Seminários em Fitopatologia II - Aluno Adriano Martins Barbosa

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

SECRETARIA DE EDUCAÇÃO PROFISSIONAL E TECNOLÓGICA

INSTITUTO FEDERAL GOIANO CAMPUS URUTAÍ

Curso Superior de Bacharelado em Agronomia

Acadêmico: Adriano Martins Barbosa

Professor: Milton Luíz da Paz Lima

Manejo de solos orgânicos visando redução da

colonização interna de plantas de tomate por

Salmonella enterica serovarTyphimurium

GU, G., CEVALLOS-CEVALLOS, J. M., VALLAD, G. E., AND VAN BRUGGEN, A. H.C. Organically managed soils reduceinternal colonization of tomato plants by Salmonella enterica serovar Typhimurium. Phytopathology 103:381-388.2013.

INTRODUÇÃO

• Frutas e legumes frescos cada vez mais reconhecidos como

veículos para a transmissão de patógenos entéricos humano

(salmonelose);

• Contaminação desde campos de produção até durante o

processamento;

• Salmonella enterica pode contaminar brotos, folhas, frutos

e sementes de uma gama de espécies de plantas;

• Produção vegetal orgânica tem sido sugerido com maior

risco de contaminação com patógenos entéricos do que em

produção convencional;

• Uso de esterco compostado ou resíduos de jardim para manter a

fertilidade do solo: possível via de contaminação.

• Mudanças na qualidade do solo afetam a fisiologia vegetal e,

possivelmente, a resistência à colonização por microrganismos;

• Plantas podem explorar consórcios microbianos do solo para se

protegerem contra infeccções;

• Indicações a respeito da correlação negativa entre populações de

enteropatogenos e diversidade microbiana em adubo, solo e

plantas.

INTRODUÇÃO

OBJETIVO

O objetivo deste trabalho foi investigar a colonizaçãointerna e transmissão por sementes de S. enterica ser.Typhimurium em plantas de tomate, e a avaliação do efeitodo tipo de manejo do solo em comunidades bacterianasendofíticas, persistência interna e translocação deSalmonella spp. nas plantas.

MATERIAL E MÉTODOS

Cepas bacterianas e preparação da planta

• Culturas bacterianas armazenadas em meio de Luria-Bertani (LB)

contendo 25% de glicerol a -80 °C;

• Sementes de tomate (Solanum lycopersicum 'Florida Lanai'),

desinfectadas, semeadas em mistura de envasamento;

• Mudas transplantadas em vasos, e água aplicada em um intervalo de 2

dias;

• Fertilização semanal com 8 g de Kow® para solo orgânico e 150 ml

de solução Hoagland® para o solo convencional;

• Temperatura oscilou entre 23 e 33 °C, com temperatura média de 28

°C.

Configuração experimental

• Experimento principal de duas fases, realizado duas vezes (1º em 2009

e experimento 2º em 2010);

• 126 plantas de tomate divididas em sete blocos e em cada bloco, nove

plantas cultivadas em solo e os outros nove em solo orgânico;

• Seis das nove plantas inoculadas aleatoriamente com S. enterica ser.

Typhimurium MAE110 ou MAE119, e as outras três plantas por bloco

mergulhadas em SDW;

• Cada ano, 84 plantas de tomate cultivadas em solo convencional ou

orgânicos (42 plantas cada), inoculados duas a quatro vezes, antes de

frutificação com cepas de S. entérica ser. Typhimurium, e 42 plantas

cultivadas no mesmos solos foram tratados com SDW como controle.

MATERIAL E MÉTODOS

• Segunda fase: extraiu-se sementes a partir de frutos contaminados e

não contaminados na primeira geração e semeadas em substrato

(experimento 1, com 135 sementes) ou convencional do solo

(Experimento 2, com 130 sementes);

• Detectar a possível contaminação da segunda geração plantas;

• Experimento adicional realizado para confirmar o efeito do manejo do

solo na sobrevivência interna de Salmonella spp. em folhas de tomate.

• 16 mudas de tomate plantadas aleatoriamente em quatro vasos com

solos convencional e orgânico, inoculados com Salmonella MAE110 (4

plantas por tratamento) e 4 vasos com SDW como controle.

