Validação Slides

Análise Instrumental

Capítulo 9 – Desenvolvimento e Validação de Métodos

Quantitativos

Prof. Luiz Antonio Mazzini Fontoura

Prof. Carlos Rodolfo Wolf

Análise Instrumental

Capítulo 9 – Desenvolvimento e Validação de Métodos Quantitativos

9.1 Desenvolvimento do método

9.2 Métodos quantitativos

9.2.1 Normalização de áreas

9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica

9.2.3 Superposição da matriz

9.2.4 Adição-padrão

9.2.5 Padronização interna com calibração por um ponto

9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica

9.3 Validação

9.3.1

Bibliografia:

1. Holler, F. J.; Skoog, D. A.; Crouch, S. R. ; Princípios de Análise Instrumental, 6ª

ed.; Bookman: Porto Alegre, 2009, cap. 26 a 28.

2. Skoog, D. A.; West, D. M; Holler, F. J.; Crouch, S. R. ; Fundamentos de Química

Analítica, Thomson: São Paulo, 2006, cap. 30 a 32.

3. Aquino Neto, F. R.; Nunes, D.; S. S.; Cromatografia, Princípios básicos e

técnicas afins, Interciência, Rio de Janeiro: 2003.

4. Collins, C. H.; Braga, G. L.; Bonato, P. S.; Fundamentos de Cromatografia,

UNICAMP, Campinas: 2006.

5. Valente, A. L. P.; Riedo, C. R. F.; Augusto, F.; Análise Quantitativa por

cromatografia, ChemKeys; http://chemkeys.com/br/2003/10/17/analise-

quantitativa-por-cromatografia/, acessado em novembro de 2011.

6. Ribeiro, F. A. L.; Ferreira, M. M. C.; Morano, S. C.; da Silva, L. R.; Schneider, R.

P.; Quim. Nova, 2008, 31, 164.

7. Ribani, M.; Bottoli, C. B. G.; Collins, C. H.; Jardim, I. C. S. F.; Melo, L. F. C.

Quim. Nova 2004, 27, 771

8. Snyder,L.R. et al Practical HPLC Method Development, 2 ed., Wiley: Nova

Iorque, 1997.

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.1 Desenvolvimento do Método

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

Desenvolvimento do método: qual é o objetivo?

1. Análise de mistura ou um componente?

2. A resolução de todos os componentes é necessária?

3. Precisão, LD e LQ?

4. Quais matrizes?

5. Quantas amostras por análise?

9.1 Desenvolvimento do Método

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

Que tipo de amostra?

1. Soluções prontas para injeção?

2. Diluição, tamponamento, adição de padrão interno?

3. Matriz sólida? Dissolução? Extração?

4. Pré-tratamento? Interferentes? Concentração?

9.1 Desenvolvimento do Método

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

Informações importantes

1. Número de componentes da mistura

2. Estrutura Química

3. Massa molar

4. polaridade

5. volatilidade

9.1 Desenvolvimento do Método

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

CG - Por onde começar?

Variável Valores típicos

T (oC) isoterma inicial gradiente (10 oC min-1),

isoterma final

L (m) 10 - 25

dcoluna (mm) 0,2 -0,3

dfilme (mm) 0,15 – 0,3

Vazão (mL min-1) 1 - 2

Gás de arraste H2 ou He

Vinjeção (mL) 1

Volume de amostra 20 mL

9.1 Desenvolvimento do Método

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

CLAE - Por onde começar?

Variável Sugestão

Dimensão da coluna 15 x 0,46 cm

Tamanho de partícula 5 mm

Fase estacionária C18 ou C8

Fase móvel acetonitrila (100 a 80 %) – tampão

Tipo de tampão fosfato de potássio 25 mM

Vazão 1,4 a 2 mL.min-1

Temperatura 35 a 45 OC

Volume de amostra 20 mL

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.1 Normalização de áreas

Determinação da composição de uma mistura

Todos os componentes devem ser eluídos e detectados

Resposta depende da concentração e da natureza do analito

Fator de resposta: relação entre as respostas dos diversos analitos

Fator de resposta depende do detector

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.1 Normalização de áreas

Mistura padrão: concentrações conhecidas

Relação área/concentração

Área normalizada: percentual

Injeções: três

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.1 Normalização de áreas

Determinação do fator de resposta

álcool m (g) C (%) A (u.a.) A/C FR n-butílico 0,1731 3023

i-butílico 0,1964 3074 s-butílico 0,1514 3112

t-butílico 0,1826 3004

S 0,7035 12213

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.1 Normalização de áreas

Determinação do fator de resposta

álcool m (g) C (%) A (u.a.) A/C FR n-butílico 0,1731 24,61 3023

i-butílico 0,1964 27,92 3074 s-butílico 0,1514 21,52 3112

t-butílico 0,1826 25,96 3004

S 0,7035 100,00 12213

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.1 Normalização de áreas

Determinação do fator de resposta

álcool m (g) C (%) A (u.a.) A/C FR n-butílico 0,1731 24,61 3023 122,8585

i-butílico 0,1964 27,92 3074 110,1099 s-butílico 0,1514 21,52 3112 144,6032

t-butílico 0,1826 25,96 3004 115,7346

S 0,7035 100,00 12213

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.1 Normalização de áreas

Determinação do fator de resposta: mistura de álcoois (CG)

