interferir nas atividades de vida diária

Alteração sensitiva ou parestesia interferindo nas atividades da vida diária

OSNS Disestesia ou parestesia que regressam completa-mente antes do próximo ciclo da terapia

Disestesia ou parestesia persistindo entre os cursos da terapia

Disestesia ou pareste-sia causando compro-metimento funcional

Fonte: PARK et al., 2009a Legenda: NCI - Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos da América (EUA). OSNS - Escala de Neurotoxicidade Específica de Oxaliplatina

1.4 Dor x Nocicepção

O Comitê de Taxonomia da Associação Internacional para o Estudo da Dor

(IASP) conceituou a dor como “uma experiência sensitiva e emocional desagradável

decorrente ou descrita em termos de lesões teciduais reais ou potenciais”. Entretanto, muitas

vezes, a dor manifesta-se mesmo na ausência de agressões teciduais vigentes, envolvendo

aspectos emocionais, psicológicos e comportamentais da percepção da dor (LOESER;

TREEDE, 2008).

A capacidade para sentir dor tem papel protetor para os seres vivos, pois os alerta

para iminente ou real dano aos tecidos e induzem reflexos coordenados e respostas

comportamentais para que tal lesão seja mínima. Se o dano tecidual for inevitável, uma gama

de alterações da excitabilidade no sistema nervoso central (SNC) e sistema nervoso periférico

(SNP) se estabelecem como um profundo, mas reversível, estado de dor e hipersensibilidade

no tecido inflamado e nas suas adjacências. Esse processo facilita a reparação das partes

lesadas, evitando o contato local até que a cura aconteça. Entretanto, quando as lesões afetam

as vias nervosas centrais e periféricas, podem se desenvolver síndromes dolorosas

persistentes, que não oferecem nenhuma vantagem biológica, causando sofrimento e estresse

para os portadores (WOOLF; MANNION, 1999).

Introdução


A dor envolve funções cerebrocorticais, com ativação dos componentes

discriminativos, afetivos, cognitivos e locomotores, além de existir a estimulação da via

nociceptiva; enquanto a nocicepção refere-se à percepção sensorial no SNC, produzida pela

ativação de receptores sensoriais periféricos especializados, denominados nociceptores, com

capacidade de codificar e transmitir estímulos nocivos, tanto exógenos (mecânicos, físicos,

químicos e biológicos) como endógenos (inflamação, aumento do peristaltismo, isquemia

tecidual), presentes no local da lesão (LOESER; TREEDE, 2008).

Os nociceptores são estruturas responsáveis pela sensação periférica inicial do

fenômeno doloroso. Representam as terminações nervosas livres do axônio periférico do

neurônio aferente primário (NAP), responsáveis pela transdução de estímulos térmicos,

mecânicos e químicos de alta intensidade. Estão localizados em toda a superfície da pele, das

articulações, dos músculos, das vísceras, exceto no cérebro e tecido ósseo (TEIXEIRA, 2009).

Eles podem ser divididos em nociceptores térmicos, mecânicos e polimodais

inespecíficos, de acordo com o tipo de estímulo à que respondem. As fibras nociceptivas

conhecidas como Aδ e C estão associadas à inflamação e, quando sensibilizadas, são capazes

de transduzir estímulos mecânicos, térmicos ou químicos em impulsos elétricos que serão

transmitidos ao SNC. As fibras Aβ são especializadas em detectar estímulos de baixa

intensidade e condução da informação sensorial normal, como o tato e a temperatura. Elas

podem estar associadas a fenômenos dolorosos associados às dores neuropáticas (FERREIRA

et al., 2009).

As fibras do tipo C, denominadas de nociceptores “silenciosos”, em condições

normais, não respondem aos estímulos nocivos mecânicos e térmicos intensos. Contudo, após

lesões teciduais ou processos inflamatórios, eles são sensibilizados e passam a ser ativados

por uma série de mediadores químicos. Assim, o recrutamento desses nociceptores em

condições patológicas deve contribuir para o aumento da sensibilidade aos estímulos nocivos

que acompanham algumas doenças (OLIVEIRA; SILVA, 2009).

Normalmente a sensação dolorosa é acompanhada de alterações sensoriais como:

hiperalgesia (sensibilidade aumentada para estímulo doloroso), alodinia (dor em resposta a

estímulo não nociceptivo) e hiperestesia (sensibilidade anormal dos neurônios sensoriais)

(LOESER; TREEDE, 2008). Em humanos, embora a distinção entre hiperalgesia e alodinia

seja de interesse clínico, ainda permanecem desconhecidas as bases moleculares desta

diferença. Em se tratando de resultados obtidos a partir da avaliação da sensibilidade térmica

e mecânica em modelos experimentais, tem se sugerido a substituição do termo alodinia pelo

Introdução


termo hipernocicepção, por se considerar mais adequado quando se trata da observação de

comportamento animal (SACHS; CUNHA; FERREIRA, 2004; SANTODOMINGO-

GARZON et al., 2006).

1.5 Dor neuropática

Segundo o Comitê de Taxonomia da IASP, a dor neuropática é definida como

“uma conseqüência direta de lesão ou doença que afete o sistema somatosensorial”

(LOESER; TREEDE, 2008). É um estado de má adaptação provocada por alterações

funcionais e estruturais das vias sensitivas centrais e periféricas, que produzem marcadas

modificações e perversões no processamento das informações nociceptivas. Pode ser

provocada por quaisquer lesões nas raízes e nervos periféricos, na medula espinhal, no tronco

cerebral e no encéfalo. É uma entidade complexa e heterogênea, com sinais e sintomas que

podem flutuar em intensidade com o tempo. Suas características principais são a presença de

dor espontânea ou dor provocada por estímulos não-nocivos nos locais afetados, combinação

paradoxal de perda sensitiva e hiperalgesia na área dolorosa, dor paroxística e aumento

gradual da dor com a estimulação repetitiva (GALVÃO, 2005).

A dor neuropática é a toxicidade dose- limitante mais comum relacionada aos

esquemas quimioterápicos. Entre os vários tipos de neuropatias observadas nos pacientes com

câncer, a neuropatia periférica induzida por quimioterápicos (CIPN) é a mais relatada nos

estudos clínicos. Ela é considerada uma polineuropatia, com sintomas simétricos e distais

(mãos e pés). A dor pode ser grave e incapacitante, sendo frequentemente descrita como uma

sensação “em queimação”, “em agulhada”, “ardência” ou “cãimbra”, podendo reaparecer

meses ou anos mais tarde. Ambos os mecanismos, periférico e central, estão envolvidos neste

processo (STUBBLEFIELD et al., 2009).

A dor neuropática está associada a diversos tipos de lesões do SNP, incluindo

traumas mecânicos, compressão nervosa, distúrbios metabólicos (diabetes), uso crônico de

determinadas drogas quimioterápicas, infecções e infiltração tumoral. Já a dor neuropática

associada ao SNC normalmente resulta de lesões na medula espinhal, doença vascular

cerebral, doenças inflamatórias, epilepsia, doença de Parkinson e esclerose múltipla

(HANSON, 2002; COSTIGAN; SCHOLZ; WOOLF, 2009; COSTA, 2009).

Introdução


1.5.1 Fisiopatologia da dor neuropática

Enquanto os mecanismos pelos quais os quimioterápicos produzem seus efeitos

antitumorais já estão bem estabelecidos na literatura, a grande questão se o mesmo

mecanismo também é responsável pelos efeitos tóxicos dose- limitantes permanecem

desconhecidos, especialmente quando relacionados ao SNP. Assim, enquanto já é sabido que

o efeito terapêutico dos compostos platinos é mediado pela alquilação do DNA, o mecanismo

pelo qual eles produzem a NSP, o maior efeito dose- limitante desta classe de quimioterápicos,

ainda não foi totalmente esclarecido (JOSEPH et al., 2008).

O circuito neuronal envolvido no processamento da dor consiste em um equilíbrio

entre as vias sinalizadoras e moduladoras desse estímulo, que conectam o SNP e o SNC. A

transmissão do estímulo nociceptivo, a partir do local da lesão tecidual, constitui uma resposta

biológica importante que visa proteger o organismo da lesão adicional. A transdução da dor

envolve a detecção de estímulos nocivos nos nociceptores periféricos e sua conversão em um

impulso elétrico. Estes impulsos são transmitidos para o corno dorsal da medula espinhal,

através de fibras Aδ e C (FERREIRA et al., 2009).

Em seguida, neurônios da medula espinhal se projetam para o tálamo, e depois

para o córtex sensitivo primário, tornando o impulso nociceptivo perceptível. Por sua vez, o

córtex ativa as vias de controle de dor descendentes, com liberação de várias substâncias

neuromoduladoras, como a noradrenalina, serotonina, opióides e ácido gaba-aminobutírico

(GABA), que desencadeiam uma cascata complexa de interações, culminando na inibição

parcial ou total da transmissão excitatória gerada nos nociceptores (NAMAKA et al., 2004).

Ocorrendo lesão das estruturas do SNP, os nociceptores modificam-se lentamente,

gerando dor prolongada em decorrência das alterações anatômicas e funcionais, liberação de

substâncias algogênicas nos tecidos e anormalidades secundárias no SNC (TEIXEIRA, 2009).

A liberação de vários mediadores inflamatórios, incluindo a serotonina, bradicinina,

substância P (SP) e histamina age sensibilizando os nociceptores periféricos, resultando no

aumento da resposta a estímulos nociceptivos no local da injúria. Os receptores nociceptivos

das fibras C passam a responder a estímulos mecânicos e térmicos, normalmente inócuos, ou

a ter atividade espontânea, produzindo a sensação de “dor em queimação”. Esta também pode

ocorrer nas fibras Aβ e Aδ, produzindo disestesias (alteração da sensibilidade) ou parestesias

(formigamento). Além disso, fibras nervosas danificadas causam uma entrada intensa e

Introdução


prolongada de descargas ectópicas no SNC e em trajetos secundários de neurônios da medula

espinhal. Estes sinais ectópicos podem persistir por períodos prolongados de tempo e são

responsáveis pelo início e manutenção da dor neuropática (CHAKRAVARTY; SEN, 2009).

Observa-se ainda modificação da permeabilidade das membranas neuronais, assim

como aumento do número e atividade dos canais de Na+ e Ca2+ na zona de regeneração e nos

gânglios sensitivos. A elevada densidade de canais de Na+ provoca descarga neuronal

exacerbada e ectópica, levando a uma hiperexcitabilidade nervosa das fibras C, Aβ e Aδ,

caracterizando, assim, a sensibilização periférica (GILRON; WATSON; MOULIN, 2006).

Os neurônios centrais inervados pelos nociceptores afetados são submetidos a

alterações funcionais, caracterizando a sensibilização central. Estas incluem desorganização

sináptica, brotamento nervoso, ampliação da distribuição espacial das terminações aferentes

intactas nos locais da lesão, das quais resulta em aumento dos campos receptivos e condução

de estímulos inócuos (FINNERUP; JENSEN, 2006). As principais vias envolvidas na dor

neuropática, assim como os sítios potenciais de intervenção farmacológica estão

demonstradas na figura 5 abaixo.

Ca2+PK

Aumento doimpulso

excitatórioInterneurôniogabaérgico Interneurônio

excitatório Brotamentodo axônio Aβ Brotamento dos

axôniossimpáticos Neurônio nociceptivo

(Alteração na expressão doscanais de Na , K e Ca )

Neurônio Aβ

Gânglio da raízdorsal

GlutamatoCGRPSP

Glutamato

Neurônio de2a ordem

Excitabilidade decanais de Na

+ + +

+

2

Figura 5 - Principais vias envolvidas na dor neuropática e sítios potenciais de intervenção farmacológica Fonte: Adaptado de MENDELL; SAHENK, 2003

Introdução


1.5.2 Tratamento da dor neuropática

O tratamento da dor neuropática costuma ser difícil e muitas vezes desapontador.

Deve iniciar com a identificação correta dos fatores etiológicos e dos mecanismos que

mantêm a sensibilização central e periférica. Além de medicamentos, podem se requerer

medidas neurocirúrgicas, bloqueios anestésicos, infusão regional de simpaticolíticos,

infiltrações, neuroestimulação com eletrodos e infusões intratecais de drogas, não esquecendo

as terapias fisiátricas, psicológicas e ocupacionais que ajudam o paciente a conviver com a

dor e ter recuperação funcional (CLOSS et al., 2007).

A prevenção e/ou tratamento da neurotoxicidade induzida pela OXL também

envolve educação sobre a exposição ao frio, modificações nos horários das administrações,

utilização de agentes protetores e estratégias específicas. A estratégia stop-and-go determina o

paciente parar o tratamento quando a dose pré-definida for alcançada ou quando tiver início

algum grau de neuropatia, e continuar quando a neuropatia tiver regredido ou quando o

tratamento for necessário para impedir a progressão tumoral. Em pacientes com alto risco de

desenvolver uma NSP, o uso da OXL deve ser interrompido e substituído por outro agente

quimioterápico (ALI, 2009).

O diagnóstico diferencial da CIPN pode ser realizado através da observação de

algumas características específicas, tais como: 1) A neuropatia é simétrica, distal, com

distribuição em “luvas e meias”; 2) Os sintomas são predominantemente sensitivos; 3) Tem

início logo após a administração de um quimioterápico, podendo ser progressivo e rápido; 4)

Dose-dependente (STUBBLEFIELD et al., 2009).

Apesar de existirem diferentes estratégias para o tratamento da dor neuropática,

nenhum agente farmacológico é totalmente eficaz na redução dos sintomas. O tratamento

pode ser resumido em dois tipos de terapia: preventiva e sintomática. O tratamento com

drogas preventivas, tais como a infusão de Ca2+ e Mg2+, vitamina E, glutationa, glutamina e

N-acetilcisteína objetivam reduzir a severidade dos sintomas neuropáticos em pacientes que

estão recebendo tratamento com antineoplásicos. Para serem eficazes, essas drogas

citoprotetoras não devem reduzir somente o efeito neurotóxico dos quimioterápicos, mas

também devem manter o efeito antitumoral desses agentes (KALEY; DEANGELIS, 2009;

PAICE, 2009).

Introdução


O tratamento sintomático consiste na utilização de agentes neuromoduladores que

irão interferir na patogênese da dor neuropática já instalada. Sendo esta condição clínica

parcial ou completamente insensível aos analgésicos comuns, as terapias médicas tendem a

envolver analgésicos adjuvantes, isto é, fármacos cuja indicação elementar não é a analgesia.

Deste modo, recomendações para o tratamento de primeira linha incluem a gabapentina,

lidocaína, opióides, tramadol e antidepressivos tricíclicos. Os de segunda linha são

lamotrigina, carbamazepina e inibidores seletivos da recaptação de serotonina (DWORKIN et

al., 2007).

1.6 Modelos experimentais de neuropatia periférica induzida por quimioterápicos

Análogos platinos (cisplatina, carboplatina e OXL), taxanos (paclitaxel e

docetaxel), vinca alcalóides (vincristina), talidomida e bortezomida são conhecidos por ter

como principal efeito adverso a ocorrência de neuropatia periférica (AUTHIER et al., 2009).

