Exame de Qualificação para o Título de DoutoradoQualis A – UFRJ – IBCCF

Apresentado em 17/06/2009

Via Ubiquitina-proteassoma: exportação, endereçamento e métodos de determinação da

estrutura proteica

Roberta Alvares CamposIBCCF – UFRJ

Proteólise intracelular

Sumário dos Sistemas Proteolíticos Intracelulares

Sistema Localização Especificidade/Substrato/Função

Lisossomo Citoplasma Degradação intracelular de proteínas por endocitose.

Ubiquitina-proteassoma (UPS)

Citoplasma, Núcleo, Compartimentos

Ação sobre muitas proteínas intracelulares, bem como degrada a maioria das proteínas danificadas/unfolding. Via dependente de ATP.

Via dependente Cálcio - Calpaínas

Citoplasma Degrada proteínas do citoesqueleto.

Cascata das Caspases

CitoplasmaRelacionadas a apoptose celular e com as vias de resposta do sistema imune/citocinas/TNFs. São reguladas pos-traducionalmente.

Proteinases Mitocondriais

MitocôndriasDegradam proteínas mitocondriais oxidadas. Degradação parcial de proteínas para importação do citoplasma para mitocôndria e vice-versa (dependente de UPS).

Proteinases de Membranas

Retículo Endoplasmático (ER), Membrana plasmática e Mitocôndria

Degradação parcial de proteínas secretadas, endocitadas e importadas. Degradação de proteínas defeituosas, recém sintetizadas.

Modificado de: Donohue, TM Jr & Osna NA. Alcohol Res. Health, 2004: 27(4).

• REGULADORES DO CICLO CELULAR: proteínas que são ubiquitinadas e endereçadas para

proteólise cumprem um papel essencial para as células que fazem parte de vias regulatórias. Ex.

ubiquitinação das ciclinas durante a fase G1 da mitose.

• PROMOVE FATORES PARA LINFÓCITOS: estimulando a diferenciação dos linfócitos B e T.

• EXPORTAÇÃO E IMPORTAÇÃO PROTEÍNAS: intracelularmente. Ex. Monoamina oxidase A e B,

dependentes de ATP e que são associadas com outras proteínas de membranas para entrar e sair de

mitocondrias.

• HEAT SCHOCK PROTEINS: como resposta rápida ao aumento de temperatura, observa-se um

aumentando da expressão gênica de ubiquitinas, promovendo um aumento na degradação de

proteínas que perderam a conformação e que não voltaram a sua conformação funcional, mesmo

com a assitencia ou não das chaperonas, evitando oxidação celular.

• FATORES PARA COMPONENTES NEURONAIS: a via tem funções importantes para degradação de

proteínas que perderam a sua conformação e/ou formação de agregados (fibras) no sistama nervoso

central. Principalmente de pessoas cometidas por doenças neurodegenarativas como Alzheimer,

Parkinson, Machado-Joseph, Síndrome de Rett, Doença de Huntington, entre outras.

 

Funções Biológicas específicas : Via Ubiquitina-proteassoma

Funções Biológicas específicas : Via Ubiquitina-proteassoma

 • APARATO IMUNITÁRIO: ubiquitinação de proteínas como resposta imune-primária.

• REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA DE HISTONAS H2A: mono-ubiquitinação de regiões

transcritas sendo desviadas do endereçamento para proteólise, sugere que a ubiquitina pode

influenciar na expressão gênica.

 

• MANUTENÇÃO DA ESTRUTURA DA CROMATINA: histonas H2A que são mono-ubiquitiniladas, e

não proteolisadas, sugerindo que a ubiquitina pode ter influência na conformação da cromatina.

 

• ATUAÇÃO EM IMUNOFILINAS: ubiquitina atua em ligações com FK506 e rapamicinas

promovendo uma ação inibitória da fosfatase calcineurina (proteína que se liga ao cálcio e a

calmodulina do SNC). Recentemente, mostrou-se que a calcineurina desfosforila várias

fosfoproteínas, incluindo histonas, cadeia leve da miosina e a subunidade reguladora da proteína

quinase dependente de cAMP.

 

 

•IMUNOMODULADORA – alguns estudos noticiaram que fragmentos de ubiquitina podem trabalhar do lado

de fora das célula, especialmente os resíduos 51-59, como biopolímeros, podem diminuir uma resposta

imune humoral e celular. Alguns análogos da ubiquitina podem ser comparáveis a ciclosporina A ou

FK506, usados como drogas imunosuppressoras para pessoas transplantadas.

