Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Ciências …³ides.HPLC_Andrey... · 2018-03-13 · mostrou o poder de mudança que a empatia tem, me ensinando a me tornar um

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Andrey Fabiano Lourenço de Aguiar

Desenvolvimento e validação de método analítico para

quantificação


Instituto de Ciências Biomédicas



quantificação de canabinoides em extratos de

Rio de Janeiro

2018

1


Instituto de Ciências Biomédicas



de Cannabis

2



quantificação de canabinoides em extratos de Cannabis

Orientadora: Profª. Drª. Virgínia Martins Carvalho

Rio de Janeiro

2018

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao Instituto de Ciências

Biomédicas da Universidade Federal do

Rio de Janeiro como parte dos requisitos

necessários à obtenção do grau de

bacharel em Ciências Biológicas:

Modalidade Médica

Habilitação: Biociência Legal

3

Agradecimentos

A minha mãe, Andreia, que bravamente venceu os obstáculos que uma mãe

solteira se vê obrigada a superar todos os dias para oferecer aos filhos uma vida

digna e uma educação de qualidade. Graças aos seus esforços, eu pude me tornar

o homem que sou hoje.

A minha irmã e cunhado, Andressa e Leonardo, que me abraçaram como

filho em todos os momentos em que precisei de apoio e contribuíram imensamente

para que eu pudesse ir mais longe do que qualquer um.

Aos meus grandes amigos Vitor, Max, Zé, Raquel, Rafaela, Thays e Victor,

os quais sempre tinham uma palavra de conforto, uma boa dose de risada ou

apenas o bom e velho amor incondicional para me ajudar a superar os dias de

ansiedade e desânimo.

A família que a Biomedicina-UFRJ me deu, Bruna, Anne, Leonan, Marcus,

Júlia, Deka, Mayara, Thiago, Larissa, Guilherme, Nathalia, Letícia e John. Vocês

foram essenciais para tornar os dias de aula e terrores de provas muito mais leves e

prazerosos.

A minha orientadora, Virgínia, que além de ser uma cientista incrível, me

mostrou o poder de mudança que a empatia tem, me ensinando a me tornar um ser

humano melhor nessa jornada e me dando o presente que foi esse trabalho. Minha

gratidão não pode ser mensurada.

Ao povo brasileiro, que luta bravamente todos os dias por seus direitos, pelo

acesso a um programa de saúde que atenda suas necessidades e por um Estado

mais empático. Retribuir o investimento de seus impostos em minha formação é uma

das motivações para o meu trabalho.

4

Não há garantias, mas lembre-se:

até no futuro, o doce não é tão doce

sem o amargo

(Vanilla Sky)

5

Resumo

AGUIAR, A.F.L. Desenvolvimento e validação de método analítico para quantificação de canabinoides em extratos de Cannabis. Rio de Janeiro, 2017. Trabalho de Conclusão de Curso (Ciências Biológicas: Modalidade Médica) –Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.

As plantas do gênero Cannabisapresentam uma controversa história, em que

tradição e proibição se colidem, sobretudo após a Convenção Internacional de

Drogas de 1961. No Brasil, no entanto, seu uso terapêutico foi reclamado por

familiares e pacientes portadores de epilepsia refratária, os quais redescobriram as

propriedades farmacológicas dos canabinoides. Essas terapias, utilizadas de forma

compassiva, ainda não possuem estudos que comprovem sua segurança e doses

necessárias para obtenção do efeito farmacológico desejado. Desse modo, este

trabalho visa desenvolver um método de quantificação de canabinoides em matrizes

oleosas para sua validação conforme regulamentação publicada pela Agência

Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). A técnica de identificação e quantificação

utilizada foi a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a um Detector de

Arranjo de Diodo (CLAE-DAD). O método apresentou-se parcialmente validado,

havendo a necessidade de aumento do número de repetições de alguns parâmetros

e avaliação da robustez. Os resultados demonstram ainda uma incongruência entre

o valor quantificado e o relatado nos rótulos de extratos comercializados no Brasil.

Espera-se que o método desenvolvido possa ser otimizado e revalidado para

matrizes vegetais para identificação do perfil químico de variedades cultivadas por

pacientes com salvo-conduto judicial

Palavras-chave: Cannabis. Canabinoides, CLAE-DAD. Validação. Extratos.

6

Lista de Abreviaturas e siglas

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AO – Ácido olivetólico

ASC – Área sob a curva

CBD – Canabidiol

CBDA – Ácido Canabidiólico

CBDAS – CBDA-sintase

CBC – Canabicromeno

CBCA – Ácido canabicromênico

CBG – Canabigerol

CBGA – Ácido canabigerólico

CBN – Canabinol

CB1 – Receptor canabinoide 1

CB2 – Receptor canabinoide 2

CG – Cromatografia gasosa

CG-EM – Cromatografia gasosa acoplado à espectrometria de massas

CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência

CLAE-DAD – Cromatografia líquida de alta eficiência acoplado à detector de arranjo de diodo

CMD – concentração média determinada

CME – Concentração média experimental

CT – Concentração teórica

CV – Coeficiente de variação

CYP – Citocromo P450

DAD – Detector de arranjo de diodos

DP – Desvio padrão

DPR – Desvio padrão relativo

7

EM – Espectrômetro de massas

FDA – Food and Drug Administration

GABA – Ácido γ-aminobutírico

GOT – Geranil pirofosfato-olivetolatogeraniltransferase

GPP – Pirofosfato de geranil

LD – Limite de detecção

LQ – Limite de quantificação

QC – Controle de qualidade

TCM – Triglicerídeo de cadeia média

THC ou Δ9-THC – Δ9-tetrahidrocanabinol

Δ8-THC – Δ8-tetrahidrocanabinol

THCS – THC-sintase

THCA – Ácido tetrahidrocanabinólico

TRPA1 – Receptor de potencial transitório anquirina 1

TRPV1 - Receptor de potencial transitório vaniloide 1

TRPV2 - Receptor de potencial transitório vaniloide 2

Δ8THC – Δ8-tetrahidrocanabinol

2- AG – 2-araquidonilglicerol

8

Lista de Ilustrações

Figura 1: Principais canabinoides encontrados em extratos de Cannabis sativa.................. 13

Figura 2: Esquema da biossíntese de canabinoides a partir do ácido canabigerólico.......... 15

Figura 3: Variedade organoléptica de extratos recebidos para análise..................................30

Figura 4: Branco de metanol adicionado de padrão interno (diazepam)................................31

Figura 5: Perfil cromatográfico de canabinoides a 10µg/mL................................................. 32

Figura 6: Perfil cromatográfico do ponto 1 da curva de calibração........................................33

Figura 7: Perfil cromatográfico do ponto 2 da curva de calibração........................................33

Figura 8: Perfil cromatográfico do ponto 3 da curva de calibração....................................... 34

Figura 9: Perfil cromatográfico do ponto 4 da curva de calibração....................................... 34

Figura 10: Perfil cromatográfico do ponto 5 da curva de calibração......................................35



Figura 13: Representação gráfica para curva analítica de THC, a partir de 7 pontos de

calibração, entre as concentrações 1,11 a 21,31µg/mL........................................................37

Figura 14: Representação gráfica para curva analítica de CBD, a partir de 7 pontos de

calibração, entre as concentrações 1,29 a 32,93 µg/mL.......................................................37

Figura 15: Representação gráfica para curva analítica de THCA, a partir de 7 pontos de


Figura 16: Representação gráfica para curva analítica de CBDA, a partir de 7 pontos de


Figura 17: Representação gráfica para curva analítica de THCA, a partir de 7 pontos de


Figura 18: Perfil cromatográfico de óleo de coco, adicionado de Diazepam na concentração

de 5µg/mL..............................................................................................................................40

Figura 19: Perfil cromatográfico de óleo de soja, adicionado de Diazepam na concentração

de 5µg/mL..............................................................................................................................40

9

Figura 20: Perfil cromatográfico de óleo de girassol, adicionado de Diazepam na

concentração de 5µg/mL........................................................................................................41

Figura 21: Perfil cromatográfico do azeite de oliva, adicionado de Diazepam na

concentração de 5µg/mL....................................................................................................... 41

Figura 22: perfil cromatográfico dos triglicerídeos de cadeia média (TCM), adicionado de

Diazepam na concentração de 5µg/mL.................................................................................42

Figura 23: Perfil cromatográfico de um extrato importado (CBD puro) em TCM como

veículo.....................................................................................................................................45

Figura 24: Perfil cromatográfico de extrato artesanal rico em THC em azeite de oliva como

veículo.....................................................................................................................................45

10

Lista de Tabelas

Tabela 1: Gradiente adotado na separação dos analitos.......................................... 24

Tabela 2: Concentração dos interferentes das matrizes nos tempos de retenção dos canabinoides............................................................................................................. 42

Tabela 3: Parâmetros de segurança do método para CBD e THC........................... 43

Tabela 4: Resultados preliminares de produtos comerciais importados analisados por CLAE-DAD................................................................................................................ 47

Tabela 5: Resultados preliminares de produtos artesanais caseiros ou clandestinos analisados por CLAE-DAD.........................................................................................48

11

Sumário

1. Introdução ............................................................................................................. 13

1.1. Histórico .......................................................................................................... 13

1.2. Canabinoides .................................................................................................. 15

1.3. Biossíntese ..................................................................................................... 15

1.4. THC ................................................................................................................ 18

1.5. CBD ................................................................................................................ 19

1.6. Formas ácidas THCA e CBDA ........................................................................ 20

1.7. CBN ................................................................................................................ 21

1.8. Sistema endocanabinoide ............................................................................... 21

1.9. Farmacocinética ............................................................................................. 22

2. Obejtivo ................................................................................................................. 24