Nesse sentido, diversos autores vêm demonstrando esses efeitos através de modelos

experimentais no intuito de estudar o mecanismo associado à neurotoxicidade. Já estão bem

documentados na literatura modelos animais desenvolvidos para a neuropatia induzida pela

vincristina (WENG; CORDELLA; DOUGHERTY, 2003) e pelo paclitaxel (AUTHIER et al.,

2000). No entanto a neuropatia induzida por OXL ainda é pouco estudada a nível

experimental, existindo poucos modelos animais para o seu estudo.

O primeiro modelo experimental de NSP induzida por OXL foi desenvolvido por

Ling et al. (2007a). Esses autores administraram OXL (1, 2 ou 4mg/kg, i.p.) em ratos, duas

vezes por semana durante 4,5 semanas consecutivas e avaliaram o comportamento desses

animais mediante estímulos mecânicos e térmicos, assim como o efeito de drogas comumente

utilizadas em doenças neuropáticas como carbamazepina, gabapentina, anestésicos locais,

cloreto de cálcio e cloreto de magnésio.

Em um segundo trabalho, esses mesmos autores avaliaram, através da

imunohistoquímica, a participação de neuropeptídeos como a SP e o peptídeo relacionado ao

gene da calcitonina (CGRP) nesse tipo de neuropatia (LING et al., 2007b).

Ta, Low e Windebank (2009) desenvolveram um modelo de NSP induzida por

OXL (3mg/kg, i.p.) e cisplatina (2,3mg/kg, i.p.), em camundongos, onde esses compostos

Introdução


platinos eram administrados em dois ciclos de cinco dias consecutivos, e eram realizados

testes nociceptivos para avaliação da neuropatia.

No Laboratório de Farmacologia da Inflamação e do Câncer (LAFICA), a

doutoranda Renata Pontes, em sua dissertação de mestrado (2009) desenvolveu um modelo de

NSP induzida por OXL (1, 2 ou 4mg/kg, i.v.), também em camundongos, baseado no modelo

de Ling et al. (2007a). Ela também avaliou a administração de opióides e anticonvulsivantes

na inibição dessa neuropatia.

1.7 Agentes citoprotetores

Nos últimos anos, com os avanços na radioterapia e quimioterapia sistêmica, tem

se observado um aumento significativo na sobrevida dos pacientes com câncer, com melhora

da qualidade de vida. Contudo, apesar desse progresso, a maioria das drogas utilizadas no

tratamento de tumores sólidos começou a apresentar efeitos tóxicos e limitantes, levando à

redução das doses ou descontinuação do tratamento, assim como, o aumento da morbidade e

dos custos com tratamentos médicos e não médicos (HENSLEY et al., 1999; SANTINI;

GILES, 1999; SIOKA; KYRITSIS, 2009).

Um amplo número de órgãos e tecidos pode ser afetado pelos agentes

quimioterápicos. A toxicidade destes fármacos pode ser considerada fator limitante primário

da terapêutica do câncer. A medula óssea; o epitélio gastrointestinal, incluindo as mucosas; o

rim e a bexiga; os nervos periféricos; o SNC; o pulmão; o coração e as gônadas são,

particularmente, alvos da toxicidade advinda da quimioterapia. Para muitos pacientes,

intensificar as doses da quimioterapia e/ou radioterapia, dentro de um plano de melhorar e

estender a duração da resposta terapêutica pode ser limitado pela toxicidade desses fármacos

(SOUZA et al., 2000).

A combinação da quimioterapia com a radioterapia tem melhorado a resposta ao

tratamento do câncer ao longo dos anos, sendo o principal objetivo desta combinação a

obtenção do máximo efeito terapêutico, com morbidades mínimas aos tecidos normais.

Porém, a maioria desses tratamentos está associada ao aumento da toxicidade. Com isso, os

efeitos adversos do tratamento do câncer levaram ao desenvolvimento de agentes específicos

Introdução


designados a melhorar ou eliminar as toxicidades associadas à quimioterapia e radioterapia

(DZIEGIELEWSKI et al., 2008).

Do ponto de vista teórico, o agente citoprotetor ideal deveria apresentar as

seguintes características: 1) Seletividade, ou seja, habilidade para proteger tecidos não-

neoplásicos da toxicidade da terapia antitumoral, sem proteger as células tumorais; 2)

Atividade de amplo espectro, ou seja, deve proteger um grande número de tecidos normais

dos efeitos adversos da grande maioria dos agentes citotóxicos, com diferentes mecanismos

de ação; 3) Apresentar o mínimo de efeitos adversos (GRIGGS, 1998; HENSLEY et al.,

1999; SANTINI; GILES, 1999).

Nos últimos anos diversos agentes citoprotetores têm sido desenvolvidos no

intuito de proteger células normais dos efeitos adversos da terapia antitumoral. Entre esses

agentes estão as citocinas; fatores de crescimento, como a eritropoietina, fator estimulador de

colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e fator estimulador de colônias

granulocitárias (G-CSF); antioxidantes, como a glutationa, N-acetilcisteína e vitaminas E e C;

selênio; dexrazoxane; mesna e amifostina (AMF) (SCHUCHTER, 1997; GRIGGS, 1998;

SOUZA et al., 2000).

A tabela 4 apresenta os principais agentes citoprotetores disponíveis para

comercialização no Brasil.

Tabela 4 - Citoprotetores disponíveis no Brasil

AGENTE NOME COMERCIAL INDICAÇÃO

Amifostina Ethyol® Para reduzir a toxicidade cumulativa associada à administração de cisplatina e alquilantes

Dexarazoxane Cardioxane® Para reduzir a incidência e severidade da cardiopatia associada à administração da doxorrubicina

Mesna Mesna® Profilaxia da cistite hemorrágica induzida pela ifosfamida e ciclofosfamida

Fonte: Physicians ´Desk Reference, 1998

Introdução


1.8 Amifostina

Amifostina (Ethyol®), Walter-Reed (WR-2721), é um agente citoprotetor, de

amplo espectro, quimicamente conhecido como ácido etilfosforotióico S-2-[(3-aminopropil)

amino], que possui o potencial de proteger diversos órgãos e tecidos contra a toxicidade da

radioterapia e/ou da quimioterapia (BATISTA et al., 2007). Este fármaco foi desenvolvido

pela Walter Red Army Institute, na década de 1950, como parte das pesquisas realizadas pelo

exército americano no intuito de encontrar uma droga capaz de proteger tropas militares em

uma eventual guerra nuclear, durante o período da guerra fria. AMF foi escolhida, dentre

4400 fármacos, devido ao seu superior potencial protetor e seu perfil de uso clínico bastante

seguro (SCHUCHTER et al., 1995; HYPPOLITO et al., 2005; MARCU, 2009). A figura 6

representa a estrutura química da AMF.

Figura 6 - Estrutura química da amifostina Fonte: Souza et al., 2000

1.8.1 Mecanismo de ação da amifostina

AMF é uma pró-droga fosforilada, isto é, um fármaco inativo, que possui uma

vida média muito curta em circulação, sendo 90% do fármaco removido em 6 minutos (min).

Quando injetada, depende da ação enzimática de membrana para formar seu primeiro

metabólito ativo. Ela é desfosforilada nos tecidos por ação da enzima fosfatase alcalina de

membrana, formando um thiol livre (WR-1065), que neutraliza produtos reativos dos

organoplatinos e agentes alquilantes (Figura 7). Este metabólito ativo previne a formação de

complexos de DNA com quimioterápico e tem a capacidade de reverter os complexos que

Introdução


eventualmente já tenham sido formados (SCHUCHTER et al., 1995; WINCZURA; JASSEM,

2010).

O princípio de ação deste fármaco consiste nas diferenças fisiológicas entre as

células normais e tumorais, que interferem no transporte seletivo do fármaco para dentro das

células. Os tecidos normais apresentam altos níveis de fosfatase alcalina de membrana e pH

mais elevado, quando comparado com os tecidos tumorais. A diferença na estrutura das

membranas e na vascularização pobre dos tecidos tumorais também confere uma maior

conversão da AMF nos tecidos normais, facilitando, assim, a penetração ativa da droga nas

células normais e promovendo ação protetora através da “varredura” de radicais livres de O 2

citoplasmáticos, diminuição dos complexos de DNA formados por agentes alquilantes e

reparo do DNA nuclear (GRDINA; SIGDESTAD, 1989; BLOCK; GYLLENHAAL, 2005;

MARCU, 2009).

Figura 7 - Mecanismo de ação da amifostina

A AMF pode, ainda, reduzir a lesão mutagênica, sendo capaz de reduzir o impacto

carcinogênico de médio e longo prazo da terapia do câncer (YUHAS, 1980; SCHUCHTER et

Introdução


al, 1996). Quando dentro da célula, o WR-1065 é oxidado e forma um segundo metabólito, o

composto dissulfídico simétrico, designado WR-33278, dentre outros dissulfídicos

assimétricos. A formação deste novo composto libera íons hidrogênio (H+) para auxiliar no

mecanismo de reparo do DNA celular (VAN DER VIJGH; PETERS, 1994).

1.8.2 Farmacocinética da amifostina

AMF é rapidamente removida do plasma, com uma meia vida de distribuição

menor que 1 min e uma meia vida de eliminação de aproximadamente 8 min. Isto significa

que somente 10% da droga permanece no plasma 6 min após uma administração i.v. O rápido

desaparecimento da AMF do plasma ocorre devido sua rápida conversão em WR-1065,

através da ação da enzima fosfatase alcalina ligada à membrana, que também é rapidamente

removida da circulação, por sua rápida absorção em tecidos normais ou por sua conversão em

metabólitos dissulfídicos (CHRONIDOU et al., 2009).

Em contraste com a meia vida curta no plasma, AMF e seus metabólitos

apresentam um pico de concentração tecidual de 10-30 min após a administração da droga,

permanecendo intracelularmente por um longo período. AMF tende a acumular-se

predominantemente nos rins, glândulas salivares, coração, pulmões e intestino delgado. Por

não atravessar a barreira hematoencefálica, ela se concentra em pequenas quantidades no

cérebro e na medula espinhal (YALCIN et al., 2003). Os metabólitos WR-1065 e WR-33278

são excretados na urina 1 h após a administração da AMF. Esses dados demonstram que, tão

logo a AMF é absorvida pelo plasma, ela é rapidamente metabolizada e distribuída para os

tecidos, enquanto que a excreção dos produtos metabólicos ocorre de forma mais lenta

(KORST et al., 1996; FOSTER-NORA; SIDEN, 1997).

Geralmente AMF é administrada por via i.v., porém estudos recentes têm

demonstrado uma diminuição dos efeitos adversos causados pela infusão i.v. e uma maior

tolerância por parte do paciente quando administrada por via subcutânea (s.c.), sendo

mantidos níveis plasmáticos aceitáveis do metabólito WR-1065 (VAN DER VIJGH; KORST,

1996).

Introdução


1.8.3 Efeitos citoprotetores da amifostina

O composto WR-1065, a forma ativa da AMF, produz efeitos citoprotetores

ligando-se diretamente a agentes citotóxicos, removendo radicais livres e doando íons de H+

para o reparo do DNA. Os radicais livres são fatores de toxicidade induzidos por radioterapia

e algumas drogas quimioterápicas (FOSTER-NORA; SIDEN, 1997; GRIGGS, 1998;

CAPIZZI, 1999; YALCIN et al., 2003).

AMF tem a habilidade de proteger tecidos normais, e não células tumorais, da

radioterapia e quimioterapia (VAN DER VIJGH; PETERS, 1994; GRIGGS, 1998; PRIETO

GONZÁLEZ; FUCHS; SÁNCHEZ, 2009). Esta proteção seletiva é derivada de vários

mecanismos, tais como: 1) A concentração de fosfatase alcalina ligada a membrana é 275

vezes maior em tecidos normais do que em tumorais; 2) Esta droga é absorvida por difusão

passiva em tecidos normais, e por transporte ativo em células tumorais; 3) O menor

suprimento sanguíneo em tumores, quando comparados com tecidos normais, pode resultar

em menor absorção da droga pelas células tumorais; 4) O pH neutro dos tecidos normais

resulta em uma maior absorção da droga do que no ambiente ácido do tecido tumoral. Sendo

assim, esses mecanismos resultam em uma maior concentração da droga em tecidos normais

do que em tecidos tumorais (SCHUCHTER, 1997; FOSTER-NORA; SIDEN, 1997).

Os tecidos normais, potencialmente protegidos da toxicidade da quimioterapia e

da radioterapia, com a utilização da AMF, são: o epitélio gástrico; os rins; a medula óssea; o

coração; as glândulas salivares; os pulmões; o intestino delgado; a mucosa oral; a pele; os

testículos; o sistema imune; o fígado e o cólon (GRDINA; SIGDESTAD, 1989; CAPIZZI,

1999).

Pesquisadores do LAFICA vêm estudando o efeito citoprotetor da AMF em

modelos experimentais de inflamação gástrica e vesical. Nesse sentido já foi demonstrado que

AMF exerce um efeito protetor sobre a mucosa gástrica, prevenindo a lesão gástrica por

indometacina através de um mecanismo envolvendo radicais sufidrílicos não-protéicos e

migração de neutrófilos (MOTA, et al., 2007).

Em outro estudo foi observado um importante efeito protetor da AMF na cistite

hemorrágica induzida por ifosfamida e naquela induzida pela injeção intravesical de

acroleína, tendo-se evidenciado significativas inibições de parâmetros inflamatórios

(BATISTA et al., 2007).

Introdução


Também foi demonstrado na tese de doutorado de Mota (2004) o efeito da AMF

na redução da severidade da lesão inflamatória e da leucocitose no modelo de mucosite oral

induzida por 5-Fluorouracil, sugerindo um efeito citoprotetor local da AMF. Outros estudos

confirmaram o efeito protetor da AMF na prevenção da mucosite oral durante a radioterapia e

quimioterapia em pacientes com câncer de cabeça e pescoço (KOUVARIS et al., 2002;

BOURHIS; THEPHAMONGKHOL; PIGNON, 2004).

Em trabalho realizado no Serviço de Oncologia Clínica do Hospital do Câncer do

Ceará, sob a supervisão do Prof. Dr. Ronaldo Ribeiro, Mota, (2004) observou que o

tratamento preventivo com AMF em 30 pacientes submetidos à quimioterapia antineoplásica

foi capaz de prevenir a disfunção da barreira intestinal detectada pelo teste de permeabilidade

intestinal com lactulose / manitol, quando comparado com o grupo de 20 pacientes controles,

que receberam quimioterapia, mas não foram tratados também com AMF. Adicionalmente

observou-se que os pacientes tratados com AMF apresentaram menos mucosite intestinal,

com ou sem diarréia. Interessante ressaltar que neste trabalho, quando se analisou o subgrupo

de pacientes que recebeu quimioterapia à base de cisplatina, os efeitos protetores da AMF

foram ainda mais marcantes.

A proteção da AMF contra toxicidade cumulativa do platino à medula óssea foi

demonstrada em estudo randomizado, em pacientes portadoras de câncer de ovário. Pacientes

protegidas tiveram redução dos eventos de neutropenia febril (62% a menos), e significante

redução das transfusões de plaquetas e hemácias, dias de internação e uso de antibióticos

(KEMP et al., 1996).

Moore et al. (2003), em estudo clínico, randomizado, de fase II, não

demonstraram efeito protetor da AMF (749mg/m2) em pacientes submetidas à quimioterapia

com paclitaxel (175mg/m2) associada a cisplatina (75mg/m2), no tratamento do câncer

ovariano. Similarmente, Openshaw et al. (2004), em estudo clínico com pacientes com câncer

de mama, não observaram efeito protetor da AMF (740mg/m2) na neuropatia por paclitaxel

(725mg/m2), não encontrando diferenças significativas na redução dos sintomas neurotóxicos.

