*11.11 pl .1 II 11111 1111 ADI

Republica Ereden,diva d BCOSB+54: trdtdouidd eadidt•i0

Inetddità NaddNa: P5dpriadede 31.1:12J2:41.

(21) P10710210-0 A2

(22) Data de Depósito: 29/03/2007(43) Data da Publicação: 24/05/2011(RPI 2107)

*11.11 pl .1 II 11111 1111 ADI(51) !M.a.:A61K 39/085 2006.01

A61 K 31/70 2006.01

A61 P 31/04 2006.01

(54) Título: COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA,MÉTODOS PARA PREPARAR A VACINA, E PARAPREVENIR OU TRATAR INFECÇÃOESTAFILOCÓCICA, USO DA COMPOSIÇÃOIMUNOGÊNICA, E, PROCESSO PARA CONJUGAROLIGASSACARÍDEO OU POLISSACARÍDEOCAPSULAR

(30) Prioridade Unionista: 30/03/2006 GB 0606416.6,30/03/2006 US 60/787249, 30/03/2006 US 60/787587

(73) Titular(es): Glaxomithkline Biologicals S.A.

(72) Inventor(es): Jan Poolman, Philippe Denoel

(74) Procurador(es): Momsen, Leonardos & CIA.

(86) Pedido Internacional: PCT EP2007053057 de 29/03/2007

(87) Publicação Internacional: wo W02007/113222de1 1/10/2007

(57) Resumo: COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA,METODOS PARA PREPARAR A VACINA, E PARA PREVENIR OUTRATAR INYECÇAO ESTAFILOCÓCICA, USO DA COMPOSIÇÃOIMUNOGÊNICA, E, PROCESSO PARA CONJUGAROLIGOSSACARIDEO OU POLISSACARIDEO CAPSULAR A presenteinvenção refere-se às composições imunogênicas compreendendooligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipos 5 e/ou 8 de S.aureus possuindo entre 30 e 100% de 0-acetilação. Vacinas, métodosde tratamento usando [sie] e processos para preparar umacomposição imunogênica compreendendo polissacarídeos capsularesde Tipos 5 e/ou 8 com 30-100% de 0-acetilação também são descritos.

1

"COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA, MÉTODOS PARA

PREPARAR A VACINA, E PARA PREVENIR OU TRATAR INFECÇÃO

ESTAFILOCÓCICA, USO DA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E,

PROCESSO PARA CONJUGAR OLIGOSSACARÍDEO OU

5 POLISSACARÍDEO CAPSULAR"

Campo técnico

A presente invenção refere-se ao campo das vacinas e

composições imunogênicas, à sua manufatura e ao uso de tais composições

em medicina. Mais particularmente, refere-se às composições de vacina

10 compreendendo polissacarídeos de tipos 5 e/ou 8 de S. aureus nos quais o

grau de 0-acetilação está entre 30 e100%. Também são proporcionados

métodos para o tratamento ou a prevenção de infecções estafilocócicas usando

tais vacinas.

Fundamentos

15 O número de infecções tanto adquiridas em comunidade

quanto adquiridas em hospitais tem aumentado no decorrer dos anos recentes

com o uso aumentado de dispositivos intravasculares. Infecções adquiridas

em hospitais (nosocomiais) são uma causa maior de morbidez e de

mortalidade, mais particularmente nos E.U.A., onde elas afetam mais do que

20 2 milhões de pacientes anualmente. Após vários estudos, cerca de 6 por cento

dos pacientes dos E.U.A. adquirirão uma infecção durante sua estadia em

hospital. O encargo econômico nos E.U.A. foi estimado em mais de 4,5

bilhões de dólares americanos em 1992 (Emori e Gaynes, 1993, Clin.

Microbiol. Rev. 6; 428). As infecções mais freqüentes são infecções do trato

25 urinário (UTI-33% das infecções), seguidas por pneumonia (15,5%),

infecções de sítio cirúrgico (14,8%) e infecções de corrente sanguínea

primária (13%) Emori e Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428).

Staphylococcus aureus, estafilococos negativos para coagulase

(em sua maior parte Staphylococcus epidermidis), enterococcus spp,

2

Esherichia coli e Pseudomonas aeruginosa são os patógenos nosocomiais

maiores. Embora aqueles patógenos causem quase o mesmo número de

infecções, a severidade dos distúrbios que podem produzir combinada com a

freqüência de isolados resistentes a antibióticos balança esta classificação na

5 direção de S. aureus e S. epidermidis como sendo os patógenos nosocomiais

mais significativos.

Staphylococcus aureus é a causa mais comum de infecções

nosocomiais com uma morbidez e uma mortalidade significativas (Romero-

Vivas et al. 1995, Infect. Dis. 21; 1417). É a causa de alguns casos de

10 osteomielite, endocardite, artrite séptica, pneumonia, abscessos e síndrome de

choque tóxico.

S. epidermidis é o comensal de pele normal que também é um

patógeno oportunista importante responsável por infecções de dispositivos

médicos implantados e infecções em sítios de cirurgia. Dispositivos médicos

15 infectados por S. epidermidis incluem marca-passos cardíacos, derivações de

fluido cerebroespinal, cateteres de diálise peritoneal ambulatorial contínua,

dispositivos ortopédicos e válvulas cardíacas prostéticas.

Infecções de S. aureus e S. epidermidis são tratadas com

antibióticos, com penicilina sendo a droga de escolha enquanto que

20 vancomicina é usada para isolados resistentes à meticilina. A percentagem de

cepas estafilocócicas exibindo resistência de amplo espectro aos antibióticos

tem se tornado crescentemente prevalente desde os anos 1980's (Panlilo et al.

1992, Infect.Control. Hosp. Epidemiol. 13; 582), colocando sob ameaça a

terapia antimicrobiana efetiva. Em adição, a emergência recente de cepa de S.

25 aureus resistente à vancomicina tem causado medo de que cepas de S. aureus

resistentes à meticilina emergirão e se disseminarão para as quais não está

disponível terapia efetiva.

Uma abordagem alternativa de uso de anticorpos contra

antígenos estafilocócicos em imunoterapia passiva tem sido investigada.

3

Terapia envolvendo a administração de anti-soros policlonais está sob

desenvolvimento (WO 00/15238, WO 00/12132) bem como o tratamento com

um anticorpo monoclonal contra ácido lipoteicóico (WO 98/57994).

Uma abordagem alternativa seria o uso de vacinação ativa para

5 gerar uma resposta imune contra estafilococos. Vários candidatos para

inclusão como componentes de vacina têm sido identificados. Estes incluem

proteína ligante de Fibronectina (US5840846), análogo de MHC II

(US5648240), proteína ligante de fibrinogênio (US6008341), GehD (US

2002/0169288), proteína ligante de colágeno (US6288214), SdrF, SdrG e

10 SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA e SEB mutantes (WO 00/02523) e

proteína ligante de vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852).

O genoma de S. aureus tem sido seqüenciado e muitas das

seqüências codificadoras têm sido identificadas (EP786519, W002/094868).

O mesmo é verdade para S. epidermidis (WO 01/34809). Como um

15 refinamento desta abordagem, outros têm identificado proteínas que são

reconhecidas por soros hiper-imunes de pacientes que têm sofrido de infecção

estafilocócica (W001/98499, WO 02/059148).

A primeira geração de vacinas contra S. aureus ou contra as

exoproteínas que ela produz têm alcançado sucesso limitado (Lee 1996

20 Trends Microbiol. 4; 162). Ainda permanece uma necessidade para o

desenvolvimento de vacinas efetivas contra infecções estafilocócicas.

Descrição das figuras

Figura 1 - Seqüências de polipeptídeo de proteínas para

inclusão em uma composição imunogênica. Tabela 1 proporciona informação

25 sobre qual proteína é representada por cada SEQ ID.

Figura 2 - Seqüências de nucleotídeos codificadoras de

proteínas para inclusão em uma composição imunogênica. Tabela 1

proporciona informação sobre qual proteína é representada por cada SEQ ID.

Figura 3 - Purificação de alfa-toxina sob condições nativas.

4

Painel A mostra uma SDS-PAGE corada com coommassie de amostras

preparadas durante a purificação de alfa-toxina. Pista 1 - marcadores de peso

molecular, pista 2 - fração solúvel contendo alfa-toxila sobre-expressada,

pista 3 - fluxo através da coluna de Ni-NTA, pista 4 - frações eluídas com

5 tampão B 10%, pista 5 - frações eluídas com tampão B 20%, pista 6 - frações

eluídas com tampão B 30%, pista 7 - frações eluídas com tampão B 50%,

pista 8 - frações eluídas com tampão B 75%, pista 9 e 10 frações eluídas com

tampão B 100%, pista 11 bactérias em T=0 antes da indução, pista 12 -

bactérias em T=4 horas após a indução, pista 13 - lisado de célula, pista 14 -

10 fração solúvel, pista 15 - fração insolúvel. Painel B mostra uma SDS-PAGE

corada com coommassie de 10, 5, 2 e 1µL da alfa-toxina purificada.

Figura 4 - Purificação de SdrC sob condições desnaturantes.

Painel A mostra uma SDS-PAGE corada com coommassie de amostras

preparadas durante a purificação de alfa-toxina. Pista M - marcadores de peso

15 molecular, pista Início - sobrenadante formado da fração insolúvel contendo

SdrC sobre-expressado, pista FT1 - fluxo através da coluna de Ni-NTA, pista

C - frações eluídas com tampão de lavagem C, pista D - frações eluídas com

tampão D, pista E - frações eluídas com tampão E. Painel B mostra uma SDS-

PAGE corada com coommassie de 1, 2, 5 e 10 !..iL de SdrC purificado.

20 Figura 5 - Resultados de ELISA para anti-soros contra

proteínas estafilocócicas em placas revestidas com proteínas purificadas.

Resultado de combinação camundongos pré - usando soros combinados

extraídos de camundongos pré-inoculação. Resultado de combinação

camundongos pós III - usando soros de camundongo combinados extraídos

25 pós-imunização. Resultado de combinação coelho pré - usando soros

combinados extraídos de coelhos pré-inoculação. Resultado de combinação

coelho pós III usando soros de coelho combinados extraídos pós-imunização.

Figura 6 - Resultados de ELISA para anti-soros de

camundongo produzidos contra proteínas estafilocócicas em placas revestidas

5

com estafilococos mortos.

Painel A usa placas revestidas com células inteiras mortas de

sorotipo 5 de S. aureus. Painel B usa placas revestidas com células inteiras

mortas de sorotipo 8 de S. aureus. Painel C usa placas revestidas com células

5 inteiras mortas de S. epidermidis.

A linha marcada com sinais quadrados mostra o resultado de

ELISA usando anti-soros de camundongos imunizados três vezes com a

proteína estafilocócica indicada. A linha marcada com sinais de diamante

mostra o resultado de ELISA para soros de camundongo pré-imunes.

10 Figura 7 - Resultados de ELISA para anti-soros de coelho

produzidos contra proteínas estafilocócicas em placas revestidas com

estafilococos mortos.

Painel A usa placas revestidas com células inteiras mortas de

sorotipo 5 de S. aureus. Painel B usa placas revestidas com células inteiras

15 mortas de sorotipo 8 de S. aureus. Painel C usa placas revestidas com células

inteiras mortas de S. epidermidis.

A linha marcada com sinais quadrados mostra o resultado de

ELISA usando anti-soros de coelhos imunizados três vezes com a proteína

estafilocócica indicada (exceto para HarA onde apenas uma imunização foi

20 dada). A linha marcada com sinais de diamante mostra o resultado de ELISA

para soros de coelho pré-imunes.

Descrição detalhada

A presente invenção descreve composições imunogênicas que

compreendem Polissacarídeos de S. aureus de Tipos 5 e/ou 8 nos quais o

25 oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipo 5 e/ou de Tipo 8 está entre

30% e 100% 0-acetilado. Em modalidades particulares, a composição

imunogênica da invenção adicionalmente compreende proteína(s)

estafilocócica(s) ou PNAG. PNAG está elevadamente conservada dentre

bactérias Gram-positivas e proporciona proteção contra uma ampla variedade

6

de bactérias enquanto que polissacarídeos de Tipos 5 e 8 são imunógenos

potentes que geram uma resposta imune contra a maioria das cepas de S.

aureus que é a causa mais comum de infecção nosocomial.

Polissacarídeos

5 As composições imunogênicas da invenção compreendem

polissacarídeos dos tipos 5 e 8 e PNAG de S. aureus qualquer um dos quais

ou ambos os quais estão entre 30% e 100% 0-acetilados.

Poli-glicosamina N-acetilada (PNAG)

PNAG é uma adesina intercelular de polissacarídeo e é

10 composta de um polímero de glicosamina r3-(1—>6)-ligada, opcionalmente

substituída com constituintes N-acetila e/ou 0-succinila. Este polissacarídeo

está presente em ambas S. aureus e S. epidermidis e pode ser isolado de

qualquer fonte (Joyce et al. 2003, Carbohydrate Research 338; 903; Maira

Litran et al. 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Por exemplo, PNAG pode ser

15 isolada de cepa MN8m de S. aureus (WO 04/43407). A preparação de

dPNAG é descrita em WO 04/43405.

Foi recentemente mostrado que o polissacarídeo previamente

conhecido como poli-N-succini1-13-(1-6)-glicosamina (PNSG) não possui a

estrutura esperada porque a identificação da N-succinilação foi incorreta

20 (Maira-Litran et al. 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Portanto o polissacarídeo

formalmente conhecido como PNSG e agora verificado em ser PNAG

também é incluído pelo termo PNAG.

PNAG pode ser de tamanhos diferentes variando de mais de

400kDa a entre 75 e 400kDa a entre 10 e 75kDa para oligossacarídeos

25 compostos de até 30 unidades repetidas (de glicosamina (3-(1—>6)-ligada,

opcionalmente substituída com constituintes N-acetila e 0-succinila).

Qualquer tamanho de oligossacarídeo ou polissacarídeo de PNAG pode ser

usado em uma composição imunogênica da invenção, por exemplo um

tamanho de acima de 40kDa pode ser usado. O ajuste do tamanho pode ser

7

realizado por qualquer método conhecido na arte, por exemplo por

microfluidização, irradiação ultra-sônica ou por clivagem química (WO

03/53462, EP497524, EP497525).

Faixas de tamanho de PNAG são por exemplo 40-400kDa, 50-

5 350kDa, 40-300kDa, 60-300kDa, 50-250kDa e 60-200kDa.

PNAG pode possuir grau de acetilação diferente devido à

substituição nos grupos amino por acetato. PNAG produzida in vitro está

quase totalmente substituída nos grupos amino (95-100%).

Alternativamente, pode ser usada uma PNAG acetilada

10 possuindo menos do que 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 5% de N-acetilação.

Uso de uma PNAG acetilada permite morte opsônica de bactérias Gram-

positivas, opcionalmente S. aureus e/ou S. epidermidis (WO 04/43405). Em

uma modalidade, a PNAG possui um tamanho entre 40kDa e 300kDa e é

desacetilada de modo que menos do que 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 5%

15 dos grupos amino estejam N-acetilados.

Em uma modalidade, a PNAG não está 0-succinilada ou está

0-succinilada em menos do que 25, 20, 15, 10, 5, 2, 1 ou 0,1% de resíduos.

O termo PNAG desacetilada (dPNAG) refere-se a um

oligossacarídeo ou polissacarídeo PNAG no qual menos do que 50%, 40%,

20 30%, 20%, 10% or 5% dos grupos amino estão acetilados.

Como aqui usado, o termo PNAG inclui ambas as formas

acetiladas e desacetiladas do sacarídeo.

Em uma modalidade, PNAG é desacetilada para formar

dPNAG, por tratamento químico do polissacarídeo nativo. Por exemplo, a

25 PNAG nativa é tratada com uma solução básica de tal modo que o pH suba

para acima de 10. Por exemplo a PNAG é tratada com NaOH, KOH ou

NH4OH 0,1-5M, 0,2-4M, 0,33M, 0,5-2M, 0,75-1,5M ou 1M. Tratamento é

por pelo menos 10 ou 30 minutos, ou 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 ou 20 horas em uma

temperatura de 20-100, 25-80, 30-60 or 30-50 ou 35-45°C. dPNAG pode ser

8

preparada como descrito em WO 04/43405.

Em uma modalidade, o(s) polissacarídeo(s) incluído(s) na

composição imunogênica da invenção é (são) conjugado(s) em uma proteína

carreadora como descrito abaixo ou alternativamente não é (são)

5 conjugado(s).