2.1. Objetivo geral .................................................................................................. 24

2.2. Objetivos específicos ...................................................................................... 24

3. metodologia........................................................................................................... 25

3.1. Extração e preparo de amostras ..................................................................... 25

3.2. Identificação dos canabinóides ....................................................................... 25

3.3. Quantificação e Validação do método ............................................................ 26

3.3.1. Especificidade ........................................................................................... 26

3.3.2. Linearidade ............................................................................................... 27

3.3.3. Precisão .................................................................................................... 28

3.3.4. Limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) ............................ 29

3.3.5. Exatidão .................................................................................................... 30

3.3.6. Robustez ................................................................................................... 30

4. Resultados e discussão ........................................................................................ 32

12

4.1. Extração e preparo de amostras ..................................................................... 32

4.2. Identificação dos canabinoides, quantificação e validação do método ........... 33

4.3. Aplicação do método às amostras autênticas ................................................. 46

4.4. Comparação entre CLAE-DAD e cromatografia gasosa ................................. 51

4.5. discrepância entre valores estipulados nos rótulos e quantificados ............... 53

4.6. implicações forenses e terapêuticas do desenvolvimento de um novo método

analítico para canabinoides ............................................................................ 55

4.7. limitações para validação do método .............................................................. 56

5. Conclusão ............................................................................................................. 59

6. Referências ........................................................................................................... 60

13

1. INTRODUÇÃO

1.1. HISTÓRICO

Provavelmente uma das plantas mais controversas do mundo, a Cannabis

foi primeiramente descrita por Carolus Linnaes em 1753. Contudo, era usada por

culturas bem mais antigas como substrato para preparações medicinais, rituais

religiosos ou ainda para fins recreativos, tendo sua origem atribuída à Ásia Central e

se expandido posteriormente para a Ásia Oriental, onde o cânhamo era utilizado

para a manufatura de tecidos, sobretudo na região onde atualmente se encontra o

norte da China (LI, 1975).

Após a Convenção de Internacional Drogas de 1961 (Convenção de Nova

York), revisitada em 1972, uma política internacional de combate às drogas foi

instituída através da cooperação entre os países signatários para suprimir o uso,

comércio, troca, distribuição e importação de opioides e outras substâncias

psicotrópicos, sendo o controle da Cannabis instituído no artigo 28 (UNITED

NATIONS, 1972).

Segundo Carlini (2006), a chegada de produtos derivados de Cannabis ao

Brasil deu-se através da composição das velas e cordames das embarcações, as

quais eram produzidas a partir de cânhamo, uma variedade da planta. Seu uso não

terapêutico disseminou-se, contudo, entre negros escravos que trouxeram sementes

consigo durante o transporte para o Brasil. No século XIX, era usada no tratamento

de bronquite crônica, asma, insônia, além de sua prescrição por conta de sua

atividade hipnótica, sedativa e antiemética, até 1930, quando teve início uma era de

repressão da planta no país, sobretudo após a atuação dos delegados brasileiro e

egípcio na II Convenção do Ópio.

14

Atualmente no Brasil, a repressão ao tráfico e uso de substâncias

entorpecentes encontra-se normatizada pela lei nº 11.343/2006, a qual institui o

Sistema Nacional de Políticas Públicas sobre Drogas e cria um canal de apelação

para usuários que portam quantidades para consumo próprio, além de introduzir a

possibilidade de autorização judicial para plantio e cultura de plantas proscritas em

acordo com convenções internacionais das quais o Brasil é signatário. Contudo, a lei

não estabelece parâmetros quantitativos para considerar o material apreendido com

pessoa física como tráfico ou uso pessoal, cabendo ao juiz responsável avaliar a

questão com base em fatores sociais e pessoais, local e condições de realização da

ação, quantidade apreendida, além da conduta e dos antecedentes do agente.

No âmbito pericial, a identificação positiva para canabinoides de amostras

apreendidas segue sobretudo triagem qualitativa por meio de testes químicos

rápidos, chamados de presuntivos, tais como Fast Blue B Salt e teste de Duquenois-

Levine, sendo posteriormente submetidos a testes confirmatórios como, por

exemplo, a cromatografia gasosa (CG). Em 2006, foi publicado um roteiro que

auxiliasse peritos criminais a fazer a identificação botânica da planta em matéria

vegetal fresca, na qual os testes químicos não podem atuar com eficiência

(VALENTE et al., 2006).

Em 2015, devido à demanda de pacientes portadores de enfermidades

neurológicas graves com quadros de epilepsias refratárias aos tratamentos

disponíveis no Brasil, a Anvisa publicou a RDC 17/2015 (BRASIL, 2015) com o

objetivo de estabelecer os critérios e procedimentos para importação de produtos à

base de canabidiol (CBD) em associação com outros canabinoides, inclusive THC,

em caráter excepcional. A resolução, portanto, autoriza a importação de produtos

industrializados contendo CBD por pessoas físicas, para uso próprio, segundo

prescrição médica por profissional de saúde habilitado e mediante cadastro prévio

numa base eletrônica da agência reguladora

autorizou a importação de THC e partes da planta (BRASIL, 2016)

1.2. CANABINOIDES

A Cannabis é uma planta que apresenta mais de 400 componentes, sendo

mais de 60 pertencentes à classe de canabinoides, sendo o

(THC) o mais abundante entre eles, po

canabinoides podem ser naturais, dividindo

endocanabinoides, ou sintéticos

antagonistas com relação ao THC

encontram-se representados na

Figura 1: Principais canabinoides encontrados em extrat

1.3. BIOSSÍNTESE

Os principais compostos participantes da via de biossíntese de

são o pirofosfato de isopentenila e difosfato de dimetilalilo.

iniciais, acreditava-se que os



numa base eletrônica da agência reguladora (BRASIL, 2015)

a importação de THC e partes da planta (BRASIL, 2016)

CANABINOIDES

é uma planta que apresenta mais de 400 componentes, sendo

mais de 60 pertencentes à classe de canabinoides, sendo o ∆

(THC) o mais abundante entre eles, possuindo relevante atuação psicotrópica.

canabinoides podem ser naturais, dividindo-se entre fitocanabinoides e

endocanabinoides, ou sintéticos, podendo apresentar efeitos aditivos, sinérgicos ou

antagonistas com relação ao THC (ASHTON, 2001). Os principais canabinoides

se representados na Figura 1.

nabinoides encontrados em extratos de Cannabis sativa

Os principais compostos participantes da via de biossíntese de

são o pirofosfato de isopentenila e difosfato de dimetilalilo. A partir de estudos

se que os terpenoides eram formados através da via do

15



(BRASIL, 2015) e, em seguida,

a importação de THC e partes da planta (BRASIL, 2016).

é uma planta que apresenta mais de 400 componentes, sendo

∆9-tetraidrocanabinol

ssuindo relevante atuação psicotrópica. Os

se entre fitocanabinoides e

, podendo apresentar efeitos aditivos, sinérgicos ou

incipais canabinoides

Cannabis sativa.

Os principais compostos participantes da via de biossíntese de terpenoides

A partir de estudos

s eram formados através da via do

16

mevalonato (ROHMER, 1999). Contudo, posteriores experimentos demonstraram

que sua biossíntese ocorria no mesmo compartimento da via do fosfato de 1-deoxi-

D-xilulose, de modo que a via do mavelonato e do fosfato de 1-deoxi-D-xilulose

poderiam trocar componentes entre si, o que foi comprovado por experimento que

mostrou a incorporação de mavelonato radioativamente marcado na formação de

precursores de canabinoides, acrescentando ainda que pirofosfato de geranil (GPP)

e ácido olivetólico (AO) atuavam como intermediários específicos na biossíntese dos

canabinoides (EISENREICH et al., 1998; FELLERMEIER et al., 2001). A via de

biossíntese atualmente aceita consiste na condensação de GPP com AO através da

enzima geranil pirofosfato-olivetolatogeraniltransferase (GOT), enzima que promove

a prenilação de AO, gerando como produto o ácido canabigerólico (CBGA)

(FELLERMEIER; ZENK, 1998). CBGA pode então sofrer a ação de majoritariamente

três enzimas diferentes secretadas na cavidade de armazenamento dos tricomas

glandulares (SIRIKANTARAMAS et al., 2005) para gerar as formas ácidas de

importantes canabinoides.

As enzimas ácido ∆9-tetraidrocanabinolico-sintase (THCAS), ácido

canabidiólico-sintase (CBDAS) e ácido canabicromêmico-sintase (CBCAS) são

responsáveis por promover a ciclização oxidativa de CBGA, produzindo o ácido ∆9-

tetraidrocanabinolico, o ácido canabidiólico e o ácido canabicromênico (TAURA et

al., 1995; TAURA; MORIMOTO; SHOYAMA, 1996; MORIMOTO et al., 1998). As

plantas de Cannabis sativa produzem apenas as formas ácidas dos canabinoides,

de modo que as formas neutras são formadas a partir da descarboxilação não-

enzimática dos ácidos por ação da luz ou calor (PREEDY, 2016). Em 1970, um

grupo de pesquisadores japoneses identificou a presença de ácido canabinólico

(CBNA) em plantas secas armazenadas, o que não

frescas, através de cromatografia em sílica gel, comprovando posteriormente que

sua origem estava atrelada ao THCA

de THCA e CBDA com uma lâmpada UV

amostras de THCA irradiadas

degradação do THCA e não possui vínculo com a degradação de CBDA

(SHOYAMA; YAMAUCHI; NISHIOKA, 1970)

isomerização ácida de ∆

biossíntese desses compostos.