A possível ação citoprotetora da AMF também tem sido avaliada na

neurotoxicidade da OXL, sendo primeiramente relatada por Rudolph, Kuhn e Lipert (2000),

que demonstraram os resultados de um estudo clínico randomizado onde a OXL e o 5-FU

foram administrados em pacientes com câncer colorretal, e a AMF foi administrada em alguns

pacientes antes da quimioterapia. AMF demonstrou ser efetiva na redução significativa da

NSP, a julgar pelo número de dias que os pacientes apresentaram parestesia associada ao frio.

Introdução


Um ano depois, Penz et al. (2001), em um estudo piloto envolvendo somente 15

pacientes com câncer, demonstraram que AMF (500mg/m2, s.c.) administrada antes da OXL,

foi capaz de antagonizar a neurotoxicidade, sem comprometer o efeito antitumoral da droga.

Mais recentemente Lu et al. (2008) avaliaram a eficácia clínica da AMF na

prevenção da neurotoxicidade induzida pela OXL em 92 pacientes com câncer colorretal ou

gástrico. Foi demonstrado que a ocorrência de NSP nos graus 1-2 e 3-4 após a quimioterapia

foi significativamente menor no grupo pré-tratado com AMF, com relação ao grupo controle.

Em 1995, AMF foi aprovada pela FDA para a prevenção de nefrotoxicidade

cumulativa associada a altas doses de cisplatina em pacientes com câncer ovariano avançado e

câncer pulmonar, e para a redução da incidência de xerostomia induzida pela radioterapia em

pacientes com câncer de cabeça e pescoço. É o único agente citoprotetor especificamente

aprovado pela FDA como radioprotetor (SASSE et al., 2006; DZIEGIELEWSKI et al., 2008).

De acordo com o Guideline da Sociedade Americana de Oncologia Clínica acerca

do uso de agentes quimio e radioprotetores (HENSLEY et al., 2009), AMF foi considerada

como uma opção na prevenção da nefrotoxicidade da cisplatina, na redução dos graus 3 e 4 de

neutropenia, assim como na atenuação da xerostomia aguda e crônica, relacionada a

radioterapia em câncer de cabeça e pescoço. Neste estudo, entretanto, a AMF não foi

recomendada na proteção contra a trombocitopenia, na prevenção da neurotoxicidade e

ototoxicidade relacionadas à cisplatina, na neuropatia que acompanha o tratamento com

paclitaxel, na mucosite associada à radioterapia de câncer de cabeça e pescoço e na prevenção

da esofagite causada pelo tratamento quimioterápico e radioterápico concomitante no câncer

de pulmão não pequenas células.

1.8.4 Toxicidades da amifostina

AMF geralmente é bem tolerada, mas existem alguns efeitos adversos que podem

limitar sua dose e administração, tais como: hipotensão, náuseas, vômitos, sonolência e,

ocasionalmente, reações alérgicas que podem incluir rashs cutâneos, febre e choque

anafilático (KOUVARIS; KOULOULIAS; VLAHOS, 2007).

Ainda que a hipotensão seja o evento adverso mais significante clinicamente, as

interrupções no tratamento causadas por uma queda na pressão sanguínea são raras, ocorrendo

Introdução


em menos que 5% dos pacientes que recebem AMF (KOUVARIS; KOULOULIAS;

VLAHOS, 2007). Geralmente a hipotensão aparece quando a administração da AMF ocorre

por via i.v. Para evitar esse evento adverso algumas medidas são necessárias, tais como evitar

a administração de anti-hipertensivos antes da AMF, administrar AMF na posição supino,

monitorar a pressão sanguínea a cada 5 min, reduzir a velocidade de infusão da droga ou, em

último caso, suspender o tratamento. Se a pressão sistólica diminuir mais do que 20% de sua

linha de base, a infusão da AMF deve ser interrompida até que a pressão retorne ao normal. O

mecanismo da hipotensão ainda é impreciso, porém, parece estar relacionado ao seu efeito

vasodilatador (DE SOUZA et al., 2000; BLOCK; GYLLENHAAL, 2005).

A incidência e severidade dos efeitos adversos associados à AMF podem variar

de acordo com a via de administração. Uma metanálise recente de estudos randomizados

utilizando AMF relatou um aumento significativo do risco para graus 3 e 4 de hipotensão,

quando a AMF foi administrada por via i.v. (SASSE et al., 2006). Estudos sobre a

administração s.c. de AMF têm demonstrado uma menor incidência de hipotensão, náuseas e

vômitos (ANNE; CURRAN, 2007).

1.9 Justificativa e caracterização do problema

Ao longo dos últimos anos uma grande variedade de agentes antineoplásicos tem

crescido exponencialmente e contribuído para o aumento da qualidade de vida e sobrevida dos

pacientes com diferentes tipos de câncer. Contudo, os pacientes passaram a sofrer com os

efeitos adversos limitantes da terapia antitumoral, tais como náuseas, vômitos, mucosites,

infecções e neuropatias, estando esta última associada aos compostos platinos.

A OXL, terceira geração de agentes platinos, tem demonstrado um amplo espectro

de atividade antitumoral, representando o quimioterápico de primeira linha para o tratamento

do câncer colorretal metastático. Porém, sua neurotoxicidade é capaz de reduzir a

tolerabilidade ao tratamento e, com isso, levar a sua descontinuidade.

Nos últimos anos, a NSP induzida por OXL vem recebendo especial atenção por

dois motivos principais, tais como a refratariedade terapêutica e o desenvolvimento de

ferramentas diagnósticas para o reconhecimento deste tipo de patologia.

Introdução


A ausência de um tratamento eficaz na prevenção da sintomatologia dolorosa

sensitiva induzida pelo tratamento crônico com OXL despertou o interesse na pesquisa sobre

a AMF, que vem ganhando destaque por ser um fármaco citoprotetor de amplo espectro.

Contudo, até o momento não existem trabalhos experimentais na literatura avaliando o papel

da AMF na lesão nervosa periférica por OXL.

Desta forma, justifica-se o desenvolvimento de um conhecimento mais

aprofundado do efeito protetor da AMF na NSP experimental induzida pela OXL, como

forma de se buscar meios preventivos e terapêuticos que permitam uma melhoria significativa

na qualidade de vida dos pacientes, evitando, assim, a redução das doses dos quimioterápicos

e a interrupção do tratamento.

51

OBJETIVOS

Objetivos


2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Investigar o efeito protetor da amifostina no curso da neuropatia sensitiva

periférica experimental induzida por oxaliplatina.

2.2 Objetivos específicos

Avaliar o efeito da amifostina na neuropatia sensitiva periférica induzida pelo

tratamento crônico com oxaliplatina, através de testes nociceptivos (hiperalgesia mecânica

plantar e alodinia térmica ao frio);

Avaliar o efeito da amifostina sobre as alterações histopatológicas e sobre a

imunoexpressão de marcadores (c-Fos, caspase 3, IL-1, nitrotirosina, NOSi, NOSn, NMDA),

observados no corno dorsal da medula espinhal lombar de camundongos submetidos à

neuropatia sensitiva periférica por oxaliplatina.

53

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais e Métodos


3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Animais

Para a realização do presente estudo foram utilizados camundongos Swiss (Mus

musculus) machos, pesando entre 25-35 gramas (g), provenientes do Biotério Central da

Universidade Federal do Ceará (UFC).

3.2 Aspectos éticos

Os protocolos experimentais utilizados no presente estudo seguiram as

recomendações da UFC. A pesquisa foi submetida ao Comitê de Ética em Pesquisa Animal

(CEPA) da UFC, sendo aprovada de acordo com o protocolo no 27/08, no dia 25 de Junho de

2008.

3.3 Ambientes

Os animais foram acondicionados, em número de 20-25 animais, em gaiolas de

polipropileno, medindo 40 centímetros (cm) de comprimento, 31 cm de largura e 17 cm de

altura. O fundo das gaiolas era coberto por raspas de madeira, que eram trocadas duas vezes

por semana; e o teto era constituído por uma grade de metal com um espaço para apoiar o

bebedouro e a ração. Os animais permaneciam em um ambiente com temperatura de 25ºC,

com exaustão de ar, em um ciclo de 12h claro/escuro, com acesso à água e comida ad libitum.



3.4 Horário dos experimentos

Todos os experimentos, observações clínicas e comportamentais foram realizados

entre 8 e 18h. Os animais foram testados 1 vez por semana, e receberam as injeções 2 vezes

por semana, durante 4,5 semanas.

3.5 Observações clínicas

Diariamente foram realizados exames clínicos para avaliar o trofismo muscular, a

coloração e o aspecto da pele, sinais de infecção local ou generalizada e a marcha.

3.6 Aparelhos e instrumentos laboratoriais

• Agulhas (0,45 x 13) descartáveis;

• Alicate;

• Aparelho Von Frey Eletrônico (Insight);

• Autoclave;

• Balança analítica (Sartorious modelo BL2105);

• Balança para pesagem de animais modelo ID-1500 (Filizola);

• Beckers (SIMAX);

• Bomba de infusão (Insight);

• Bisturi;

• Caixas térmicas de isopor;

• Capela de fluxo laminar, vertical (modelo TROX do Brasil);

• Cassetes;

• Cronômetro;

• Eppendorf (1ml);



• Equipo (Embramed);

• Esparadrapo;

• Estufa de cultura celular com atmosfera de 5% de CO 2;

• Filtro estéril;

• Gaze estéril;

• Gelo;

• Grade para eppendorf;

• Grade para tubo falcon;

• Lâminas para imunohistoquímica (Fisherbrand);

• Luvas descartáveis;

• Material cirúrgico;

• Micropipetas automáticas (GILSON);

• Micrótomo Olympus;

• Papel alumínio;

• Pinça “dente de rato”;

• Pincel para marcação dos animais (PILOT);

• Pipeta automática de 200 e 1000;

• Ponteiras para as pipetas automáticas estéreis (Sigma);

• Seringas de 1ml e 5ml (BD Plastipak);

• Sonicador (THORNTOW - TT7);

• Termômetro;

• Tesoura;

• Tubos de plástico de 15ml e 45ml (FALCON)

3.7 Drogas, soluções e líquidos

• Água destilada;

• Água filtrada;

• Álcool a 70%;

• Amifostina (Ethyol, Sanofi-Aventis, 500mg/kg) diluída em solução salina;



• Anticorpos para imunohistoquimica (Santacruz Biotecnology);

• Eosina (Merk);

• Éter etílico (Dinâmica - Reagentes Analíticos);

• Formol a 10%;

• Hematoxilina (Reagen);

• Meio de cultura DMEM (Sigma);

• Oxaliplatina (Sigma 5mg/kg) diluída em solução glicosada;

• Paraformaldeído (PFA - 4%);

• Solução glicosada (D-glucose anidra - dextrose synth);

• Solução salina estéril (NaCl 0,9%);

• Soro fetal bovino (Sigma);

• Tampão Hanks com HEPES (Sigma)

3.8 Protocolo experimental e desenho do estudo

3.8.1 Indução da neuropatia sensitiva periférica por oxaliplatina

Para dar início aos experimentos com animais neuropáticos, foi realizado um

experimento piloto para confirmar a indução da NSP pela OXL, utilizando-se a melhor dose

encontrada de 1mg/kg no modelo experimental desenvolvido pela doutoranda Renata Pontes

em sua dissertação de mestrado (2009).

Inicialmente os animais eram pesados utilizando uma balança de precisão digital

Filizola®, e realizados todos os testes nociceptivos no tempo zero. Em seguida eles eram

divididos em grupos de 6 animais. Então eram anestesiados com éter, colocados em um

recipiente de acrílico para deixá-los imóveis, e recebiam uma injeção de OXL (0,3ml/30g,

i.v.) na dose de 1mg/kg, dissolvida em uma solução glicosada estéril, na veia lateral da cauda

do camundongo, utilizando-se uma agulha de calibre 0,45 x 0,75 cm em seringa de 1ml. Os

animais do grupo controle receberam somente a solução glicosada estéril. Essas injeções eram

administradas 2 vezes por semana, durante 4,5 semanas consecutivas, totalizando 9 injeções,

onde o grupo experimental recebia a OXL e o grupo controle recebia a solução glicosada. Os



testes nociceptivos e de atividade motora forçada eram realizados uma vez a cada semana,

durante 49 dias. A figura 8 representa o protocolo experimental utilizado para a indução da

NSP pela OXL.

Figura 8 - Protocolo experimental para indução da neuropatia sensitiva periférica por oxaliplatina

3.8.2 Avaliação do efeito protetor da amifostina na neuropatia sensitiva periférica induzida

por oxaliplatina

Para a obtenção da curva dose-resposta, AMF foi administrada em 5 doses

diferentes (1, 5, 25, 50 ou 100 mg/kg, s.c.). A administração de AMF foi realizada 30 min

antes de cada injeção de OXL, obedecendo ao protocolo de 2 injeções semanais, totalizando 9

injeções, durante 4,5 semanas. Foram realizados os testes nociceptivos e de atividade motora

forçada para a avaliação do efeito da AMF in vivo. Os animais eram sacrificados com 24h, 7,

14, 21 e 28 dias após o início do tratamento, para a remoção da medula espinhal lombar, e

posterior análise histopatológica e imunohistoquímica.

Peso Testes nociceptivos

Rota-Rod

9 injeções de OXL (1mg/kg, i.v.) 2x por

semana

0 1 30 49

Peso Testes nociceptivos 1x por semana

Rota-Rod 1x por semana

dias



A figura 9 representa o protocolo experimental utilizado para a avaliação do efeito

protetor da AMF na NSP induzida pela OXL.

Figura 9 - Protocolo experimental para avaliação do efeito protetor da amifostina na neuropatia sensitiva periférica por oxaliplatina

3.9 Testes para avaliação de hipernocicepção mecânica e térmica

3.9.1 Teste de hiperalgesia mecânica plantar

O aparelho Von-Frey Eletrônico (Insight®) registra a pressão em gramas

suficiente para provocar uma reação descrita como uma flexão da pata seguida por sua

retirada em contato com o aparelho (CUNHA et al., 2004).

A intensidade de hiperalgesia foi avaliada através do limiar de sensibilidade de

cada animal a um estímulo mecânico produzido pela pressão gradual exercida por um

filamento rígido acoplado a um aparelho que registra a pressão em gramas exercida na ponta

AMF (1, 5, 25, 50 ou 100mg/kg, s.c.)

OXL (1mg/kg, i.v.) Testes nociceptivos

30 min

4,5 semanas consecutivas

Coleta do segmento medular para análise histopatológica e imunohistoquímica



desse filamento. A estimulação mecânica foi exercida na superfície plantar das patas traseiras,

como é demonstrado na figura 10.

Os animais foram colocados individualmente em compartimentos de acrílico

transparentes (9 x 7 x 11 cm), localizados em uma plataforma de arame elevada para permitir

o acesso à superfície ventral das patas traseiras. A hiperalgesia mecânica plantar foi avaliada

antes (tempo zero) e após a injeção das drogas, semanalmente.