Polissacarídeos de Tipo 5 e de Tipo 8 de S. aureus

A maioria das cepas de S. aureus que causa infecção em

homem contém polissacarídeos quer de Tipo 5 quer de Tipo 8.

Aproximadamente 60% de cepas de humano são de Tipo 8 e

10 aproximadamente 30% são de Tipo 5. As estruturas de antígenos

polissacarídeo capsular de Tipo 5 e de Tipo 8 são descritas em Moreau et al.

Carbohydrate Res. 201; 285 (1990) e Fournier et al. Infect. Immun. 45; 87

(1984). Ambas possuem FucNVAcp em sua unidade repetida bem como

ManNAcA que pode ser usado para introduzir um grupo sulfidrila.

15 Recentemente (Jones Carbohydrate Research 340, 1097-1106

(2005)) espectroscopia em NMR revisou as estruturas dos polissacarídeos

capsulares para:

Tipo 5

—>4)-p-D-ManNAcA-(1 —+4)-a-L-FucNAc(3OAc)-(1 .-->3)-0-D-FucNAc-(1 --->

Tipo 8

—>3)-p-D-ManNAcA(40Ac)-(1 —>3)-a-L-FucNAc(1 --43)-a-D-FucNAc(1 —>

20 Polissacarídeos podem ser extraídos da cepa apropriada de S.

aureus usando métodos bem conhecidos pelo homem experiente, por exemplo

como descrito em US6294177 ou Infection and Immunity (1990) 58(7); 2367.

Por exemplo, ATCC 12902 uma cepa de S. aureus de Tipo 5 e ATCC 12605 é

uma cepa de S. aureus de Tipo 8.

25 Polissacarídeos são de tamanho nativo ou alternativamente

podem ser de tamanho ajustado, por exemplo por microfluidização, irradiação

9

ultra-sônica ou por tratamento químico. A invenção também cobre os

oligossacarídeos derivados de polissacarídeos de tipos 5 e 8 de S. aureus.

Os oligossacarídeos ou polissacarídeos capsulares de tipos 5

e/ou 8 incluídos na composição imunogênica da invenção estão 0-acetilados.

5 Em uma modalidade, o grau de 0-acetilação do oligossacarídeo ou

polissacarídeo capsular de tipo 5 é 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%,

50-100%, 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90%

ou 80-90%. Em uma modalidade, o grau de 0-acetilação do oligossacarídeo

ou polissacarídeo capsular de tipo 8 é 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-

10 100%, 50-100%. 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%,

70-90% ou 80-90%. Em uma modalidade, o grau de 0-acetilação dos

oligossacarídeos ou polissacarídeos capsulares de tipo 5 e de tipo 8 é 10-

100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100%, 70-100%, 80-

100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% ou 80-90%.

15 O grau de 0-acetilação do oligossacarídeo ou polissacarídeo

pode ser determinado por qualquer método conhecido na arte, por exemplo,

por NMR de próton (Lemercinier e Jones 1996, Carbohydrate Resarch 296;

83-96, Jones e Lemercinier 2002, J Pharmaceutical and Biomedical Analysis

30; 1233-1247, WO 05/033148 ou WO 00/56357). Um outro método

20 comumente usado é aquele descrito por Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180;

249-261.

Grupos 0-acetila podem ser removidos por hidrólise, por

exemplo pelo tratamento com uma base tal como hidrazina anidra (Konadu et

al. 1994; Infect. Immun. 62; 5048-5054) ou tratamento com NaOH 0,1 N por

25 1-8 horas. Com o propósito de manter níveis altos de 0-acetilação no

oligossacarídeo ou polissacarídeo de tipos 5 e/ou 8, tratamentos que levariam

à hidrólise dos grupos 0-acetila são minimizados. Por exemplo tratamento em

extremos de pH são minimizados.

Os polissacarídeos de tipos 5 e 8 incluídos na composição

10

imunogênica da invenção estão normalmente conjugados em uma proteína

carreadora como descrito abaixo ou alternativamente estão não-conjugados.

As composições imunogênicas da invenção alternativamente

contêm polissacarídeo quer de tipo 5 quer de tipo 8.

5 Antígeno 336 de S. aureus

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção

compreende o antígeno 336 de S. aureus descrito em US6294177.

O antígeno 336 compreende hexosamina (3-ligada, não contém

grupos 0-acetila e especificamente se liga em anticorpos para S. aureus Tipo

10 336 depositado sob ATCC 55804.

Em uma modalidade, o antígeno 336 é um polissacarídeo que é

de tamanho nativo ou alternativamente pode ser dimensionado, por exemplo

por microfluidização, irradiação ultra-sônica ou por tratamento químico. A

invenção também cobre oligossacarídeos derivados do antígeno 336.

15 O antígeno 336, onde incluído na composição imunogênica da

invenção opcionalmente está conjugado em uma proteína carreadora como

descrito abaixo ou alternativamente está não-conjugado.

Polissacarídeos de Tipos I, II e III de S. epidermidis

Cepas ATCC-31432, SE-360 e SE-10 de S. epidermidis são

20 características de três tipos capsulares diferentes I, II e III respectivamente

(Ichiman e Yoshida 1981, J. Appl. Bacteriol. 51; 229). Polissacarídeos

capsulares extraídos de cada sorotipo de S. epidermidis constituem os

polissacarídeos de Tipos I, II e III. Polissacarídeos podem ser extraídos por

vários métodos incluindo o método descrito em US4197290 ou como descrito

25 em Ichiman et al. 1991, J. Appl. Bacteriol. 71; 176.

Em uma modalidade da invenção, a composição imunogênica

compreende oligossacarídeos ou polissacarídeos de tipos I e/ou II e/ou III de

S. epidermidis.

Polissacarídeos são de tamanho nativo ou alternativamente

11

podem ser de tamanho ajustado, por exemplo por microfluidização, irradiação

ultra-sônica ou clivagem química. A invenção também cobre os

oligossacarídeos extraídos de cepas de S. epidermidis.

Estes polissacarídeos estão não-conjugados ou são

5 opcionalmente conjugados como descrito abaixo.

Conjugação de polissacarídeos

Dentre os problemas associados com o uso de polissacarídeos

em vacinação, está o fato de que os polissacarídeos per se são imunógenos

insatisfatórios. Estratégias, que tem sido planejadas para suplantar esta falta

10 de imunogenicidade, incluem a ligação do polissacarídeo em carreadores

protéicos grandes, que proporcionam auxílio de célula-T espectadora.

Exemplos de carreadores que podem ser usados para copulação em

imunógenos polissacarídeo ou oligossacarídeo incluem os toxóides de Difteria

e Tétano (DT, DT Crm197 e TT), Hemocianina de Lapa Buraco de Fechadura

15 (KLH), exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) e o derivado de

proteína purificado de Tuberculina (PPD), proteína D de Haemophilus

influenzae, pneumolisina ou fragmentos de qualquer um dos acima.

Fragmentos adequados para uso incluem fragmentos incluindo epitopos de

célula T-auxiliadora. Em particular framento de proteína D opcionalmente

20 conterá o 1/3 N-terminal da proteína. Proteína D é uma proteína ligante de

IgD de Haemophilus influenzae (EP O 594 610 B1).

Uma proteína carreadora alternativa para uso na composição

imunogênica da invenção é uma proteína estafilocócica única ou seu

fragmento ou uma proteína de fusão compreendendo pelo menos ou

25 exatamente 1, 2, 3 ou 4 ou mais das proteínas estafilocócicas ou seus

fragmentos listados na sessão abaixo.

Uma proteína carreadora nova que seria particularmente

vantajosa para uso no contexto de uma vacina estafilocócica é o alfa-toxóide

estafilocócico. A forma nativa pode estar conjugada em um polissacarídeo

12

porque o processo de conjugação reduz a toxicidade. Opcionalmente uma

alfa-toxina geneticamente destoxificada tal como as variantes His35Leu ou

His35Arg são usadas como carreadoras porque a toxicidade residual é mais

baixa. Alternativamente a alfa-toxina é quimicamente destoxificada pelo

5 tratamento com um agente reticulante, formaldeído ou glutaraldeído. Uma

alfa-toxina geneticamente destoxificada é opcionalmente quimicamente

destoxificada, opcionalmente pelo tratamento com um agente reticulante,

formaldeído ou glutaraldeído para reduzir mais a toxicidade.

Os polissacarídeos podem ser ligados na(s) proteína(s)

10 carreadora(s) por método conhecido (por exemplo, por Likhite, Patente U.S.

4.372.945 de Armor et al., Patente U.S. 4.474.757, WO e Jennings et al.,

Patente U.S. 4.356.170). Opcionalmente, química de conjugação de CDAP é

realizada (veja W095/08348).

Em CDAP, o reagente de cianilação tetrafluoro-borato de 1-

15 ciano-dimetil-amino-piridínio (CDAP) é opcionalmente usado para a síntese

de conjugados de polissacarídeo-proteína. A reação de cianilação pode ser

conduzida sob condições relativamente brandas, que evita a hidrólise dos

polissacarídeos alcalinamente sensíveis. Esta síntese permite a copulação

direta em uma proteína carreadora.

20 O polissacarídeo pode ser solubilizado em água ou uma

solução salina. CDAP pode ser dissolvido em acetonitrila e adicionado

imediatamente na solução de polissacarídeo. O CDAP reage com os grupos

hidroxila do polissacarídeo para formar um éster de cianato. Após a etapa de

ativação, a proteína carreadora é adicionada. Grupos amino de usina reagem

25 com o polissacarídeo ativado para formar uma ligação covalente de isouréia.

Após a reação de copulação, um excesso grande de glicina é então adicionado

para extinguir os grupos funcionais ativados residuais. O produto é então

passado através de uma coluna de permeação em gel para remover a proteína

carreadora não reagida e os reagentes residuais.

13

Proteínas

A composição imunogênica da invenção opcionalmente

adicionalmente compreende uma proteína estafilocócica, por exemplo uma

proteína de S. aureus ou de S. epidermidis. Algumas modalidades da invenção

5 contêm proteínas de ambas S. aureus e S. epidermidis.

Composições imunogênicas da invenção compreendem uma

proteína isolada que compreende uma seqüência de aminoácidos que possui

pelo menos 85% de identidade, opcionalmente pelo menos 90% de

identidade, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 97-99% ou identidade

10 exata, em relação àquela de qualquer seqüência da figura 1.

Onde uma proteína é especificamente aqui mencionada, é

opcionalmente uma referência a uma proteína de comprimento total, nativa ou

recombinante, ou opcionalmente uma proteína madura na qual qualquer

seqüência de sinal tem sido removida. A proteína pode ser isolada diretamente

15 da cepa estafilocócica ou produzida por técnicas de DNA recombinante.

Fragmentos imunogênicos da proteína podem ser incorporados na composição

imunogênica da invenção. Estes são fragmentos compreendendo pelo menos

10 aminoácidos, pelo menos 20 aminoácidos, pelo menos 30 aminoácidos,

pelo menos 40 aminoácidos, pelo menos 50 aminoácidos ou pelo menos 100

20 aminoácidos, tomados contiguamente da seqüência de aminoácidos da

proteína. Em adição, tais fragmentos imunogênicos são tipicamente

imunogenicamente reativos com anticorpos gerados contra as proteínas

estafilocócicas ou com anticorpos gerados pela infecção de um hospedeiro

mamífero com estafilococos ou contem epitopos de célula-T. Em uma

25 modalidade, fragmentos imunógenos também incluem fragmentos que quando

administrados em uma dose efetiva, (quer sozinhos quer como um hapteno

ligado em um carreador), geram uma resposta imune protetora contra infecção

estafilocócica, opcionalmente é protetor contra infecção de S. aureus e/ou S.

epidermidis. Um tal fragmento imunógeno pode incluir, por exemplo, a

14

proteína faltante de uma seqüência líder N-terminal, e/ou um domínio de

transmembrana e/ou um domínio de âncora C-terminal. Em uma modalidade,

o fragmento imunógeno de acordo com a invenção compreende

substancialmente todo o domínio extracelular de uma proteína que possui

5 pelo menos 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade, em relação àquela

de uma seqüência selecionada de Figura 1 sobre o comprimento inteiro da

seqüência de fragmento.

Em uma modalidade, composições imunogênicas da invenção

podem conter proteínas de fusão de proteínas estafilocócicas, ou fragmentos

10 de proteínas estafilocócicas. Tais proteínas de fusão podem ser preparadas

recombinantemente e podem compreender uma porção de pelo menos 2, 3, 4,

5 ou 6 proteínas estafilocócicas, por exemplo as combinações de proteínas

estafilocócicas listadas abaixo. Alternativamente, uma proteína de fusão pode

compreender uma multitude de porções de pelo menos 2, 3, 4 ou 5 proteínas

15 estafilocócicas. Estas podem combinar proteínas estafilocócicas diferentes ou

seus fragmentos na mesma proteína. Alternativamente, a invenção também

inclui proteínas de fusão individuais de proteínas estafilocócicas ou seus

fragmentos, como uma proteína de fusão com seqüências heterólogas tais

como um proporcionador de epitopos de célula-T ou marcadores de

20 purificação, por exemplo: 13-galactosidase, glutatione-S-transferase, proteínas

fluorescentes verdes (GFP), marcadores de epitopo tais como FLAG,

marcador myc, poli-histidina, ou proteínas de superficie viral tal como

hemaglutinina de vírus da gripe, ou proteínas bacterianas tais como toxóide

do tétano, toxóide da difteria, CRM197. A proteína de fusão pode estar

25 presente na composição imunogênica da invenção como uma proteína livre

ou pode ser uma proteína carreadora ligada em um sacarídeo.

Proteínas


adicionalmente compreende uma ou mais das proteínas mencionadas abaixo

15

ou seus fragmentos imunógenos. Muitas das proteínas caem dentro de

categorias de proteínas ligantes de componente extracelular, proteínas

transportadoras ou toxinas e reguladores de virulência. A composição

imunogênica da invenção opcionalmente adicionalmente compreende uma

5 proteína ligante de componente extracelular estafilocepa estafilocócica ou

uma proteína transportadora estafilocepa estafilocócica ou uma toxina

estafilocepa estafilocócica ou um regulador de virulência estafilocepa

estafilocócica. A composição imunogênica da invenção opcionalmente

compreende pelo menos ou exatamente 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 proteínas

10 estafilocócicas.

Tabela 1

A seguinte tabela exibe números de SEQ das seqüências de

proteína e seqüências de DNA que são encontradas em Figura 1 e Figura 2

respectivamente. SA indica uma seqüência de S. aureus e SE indica uma

15 seqüência de S. epidermidis.Nome Seqüência de proteína Seqüência de DNATransportador ABC imunodominanteSASE

SEQ ID 1 SEQ ID 34SEQ ID 2 SEQ ID 35

Receptor de lamininaSASE


Antígeno Secretário A SsaASA 1SA 2SE

SEQ ID 5 SEQ ID 38SEQ ID 6 SEQ ID 39SEQ ID 7 SEQ ID 40

S itCSASE

SEQID8 SEQID41SEQ ID 9 SEQ ID 42

IsaA/PisA (IssA)SASE


EbhA/BSA EbhASA EbhBSE EbhASE EbhB

SEQ ID 12 SEQ ID 45SEQ ID 13 SEQ ID 46SEQ ID 14 SEQ ID 47SEQ ID 15 SEQ ID 48

Acumulação-assoc pro AapASSE


Proteína ativadora de RNA III RAPSASE


16

FIG/SdrGSASE


Proteína ligante de elastina EbpSSASE


Proteína extracelular EFB SA SEQ ID 24 SEQ ID 57alfa-toxina SA SEQ ID 25 SEQ ID 58SBI SA SEQ ID 26 SEQ ID 59IsdA SA SEQ ID 27 SEQ ID 60IsdBSA SEQID28 SEQID61

SEQ ID 62SdrC SA SEQ ID 29CTfA SA SEQ ID 30 SEQ ID 63FnbA SA SEQ ID 31 SEQ ID 64C1fB SA SEQ ID 32 SEQ ID 65Coagulase SA SEQ ID 33 SEQ ID 66FnbB SA SEQ ID 67 SEQ ID 77MAP SA SEQ ID 68 SEQ ID 78HarA SA SEQ ID 69 SEQ ID 79Autolisina glicosaminidase SA SEQ ID 70 SEQ ID 80Autolisina amidase SA SEQ ID 71 SEQ ID 81fragmento Ebh SA SEQ ID 72 SEQ ID 82Autolisina Ant SA SEQ ID 73 SEQ ID 83SdrCSA SEQ ID74 SEQ ID84MRPIISA SEQ ID75 SEQ ID85SdrG SA SEQ ID 76 SEQ ID 86SdrE SA SEQ ID 87 SEQ ID 88SdrD SA SEQ ID 89 SEQ ID 90SasF SA SEQ ID 91 SEQ ID 92

Proteínas ligantes de componente extracelular

Proteínas ligantes de componente extracelular são proteínas

que se ligam em componentes extracelulares de hospedeiro. O termo inclui,

mas não é limitado às adesinas.