Figura 2: Esquema da biossíntese de canabinoides a partir do ácido canabigerólico.

Fonte: Adaptado de

Nota: ∆Τ= aquecimento;

(CBNA) em plantas secas armazenadas, o que não foi constatado

, através de cromatografia em sílica gel, comprovando posteriormente que

sua origem estava atrelada ao THCA. Essa conclusão foi alcançada

e CBDA com uma lâmpada UV, processo que gerou CBNA apenas das

amostras de THCA irradiadas, demonstrando que CBNA é um produto de

do THCA e não possui vínculo com a degradação de CBDA

(SHOYAMA; YAMAUCHI; NISHIOKA, 1970). A formação de ∆

∆9-THC (GAONI; MECHOULAM, 1966). A

biossíntese desses compostos.


Fonte: Adaptado de DE BACKER et al., 2009.

aquecimento; -CO2= descarboxilação.

17

foi constatado em plantas

, através de cromatografia em sílica gel, comprovando posteriormente que

. Essa conclusão foi alcançada após irradiação

, processo que gerou CBNA apenas das

, demonstrando que CBNA é um produto de

do THCA e não possui vínculo com a degradação de CBDA

∆8-THC ocorre pela

. A Figura 2 ilustra a


18

1.4. THC

O ∆9-tetraidrocanabinol (THC) é o principal componente psicoativo da

Cannabis sativa e foi primeiramente isolado em 1964 (GAONI; MECHOULAM,

1964), atuando como agonista parcial dos receptores CB1 e CB2, modulando efeitos

excitatórios, por ação sobre a neurotransmissão mediada por glutamato e dopamina,

e inibitórios por ação sobre liberação de ácido γ-aminobutírico (GABA) (SHEN, 1999;

PISTIS et al., 2002).

No Brasil, o THC encontra-se registrado na lista de substâncias

psicotrópicas de uso proscrito (lista F2), segundo portaria SVS/MS nº 344/98,

enquanto seu equivalente sintético, dronabinol, encontra-se na lista A3 de

substâncias psicotrópicas. O primeiro medicamento à base de Cannabis sativa

registrado na Anvisa e de comercialização autorizada foi o Mevatyl®, conhecido no

exterior como Sativex®, composto por 27mg/mL de THC e 25mg/mL de CBD e

administrado na forma de solução oral (spray orobucal), cujo uso é preconizado no

tratamento da espasticidade muscular moderada ou severa em pacientes com

esclerose múltipla (SYED; MCKEAGE; SCOTT, 2014). Mantêm-se vetados para

registro pela Anvisa produtos com teores maiores do que 30mg/mL de THC ou CBD.

(BRASIL, 1998; BRASIL, 2017)

Um recente estudo publicado no fim de 2017 foi capaz de associar a

administração aguda de THC ao aumento da ansiedade em homens com exposição

prévia mínima, explicitando ainda a correlação entre a disponibilidade de receptores

CB1 na amídala e a intensidade da resposta fisiológica e elucidando o mecanismo

de atuação do THC nesse sistema (BHATTACHARYYA et al., 2017).

19

O THC apresenta um análogo sintético de estrutura idêntica chamado

dronabinol, conhecido pelo nome comercial de Marinol®, registrado na lista A3 de

substâncias psicotrópicas da ANVISA. Esse composto foi inicialmente utilizado como

antiemético após aprovação pelo FDA para tratamento de náuseas e enjoos em

pacientes oncóticos não-responsivos aos tratamentos antieméticos tradicionais

(MAY; GLODE, 2016). E meados dos anos 90, surgiram estudos focando em seu

uso como indutor de apetite para anorexia ligada à pacientes com Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida (AIDS) (BEAL et al., 1995, 1997), além de estudos para

avaliação de sua atuação antiemética em combinação com outros fármacos

disponíveis no mercado, tais como proclorperazina e ondasetrona (LANE et al.,

1991; MEIRI et al., 2007).

1.5. CBD

O canabidiol foi primeiramente isolado por Adams (1940), a partir do

cânhamo cultivado em Minessota (EUA). Devido à falta de estudos capazes de

comprovar a atividade intrínseca do CBD, por muitos anos ele foi considerado um

canabinoide inativo, até o surgimento de um estudo que demonstrou efeitos

altamente discrepantes do THC em animais tratados com a substância isolada e

com o extrato de Cannabis, surgindo a hipótese de que outros canabinoides, entre

eles o CBD, poderiam interferir e modular o efeito do THC, o que foi posteriormente

comprovado. Além disso, posteriores trabalhos foram capazes de identificar uma

série de aplicações terapêuticas para o CBD, tais como antiepiléptico, sedativo,

ansiolítico, antipsicótico, anti-inflamatório e antiemético, além de sua atividade

neuroprotetora (ZUARDI, 2008).

20

No âmbito molecular, o CBD age como agonista do receptor 5-HT1a, dos

receptores α1 e α3 de glicina, do receptor de potencial transitório anquirina 1

(TRPA1), assim como o receptor de potencial transitório vaniloide 1 e 2 (TRPV 1 e

TRPV2, respectivamente) (CILIO; THIELE; DEVINSKY, 2014). Além disso, CBD é

capaz de mediar a neuroproteção através da regulação do fluxo de cálcio em

patologias envolvendo disfunções mitocondriais, prevenindo a sinalização apoptótica

(RYAN et al., 2009).

1.6. FORMAS ÁCIDAS THCA E CBDA

Nas plantas frescas, THC e CBD são sintetizados em sua forma ácida THCA

e CBDA, respectivamente, convertendo-se para sua forma neutra após ação não-

enzimática de fatores físicos, tais como luz e calor. Devido à instabilidade térmica

desses compostos, sua análise por metodologias que necessitam submeter a

amostra a elevadas temperaturas, tais como a cromatografia gasosa (CG), requerem

um processo de derivatização da amostra para torná-la volátil e estável (DE

BACKER et al., 2009). Até o momento, não foram identificadas atividades

terapêuticas desses compostos, de modo que sua conversão para as formas neutras

é de grande importância para a produção de fitoterápicos.

Na rotina forense, a análise de amostras de plantas apreendidas

presumidamente pertencentes ao gênero Cannabis pode ser feita por CG sem a

necessidade de derivatização desses compostos, posto que sua conversão durante

a análise já é capaz de comprovar a presença de canabinoides e, portanto, tipifica a

infração.

21

1.7. CBN

O canabinol (CBN) é uma molécula gerada pela oxidação do THC,

primeiramente identificada em amostras de plantas secas armazenadas. Foi o

primeiro fitocanabinoide isolado da Cannabis sativa e, a princípio, foi erroneamente

considerado o principal responsável pela atividade psicotrópica da planta.

Sua atividade biológica ainda não foi totalmente elucidada, havendo indícios

de que atue como fraco agonista parcial de receptores CB1 e CB2, revelando uma

potencial aplicação terapêutica em doenças que envolvem superativação de

receptores CB (IZZO et al., 2009).

1.8. SISTEMA ENDOCANABINOIDE

Em 1990, o primeiro receptor do sistema endocanabinoide, CB1, foi descrito

e clonado a partir do cérebro de ratos (MATSUDA et al., 1990), descrito ainda como

característico do sistema nervoso central, seguido do receptor CB2, o qual foi

identificado em macrófagos, na região periférica do baço e em outras células do

sistema imune (MUNRO; THOMAS; ABU-SHAAR, 1993). A partir de experimentos

com extratos de cérebros de porcos, a anandamida, um ligante endógeno capaz de

interagir com os receptores CB1 e CB2, foi descrita e, em 1997, um segundo ligante

endógeno, o 2-aracdonilglicerol (2-AG) foi caracterizado (DEVANE et al., 1992;

STELLA; SCHWEITZER; PIOMELLI, 1997). Em 2002, um terceiro endocanabinoide,

virodamina, foi caracterizado como antagonista do receptor CB1 e agonista total do

receptor CB2 (PORTER et al., 2002).

Ambos receptores são acoplados à proteína G inibitória, a qual inibe a

atividade da enzima adenilato ciclase, reduzindo os níveis citoplasmáticos de AMPc

e possivelmente mediando o mecanismo de analgesia in vivo (HOWLETT et al.,

22

1988). A estimulação do receptor CB1 também suprime a liberação de

neurotransmissores como, por exemplo, GABA, além de mediar a supressão

induzida por despolarização de neurônios inibitórios que recebem sinal retrógado em

células do hipocampo, culminando no efeito inibitório dos canabinoides em aspectos

relacionados à memória e ao movimento (BARINAGA, 2001; KLEIN et al., 2003)

1.9. FARMACOCINÉTICA

Os canabinoides são substâncias altamente lipofílicas, portanto facilmente

capazes de atravessar barreiras biológicas, e suscetíveis à metabolização por

enzimas hepáticas, sobretudo os citocromos P450 (CYP). Foi encontrada uma

correlação entre CYP2C9 e CYP3A com a formação de 7-hidroxi-THC e 6-β-hidroxi-

THC, respectivamente, enquanto CYP2C foi responsável pela biotransformação

de∆8-tetraidrocanabinol, ∆

9-tetraidrocanabinol e canabinol para seus respectivos

metabólitos do tipo 11-hidróxi (LOCKWOOD, 2002; WATANABEet al., 1995). Em

2007, a enzima CYP3A4 foi identificada como a principal responsável pela 7-α-

hidroxilação e 7-β-hidroxilação de ∆8-THC e 9-α-epoxidação e 10-α-epoxidação de

∆9-THC (WATANABE et al., 2007). Esse efeito de primeira passagem hepático reduz

drasticamente a biodisponibilidade de canabinoides após sua administração por via

oral. Adicionalmente, CBD e CBN possuem efeito inibitório seletivo sobre a isoforma

CYP1, viabilizando a formulação de medicamentos com base na interação de

fármacos para prolongar a ação de um composto metabolizado por essa enzima

(YAMAORI et al., 2010).