Figura 10 - Teste de hiperalgesia mecânica plantar

3.9.2 Teste de alodinia térmica ao frio

Baseado no modelo de Necker e Hellon (1978) e Authier et al. (2003), a cauda do

camundongo foi imersa em água fria mantida a uma temperatura de 10ºC para testar a

alodinia, sendo contado o tempo de permanência até o camundongo levantar a extremidade da

cauda em contato com a água fria. O mesmo era acomodado em um contensor de acrílico

transparente, onde esperava-se de 5 a 10 min até os animais se adaptarem ao ambiente e

ficarem imóveis para a realização do teste. As temperaturas foram constantemente mantidas e

monitorizadas através do uso de caixas isolantes de isopor e termômetros.



3.9.3 Teste do Rota-Rod

Para avaliar a motricidade, foi utilizado o Rota-Rod (Insight®), que é um

dispositivo que mede a atividade motora forçada, através da avaliação do equilíbrio e da

coordenação dos animais de laboratório para observar transtornos neurológicos e efeitos de

drogas (Rosland et al., 1990).

O Rota-Rod consiste em um cilindro rotatório, em acrílico resistente, com raio de

espaço de aproximadamente 2,7 cm e altura de 40 cm, motorizado com aceleração progressiva

e invariável de 5 a 37 rotações por minuto (RPM). Ele possui 4 baias, com espaço de 3 cm

para cada camundongo, de modo que 4 animais são avaliados por vez. O camundongo deve

caminhar continuamente sobre o cilindro em rotação para evitar a queda. As quatro baias

possuem sistema de detecção de queda do animal através de impacto, circuito micro-

processado, para cronometragem de permanência do animal na baia e contagem de vezes em

que este caiu.

Todos os animais da pesquisa foram treinados no Rota-Rod (5,5 RPM) 24h antes

da realização do experimento. O animal que permaneceu 2 min na barra foi selecionado para

o estudo.

3.10 Coleta da medula espinhal lombar (L4-L5)

Como foi citado anteriormente os animais recebiam as injeções de AMF, seguida

de OXL, 2 vezes por semana, durante 4,5 semanas consecutivas, e eram sacrificados com 24h,

7, 14, 21 e 28 dias após o início do tratamento, para a remoção da medula espinhal lombar.

Para a coleta dos segmentos medulares, os animais foram submetidos à perfusão

intracardíaca, através de uma bomba de infusão (Insight®). Inicialmente eles eram

anestesiados com tribromo (0,3 mg/kg), via intraperitonial (i.p.) e, em seguida, a porção

torácica do camundongo era removida para exposição do coração. Então era introduzida uma

agulha descartável de calibre 0,70 x 25 cm, sem o bisel, no ventrículo esquerdo cardíaco e era

realizado um pequeno corte na aurícula direita, para o escoamento das soluções (Figura 11A).

A agulha era conectada à bomba de infusão através de um equipo simples (Embramed®), onde

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T99-4GG2M11-3&_user=686348&_coverDate=10/21/2005&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=gateway&_origin=gateway&_sort=d&_docanchor=&view=c&_acct=C000037259&_version=1&_urlVersion=0&_userid=686348&md5=2a282554b98ef312f35ec2caaf42fde6&searchtype=a#bib26



os animais eram perfundidos via intracardíaca com solução salina (50ml) por 5 min e solução

de parafolmaldeído (PFA) 4% em solução salina tamponada (PBS) 0,1M (50ml) por mais 5

min.

Após a perfusão, os animais eram fixados sobre uma superfície plana, na posição

em decúbito ventral. Para a retirada da medula, primeiramente toda a pele do dorso do animal

era dissecada com uma tesoura, e então os discos vertebrais eram fragmentados com o auxílio

de um alicate, até que a medula fosse totalmente visualizada (Figura 11B). Após a remoção,

esse material era colocado em cassetes e fixado na solução de formol a 10% por 1h e, após

24h, colocados em etanol a 50%.

Figura 11 - A) Perfusão intracardíaca. B) Remoção da medula espinhal

3.11 Análise histopatológica

Para a verificação das alterações teciduais microscópicas observadas nas secções

medulares, foram realizados cortes histológicos do grupo tratado somente com OXL, dos

grupos pré-tratados com AMF e do grupo controle. Os tecidos foram fixados em formaldeído

tamponado 10% e incluídos em parafina. Os cortes foram obtidos através de micrótomo 4µm,

corados em lâminas com hematoxilina-eosina (HE) e examinados na microscopia ótica. Foi

observada a região do corno dorsal da medula espinhal lombar, onde se encontram as

terminações nervosas das fibras nervosas sensitivas. A análise histopatológica foi realizada de

A B



forma qualitativa pela Profa. Dra. Gerly Anne de Castro Brito, do Departamento de

Morfologia da UFC.

3.12 Análise imunohistoquimica

Os camundongos foram anestesiados, perfundidos e foram removidas as seções

L4-L5 da medula espinhal, para a realização da imunohistoquímica, seguindo esquema

cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias para o sacrifício, após o início do tratamento. As

injeções continuaram a ser administradas 2 vezes por semana, com exceção do grupo de 24h,

que recebeu apenas 1 injeção antes da eutanásia.

A medula espinhal foi removida com o auxílio de bisturis, pinças e alicates, e

fixada em formol a 10%. Posteriormente foram desidratadas em álcool e depois xilol, e então

parafinizadas.

No dia seguinte os tecidos foram cortados no plano transversal com 5µm de

espessura com o auxílio de um micrótomo. As secções de tecidos foram montadas em lâminas

silanizadas especiais para imunohistoquímica. O ensaio de imunohistoquímica foi realizado

na seguinte sequência: desparafinização e hidratação dos cortes, seguida da ativação

antigênica (98ºC por 15min) no microondas, inibição da peroxidase endógena com peróxido

de hidrogênio (H2O2) a 3% por 10min. Em seguida as secções foram incubadas com os

anticorpos primários policlonais rabbit (Santa Cruz Biotechnology) para a proteína c-Fos,

enzima óxido nítrico sintase induzível (NOSi), enzima óxido nítrico sintase neuronal (NOSn),

nitrotirosina, interleucina-1 (IL-1) e caspase 3; e com o anticorpo primário policlonal goat

(Santa Cruz Biotechnology) para o Ácido N-Metil-D-Aspartato (NMDA) - NMDAζ1 (NR1),

ficando over night a 4ºC. O controle negativo não recebeu anticorpo primário. No dia seguinte

foi realizada a incubação com o anticorpo secundário biotinilado universal (LSAB - DAKO)

durante 30 min e incubação com o complexo strepto-avidina-peroxidase (LSAB - DAKO)

durante 30 min. A coloração foi realizada através da adição do diaminobenzidina-peróxido

(DAB-H2O2), e foi realizada a contra-coloração com hematoxilina de Mayer. Então foi

realizada a desidratação e montagem das lâminas, que foram examinadas no microscópio

Leica® e registradas as fotografias dos cortes obtidos do corno dorsal da medula espinhal.



3.13 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). Para

comparação múltipla dos dados paramétricos dos testes comportamentais e farmacológicos foi

utilizada a análise de variância (Two-Way ANOVA), seguida pelo teste de Bonferroni.

O número (n) de animais correspondeu a 6 animais por grupo experimental.

Valores de p menores que 0,05 (p<0,05) foram considerados como indicativos de

significância. Todas as análises citadas acima foram realizadas utilizando o programa

GraphPad Prism (Prisma 5.0).

65

RESULTADOS

Resultados


4 RESULTADOS

4.1 Estudo da neuropatia sensitiva periférica (OXL - 1mg/kg)

4.1.1 Avaliação do desenvolvimento de hiperalgesia mecânica plantar induzida por

oxaliplatina

Na dissertação de mestrado de Renata Pontes (2009) foi desenvolvido um modelo

experimental de NSP induzida por OXL, em camundongos, onde foi realizada uma curva

dose-resposta para a escolha da melhor dose de OXL, através de testes mecânicos e térmicos.

No teste de hiperalgesia mecânica plantar todas as doses (1mg/kg, 2mg/kg e 3mg/kg)

mostraram redução significativa do limiar de sensibilidade, quando comparadas ao grupo

controle (glicose), como é mostrado na figura 12A.

Sendo assim optou-se, no presente trabalho, por inicialmente confirmar a eficácia

da menor dose (1mg/kg) de OXL, em um experimento piloto, antes de iniciar o tratamento

com AMF, como é mostrado na figura 12B.

Pode-se observar que a dose de 1mg/kg de OXL foi capaz de reduzir o limiar de

sensibilidade do animal ao estímulo mecânico, de forma significativa (p<0,001), a partir do

21º dia, até o final do teste.

Resultados


0 7 14 21 28 35 42 49 560

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Controle

OXL 4 mg/kg

OXL 2 mg/kg

OXL 1 mg/kg

***

***

**

******

**

***

******

***

******

***

******

Tempo (dias)

∆ d

e lim

iar

de r

etir

ada

da p

ata

(g)

0 7 14 21 28 35 42 49 560

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Controle

OXL 1mg/Kg

* * *

* * ** * *

* * * * * *

Tempo (dias)

∆ d

e lim

iar

de r

etir

ada

da p

ata

(g)

Figura 12 - Avaliação do desenvolvimento de hiperalgesia mecânica plantar induzida por oxaliplatina Painel A: OXL (1mg/kg, 2mg/kg e 4mg/kg, n=12) ou glicose (controle, n=12) foram administrados por via i.v. durante 4,5 semanas. Cada animal recebeu 9 injeções (setas). O teste nociceptivo (hiperalgesia plantar mecânica - Von-Frey Eletrônico) foi realizado 1 vez por semana durante 56 dias. Painel B: Confirmação da melhor dose de 1mg/kg de OXL. Os pontos representam a média ± EPM da variação do limiar de retirada da pata em gramas (intensidade da hiperalgesia). Os asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao controle (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; Two-Way ANOVA e teste de Bonferroni).

A

B

Resultados


4.1.2 Avaliação do desenvolvimento de alodinia térmica ao frio (10oC) induzida por

oxaliplatina

Como foi mencionado no experimento anterior, também foi realizado um

experimento piloto para confirmar o resultado observado no modelo experimental

desenvolvido por Renata Pontes (2009) sobre a melhor dose encontrada no teste térmico de

imersão da cauda em água fria (10ºC). Entre as doses de OXL testadas (1mg/kg, 2mg/kg e 4

mg/kg), constatou-se que a melhor resposta foi observada na dose de 1mg/kg, como mostra a

figura 13A.

Esse resultado também foi confirmado no experimento piloto (Figura 13B), onde

as duas curvas foram estatisticamente diferentes entre si (p<0,001), demonstrando que a dose

de 1mg/kg foi capaz de reduzir o limiar de sensibilidade do animal ao estímulo térmico, a

partir do 14º dia, até o final do teste.

Resultados


0 7 14 21 28 35 42 49 560

30

60

90

120

150

Controle

OXL 4mg/KgOXL 2mg/Kg

OXL 1mg/Kg**

***

Tempo (dias)

Tem

po d

e re

tirad

a da

cau

da (s

eg)

0 7 14 21 28 35 42 49 560

20

40

60

80

100

Controle

OXL 1mg/Kg******

************

Tempo (dias)

Tem

po d

e re

tirad

a da

cau

da (s

eg)

Figura 13 - Avaliação do desenvolvimento de alodinia térmica ao frio (10oC) induzida por oxaliplatina Painel A: OXL (1mg/kg, 2mg/kg, 4mg/kg, n=12) ou glicose (controle, n=12) foram administrados por via i.v. durante 4,5 semanas. Cada animal recebeu 9 injeções (setas). O teste nociceptivo (teste de imersão da cauda a 10ºC) foi realizado 1 vez por semana durante 56 dias. Painel B: Confirmação da melhor dose de 1mg/kg de OXL. Os pontos representam a média ± EPM do tempo de retirada da cauda em segundos (intensidade da alodinia). Os asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao controle (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; Two-Way ANOVA e teste de Bonferroni).

A

B

Resultados


4.2 Curva dose-resposta para escolha da melhor dose de amifostina

4.2.1 Efeito da amifostina sobre a hiperalgesia mecânica plantar induzida por oxaliplatina

No teste do Von-Frey Eletrônico observou-se que a OXL induziu a hiperalgesia

mecânica plantar, de forma significativa, a partir do 21º dia (p<0,001) de experimento. Todas

as doses de AMF (1mg/kg, 5mg/kg, 25mg/kg, 50mg/kg e 100mg/kg) foram capazes de

prevenir esse efeito, quando comparadas ao grupo tratado apenas com OXL. Entretanto, a

dose de 25mg/kg foi aquela que, de maneira mais precoce, mais eficaz e mais regular,

aumentou o limiar nociceptivo do animal, já a partir do 14º dia (p<0,05), alcançando o

máximo de inibição no 42º dia (98%), sendo considerada a melhor dose de AMF encontrada

na prevenção da hiperalgesia mecânica plantar induzida pela OXL (Figura 14).

Resultados


0 7 14 21 28 35 42 49 560

1

2

3

4

5

OXL 1mg/kg

AMF 1mg/kg + OXL 1mg/kg AMF 5mg/kg + OXL 1mg/kg


AMF 100mg/kg + OXL 1mg/kg

****

*** ******

* *** ****** *** **** ***

****** *** ***

***

***

*** ****

****** *** ***

Controle

*

***

***

*** ******

Tempo (dias)

∆ d

e lim

iar

de r

etir

ada

da p

ata

(g)

Figura 14 - Efeito da amifostina sobre a hiperalgesia mecânica plantar induzida por oxaliplatina OXL (1mg/kg, n=6) ou glicose (controle, n=6) foram administrados por via i.v. durante 4,5 semanas. AMF (1mg/kg, 5mg/kg, 25mg/kg, 50mg/kg, 100mg/kg, n=6) foi administrada por via s.c., 30 min antes da administração da OXL. Cada animal recebeu 9 injeções de OXL e de AMF (setas). O teste nociceptivo (hiperalgesia mecânica plantar - Von-Frey Eletrônico) foi realizado 1 vez por semana durante 49 dias. Os pontos representam a média ± EPM da variação do limiar de retirada da pata em gramas (intensidade da hiperalgesia). Os asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao controle (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; Two-Way ANOVA e teste de Bonferroni).

Resultados


4.2.2 Efeito da amifostina sobre a alodinia térmica ao frio (10ºC) induzida por oxaliplatina

No teste de imersão da cauda em água fria a 10ºC, a OXL induziu a alodinia

térmica, de forma significativa, através da diminuição do limiar de nocicepção do animal, a

partir do 14º dia (p<0,01). Todas as dose de AMF foram capazes de prevenir esse efeito,

aumentando de forma significativa (p<0,001) o limiar nociceptivo dos animais, como pode ser

observado na figura 15. A dose de 25mg/kg foi aquela que, de maneira mais precoce, mais

eficaz e mais regular, aumentou o limiar nociceptivo térmico, a partir do 21º dia (p<0,001),

alcançando o máximo de inibição no 35º dia (238%), sendo considerada a melhor dose de

AMF encontrada na prevenção da alodinia térmica ao frio induzida pela OXL.