5 Exemplos de proteínas ligantes de componente extracelular

incluem receptor de laminina (Naidu et al. J. Med. Microbiol. 1992, 36; 177),

proteína ligante de saliva/SitC/MntC (US5801234, Wiltshire e Foster Infec.

Immun. 2001, 69; 5198), EbhA (Williams et al. Infect. Immun. 2002, 70;

6805), EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS) (Park et al. 1999, J. Biol.

10 Chem. 274; 2845), EFB (FIB) (Wastfelt e Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33;

2347), SBI (Zhang et al. FEMS Immun. Med. Microbiol. 2000, 28; 211),

autolisina (Rupp et al. 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), CTfA ( US6008341,

McDevitt et al. Mol. Microbiol. 1994, 11; 237), SdrC, SdrG (McCrea et al.

Microbiology 2000, 146; 1535), SdrH (McCrea et al. Microbiology 2000,

17

146; 1535), Lipase GehD (US2002/0169288), SasA (Roche et al.

Microbiology 2003, 149 ; 643), SasC (Roche et al. Microbiology 2003, 149 ;

643), SasK (Roche et al. Microbiology 2003, 149 ; 643), FnbA (Flock et al.

Mol Microbiol. 1994, 12; 599, US6054572), FnbB (WO 97/14799, Booth et

5 al. 2001 Infec. Immun. 69; 345), proteína ligante de colágeno Cna (Visci et al.

2000, J. Biol. Chem. 275; 39837), ClfB (WO 99/27109), SdrD (WO

99/27109), SdrE (WO 99/27109), FbpA (Phonimdaeng et al. 1988 J. Gen

Microbio1.134; 75), Npase (Flock 2001 J. Bacteriol. 183; 3999), IsaA/PisA

(Lonenz et al. FEMS Immuno. Med. Microbiol. 2000, 29; 145), SsaA (Lang

10 et al. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29; 213), EPB (Hussain e

Hermann symposium on Staph Denmark 1417th 2000), SSP-1 (Veenstra et al.

1996, J. Bacteriol. 178; 537), SSP-2 (Veenstra et al. 1996, J. Bacteriol. 178;

537), proteína ligante de heparina de 17 kDa HBP (Fallgren et al. 2001, J.

Med. Microbiol. 50; 547), proteína ligante de Vitronectina (Li et al. 2001,

15 Curr. Microbiol. 42; 361), proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig

(WO 97/48727) e MAP (US5648240)

Proteína ligante de saliva/SitC/MntC

Esta é uma proteína transportadora ABC que é um homólogo

de adesina PsaA em S. pneumoniae. É uma lipoproteína elevadamente

20 imunogênica de 32kDa que está distribuída em toda a parede celular

bacteriana (Cockayne et al. Infect. Immun. 1998 66; 3767). É expressada em

S. aureus e S. epidermidis como uma lipoproteína de 32kDa e um

homólogo de 40kDa está presente em S. hominis. Em S. epidermidis, é um

componente de um operon regulado por ferro. Mostra homologia considerável

25 com ambas adesinas incluindo FimA de Streptococcus parasanguis,

e com lipoproteínas de uma família de transportadores ABC com funções de

transporte de ferro metálico putativo ou provado. Portanto SitC está

incluída como uma proteína ligante extracelular e como um transportador de

íon ferro.

18

A proteína ligante de saliva descrita em US5.801.234 também

é uma forma de SitC e pode ser incluída em uma composição imunogênica da

invenção.

CTfA e ClfB

5 Ambas estas proteínas possuem atividade de ligação de

fibrinogênio e acionam S. aureus para formar agrupamentos na presença de

plasma. Contêm um motivo LPXTG comum às proteínas associadas à parede.

CTfA é descrita em US6008341 e ClfB é descrita em WO

99/27109.

10 Coagulase (FbpA)

Esta é uma proteína ligante de fibrinogênio que aciona S.

aureus para formar agrupamentos na presença de plasma. É descrita em

referências relacionadas com Coagulase : Phonimdaeng et al. (J. Gen.

Microbio. 1988, 134:75-83), Phonimdaeng et al. (Mol Microbiol 1990; 4:393-

15 404), Cheung et al. (Infect Immun 1995; 63:1914-1920) e Shopsin et al. (J.

CLin. Microbiol. 2000; 38:3453-3456). Em uma modalidade, fragmentos

para inclusão na composição imunogênica da invenção incluem a proteína

madura na qual o peptídeo de sinal tem sido removido (aminoácidos 27 à

terminação-C).

20 Coagulase possui três domínios distintos. Aminoácidos 59-297

que são uma região de espiral enrolada, aminoácidos 326-505 que são uma

região rica em prolina e glicina, e o domínio C-terminal do aminoácido 506 a

645 que possui uma conformação de folha beta. Cada um destes domínios é

um fragmento que pode ser incorporada na composição imunogênica da

25 invenção.

SdrG

Esta proteína é descrita em WO 00/12689. SdrG é encontrada

em estafilococos negativos para coagulase e é um proteína associada à parede

celular contendo uma seqüência LPXTG.

19

SdrG contém um peptídeo de sinal (aminoácidos 1-51), uma

região contendo sítios de ligação de fibrinogênio e sítios de ligação de

colágeno (aminoácidos 51-825), dois domínios CnaB (aminoácidos 627-698 e

738-809), uma região de repetição de SD (aminoácidos 825-1000) e um

5 domínio de âncora (aminoácidos 1009-1056).

Em uma modalidade fragmentos de SdrG incluem

polipeptídeos nos quais o peptídeo de sinal e/ou as repetições de SD e o

domínio de âncora têm sido removidos. Estes incluem polipeptídeos

compreendendo ou consistindo de aminoácidos 50-825, aminoácidos 50-633,

10 aminoácidos 50-597 (SEQ ID NO 2 de WO 03/76470), aminoácidos 273-597

(SEQ ID NO 4 de WO 03/76470), aminoácidos 273-577 (SEQ ID NO 6 de

WO 03/76470) aminoácidos 1-549, aminoácidos 219-549, aminoácidos

225-549, aminoácidos 219-528, aminoácidos 225-528 of SEQ ID NO: 70 ou

20 ou 21.

15 Opcionalmente, um polipeptídeo SdrG possuindo uma

seqüência pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100%

homóloga à seqüência de SEQ ID NO: 70, 20 ou 21 é incorporado na

composição imunogênica da invenção.

As composições da invenção opcionalmente compreendem um

20 fragmento dos polipeptídeos SdrG descritos acima.

Em uma modalidade fragmentos possuem o peptídeo de sinal

e/ou o domínio de repetição de SD e/ou o domínio de âncora deletados. Por

exemplo seqüências correspondendo aos aminoácidos 1713, 1-549, 225-549,

225-529, 24-717, 1-707, 1-690, 1-680, 1-670, 1-660, 1-650, 1-640, 1-630, 1-

25 620, 1-610, 1-600, 34-707, 44-697, 36-689 de SEQ ID 70 ou seqüências

possuindo 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade em

relação à SEQ ID 70 ou 20 ou 21.

Em uma modalidade, fragmentos com o peptídeo de sinal

deletado possuem um resíduo de metionina na terminação-N do fragmento

20

para garantir tradução correta.

Em uma modalidade, o fragmento possui a seguinte seqüência:

MEENSVQDVICDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVINNNQS INTDDNNQ I IKKEETNNYDGIEKRS EDRTEST TN

VDENEATFLQKTPQDNTHLTEEEVKES S SVESSNS S IDTAQQPSHTTINREESVQTSDNVEDSHVSDFANSKI

ICESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSGYTNIDEKISNQDE

LLNLPINEYENKARPLSTTSAQPS IICRVTVNQLAAEQGSNVNHL IKVTDQS ITEGYDDS EGVI KAHDAENL I Y

DVTFEVDDKVKSGDTMTVD IDKNTVPSDLTDS FT I PKI ICDNSGE I IATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIK

AHLICLTSYIDKS KVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSM FTNIDTKNHTVEQT I Y INP

LRY SAKETNVN I S GNGD EG ST

I IDD ST I IKVYKVGDNQNL PDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNNDVNINFGN IDS PYI IKVISKYDPNICDD

YTTIQQTVTMQTTINEYTGEFRTASYDNTIAFSTS SGQGQGDLPPEKTYKIGDYVWEDVDICDGIQNTNDNEKP

LSNVLVTLTYPDGTSKSVRTDEDGICYQFDGLKNGLTYKITFETPEGYTPTLICHSGTNPALDSEGNSVWVTING

QDDMTIDSGFYQTPKYSLGNY

VWYDTNKDGIQGDDEKGISGVICVTLICDENGNIISTTTTDENGKYQFDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDSGD

DDEQDADGEEVHVT I TDHDD F S I DNGY YDDE

EbhA e EbhB

EbhA e EbhB são proteínas que são expressadas em ambas S.

5 aureus e S. epidermidis (Clarke e Foster Infect. Immun. 2002, 70; 6680,

Williams et al. Infect. Immun. 2002, 20; 6805) e que se ligam em

fibronectina. Visto que fibronectina é um componente importante de matrix

extracelular, EbhA e EbhB possuem uma função importante em aderência de

estafilococos em matriz extracelular de hospedeiro.

10 As proteínas Ebh são grandes, possuindo um peso molecular

de 1,1 megadaltons. É vantajoso o uso de um fragmento da proteína Ebh em

vez de a seqüência completa devido à facilidade de produção e de formulação.

A região central da proteína contém repetições imperfeitas que contêm sítios

de ligação de fibronectina. Fragmentos contendo um ou mais dos domínios

15 repetidos descritos abaixo são alguns fragmentos adequados para

incorporação na composição imunogênica da invenção.

Proteínas Ebh contêm unidades de repetição imperfeitas de

127 aminoácidos em comprimento que são caracterizadas por conterem a

seqüência de consenso:

L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...m..L.{33}A

20 ou

21

.{19}L.G.{1o}A.{13}Q.{26}L...m..L.{33}A.{12}

ou

I/V..A...I/V..AK.ALN/DG..NL..AK..A.{6}L..LN.AQK..L..QI/V..A..V..

V.{6}A..LN/D.AM..L...I/V.D/E...TK.S.NY/F.N/DAD..K..AY/F..AV..A..I/V.N

/D

Onde '.' significa qualquer aminoácido e '.{10}' significa

quaisquer 10 aminoácidos e I/V indica escolhas alternativas de aminoácido.

Por referência à seqüência descrita em Kuroda et al. (2001)

5 Lancet 357; 1225-1240, e Tabela 2, as seqüências repetidas dentro de

proteínas Ebh são prontamente deduzidas.

Em uma modalidade, fragmentos a serem incluídos na

composição imunogênica da invenção incluem proteínas contendo de uma,

duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais do que 10 das

10 unidades repetidas de 127 aminoácidos. Tais fragmentos podem consistir de

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais repetições da região repetida de 127

aminoácidos e podem consistir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais

repetições com resíduos de aminoácido adicionais presentes em qualquer uma

das ou em ambas as extremidades do fragmento. Opcionalmente o fragmento

15 é o polipeptídeo H2 de cerca de 44kDa abarcando três repetições

(aminoácidos 3202-3595) como descrito em Clarke et al. Infection and

Immunity 70, 66806687, 2002. Tais fragmentos opcionalmente serão capazes

de se ligarem em fibronectina e/ou de produzirem anticorpos que são reativos

contra a proteína Ebh inteira.

20 As proteínas Ebh são capazes de se ligarem em fibronectina.

Em uma modalidade, fragmentos destas seqüências de polipeptídeos retêm a

capacidade para se ligarem em fibronectina. Ligação em fibronectina pode ser

avaliada por ELISA como descrito por Clarke et al. (Infection and Immunity

70; 6680-6687 2002).

25 Em uma modalidade, o fragmento é um que compreende um

epitopo de célula-T auxiliadora ou célula-B, por exemplo aqueles

22

fragmentos/peptídeos descritos em Tabelas 3 e 4.

TABELA 2 Seqüências de repetição da seqüência de

comprimento total de Ebh.

A seqüência de comprimento total de Ebh é descrita em

5 Kuroda et al. (2001) Lancet 357; 12251240. A seguinte tabela mostra os

resíduos de aminoácido nos quais repetições de 127 aminoácidos começam e

terminam dentro da seqüência de comprimento total.Início Término

1 3204 33302 3331 34573 3457 35834 3583 37095 3709 38356 3835 39617 3961 40878 4200 43269 4326 445210 4452 457811 4578 470412 4704 483013 4830 495614 4956 508215 5082 520816 5208 533417 5334 546018 5460 558619 5585 571120 5711 583721 5837 596322 5963 608923 6089 621524 6215 634125 6341 646726 6467 659327 6593 671928 6719 684529 6845 697130 6971 709731 7097 722332 7223 734933 7349 747534 7475 760135 7601 772736 7727 785337 7852 7978

23

38 7978 810439 8104 823040 8230 835641 8356 848242 8482 860843 8604 873044 8858 8984

Tabela 3 Predição de epitopo de célula-B para uma repetição

de 127 aminoácidos:

A seqüência de comprimento total é descrita em Kuroda et al.

(2001) Lancet 357; 1225-1240. Uma destas repetições, codificada pelos

5 aminoácidos 3204-3331 da seqüência de comprimento total foi escolhida para

realizar a predição de epitopo:

MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQN LQRAKTEATNAITHASDLNQAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQWQSDNYVNADTNKKNDYNNAYNHANDIINGNAQHPVI

Início TérminoSeqüência de epitopo Iniciação Terminação5 10 TVNQKA 3208 321314 19 KSTKDA 3217 322221 33 DGQQNLQRAKTEA 3224 323642 51 DLNQAQKNAL 3245 325466 74 DIKQTTQSL 3269 3277100 112 ADTNKKNDYNNAY 3303 3315117 123 DIINGNA 3320 3326

- As colunas "Início" e "Término" apresentam a posição dos

epitopos de célula-B preditos na repetição de 127 aminoácidos.

- As colunas "Iniciação" e "Terminação" apresentam a posição

10 dos epitopos de célula-B preditos na seqüência de comprimento total de Ebh

Tabela 4 Predição de epitopo de célula-T auxiliadora em Ebh:

A seqüência de comprimento total é descrita no bando de

dados TrEMBL, referência de seqüência Q8NWQ6. Uma destas repetições,1 . 1,1 dl ,"/ 1 1 • • "codificada pelc

• 1

•MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDLNQAQKNALTQQ'

15 foi escolhida p sAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQVVQSDNYVNADTNKKNDYNNHANDIINGNAQHPVI

Posição na repetição Seqüência de epitopo Posição na seqüência1 MDVNTVNQK 32043 VNTVNQKAA 3206

24

6 VNQKAASVK 320926 LQRAKTEAT 322937 ITHASDLNQ 324043 LNQAQKNAL 324651 LTQQVNSAQ 325455 VNSAQNVHA 325861 VHAVNDIKQ 326464 VNDIKQTTQ 326767 IKQTTQSLN 327074 LNTAMTGLK 327778 MTGLKRGVA 328181 LKRGVANHN 328485 VANHNQWQ 328891 WQSDNYVN 329492 VQSDNYVNA 329597 YVNADTNKK 330198 VNADTNKKN 3302108 YNNAYNHAN 3311112 YNHANDIIN 3315118 IINGNAQHP 3321119 INGNAQHPV 3322

- A coluna "Posição na repetição ' apresenta a posição dos

epitopos de célula-T preditos na repetição

- A coluna "Posição na seqüência" apresenta a posição dos

epitopos de célula-T preditos na seqüência de comprimento total de Ebh

5 Fragmentos das proteínas da invenção podem ser

empregados para produzir o polipeptídeo de comprimento total

correspondente por síntese de peptídeo; portanto, estes fragmentos

podem ser empregados como intermediários para produzir as proteínas de

comprimento total da invenção.

10 Em uma modalidade, são usadas variantes nas quais vários, 5-

10, 1-5, 1-3, 1-2 ou 1 aminoácidos são substituídos, deletados, ou adicionados

em qualquer combinação.

Proteína ligante de elastina (EbpS)

EbpS é uma proteína contendo 486 aminoácidos com um peso

15 molecular de 83kDa. Está associada com a membrana citoplasmática de S.

aureus e possui três regiões hidrofóbicas que mantêm a proteína na membrana

(Downer et al. 2002, J. Biol. Chem. 277; 243; Park et al. 1996, J. Biol. Chem.