A administração pela via pulmonar é mais eficiente com relação à velocidade

de absorção e biodisponibilidade quando comparada à via oral devido à grande

23

superfície alveolar e intensa vascularização do tecido pulmonar, permitindo a rápida

absorção dos canabinoides, além de não apresentar o efeito de primeira passagem

da via oral. A pico da concentração de CBD e THC no soro e no cérebro acontece

nos primeiros minutos após administração pulmonar e duas horas após a

administração na via oral, havendo ainda relação sinérgica entre esses compostos

na manutenção da biodisponibilidade (HLOŽEK et al., 2017).

A lipofilicidade desses compostos colabora para sua distribuição sobretudo

no tecido adiposo e órgãos com elevado teor de gordura, tais como o cérebro. No

sangue, a maior parte do THC encontra-se ligado a proteínas plasmáticas, enquanto

o restante apresenta-se internalizado em eritrócitos (HUESTIS, 2007).

A eliminação do THC pode ser realizada pela urina, após reação de

conjugação com o ácido glicurônico, produzindo um composto com maior polaridade,

ou através das fezes. A excreção de metabólitos de canabinoides na urina é muito

baixa, sendo a excreção fecal a principal responsável pelo clearance de THC (WALL

et al., 1983).

24

2. OBEJTIVO

2.1. OBJETIVO GERAL

Desenvolver e validar um método analítico que possa ser aplicado na

quantificação de canabinoides presentes em extratos medicinais artesanais e

produtos industrializados à base de Cannabis utilizados no Brasil.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Constituem objetivos específicos deste trabalho:

• Desenvolvimento de método analítico para quantificação de canabinoides por

CLAE-DAD.

• Validação do método desenvolvido

• Avaliação de extratos medicinais e importados segundo método proposto.

25

3. METODOLOGIA

3.1. EXTRAÇÃO E PREPARO DE AMOSTRAS

A extração dos canabinóides foi otimizada por extração líquido-líquido com

base nas referências DEBACKER et al. (2009) e AMBACH et al. (2014), para tanto

100mg de extrato foi pesado e adicionado de 10mL da solução de metanol e n-

hexano (9:1 v/v) em tubo de polipropileno (Falcon) de 15mL. Os tubos foram

agitados em vórtex à velocidade de 2000rpm por 1 minuto e seguiram para um

banho de ultrassom durante 30 minutos. As amostras foram mantidas sob

resfriamento a -20ºC por 30 minutos e centrifugadas por 25 minutos a 4000rpm. O

sobrenadante foi retirado com o auxílio de uma seringa e filtrado em membrana com

poros de 0,22µm do tipo PTFE. A amostra final foi adicionada de diazepam 5,0µg/mL

para padronização interna.

Para quantificação dos canabinoides foi adotada a diluição das amostras de

no mínimo 10 vezes.

3.2. IDENTIFICAÇÃO DOS CANABINÓIDES

A separação e quantificação dos analitos (THC, THCA, CBD, CBDA e CBN)

foi realizada com base no publicado por DeBacker (2009) porcromatografia líquida

de alta eficiência acoplada ao detector de arranjo de diodos, equipamento da marca

ThermoFisher, utilizando-se uma bomba modelo 600, tipo Rheos 5600,

automostrador Accela, detector Accela PDA e software Chromequest.

As condições cromatográficas adotadas foram: coluna C18, 25cm x 4,6mm

de diâmetro interno e partícula de 5um, da marca ACE, temperatura de 50°C, fase

móvel composta por tampão formiato de amônio 50mM, pH 5,19 e metanol no modo

gradiente (Tabela 1), fluxo de 1,0 mL/min, volume de injeção de 10µL e λ=240 nm.

26

Tabela 1 - Gradiente adotado na separação dos analitos.

Intervalo de tempo (min) A B 0 - 10 32% 68%

10 - 20 15% 85% 20 - 22 8% 92% 22 - 30 5% 95%

Nota: A=tampão formiato de amônio, pH 5,19; B=metanol.

3.3. QUANTIFICAÇÃO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO

No Brasil, não há método farmacopeico de quantificação de canabinóides,

nem em outras farmacopeias ou compêndios oficiais reconhecidos pela ANVISA,

portanto o método de quantificação foi desenvolvido e parcialmente validado com

base nas normativas Resolução RE 899/2003, sua atualização RDC nº 166/2017 e

regulação de fitoterápicos Instrução Normativa nº 4, de 18 de junho de 2014 que

trata sobre os critérios de registro de fitoterápicos, inclusive o controle de qualidade.

Os seguintes parâmetros de segurança foram avaliados: especificidade, linearidade,

intervalo, precisão, limite de detecção, limite de quantificação, exatidão e robustez.

3.3.1. Especificidade

A especificidade é o parâmetro que se refere à capacidade de um método

analítico de diferenciar o sinal referente ao analito de interesse de sinais gerados por

interferentes presentes na matriz. No método desenvolvido, foi utilizado um detector

de arranjo de diodo (DAD) acoplado ao cromatógrafo, permitindo maior

especificidade na identificação dos componentes com auxílio da identificação dos

espectros de absorção UV. Padrões de referência certificados para os canabinoides

THC, CBD, THCA, CBDA E CBN na concentração de 0,1 mg/mL (Cerilliant, Sigma-

Aldrich, 1 mg/mL em estoque) foram analisados individualmente e o tempo de

retenção para cada um desses compostos foi identificado para comparação do perfil

cromatográfico com as amostras. Além disso, 5 matrizes oleosas diferentes foram

27

analisadas a fim de avaliar o efeito-matriz, sendo elas óleo de coco, óleo de soja,

azeite de oliva, óleo de girassol e triglicerídeos de cadeia média (TCM).

3.3.2. Linearidade

A linearidade é a relação entre o sinal obtido na análise e a concentração do

analito na amostra, dentro de um intervalo previamente estabelecido. As curvas de

calibração foram estabelecidas através da análise de 7 concentrações crescentes de

soluções contendo padrões de referência certificados. As curvas foram projetadas

para o intervalo compreendido entre 1µg/mL e 30µg/mL, abrangendo as

concentrações de 1,0; 5,6; 7,5; 10,0; 15,0; 20,0 e 30,0µg/mL, e a regressão linear foi

aplicada, sendo a linearidade expressa pelo valor do coeficiente de determinação

(r2). Segundo critérios da IN nº4/2014, a linearidade deve ser determinada pela

análise de pelo menos 5 concentrações diferentes das concentrações do material de

certificado, na faixa de 80 a 120% da concentração teórica do teste. O critério

adotado na IN nº4/2014é de r≥0,99 para curva de calibração de padrão e r≥0,98

quando a curva de calibração for preparada na matriz.

A curva de calibração foi construída por padronização interna com diazepam

(CITTI et al., 2016) na concentração de 5µg/mL.

As concentrações teóricas, no entanto, foram normalizadas pela massa de

cada composto (curva de calibração construída por gravimetria), portanto os pontos

de calibração ajustados foram1,11; 6,89; 9,13; 12,08; 15,99; 21,26 e 28,31µg/mL

para THC, 1,29; 8,02; 10,63; 14,05; 18,60; 24,74 e 32,93µg/mL para CBD, 1,22;

7,57; 10,04; 13,27; 17,57; 23,36 e 31,10µg/mL para THCA, 1,23; 7,59; 10,07; 13,31;

17,62; 23,43 e 31,19µg/mL para CBDA e 1,15; 7,12; 9,44; 12,47; 16,52; 21,96 e

29,24µg/mL para CBN.

28

3.3.3. Precisão

A precisão é definida através da proximidade de resultados obtidos através

de uma metodologia durante consecutivas replicatas de uma mesma amostra.

A precisão intra-ensaio, ou repetibilidade, refere-se à proximidade dos

resultados obtidos através de análises com o mesmo analista, reagentes,

equipamento e em curto intervalo de tempo, enquanto a precisão inter-ensaio, ou

precisão intermediária, deve ser mensurada através da aplicação do método

analítico sob condições diferentes daquelas previamente mencionadas, no mesmo

laboratório. A precisão inter-laboratorial, ou reprodutibilidade, contudo, refere-se a

concordância entre os resultados obtidos em diferentes laboratórios, o que é

importante para a inclusão de um método na Farmacopéia.

Neste trabalho, foi avaliada a precisão intra-ensaio apenas para os analitos

THC e CBD que são os canabinóides de interesse nos tratamentos farmacológicos.

Esse ensaio foi realizado pela análise de amostras de controlede qualidade (QC) em

concentração alta (QC1= 52µg/mL de THC e 45µg/mL de CBD) ebaixa (QC2=

3,5µg/mL de THC e 2,5µg/mL de CBD), de acordo com o intervalo do método, em 6

repetições para cada QC. Este parâmetro é avaliado em termos de imprecisão e

para tanto é adotado o desvio padrão relativo (DPR), também chamado de

coeficiente de variação (CV) (Equação 1). Para fitoterápicos, é aceito coeficiente de

variação de até 15%.

29

Equação 1: CV= (DP x CMD) x 100

Onde:

CV=coeficiente de variação;

DP=desvio padrão;

CMD=concentração média determinada.

3.3.4. Limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)

Entende-se como limite de detecção a menor concentração de um analito

capaz de gerar resposta no detector quando submetido ao método experimental,

sem que necessariamente possa ser quantificado de forma precisa e exata. O LD

para os canabinoides também podem ser determinados através da avaliação da

relação de 3 vezes o ruído da linha de base de 3 curvas de calibração,

compreendendo concentrações de analito próximas ao suposto limite de

quantificação.