Resultados


0 7 14 21 28 35 42 49 560

30

60

90

120

150

OXL 1mg/kg

AMF 1mg/kg + OXL1 mg/kg AMF 5mg/kg + OXL 1mg/kg


AMF 100mg/kg + OXL1mg/kg

**

*****

******

*** ***

****** *** ***

***

***

*** ***

*

******

****** ***

Controle

*********

******

**

Tempo (dias)

Tem

po d

e re

tirad

a da

cau

da (s

eg)

Figura 15 - Efeito da amifostina sobre a alodinia térmica ao frio (10oC) induzida por oxaliplatina OXL (1mg/kg, n=6) ou glicose (controle, n=6) foram administrados por via i.v. durante 4,5 semanas. AMF (1mg/kg, 5mg/kg, 25mg/kg, 50mg/kg, 100mg/kg, n=6) foi administrada por via s.c., 30 min antes da administração da OXL. Cada animal recebeu 9 injeções de OXL e de AMF (setas). O teste nociceptivo (teste de imersão da cauda a 10ºC) foi realizado 1 vez por semana durante 49 dias. Os pontos representam a média ± EPM da variação do limiar de retirada da pata em gramas (intensidade da alodinia). Os asteriscos indicam a diferença estatística em relação ao controle (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; Two-Way ANOVA e teste de Bonferroni).

Resultados


4.3 Efeito da amifostina sobre a atividade motora forçada (Rota-Rod) em camundongos

tratados com oxaliplatina

No teste do Rota-Rod (5,5 RPM) realizado com o grupo OXL e com os grupos

experimentais de doses diferentes de AMF (1mg/kg, 5mg/kg, 25mg/kg, 50mg/kg e 100mg/kg)

não foi observada variação significativa em nenhum grupo comparado com o controle nem

entre si, onde todos os animais permaneceram um tempo maior do que 2 min no cilindro

rotatório do aparelho, como se observa na figura 16.

Resultados


0 7 14 21 28 35 42 49 560

30

60

90

120

150

OXL 1mg/kg


AMF 25 mg/kg + OXL 1mg/kg AMF 50 mg/kg + OXL 1mg/kg


Controle

Tempo (dias)

Tem

po d

e pe

rman

ênci

a na

bar

ra (s

eg)

Figura 16 - Efeito da amifostina sobre a atividade motora forçada (Rota-Rod) em camundongos tratados com oxaliplatina OXL (1mg/kg, n=6) ou glicose (controle, n=6) foram administrados por via i.v. durante 4,5 semanas. AMF (1mg/kg, 5mg/kg, 25mg/kg, 50mg/kg, 100mg/kg, n=6) foi administrada por via s.c., 30 min antes da administração da OXL. Cada animal recebeu 9 injeções de OXL e de AMF. Os valores representam a média ± EPM do tempo dos animais no aparelho de Rota Rod durante 2 minutos a cada semana em um total de 49 dias. Foram utilizados 6 animais por grupo. Não houve diferença estatística entre os grupos (Two-Way ANOVA e teste de Bonferroni).

Resultados


4.4 Avaliação da média ponderal nos animais tratados com oxaliplatina e pré-tratados

com amifostina

O peso corporal dos animais foi mensurado antes de cada injeção de OXL e AMF

e antes de cada teste nociceptivo, durante todo o experimento. Não houve nenhuma variação

significativa entre o peso dos animais quando comparados o grupo tratado com OXL e os

grupos pré-tratados com AMF, como é mostrado na figura 17.

Resultados


0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 4220

25

30

35

40

45

OXL 1mg/kg




Controle

Tempo (dias)

Méd

ia p

onde

ral (

g)

Figura 17 - Avaliação da média ponderal nos animais tratados com oxaliplatina e pré-tratados com amifostina OXL (1mg/kg, n=6) ou glicose (controle, n=6) foram administrados por via i.v. durante 4,5 semanas. AMF (1mg/kg, 5mg/kg, 25mg/kg, 50mg/kg, 100mg/kg, n=6) foi administrada por via s.c., 30 min antes da administração da OXL. Cada animal recebeu 9 injeções de OXL e de AMF. O peso dos animais foi medido antes de cada administração de OXL e AMF, sendo verificado 2 vezes por semana até o final das administrações. Os valores representam a média ± EPM e não houve diferença estatística em relação ao controle (Two-Way ANOVA e teste de Bonferroni).

Resultados


4.5 Análise histopatológica do corno dorsal da medula espinhal lombar

Foi analisado a nível microscópico (através de análise histopatológica) a presença

de alteração morfológica no corno dorsal da medula espinhal dos camundongos tratados com

OXL e pré-tratados com AMF. Não foram observados infiltrados celulares inflamatórios e

necrose. Contudo, foi possível observar no corno dorsal da medula espinhal de camundongos

tratados apenas com OXL, a partir do 21º dia, a presença de espaços lacunares entre as células

nervosas, sugerindo edema do tecido nervoso (seta). Também se observou a diminuição

progressiva do tamanho das células nervosas (neurônios piquinóticos), sugerindo haver uma

atrofia dos neurônios (cabeça de seta) nos animais tratados com OXL (Figura 18). Essas

alterações foram completamente revertidas nas amostras obtidas de animais tratados com

OXL, mas pré-tratados com AMF (Figura 19).

Resultados


Figura 18 - Curso temporal das alterações histopatológicas observadas na neuropatia sensitiva periférica por oxaliplatina Os animais foram tratados com OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para avaliação histopatológica, seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle Normal (Veículo: glicose). B: OXL após 1 injeção. C: OXL após 3 injeções. D: OXL após 5 injeções. E: OXL após 7 injeções. F: OXL após 9 injeções. Coloração hematoxilina-eosina (aumento 400x). Observou-se presença de edema do tecido nervoso (seta), assim como atrofia dos neurônios (cabeça de seta), partir do 21º dia.

Normal

A B

C D

E F

OXL 24h

OXL 7d OXL 14d

OXL 21d OXL 28d

Resultados


Figura 19 - Análise histopatológica do corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina Os animais foram tratados com AMF (25mg/kg, s.c.), seguida de OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para análise histopatológica, seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle Normal (Veículo: glicose). B e D: OXL após 7 e 9 injeções, respectivamente. C e E: AMF + OXL após 7 e 9 injeções, respectivamente. Coloração hematoxilina-eosina (aumento 400x). Observou-se a presença de edema do tecido nervoso (seta), assim como atrofia dos neurônios (cabeça de seta), a partir do 21º dia, nos animais tratados apenas com OXL. Essas alterações não foram encontradas nos animais pré-tratados com AMF.

Normal

A

B

OXL 21d AMF + OXL 21d

OXL 28d

C

D E

AMF + OXL 28d

Resultados


4.6 Avaliação de imunoexpressão de marcadores no corno dorsal da medula espinhal lombar

Após ser observado, através dos resultados comportamentais, que a AMF foi

capaz de exercer uma proteção contra a hiperalgesia e a alodinia induzidas pela OXL,

resolveu-se investigar, por meio da imunohistoquímica, o papel de alguns marcadores, que

poderiam estar participando desta ação citoprotetora no corno dorsal da medula espinhal de

camundongos.

Após a administração de OXL (1mg/kg, i.v.) e AMF (25mg/kg, s.c.), os animais

foram sacrificados, seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias, onde a

medula espinhal foi removida e parafinizada, para posterior realização da imunohistoquímica

para os seguintes marcadores: proteína c-Fos, caspase 3, NOSn, NOSi, IL-1, nitrotirosina e

receptor NMDA.

Ao analisar a imunohistoquímica para a proteína c-Fos em amostras obtidas do

corno dorsal da medula espinhal dos camundongos, observou-se que houve um aumento

importante de sua imunoexpressão no grupo tratado somente com OXL, a partir do 21º dia,

persistindo até o 28º dia, quando comparado ao grupo normal (Figura 20). Esta

imunoexpressão de c-Fos foi reduzida de forma contundente, embora parcial, pelo pré-

tratamento com AMF (Figura 21).

Na imunohistoquímica para caspase 3 observou-se que o tratamento com OXL

aumentou sua imunoexpressão, a partir do 14º dia, quando comparado ao grupo normal

(Figura 22). AMF, no entanto, não foi capaz de modificar tal imunoexpressão (Figura 23).

Quanto à imunohistoquímica para a citocina IL-1, não foi observado aumento de

sua imunoexpressão nos animais tratados com OXL, assim como naqueles pré-tratados com

AMF (Figura 24 e 25).

Na imunohistoquímica para a nitrotirosina observou-se um aumento de sua

imunoexpressão no grupo tratado somente com OXL, a partir do primeiro dia de

administração do quimioterápico até o 28º dia, sendo mais acentuada na 24ª hora, quando

comparado ao grupo normal (Figura 26). O pré-tratamento com AMF foi capaz de reverter

esse efeito, reduzindo a imunoexpressão da nitrotirosina (Figura 27).

Ao avaliar a participação de NOSi na NSP induzida por OXL observou-se que

esta foi capaz de promover um aumento da imunoexpressão de NOSi, já a partir de 24h, sendo

Resultados


mais acentuado no 21º e 28º dias, quando comparado ao grupo normal (Figura 28). O pré-

tratamento com AMF, no entanto, não foi capaz de modificar tal efeito (Figura 29).

Similarmente, na avaliação de NOSn observou-se um aumento de sua

imunomarcação no grupo tratado apenas com OXL, a partir do 14º dia, quando comparado ao

grupo normal (Figura 30). Essa imunomarcação também não foi modificada pelo pré-

tratamento dos animais com AMF (Figura 31).

Quanto aos receptores NMDA, observou-se uma diminuição progressiva, tempo-

dependente, de sua imunoexpressão, nas amostras de corno dorsal da medula espinhal de

animais tratados apenas com OXL (Figura 32). Por outro lado, observou-se que o pré-

tratamento com AMF resultou em uma reversão deste efeito, levando a um aumento

progressivo da imunoexpressão do receptor NMDA, já a partir de 24h, culminando com uma

expressiva marcação aos 28 dias (Figura 33).

Resultados


Figura 20 - Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para c-Fos no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados apenas com oxaliplatina Os animais foram tratados com OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para realização de imunohistoquímica para c-Fos (aumento de 400x), seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle Normal (Veículo: glicose). B: OXL após 1 injeção. C: OXL após 3 injeções. D: OXL após 5 injeções. E: OXL após 7 injeções. F: OXL após 9 injeções. Observou-se um aumento importante da imunomarcação para c-Fos, a partir do 21º dia, persistindo até o 28º dia, quando comparado ao grupo normal.

Normal

A B

C D

E F

OXL 24h

OXL 7d OXL 14d

OXL 21d OXL 28d

Resultados


Figura 21 - Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para c-Fos no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina Os animais foram tratados com AMF (25mg/kg, s.c.), seguida de OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para realização de imunohistoquímica para c-Fos (aumento de 400x), seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle negativo: medula espinhal removida no 7º dia após administração de OXL, na ausência de anticorpo primário. B: Controle Normal (Veículo: glicose). C e E: OXL após 7 e 9 injeções, respectivamente, mostrando aumento da imunomarcação para c-Fos. D e F: AMF + OXL após 7 e 9 injeções, respectivamente, mostrando redução da imunomarcação para c-Fos.

Cont. Neg.

A B

Normal

C

OXL - 21d

D

AMF + OXL 21d

E

OXL - 28d

F

AMF + OXL 28d

Resultados


Figura 22 - Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para caspase 3 no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados apenas com oxaliplatina Os animais foram tratados com OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para realização de imunohistoquímica para caspase 3 (aumento de 400x), seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle Normal (Veículo: glicose). B: OXL após 1 injeção. C: OXL após 3 injeções. D: OXL após 5 injeções. E: OXL após 7 injeções. F: OXL após 9 injeções. Observou-se um aumento da imunomarcação para caspase 3, a partir do 14º dia, quando comparado ao grupo normal.

A

Normal

B

C D

E F

OXL 24h

OXL 7d OXL 14d

OXL 21d OXL 28d

Resultados


Figura 23 - Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para caspase 3 no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina Os animais foram tratados com AMF (25mg/kg, s.c.), seguida de OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para realização de imunohistoquímica para caspase 3 (aumento de 400x), seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle negativo: medula espinhal removida no 7º dia após administração de OXL, na ausência de anticorpo primário. B: Controle Normal (Veículo: glicose). C e E: OXL após 5 e 9 injeções, respectivamente, mostrando aumento da imunomarcação para caspase 3. D e F: AMF + OXL após 5 e 9 injeções, respectivamente, não modificando a imunomarcação para caspase 3.

A

Cont. Neg.

B

Normal

C

OXL - 28d

F

AMF + OXL 28d

OXL - 14d

E

D

AMF + OXL 14d

Resultados


Figura 24 - Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para IL-1 no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados apenas com oxaliplatina Os animais foram tratados com OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para realização de imunohistoquímica para IL-1 (aumento de 400x), seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle Normal (Veículo: glicose). B: OXL após 1 injeção. C: OXL após 3 injeções. D: OXL após 5 injeções. E: OXL após 7 injeções. F: OXL após 9 injeções. Não foi observado aumento da imunomarcação para IL-1 nos animais tratados com OXL.

A

Normal

E F

OXL 21d OXL 28d

OXL 24h

B

OXL 7d

C

OXL 14d

D

Resultados


Figura 25 - Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para IL-1 no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina Os animais foram tratados com AMF (25mg/kg, s.c.), seguida de OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para realização de imunohistoquímica para IL-1 (aumento de 400x), seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle negativo: medula espinhal removida no 7º dia após administração de OXL, na ausência de anticorpo primário. B: Controle Normal (Veículo: glicose). C e E: OXL após 7 e 9 injeções, respectivamente. D e F: AMF + OXL após 7 e 9 injeções, respectivamente. Não foi observado aumento da imunomarcação para IL-1 nos animais tratados com OXL, assim como naqueles pré-tratados com AMF.

A

Cont. Neg.

B

Normal


OXL 28d

C D

E E

AMF + OXL 28d

Resultados


Figura 26 - Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para nitrotirosina no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados apenas com oxaliplatina Os animais foram tratados com OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para realização de imunohistoquímica para nitrotirosina (aumento de 400x), seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle Normal (Veículo: glicose). B: OXL após 1 injeção. C: OXL após 3 injeções. D: OXL após 5 injeções. E: OXL após 7 injeções. F: OXL após 9 injeções. Foi observado um aumento da imunomarcação para nitrotirosina, a partir de 24h após o início do tratamento com OXL.

Normal

A B

C D

E F

OXL 24h

OXL 7d OXL 14d

OXL 21d OXL 28d

Resultados


Figura 27 - Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para nitrotirosina no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina Os animais foram tratados com AMF (25mg/kg, s.c.), seguida de OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para realização de imunohistoquímica para nitrotirosina (aumento de 400x), seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle negativo: medula espinhal removida no 7º dia após administração de OXL, na ausência de anticorpo primário. B: Controle Normal (Veículo: glicose). C e E: OXL após 1 e 7 injeções, respectivamente, mostrando aumento da imunomarcação para nitrotirosina. D e F: AMF + OXL após 1 e 7 injeções, respectivamente, mostrando redução da imunomarcação para nitrotirosina.

A

Cont. Neg. Normal

OXL 24h AMF + OXL 24h

OXL 21d

B

C D

E F

AMF + OXL 21d

Resultados


Figura 28 - Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para NOSi no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados apenas com oxaliplatina Os animais foram tratados com OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para realização de imunohistoquímica para NOSi (aumento de 400x), seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle Normal (Veículo: glicose). B: OXL após 1 injeção. C: OXL após 3 injeções. D: OXL após 5 injeções. E: OXL após 7 injeções. F: OXL após 9 injeções. Foi observado um aumento da imunomarcação para NOSi a partir de 24h, sendo mais acentuado no 21º e 28º dias, quando comparado ao grupo normal.

