ENZIMAS BRANCO

FCAV/UNESPJaboticabalDezembro de 1991

ENZIMAS

Enzimas

●Conceito■São biomoléculas de natureza

predomi- nantemente protéica, cuja função é cata- lisar reações termodinamicamente pos- síveis

●Exemplos■pepsina - hidrólise de proteínas no

estôma- go■tripsina - hidrólise de proteínas no

intesti- no delgado■Papaína - hidrólise de proteínas no

látex do mamoeiro

CONCEITO E EXEMPLOS

Enzimas

PROPRIEDADES GERAIS

●Catalizam reações que, em condições normais, seriam muito lentas

●Não alteram o ponto de equilíbrio●Não são consumidas na reação●Qualquer fator que altere sua

estrutura pode de- terminar perda da atividade (calor, pH, metais pesados)

●O peso molecular das enzimas varia de 12.000 a mais de 1.000.000

●Aumentam a velocidade de reação em 109 1012 vezes

Enzimas

CONSTITUIÇÃO●Apoenzima

■Porção protéica da molécula enzimática

●Grupo prostético■Porção não protéica da enzima

⋆Componente orgânico - coenzima⋆Componente inorgânico⋆Metal - Cu, Fe, Mn, Zn

● Sítio ativo■Porção da enzima onde se liga o

substrato●Sítio alostérico

■Porção das enzimas reguladoras onde se liga o efetor (agente regulador)

Enzimas

CONSTITUIÇÃO

apoenzima

sítio ativo

sítio alostérico

grupo prostético

holoenzima

CLASSIFICAÇÃO●Pelo tipo de reação que catalisa

■Amilase - hidrólise do amido■Protease - hidrólise de proteína■Celulase - hidrólise da celulose■Lipase - hidrólise de lipídeo●Enzyme Comission (EC)

■Classificou as enzimas em classes e subclasses

■Classes (6): oxidorredutase, transferase, hidro-lase, liase, isomerase, ligase

Enzimas

CLASSIFICAÇÃO - EC●Classe 1 - oxidorredutases

■São enzimas que catalisam reações de oxi- redução

■Nesta classe estão as desidrogenases, oxi- dases, oxigenases, peroxidases

■Sub-classes⋆1.1. atuam sobre =CH-OH⋆1.2. atuam sobre =C=O⋆1.3. atuam sobre =C-OH⋆1.4. atuam sobre =CH-NH2

⋆1.5. atuam sobre =CH-NH⋆1.6. atuam sobre NAD, NADP

Fermentação Lática

NADH+H+CH3

IC=O IC00Hac. pirúvico

desidrogenase lática

NAD+ CH3

I HO-C-H I C00Hac. L-lático

Glicólise

Enzimas

CLASSIFICAÇÃO - EC●Classe 2 - transferases

■Atuam na transferência de grupos funcionais

■Nesta classe estão as transaminases, quina- ses, transaldolases, transcetilases.

■Sub-classes⋆2.1. grupos de 1C⋆2.2. grupos aldeído ou cetona⋆2.3. grupos acila⋆2.4. grupos glicosila⋆2.5. grupos alquila or arila mas não

metila⋆2.6. grupos nitrogênio⋆2.7. grupos fosfato⋆2.8. grupos contendo S

Enzimas

H-C=OH-C-OH

H-C-OH

HO-C-H

H-C-OH

CH OH2

D(+)glicose

ATP

hexoquinase

ADPH-C=OH-C-OH

H-C-OH

HO-C-H

H-C-OH

CH OP2

D(+)glicose-6P

TRANSFERASE

Enzimas

CLASSIFICAÇÃO - EC

●Classe 3 - hidrolases■Atuam em reações de hidrólise■Nesta classe estão as lipases,

fosfatases, proteases, amilases■Sub-classes

⋆3.1. ligação éster⋆3.2. ligção glicosídica⋆3.3. ligação peptídica⋆3.4. ligação C-N⋆3.5. anidridos ácidos