O limite de quantificação, por sua vez, representa a menor concentração de

um analito que pode ser determinada com exatidão e precisão aceitáveis quando

submetidas ao método analítico, a qual também pode ser determinada

considerando-se uma relação de 10 vezes o ruído da linha de base.

Optamos por adotar como limite de detecção a menor concentração capaz

de proporcionar pico integrado pelo equipamento, diferenciado do ruído da linha de

base (método visual), enquanto, para o limite de quantificação, foi considerado o

valor correspondente ao menor valor ensaiado durante a execução da curva de

calibração corrigido para os fatores de diluição adotados na preparação da amostra.

30

3.3.5. Exatidão

A exatidão é entendida como a concordância entre os resultados obtidos a

partir de um teste analítico com um valor de referência aceito como verdadeiro

(CAUSON, 1997; PETERS; MAURER, 2002).

A avaliação desse parâmetro foi feita através da análise de 6 determinações,

sendo duas concentrações, média (QC1= 10µg/mL) e alta (QC2= 20µg/mL), em

triplicata, de amostras preparadas numa matriz de TCM com a adição de padrão de

referência certificado em concentrações finais compreendidas dentro do intervalo

linear e submetidas ao método extrativo. Os resultados foram comparados com as

soluções de padrões de referência certificados diluídos em metanol, ou seja, os

valores encontrados para essas amostras foram convencionalmente aceitos como

verdadeiros. Para cálculo da exatidão foi adotada a equação 2 (BRASIL, 2003).

Equação 2: Exatidão = (CME/CT) x 100

Onde:

CME=concentração média experimental;

CT=concentração teórica.

3.3.6. Robustez

A robustez é o parâmetro que se refere à capacidade de um método de gerar

os mesmos resultados mesmo com pequenas e deliberadas alterações das

condições analíticas, tais como pH, soluções-tampão, proporção entre componentes

da fase móvel, entre outros. Uma lista de fatores que afetam a robustez de um

método é elucidada na RE 899/2003, sendo eles a variação de pH da fase móvel,

31

variação na composição da fase móvel, mudança no lote ou fabricante da coluna

cromatográfica, temperatura e fluxo da fase móvel, no que tange à cromatografia

líquida.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. EXTRAÇÃO E PREPARO D

Uma extensa variedade de amostras foi recebida para aplicação do método

proposto (Figura 3). A metodologia de extração proposta visava ser eficiente para os

extratos recebidos de forma a abranger as diferentes matrizes oleosas empregadas

na produção dos extratos.

amostra e sua diluição em 10mL de solução metanol:n

adequadas para realizar

nas curvas de calibração. Para o caso de extratos em que a concentração de

canabinoides pós-quantificação ultrapassava o limite da curva, posterior diluição foi

realizada com solução diluente com 5

ficaram abaixo do limite de quantificação, 1g de amostra foi pesada, para aumentar a

quantidade de canabinoides extraídos. Os resultados foram normalizados pelos

fatores de diluição.

Figura 3: Variedade organoléptica

E DISCUSSÃO

EXTRAÇÃO E PREPARO DE AMOSTRAS



s recebidos de forma a abranger as diferentes matrizes oleosas empregadas

na produção dos extratos. Os resultados obtidos a partir da pesagem de 100mg de

amostra e sua diluição em 10mL de solução metanol:n-hexano (9:1, v/v) foram

para realizar a extração de canabinoides dentro do intervalo ensaiado


quantificação ultrapassava o limite da curva, posterior diluição foi

da com solução diluente com 5µg/mL de padrão interno. Para amostras que



ariedade organoléptica de extratos recebidos para análise.

32



s recebidos de forma a abranger as diferentes matrizes oleosas empregadas

Os resultados obtidos a partir da pesagem de 100mg de

hexano (9:1, v/v) foram

a extração de canabinoides dentro do intervalo ensaiado


quantificação ultrapassava o limite da curva, posterior diluição foi

mL de padrão interno. Para amostras que



de extratos recebidos para análise.

4.2. IDENTIFICAÇÃO DOS CA

DO MÉTODO

A identificação dos canabinoides foi obtida através

tempos de retenção. Foi

2016) em metanol para identificação do tempo de retenção do padrão interno (Figura

4). Em seguida, foram adicionados 10mg/mL de padrão

para os canabinoides THC, CBD, THCA, CBDA e CBN, cujos tempos de retenção

foram verificados (Figura 5).

Figura 4: Branco de metanol adicionado de padrão interno (diazepam). Tempo do diazepam= 7,947 minutos.

Os tempos de retenção de cada canabinoide obtidos pela análise individual

dos respectivos padrões de referência certificado

min para CBD, 19,00 min para CBN, 11,47 min para CBDA e

os quais estão associados ao parâmetro de especificidade do método analítico,

IDENTIFICAÇÃO DOS CANABINOIDES, QUANTIFICAÇÃO E VA

A identificação dos canabinoides foi obtida através da

i realizada adição de padrão interno diazepam

em metanol para identificação do tempo de retenção do padrão interno (Figura

). Em seguida, foram adicionados 10mg/mL de padrão de referência


foram verificados (Figura 5).

Figura 4: Branco de metanol adicionado de padrão interno (diazepam). Tempo do diazepam= 7,947 minutos.


dos respectivos padrões de referência certificados foram 20,69 min para THC, 14,96

min para CBD, 19,00 min para CBN, 11,47 min para CBDA e 16,17 min para THCA.


33

, QUANTIFICAÇÃO E VALIDAÇÃO

da determinação dos

adição de padrão interno diazepam (CITTI et al.,

em metanol para identificação do tempo de retenção do padrão interno (Figura

de referência certificado


Figura 4: Branco de metanol adicionado de padrão interno (diazepam). Tempo de retenção


20,69 min para THC, 14,96

16,17 min para THCA.,


posto que o método foi eficiente em demonstrar um

dos extratos.

Figura 5: Perfil cromatográfico de canabinoides a 10de 5µg/mL.

Após otimização

899/2003 (ANVISA), com atualização

Instrução Normativa nº4 da ANVISA, publicada em junho de 2014

O próximo parâmetro a ser avaliado foi a linearidade, através da construção

de uma curva de calibração formada a partir da análise de amostras com

concentrações conhecidas de padrão certificado de referência.

referentes a cada ponto de calibração

posto que o método foi eficiente em demonstrar uma separação dos componentes

Figura 5: Perfil cromatográfico de canabinoides a 10µg/mL. Concentração de diazepam foi

otimização do método, foi realizada a validação

(ANVISA), com atualização da RDC nº 166, de 24 de julho de

Instrução Normativa nº4 da ANVISA, publicada em junho de 2014

âmetro a ser avaliado foi a linearidade, através da construção


concentrações conhecidas de padrão certificado de referência.

referentes a cada ponto de calibração são apresentados nas Figura

34

a separação dos componentes

tração de diazepam foi

oi realizada a validação segundo a RE

de 24 de julho de 2017, e

Instrução Normativa nº4 da ANVISA, publicada em junho de 2014.

âmetro a ser avaliado foi a linearidade, através da construção


concentrações conhecidas de padrão certificado de referência. Os cromatogramas

Figuras 6 a 12.

Figura 6: Perfil cromatográfico do ponto 1 da curva de calibração. Concentração de diazepamigual a 5µg/mL e dos analitos correspondentes aos seguintes valores: THC=1,11µg/mL, CBD=1,29CBN=1,15µg/mL.

Figura 7: Perfil cromatográfico do ponto 2 da curva de calibração. Concentração de diazepam igual a 5µg/mL e dos aTHC=6,89µg/mL, CBD=8,02CBN=7,12µg/mL.

Figura 6: Perfil cromatográfico do ponto 1 da curva de calibração. Concentração de mL e dos analitos correspondentes aos seguintes valores:

mL, CBD=1,29µg/mL, THCA=1,22µg/mL, CBDA=1,23



35


mL, CBDA=1,23µg/mL,

Figura 7: Perfil cromatográfico do ponto 2 da curva de calibração. Concentração de nalitos correspondentes aos seguintes valores:


Figura 8: Perfil cromatográfico do ponto 3 da curva de calibração. Concentração de diazepam igual a 5µg/mL e dos analitos corresTHC=9,13µg/mL, CBD=10,63CBN=9,44µg/mL.

Figura 9: Perfil cromatográfico do ponto 4 da curva de calibração. Concentração de diazepam igual a 5µg/mL e dos analitos correspondentesTHC=12,08µg/mL, CBD=14,05CBN=12,47µg/mL.





36

Figura 8: Perfil cromatográfico do ponto 3 da curva de calibração. Concentração de pondentes aos seguintes valores:


Figura 9: Perfil cromatográfico do ponto 4 da curva de calibração. Concentração de aos seguintes valores:


Figura 10: Perfil cromatográfico do ponto 5 da curva de calibração. Concentração de diazepam igual a 5µg/mL e dos analitos correspondentes aos segTHC=15,99µg/mL, CBD=18,60CBN=16,52µg/mL.

Figura 11: Perfil cromatográfico do ponto 6 da curva de calibração. Concentração de diazepam igual a 5µg/mL e dos analitos correspondentes aos seguintesTHC=21,26µg/mL, CBD=24,74CBN=21,96µg/mL.