Normal

A B

C D

E F

OXL 24h

OXL 7d OXL 14d

OXL 21d OXL 28d

Resultados


Figura 29 - Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para NOSi no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina Os animais foram tratados com AMF (25mg/kg, s.c.), seguida de OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para realização de imunohistoquímica para NOSi (aumento de 400x), seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle negativo: medula espinhal removida no 7º dia após administração de OXL, na ausência de anticorpo primário. B: Controle Normal (Veículo: glicose). C e E: OXL após 7 e 9 injeções, respectivamente, mostrando aumento da imunomarcação para NOSi. D e F: AMF + OXL após 7 e 9 injeções, respectivamente, não modificando a imunomarcação para NOSi.

A

Cont. Neg. Normal


OXL 28d

B

C D

E F

AMF + OXL 28d

Resultados


Figura 30 - Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para NOSn no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados apenas com oxaliplatina Os animais foram tratados com OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para realização de imunohistoquímica para NOSn (aumento de 400x), seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle Normal (Veículo: glicose). B: OXL após 1 injeção. C: OXL após 3 injeções. D: OXL após 5 injeções. E: OXL após 7 injeções. F: OXL após 9 injeções. Foi observado um aumento da imunomarcação para NOSn, a partir de 14º dia, quando comparado ao grupo normal.

Normal

A

E F

OXL 21d OXL 28d

OXL 14d

D

OXL 24h

B

OXL 7d

C

Resultados


Figura 31 - Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para NOSn no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina Os animais foram tratados com AMF (25mg/kg, s.c.), seguida de OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para realização de imunohistoquímica para NOSn (aumento de 400x), seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle negativo: medula espinhal removida no 7º dia após administração de OXL, na ausência de anticorpo primário. B: Controle Normal (Veículo: glicose). C e E: OXL após 7 e 9 injeções, respectivamente, mostrando aumento da imunomarcação para NOSn. D e F: AMF + OXL após 7 e 9 injeções, respectivamente, não modificando a imunomarcação para NOSn.

A

Cont. Neg. Normal

OXL 21d

OXL 28d

AMF + OXL 21d

B

C D

E F

AMF + OXL 28d

Resultados


Figura 32 - Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para o receptor NMDA no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados apenas com oxaliplatina Os animais foram tratados com OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para realização de imunohistoquímica para NMDA (aumento de 400x), seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle Normal (Veículo: glicose). B: OXL após 1 injeção. C: OXL após 3 injeções. D: OXL após 5 injeções. E: OXL após 7 injeções. F: OXL após 9 injeções. Foi observada uma redução progressiva da imunomarcação para o receptor NMDA a partir de 24h após o início do tratamento com OXL.

Normal

A B

C D

E F

OXL 24h

OXL 7d OXL 14d

OXL 21d OXL 28d

Resultados


Figura 33 - Fotomicrografias da marcação de imunohistoquímica para o receptor NMDA no corno dorsal da medula espinhal de camundongos tratados com amifostina e oxaliplatina Os animais foram tratados com AMF (25mg/kg, s.c.), seguida de OXL (1mg/kg, i.v.), e a medula espinhal foi removida para realização de imunohistoquímica para NMDA (aumento de 400x), seguindo o esquema cronológico de 24h, 7, 14, 21 e 28 dias. O protocolo de 2 injeções por semana foi seguido, com exceção do grupo 24h, que recebeu apenas uma injeção antes da eutanásia. A: Controle negativo: medula espinhal removida no 7º dia após administração de OXL, na ausência de anticorpo primário. B: Controle Normal (Veículo: glicose). C e E: OXL após 7 e 9 injeções, respectivamente, mostrando redução da imunomarcação para o receptor NMDA. D e F: AMF + OXL após 7 e 9 injeções, respectivamente, mostrando aumento da imunomarcação para o receptor NMDA.

Cont. Neg. Normal

A B

C D

E F



97

DISCUSSÃO

Discussão


5 DISCUSSÃO

A neurotoxicidade, manifestada como uma NSP, representa o principal efeito

dose-limitante do tratamento com o agente antineoplásico OXL. A conseqüência do

surgimento desta manifestação neurológica pode levar à redução da tolerabilidade ao

tratamento quimioterápico, influenciando, consequentemente, de forma negativa, a resposta

ao tratamento, bem como a qualidade de vida dos pacientes.

As opções terapêuticas no combate a esta afecção tem se resumido a poucas

drogas, entre elas a gabapentina, a carbamazepina e a fluoxetina, as quais têm sido utilizadas

há algum tempo em outros tipos de neuropatias periféricas, como a neuropatia diabética.

No presente estudo foi demonstrado que o fármaco antioxidante AMF promoveu

uma importante ação protetora nas alterações sensitivas e teciduais observadas na NSP

experimental induzida pela OXL, em camundongos. Adicionalmente este estudo evidenciou

que tal efeito neuroprotetor parece ser consequente a uma ação antioxidante e a um efeito

antiapoptótico.

O modelo de neuropatia por OXL utilizado na presente investigação foi aquele

desenvolvido no LAFICA por ocasião da dissertação de mestrado de Renata Pontes (2009),

que tomou por base os modelos desenvolvidos por Ling et al. (2007a), em ratos e o de Ta,

Low e Windebank (2009), em camundongos.

Constatou-se mais uma vez que o modelo em camundongos se adequou

perfeitamente à observação das principais características clínicas encontradas na neuropatia

por OXL em seres humanos, quais sejam, hiperalgesia e alodinia, entre outras. Além disso, o

camundongo é um animal mais econômico tanto com relação à quantidade de drogas e

reagentes gastos no estudo, quanto aos gastos com a sua manutenção em biotério.

A nomenclatura utilizada no presente trabalho, hiperalgesia e alodinia, foram

introduzidas pela IASP, em 1982, que redefiniu a hiperalgesia como uma resposta dolorosa

aumentada a um estímulo previamente doloroso; e a alodinia como uma resposta dolorosa a

um estímulo que antes não era doloroso. Porém, alguns autores argumentam que essas

definições foram elaboradas para serem utilizadas em humanos, uma vez que não é possível

determinar objetivamente se a sensação apresentada pelo animal em resposta a um estímulo

doloroso é realmente compatível com a sensação de dor, já que o mesmo não pode se

comunicar. Os mesmos autores ainda afirmam que essas características de alteração

Discussão


patológica das vias de sensação dolorosa não devem ser avaliadas nos modelos experimentais

usuais de nocicepção animal, sugerindo, assim, a utilização do termo hipernocicepção para

descrever a intensidade de nocicepção em modelos animais de neuropatia experimental

(SACHS; CUNHA; FERREIRA, 2004; FERREIRA et al., 2009). Contudo, como o uso

desses termos tem-se generalizado na maioria dos trabalhos e pesquisas envolvendo modelos

animais de dor, optou-se por utilizá- los na denominação das alterações de sensibilidade

observadas na presente investigação.

De forma análoga à neuropatia por OXL em humanos, não foi observada na

presente investigação nenhuma alteração no trofismo muscular, na coloração e no aspecto da

pele, assim como nenhum sinal de perda de peso e de infecção local ou generalizada durante

todo o período de experimentação. Assim como no trabalho de Ta, Low e Windebank (2009),

que também demonstraram não haver diferença no peso corporal dos animais tratados com

OXL e cisplatina.

Em se tratando de um estudo comportamental, todos os testes nociceptivos foram

realizados em um ambiente silencioso e com exaustão e iluminação adequadas, em dias

diferentes daqueles destinados à administração das drogas, no intuito de causar o mínimo de

estresse aos animais.

No presente estudo foi observado que a OXL induziu hiperalgesia mecânica

plantar e alodinia térmica ao frio (10ºC), através da diminuição do limiar de nocicepção do

animal, a partir do 21º dia e 14º dia, respectivamente; e todas as doses de AMF foram capazes

de prevenir essas alterações, sendo a dose de 25mg/kg aquela que, de forma mais precoce,

mais eficaz e mais regular, conseguiu prevenir esse efeito a partir do 14º dia na hiperalgesia

mecânica plantar e a partir do 21º dia na alodinia térmica ao frio (10ºC).

Segundo Greenspan e McGillis (1994) a medição da hiperalgesia utilizando o

dispositivo de Von Frey Eletrônico, utilizado no presente estudo, apresenta algumas

vantagens com relação ao Von Frey Filamentos, tais como: redução do número de tentativas

necessárias para avaliar o limiar nociceptivo, eliminação de problemas de padronização de

filamentos, estimulação de áreas de tamanhos semelhantes e gravação automática do valor

final.

Cunha et al. (2004) demonstraram que o dispositivo Von Frey Eletrônico era mais

sensível que o Von Frey Filamentos para a detecção da hipernocicepção (hiperalgesia)

induzida pelos agentes inflamatórios carragenina e prostaglandina E2 em camundongos. Os

Discussão


autores observaram uma diminuição do limiar de nocicepção, de maneira dose-dependente, a

partir da primeira hora após a administração dessas substâncias.

Joseph e Levine (2009) desenvolveram um modelo de neuropatia, em ratos,

através da administração de OXL em dose única de 2mg/kg, tendo sido possível também se

demonstrar a presença de alodinia térmica ao frio e ao calor, dose-dependente, e uma

hiperalgesia mecânica. Ainda neste estudo, demonstrou-se que a hiperalgesia mecânica,

encontrada na fase tardia da neuropatia, foi antagonizada pelo co-tratamento dos animais com

agentes antioxidantes (acetil-L-cartinina, ácido α-lipóico e vitamina C) e com inibidores da

Cadeia Transportadora de Elétrons Mitocondriais (mETC), relacionados com a produção de

espécies reativas de oxigênio (ROS). Esses achados corroboram com os resultados ora

apresentados, utilizando-se um outro agente antioxidante, no caso a AMF, que também foi

capaz de inibir a hiperalgesia mecânica plantar e alodinia térmica ao frio. A partir daí

aventou-se a hipótese de que o efeito protetor da AMF pudesse também estar relacionado à

inibição da geração de ROS.

Attal et al. (2009), em um estudo quantitativo em humanos, observaram que a

administração de OXL (85mg/m2) foi capaz de causar hiperalgesia e alodinia térmica, duas

semanas após o terceiro ciclo de tratamento, sem no entanto provocar hiperalgesia mecânica,

o que contrasta com o trabalho aqui apresentado, onde observou-se que a OXL induziu

também hiperalgesia mecânica plantar, a partir do 21º dia de tratamento. Esse fato pode ser

devido ao tipo de dispositivo, Von Frey Filamentos, utilizado para avaliação da hiperalgesia

mecânica por aqueles autores, que foi diferente do aqui utilizado, Von Frey Eletrônico. O

tempo de avaliação da hiperalgesia também foi diferente nos dois trabalhos: 2 semanas após

cada ciclo de tratamento, no trabalho de Attal et al. (2009) e semanalmente, no presente

estudo. Outro ponto que deve ser considerado é que o trabalho deles foi realizado em

humanos, em um total de 9 ciclos de quimioterapia, com intervalo de 2 semanas entre eles,

enquanto o protocolo aqui utilizado foi realizado em animais, com 9 injeções de OXL, sendo

administrada 2 injeções a cada semana, o que pode explicar o aparecimento mais precoce dos

sinais de alodinia térmica e também a hiperalgesia mecânica.

Esses mesmos autores também evidenciaram uma relação entre a neuropatia

aguda e crônica, demonstrando que os sintomas neuropáticos agudos (parestesias e

disestesias), apresentados pelos pacientes logo após o primeiro ciclo, estavam associados com

o risco aumentado de desenvolvimento da neuropatia crônica nos últimos ciclos de

tratamento. Park et al. (2009a), em outro estudo em humanos, também demonstraram haver

Discussão


essa relação, desde que observaram que aqueles pacientes que apresentaram alterações de

excitabilidade neuronal no período agudo eram mais suscetíveis a desenvolver a forma

crônica da neuropatia, após o sétimo ciclo de tratamento.

A possível ação citoprotetora da AMF tem sido avaliada na neurotoxicidade da

OXL, sendo primeiramente relatada por Rudolph, Kuhn e Lipert (2000), que demonstraram os

resultados de um estudo clínico randomizado onde a OXL e o 5-FU foram administrados em

pacientes com câncer colorretal, e AMF foi administrada em alguns pacientes antes da

quimioterapia. AMF demonstrou ser efetiva na redução significativa da NSP, a julgar pelo

número de dias que os pacientes apresentaram parestesia associada ao frio.

Um ano depois, Penz et al. (2001), em um estudo piloto envolvendo somente 15

pacientes com câncer, demonstraram que AMF (500mg/m2, s.c.), administrada antes da OXL,

foi capaz de antagonizar a neurotoxicidade, sem comprometer o efeito antitumoral da droga.

Em 2003, Yalcin e colaboradores demonstraram, através de estudos de análise

histopatológica no nervo ciático de ratos, que AMF (200mg/kg) foi capaz de prevenir a

neurotoxicidade motora induzida pela cisplatina (1mg/kg), protegendo a degeneração de

fibras mielínicas e a diminuição da amplitude do potencial de ação do nervo peroneal.

Moore et al. (2003), em estudo clínico, randomizado, de fase II, não

demonstraram efeito protetor da AMF (749mg/m2) em pacientes submetidas à quimioterapia

com paclitaxel (175mg/m2) associada a cisplatina (75mg/m2), no tratamento do câncer

ovariano. Similarmente, Openshaw et al. (2004), em estudo clínico com pacientes com câncer

de mama, não observaram nenhum efeito significativo da AMF (740mg/m2) na neuropatia por

paclitaxel (725mg/m2), não encontrando diferenças significativas na redução dos sintomas

neurotóxicos. Eles justificam esses resultados afirmando que o mecanismo citoprotetor da

AMF ocorre ao nível do DNA, enquanto a neuropatia induzida pelo paclitaxel está associada à

inibição do transporte axoplasmático dos microtúbulos. Esses dados podem então justificar a

proteção na AMF na NSP experimental induzida por OXL, observada no presente trabalho, já

que o mecanismo antitumoral da OXL corresponde à inibição da transcrição e replicação do

DNA celular.

Lu et al. (2008) avaliaram a eficácia clínica da AMF na prevenção da

neurotoxicidade induzida pela OXL em 92 pacientes com câncer colorretal ou gástrico. Foi

demonstrado que a ocorrência de NSP nos graus 1-2 e 3-4 após a quimioterapia foi

significativamente menor no grupo pré-tratado com AMF, com relação ao grupo controle.

Discussão


Mais recentemente Albers e colaboradores (2011), em revisão sistemática acerca

de intervenções terapêuticas preventivas na neuropatia periférica causada por cisplatina e

compostos correlatos, entre os quais a OXL, identificaram 16 estudos randomizados

envolvendo 5 possíveis agentes quimioprotetores até 2006 e mais 11 novos estudos, incluindo

9 possíveis agentes quimiopreventivos até 2010 (total de 1.537 pacientes). Entre esses agentes

estavam incluídos: AMF, acetilcisteína, cálcio e magnésio, glutationa, oxcarbamazepina,

vitamina E, dietilditiocarbamato, hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), BNP 7787 e ORG

2766. Destes estudos, 4 envolviam AMF (541 pacientes no total), porém em apenas um deles

em que foi utilizado um teste sensorial quantitativo demonstrou-se um curso favorável em

termos de neuroproteção. A despeito disso, os autores comentam que os dados analisados de

todos os estudos eram insuficientes para se concluir que qualquer um dos agentes avaliados

podia ser considerado capaz de prevenir ou limitar a neurotoxicidade causada por compostos

platinos.