O

CH OH2

O

CH OH2

OO

CH OH2

O

CH OH2

OOO...

celulose celulase

O

CH OH2

O

CH OH2

On celobiose

celobiase

O

CH OH2

n a -D(+)glicose

Enzimas

CLASSIFICAÇÃO - EC

●Classe 4 - liases■Atuam em reações de adição-remoção

reversí- vel a duplas ligações■Nesta classe estão aldolase,

fumarase, carbo- xilase■Não incluem a adiçãoremoção de

hidrogênio■Sub-classes

⋆4.1. adição a =C=C=⋆4.2. adição a C=O⋆4.3. adição a =C=N-

Enzimas

EXEMPLO DE LIASE

H-C-COOHII

HOOC-CHÁcido fumárico

+ H-OH

COOH IHO-CH I CH2 I COOH

Ácido L-málico

Fumarase

Enzimas

CLASSIFCAÇÃO - EC

●Classe 5 - isomerases

■Catalisam reações de isomerização■Nesta classe estão racemases,

epimerases, cis-trans isomerases, mutases

■Sub-classes⋆5.1. racemases

Enzimas

EXEMPLO DE ISOMERASE

H-C=O

H-C-OH

H-C-OH

HO-C-H

H-C-OH

CH OP2

D(+)glicose-6P

CH2OH

C=O

H-C-OH

HO-C-H

H-C-OH

CH OP2

D(-)frutose-6P

fosfoglicoisomerase

Enzimas

CLASSIFICAÇÃO●Classe 6 - ligases

■Catalisam reações com formação de ligção às custas da hidrólise do ATP

■Sub-classes⋆6.1. ligação C-O⋆6.2. ligação C-S⋆6.3. ligação C-N⋆6.4. ligação C-C

X + Y + ATP

X-Y + AMP + P-P

EXEMPLO DE LIGASE

FIM DA AULA 512/04/2011

Pintura com a boca

Simony da Rosa Garcia

Pintura com o péMoacir Ferraz

Enzimas

NOMENCLATURA

●Antes do EC

■Nomes sem qualquer vínculo⋆Exemplos: pepsina, tripsina

■Nomes em função da origem da enzima⋆Exemplos: papaína, bromelina

■Terminação ase adicionada ao nome do subs- trato em que a enzima atua

⋆Exemplos: amilase, celulase, celobiase

Enzimas

NOMENCLATURA

●De acordo com o EC

■nome indicativo do tipo de reação■até 4 algarismos, que indicam

⋆1o - classe da enzima⋆2o - sub-classe da enzima⋆3o grupos químicos que participam

da reação⋆4o nome recomendado para a

enzima

Enzimas

NOMENCLATURA - ECEXEMPLO

ATP + creatina

ADP + creatina-fosfato

1. Nome: ATP-creatina-transferase2. números: 2.7.3.2

3. Significado dos números2 - classe transferase7 - sub-classe transferência de P3 - sub-classe que tem grupo nitrogena- do como receptor

2 - nome recomendado: creatina quinase

Http://www.chem.qmui.uk/iubmb/enzyme

MAIS DETALHES NA PÁGINA

Enzimas

O COMPLEXO ENZIMA-SUBSTRATO

●O substrato liga-se ao sítio ativo da enzima, formando um complexo E-S

●O complexo E-S é instável, podendo desli- gar-se ou transformar o substrato S em um produto P, com regeneração da enzima

●A enzima livre formará outro complexo E-S, dando contiunidade à reação.

E + S E-S E + P

Enzimas

O COMPLEXO ENZIMA-SUBSTRATO

E

+

S E-S

E

+

P

Enzimas

O COMPLEXO ENZIMA-SUBSTRATO

Enzima (E)+

Substrato (S)

Complexo E-S

+

Enzimas

MODO DE AÇÃO DAS ENZIMAS

●Porque as enzimas aceleram a velocidade das reações?

●As enzimas aceleram a velocidade das rea- ções porque abaixam a energia necessária para ativação do substrato, atingindo com maior facilidade, a barreira energética da transformação.