25

271; 15803).

Duas regiões entre aminoácidos 1-205 e 343-486 estão

expostas na superfície sobre a face externa da membrana citoplásmica. O

domínio de ligação de ligante de EbpS está localizado entre os resíduos 14-34

5 na terminação-N (Park et al. 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845).

Em uma modalidade, o fragmento a ser incorporado na

composição imunogênica da invenção é o fragmento exposto na superfície

contendo a região de ligação de elastina (aminoácidos 1-205). Opcionalmente

os fragmentos não contêm a alça exposta inteira mas devem conter a região de

10 ligação de elastina (aminoácidos 14-34). Um fragmento alternativo que

poderia ser usado consiste de aminoácidos formando a segunda alça exposta

na superfície (aminoácidos 343-486). Fragmentos alternativos contendo até 1,

2, 5, 10, 20, 50 aminoácidos menos em uma ou ambas as extremidades

também são possíveis.

15 Receptores de laminina

O receptor de laminina de S. aureus desempenha um papel

importante em patogenicidade. Uma feição característica da infecção é

invasão de corrente sanguínea que permite formação de abscesso metastático

disseminada. Invasão de corrente sanguínea requer a capacidade para

20 extravasar através da membrana basal vascular. Isto é realizado através da

ligação em laminina por intermédio do receptor de laminina (Lopes et al.

Science 1985, 229; 275).

Receptores de laminina estão expostos em superfície e estão

presentes em muitas cepas de estafilococos incluindo S. aureus e S.

25 epidermidis.

SBI

Sbi é uma segunda proteína ligante de IgG em adição à

proteína A e é expressada na maioria das cepas de S. aureus (Zhang et al.

1998, Microbiology 144; 985).

26

A terminação-N da seqüência de Sbi possui uma seqüência de

sinal típica com um sítio de clivagem após aminoácido 29. Portanto um

fragmento de Sbi que poderia ser usado em uma composição imunogênica da

invenção inicia no resíduo de aminoácido 30, 31, 32 ou 33 e continua até a

5 terminação-C de Sbi, por exemplo de SEQ ID NO: 26.

O domínio ligante de IgG de Sbi tem sido identificado como

uma região na direção de terminação-N da proteína dos aminoácidos 41-92.

Este domínio é homólogo aos domínios ligantes de IgG de proteína A.

O domínio ligante de IgG mínimo de Sbi contém a seguinte

10 seqüência:

QTTQNNYVTDQQKAFYQVLHLKGITEEQRNQYIKTLREHPERAQEVFSESLK

** *** * *** * *

* - denota aminoácidos que são similares entre os domínios

ligantes de IgG

Em uma modalidade, um fragmento de Sbi a ser incluído na

composição imunogênica da invenção contém um domínio ligante de IgG.

15 Este fragmento contém a seqüência de consenso para um domínio ligante de

IgG como designado por como mostrado na seqüência acima.

Opcionalmente o fragmento contém ou consiste da seqüência completa

mostrada acima. Opcionalmente, o fragmento contém ou consiste de

aminoácidos 30-92, 33-92, 30-94, 33-94, 30-146, 33-146, 30-150, 33-150, 30-

20 160, 33-160, 33-170, 33-180, 33-190, 33-200, 33-205 ou 33-210 de Sbi, por

exemplo de SEQ ID NO:26.

Um fragmento pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10

substituições de aminoácido das seqüências indicadas.

Um fragmento pode conter repetições múltiplas (2, 3, 4, 5, 6,

25 7,8, 9 ou 10) do domínio ligante de IgG.

EFB - FIB

Fib é uma proteína ligante de fibrinogênio de 19kDa que é

27

secretada para dentro do meio extracelular por S. aureus. É produzida por

todos os isolados de S. aureus testados (Wastfelt e Flock 1995, J. Clin.

Microbiol. 33; 2347).

S. aureus agrupa-se na presença de fibrinogênio e liga-se em

5 superfícies revestidas com fibrinogênio. Esta capacidade facilita a

colonização estafilocepa estafilocócica de cateteres e células endoteliais.

Fib contém uma seqüência de sinal na terminação-N da

proteína com um sítio de clivagem putativo a cerca do aminoácido 30. Em

uma modalidade, a composição imunogênica da invenção compreende ou

10 consiste da seqüência da proteína madura (de cerca de aminoácido 30 até a

terminação-C da proteína).

Fbe - EfB/FIG

Fbe é uma proteína ligante de fibrinogênio que é encontrada

em muitos isolados de S. epidermidis e possui um peso molecular deduzido de

15 119 kDa (Nilsson et al. 1998. Infect. Immun. 66; 2666). Sua seqüência está

relacionada com aquela do fator de agrupamento de S. aureus (CTfA).

Anticorpos contra Fbe podem bloquear a ligação de S. epidermidis em placas

revestidas com fibrinogênio e em cateteres (Pei e Flock 2001, J. Infect. Dis.

184; 52).

20 Fbe possui uma seqüência de sinal putativa com um sítio de

clivagem entre aminoácidos 51 e 52. Portanto um fragmento potencial de Fbe

contém a forma madura de Fbe se estendendo do aminoácido 52 até a

terminação-C (aminoácido 1.092).

O domínio de Fbe do aminoácido 52 até o aminoácido 825 é

25 responsável pela ligação de fibrinogênio. Em uma modalidade, o fragmento

de Fbe consiste de ou contém aminoácidos 52825.

A região entre aminoácido 373 e 516 de Fbe mostra a

conservação maior entre Fbe e CTfA. Em uma modalidade, o fragmento

contém aminoácidos 373-516 de Fbe.

28

Aminoácidos 825 - 1041 de Fbe contêm uma região

elevadamente repetitiva composta de resíduos de ácido aspártico e de serina

serialmente repetidos.

IsaA/PisA

5 IsaA é uma proteína de 29kDa, também conhecida como PisA

que, como tem sido mostrado, é uma proteína estafilocócica imunodominante

durante sepsia em pacientes hospitalizados (Lorenz et al. 2000, FEMS

Immunol. Med. Microb. 29; 145).

Os primeiros 29 aminoácidos da seqüência de IsaA são

10 considerados como sendo uma seqüência de sinal. Em uma modalidade, o

fragmento de IsaA a ser incluído em uma composição imunogênica da

invenção contém resíduos de aminoácido 30 em diante, até o final da

seqüência codificada.

Proteína ligante de fibronectina

15 Proteína A ligante de fibronectina contém vários domínios que

estão envolvidos em ligação de fibronectina (WO 94/18327). Estes são

chamados de Dl, D2, D3 e D4. Em uma modalidade fragmentos de proteína

A ou B ligante de fibronectina compreendem ou consistem de Dl, D2, D3,

D4, Dl-D2, D2-D3, D3-D4, Dl-D3, D2-D4 ou Dl-D4.

20 Proteína ligante de fibronectina contém uma seqüência de sinal

de 36 aminoácidos. Por exemplo:

VKNNLRYGIRKFIKLGAASVFLGTMIVVGMGQDKEAA

Opcionalmente, a proteína madura omitindo esta seqüência de

sinal é incluída na composição imunogênica da invenção.

25 Proteínas transportadoras

A parede celular de bactérias Gram-positivas atua como uma

barreira prevenindo a difusão livre de metabólitos para dentro da bactéria.

Uma família proteínas orquestra a passagem de nutrientes essenciais para

dentro da bactéria e são portanto essenciais para a viabilidade da bactéria. O

29

termo proteína transportadora cobre proteínas envolvidas na etapa inicial de

ligação em metabólitos tal como ferro bem como aquelas envolvida em

transporte real do metabólito para dentro da bactéria.

Ferro molecular é um co-fator essencial para crescimento

5 bacteriano. São secretados sideróforos que se ligam em ferro livre e então são

capturados por receptores de superfície bacteriana que liberam ferro para

transporte através da membrana citoplásmica. Aquisição de ferro é crítica

para o estabelecimento de infecções humanas de modo que a geração de uma

resposta imune contra esta classe de proteínas leva a uma perda de viabilidade

10 estafilocepa estafilocócica.

Exemplos de proteínas transportadoras incluem transportador

Imunodominante ABC (Burnie et al. 2000 Infect. Immun. 68; 3200), IsdA

(Mazmanian et al. 2002 PNAS 99; 2293), IsdB (Mazmanian et al. 2002 PNAS

99; 2293), IsdC (WO 06/59247), transportador de Mg2+, SitC (Wiltshire e

15 Foster 2001 Infect. Immun. 69; 5198) e transportador Ni ABC.

Transportador Imunodominante ABC

Transportador Imunodominante ABC é uma proteína bem

conservada que pode ser capaz de gerar uma resposta imune que é protetora

cruzada contra diferentes cepas estafilocócicas (Mei et al. 1997, Mol.

20 Microbiol. 26; 399). Anticorpos contra esta proteína têm sido encontrados em

pacientes com septicemia (Burnie et al. 2000, Infect. Immun. 68; 3200).

Fragmentos opcionais de transportador imunodominante ABC

incluirão os peptídeos DRHFLN, GNYD, RRYPF, KTTLLK, GVTTSLS,

VDWLR, RGFL, KIKVYVGNYDFWYQS, TV1VVSHDRHFLYNNV e/ou

25 TETFLRGFLGRWILFS porque estas seqüências contêm epitopos que são

reconhecidos pelo sistema imune humano.

IsdA-IsdB

Os genes isd (determinante de superfície regulado por ferro) de

S. aureus codificam proteínas responsáveis pela ligação de hemoglobina e

30

passagem de ferro de hemoglobina para o citoplasma, onde atua como um

nutriente essencial. IsdA e IsdB estão localizadas na parede celular de

estafilococos . IsdA parece estar exposta sobre a superfície de bactéria porque

é suscetível à digestão por proteinase K. IsdB foi parcialmente digerida

5 sugerindo que está parcialmente exposta sobre a superfície da bactéria

(Mazmanian et al. 2003 Science 299; 906).

IsdA e IsdB são ambas proteínas de 29kDa que se ligam em

hemoglobina. Sua expressão é regulada pela disponibilidade de ferro via o

repressor Fur. Sua expressão será alta durante infecção em um hospedeiro

10 onde a concentração de ferro será baixa.

Também são conhecidas como FrpA e FrpB (Morrissey et al.

2002, Infect. Immun. 70; 2399). FrpA e FrpB são as proteínas de superfície

maiores com uma carga alta. Tem sido mostrado que proporcionam uma

contribuição maior para adesão em plástico.

15 Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção

compreende um fragmento de IsdA e/ou IsdB que é descrito em WO

01/98499 ou WO 03/11899.

Toxinas e reguladores de virulência

Membros desta família de proteínas incluem toxina tais como

20 alfa-toxina, hemolisina, enterotoxina B e TSST-1 bem como as proteínas que

regulam a produção de toxinas tal como RAP.

Alfa-toxina (Fila)

Alfa-toxina é um determinante de virulência importante

produzido pela maioria das cepas de S. aureus. É uma toxina formadora de

25 poro com atividade hemolítica. Tem sido mostrado que anticorpos contra alfa-

toxina neutralizam os efeitos prejudiciais e letais de alfa-toxina em modelos

animais (Adlam et al. 1977 Infect. Immun. 17; 250). Plaquetas, células

endoteliais e células mononucleares de humano são suscetíveis aos efeitos de

alfa-toxina.

31

A toxicidade alta de alfa-toxina requer que ela deve ser

destoxificada antes de ser usada como um imunógeno. Isto pode ser realizado

por tratamento químico, por exemplo por tratamento com formaldeído,

glutaraldeído de outros reagentes reticulantes ou por conjugação química dela

5 em polissacarídeos bacterianos como descrito abaixo.

Uma outra maneira de remover a toxicidade é introduzir mutações

pontuais que removem a toxicidade ao mesmo tempo retendo a antigenicidade da

toxina. A introdução de uma mutação pontual em aminoácido 35 de alfa-toxina

onde um resíduo de histidina é substituído por um resíduo de leucina resulta na

10 remoção de toxicidade simultaneamente restando a imunogenicidade (Menzies e

Kernodle 1996; Infect. Immun. 64; 1839). Histidina 35 parece ser crítica para

oligomerização apropriada requerida para formação de poro e mutação deste

resíduo leva à perda de toxicidade.

Quando incorporada em composições imunogênicas da

15 invenção, alfa-toxina é opcionalmente destoxificada por mutação de His 35,

por exemplo por substituição de His 35 por Leu ou Arg. Em uma modalidade

alternativa, alfa-toxina é destoxificada por conjugação em outros

componentes da composição imunogênica, por exemplo polissacarídeos

capsulares ou PNAG, opcionalmente em polissacarídeo de tipo 5 de S. aureus

20 type e/ou PNAG e/ou polissacarídeo de tipo 8 de S. aureus.

Proteína ativadora de RNA III (RAP)

RAP em si mesma não é uma toxina, mas é uma reguladora da

expressão de fatores de virulência. RAP é produzida e secretada por

estafilococos. Ativa o sistema regulatório agr de outros estafilococos e ativa a

25 expressão e a subseqüente liberação de fatores de virulência tais como

hemolisina, enterotoxina B e TSST-1.

Outras proteínas imunodominantes

Proteína associada à acumulação (Aap)

Aap é uma proteína de 140kDa que é essencial para a

32

acumulação de cepas de S. epidermidis sobre superfícies (Hussain et al.

Infect. Immun. 1997, 65; 519). Cepas expressando esta proteína produziram

quantidades significativamente maiores de biofilme e Aap parece estar

envolvida em formação de biofilme. Anticorpos contra Aap são capazes de

5 inibir a formação de biofilme e de inibir a acumulação de S. epidermidis.

Antígeno secretório estafilocepa estafilocócica SsaA

SsaA é uma proteína fortemente imunogênica de 30kDa

encontrada em ambas S. aureus e S. epidermidis (Lang et al. 2000 FEMS

Immunol. Med. Microbiol. 29; 213). Sua expressão durante endocardite

10 sugeriu um papel de virulência específico para as patogêneses da doença

infecciosa.

SsaA contém uma seqüência líder N-terminal e um sítio de

clivagem por peptídade se sinal. O peptídeo líder é seguido por uma região

hidrofilica de aproximadamente 100 aminoácidos do resíduo 30 até o resíduo

15 130.

Um fragmento opcional de SsaA a ser inserido na composição

imunogênica da invenção é composto da proteína madura (aminoácidos 27 até

terminação-C ou aminoácidos 30 até terminação-C).

Um outro fragmento opcional contém a área hidrofilica de

20 SsaA desde o aminoácido 30 até o aminoácido 130.

Combinações

Infecções estafilocócicas progridem através de vários estágios

diferentes. Por exemplo, o ciclo de vida estafilocepa estafilocócica envolve

colonização comensal, iniciação de infecção pelo acesso aos tecidos

25 conjuntivos ou à corrente sanguínea, multiplicação anaeróbica no sangue,

interação entre determinantes de virulência de S. aureus e os mecanismos de

defesa do hospedeiro e indução de complicações incluindo endocardite,

formação de abscesso metastático e síndrome de sepsia. Moléculas diferentes

sobre a superficie da bactéria estarão envolvidas em diferentes etapas do ciclo

33

de infecção. Pela seleção da resposta imune contra uma combinação de

antígenos particulares envolvidos em processos diferentes de infecção

estafilocócica, múltiplos aspectos de função estafilocepa estafilocócica são

afetados e isto pode resultar em boa eficácia de vacina.

5 Em particular, combinações de certos antígenos de classes

diferentes, alguns dos quais estão envolvidos em adesão em células

hospedeiras, alguns dos quais estão envolvidos em aquisição de ferro ou

outras funções de transporte, alguns dos quais são toxinas ou reguladores de

virulência e antígenos imunodominantes podem produzir uma resposta imune

10 que protege contra os múltiplos estágios de infecção.

Algumas combinações de antígenos são particularmente

efetivas em indução de uma resposta imune. Esta pode ser medida por

qualquer um dos ensaios de modelo animal como descrito nos exemplos e/ou

usando um ensaio opsonofagocítico como descrito nos exemplos. Sem o

15 desejo de estar ligado à teoria, considera-se que tais combinações efetivas de

antígenos são permitidas por numerosas características da resposta imune à

combinação de antígenos. Os próprios antígenos são normalmente expostos

sobre a superfície de células estafilocócicas, tendem a ser conservados mas

também tendem a não estarem presentes em quantidade suficiente sobre a

20 superfície celular para uma resposta bactericida ótima ocorrer usando

anticorpos produzidos contra o antígeno único. Combinação dos antígenos da

invenção pode resultar na formulação produzindo uma combinação vantajosa

de anticorpos que interagem com a célula estafilocepa estafilocócica além de

um limite crítico. Neste nível crítico, anticorpos suficientes de qualidade

25 suficiente se ligam na superfície da bactéria para permitirem quer extermínio

eficiente por complemento quer neutralização da bactéria. Isto pode ser

medido quer em modelo de desafio animal quer em um ensaio de opsonização

como descrito nos exemplos.