Figura 10: Perfil cromatográfico do ponto 5 da curva de calibração. Concentração de mL e dos analitos correspondentes aos seg


Figura 11: Perfil cromatográfico do ponto 6 da curva de calibração. Concentração de mL e dos analitos correspondentes aos seguintes


37





Figura 12: Perfil cromatográfico do ponto 7 da curva de calibração. Concentração de diazepam igual a 5µg/mL e dos analitos correspondentes aos seguintes valoresTHC=28,31µg/mL, CBD=32,93CBN=29,24µg/mL.

Inicialmente, havia sido projetada uma curva de calibração com os mesmos

valores para cada canabinoide. Contudo, cada componente da amostra foi pesado

individualmente e fizemos um cálculo de sua concentração na amostra final com

base no peso, normalizando os dados com relação à massa dos compostos.

Portanto, foram gerados intervalos lineares e limites inferior e superior de

quantificação diferentes para cada analito.

A partir da resposta obtida no detector para cada concentração de analito,

foram geradas as curvas para THC, CBD, THCA, CBDA e CBN

A representação gráfica das curvas de calibração

equações de reta e coeficientes de determinação

analito/área do PI) são apresentadas nas Figuras 1

Figura 12: Perfil cromatográfico do ponto 7 da curva de calibração. Concentração de mL e dos analitos correspondentes aos seguintes valores




e fizemos um cálculo de sua concentração na amostra final com



quantificação diferentes para cada analito.

partir da resposta obtida no detector para cada concentração de analito,

foram geradas as curvas para THC, CBD, THCA, CBDA e CBN

A representação gráfica das curvas de calibração com as respectivas

equações de reta e coeficientes de determinação obtidas pela área relativa (área do

analito/área do PI) são apresentadas nas Figuras 13, 14, 15, 16 e 1

38





e fizemos um cálculo de sua concentração na amostra final com



partir da resposta obtida no detector para cada concentração de analito,

com as respectivas

área relativa (área do

e 17.

Figura 13: Representação gráfica para curva analítica depontos de calibração, entre as concentrações 1,11 a 21,31

Figura 14: Representação gráfica para curva analítica de CBDpontos de calibração

Representação gráfica para curva analítica de THC, a papontos de calibração, entre as concentrações 1,11 a 21,31µg/mL.

entação gráfica para curva analítica de CBDpontos de calibração, entre as concentrações 1,29 a 32,93µg/mL

39

THC, a partir de 7 mL.

entação gráfica para curva analítica de CBD, a partir de 7 mL.

Figura 15: Representação gráfica para curva analítica de THCApontos de calibração, entre as concentrações 1,22

Figura 16: Representação gráfica para curva analítica de CBDApontos de calibração

Representação gráfica para curva analítica de THCA, entre as concentrações 1,22 a 31,10µg/mL

Representação gráfica para curva analítica de CBDApontos de calibração, entre as concentrações 1,23 a 31,19µg/mL

40

Representação gráfica para curva analítica de THCA, a partir de 7 mL.

Representação gráfica para curva analítica de CBDA, a partir de 7 mL.

Figura 17: Representação gráfica para curva analítica de THCApontos de calibração

Os cromatogramas obtidos no ensaio de especificidade pela análise de

alguns óleos normalmente empregados como veículos nos

apresentados nas Figura

azeite de oliva e TCM apresentaram interferentes nos tempos de retenção do CBD e

CBDA, enquanto o óleo de girassol apresentou interferentes nos tempos de retenção

do CBDA e THC. Após a aplicação do cálculo do valor do fator de diluição

amostra, a concentração de interferente que seria adicionada a cada amostra

encontra-se representada na

Representação gráfica para curva analítica de THCAção, entre as concentrações 1,15 a 29,24µg/mL


alguns óleos normalmente empregados como veículos nos extratos

Figuras 18 a 22. Conforme observado, os ó



Após a aplicação do cálculo do valor do fator de diluição


se representada na Tabela 2.

41

Representação gráfica para curva analítica de THCA, a partir de 7 mL.


extratos medicinais são

. Conforme observado, os óleos de coco, soja,



Após a aplicação do cálculo do valor do fator de diluição para cada


Figura 18: Perfil cromatográfico de óleo de coco, adicionado de Diazepam na concentração de 5µg/mL.

Figura 19: Perfil cromatográfico de óleo de soja, adicionado de Diazepam na concentração de 5µg/mL.

Figura 18: Perfil cromatográfico de óleo de coco, adicionado de Diazepam na g/mL.

Figura 19: Perfil cromatográfico de óleo de soja, adicionado de Diazepam na g/mL.

42

Figura 18: Perfil cromatográfico de óleo de coco, adicionado de Diazepam na

Figura 19: Perfil cromatográfico de óleo de soja, adicionado de Diazepam na

Figura 20: Perfil cromatográfico de óleo de girassol, adicionado de Diazepam na concentração de 5µg/mL.

Figura 21: Perfil cromatográficoconcentração de 5µg/mL.

Figura 20: Perfil cromatográfico de óleo de girassol, adicionado de Diazepam na g/mL.

Figura 21: Perfil cromatográfico do azeite de oliva, adicionado de Diazepam na g/mL.

43

Figura 20: Perfil cromatográfico de óleo de girassol, adicionado de Diazepam na

do azeite de oliva, adicionado de Diazepam na

Figura 22: perfil cromatográfico dos triglicerídeos de cadeia média (TCM), adicionado de Diazepam na concentração de 5

Tabela 2: Concentração dos interferentes das matrizedos canabinoides. Matrizes

Óleo de coco Óleo de soja Óleo de girassol Azeite de oliva TCM

TCM= triglicerídeos de cadeia média.ND= não detectável

No ensaio de precisão intra

CBD e CV= 2,97% e 6,47% para o THC nos QC1 e QC2, respe

Os parâmetros de segurança do método para CBD e THC estão

apresentados na Tabela 3

Figura 22: perfil cromatográfico dos triglicerídeos de cadeia média (TCM), adicionado de Diazepam na concentração de 5µg/mL.

: Concentração dos interferentes das matrizes nos tempos de retenção

Concentração de interferentes (

CBD CBDA 0,07 0,083 0,052 0,083 ND 0,062

0,071 0,095 0,072 0,081

M= triglicerídeos de cadeia média.

No ensaio de precisão intra-ensaio foram obtidos CV=3,25% e

CBD e CV= 2,97% e 6,47% para o THC nos QC1 e QC2, respect


la 3.

44

Figura 22: perfil cromatográfico dos triglicerídeos de cadeia média (TCM), adicionado

s nos tempos de retenção

Concentração de interferentes (µµµµg/mL)

THC ND ND

0,053 ND ND

3,25% e 6,21% para o

ctivamente.


45

Tabela 3: Parâmetros de segurança do método para CBD e THC

Parâmetro

LQ (µµµµg/mL)

0,1 LD (µµµµg/mL)

0,01 Intervalo linear (µµµµg/mL)

1 - 30 Coeficiente de determinação (r2) para CBD

0,99965 Coeficiente de determinação (r2) para THC 0,99936

QC1 QC2

Imprecisão intra-ensaio 3,25 6,21 (CV %) para CBD

Imprecisão intra-ensaio 2,97 6,47 (CV %) para THC

LQ= limite de quantificação; LD= limite de detecção; CV= coeficiente de variação; QC1= concentração alta, sendo CBD=45,0µg/mL e THC=52,0µg/mL; QC2= concentração baixa, sendo CBD=2,5µg/mL e THC=3,5µg/mL.

Os resultados da validação parcial estão de acordo com a Instrução

Normativa nº4 da ANVISA, publicada em junho de 2014, para registro de

medicamento fitoterápico.

A exatidão do método foi mensurada para os canabinoides CBD, THC e

CBN, segundo formula descrita na RE 899/2003, na matriz TCM, e os valores

obtidos para cada QC encontram-se mostrados na Tabela 4.

Tabela 4: Exatidão do método na quantificação dos canabinoides CBD, THC e CBN.

CBD THC CBN

QC1 89,51% 85,05% 97,09%

QC2 117,45% 99,49% 90,34%

Nota: QC1= 10µg/mL; QC2= 20µg/mL.

46

No QC2 para CBD, o valor de 117,45% de exatidão pode ser um indicativo

de ação do interferente da matriz TCM, o qual foi confirmado na análise da matriz

(Figura 22 e Tabela 2).

4.3. APLICAÇÃO DO MÉTODO ÀS AMOSTRAS AUTÊNTICAS

No âmbito do projeto de extensão universitária Farmacannabis-UFRJ,

amostras de extratos medicinais artesanais e produtos industrializados utilizados no

tratamento de pacientes com epilepsia refratária foram recebidas pela equipe e o

método proposto de quantificação dos canabinoides foi aplicado. Os perfis

cromatográficos de duas amostras, uma importada e outra artesanal, são

apresentados nas Figuras 24 e 25. As amostras, conforme se pode observar na

Figuras 24 e 25, frequentemente tiveram que ser diluídas a fim de se obter valores

dentro do intervalo da curva de calibração.

Figura 23: Perfil cromatográfico de um extrato importado (CBD puro) em TCM como veículo

Figura 24: Perfil cromatográfico de extrato artesanal veículo.


: Perfil cromatográfico de extrato artesanal rico em THC em azeite de oliva como

47


em azeite de oliva como

48

As Tabelas 5 e 6 mostram dados preliminares obtidos no projeto

Farmacannabis em que é possível estabelecer comparações entre a realidade

química dos extratos de Cannabis importados e dos produzidos artesanalmente. Os

extratos apresentaram grande variabilidade nas características físicas e

organolépticas, tais como, cor, textura, odor e viscosidade, além de grande

variabilidade de veículos, tais como, óleo de coco, soja, uva, girassol, TCM, azeite

de oliva, glicerina, óleo de semente de cânhamo, entre outros, gerando dificuldades

no estabelecimento de um branco de matriz para o método analítico.