Enzimas

MODO DE AÇÃO

/ / / / / / / / / / /

/ / / / / / / / / / // / / / / / / / / / /

/ / / / / / / / / / // / / / / / / / / / // / / / / / / / / / /

W.J.Melo

MODO DE AÇÃO DAS ENZIMAS

XEx

YEY

EAse

SEM

EN

ZIM

AEAce

CO

M E

NZ

IMA

AS ENZIMAS DIMINUEM A ENERGIA DE ATIVAÇÃO

W.J.Melo

W.J.Melo

Cinética Enzimática

EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO●Realiza-se experimento com as

seguintes características:■A varios tubos de ensaio, colocam-se a

mesma concentração da enzima em estudo.

■Adiciona-se, a cada tubo, uma concentração di- ferente do substrato, partindo-se de um tubo em que não se coloca sub trato (testemunha ou branco).

■Incuba-se por um certo tempo em um pH e uma temperatura ideal.

■Mede-se a quantidade de produto formado ou a de substrato que sobrou.

■Com os resultados obtidos, elabora-se um grá- fico em sistema cartesiano.

CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

T1 T2 T3 T4 T5

EnzimaTampão

adicionar substrato

H2O S1

S2

S3 S4

Substrato

incubarTemperatura

Tempo tMedir

Substratoou

Produto

GRÁFICO

CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO

SUBSTRATOVmax

Vmax 2

KMW.J.Melo

II I I

-

-

-

concentração do substrato

Velo

cid

ad

e

20

0

40

60

0 32 64 128

96

0

3

6

9

12

15

18

0 1 2 3 4 5

Atividade

Uréia (g L -1)

ATIVIDADE DA UREASE NO SOLOEFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO

SUBSTRATO

Longo & Melo (2005)

Cinética Enzimática

CINÉTICA ENZIMÁTICA - CONCEITOS

●Equação de Michaelis-Mentem■Equação que descreve a velocidade

de uma reação en-zimatica em função da concentraçao do substrato.

●Velocidade máxima■Qantidade máxima de produto

formado por unidade de tempo e por unidade de enzima nas mesmas con-dições experimentais.

●Constante de Michaelis (KM)

■Concentração de substrato que determina que a veloci-dade de uma ração enzimática ocorra com a metade da velocidade máxima.

Cinética Enzimática

CINÉTICA ENZIMÁTICA

EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO■Equação de Michaelis-Menten

⋆A velocidade de reação das enzimas não alos-téricas segue a equação de Michaelis-Menten

⋆A velocidade da reação em um ponto qualquer é dada pela equação

V=Vmax S

KM + S

Cinética Enzimática

A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN

●V= velocidade da reação●Vmax= velocidade máxima da reação●S= concentração do substrato●KM= constante de Michael

■Indica a concentração do substrato que deter-mina que a velocidade da reção seja a metade da velocidade máxima.

■Reflete a afinidade entre a enzima e o substrato

⋆Quanto menor KM, maior afinidade.

V=Vmax*[S]KM + [S]

Cinética Enzimática

A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN

INTERPRETAÇÃO●Para baixas concentrações de

substrato, a velocidade da reação aumenta linearmente com o aumento da concentra-ção do substrato.■Esta é uma reação de primeira

ordem.●Para concentrações intermediárias

do substrato o aumento da velocidade não é linear com o aumento da concentra-ção do substrato.■Esta é uma reação de segunda

ordem.●Para altas concentrações do

substrato, a velocidade da reação não se altera com o aumento da concentração do substrato.

⋆Esta é uma reação de ordem zero⋆O sítio ativo está saturado pelo substrato

Cinética Enzimática

A EQUAÇÃO DE LINEWEAVER-BURK

●Lineweaver e Burk trabalharam com os inversos da velocidade e da concentração do substrato.

●Verificaram que, ao plotarem o inverso da concentra-ção do substrato (eixo x) com o inverso da velocida-de (eixo y), obtinha-se uma equação de reta.