álcool m (g) C (%) A (u.a.) A/C FR n-butílico 0,1731 24,61 3023 122,8585 1,116

i-butílico 0,1964 27,92 3074 110,1099 1,000 s-butílico 0,1514 21,52 3112 144,6032 1,313

t-butílico 0,1826 25,96 3004 115,7346 1,051

S 0,7035 100,00 12213

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.1 Normalização de áreas

Determinação da composição de uma mistura de álcoois (CG)

álcool A (u.a.) FR A/FR C (%)

n-butílico 1731 i-butílico 3753

s-butílico 2845 t-butílico 1117

S

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.1 Normalização de áreas

Determinação da composição de uma mistura de álcoois (CG)

álcool A (u.a.) FR A/FR C (%)

n-butílico 1731 1,116 i-butílico 3753 1,000

s-butílico 2845 1,313 t-butílico 1117 1,051

S

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.1 Normalização de áreas

Determinação da composição de uma mistura de álcoois (CG)

álcool A (u.a.) FR A/FR C (%)

n-butílico 1731 1,116 1551 i-butílico 3753 1,000 3753

s-butílico 2845 1,313 2166 t-butílico 1117 1,051 1063

S 8533

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.1 Normalização de áreas

Determinação da composição de uma mistura de álcoois (CG)

álcool A (u.a.) FR A/FR C (%)

n-butílico 1731 1,116 1551 18,18 i-butílico 3753 1,000 3753 43,98

s-butílico 2845 1,313 2166 25,39 t-butílico 1117 1,051 1063 12,45

S 8533 100,00

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica

resposta a concentração

padrão analítico: pureza conhecida

nº pontos ≥ 5 (excluída a origem)

faixa linear dinâmica

fontes de erro: preparo da amostra, preparo de soluções, medidas de

áreas

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica

Preparo das soluções

solução estoque: matriz

soluções de trabalho: diluições

estabilidade do padrão e das soluções

armazenamento

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica

Preparo das soluções

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica

Preparo das soluções: uma solução estoque

soluções de trabalho: diluições da solução estoque

soluções de trabalho: diluições sucessivas

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica

Preparo das soluções: duas soluções estoque

solução estoque 1: soluções de trabalho ímpares

solução estoque 2: soluções de trabalho pares

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica

Obtenção da curva: escolha da faixa linear de trabalho

expectativa de resposta, limites permitidos

cinco ou mais pontos

três injeções

espaçamento dos pontos

faixa de trabalho

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica

Obtenção da curva: escolha da faixa linear de trabalho

expectativa de resposta é conhecida?

há limites definidos na legislação?

cinco ou mais níveis de concentração

três injeções

espaçamento dos pontos

faixa de trabalho: 50 a 150 % do valor esperado (IUPAC)

faixa de trabalho: 80 a 120 % do valor esperado (ANVISA)

RSD área das injeções < 5 %

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica

Obtenção da curva: escolha da faixa linear de trabalho

exemplo

c (mg mL-1) Amédia (ua)

1,05 319

1,98 601,2 2,97 896,5

4,01 1211 5,00 1508,8

5,99 1815,9

y = 302,35x + 0,5048 R² = 1

0

500

1000

1500

2000

0 2 4 6 8

A (

u.a

.)

c (mg mL-1)

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica

Uma amostra problema: três replicatas, três injeções

replicata 1 2 3 injeção 1 2 3 1 2 3 1 2 3 A (u.a.) 999,1 990,7 990,5 1001 1020,6 1005,7 972,3 985,4 988,3

Amédia (u.a.) c (mg mL-1)

c (mg mL-1) s IC

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica

Uma amostra problema: três replicatas, três injeções

replicata 1 2 3 injeção 1 2 3 1 2 3 1 2 3 A (u.a.) 999,1 990,7 990,5 1001 1020,6 1005,7 972,3 985,4 988,3

Amédia (u.a.) 993,4 1009,1 982,0 c (mg mL-1)

c (mg mL-1) s IC

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica

Uma amostra problema: três replicatas, três injeções

replicata 1 2 3 injeção 1 2 3 1 2 3 1 2 3 A (u.a.) 999,1 990,7 990,5 1001 1020,6 1005,7 972,3 985,4 988,3