MATERIAIS E MÉTODOS

Coleta do solo e análise

• Experimentos 1, 2 e 3: solos convencionais e orgânicos coletados a

partir de locais de manejo intensivo em diversas culturas;

• Vegetais cultivados organicamente por 5 anos e esterco de galinha

compostado foi aplicado 4 meses antes colheita;

• Nas fazendas convencionais, as culturas foram cultivadas com

fertilizantes, fungicidas, inseticidas e aplicação do herbicida;

• Duas sub-amostras (500 g) das amostras de solo coletadas foram

enviadas para análises laboratoriais.


Inoculação foliar das plantas de tomateiro com S. enterica

Typhimurium

• Imersão três folhas em cada um dos dois ramos, por planta, em 15 ml de

suspensão de Salmonella sp. (109 UFC/ml) com 0,025% de Silwet L-77

por 30 s.

• As plantas de controle inoculados com a mesma quantidade de SDW

com 0,025% de Silwet L-77;

• Plantas de tomate inoculadas nas semanas 5 e 10 no experimento 1 e nas

semanas 5, 8, 9 e 10 no experimento 2;

• Experimento 3: três folhas em cada um dos quatro ramos, por planta,

mergulhados em suspensão de Salmonella sp. (109 UFC/ml) com 0,025%

de Silwet L-77 durante 30 s, oito semanas após a semeadura da semente.


Amostragem de folhas e procedimento de teste

• Folhas inoculadas e não inoculadas amostradas 14 dias após a

inoculação no experimento 1;

• Experimento 2: 3 horas e 1, 3, 5, 7, 14, 21 e 30 dias após as

inoculações;

• Experimento 3: 1, 3, 5, 7, 14, 21 e 30 dias após a inoculação das quatro

plantas de cada tratamento. Mesmos número de folhas para as plantas do

controle;

• Retirados discos de 12 mm com um furador de cortiça estéril a partir

do meio de cada folha inoculada;

• Números de colônias de S. enterica ser. Typhimurium em cada placa de

Petri foi determinada pela contagem de UFC verde fluorescente usando

uma lâmpada UV.


Observações microscópicas

•Amostras observadas em microscópio de varredura a laser;

•Ao todo, 40 cortes de tecido foram examinados por amostra:

total 40 × 3 × 8 = 960 seções para folhas inoculadas e 960 seções

para folhas não inoculadas;

• Trinta seções por amostra de tronco foram examinados: total

30 × 8 = 240 seções;

• Cortes de tecido foram analisados com um comprimento de

onda de excitação de 488 nm e um filtro de emissão BA505-525

(GFP).


Extração de DNA, reação em cadeia da polimerase e

desnaturação eletroforese em gel gradiente

• DNA extraído a partir de 0,1 g de tecidos desinfectados das plantas,

usando um kit de isolamento de DNA PowerPlant®;

• Amostras submetidas a 16S rDNA polimerase reação em cadeia

(PCR) utilizando primers 799F e1492R;

• Produtos de PCR foram submetidos a eletroforese num gel de

agarose a 1%;

• Após a eletroforese, os géis foram corados durante 30 min com

SYBR GOLD® gel de ácido nucleico;

• As bandas foram visualizadas por Molecular Imager Gel Doc XR

System®.


Amostragem de frutas e procedimento de teste

• Frutos de tomate foram colhidos, desinfestados, cortado verticalmente

em metades e colocado por 1 min em LB agar contendo canamicina a

50 μg/ml.

• Quantidade de colônias foi determinada por contagem de UFC verde

fluorescente utilizando uma lâmpada de UV.

Extração das sementes e detecção

• Retirada da sementes por escavação da polpa do fruto de tomate.

• Sementes desinfestadas e secas, moídas e incubadas em caldo LB

(canamicina 50 μg/mL) a 37 °C durante 24 h.

• Salmonella sp. foi confirmada sob a luz UV.


Medição do peso seco das plantas

• Após a colheita, todos os frutos de tomate da primeira fase do

experimento 2, foram mensurados os pesos da parte aérea seca.