Cinética Enzimática

A EQUAÇÃO DE LINEWEAVER-BURKE1 v

1

S

1

Vmax

1Km-

Y=aX + bb= 1/VmaxSe Y=0, X=-1/KM

LINEAWER-BURK

DEDUÇÃO

V=Vmax*[S]KM + [S]

Vmax*[S]

KM + [S]1

V=

Vmax

KM1V

=1

Vmax1

[S]X +

a b1V

=1

[S]a + b

Y= aX + b

b= 1/VmaxSe Y=0, X=-1/KM

Cinética Enzimática

EFEITO DA TEMPERATURA

●Efeitos da temperatura■Aumenta a velocidade da reação.■Causa desnaturação da proteína

enzimática.■A conjugação dos dois efeitos

determina o comporta-mento da velocidade em função da temperatura.

■No caso de enzimas do solo, o efeito é m pouco dife-rente, devido à proteção dos colóides do solo.

Temperatura

Velo

cid

ad

e

-

-

-

II I I I I

CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA TEMPERATURA

Vmax

W.J.Melo

--

------

0

10

20

30

40

II I I II I I

10 20 30 40 50

60

70

80

0Temperatura (oC)

Velo

cid

ad

e

ATIVIDADE DA UREASE NO SOLO

EFEITO DA TEMPERATURA

LVd

LVef

60

oC

Longo & Melo (2005)

Cinética Enzimática

CINÉTICA ENZIMÁTICA

EFEITO DO pH●Desnaturação da proteína

enzimática■Em pH muito baixo ou muito alto,

tende a ocorrer a des-naturação da proteína enzimática, resultando em uma diminuição na atividade catalítica.

●A curva de resposta da velocidade da reação enzimáti-ca tende a assumir a forma de um sino, mas é variável em função do tipo de enzima.

●As enzimas do solo apresentam um comportamento dife-rente, em função da interação com os colóides do solo.

CINÉTICA ENZIMÁTICA

EFEITO DO pH

pH

Velo

cid

ad

e Vmax

--

--

--

-

II I I II

pH

02 -4

6

810

12

14

2,2 3,2 4,2

5,2

6,2 7,2 8,2

Velo

cid

ad

e

LVd

LVef

Longo & Melo (2005)

ATIVIDADE DA UREASE NO SOLO

EFEITO DO pH

Cinética Enzimática

CINÉTICA ENZIMÁTICA

EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA●A velocidade de uma reação

enzimática aumenta com o aumento da concentração da enzima.

●Condição■Não haver falta de substrato■As demais condições são as ideais

para a atividade da enzima

EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA

E

V

Cinética Enzimática

CINÉTICA ENZIMÁTICA

EFEITO DA LUZ●Algumas enzimas, caso da redutase

do nitrato, são sen-síveis à presença da luz.

●Quando isto ocorre, há necessdade de se traba-lhar na ausência da luz.

Enzimas

UNIDADES PARA EXPRESSAR A ATIVIDADE

ENZIMÁTICA●Quantidade do substrato ou da enzima■Pode ser expressa em miligrama,

micrograma, mol, milimol.■A unidade do SI é o mol.●Especificação da enzima

■Pode ser expressa em quantidade do material que contém a enzima (por exemplo g de solo), quantidade de proteí- na, quantidade de enzima, número de moléculas enzimáti-cas.

●Tempo de incubação■Pode ser expresso em horas,

minutos ou segundos.●Deve-se usar unidades do Sistema

Internacional (SI).

W.J.Melo

Enzimas

UNIDADES PARA EXPRESSAR A ATIVIDADE

ENZIMÁTICA●Katal (kat)

■Unidade definida pela EC (Enzyme Comission) em 1961.

■É derivada do SI para expressar a atividade catalítica das enzimas.

■Seu uso é recomendado pela Conferência Geral de Pesos e Medidas (outubro de 1999).