49

Tabela 4: Resultados preliminares de produtos comerciais importados analisados por CLAE-DAD.

CBD purificado

Concentração (mg/mL ou mg/g)

origem forma/veículo concentração

no rótulo CBDA CBD THCA CBN THC

EUA oleoso 200 mg/mL

ND 210,45 ND ND ND

EUA oleoso 50 mg/mL

ND 13,17 ND 0,45 ND

EUA oleoso 50 mg/mL

ND 77,45 ND ND ND

EUA oleoso 50 mg/mL

ND 41,17 1,10 0,4 ND


ND 104,13 ND ND ND


ND 284,90 ND ND ND


ND 88,40 ND ND ND


ND 90,70 ND ND ND

Extratos ricos em CBD

CBDA CBD THCA CBN THC

EUA oleoso 50 mg/mL ND 47,88 ND 0,75 3,30

EUA oleoso 60 mg/mL ND 39,34 ND ND 1,44

EUA oleoso 61 mg/mL ND 40,67 ND ND 1,74

Canadá oleoso 24,97 mg/mL 1,15 21,14 0,56 0,30 2,16

EUA resina 170 mg/mL ND 121,93 1,00 0,42 2,31

EUA resina 160 mg/g

(THC<9 mg/g)

4,49 142,48 ND 1,32 8,15

EUA resina 240 mg/g 1,97 118,81 ND ND 1,60

EUA cápsula ND ND 80,87 ND ND 4,12

EUA cápsula 50 mg/cápsula ND 95,88 ND ND 4,33

ND= não detectado (limite de detecção= 0,01mg/mL ou 0,01mg/g, para resina). EUA= Estados Unidos da América.Fonte: CARVALHO, 2017.

50

Tabela 5: Resultados preliminares de produtos artesanais caseiros ou clandestinos analisados por CLAE-DAD.

Extratos ricos em THC

ou THC-CBD (1:1) Concentração (mg/mL ou mg/g)

origem forma/veículo Variedade de Cannabis


RJ oleoso Cronic

ND 0,1 2,36 ND 1,64

RJ oleoso Pur Kush

ND 0,1 3,65 ND 1,39

RJ oleoso Cinderela

ND ND 0,8 ND 2,19

RJ oleoso Cinderela

ND ND 1,16 ND 2,64

RJ oleoso Wildfire

ND 0,97 ND ND 6,39

RJ oleoso óleo de Harletsu + resina de

Cinderela

3,35 2,59 0,74 0,4 2,83

RJ oleoso Híbrida:

CBD skunk haze + LSD

3,81 ND 2,39 ND 0,1

SC oleoso NI

0,1 0,61 2,65 0,11 12,9

SC oleoso NI

ND 2,2 0,9 1,03 44,85

SC oleoso NI

0,1 1,36 0,71 0,77 29,6

RJ resina Cinderela

0,1 0,33 0,14 8,42 28,3

SC resina NI

ND 16,67 6,32 5,43 338,22

SC resina NI

0,75 14,59 0,7 4,2 314,12

SC resina NI

ND 14,05 1,02 5,84 303,25

Extratos ricos em CBD


RJ oleoso Harletsu 2,32 1,06 0,1 ND ND

RJ oleoso Harletsu 2,67 1,21 0,1 ND 0,1

RJ oleoso Harletsu 4,33 3,3 0,11 ND 0,25

RJ oleoso Harletsu 0,24 4,77 ND 0,1 0,4

RJ oleoso Harletsu 0,1 7,95* ND ND 0,33

RJ oleoso Harletsu 4,25 17,43* ND 0,15 0,73

Extratos com traços de canabinoides CBDA CBD THCA CBN THC

PB glicerina NI ND ND 0,2 ND 0,14


PB glicerina NI 0,3 0,1 0,12 ND 0,1





PB glicerina NI ND 0,1 0,21 0,05 0,16


PB água/spray NI 0,05 ND 0,2 ND 0,06

ND= não detectado (limite de detecção= 0,01mg/mL ou 0,01mg/g de resina); PB= Paraíba, BR; RJ= Rio de Janeiro, BR; SC= Santa Catarina, BR; NI= não identificado; *Preparado por extração alcoólica no Laboratório de Análises Toxicológicas sob supervisão farmacêutica. Fonte: CARVALHO, 2017.

51

As amostras que apresentaram concentração abaixo de 1mg/mL, estando,

portanto, muito próximas do LQ do método, foram novamente analisadas pesando-

se 1g da amostra ao invés de 100mg, a fim de obter de obter picos dentro da faixa

linear do método compreendido na curva de calibração ensaiada.

A partir dos resultados qualitativos e quantitativos foi possível verificar

diferenças entre os teores de canabinoides em produtos comerciais importados e

produtos artesanais nacionais, uma vez que o os comerciais importados

apresentaram em sua totalidade teores de CBD muito maiores do que THC.

4.4. COMPARAÇÃO ENTRE CLAE-DAD E CROMATOGRAFIA GASOSA

Uma série de técnicas quantitativas podem ser empregadas na

determinação dos teores de canabinoides de amostras e determinação de perfis

químicos como, por exemplo, CLAE, cromatografia gasosa com detecção de

ionização de chama (CG-DIC), ressonância magnética nuclear e outras (AIZPURUA-

OLAIZOLA et al., 2014; CITTI et al., 2016; PESCHEL; POLITI, 2015).

A forma mais comum de consumo de Cannabis acontece por via pulmonar,

através do fumo da planta, ou via oral, através da ingestão de produtos alimentícios

preparados utilizando-a como ingrediente. Em ambos os casos, a utilização de

elevadas temperaturas para consumo ou preparo do material contribui para a

descarboxilação da forma ácida do THC, gerando a forma neutra e seu consequente

efeito psicoativo. Por tratar-se de uma planta proscrita no Brasil, a detecção de

canabinoides numa amostra de planta já é suficiente para fornecer evidência para a

inclusão da amostra analisada como prova em possíveis inquéritos policiais e ações

judiciais. Portanto, para efeito de avaliação forense, a simples detecção da

52

concentração total de THC (constituído pela soma da concentração de THC com a

concentração de THCA) presente na amostra atende à necessidade da rotina de

trabalho dos peritos. Para tal finalidade, tende-se a utilizar a cromatografia gasosa,

por conta de sua alta seletividade e sensibilidade, acoplada a diversos detectores,

sendo os mais comuns o detector de ionização de chama (DIC) e espectrômetro de

massa (EM). CG baseia-se na separação de compostos com base na afinidade do

analito entre uma fase móvel gasosa, geralmente composta por um gás inerte, tal

como o hélio, ou um gás não reativo, como o nitrogênio, e uma fase estacionária

líquida, sob alta temperatura, a qual promove a volatilização do composto a ser

analisado. No caso dos canabinoides, a análise no equipamento de CG promove a

descarboxilação das formas ácidas por conta da temperatura empregada

(ROMANO; HAZEKAMP, 2013; VERESS; SZANTO; LEISZTNER, 1990), de modo

que, para que seja feita a análise desses componentes, seja necessária a introdução

de uma etapa extra de preparo das amostras que consiste na derivatização dos

compostos ácidos, assim como dos compostos derivados dos canabinoides em

matrizes biológicas (CLOUETTE et al., 1993; STAUB, 1999). Cabe ressaltar que

diferentes processos extrativos também podem influenciar na concentração final de

canabinoides em uma amostra, tal como em sua descarboxilação (SMITH;

VAUGHAN, 1977)

Contudo, em análises de material vegetal e extratos utilizados com finalidade

terapêutica, a distinção entre as formas ácidas e neutras de THC e CBD são de

extrema importância. Até o momento, os efeitos farmacológicos das formas ácidas

dos canabinoides não foram suficientemente explorados e descritos, de modo que a

ação terapêutica é atribuída massivamente às formas neutras, motivo pelo qual a

53

validação do método, mormente no ensaio de precisão, foi focada nos marcadores

THC e CBD. Assim, é imprescindível para os pacientes o acesso aos extratos que já

tenham sofrido o processo de descarboxilação ou, pelo menos, ter conhecimento

dos teores de cada um dos principais canabinoides para prospectar alternativas para

providenciar a descarboxilação para maior aproveitamento do material terapêutico,

além de auxiliá-los no gerenciamento do tratamento, através do ajuste de doses por

parte dos médicos responsáveis.

Portanto, o uso de CLAE-DAD neste trabalho trouxe algumas vantagens

para o desenvolvimento das análises que o tornou uma opção mais adequada à

rotina. Primeiramente, exclui-se a necessidade de derivatização das amostras para

análise das formas ácidas THCA e CBDA, posto que a baixa temperatura no

equipamento mantém os compostos estáveis durante a análise, sendo possível

avaliar suas concentrações de forma independente.

4.5. DISCREPÂNCIA ENTRE VALORES ESTIPULADOS NOS RÓTULOS E

QUANTIFICADOS

O uso medicinal de Cannabis emergiu de forma inusitada no Brasil a partir

de 2015, sobretudo em decorrência do movimento social liderado por mães de

pacientes portadores de epilepsia refratária como consequência de condições

clínicas graves, esse cenário trouxe uma questão para o uso terapêutico da planta: a

correta identificação dos teores de canabinoides em produtos industrializados

importados e artesanais nacionais.

No exterior, produtos à base de Cannabis são comercializados como

suplemento alimentar ao invés de produto farmacêutico. Devido a essa classificação,

tais produtos não passam pelo rígido controle de qualidade ao qual são submetidas

54

as formulações para uso terapêutico. Portanto, a homogeneidade intra e inter-lote

não pode ser assegurada, gerando o risco de ingestão inadequada de canabinoides,

o que pode ocasionar resposta fisiológica variável nos pacientes. Vandrey et al.