Segunda geração de amostras de tecido de plantas e a

detecção

• Experimento 1: 61 sementes de frutos contaminados e 74 sementes de

sem inoculação foram plantadas em substrato; Experimento 2: 100

sementes contaminadas e 30 sementes sem inoculação foram plantadas m

solo convencional;

• Mudas foram transplantadas novamente em substrato e cresceu para a

maturidade;

• Fruitos foram verificados se havia presença de Salmonella spp. como

descrito nos testes anteriores.


Análises estatísticas

• Taxa estimada dos parâmetros foram submetidos à análise de variância

(ANOVA) incluindo o termo de interação;

• Como não houve interação significativa, o efeitos do tipo de manejo

do solo na sobrevivência de Salmonella spp. nas folhas inoculadas

foram avaliados por meio de análise multivariada de variância

(MANOVA);

• ANOVA, MANOVA e testes t foram realizados utilizando programa

de comparação de médias SAS;

• Os testes χ2 e Q' foram realizados em Microsoft Excel.


RESULTADOS E DISCUSSÃO

Testes de interação

• Não houve efeito significativo de interação entre morfotipo

Salmonella e manejo do solo na diminuição das taxas de Salmonella

Typhimurium em folhas inoculadas;

• Não houve efeito significativo da interação entre morfotipo

Salmonella e tipo de manejo do solo sobre o número de plantas com

e sem inoculação das folhas, número de frutos e de plantas com

frutas com presença da bacteria;

• Os valores de P para os testes do Q‘ que determinam essas

interações foram de 0,72, 0,67, e 0,64, respectivamente.

Tabela 1. Salmonella enterica ser. Typhimurium (dados da combinação de cepas

MAE110 e MAE119) em contaminação em plantas de tomate nos dois experimentos

principais.

w - Plantas com folhas adjacentes não inoculadas contaminadas internamente para folíolos inoculados, conforme determinado após

enriquecimento de Salmonella spp. em suspensão de folhas. Contaminação dos frutos foi alta o suficiente para que o enriquecimento

não fosse necessário.

x - Nove de nove frutas em uma planta.

y - Número igual de solos orgânicos e convencionais.

z - Cinco de seis frutas em uma planta e duas de sete frutas na outra planta.

Experimento, tratamento

Número de plantas

internamente contaminadas/

total de plantas (w)

Número de plantas com fruta

contaminada/ total de plantas

Número de frutas

contaminadas/ total de plantas

1

Plantas inoculadas em solo

convencional... 1/42 9/270(x)


orgânico... 0/42 0/270

Controle - Plantas controle em

solo orgânico ou convencional

(y)

... 0/42 0/270

2


convencional5/42 2/42 7/250(z)


orgânico3/42 0/42 0/250

Controle - Plantas controle em

solo orgânico ou convencional0/42 0/42 0/250

Fig. 1. Tendências de sobrevivência de Salmonella enterica Typhimurium em folhas de tomate inoculadas. Silwet L-77 foi usado

0,025% de suspensão de inoculo, um tanto mais baixa que a concentração utilizada pelos agricultores em aplicações de pesticidas

(≈0.10%). A. Diminuição da S. enterica Typhimurium na primeira fase do experimento 2 (dados de cepas MAE MAE 110 e 119 foram

aglomeradas); B. Diminuição da S. enterica Typhimurium tensão MAE 110 no experimento 3. Porg e Pcon - curva de regressão prevista

com base no modelo de decaimento exponencial com assíntota para a sobrevivência de Salmonella spp. em plantas de tomate cultivadas

em solos orgânicos e convencionais, respectivamente.

Sobrevivência de S. enterica ser. Typhimurium em plantas de

tomate

Tabela 2 - Estimativas dos parâmetros para o declínio exponencial da concentração de

Salmonella enterica ser. Typhimurium em folhas de tomate depois de um período de 30

dias(y).

y - A = assíntota e R = taxa de declínio. Letras indicam diferenças significativas (P = 0,05) entre tratamentos dentro de cada uma dos

experimentos.

Z - número do experimento e tipo de manejo do solo.