Composições imunogênicas da invenção preferidas

34

compreendem uma pluralidade de proteínas selecionadas de pelo menos duas

categorias diferentes de proteína, possuindo funções diferentes dentro de

estafilococos. Exemplos de tais categorias de proteínas são proteínas ligantes

extracelulares, proteínas transportadoras tais como proteínas de aquisição de

5 Fe, toxinas ou reguladores de virulência e outras proteínas imunodominantes.

Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica da

invenção adicionalmente compreende um número de proteínas igual a ou

maior do que 2, 3, 4, 5 ou 6 selecionadas de 2, 3 ou 4 grupos diferentes

selecionados de:

10 • Grupo a) proteínas ligantes de componente extracelular;

• Grupo b) proteínas transportadoras;

• Grupo c) toxinas ou reguladores de virulência

• Grupo d) proteínas estruturais.


15 invenção adicionalmente compreende um número de proteínas igual a ou

maior do que 2, 3, 4, 5 ou 6 selecionadas de 2, 3 ou 4 dos seguintes grupos:

• grupo a) - pelo menos uma proteína ligante de componente

extracelular estafilocepa estafilocócica ou seu fragmento selecionada do

grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de

20 salivalSitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB

(FM), SBI, CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, lipase GehD, SasA,

SasB, SasC, SasD, SasK, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA,

SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína

ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP;

25 • grupo b) - pelo menos uma proteína transportadora

estafilocepa estafilocócica ou seu fragmento selecionada do grupo consistindo

de transportador Imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, transportador de

Mg2+, HarA, SitC e transportador Ni ABC;

• grupo c) - pelo menos um regulador de virulência

35

estafilocepa estafilocócica, toxina ou seu fragmento selecionado do grupo

consistindo de alfa-toxina (Hla), mutante H35R de alfa-toxina, proteína

ativadora de RNA III (RAP);

• grupo d) - pelo menos uma proteína estrutural estafilocepa

5 estafilocócica ou seu fragmento imunogênico selecionada do grupo

consistindo de MRPII e autolisina.


invenção compreende um número de proteínas igual a ou maior do que 2, 3,

4, 5 ou 6 selecionadas de 2 ou 3 dos seguintes grupos:

10 • grupo a) - pelo menos uma proteína ligante de componente

extracelular estafilocepa estafilocócica ou seu fragmento imunogênico

selecionada do grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de

saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB

(FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, Lipase

15 GehD, SasA„ SasB, SasC, SasD, SasK, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA,

Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de

Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP;

• grupo b) - pelo menos uma proteína transportadora

estafilocepa estafilocócica ou seu fragmento imunogênico selecionada do

20 grupo consistindo de transportador Imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC,

HarA, transportador de Mg2÷, SitC e transportador Ni ABC;

• grupo c) - pelo menos um regulador de virulência

estafilocepa estafilocócica, toxina ou seu fragmento imunogênico selecionado

do grupo consistindo de alfa-toxina (Hla), mutante H35R de alfa-toxina,

25 proteína ativadora de RNA III (RAP).


invenção contém pelo menos uma proteína selecionada de grupo a) e uma

proteína adicional selecionada de grupo b) e/ou grupo c).

Em uma outra modalidade, a composição imunogênica da

36

invenção contém pelo menos um antígeno selecionado de grupo b) e uma

proteína adicional selecionada de grupo c) e/ou grupo a).

Em uma outra modalidade, a composição imunogênica da

invenção contém pelo menos um antígeno selecionado de grupo c) e uma

5 proteína adicional selecionada de grupo a) e/ou grupo b).

Uma combinação opcional de proteínas na composição

imunogênica da invenção compreende receptor de laminina e 1, 2, 3, 4 ou 5

outros antígenos selecionados do grupo consistindo de transportador

imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,

10 transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,

RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação de proteínas na composição

imunogênica da invenção compreende SitC e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos

selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,

15 IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,

alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.


imunogênica da invenção compreende EbhA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende EbhB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende EbpS e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos


37

IsdA, IsdB, IsdA, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,



imunogênica da invenção compreende EFB(FIB) e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros

5 antígenos selecionados do grupo consistindo de transportador


transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,

RAP, Aap e SsaA.


10 imunogênica da invenção compreende SBI e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos


IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2÷, SitC, transportador Ni ABC,



15 imunogênica da invenção compreende autolisina e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros

antígenos selecionados do grupo consistindo de transportador



RAP, Aap e SsaA.

20 Uma outra combinação de proteínas na composição

imunogênica da invenção compreende CTfA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos


IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,



imunogênica da invenção compreende SdrC e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos




38


imunogênica da invenção compreende SdrD e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos



5 alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.


imunogênica da invenção compreende SdrE e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende SdrG e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos


IsdA, IsdB, IsdC. HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,

15 alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina e RAP.


imunogênica da invenção compreende SdrH e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende SasF e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende Lipase GehD e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros



39


RAP, Aap e SsaA.


imunogênica da invenção compreende SasF e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos

5 selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,




imunogênica da invenção compreende FnbA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende FnbB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende Cna e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende ClfB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende FbpA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos

40





5 imunogênica da invenção compreende Npase e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





10 imunogênica da invenção compreende IsaA/PisA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros




RAP, Aap e SsaA.


imunogênica da invenção compreende SsaA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende EPB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende SSP-1 e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos




41


imunogênica da invenção compreende SSP-2 e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende HPB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende proteína ligante de Vitronectina e 1, 2,

3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados do grupo consistindo de transportador


15 transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,

RAP, Aap e SsaA.


imunogênica da invenção compreende proteína ligante de fibrinogênio e 1, 2,

3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados do grupo consistindo de transportador

20 imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,


RAP, Aap e SsaA.


imunogênica da invenção compreende coagulase e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros

25 antígenos selecionados do grupo consistindo de transportador



RAP, Aap e SsaA.


42

imunogênica da invenção compreende Fig e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende MAP e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos





imunogênica da invenção compreende transportador imunodominante ABC e

1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados do grupo consistindo de receptor

de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína

ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrD,

15 SdrE, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CTfA, C1fB,

FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de

Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa-

toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.


20 imunogênica da invenção compreende IsdA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos

selecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de


(FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrC, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, Lipase

GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CTfA, C1FB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA,

25 EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante

de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de

alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.


imunogênica da invenção compreende IsdB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos

43

selecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de


(FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrG, SdrH, SasF, Lipase GehD, SasA,

FnbA, FnbB, Cna, CTfA, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1,

5 SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de

fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de



imunogênica da invenção compreende SitC e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos

10 selecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, Proteína ligante

de saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB


GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CTfA, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA,

EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante

15 de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa-toxina, mutante H3 5R ou H3 5L de



imunogênica da invenção compreende alfa-toxina e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros

antígenos selecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, proteína

20 ligante de saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina

(EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH,

SasF, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA,

SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína

ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, transportador imunodominante

25 ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2÷, SitC, transportador Ni

ABC, Aap e SsaA.


imunogênica da invenção compreende variante H35L ou H35R dealfa-toxina

e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados do grupo consistindo de

44

receptor de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB,

proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC,

SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, Lipase GehD, SasA, FribA, FnbB, Cna, ClfB,


5 Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP,

transportador imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador

de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC, Aap e SsaA.


imunogênica da invenção compreende RAP e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos

10 selecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de

saliva/SitC/NIntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB


GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB,

SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de

15 fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, transportador imunodominante ABC,


Aap e SsaA.

Outras combinações de proteína na composição imunogênica

da invenção compreendem IsdA e IsdB; IsdA e CTfA; IsdA e ClfB; IsdA e

20 SdrC; IsdA e SdrD; IsdA e SdrE; IsdA e SdrG; IsdA e SasF;IsdB e CTfA;

IsdB e ClfB; IsdB e SdrC; IsdB e SdrD; IsdB e SdrE; IsdB e SdrG; IsdB e

SasF; CTfA e ClfB; CTfA e SdrC; CTfA e SdrD; CTfA e SdrE; CTfA e SasF;

ClfB e SdrC; ClfB e SdrD; ClfB e SdrE; ClfB e SasF; SdrC e SdrD; SdrC e

SdrE; SdrC e SasF; SdrD e SdrE; SdrD e SasF; SdrE e SasF.

25 Nas combinações acima e abaixo, as proteínas especificadas

podem estar opcionalmente presentes na composição imunogênica da

invenção como um fragmento ou uma proteína de fusão como descrito acima.

Combinações de três proteínas


45

adicionalmente compreende três componentes de proteína em uma

combinação de alfa-toxina, uma proteína ligante de componente extracelular

(por exemplo uma adesina) e uma proteína transportadora (por exemplo uma

proteína ligante de ferro).

5 Em uma tal combinação, a alfa-toxina pode ser quimicamente

destoxificada ou geneticamente destoxificada por introdução de mutação(ões)

pontual(ais), por exemplo a mutação pontual de His35Leu. A alfa-toxina está

presente como uma proteína livre ou alternativamente está conjugada em um

componente polissacarídeo ou PNAG da composição imunogênica.

10 Exemplos de combinações incluem:

Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,

IsdA e uma proteína ligante de componente extracelular selecionada do grupo

consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC,

EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina,

15 CTfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB,


Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP.


IsdB e uma proteína ligante de componente extracelular selecionada do grupo

20 consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC,


CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB,

Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP,

proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase,

25 Fig e MAP.


IsdA e uma adesina selecionada do grupo consistindo de receptor de laminina,

EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), CTfA, SdrC,

SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, autolisina, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase,

46

SSP-1, SSP-2, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de

fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP.


IsdB e uma adesina selecionada do grupo consistindo de receptor de laminina,

5 EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), autolisina,

CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase,

SSP-1, SSP-2, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de

fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP.


10 IsdA e receptor de laminina.


IsdA e EbhA.


IsdA e EbhB.

15 Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,

IsdA e EbpS.


IsdA e EFB (FIB).


20 IsdA e SdrG.


IsdA e CTfA.


IsdA e ClfB.

25 Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,

IsdA e FnbA.


IsdA e coagulase.


47

IsdA e Fig.

IsdA e SdrH.

5 IsdA e SdrC.

IsdA e SdrD.

IsdA e SdrE.

10

IsdA e MAP.






Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e Sbi.

Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e IsdB.

Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e IsdA.

15 Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e SdrC.

Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e Ebh ou

seu fragmento como descrito acima.

Uma composição imunogênica compreendendo Sbi e SdrC.

Uma composição imunogênica compreendendo Sbi e Ebh ou

20 seu fragmento como descrito acima.

Uma composição imunogênica da invenção compreendendo

IsaA, Sbi ou SdrC.

Seleção de antígenos expressados em linhagens clonais

diferentes

25 Análise da ocorrência de fatores de virulência em relação com

a estrutura de população de Staphylococcus aureus mostrou presença variável

de genes de virulência em populações naturais de S. aureus.

Dentre os isolados clínicos de Staphylococcus aureus, foi

mostrado que pelo menos cinco linhagens clonais são elevadamente

48

prevalentes (Booth et al., 2001 Infect Immun. 69(1):345-52). Foi mostrado

que alfa-hemolisina (hla), proteína A ligante de fibronectina (fnbA) e fator A

agrupante (c1fA) estão presentes na maioria dos isolados de identidade de

linhagem, sugerindo um papel importante destas proteínas na sobrevivência

5 de S. aureus (Booth et al., 2001 Infect Immun. 69(1):345-52). Além disso, de

acordo com Peacock et al. 2002 pareceu que as distribuições de fnbA, ctfA,

coagulase, spa, map, pvl (leucocidina de Panton-Valentine), hlg (gama-

toxina), alfa-toxina e ica não estão relacionadas com a estrutura clonal

subjacente sugerindo transferência horizontal considerável destes genes.

10 Em contrário, outros genes de virulência tal como proteína B

ligante de fibronectina (fnbB), beta-hemolisina (hlb), proteína ligante de

colágeno (cna), TSST-1 (tst) e gene de resistência a meticilina (mecA) estão

fortemente associados com linhagens específicas (Booth et al., 2001 Infect.

Immun. 69(1):345-52). Similarmente, Peacock et al. 2002 (Infect. Immun.

15 70(9):4987-96) mostraram que as distribuições das enterotoxinas, tst, das

exfolatinas (eta e etb), beta- e delta-toxinas, dos genes sdr (sdrD, sdrE e bbp),

cna, ebpS e efb dentro da população estão todas elevadamente

significativamente relacionadas com complexos clonais derivados de MLST.

Dados de NILST não proporcionam evidência de que cepas

20 responsáveis por doença nosocomial representam uma subpopulação distinta

das cepas causadoras de doença adquirida em comunidade ou cepas

recuperadas de veículos assintomáticos (Feil et al., 2003 J Bacteriol.

185(11):3307-16).

Em uma modalidade, composições imunogênicas da invenção

25 são efetivas contra estafilococos de linhagens clonais diferentes.

Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende

1, 2, 3, 4, ou pelo menos 1 proteína que é expressada na maioria dos isolados

de estafilococos. Exemplos de tais proteínas incluem alfa-hemolisina (hla),

proteína A ligante de fibronectina (fnbA) e fator A agrupante (ctfA),

49

coagulase, spa, map, pvl (leucocidina de Panton-Valentine), hlg (gama-

toxina), ica, transportador imunodominante ABC, RAP, autolisina (Rupp et

al. 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), receptores de laminina, SitC, IsaA/PisA,

SPOIIIE O, SsaA, EbpS, SasF (Roche et al. 2003, Microbiology 149; 643),

5 EFB(FIB), SBI, C1fB, IsdA, IsdB, FnbB, Npase, EBP, proteína II ligante sialo

de Osso, IsaB/PisB (Lorenz et al. FEMS Immuno. Med. Microb. 2000, 29;

145), SasH (Roche et al. 2003, Microbiology 149; 643), MRPI, SasD (Roche

et al. 2003, Microbiology 149; 643), SasH (Roche et al. 2003, Microbiology

149; 643), precursor aureolisina (AUR)/Seppl e autolisina nova.

10 Em uma modalidade alternativa, 2 ou mais proteínas que são

expressadas em conjuntos diferentes de cepas clonais são incluídas na

composição imunogênica da invenção. Opcionalmente a combinação de

antígenos permitirá que seja gerada uma resposta imune que é efetiva contra

múltiplas cepas clonais, ou contra todas as cepas clonais. Por exemplo

15 combinações incluem FnbB e beta-hemolisina, FnbB e Cna, FnbB e TSST-1,

FnbB e mecA, FnbB e SdrD, FnbB e SdrF, FnbB e EbpS, FnbB e Efb, beta-

hemolisina e Cna, beta-hemolisina e TSST-1, beta-hemolisina e mecA, beta-

hemolisina e SdrD, beta-hemolisina e SdrF, beta-hemolisina e EbpS, beta-

hemolisina e Efb, Cna e TSST-1, Cna e mecA, Cna e SdrD, Cna e SdrF, Cna

20 e EbpS, Cna e Efb, TSST-1 e mecA, TSST-1 e SdrD, TSST-1 e SdrF, TSST-1

e EbpS, TssT-1 e Efb, MecA e SdrD, MecA e SdrF, MecA e EbpS, MecA e

Efb, SdrD e SdrF, SdrD e EbpS, SdeD e Efb, SdrF e EbpS, SdrF e Efb, e,

EbpS e Efb.

As combinações descritas acima podem ser combinadas com

25 componentes adicionais descritos acima.

Proteção contra S. aureus e S. epidermidis

Em uma modalidade da invenção a composição imunogênica

proporciona uma resposta imune efetiva contra mais do que uma cepa de

estafilococos, por exemplo contra cepas de ambas S. aureus e S. epidermidis.

50

Por exemplo, uma resposta imune protetora é gerada contra sorotipos de tipos

5 e 8 de S. aureus.

Um uso da composição imunogênica da invenção é prevenir

infecções nosocomiais, por exemplo em pacientes eletivos para cirurgia, por

5 inoculação antes do tratamento hospitalar. Neste estágio, é dificil predizer

acuradamente a quais cepas estafilocócicas o paciente será exposto. Portanto é

vantajosa a inoculação com uma vacina que é capaz de gerar uma resposta

imune efetiva contra várias cepas de estafilococos.