■1 kat equivale à uma atividade que produz a transforma-ção de 1 mol do substrato ou a formação de 1 mol do produto em 1 segundo.

Kat

mol/segundo

Enzimas

FORMAS DE EXPRESSAR A ATIVIDADE

ENZIMÁTICA●Unidade Internacional (IU ou U)

■Definida pela International Union of Biochemistry (1964)

■Atividade que catalisa a transformação de 1 micromol do substrato ou a produção de 1 micromol do produto em 1 minuto sob condições padrões.

■U - micromol/minuto

1 kat= 6x107 U

Enzimas

FORMAS DE EXPRESSAR A ATIVIDADE

ENZIMÁTICA●Atividade específica

■Atividade que representa a massa ou o número de mo-les de substrato transformado ou do produto formado por umidade de enzima ou do material que a contém e por unidade de tempo.

■Exemplo⋆Na hidrólise total do amido▸Atividade= mg de glicose/g de

folha * hora▸Atividade= kat/mg folha▸Atividade= kat/mg de proteína

Enzimas

FORMAS DE EXPRESSAR A ATIVIDADE

ENZIMÁTICA●Atividade molar ou molecular

■É o antigo turnover.■Expressa a quantidade de substrato

transformado ou de produto produzido por molécula de enzima ou por sítio ativo.

Planta de sorgoDeficiência de Mg

ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Enzimas

ATIVAÇÃO E INIBIÇÃO ENZIMÁTICA

●Ativação enzimática■Algumas enzimas precisam sofrer um

proces-so de ativação para se tornarem ativas.

■A enzima antes de ser ativada recebe o nome de zimogênio.

■Exemplo■Todas as proteases do pâncreas são

produzi-das como zimogênio, como forma de proteção.

■Pancreatite - doença que pode ser letal, causa-da pela ativaçao prematura das proteases e lipases do pâncreas.

●Inibição enzimática

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA

Inibição Enzimática

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA

●Há substâncias que, ao se ligarem à molécula enzimática, alteram o efeito catalítico da enzima.

●A ligação pode ser no sítio ativo ou em outra parte da molécula, de forma reversível ou irre-versível. Pode ser, também, uma ligação com o complexo enzima-substrto.

●Muitas delas são usadas como remédio■Exemplo: aspirina■Inibe a reação da primeira etapa da

biossínte-se de prostaglandinas, algumas das quais es-tão envolvidas na geração de dor.

Enzimas

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA

●Porque estudar Inibição Enzimática

■Dar suporte ao conhecimento do mecanismo de reações químicas.

■Descobrir substâncias com potencial para uso far-macêutico.

■Contribuir no estudo das vias metabólicas.

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA -TIPOS

INIBIÇÃOENZIMÁTIC

A

REVERSÍVEL

IRREVERSÍVEL

COMPETITIVAINCOMPETITIVAMISTA

W.J.Melo

Enzimas

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA - TIPOS

●Inibição enzimática reversível

■O inibidor forma um complexo instável com a enzima ou com o complexo ES.

■O efeito do inibidor pode ser revertido

●Inibição enzimática irreversível

■O inibidor forma um complexo estável com a enzima

■O efeito inibidor não pode ser revertido

Enzimas

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA COMPETITIVA

●O inibidor é uma biomolécula muito parecida com o substrato, de modo que pode ocupar o sítio ati-vo da enzima, concorrendo com o substrato.■Exemplos

⋆Metanol e etanol⋆Ácidos málico e malônico

●O complexo E-I não forma produto, mas é rever-sível.

●Quando o complexo E-I se dissocia, o substra-to pode ocupar o sítio ativo da enzima e formar produto. Isto significa que, aumentando a con-centração do substrto, dimiui o efeito do inibidor.

Enzimas

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA COMPETITIVA

H IH-C-OH I Hmetanol

H IH-C-H IH-C-OH I Hetanol

Metanol e etanol competem pelo sítio ativo da desidrogenase

alcoólica no figado

Enzimas

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA COMPETITIVA COOH I H-C-H IHO-C-H I COOH

ácido L-málico

COOH IHO-C-H I COOH

ácido malônico

Ambos concorrem pelo sítio ativo da desidrognase málicaO ácido L-málico é oxidado a ácido oxaloacético.O ácido malônico não sofre alteração.