Experimento, solo (z) A (log [CFU/g]) R (dia–1)

2

Solo convencional 3.826 +- 0.129 a 0.039 +- 0.023 a

Solo orgânico 2.071 +- 1.715 b 0.168 +- 0.059 b

3

Solo convencional 3.877 +- 0.229 a 0.044 +- 0.043 a

Solo orgânico 0.027 +- 1.012 b 0.219 +- 0.059 b

Tabela 3 - Impacto do manejo convencional e orgânico de fazenda na taxa de declínio de Salmonella

enterica Typhimurium em folhas de tomate, as propriedades do solo e diversidade e riqueza de

comunidades bacterianas endofíticas em experimentos 2 e 3, e os coeficientes de correlação entre as

taxas de declínio de Salmonella spp. e as propriedades solo e comunidade bacteriana (v).

v - Propriedades do solo: NH3, nitrogênio; NOx, os óxidos de nitrogênio; P, fósforo; K, potássio; Ca, cálcio; Mg, magnésio; e OM, a

matéria orgânica do solo (%). Coeficiente significativo de correlação (α <0,05) entre os níveis de nutrientes, teor de matéria orgânica ou

diversidade bacteriana ea taxa de declínio de Salmonella spp. são mostradas em negrito.

w - C1 a C3, solos provenientes de diferentes fazendas convencionais; O1 a O3, solos coletados em diferentes fazendas orgânicas.

x - Taxa de declínio de Salmonella spp. (log [UFC / g] / dia) foi medida através do ajuste dos dados observados (como na Figura 1) a um

modelo de decaimento exponencial com assíntota. y - Diversidade da comunidade bacteriana endofítica antes da inoculação.

z - Riqueza da comunidade bacteriana endofítica antes da inoculação.

Propriedades da amostra de solo e correlação com

persistência interna de S. enterica ser. Typhimurium em folhas

de tomate

Tabela 3 - Impacto do manejo convencional e orgânico de fazenda na taxa de declínio de Salmonella

enterica ser. Typhimurium em folhas de tomate, as propriedades do solo e diversidade e riqueza de

comunidades bacterianas endofíticas em experimentos 2 e 3, e os coeficientes de correlação entre as

taxas de declínio de Salmonella spp. e as propriedades solo e comunidade bacteriana (v).

v - Propriedades do solo: NH3, nitrogênio; NOx, os óxidos de nitrogênio; P, fósforo; K, potássio; Ca, cálcio; Mg, magnésio; e OM, a

matéria orgânica do solo (%). Coeficiente significativo de correlação (α <0,05) entre os níveis de nutrientes, teor de matéria orgânica ou

diversidade bacteriana ea taxa de declínio de Salmonella spp. são mostradas em negrito.

w - C1 a C3, solos provenientes de diferentes fazendas convencionais; O1 a O3, solos coletados em diferentes fazendas orgânicas.

x - Taxa de declínio de Salmonella spp. (log [UFC / g] / dia) foi medida através do ajuste dos dados observados (como na Figura 1) a um

modelo de decaimento exponencial com assíntota. y - Diversidade da comunidade bacteriana endofítica antes da inoculação.

z - Riqueza da comunidade bacteriana endofítica antes da inoculação.

Comunidades bacterianas endofíticas em plantas de tomate

cultivadas em solos convencionais e orgânicas

Figura 2. Fruto de tomate e sementes contaminadas com Salmonella enterica Typhimurium. A, Fruto contaminado cortado; B,

Colónias de Salmonella recuperado a partit do fruto mostrado em A em placas de Luria-Bertani com canamicina; C e D,

Contaminação internadas sementes de tomate quando germinadas em ágar rico em carbono com ≈1,000 ppm C (55).

Contaminação do fruto e da semente de plantas de tomate

cultivadas em solo convencional

CONCLUSÕES

• S. enterica Typhimurium pode atingir não apenas frutos de

tomate, mas também sementes via inoculação da folha, embora

a possibilidade seja baixa;

•A colonização interna de Salmonella spp. em folhas de

tomate foi afetada pelo tipo de manejo do solo;

• Células de Salmonella foram encontradas nas células do

floema no caule de plantas cultivadas convencionalmente mas

não naquelas cultivadas organicamente;

• Ca é conhecido por resultar em paredes celulares mais

resistentes e melhor função da membrana;

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