Uma resposta imune efetiva é definida como uma resposta

10 imune que dá proteção significativa em um modelo de desafio de

camundongo ou ensaio de opsonofagocitose como descrito nos exemplos.

Proteção significativa em um modelo de desafio de camundongo, -por

exemplo aquele do exemplo 5, é definida como um aumento na LD50 em

comparação com os camundongos inoculados com veículo de pelo menos

15 10%, 20%, 50%, 100% ou 200%. Proteção significativa em um modelo de

desafio de rato de algodão, por exemplo aquele de exemplo 8, é definida

como um decréscimo de LogCFU/nariz médio observado de pelo menos 10%,

20%, 50%, 70% ou 90%. É sabido que a presença de anticorpos de

opsonização está correlacionada com a proteção, portanto proteção

20 significativa é indicada por um decréscimo na contagem bacteriana de pelo

menos 10%, 20%, 50%, 70% ou 90% em um ensaio de opsonofagocitose, por

exemplo aquele de exemplo 7.

Várias das proteínas incluindo transportador imunodominante

ABC, proteína ativadora de RNA III, receptores de laminina, SitC, IsaA/PisA,

25 SsaA, EbhA/EbhB, EbpS e Aap estão bem conservadas entre S. aureus e S.

epidermidis e exemplo 8 mostra que IsaA, CTfA, IsdB, SdrG, HarA, FnbpA e

Sbi podem gerar resposta imune reativa cruzada (por exemplo reativa cruzada

entre pelo menos uma cepa de S. aureus e pelo menos uma cepa de S.

epidermidis). PIA também está bem conservada entre S. aureus e S.

51

epidermidis.

Portanto em uma modalidade, a composição imunogênica da

invenção compreenderá PNAG e polissacarídeos dos tipos 5 e 8 e uma, duas,

três ou quatro das proteínas acima.

5 Vacinas


é misturada com um excipiente farmaceuticamente aceitável, e opcionalmente

com um adjuvante para formar uma vacina.

As vacinas da presente invenção podem ser adjuvantadas,

10 particularmente quando intencionadas para uso em uma população idosa mas

também para emprego em populações infantis. Adjuvantes adequados

incluem um sal de alumínio tal como gel de hidróxido de alumínio ou fosfato

de alumínio ou alume, mas também podem ser outros sais de metal tais como

aqueles de cálcio, de magnésio, de ferro ou de zinco, ou podem ser uma

15 suspensão insolúvel de tirosina acilada, ou açúcares acilados, sacarídeos

catiônica ou anionicamente derivados, ou polifosfazenos.

É preferido que o adjuvante seja selecionado para ser um

indutor preferencial de um tipo TH1 de resposta. Tais níveis altos de citocinas

de tipo Thl tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas por

20 célula a um dado antígeno, enquanto que níveis altos de citocinas de tipo Th2

tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais ao antígeno.

A distinção de resposta imune dos tipos Thl e Th2 não é

absoluta. Em realidade um indivíduo suportará uma resposta imune que é

descrita como sendo predominantemente Thl ou predominantemente Th2.

25 Contudo, muitas vezes é conveniente considerar as famílias de citocinas em

termos do que descrito em clones de célula CD4 +ve T murina por Mosmann

e Coffman (Mosmann, T.R. e Coffman, R.L. (1989) "TH1 e TH2 cells:

different patterns of lymphokine secretion lead to different functional

properties" (Annual Review of Immunology, 7, p145-1'73). Tradicionalmente,

52

as respostas de tipo Thl estão associadas com a produção das citocinas INF-y

e IL-2 por linfócitos-T. Outras citocinas muitas vezes diretamente associadas

com a indução de respostas imunes de tipo Thl não são produzidas por

células-T, tal como IL-12. Em contraste, respostas de tipo Th2 estão

5 associadas com a secreção de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Sistemas adjuvantes

adequados que promovem uma resposta predominantemente Thl incluem:

Monofosforil-lipídeo A ou um seu derivado (ou lipídeo A destoxificado em

geral - veja por exemplo W02005107798), particularmente monofosforil-

lipídeo A 3-de-0-acilado (3D-MPL) (para sua preparação veja GB 2220211

10 A); e uma combinação de monofosforil-lipídeo A, preferivelmente

monofosforil-lipídeo A 3-de-O-acilado, junto com quer um sal de alumínio

(por exemplo fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio) ou uma emulsão

de óleo-em-água. Em tais combinações, antígeno e 3D-MPL estão contidos

nas mesmas estruturas particuladas, permitindo liberação mais eficiente de

15 sinais antigênicos e imunoestimulatórios. Estudos têm mostrado que 3D-MPL

é capaz de adicionalmente intensificar a imunogenicidade de um antígeno

absorvido em alume [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-

B1].

Um sistema intensificado envolve a combinação de um

20 monofosforil-lipídeo A e um derivado de saponina, particularmente a

combinação de QS21 e 3D-MPL como descrito em WO 94/00153, ou uma

composição menos reatogênica onde o QS21 é extinto com colesterol como

descrito em WO 96/33739. Uma formulação adjuvante particularmente

potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão de óleo-em-

25 água é descrita em WO 95/17210. Em uma modalidade a composição

imunogênica adicionalmente compreende uma saponina, que pode ser QS21.

A formulação também pode compreender uma emulsão de óleo-em-água e

tocoferol (WO 95/17210). CpG não-metilado contendo oligonucleotídeos

(WO 96/02555) e outros oligonucleotídeos imunomodulatórios (W00226757

53

e W003507822) também são indutores preferenciais de uma resposta TH1 e

são adequados para uso na presente invenção.

Adjuvantes particulares são aqueles selecionados do grupo de

sais de metal, emulsões de óleo-em-água, agonista de receptores semelhantes

5 a Toll, (em particular agonista de receptor 2 semelhante a Toll, agonista de

receptor 3 semelhante a Toll, agonista de receptor 4 semelhante a Toll,

agonista de receptor 7 semelhante a Toll, agonista de receptor 8 semelhante a

Toll e agonista de receptor 9 semelhante a Toll), saponinas ou suas

combinações.

10 Um adjuvante que pode ser usado com as composições de

vacina da invenção são preparações de vesícula de membrana externa ou

bolha de cepas de bactérias Gram-negativas tais como aquelas ensinadas por

W002/09746 - particularmente bolhas de N meningitidis . Propriedades

adjuvantes de bolhas podem ser melhoradas pela retenção de LOS

15 (lipooligossacarídeo) sobre sua superfície (e.g. através de extração com

concentrações baixas de detergente [por exemplo desoxicolato 0-0,1% d]).

LOS pode ser destoxificado através de mutações msbB(-) ou htrB(-)

discutidas em W002/09746. Propriedades adjuvantes também podem ser

melhoradas pela retenção de PorB (e opcionalmente remoção de PorA) de

20 bolhas estafilocócicas. Propriedades adjuvantes também podem ser

melhoradas por truncamento da estrutura de sacarídeo de núcleo externo de

LOS sobre bolhas estafilocócicas - por exemplo via a mutação IgtB(-)

discutida em W02004/014417. Alternativamente, o LOS acima mencionado

(e.g. idolado de uma cepa msbB(-) e/ou IgtB(-)) pode ser purificado e usado

25 como um adjuvante nas composições da invenção.

Um outro adjuvante que pode ser usado com as composições

da invenção pode ser selecionado do grupo: uma saponina, lipídeo A ou um

seu derivado, um oligonucleotídeo imunoestimulatório, um alquil-

glicosaminida-fosfato, uma emulsão de óleo-em-água ou suas combinações.

54

Um outro adjuvante preferido é um sal de metal em combinação com outro

adjuvante. É preferido que o adjuvante seja um agonista de receptor

semelhante a Toll em particular um agonista de um receptor 2, 3, 4, 7, 8 ou 9

semelhante a Toll, ou uma saponina, em particular Qs21. É adicionalmente

5 preferido que o sistema adjuvante compreenda dois ou mais adjuvantes da

lista acima. Em particular as combinações preferivelmente contêm uma

saponina (em particular Qs21) adjuvante e/ou um agonista de receptor 9

semelhante a Toll tal como um oligonucleotídeo imunoestimulatório contendo

CpG. Outras combinações preferidas compreendem uma saponina (em

10 particular QS21) e um agonista de receptor 4 semelhante a Toll tal como

monofosforil-lipídeo A ou seu derivado 3-desacilado, 3 D-MPL, ou uma

saponina (em particular QS21) e um ligante de receptor 4 semelhante a Toll

4ta1 como um alquil-glicosaminida-fosfato.

Adjuvantes particularmente preferidos são combinações de

15 3D-MPL e QS21 (EP 0.671.948 B1), emulsões de óleo-em-água

compreendendo 3D-MPL e QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414), ou 3D-

MPL formulado com outros veículos (EP 0.689.454 B1). Outros sistemas

adjuvantes preferidos compreendem uma combinação de 3 D MPL, QS21 e

um oligonucleotídeo CpG como descrito em US6558670, US6544518.

20 Em uma modalidade o adjuvante é um ligante de receptor 4

semelhante a Toll (TLR), preferivelmente um antagonista tal como um

derivado de lipídeo A particularmente monofosforil-lipídeo A ou mais

particularmente monofosforil-lipídeo A 3-desacilado (3D-MPL).

3D-MPL está disponível na GlaxoSmithKline Biologicals

25 North America e primariamente promove respostas de células CD4+ T com

um fenótipo de IFN-g (Th1). Pode ser produzido de acordo com os métodos

descritos em GB 2.220.211 A. Quimicamente é uma mistura de monofosforil-

lipídeo A 3-desacilado com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Preferivelmente nas

composições da presente invenção é usado 3D-MPL de partícula pequena.

55

3D-MPL de partícula pequena possui um tamanho de partícula tal que pode

ser esterilmente filtrado através de um filtro de 0,22 gm. Tais preparações

estão descritas em Pedido de Patente Internacional de No. WO 94/21292.

Derivados sintéticos de lipídeo A são conhecidos e considerados em serem

5 agonistas de TLR 4 incluindo, mas não limitados a:

0M174 (2-desóxi-6-o-[2-desóxi-2-[(R)-3-dodecanoil-óxi-

tetradecanoil-amino]-4-o-fosfono-P-D-glicopiranosil]-2-[(R)-3-hidróxi-

tetradecanoil-amino]-a-D-glicopiranosil-di-hidrogeno-fosfato), (WO

95/14026)

10 OM 294 DP (3S, 9 R) -3-[(R)-dodecanoil-óxi-tetradecanoil-

amino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidróxi-tetradecanoil-amino] -decan-1,10-

dio1,1,10-bis(di-hidrogeno-fosfato) (W099 /64301 e WO 00/0462 )

OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)-dodecanoil-óxi-

tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9[(R)-3-hidróxi-tetradecanoil-amino]-

15 decan-1,10-diol, 1-di-hidrogeno-fosfato 10-(6amino-hexanoato) (WO

01/46127)

Outros ligantes TLR4 que podem ser usados são alquil-

glicosaminida-fosfatos (AGPs) tais como aqueles descritos em W09850399

ou US6303347 (processes para a preparação de AGPs também são descritos),

20 ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGPs como descrito em US6764840.

Alguns AGPs são agonistas de TLR4, e alguns são antagonistas de TLR4.

Ambos são considerados como adjuvantes úteis.

Outro imunoestimulante preferido para uso na presente

invenção é Quil A e seus derivados. Quil A é uma preparação de saponina

25 isolada da árvore sul-americana Quilaja Saponaria Molina e foi primeiro

descrita como possuindo uma atividade adjuvante por Dalsgaard et al. Em

1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fiir die gesamte Virusforschung, Vol. 44,

Springer Verlag, Berlin, p243-254). Têm sido isolados por HPLC fragmentos

purificados de Quil A que retêm atividade adjuvante sem a toxicidade

56

associada com Quil A (EP 0.362.278), por exemplo QS7 e QS21 (também

conhecidas como QA7 e QA21). QS-21 é uma saponina natural derivada da

casca de Quillaja saponaria Molina que induz as células-T citotóxicas CD8+

(CTLs), células Thl e uma resposta de anticorpo IgG2a predominante e é uma

5 saponina preferida no contexto da presente invenção.

Têm sido descritas formulações particulares de QS21 que são

particularmente preferidas, estas formulações compreendem um esterol

(W096/33739). As saponinas formando parte da presente invenção podem ser

separadas na forma de micelas, micelas mistas (preferencialmente, mas não

10 exclusivamente com sais biliares) ou podem estar na forma de matrizes de

ISCOM (EP 0.109.942 B1), lipossomos ou estruturas coloidais relacionadas

tais como complexos multiméricos semelhantes a anel ou semelhantes a

verme ou estrutura em camadas/lipídicas e lamelas quando formuladas com

colesterol e lipídeo, ou em uma emulsão de óleo-em-água (por exemplo como

15 em WO 95/17210). As saponinas podem estar preferivelmente associadas

com um sal metálico, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio

(WO 98/15287).

Preferivelmente, a saponina é apresentada na forma de um

lipossomo, ISCOM ou uma emulsão de óleo-em-água.

20 Um sistema intensificado envolve a combinação de um

monofosforil-lipídeo A (ou lipídeo A destoxificado) e um derivado de

saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como descrito

em WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica onde a QS21 está

extinta com colesterol como descrito em WO 96/33739. Uma formulação de

25 adjuvante particularmente potente envolvendo tocoferol com ou sem QS21

e/ou 3D-MPL em uma emulsão de óleo-em-água é descrita em WO 95/17210.

Em uma modalidade a composição imunogênica compreende uma saponina,

que pode ser QS21.

Oligonucleotídeos imunoestimulatórios ou qualquer outro

57

agonista de receptor 9 semelhante a Toll (TLR) também podem ser usados.

Os oligonucleotídeos preferidos para uso em adjuvantes ou vacinas da

presente invenção são oligonucleotídeos contendo CpG, preferivelmente

contendo dois ou mais motivos CpG de dinucleotídeo separados por pelo

5 menos três, mais preferivelmente pelo menos seis ou mais nucleotídeos. Um

motivo CpG é um nucleotídeo citosina seguido por um nucleotídeo guanidina.

Os oligonucleotídeos CpG da presente invenção são tipicamente

desoxinucleotídeos. Em uma modalidade preferida o internucleotídeo no

oligonucleotídeo é uma ligação fosforoditioato, ou mais preferivelmente uma

10 ligação fosforotioato, embora ligações fosfodiéster e outras ligações de

internucleotídeo estão dentro do escopo invenção. Também estão incluídos

dentro do escopo da invenção os oligonucleotídeos com ligações de

internucleotídeo. Métodos para produzir oligonucleotídeos de fosforotioato ou

fosforoditioato são descritos em US5.666.153, US5.278,302 e W095/26204.

15 Exemplos de oligonucleotídeos preferidos possuem as

seguintes seqüências. As seqüências preferivelmente contêm ligações de

internucleotídeo modificadas com fosforotioato.

OLIGO 1(SEQ ID NO:1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT

(CpG 1826)

OLIGO 2 (SEQ ID NO:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG

1758)

OLIGO 3(SEQ ID NO:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC

GGC ACC ACG

OLIGO 4 (SEQ ID NO:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC

GTT (CpG 2006)

OLIGO 5 (SEQ ID NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT

(CpG 1668)

OLIGO 6 (SEQ ID NO:6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC

G (CpG 5456)

58

Oligonucleotídeos CpG alternativos podem compreender as

seqüências preferidas acima pelo fato de que possuem adições ou deleções

inconseqüentes nas mesmas.

Os oligonucleotídeos CpG utilizados na presente invenção

5 podem ser sintetizados por qualquer método conhecido na arte (por exemplo

veja EP 468520). Convenientemente, tais oligonucleotídeos podem ser

sintetizados utilizando um sintetizador automático.