Enzimas

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA COMPETITIVA

COOH I H-C-H IHO-C-H I COOH

ácido L-málico

desidrogenase málica

NAD+

H H

NADH + H+

COOH I H-C-H I C=O I COOH

ácido oxaloacético

W.J.Melo

Inibição Enzimática

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA COMPETITIVA

●Características

■Substrato e inibidor competem pelo sítio ativo da enzima

■Mantendo-se constante a concentração do inibidor e aumentando-se a concentração do substrato, aumenta-se a velocidade da reação.

■A velocidade máxima da reação pode ser recuperada.

■O valor de KM aumenta.

Inibição Enzimática

+

S S+

P

II

+

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA COMPETITIVA

I

W.J.Melo

Enzimas

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA COMPETITIVA

1

S

1 v Io

1

Vmax

1Km-

I1I2

Vmax não se alteraKM aumenta

Inibição Enzimática

INIBIÇÃO ENIMÁTICA COMPETITIVA

●Aplicação terapêutica■O metanol é tóxico: no fígado a

desidro- genase alcoóica o transforma em formal- deído, que causa dano aos tecidos, in- cluindo cegueira.

■O etanol compete com o metanol e seu produto não é tóxico.

■No caso de envenenamento por metanol usa-se etanol como antídoto.

Enzimas

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA INCOMPETITIVA

●O inibidor liga-se a um local da enzima que não é o sítio ativo.

●O inibidor liga-se ao complexo E-S.●Quando o complexo E-I se desfaz,

não significa que o substrato virá a ocupar o sítio ativo da en-zima.

●O aumento da concentração do substrato, man-tendo-se a concentração do inibidor, poderá au-mentar a velocidade da reação, mas o Vmax não será regenerado.

●Tanto o Vmax como o KM diminuem.

Enzimas

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA INCOMPETITIVA

+ S S

+P

+ I S I

W.J.Melo

Enzimas

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA INCOMPETITIVA

1

S

1 v IoI1

I2

1

Vmax

1Km-

Vmax e KM diminuem

Inibiação Enzimática

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA MISTA

●O inibidor se liga à enzima em um local distinto do sítio ativo.

●O inibidor pode ligar-se tanto à enzima quanto ao complexo E-S.

●Tanto Vmax como KM são afetados (o Vmax dimi-nui e o KM aumenta).

●Há um caso especial, em que a inibição mista recebe a denominação de inibição não compe-titiva.

●Na inibição enzimática não competitiva, o Vmax diminui, mas o KM permanece constante.

Enzimas

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA MISTA1 v

1

S

IoI1I2

1

Vmax

1Km-

Vmax diminuiKM aumenta

1 v

1

S

IoI1

I2

1

Vmax

1Km-

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA NÃO COMPETITIVA

Vmax diminuiKM não se altera

Inibição Enzimática

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA IRREVERSÍVEL

●O inibidor liga-se ao sítio ativo ou a uma outra por-ção da enzima.

●O inibidor forma um complexo estável com a enzi-ma, inativando-a.

●Exemplos■Inibição da quimiotripsina pelo

DIFP (diisopro-pilfluorfosfato).■inibição do grupo sulfidrila pelo

iodo acetato.●Caso especial - inativadores suicidas

■O complexo E-S, ao invés de formar um produto normal, forma um produto altamente reativo, que se liga irreversivelmente à enzima, inativando-a.

Enzimas

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA IRREVERSÍVEL

+E-CH2-OH serin

a

O CH3 II I F-P-O-C-H I I O CH3 I H3C-C-CH3 I H

DIFP

F

H HF +

E-CH2-O

O CH3 II I -P-O-C-H I I O CH3 IH3C-C-CH3 I H

complexo estável