•BIOGÊNESE DE RIBOSSOMOS – ubiquitina é expressada frequentemente em células como copia única

fusionadas a algumas proteínas rbossomais, como L40 ou S27A. Após a tradução as proteínas fusionadas

são clivadas da ubiquitina.

• REPARO DE DNA – genes implicados nas respostas ao estresse genotóxico relacionado ao sistema do

retículo endoplasmático (ERAD) têm funções ligadas a via ubiquitina-proteassoma e com UPR (unfolded

protein response). Vlachostergios PJ, Patrikidou A, Daliani DD, Papandreou CN. 2009. The Ubiquitin-Proteasome

System in cancer, a major player in DNA Repair. Part 1: Post-translational regulation. J Cell Mol Med.

Funções Biológicas específicas : Via Ubiquitina-proteassoma

Via Ubiquitina-proteassomaFunção Biológica GERAL

 • Ubiquitinação de proteínas e endereçamento para degradação no

proteassoma.

30% das proteínas recém-sintetizadas de uma

célula sofrem regulação proteolítica pela via da

ubiquitina-proteassoma, por serem reprovadas

pelo rigoroso controle de qualidade intracelular.

Essa via é “balanceada” pela presença de

chaperonas do citoplasma e do núcleo, pois

muitas proteínas precisam do unfolding/folding

protéico para exercer as suas funções dentro da

célula, antes que sejam marcadas e

endereçadas a degradação.

Cam Patterson (2006). Search and destroy:

the role of protein quality control in maintaining

cardiac function. Editorial. JMCC (40).

A molécula da Ubiquitina

76 aminoácidos de 85 kDa

Conservada nos eucariotos (difere no máximo em 4 aa).

Presente no citosol, núcleo e demais compartimentos.

Grande tolerância a mudanças de pH e temperatura.

Podem se ligar formando cadeias

poliubiquitinas (ligação ocorre entre os

resíduos Gly76 + Lys48, podendo ocorrer mais

de uma vez formando di-tri-tetraubiquitinas.

(Kim JH et al, 2003).

É sintetizada diretamente pelos ribossomos.

Enzimas – Ubiquitinação Quatro enzimas são necessárias para a ubiquitinação:

E1 - enzima ativadora da ubiquitina

E2 - enzima conjugadora da ubiquitina

E3 - ubiquitina ligase (mais específica/substrato)

E4/E3 - coopera com a E3 para extender a cadeia de poliubiquitina (mais rara).

 

Enzimas - Ubiquitinação

 E1 – enzima ATIVADORA da ubiquitina

• O enzima E1 é codificada por um único Gene.

Sua deleção provoca inviabilidade celular, embora em mamíferos sejam conhecidas duas

isoformas, E1a e E1b, que resultam da iniciação da tradução em dois locais diferentes.

• O primeiro passo de ubiquitinação envolve a formação de um adenilato de ubiquitina

intermediário (concomitante hidrólise de ATP) e a transferência da ubiquitina ativada para o

grupo tiol da cisteína do centro ativo do enzima E1 (com a libertação de AMP).

• Cada enzima E1 pode no máximo transportar duas moléculas de ubiquitina, uma como tiol-

éster e outra como adenilato.

• A ubiquitina ativada é transferida para a cisteína do centro ativo de E2. 

Enzimas - Ubiquitinação E2 – enzima CONJUGADORA da ubiquitina

• Ao contrário de E1, cada célula contém muitas enzimas E2. Em Saccharomyces são 11 capazes

de transportar ubiquitina, enquanto que em mamífero são conhecidas mais de 30.

• Possuem um domínio muito conservado (UBC – ubiquitin conjugation) com cerca de 150

resíduos de aminoácidos contendo uma cisteína que é o centro aceptor da ubiquitina

ativada por E1.

• As diferenças situam-se nas regiões dos terminais N e C, podendo alguns casos existirem

inserções no domínio UBC.

• Estas sequências estão envolvidas na interação com os enzimas E3. 

Enzimas - Ubiquitinação

 E3 – ligases de ubiquitina

• Enquanto que os enzimas E2 têm grande semelhança nas suas sequências e estruturas, os enzimas E3

são pouco semelhantes entre si, em parte porque estes são responsáveis pelo reconhecimento de sinais

de destruição nas proteínas/substrato.

• Existem duas classes distintas de E3.

• A primeira classe é caracterizada por ter um domínio designado HECT (homologous to the E6-AP

protein C-terminus). A proteína E6-AP foi a primeira ligase identificada desta classe e foi descoberta por

participar na degradação da proteína supressora de tumores P53 ao interagir com a proteína E6 do

papilomavírus humano. O domínio HECT é constituído por 80 resíduos de aminoácidos e inclui a

cisteína do centro ativo que forma uma ligação tiol com a ubiquitina.