Amédia (u.a.) 993,4 1009,1 982,0 c (mg mL-1) 3,28 3,34 3,25

c (mg mL-1) s IC

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica

Uma amostra problema: três replicatas, três injeções

replicata 1 2 3 injeção 1 2 3 1 2 3 1 2 3 A (u.a.) 999,1 990,7 990,5 1001 1020,6 1005,7 972,3 985,4 988,3

Amédia (u.a.) 993,4 1009,1 982,0 c (mg mL-1) 3,28 3,34 3,25

c (mg mL-1) 3,29 s 0,04 IC 0,11

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.3 Superposição da matriz

avalia efeito de interferentes presentes na matriz

matriz isenta do analito semelhante à amostra analítica

soluções de trabalho: matriz fortificada com o analito

adição do padrão à matriz em diversas concentrações

preparação das soluções: procedimento aplicado à matriz

construção da curva analítica

presença de interferentes: erro nos coeficientes angular e linear

análise da amostra analítica

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.4 Adição-padrão

avalia efeito de interferentes presentes na matriz

matriz isenta não disponível

soluções de trabalho: amostra analítica fortificada com o analito

adição do padrão à amostra em diversas concentrações

preparação das soluções: procedimento aplicado à amostra analítica

construção da curva analítica

presença do analito: erro nos coeficientes linear

determinação quantitativa: extrapolação

C na amostra A = 0

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.4 Adição-padrão

exemplo: qual é a concentração do analito na amostra?

expressão do resultado

c (mg mL-1) Amédia (ua)

1,05 974,0

1,98 1256,2 2,97 1551,5

4,01 1866,0 5,00 2163,8

5,99 2470,9 y = 302,35x + 655,5

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 2 4 6 8

A (

u.a

.)

c (mg mL-1)

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.4 Adição-padrão

exemplo: qual é a concentração do analito na amostra?

expressão do resultado: 2,16 mg mL1

c (mg mL-1) Amédia (ua)

1,05 974,0

1,98 1256,2 2,97 1551,5

4,01 1866,0 5,00 2163,8

5,99 2470,9 y = 302,35x + 655,5

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 2 4 6 8

A (

u.a

.)

c (mg mL-1)

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.5 Padronização interna com calibração por um ponto

Características do padrão interno

ausente na amostra

estruturalmente semelhante ao analito

quimicamente estável

tempo de retenção semelhante ao do analito

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.5 Padronização interna com calibração por um ponto

Características do padrão interno

ausente na amostra

estruturalmente semelhante ao analito

quimicamente estável

tempo de retenção semelhante ao do analito

bem resolvido

comportamento semelhante ao do analito nas etapas de

preparação da amostra

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.5 Padronização interna com calibração por um ponto

Vantagens

elimina erros de preparação da amostra

elimina o erro do volume injetado

elimina o erro da oscilação do sinal

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.5 Padronização interna com calibração por um ponto

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica

soluções de trabalho contém uma quantidade conhecida e constante

do padrão interno

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica

soluções de trabalho contém uma quantidade conhecida e constante

do padrão interno

curva analítica: Aanalito / API versus Canalito

solução da amostra contém padrão interno

bCaA

Aanalito

PI

analito

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica

soluções de trabalho contém uma quantidade conhecida e constante

do padrão interno

curva analítica: Aanalito / API versus Canalito

solução da amostra contém padrão interno

bCaA

Aanalito

PI

analito

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica

exemplo

Can (mg mL-1) CPI (mg mL-1) Aan API A/A 1,01 2,45 2087 4512 0,462622 1,99 2,45 4081 4540 0,899042 3,02 2,45 6177 4523 1,365841 4,00 2,45 8172 4522 1,807165 5,02 2,45 10247 4528 2,263185

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica

exemplo

y = 0,4496x + 0,0072

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0

Aa

na

lito/A

PI

c (mg mL-1)

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica

exemplo: uma amostra foi preparada contendo a mesma

concentração de padrão interno adicionado às soluções de trabalho

com o qual a curva analítica foi construída. Qual é a concentração do

analito na solução, se a razão entra as áreas do seu pico e o do padrão

interno no cromatograma foi igual a 1,71?

9.2 Métodos Quantitativos

Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas

9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica

exemplo: uma amostra foi preparada contendo a mesma

concentração de padrão interno adicionado às soluções de trabalho

com o qual a curva analítica foi construída. Qual é a concentração do

analito na solução, se a razão entra as áreas do seu pico e o do padrão

interno no cromatograma foi igual a 1,71? Can = 3,79 mg mL-1.