Apesar da maioria desses estudos serem clínicos, seus dados são semelhantes aos

resultados encontrados no presente trabalho, onde a AMF preveniu, de maneira significativa,

as alterações sensitivas induzidas pelo tratamento crônico com OXL.

Com relação à função motora dos animais, não foram observadas alterações na

atividade motora forçada, locomoção e equilíbrio, tanto no grupo tratado somente com OXL,

como naquele pré-tratado com AMF, sendo demonstrado através do teste do Rota-Rod, que é

um aparelho utilizado para avaliar danos nos gânglios basais, cerebelo e o efeito de drogas

que afetam a função motora. Corroborando com os achados aqui encontrados, Norcini et al.,

(2009) demonstraram, através do teste do Rota-Rod, em ratos, que a OXL não causa alteração

da função motora. E ainda, através de outro tipo de teste, o teste de força de preensão, Ta,

Low e Windebank (2009) também demonstraram, em camundongos, que a OXL não altera a

motricidade do animal, sugerindo, assim, que a NSP induzida pela OXL parece ser puramente

sensitiva.

A escolha da dose de 1mg/kg de OXL para a indução da neuropatia foi baseada na

melhor dose encontrada no modelo de neuropatia desenvolvido por Renata Pontes, em sua

dissertação de mestrado, em 2009, no LAFICA. Com relação à AMF, foi realizada uma curva

dose-resposta, baseada nos resultados dos testes nociceptivos (hiperalgesia mecânica plantar e

alodinia térmica ao frio), onde todas as doses preveniram as alterações sensitivas induzidas

pela OXL, sendo que a dose de 25mg/kg foi responsável por apresentar uma proteção mais

eficaz, mais precoce e mais regular contra a neurotoxicidade induzida pela OXL.

Discussão


O tempo de administração da AMF 30 min antes da OXL foi realizado pelo fato

de já existirem estudos clínicos que comprovam a eficácia da AMF na proteção contra a

xerostomia, quando administrada 30 min antes da quimioterapia e radioterapia (BRIZEL et

al., 2000; ANTONADOU et al., 2002; KOUVARIS; KOULOULIAS; VLAHOS, 2007).

Também se optou pela adiminstração da AMF via s.c., pois alguns estudos têm

demonstrado uma menor incidência de hipotensão, náuseas e vômitos quando comparada com

a via i.v. (ANNE; CURRAN, 2007).

Durante o experimento, três animais morreram ao todo, onde um morreu após a

sétima administração de AMF (25mg/kg) seguida de OXL (1mg/kg), após uma dose

acumulada de 800mg/kg de AMF e 32mg/kg de OXL; enquanto os outros dois morreram após

a oitava administração de OXL (1mg/kg), após uma dose acumulada de 34mg/kg. Esses dados

são semelhantes ao trabalho de Ling et al. (2007a), onde dois ratos morreram após a oitava

injeção de OXL, e dois morreram após a nona injeção, no grupo de dose de 4mg/kg, com uma

dose acumulada de 32mg/kg.

Após ser demonstrado, através dos testes nociceptivos, que a AMF preveniu as

alterações sensitivas induzidas pela OXL, resolveu-se investigar, através da análise

histopatológica e imunohistoquímica, o mecanismo pelo qual a AMF exerce seu efeito

citoprotetor nas alterações encontradas na medula espinhal lombar de camundongos tratados

com OXL. Por se tratar de uma neuropatia periférica puramente sensitiva, as alterações

medulares foram investigadas no corno dorsal da medula espinhal, onde são encontradas as

terminações nervosas das fibras aferentes (sensitivas).

Para saber se existia alguma alteração morfológica na medula espinhal, a nível

microscópico, foi realizada a análise histopatológica, onde não foram observados infiltrados

celulares inflamatórios. Contudo, foi possível observar a presença de edema no tecido

nervoso, assim como atrofia dos neurônios, nas amostras obtidas do corno dorsal da medula

espinhal lombar de camundongos tratados apenas com OXL, sendo essas alterações

completamente revertidas nas amostras obtidas de animais pré-tratados com AMF.

Corroborando com esses achados, Joseph et al. (2008) demonstraram, em um

modelo de neuropatia induzida por OXL, haver perda axonal com atrofia de uma

subpopulação específica de células do GRD, os nociceptores IB-4 positivos. Outros autores

também demonstraram que a neuropatia induzida por OXL é responsável pelo aparecimento

de alterações morfológicas e estruturais nas células neuronais, tais como lesões nos corpos

celulares (CAVALETTI et al., 2001), alterações do núcleo e do nucléolo (CAVALETTI et

Discussão


al., 2001; McKEAGE et al., 2001), atrofia dos neurônios do GRD (JAMIESON et al., 2005) e

morte celular (TA et al., 2006).

Em seguida resolveu-se investigar, através da análise imunohistoquímica, a

participação de marcadores no corno dorsal da medula espinhal lombar de camundongos, que

poderiam estar participando, à nível central, da neurotoxicidade induzida pela OXL, assim

como do mecanismo citoprotetor da AMF. Foram estudados os seguintes marcadores: a

proteína c-Fos, a caspase 3, as isoenzimas NOSi e NOSn, a nitrotirosina, a citocina IL-1 e o

receptor NMDA.

Há aproximadamente duas décadas, Hunt, Pini e Evan (1987) descreveram pela

primeira vez a expressão do gene c-Fos e seu produto protéico, a proteína c-Fos, em neurônios

do corno dorsal da medula espinhal lombar de ratos submetidos à estimulação nociva. Desde

então, a análise da expressão da proteína c-Fos tem sido utilizada em estudos de bases neurais

de nocicepção. Atualmente o c-fos, um gene de ativação imediata, vem sendo utilizado como

um marcador anatômico de atividade neuronal, permitindo a avaliação da ativação

nociceptiva de uma grande população de neurônios espinhais, e a determinação do padrão de

ativação neuronal, de acordo com a natureza do estímulo e a localização da lâmina espinhal

onde os neurônios expressam esse gene.

A proteína c-Fos é expressa pós-sinapticamente em núcleos dos neurônios do

corno dorsal da medula espinhal. A maioria dos estímulos utilizados para induzir a expressão

de c-Fos na medula é nociva, tais como estímulos elétricos, tóxicos, químicos e lesão nervosa.

Estímulos inócuos também podem resultar na expressão de c-Fos na medula, principalmente

em casos de dores crônicas e devido à sensibilização central (MORGADO; TAVARES, 2007;

SMITS et al., 2009).

Smits et al. (2009) demonstraram que a estimulação da medula espinhal, utilizada

no tratamento de dor neuropática, foi capaz de induzir a expressão de c-Fos no corno dorsal

da medula espinhal de ratos com dor neuropática, após uma lesão nervosa parcial no nervo

ciático, sugerindo a participação dessa proteína na ativação celular tardia, mediada por uma

lesão nociceptiva.

O estudo de Ono et al. (2009) também demonstrou um aumento da ativação de c-

Fos no corno dorsal da medula espinhal de ratos com câncer orofacial. Os animais recebiam

uma inoculação de células de carcinosarcoma de Walker, desenvolvendo câncer orofacial e

uma subseqüente neuropatia dolorosa facial. Esses animais desenvolveram uma hiperalgesia

térmica e alodinia mecânica na região da inoculação. Através do ensaio de imunohistoquímica

Discussão


foi possível observar que a proteína c-Fos teve sua expressão aumentada na medula espinhal

ipsilateral e contralateral do estímulo nocivo (inoculação de células cancerosas), sugerindo

haver um aumento da atividade nociceptiva central mediada por um estímulo nocivo

periférico.

Em um modelo de neuropatia periférica por constrição do nervo ciático, em ratos,

Jergova, Kolesar e Cizkova (2008) evidenciaram um aumento da expressão de c-Fos nos

neurônios da região parabraqueal da medula espinhal, relacionado com a duração da alodinia

mecânica.

Corroborando com os achados supracitados, também se observou, no presente

estudo, um aumento da expressão de c-Fos no corno dorsal da medula espinhal dos

camundongos com neuropatia periférica, sugerindo haver um aumento da atividade neuronal

central nos animais tratados com OXL. O pré-tratamento com AMF promoveu uma redução

importante da expressão de c-Fos na medula espinhal.

Alguns estudos têm demonstrado ainda existir uma relação entre a expressão da

proteína c-Fos, induzida por estímulo nocivo, e a modulação, por longo período, dos

processos nociceptivos espinhais. Esses processos resultariam em alterações nos circuitos

nociceptivos espinhais (neuroplasticidade à dor patológica), promovendo o aumento da

sensibilidade ao estímulo nocivo (hiperalgesia) ou a estímulos não nocivos (alodinia). Assim,

tem sido observado que o estímulo nocivo, responsável pela indução da proteína c-Fos,

também gera hiperalgesia, a qual pode ser associada à neuroplasticidade central. Além disso,

o tempo de expressão da proteína c-Fos coincide com o desenvolvimento de hiperalgesia

(CODERRE et al., 1993).

Esses achados se assemelham aos resultados descritos na presente investigação,

onde foi observado que a imunoexpressão de c-Fos no corno dorsal da medula espinhal de

camundongos submetidos à NSP induzida por OXL encontrava-se aumentada a partir do 21º

dia, o que coincidiu com o início do desenvolvimento da hiperalgesia mecânica plantar. AMF

também reduziu a imunomarcação para c-Fos a partir do 21º dia, porém a prevenção da

hiperalgesia mecânica plantar teve início já a partir do 14º dia.

Outro marcador investigado foi a caspase 3, que apresenta um importante efeito

modulador na apoptose neuronal. Já está bem estabelecido na literatura que a ação antitumoral

da oxaliplatina ocorre através de lesões no DNA, com a formação de complexos Pt-DNA, que

são mais citotóxicos e eficazes na inibição da síntese do DNA, quando comparado com outros

Discussão


compostos platinos. Essas lesões no DNA podem levar a apoptose de células neuronais e o

desenvolvimento de neuropatia (TA et al., 2006; VELASCO; BRUNA, 2010).

Tassone et al. (2002) demonstraram, em um estudo in vitro com linhas de células

de mieloma múltiplo (MM), que o tratamento com OXL foi capaz de exercer um efeito

antiproliferativo e pró-apoptótico, mostrando ser eficaz no tratamento do MM. Eles

demonstraram que o mecanismo pelo qual a OXL exercia apoptose se dava pela expressão da

caspase 3, que representa uma enzima chave na processo de morte celular.

No estudo de Joseph e Levine (2009) foi observado que a administração de um

inibidor não-seletivo da caspase 3 (ZVAD-FMK) foi eficaz na inibição da hiperalgesia

mecânica tardia (20-25 dias após administração de dose única de OXL), sugerindo que o

mecanismo da apoptose era ativado em uma fase mais tardia e que estava diretamente

relacionado com a hiperalgesia causada pela OXL. Eles afirmaram ainda que esse processo de

apoptose mediado pela caspase 3 poderia estar relacionado com a lesão mitocondrial induzida

pelo ROS, já que no mesmo estudo, vários agentes antioxidantes e inibidores da mETC

também foram eficazes na inibição da hiperalgesia induzida por OXL.

Esses achados se assemelham aos resultados descritos no presente estudo, uma

vez que a apoptose observada no grupo tratado apenas com OXL teve início tardio, a partir do

14º dia. Outro fato relevante é que tanto os agentes antioxidantes como os inibidores da

caspase 3 utilizados no estudo de Joseph e Levine (2009) inibiram a hiperalgesia mecânica.

No presente estudo observou-se que AMF, um agente antioxidante, preveniu a hiperalgesia

mecânica de forma significativa, porém não foi capaz de modificar a expressão da caspase 3,

sugerindo que seu mecanismo protetor parece não estar relacionado com a apoptose celular

mediada pela caspase 3, mas sim pela destruição de ROS envolvidos no processo de lesão

neural.

Confirmando esse dado anterior, Siniscalco et al. (2007) demonstraram, em um

modelo de neuropatia por ligadura do nervo ciático, que o desenvolvimento da dor

neuropática parece estar associado com a apoptose celular, mediada pela caspase 3, e com a

produção de ROS, induzindo a hiperalgesia térmica e alodinia mecânica, e regulando a

expressão de genes pró-apoptóticos na medula espinhal. Outro achado importante deste

trabalho foi que a utilização de antioxidantes, como o PBN (fenil-N-tert-butilnitrone) foram

eficazes em produzir analgesia, através da inibição da fosforilação dos receptores NMDA,

envolvidos na sensibilização neural, sugerindo, assim, que tanto a fosforilação dos receptores

Discussão


NMDA como a apoptose desempenham um papel fundamental do desenvolvimento da dor

neuropática, após uma lesão nervosa.

Em contrapartida, alguns estudos demonstraram que AMF é capaz de aumentar o

efeito citotóxico de alguns agentes quimioterápicos. Como nos estudos de Mirowski et al.

(2003) e Rózalski et al. (2005), que observaram que AMF era capaz de estimular e

intensificar a ação pró-apoptótica da doxorrubicina e da carboplatina, potencializando o efeito

terapêutico dessas drogas em um modelo in vitro de células humanas com leucemia

mieloblástica aguda (HL-60). Esses autores observaram que quando a doxorrubicina e a

carboplatina eram administradas em associação com AMF, havia aumento do efeito

antiproliferativo dessas drogas, e ainda o aumento da atividade da caspase 3, sugerindo que

AMF tem a habilidade de retardar a progressão do ciclo celular. Concluíram também que esse

retardo do ciclo celular provocado pela AMF, e a lesão do DNA induzida pela doxorrubicina

e pela carboplatina poderia representar um sinal forte e sinérgico para a morte celular

programada.

Em contraste com os achados citados acima, vários autores têm demonstrado o

importante efeito citoprotetor da AMF na seletividade de tecidos normais contra os efeitos

colaterais da radioterapia e quimioterapia, sem interferir na ação antitumoral dos

antineoplásicos (GRIGGS, 1998; PRIETO GONZÁLEZ; FUCHS; SÁNCHEZ, 2009;

MARCU, 2009).

No presente estudo AMF não modificou a imunomarcação para a caspase 3, que

estava aumentada no grupo tratado apenas com OXL. Apesar de não haver diferença entre os

grupos, não se pode afirmar que a AMF potencializou o efeito antiproliferativo da OXL, uma

vez que esse agente preveniu as alterações nociceptivas induzidas pela OXL. Sendo assim

pode ser sugerido que o efeito protetor da AMF na neuropatia por OXL não deve estar

relacionado com a cascata das caspases, mas sim com outra via antiapoptótica, capaz de

prevenir a neurotoxicidade causada por esse composto platino.

Como foi dito anteriormente, na análise microscópica, não foram observados

infiltrados celulares inflamatórios no corno dorsal da medula espinhal lombar dos

camundongos tratados com OXL e pré-tratados com AMF. Com relação à imunohistoquímica

para a citocina inflamatória IL-1, também não foi observado aumento de sua imunoexpressão

nos animais tratados com OXL, assim como naqueles pré-tratados com AMF, sugerindo não

haver sinal inflamatório na neuropatia induzida pela OXL.