• A segunda classe de E3 é definida pela existência de um domínio RING finger, assim designado porque

o gene que codifica a primeira proteína descrita contendo este domínio tem o nome de "really

interesting gene 1". O domínio RING finger possui a capacidade de quelar dois Íons de zinco, através

dos seus 8 locais de coordenação constituídos por histidinas e cisteínas, e medeia interações com as

proteínas E2.

 E3 – ligases de ubiquitina

• As proteínas E3 pertencentes a última classe facilitam a transferência direta de ubiquitina de enzimas E2

para os substratos sem o envolvimento de um intermediário tiol-éster E3-Ub, como acontece com as E3

do tipo HECT. Encontram-se nesta situação UBL ligases envolvidas no ciclo celular como os complexos

APC (anaphase promoting complex), uma E3 constituída por várias subunidades que permite a

progressão do ciclo de divisão celular em vários pontos) e SCF-RING (E3 constituída por Skp1/Skp2,

Culina, uma subunidade variável com um domínio designado por proteínas F-box ou SOCS). Acumulando

evidencias que indicam a adicional modulação de fatores da proteólise sobre os substratos poli ou

monoubiquiotinados. Pines J & Lindon C. 2005. Proteolysis: anytime, any place anywhere? (Perspective).

Nature Cell Biol.: 8(7).

Enzimas - Ubiquitinação

Enzimas Ubiquitinação Proteolítica e Não Proteolítica

 Diferentes vias /funções UPS

a) Proteassoma dependente da

degradação de proteínas para

síntese de “novo”;

b) Mono ou oligoubiquitinação

(dependente de enzimas

regulatórias da via) para

endereçamento ao endossomo ou

lisossomo.

c) Monoubiquitinação endereçando a

proteína do citosol para o interior

do núcleo. Essa via é dependente

de chaperonas nucleares HSP60

que mantém o folding protéico

após a sua entrada.

d) Modificação simples feita pela

enzima UBL (E3) na proteína,

como a SUMO, pode endereçar

tanto para proteínas do poro de

membrana (NPC) como para o

interior do núcleo.

e) Poliubiqutinação de proteínas,

endereçando proteínas para o

núcleo, como a Proteína Y, que

pode regular fatores

transcricionais, direta ou

indiretamente.

Proteassoma: o coadjuvante da via UPS

A degradação de proteínas

• As proteínas multi-ubiquitiniladas são degradadas pelo proteassoma 26S.

• É uma protease multimérica dependente de ATP com 2000 kDa, constituída por dois

complexos regulatórios 19S (α) e por um complexos catalítico de 700 kDa, designado

por proteassoma 20S (β). Este ultimo pode apresentar diferentes composições e

rearranjos proteolíticas, conforme a espécie. Está presente desde arqueobactérias

até os mamíferos.

Função de ligação e reconhecimento da Ubiquitina = 19S• O proteassoma 19S faz a parte de reconhecimento de proteínas somente

ubiquitinadas.

• Desenrrolameno protéico.

• Translocação para o interior da câmara catalítica 20S.

Função catalíticas do proteassoma = 20S• O proteassoma 20S faz a parte de reconhecimento de proteínas somente

ubiquitinadas.

• Está disposto em forma de cilindro complexo, com 2 tipos de subunidades α e

β formando um heptâmero com centro catalítico internalizado com 3 funções

catalíticas diferentes:

1. ATIVIDADE PÓS-ACÍDICA (clivagem de ligação peptídica após resíduo

ácido);

2. ATIVIDADE TRÍPTICA (clivagem após um resíduo básico);

3. ATIVIDADE QUIMOTRÍPTICA (clivagem após resíduo hidrofóbico).

Especificidade do Proteassoma

Especificidade do Proteassoma

Alfred L. Goldberg. On Prions, Proteasomes, and Mad Cows.N Engl J Med. 2007 Sep 13; 357(11).

O balanço delicado do Proteassoma

Controle de Qualidade de Proteínas

Controle de Qualidade de Proteínas

Controle de Qualidade de Proteínas

Caracterização Estrutura

Caracterização Estrutura

Animando a Via Ubiquitina-proteassoma

Huda Y Zoghbi. Howard Hugues Medical Institute (HHMI).Grupo de Estudos de Doenças Neurodegenerativas, Maryland/EUA.HHMI Internacional Research Scholars in Infectious Diseases and Parasitology 2005,Lisbon-Portugal.