O adjuvante pode ser uma emulsão de óleo-em-água ou pode

compreender uma emulsão de óleo-em-água em combinação com outros

10 adjuvantes. A fase oleosa do sistema de emulsão preferivelmente compreende

um óleo metabolizável. O significado do termo óleo metabolizável é bem

conhecido na arte. Metabolizável pode ser definido como "sendo capaz de ser

transformado por metabolismo" (Dorland's Illustrated Medical Dictionary,

W.B. Sanders Company, 25a edição (1974)). O óleo pode ser qualquer óleo

15 vegetal, óleo de peixe, óleo animal ou óleo sintético, que é não tóxico para o

recipiente e é capaz de ser transformado por metabolismo. Nozes, sementes, e

grãos são fontes comuns de óleos vegetais. Óleos sintéticos também são parte

desta invenção e podem incluir óleos comercialmente disponíveis tal como

NEOBEE® e outros. Esqualeno (2,6,10,15,19, 23-Hexametil-2,6,10,14,18,22-

20 tetracosa-hexaeno) é um óleo insaturado que é encontrado em grandes

quantidades em óleo de fígado de tubarão, e em quantidades menores em

azeite de oliva, óleo de germe de trigo, óleo de farelo de arroz, e levedura, e é

um óleo particularmente preferido para uso nesta invenção. Esqualeno é um

óleo metabolizável em virtude do fato de que é um intermediário na

25 biossíntese de colesterol (Merck Index, loa Edição, entrada no.8619).

Tocóis (e.g. vitamina E) também são muito usados em

adjuvantes de emulsões de óleo (EP 0.382.271 B1; US5667784; WO

95/17210). Tocóis utilizados em emulsões de óleo (preferivelmente emulsões

de óleo-em-água) da invenção podem ser formulados como descrito em EP

59

0.382.271 B 1, pelo fato de que tocóis podem ser dispersões de gotículas de

tocol, opcionalmente compreendendo um emulsificador, de preferivelmente

menor do que 1 micrômetro em diâmetro. Alternativamente, os tocóis podem

ser usados em combinação com outro óleo, para formar a fase oleosa de uma

5 emulsão de óleo. Exemplos de emulsões de óleo que podem ser usadas em

combinação com o tocol são aqui descritos, tais como os óleos metabolizáveis

descritos acima.

Tem sido sugerido que os adjuvantes de emulsão de óleo-em-

água são por si úteis como composições adjuvantes (EP 0.399.843B), também

10 combinações de emulsões de óleo-em-água e outros agentes ativos têm sido

descritos como adjuvantes para vacinas (WO 95/17210; WO 98/56414; WO

99/12565; WO 99/11241). Outros adjuvantes de emulsão de óleo têm sido

descritos, tais como emulsões de água-em-óleo (US 5.422.109; EP 0.480.982

B2) e água em óleo em emulsões aquosas (US 5,424,067;EP O 480 981 B).

15 Todos os quais formam os sistemas preferidos de emulsão de óleo (em

particular quando incorporando tocóis) para formar adjuvantes e composições

da presente invenção.

Mais preferivelmente a emulsão de óleo (por exemplo

emulsões de óleo-em-água) adicionalmente compreende um emulsificador tal

20 como TWEEN 80 e/ou um esterol tal como colesterol.

Uma emulsão de óleo preferida (preferivelmente emulsão de

óleo-em-água) compreende um óleo não-tóxico, metabolizável, tal como

esqualano, esqualeno ou um tocoferol tal como alfa-tocoferol (e

preferivelmente ambos esqualeno e alfa-tocoferol) e opcionalmente um

25 emulsificador (ou tensoativo) tal como Tween 80. Um esterol

(preferivelmente colesterol) também pode ser incluído.

O método de produzir emulsões de óleo-em-água é bem

conhecido pelo homem experiente na arte. Comumente, o método

compreende misturar a fase oleosa contendo tocol com um tensoativo tal

60

como uma solução de PBS/TWEEN80Tm, seguido por homogeneização

usando um homogeneizador, estaria claro para um homem experiente na arte

que um método compreendendo passar a mistura duas vezes através de uma

agulha de seringa seria adequado para homogeneizar volumes pequenos de

5 líquido. Igualmente, o processo de emulsificação em microfluidizador

(máquina M1105 Microfluidics, máximo de 50 passagens, por um período de

2 minutos na pressão de entrada máxima de 600 kPa (pressão de saída de

cerca de 85.000 kPa)) poderia ser adaptado pelo homem experiente na arte

para produzir volumes menores ou maiores de emulsão. A adaptação poderia

10 ser realizada por experimentação rotineira compreendendo a medição da

emulsão resultante até que fosse obtida uma preparação com gotículas de óleo

do diâmetro requerido em uma emulsão de óleo-em-água, o óleo e o

emulsificador devem estar em um veículo aquoso. O veículo aquoso pode ser,

por exemplo, solução salina tamponada com fosfato.

15 O tamanho das gotículas de óleo verificado dentro da emulsão

de óleo-em-água estável é preferivelmente menor do que 1 micrômetro, pode

estar dentro da faixa de substancialmente 30-600 nm, preferivelmente

substancialmente ao redor de 30-500 nm em diâmetro, e mais preferivelmente

substancialmente 150-500 nm em diâmetro, e em particular cerca de 150 nm

20 em diâmetro conforme medido por espectroscopia de correlação de fóton.

Com relação a isto, 80% em número das gotículas de óleo devem estar dentro

das faixas preferidas, mais preferivelmente mais do que 90% e muito mais

preferivelmente mais do que 95% em número das gotículas de óleo estão

dentro das faixas de tamanho definidas. As quantidades dos componentes

25 presentes nas emulsões de óleo da presente invenção estão

convencionalmente dentro da faixa de 0,5-20% ou 2 a 10% de óleo (do

volume de dose total), tal como esqualeno; e quando presente, de 2 a 10% de

alfa-tocoferol; e de 0,3 a 3% de tensoativo, tal como monooleato de

polioxietileno-sorbitana. Preferivelmente a razão de óleo (preferivelmente

61

esqualeno): tocol (preferivelmente a-tocoferol) é igual a ou menor do que 1

porque esta proporciona uma emulsão mais estável. Um emulsificador, tal

como Tween80 ou Span 85 também pode estar presente em um nível de cerca

de 1%. Em alguns casos pode ser vantajoso que as vacinas da presente

5 invenção adicionalmente contenham um estabilizador.

Exemplos de sistemas de emulsão preferidos são descritos em

WO 95/17210, WO 99/11241 e WO 99/12565 que descrevem adjuvantes de

emulsão baseados em esqualeno, a-tocoferol, e TWEEN 80, opcionalmente

formulados com os imunoestimulantes QS21 e/ou 3D-MPL. Assim em uma

10 modalidade particularmente preferida da presente invenção, o adjuvante da

invenção pode adicionalmente compreender outros imunoestimulantes, tais

como LPS ou seus derivados, e/ou saponinas. Exemplos de outros

imunoestimulantes são aqui descritos e em "Vaccine Design - The Subunit

and Adjuvant Approach" 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6,

15 Eds. Powell, M.F., e Newman, M.J., Plenum Press, New York e London,

ISBN 0-306-44867-X.

Em um aspecto preferido o adjuvante e as composições

imunogênicas de acordo com a invenção compreendem uma saponina

(preferivelmente QS21) e/ou um derivado de LPS (preferivelmente 3D-MPL)

20 em uma emulsão de óleo descrita acima, opcionalmente com um esterol

(preferivelmente colesterol). Adicionalmente a emulsão de óleo

(preferivelmente a emulsão de óleo-em-água) pode conter span 85 e/ou

lecitina e/ou tricaprilina. Adjuvantes compreendendo uma emulsão de óleo-

em-água, um esterol e uma saponina são descritos em WO 99/12565.

25 Tipicamente para administração humana a saponina

(preferivelmente QS21) e/ou o derivado de LPS (preferivelmente 3D-MPL)

estará presente em uma dose para humano da composição imunogênica dentro

da faixa de 1µg - 200µg, tal como 10-100µg, preferivelmente 10µg - 50µg

por dose. Tipicamente a emulsão de óleo (preferivelmente a emulsão de óleo-

62

em-água) compreenderá de 2 a 10% de óleo metabolizável. Preferivelmente

compreenderá de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de alfa-tocoferol e de 0,3

a 3% (preferivelmente 0,4 - 2%) de emulsificador (preferivelmente tween 80

[monooleato de polioxietileno-sorbitana]). Onde ambos esqualeno e alfa-

5 tocoferol estão presentes, preferivelmente a razão de esqualeno: alfa-tocoferol

é igual a ou menor do que 1 porque esta proporciona uma emulsão mais

estável. Span 85 (trioleato de sorbitana) também pode estar presente em um

nível de 0,5 a 1% nas emulsões usadas na invenção. Em alguns casos pode ser

vantajoso que as composições imunogênicas e vacinas da presente invenção

10 adicionalmente conterão um estabilizador, por exemplo outros

emulsificadores/tensoativos, incluindo ácido caprílico (Merck Index 10th

Edition, entrada no. 1739), dos quais Tricaprilina é particularmente preferida.

Onde esqualeno e uma saponina (preferivelmente QS21) estão

incluídos, é também benéfica a inclusão de um esterol (preferivelmente

15 colesterol) na formulação porque isto permitirá uma redução no nível total de

óleo na emulsão. Isto acarreta um custo reduzido de manufatura, melhoria do

conforto total da vacinação, e também melhorias qualitativas e quantitativas

das respostas imunes resultantes, tal como produção de IFN-y melhorada.

Conseqüentemente, o sistema adjuvante da presente invenção tipicamente

20 compreende uma razão de óleo metabolizável:saponina (p/p) dentro da faixa

de 200:1 a 300:1, também a presente invenção pode ser usada em uma forma

"baixa em óleo" cuja faixa preferida é de 1:1 a 200:1, preferivelmente 20:1 a

100:1, e mais preferivelmente substancialmente 48:1, esta vacina retém as

propriedades adjuvantes benéficas de todos os componentes, com um perfil de

25 reatogenicidade muito reduzida. Conseqüentemente, as modalidades

particularmente preferidas possuem uma razão de esqualeno:QS21 (p/p)

dentro da faixa de 1:1 a 250:1, também uma faixa preferida é 20:1 a 200:1,

preferivelmente 20:1 a 100:1, e mais preferivelmente substancialmente 48:1.

Preferivelmente um esterol (mais preferivelmente colesterol) também está

63

incluído em uma razão de saponina:esterol como aqui descrita.

Os sistemas de emulsão da presente invenção preferivelmente

possuem um tamanho de gotícula de óleo pequeno na faixa submicrométrica.

Mais preferivelmente os tamanhos de gotícula de óleo estarão dentro da faixa

5 de 120 a 750 nm, e mais preferivelmente de 120-600nm em diâmetro.

Uma formulação adjuvante particularmente potente (para

combinação final com AiPO4 nas composições imunogênicas da invenção)

envolve uma saponina (preferivelmente QS21), um derivado de LPS

(preferivelmente 3D-MPL) e uma emulsão de óleo (preferivelmente

10 esqualeno e alfa-tocoferol em uma emulsão de óleo-em-água) como descrito

em WO 95/17210 ou em WO 99/12565 (em particular formulação adjuvante

11 em Exemplo 2, Tabela 1).

Exemplos de um agonista de TLR 2 incluem peptidoglicano ou

lipoproteína. Imidazoquinolinas, tais como Imiquimod e Resiquimod são

15 agonistas de TLR7 conhecidos. RNA de fita única também é um agonista de

TLR conhecido (TLR8 em humanos e TLR7 em camundongos), enquanto que

DNA de fita dupla e poli IC (ácido poliinosínico-policitidílico - um mimético

comercial de RNA virai) são exemplos de agonistas de TLR 3. 3D-MPL é um

exemplo de um agonista de TLR4 enquanto que CPG é um exemplo de um

20 agonista de TLR9.

A composição imunogênica pode compreender um antígeno e

um imunoestimulante adsorvidos sobre um sal de metal. Formulações de

vacina baseadas em alumínio nas quais o antígeno e o imunoestimulante

monofosforil-lipídeo A 3-de-O-acilado (3D-MPL), estão adsorvidos sobre a

25 mesma partícula são descritas em EP 0.576.478 B 1, EP 0.689.454 B 1, e EP

0.633.784 B1. Nestes casos então antígeno é primeiro adsorvido sobre o sal

de alumínio seguido por adsorção do imunoestimulante 3D-NfPL sobre as

mesmas partículas de sal de alumínio. Tais processos primeiro envolvem a

suspensão de 3D-MPL por sonificação em um banho de água até que as

64

partículas alcancem um tamanho de entre 80 e 500 nm. O antígeno é

tipicamente adsorvido sobre sal de alumínio por uma hora na temperatura

ambiente sob agitação. A suspensão de 3DMPL é então adicionada no

antígeno adsorvido e a formulação é incubada na temperatura ambiente por 1

5 hora, e então mantida a 4°C até o uso.

Em outro processo, o imunoestimulante e o antígeno estão

sobre partículas de metal separadas, como descrito em EP 1126876. O

processo melhorado compreende a adsorção de imunoestimulante, sobre uma

partícula de sal metálico, seguida pela adsorção do antígeno sobre outra

10 partícula de sal metálico, seguida pela misturação das partículas metálicas

discretas para formar uma vacina. O adjuvante para uso na presente invenção

pode ser uma composição adjuvante compreendendo um imunoestimulante,

adsorvido sobre uma partícula de sal metálico, caracterizado pelo fato de que

a partícula de sal metálico está substancialmente livre de outro antígeno.

15 Ademais, são proporcionadas vacinas pela presente invenção as quais são

caracterizadas pelo fato de que o imunoestimulante é adsorvido sobre

partículas de sal metálico que estão substancialmente livres de outro antígeno,

e pelo fato de que as partículas de sal metálico que adsorvem o antígeno estão

substancialmente livres de outro imunoestimulante.

20 Conseqüentemente, a presente invenção proporciona uma

formulação adjuvante compreendendo imunoestimulante que tem sido

adsorvido sobre uma partícula de um sal metálico, caracterizada pelo fato de

que a composição está substancialmente livre de outro antígeno. Além disso,

esta formulação adjuvante pode ser uma intermediária que, se um tal

25 adjuvante for usado, é requerida para a manufatura da vacina.

Conseqüentemente é proporcionado um processo para a manufatura de uma

vacina compreendendo misturar uma composição adjuvante que é um ou mais

imunoestimulantes adsorvidos sobre uma partícula de metal com um antígeno.

Preferivelmente, o antígeno tem sido pré-adsorvido sobre uma partícula de

65

metal. O citado sal metálico pode ser idêntico ou similar ao sal metálico que é

adsorvido sobre o imunoestimulante. Preferivelmente o sal de metal é um sal

de alumínio, por exemplo fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio.

A presente invenção adicionalmente proporciona uma

5 composição de vacina compreendendo imunoestimulante adsorvido sobre

uma primeira partícula de um sal metálico, e antígeno adsorvido sobre um sal

metálico, caracterizada pelo fato de que as primeira e segunda partículas de

sal metálico são partículas separadas.

Mutações ou derivados de LOS ou LPS ou derivados de

10 lipídeo A aqui descritos são planejados para serem menos tóxicos (e.g. 3D-

MPL) do que os lipopolissacarídeos nativos e são equivalentes

intercambiáveis com respeito a quaisquer usos destes grupos aqui descritos.

Em uma modalidade o adjuvante usado nas composições da

invenção compreende um veículo lipossomo (preparado por técnicas

15 conhecidas a partir de fosfolipídeos (tal como dioleoil-fosfatidil-colina

[DOPC]) e opcionalmente um esterol [tal como colesterol]). Tais veículos

lipossomo podem trazer derivados de lipídeo A [tal como 3D-MPL - veja

acima] e/ou saponinas (tal como QS21 - veja acima). Em uma modalidade o

adjuvante compreende (por dose de 0,5 mL) 0,1-10mg, 0,2-7, 0,3-5, 0,4-2, ou

20 0,5-1 mg (e,g, 0,4-0,6, 0,9-1,1, 0,5 ou 1 mg) de fosfolipídeo (por exemplo

DOPC), 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3, ou 0,125-0,25 mg (e,g, 0,2-

0,3, 0,1-0,15, 0,25 ou 0,125 mg) de esterol (por exemplo colesterol), 5-60, 10-

50, ou 20-30 µg (e,g, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 µg) de derivado de

lipídeo A (por exemplo 3DMPL), e 5-60, 10-50, ou 20-30 µg (e,g, 5-15, 40-

25 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 µg) de saponina (por exemplo QS21).

Em uma modalidade o adjuvante usado nas composições da

invenção compreende uma emulsão de óleo-em-água preparada a partir de um

óleo metabolizável (tal como esqualeno), um emulsificador (tal como Tween

80) e opcionalmente um tocol (tal como alfa-tocoferol). Em uma modalidade

66

o adjuvante compreende (por dose de 0,5 mL) 0,5-15, 1-13, 2-11, 4-8, ou 5-

6mg (e,g, 2-3, 5-6, ou 10-11 mg) de óleo metabolizável (tal como esqualeno),

0,1-10, 0,3-8, 0,6-6, 0,9-5, 1-4, ou 2-3 mg (e,g, 0,9-1,1, 2-3 ou 4-5 mg) de

emulsificador (tal como Tween 80) e opcionalmente 0,5-20, 115, 2-12, 4-10,

5 5-7 mg (e,g, 11-13, 5-6, ou 2-3 mg) de tocol (tal como alfa-tocoferol).