Discussão


Vários estudos vêm demonstrando existir um envolvimento direto entre a dor

neuropática e o estresse oxidativo provocado por diferentes estímulos nocivos. Joseph et al.

(2008) demonstraram que o mecanismo inicial do dano neural provocado pela OXL está

diretamente relacionado ao estresse oxidativo, podendo ser inibido por algumas substâncias

antioxidantes, como a vitamina C e a L-carnitina.

Outros estudos ainda têm demonstrado que o estresse oxidativo causado pela

maioria dos antineoplásicos pode estar associado com a apoptose neuronal, sendo a

peroxidação lipídica da membrana neuronal um fenômeno importante na patogenia da

neuropatia por OXL (VELASCO; BRUNA, 2010).

Nesse sentido resolveu-se investigar, através da análise imunohistoquímica, a

expressão de nitrotirosina, um marcador de lesões mediadas por compostos de nitrogênio, no

corno dorsal da medula espinhal lombar de camundongos tratados com OXL e pré-tratados

com AMF.

O peroxinitrito (ONOO-) promove a nitração (incorporação de um grupo nitro -

NO2) de resíduos alifáticos e aromáticos. Os resíduos de tirosina nas proteínas constituem

alvos-chave da nitração, mediada pelo peroxinitrito, e a presença de nitrotirosina em proteínas

representa um marcador da formação endógena de peroxinitrito (VELASCO; BRUNA, 2010).

Kilciksiz et al. (2008) compararam o efeito radioprotetor dos agentes N-

acetilcisteína e WR-2721 (AMF) na prevenção da lesão oxidativa causada por radiação gama

(6Gy) em tecidos normais de ratos; e observaram que o uso profilático tanto da N-

acetilcisteína como da AMF foram eficazes na estimulação da ativação de enzimas

antioxidantes, com consequente geração de glutationa, e na inibição da peroxidação lipídica,

causada pela exposição à radiação.

Também foi demonstrado no estudo de Vareniuk et al. (2007) o envolvimento do

estresse nitrosativo no déficit de condução nervosa sensitivo e motor do nervo ciático, em um

modelo de neuropatia diabética em camundongos nocaute para a leptina. Observou-se que a

imunofluorescência para a nitrotirosina encontrava-se aumentada no nervo ciático, na medula

espinhal e no GRD dos camundongos diabéticos, quando comparados com os animais não-

diabéticos.

Semelhante aos achados citados acima, no presente estudo observou-se que a

OXL aumentou a imunoexpressão de nitrotirosina no corno dorsal da medula espinhal

lombar, principalmente na 24ª hora após o início do tratamento; e que o pré-tratamento com

AMF foi capaz de reduzir essa imunoexpressão, sugerindo que a neuropatia induzida pela

Discussão


OXL parece ser desencadeada pela liberação de radicais livres, principalmente na fase aguda,

gerando um estresse oxidativo; e a inibição da imunoexpressão da nitrotirosina pela AMF

vem confirmar o dado na literatura de que a mesma apresenta uma ação antioxidante.

Vários estudos têm demonstrado que o óxido nítrico (NO) age como um

importante mediador no SNC e SNP, regulando diferentes funções nos processos fisiológicos

e fisiopatológicos, tais como a neurotransmissão, plasticidade sináptica, neuroproteção,

neurotoxicidade e dor patológica. O NO é sintetizado por três isoformas bem conhecidas,

como a NOSn, NOSi e NOSe (óxido nítrico sintase endotelial) que, em condições patológicas,

podem se manifestar nos tecidos nervosos em diferentes concentrações (GUAN et al., 2007).

No estudo de Hervera et al. (2010) foi demonstrado, pela primeira vez, a

participação do NO sintetizado pelas isoenzimas NOSn e NOSi no desenvolvimento e

manutenção da alodinia mecânica e térmica, assim como na hiperalgesia térmica, induzidas

por um modelo de dor neuropática por constrição total do nervo ciático, sugerindo que o

aumento da expressão de NOSn observado na medula espinhal parece ser regulado pela

NOSi, sendo a NOSn responsável pela manutenção da dor neuropática periférica crônica em

camundongos. Esses autores ainda demonstraram que a expressão da NOSn estava envolvida

nos estágios mais tardios da neuropatia, enquanto a NOSi estava envolvida nos estágios

iniciais da neuropatia.

Guan et al. (2007) evidenciaram, em um modelo de dor neuropática por lesão do

nervo espinhal, que camundongos deficientes para NOSn não apresentaram uma redução da

hipersensibilidade mecânica durante o desenvolvimento e a manutenção da dor neuropática,

quando comparados ao grupo selvagem; enquanto que a administração de inibidores não-

seletivos (L-NAME) da NOS e seletivos (7-NI) da NOSn atenuaram a hipersensibilidade

mecânica induzida pela injúria neural, sugerindo também a participação do NO sintetizado

pela NOSn na neuropatia periférica.

Outro estudo realizado em modelo de dor neuropática por transecção do nervo

ciático mostrou uma expressão aumentada na NOSn na medula espinhal lombar de ratos

neuropáticos. O inibidor seletivo da NOSn (7-NI) foi capaz de prevenir a hiperalgesia e

alodinia mecânica induzidas, a partir do 7º dia até o 30º dia, pela lesão no nervo ciático,

sugerindo que o NO sintetizado pela NOSn apresenta um importante efeito nociceptivo nos

estágios tardios da dor neuropática (CHACUR et al., 2010).

Todos esses estudos são bastante relevantes e se assemelham aos resultados aqui

descritos, onde também se observou a participação da NOSi nos estágios iniciais da

Discussão


neuropatia por OXL, sendo expressa a partir de 24h, com uma expressão mais acentuada a

partir do 21º dia. Com relação à NOSn observou-se uma imunoexpressão aumentada dessa

enzima nos estágios mais tardios da neuropatia, sendo mais acentuada a partir do 14º dia até o

final do experimento. Sendo assim, a expressão inicial da NOSi parece então regular a

expressão posterior da NOSn, sugerindo a participação do NO como um importante mediador

da dor neuropática. AMF não modificou a imunomarcação para a NOSi e NOSn.

Tanabe et al. (2009), em um modelo de dor neuropática por ligadura parcial no

nervo ciático em camundongos, demonstraram que o NO é continuamente produzido na

medula espinhal, participando da manutenção da hipersensibilidade mecânica e térmica

induzida pela lesão nervosa. Através de inibidores não-seletivos da NOS (L-NAME) e

seletivos da NOSn (Nω-propil-L-arginina) e NOSi (AMT) foi observado que essas isoenzimas

são as principais responsáveis pela mediação da produção do NO na medula espinhal. E

ainda, através da administração de TEMPOL (inibidor do superóxido) e do PBN (inibidor de

ROS) foi possível demonstrar a participação de ROS, incluindo o NO e o superóxido na

manutenção da dor neuropática induzida por uma lesão nervosa periférica. A partir desses

dados, os autores concluíram que o NO produzido pela NOSn e NOSi na medula espinhal,

está envolvido na manutenção da dor neuropática, através da via NO-peroxinitrito.

Esses mesmos autores sugeriram que essa contínua produção de NO e outras ROS

na medula espinhal pode ser desencadeada por uma hiperexcitabilidade nervosa e

sensibilização central observadas nas neuropatias, onde os potenciais de ação ectópicos nas

fibras aferentes podem levar a ativação dos receptores NMDA na medula espinhal, que por

sua vez irão estimular a produção de NO.

No presente trabalho AMF não modificou a imunoexpressão dessas isoenzimas,

sugerindo que seu mecanismo citoprotetor parece não estar relacionado de forma direta com

esse mediador. Porém, acredita-se que o efeito protetor e antioxidante da AMF na NSP

induzida pela OXL esteja relacionado com uma ação indireta do NO, ao inibir o estresse

oxidativo provocado pela via NO-peroxinitrito, um radical livre produzido a partir da

condensação dos radicais superóxido e NO.

Sabendo-se que o NMDA, um receptor ionotrópico ativado por ácido glutâmico

glutamato/aspartato, apresenta um importante papel na sensibilização central induzida por

lesões neurais, resolveu-se investigar, através de análise imunohistoquímica, sua expressão no

corno dorsal da medula espinhal lombar de camundongos tratados com OXL e pré-tratados

com AMF.

Discussão


Foi observada uma diminuição progressiva, tempo-dependente, de sua

imunoexpressão, nas amostras obtidas do corno dorsal da medula espinhal de animais tratados

apenas com OXL. Por outro lado, observou-se que o pré-tratamento com AMF resultou em

uma reversão deste efeito, levando a um aumento progressivo da imunoexpressão do receptor

NMDA, já a partir de 24h, culminando com uma expressiva marcação aos 28 dias.

Qu et al. (2009) demonstraram, através de um modelo de neuropatia por ligadura

do nervo espinhal em ratos, que a ativação dos receptores NMDA-2B na medula espinhal tem

um papel crucial no desenvolvimento da dor neuropática, especialmente no estágio inicial da

injúria nervosa.

Chen, Samoroski e Pan (2009) também demonstraram a participação do receptor

NMDA no desenvolvimento de dor crônica, onde a administração de um antagonista de

NMDA (neramexane) foi capaz de reverter a alodinia e a hiperalgesia mecânicas em um

modelo de neuropatia diabética em ratos.

A maioria dos estudos vem demonstrando que a ativação excessiva do receptor

NMDA é capaz de produzir uma excitotoxicidade neuronal, e que a administração de

inibidores desses receptores é utilizada para reverter o dano neuronal de diversas patologias.

Em contrapartida, alguns estudos recentes vêm mostrando um papel oposto do receptor

NMDA na neuropatia crônica, sugerindo uma ação antinociceptiva e antiapoptótica na

neurotoxicidade induzida por quimioterápicos.

Sendo assim, Gozdz et al. em 2003, e depois em 2008, em estudos in vitro,

demonstraram que a apoptose induzida pela lesão do DNA, na neuropatia periférica por

cisplatina, era revertida pela ação do receptor NMDA, através de uma via de sinalização da

proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), a proteína quinase regulada por sinais

extracelulares (ERK 1/2). Eles constataram que a lesão do DNA induzida pela cisplatina

ativava a via de sinalização ERK 1/2, como uma resposta automática de reparo do DNA. E

essa ativação da ERK 1/2 era mediada pela ativação dos receptores NMDA, exibindo a

capacidade de inibir a apoptose neuronal induzida pela cisplatina. Ou seja, ao mesmo tempo

em que a cisplatina induzia a apoptose, a mesma também ativava a via ERK 1/2 através do

aumento da sinalização dos receptores NMDA.

De acordo com Scuteri et al. (2010), essas MAPKs, que incluem a ERK 1/2,

JNK/Sapk e p38, desempenham um papel importante na patogênese de várias neuropatias

periféricas, incluindo as neuropatias induzidas por quimioterápicos, estando envolvidas tanto

na promoção da apoptose, como na proteção neuronal. No estudo desenvolvido em ratos

Discussão


submetidos à NSP induzida por OXL, esses autores demonstraram, através de uma cultura de

neurônios dos GRD, existir uma dupla função para a proteína ERK 1/2, dependendo da

estimulação celular. Eles comprovaram este fato através de administração de uma substância

neuroprotetora, o fator de crescimento neural (NGF). A ação pró-apoptótica da ERK 1/2 foi

observada no estágio inicial após a administração de OXL (estímulo tóxico), havendo

aumento dos níveis dessa proteína. Porém, após a administração do NGF, os níveis de ERK

1/2 eram restaurados à sua concentração basal, levando a um efeito de neuroprotetor e

antiapoptótico.

Esses achados citados acima são de suma importância na compreensão dos

resultados do presente estudo, onde foi observado que nos animais tratados apenas com OXL

houve um aumento inicial, embora parcial, da imunomarcação para NMDA, na 24ª hora e no

7º dia, que passou a diminuir progressivamente até o 28º dia, mostrando, assim, a possível

ação pró-apoptótica da ERK 1/2 mediada pela ativação do NMDA nos estágios iniciais após

um estímulo tóxico. Em contrapartida, nos animais pré-tratados com AMF, houve uma

acentuada e progressiva imunomarcação do receptor NMDA, mostrando que, assim como o

neuroprotetor NGF, a AMF também restaurou os níveis de ERK 1/2, apresentando um efeito

antinociceptivo e antiapoptótico, sugerindo haver a participação do receptor NMDA também

na citoproteção mediada pela AMF. Isso pode explicar o fato da AMF não ter apresentado

efeito na redução da imunomarcação para a caspase 3, uma vez que sua ação antiapoptótica

parece não estar relacionada com a cascata das caspases, mas sim com uma outra via de

quinases sinalizadoras de reparo de DNA.

De acordo com as evidências discutidas acima, foi possível identificar alguns dos

possíveis mecanismos envolvidos na citoproteção da AMF na inibição da neurotoxicidade

induzida pela OXL. Este agente platino parece induzir a NSP inicialmente através de uma

aumento da excitabilidade nervosa dos canais de Na+, K+ e Ca2+, levando a fosforilação dos

receptores NMDA que, por sua vez, irão ativar as enzimas NOSn e NOSi, podendo causar um

estresse oxidativo nos neurônios do corno dorsal da medula espinhal. Além disso, a OXL

também parece ativar a cascata das caspases, através da ativação da caspase 3, promovendo

alterações morfológicas neuronais e culminando na lesão do DNA e apoptose celular. AMF

apresentou um efeito protetor importante na prevenção das alterações sensitivas induzidas

pela OXL, provavelmente através de um efeito antioxidante, inibindo o estresse oxidativo

causado por esse quimioterápico; e por um efeito antiapoptótico, através da ativação da ERK

Discussão


1/2, mediada pelos receptores NMDA. Desse modo é sugerido o seguinte modelo hipotético

do efeito protetor da amifostina na NSP experimental induzida por OXL (Figura 34).

Figura 34 - Modelo hipotético do efeito protetor da amifostina na neuropatia sensitiva periférica experimental induzida por oxaliplatina

Contudo, mais estudos são necessários com o objetivo de ampliar o conhecimento

e as pesquisas sobre o mecanismo molecular da neurotoxicidade induzida pela OXL, e o papel

protetor da AMF, uma vez que a descoberta do alvo onde este agente antioxidante promove

sua ação será o início de uma abordagem terapêutica inovadora no tratamento da NSP

induzida pela OXL, assim como o aumento da tolerância dos pacientes com câncer colorretal

ao tratamento quimioterápico.

114

CONCLUSÃO

Conclusão


6 CONCLUSÃO

Diante dos dados apresentados neste trabalho, foi possível concluir que:

Na neuropatia sensitiva periférica induzida por oxaliplatina, amifostina promoveu

uma importante proteção nas alterações sensitivas, desde que inibiu a hiperalgesia mecânica e

alodinia térmica, além da imunoexpressão de c-Fos no corno dorsal da medula espinhal.

Adicionalmente amifostina promoveu uma importante ação protetora nas lesões

teciduais (edema do tecido nervoso e atrofia neuronal), sendo capaz de exercer uma ação

antioxidante e antiapoptótica, através da inibição da expressão de nitrotirosina e do aumento

da expressão do receptor NMDA, respectivamente.

Esses dados oferecem subsídio para um potencial uso clínico da amifostina na

prevenção desta importante e limitante toxicidade da quimioterapia do câncer.

116

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE … · L73e Lino, Juliana Arcanjo Efeito protetor da amifostina na neuropatia sensitiva periférica experimental induzida por oxaliplatina