(2015) fizeram um levantamento de produtos alimentícios à base de Cannabis

através de quantificação por CLAE e determinou que 60% das amostras analisadas

apresentaram rótulos que indicavam teores de canabinoides maiores do que o

declarado nos rótulos. Portanto, transportando essa realidade para o panorama

brasileiro, em que extratos são utilizados no tratamento de doenças graves, a

discrepância entre rótulo e concentração real pode gerar respostas variáveis

capazes de afetar profundamente o bem-estar de pacientes.

As recentes conquistas dos movimentos sociais pró-Cannabis medicinal

incluem a autorização judicial para cultivo e manufatura de extratos com finalidade

terapêutica através da concessão de salvo-condutos. Para tais extratos, o mais

interessante é produzi-los a partir de cânhamo, ou seja, planta de Cannabis com

teores expressivamente maiores de CBD quando comparado ao THC e demais

canabinoides(OOMAH et al., 2002; CARVALHO, 2017). Como esta planta não se

encontra caracterizada dentre as variedades cultivadas no Brasil, a avaliação

qualitativa e quantitativa dos extratos produzidos pelas famílias de pacientes é

essencial para monitoramento das terapias, o que vem sendo feito pelo projeto

Farmacannabis-UFRJ no âmbito da extensão universitária. Os resultados

preliminares verificados na Tabela 3 evidenciam que a discrepância entre rótulos e

concentração real, dados também constatados por Vandrey e colaboradores (2015),

se reproduz nos produtos que chegam ao mercado brasileiro. Além disso, mostra

que a variedade Harletsu apresenta um perfil químico mais próximo do cânhamo

55

(razão CBD:THC>>1). No entanto, futuros estudos de otimização de processos

extrativos e secagem das plantas precisam ser desenvolvidos para o

estabelecimento de protocolos seguros e confiáveis para secagem, extração e

ressuspensão da resina em óleo, sob formulação apropriada para a ingestão por via

oral.

4.6. IMPLICAÇÕES FORENSES E TERAPÊUTICAS DO DESENVOLVIMENTO

DE UM NOVO MÉTODO ANALÍTICO PARA CANABINOIDES

Na rotina forense, a metodologia de análise de canabinoides geralmente é

feita através de CG. O uso de CLAE, no entanto, traria vantagens à implementação

de análises toxicológicas, sobretudo no que concerne a matrizes biológicas, extratos

de plantas ou mesmo matéria seca, ao compararmos a relação custo-benefício.

A ausência de uma metodologia de quantificação de canabinoides descrita e

validada na Farmacopeia Brasileira ou outras farmacopeias e compêndios

reconhecidos pela ANVISA apresenta um obstáculo à padronização de análises

forenses e toxicológicas em laboratórios do Brasil, posto que é possível que

apliquem metodologias diferentes e, portanto, variações nos resultados capazes de

gerar discrepâncias entre os resultados obtidos. O presente trabalho traz uma nova

perspectiva para essa realidade ao introduzir uma metodologia validade segundo os

parâmetros estabelecidos na legislação sanitária vigente, portanto adequado à

aplicação em múltiplas unidades de análise, mantendo-se a confiabilidade dos

resultados obtidos.

Os canabinoides já possuem extensa aplicação biológica no controle de

condições clínicas. Um estudo preliminar foi capaz de associar o consumo de CBD à

redução do consumo de tabaco por indivíduos decididos a deixar de fumar,

56

reduzindo o anseio por nicotina causado pela abstinência (MORGAN et al., 2013),

além de auxiliar no controle da ansiedade provocada por discurso em público de

pacientes com Desordem de Ansiedade Social (BERGAMASCHI et al., 2011).

Apesar dessas atividades, é o efeito anticonvulsivante do CBD que mais atrai a

atenção de pacientes com quadros de epilepsia refratária aos tratamentos

disponíveis no sistema de saúde brasileiro. A aquisição de extratos que possuem

canabinoides em sua composição esbarra num aparato burocrático e na ausência de

informações precisas com relação à segurança dos tratamentos.

O desenvolvimento do método analítico por CLAE-DAD para quantificação

de canabinoides oferece às famílias de pacientes a possibilidade de identificar o

perfil químico dos extratos utilizados para tratamento no Brasil, sobretudo no que

tange aos teores de CBD, THC, CBDA, THCA e CBN, os quais possuem maior

importância farmacológica no tratamento anticonvulsivante. Tendo essas

informações em mãos, as quais por vezes difere dos dados declarados em rótulos

de produtos, pacientes e seus respectivos médicos podem ajustar o tratamento para

melhor atender às necessidades individuais e ajustar as doses administradas para

obtenção do efeito farmacêutico desejado.

4.7. LIMITAÇÕES PARA VALIDAÇÃO DO MÉTODO

A validação do método analítico seguiu as diretrizes expedidas pela ANVISA

na RE 899/2003, RDC nº 166/2017 e IN nº 4/2014, a fim de estar de acordo com a

regulamentação nacional prevista para fitoterápicos. Para a devida validação de um

novo método, algumas informações acerca das formulações são necessárias para a

correta avaliação das variáveis que afetam os resultados obtidos. Primeiramente,

necessita-se de conhecimento com relação à matriz em que o analito se encontra,

57

além de padrões de referência certificados e quantidades suficientes de amostras

para realização das replicatas. Com relação à Cannabis, o acesso a essas

informações/amostras encontra barreiras burocráticas que dificultam o trabalho.

Além do problema da falta de acurácia entre as informações dos rótulos dos

produtos à base de Cannabis importados e sua concentração legítima, as

informações no que tange aos componentes utilizados como matriz também por

vezes encontra-se defasada. De modo geral, o TCM é descrito em diversos rótulos

como componente da matriz, contudo é difícil precisar a exata origem do TCM

utilizado e se as diferentes fontes interferem na composição geral do que é tido

como TCM. Neste trabalho, foi utilizado o TCM purificado a partir do óleo de coco,

cujo cromatograma é mostrado na Figura 22. Uma rápida comparação visual entre

este cromatograma e aquele mostrado na Figura 23, referente a uma amostra

importada que descrevia o uso de TCM em seu rótulo, mostra a inexistência dos dois

picos de interferentes nos minutos finais da corrida, o que poderia ser um indicativo

de que pode ter sido utilizado TCM de fonte diferente do óleo de coco. Alguns

produtos apresentam ainda óleo de semente de cânhamo como componente da

matriz, o qual possui acesso altamente limitado pela legislação regulatória brasileira,

portanto não temos acesso a ele para realização dos estudos do efeito de matriz.

Os padrões certificados de referência apresentam elevado valor de mercado

e um forte aparato burocrático de controle de sua importação, mesmo para fins de

pesquisa. A ausência de quantidades expressivas de padrões para utilização na

validação do método analítico foi limitante durante o estabelecimento de alguns

parâmetros que exigiam muitas replicatas, tais como precisão e exatidão. Para

contornar essa questão, o ensaio de precisão foi realizado a partir de amostras de

58

concentração conhecida, atendendo aos critérios preconizados na IN nº 4/2014.

Com relação à exatidão, o ensaio foi feito com a adição de padrão certificado de

referência à TCM e submissão da amostra ao método. Apenas uma corrida para

cada uma das três concentrações de teste foi feita, demandando conclusão das

replicatas antes de considerar esse parâmetro totalmente validado.

Por fim, o próprio acesso a amostras é dificultado. Devido ao elevado preço

do produto importado e dificuldade na produção artesanal do extrato, os pacientes

atendidos pelo Farmacannabis-UFRJ não podem dispor de volumes grandes de

amostras para que sejam feitas repetições das análises para avaliação de

parâmetros importantes na realidade de um tratamento farmacêutico, tal como

estabilidade da amostra e degradação dos componentes. A autorização de cultivo de

plantas do gênero Cannabis pela UFRJ por parte da ANVISA seria de grande

importância para a elaboração de estudos mais aprofundados com relação ao uso

dos extratos de Cannabis como medicamento, aumentando sua segurança para

pacientes e familiares.

59

5. CONCLUSÃO

Os resultados mostraram que o método analítico desenvolvido durante este

trabalho foi capaz de oferecer concordância satisfatória com os parâmetros

analíticos preconizados na RE 899/2003 e na RDC n° 166, de 24 de julho de 2017.

Deste modo, o método pode ser submetido a futuros testes afim de obtenção integral

de sua validação e utilização para controle de qualidade de fitoterápicos produzidos

à base de Cannabis.

O presente método precisa ser mais profundamente testado, sobretudo no

que tange a fatores que afetam a robustez do método, de modo a obtermos a

validação plena.

A avaliação preliminar dos extratos utilizados para tratamento de pacientes

com quadros de epilepsia refratária no Brasil demonstra uma incongruência em

muitos casos entre as informações emitidas nos rótulos dos produtos com sua real

quantificação, o que pode oferecer um risco ao quadro clínico desses pacientes,

sendo extremamente necessário que seja feito o acompanhamento farmacêutico

desses tratamentos.

Uma outra possível aplicação para a metodologia, além das já citadas,

poderia ser a identificação do perfil químico de variedades de Cannabis cultivadas

atualmente no Brasil para a prospecção de variedades que ofereçam melhor

adequação terapêutica às demandas da sociedade civil, análises toxicológicas em

matrizes biológicas e continuidade da análise de extratos artesanais e importados

utilizados no país.

60

6. REFERÊNCIAS

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Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Ciências …³ides.HPLC_Andrey... · 2018-03-13 · mostrou o poder de mudança que a empatia tem, me ensinando a me tornar um