Este adjuvante pode opcionalmente adicionalmente

compreender 5-60, 10-50, ou 20-30 µg (e.g. 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50

µg) de derivado de lipídeo A (por exemplo 3D-MPL).

Este adjuvante pode opcionalmente conter 0,025-2,5, 0,05-1,5,

10 0,075-0,75, 0,1-0,3, ou 0,1250,25 mg (e,g, 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 ou 0,125

mg) de esterol (por exemplo colesterol), 5-60, 10-50, ou 20-30 µg (e,g, 5-15,

40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 µg) de derivado de lipídeo A (por exemplo 3D-

MPL), e 5-60, 10-50, ou 20-30 µg (e,g, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 µg)

de saponina (por exemplo QS21).

15 Em uma modalidade o adjuvante usado nas composições da

invenção compreende fosfato de alumínio e um derivado de lipídeo A (tal

como 3D-MPL). Este adjuvante pode compreender (por dose de 0,5 mL) 100-

750, 200-500, ou 300-400 µg Al como fosfato de alumínio, e 5-60, 10-50, ou

20-30 µg (e.g. 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 µg) de derivado de lipídeo A

20 (por exemplo 3D-MPL).

As preparações de vacina da presente invenção podem ser

usadas para proteger ou tratar um mamífero suscetível à infecção, por meio de

administração de citada vacina via rota sistêmica ou mucosal. Estas

administrações podem incluir injeção via as rotas intramuscular,

25 intraperitoneal, intradermal ou subcutânea; ou via administração mucosal nos

tratos oral/alimentar, respiratório, genitourinário. Administração intranasal de

vacinas para o tratamento de pneumonia ou otite média é preferida (porque o

transporte nasofaringeal de pneumococos pode ser mais efetivamente

prevenido, atenuando assim a infecção em seu estágio mais inicial). Embora a

67

vacina da invenção possa ser administrada como uma dose única, os seus

componentes também podem ser co-administrados juntos ao mesmo tempo ou

em tempos diferentes (por exemplo polissacarídeos pneumocócicos poderiam

ser administrados separadamente, ao mesmo tempo ou 1-2 semanas após a

5 administração de qualquer componente de proteína bacteriana da vacina para

coordenação ótima das respostas imunes uma com relação à outra). Para co-

administração, o adjuvante Thl opcional pode estar presente em qualquer

uma ou em todas as administrações diferentes, por exemplo, pode estar

presente em combinação com o componente proteína bacteriana da vacina.

10 Por exemplo, polissacarídeos podem ser administrados IM (ou ID) e proteínas

bacterianas podem ser administradas IN (ou ID). Em adição, as vacinas da

invenção podem ser administradas IM para doses iniciais e IN para doses de

reforço.

A quantidade de antígeno conjugado em cada dose de vacina é

15 selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora

sem efeitos colaterais adversos, significativos, em vacinas típicas. Tal

quantidade variará dependendo de qual imunógeno específico é empregado e

como é apresentado. Geralmente, é esperado que cada dose compreenda 0,1-

100 µg de polissacarídeo, tipicamente 0,1-50 µg, 0,1-10µg, 1-10µg ou 1-5µg

20 para conjugados de polissacarídeo.

O conteúdo de antígenos de proteína na vacina estará

tipicamente dentro da faixa de 1-100µg, 550µg ou 5 - 25µg. Após uma

vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou mais imunizações de

reforço adequadamente espaçadas.

25 Preparação de vacina é geralmente descrita em Vaccine

Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman

M.J.) (1995) Plenum Press New York). Encapsulação com lipossomos é

descrita por Fullerton, Patente US 4.235.877.

As vacinas da presente invenção podem ser armazenadas em

68

solução ou liofilizadas. Opcionalmente a solução é liofilizada na presença de

um açúcar tal como sacarose, trealose ou lactose. É típico que sejam

liofilizadas e extemporaneamente reconstituídas antes do uso. Liofilização

pode resultar em uma composição (vacina) mais estável.

5 Métodos

A invenção também inclui método de preparação das

composições imunogênicas e vacinas da invenção.

Em uma modalidade, o processo da invenção, é um método

para preparar uma vacina compreendendo as etapas de misturar antígenos

10 para preparar a composição imunogênica da invenção e adicionar um

excipiente farmaceuticamente aceitável.

Métodos de tratamento

A invenção também inclui método de tratamento de infecção

estafilocócica, particularmente de infecções nosocomiais adquiridas em

15 hospital.

Esta composição imunogênica ou vacina da invenção é

particularmente vantajosa em casos de cirurgia eletiva. Tais pacientes saberão

antecipadamente a data da cirurgia e poderão ser inoculados

antecipadamente. Visto que não é sabido se o paciente será exposto à infecção

20 por S. aureus ou S. epidermidis, é preferido inocular com uma vacina da

invenção que protege contra ambas, como descrito acima. Tipicamente

adultos acima de 16 aguardando cirurgia eletiva são tratados com as

composições imunogênicas e vacinas da invenção. Alternativamente crianças

de 3-16 anos de idade aguardando cirurgia eletiva são tratadas com as

25 composições imunogênicas e vacinas da invenção.

Também é possível inocular trabalhadores de cuidado da saúde

com a vacina da invenção.

As preparações de vacina da presente invenção podem ser

usadas para proteger ou tratar um mamífero suscetível à infecção, por meio de

69

administração de citada vacina via rota sistêmica ou mucosal. Estas

administrações podem incluir injeção via as rotas intramuscular,

intraperitoneal, intradermal ou subcutânea; ou via administração aos tratos

oral/alimentar, respiratório, genitourinários.

5 A quantidade de antígeno em cada dose de vacina é

selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora

sem efeitos colaterais adversos, significativos em vacinas típicas. Tal

quantidade variará dependendo do imunógeno específico empregado e de

como ele é apresentado. O conteúdo de proteína da vacina tipicamente estará

10 dentro da faixa de 1-100µg, 5-50µg, tipicamente dentro da faixa de 10-25p,g.

Uma quantidade ótima para uma vacina particular pode ser determinada por

estudos padrão envolvendo observação de respostas imunes apropriadas em

indivíduos. Após uma vacinação inicial, indivíduos podem receber uma ou

mais imunizações de reforço adequadamente espaçadas.

15 Embora vacinas da presente invenção possam ser

administradas por qualquer rota, administração das vacinas desejadas para

dentro da pele (ID) forma uma modalidade da presente invenção. Pele

humana compreende uma cutícula externa "córnea", chamada de stratum

corneum, que reveste a epiderme. Sob esta epiderme está uma camada

20 chamada de derme, que por sua vez reveste o tecido subcutâneo.

Pesquisadores têm mostrado que injeção de uma vacina na pele, e em

particular na derme, estimula uma resposta imune, que também pode estar

associada com um número de vantagens adicionais. Vacinação intradermal

com as vacinas aqui descritas forma uma característica opcional da presente

25 invenção.

A técnica convencional de injeção intradermal, o

"procedimento mantoux", compreende etapas de limpar a pele, e então esticar

com uma mão, e com o bisel de uma agulha de calibre estreito (calibre 26-31)

faceando para cima a agulha é inserida em um ângulo entre 10° e 15°. Uma

70

vez o bisel da agulha é inserido, o cilindro da agulha é abaixado e

adicionalmente avançado enquanto proporciona uma ligeira pressão para

elevar a agulha sob a pele. O líquido é então injetado muito lentamente

formando deste modo uma bolha ou um inchaço sob a superficie da pele,

5 seguido por remoção lenta da agulha.

Mais recentemente, dispositivos que são especificamente

projetados para administrar agentes líquidos para dentro ou através da pele

têm sido descritos, por exemplo os dispositivos descritos em WO 99/34850 e

EP 1092444. Também dispositivos de injeção de jato descritos por exemplo

10 em WO 01/13977; US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US

5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US

5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US

5.064.413, US 5.520. 639, US 4.596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US

4.940.460, WO 97/37705 e WO 97/13537. Métodos alternativos de

15 administração intradermal das preparações de vacina podem incluir seringas e

agulhas convencionais, ou dispositivos projetados para liberação balística de

vacinas sólidas (WO 99/27961), ou emplastros transdermais (WO 97/48440;

WO 98/28037); ou aplicadas sobre a superfície da pele (liberação transdermal

ou transcutânea WO 98/20734 ; WO 98/28037).

20 Quando as vacinas da presente invenção são para serem

administradas à pele, ou mais especificamente para dentro da derme, a vacina

está em um volume de líquido pequeno, particularmente um volume de entre

cerca de 0,05 mL e 0,2 mL.

O conteúdo de antígenos nas vacinas intradermais ou de pele

25 da presente invenção pode ser similar às doses convencionais como

encontradas em vacinas intramusculares (veja acima). Contudo, é uma

característica das vacinas intradermais ou de pele que as formulações podem

ser de "dose baixa". Conseqüentemente os antígenos de proteína em vacinas

de "dose baixa" estão opcionalmente presentes em tão pouco quanto 0,1 a 10

71

µg, opcionalmente 0,1 a 5 µg por dose; e os antígenos de polissacarídeo

(opcionalmente conjugado) podem estar presentes dentro da faixa de 0,01-

1µg, e opcionalmente entre 0,01 e 0,5 µg de polissacarídeo por dose.

Como aqui usado, o termo "liberação intradermal" significa a

5 liberação de vacina para a região da derme na pele. Contudo, a vacina não

necessariamente estará localizada exclusivamente na derme. A derme é a

camada na pele localizada entre cerca de 1,0 e cerca de 2,0 mm da superfície

na pele humana, mas há uma certa quantidade de variação entre indivíduos e

em partes diferentes do corpo. Em geral, pode ser esperado alcançar a derme

10 indo-se 1,5 mm abaixo da superfície da pele. A derme está localizada entre o

stratum corneum e a epiderme na superfície e a camada subcutânea abaixo.

Dependendo do modo de liberação, a vacina pode finalmente

estar localizada apenas ou primariamente dentro da derme, ou pode ser

finalmente distribuída dentro da epiderme e a derme.

15 Uma modalidade da invenção é um método de prevenção ou

de tratamento de infecção ou doença estafilocepa estafilocócica

compreendendo a etapa de administrar uma composição imunogênica ou

vacina da invenção a um paciente em necessidade da mesma.

Uma outra modalidade da invenção é um uso da composição

20 imunogênica da invenção na manufatura de uma vacina para o tratamento ou

a prevenção de doença ou infecção estafilocócica, opcionalmente de infecção

estafilocócica após cirurgia.

O termo 'infecção estafilocócica' inclui infecção causada por S.

aureus e/ou S. epidermidis e outras cepas estafilocócicas capazes de causarem

25 infecção em um hospedeiro mamífero, opcionalmente hospedeiro humano.

Os termos "compreendendo", "compreendem" e "compreende"

aqui são intencionados pelos inventores para serem opcionalmente

substituíveis pelos termos "consistindo de", "consistem de" e "consiste de",

respectivamente, em cada caso.

72

Todas as referências ou pedidos de patente citados dentro deste

relatório descritivo de patente são aqui incorporadas como referências.

Com o propósito de que esta invenção possa ser melhor

entendida, os seguintes exemplos são mostrados. Estes exemplos são apenas

5 para propósitos de ilustração, e não são para serem entendidos de nenhum

modo como limitantes do escopo da invenção.

Exemplos

Exemplo 1 Construção de plasmídeo para expressar

proteínas recombinantes

10 A: Clonagem.

Sítios de restrição apropriados engenhados em

oligonucleotídeos específicos para o gene estafilocepa estafilocócica

permitiram clonagem direcional do produto de PCR no plasmídeo pET24d ou

pQE-30 de expressão em E. coli de tal modo que uma proteína pudesse ser

15 expressada como uma proteína de fusão contendo um marcador de

cromatografia de afinidade (His)6 na terminação-N ou -C.

Os iniciadores usados foram:

Alfa-toxina - 5'-CGCGGATCCGCAGATTCTGATATTAATATTAA

AAC-3' e

5' CCCAAGCTTTTAATTTGTCATTTCTTCTTTTTC-3'

EbpS - 5'-CGCGGATCCGCTGGGTCTAATAATTTTAAAGATG-3' e

5'CCCAAG CTTTTATG GAATAACGATTTGTTG-3'

CTfA - 5'-CGCGGATCCAGTGAAAATAGTGTTACGCAATC-3, e

5'C C CAAG CTTTTACTCTG GAATTG GTTCAATTTC-3'

FnbpA - 5'-CGCGGATCCACACAAACAACTGCAACTAACG-3' e

5'CCCAAGCTTTTATG CTTTGTGATTCTTTTTCAAAC3'

Sbi - 5'-CGCGGATCCAACACGCAACAAACTTC-3' e

5' G GAACTG CAGTTATTTC CAGAATGATAATAAATTAC-3'

SdrC - 5'-CGCGGATCCGCAGAACATACGAATGGAG-3' e

73

5'CCCAAGCTTTTATGTTTCTTCTTCGTAGTAGC-3'

SdrG - 5'-CGCGGATCCGAGGAGAATTCAGTACAAG-3' e

5' CC CAAG CTTTTATTCGTCATCATAGTATC CG-3'

Ebh - 5'-AAAAGTACTCACCACCACCACCACC-3' e

5 ,AAAAGTACTCACTTGATTCATCGCTTCAG-3 '

Aaa - 5'-GCGCGCCATGGCACAAGCTTCTACACAACATAC-3' e

5'G C G CG CTCGAGATG GATGAATG CATAG CTAGA-3,

IsaA - 5'-CATCCATGGCACCATCACCATCACCACGAAGTAAAC

GTTGATCAAGC-3' e

5'-AGCACTCGAGTTAGAATCCCCAAGCACCTAAACC-3'

HarA - 5'-GCACCCATGGCAGAAAATACAAATACTTC-3' e

5'TTTTCTCGAGCATTTTAGATTGACTAAGTTG-3'

Autolisina glicosaminidase - 5'-CAAGTCCCATGGCTGAGACGAC

ACAAGATCAAC-3' e

5 '-CAGTCTCGAGTTTTACAGC TGTTTTTGGTTG-3 '

Autolisina amidase - 5'-AGCTCATATGGCTTATACTGTTACTAA

ACC-3' e

5'GCGCCTCGAGTTTATATTGTGGGATGTCG-3'

IsdA - 5'-CAAGTCCCATGGCAACAGAAGCTACGAACGCAAC-3' e

5'ACCAGTCTCGAGTAATTCTTTAG CTTTAGAG CTTG-3'

IsdB - 5'-TATTCTCGAGGCTTTGAGTGTGTCCATCATTTG-3' e

5'-GAAG C CAT G G CAG CAG CTGAAGAAACAG GT G G-3'

MRPII - 5'-GATTACACCATGGTTAAACCTCAAGCGAAA-3' e

5 'AGGTGTC TCGAGTGCGATTGTAGCTTCATT-3 '

Os produtos de PCR foram primeiro introduzidos no vetor de

clonagem pGEM-T (Novagen) usando células bacterianas Top10, de acordo

com as instruções do fabricante. Este construto intermediário foi preparado

para facilitar clonagem adicional em um vetor de expressão. Transformantes

5 contendo o inserto de DNA foram selecionados por análise com enzima de

74

restrição. Após digestão, uma alíquota de —20 µI, da reação foi analisada por

eletroforese em gel de agarose (0,8 % de agarose em um tampão Tris-acetato-

EDTA (TAE)). Fragmentos de DNA foram visualizados por iluminação UV

após eletroforese em gel e coloração com brometo de etídio. Um padrão de

5 tamanho molecular de DNA (escada de 1 kb, Life Technologies) foi

submetido à eletroforese em paralelo com as amostras de teste e foi usado

para estimar o tamanho dos fragmentos de DNA. Plasmídeo purificado dos

transformantes selecionados para cada clonagem foi então seqüencialmente

digerido até completitude com enzimas de restrição apropriadas como

10 recomendado pelo fabricante (Life Technologies). O fragmento de DNA

digerido foi então purificado usando colunas spin baseadas em gel de sílica

antes da ligação com o plasmídeo pET24d ou pQE-30. Clonagem de Ebh

(fragmento H2), AaA, IsdA, IsdB, HarA, Atl-amidase, Atl-glicosamina,

MRPII, IsaA foi realizada usando o plasmídeo pET24d e clonagem de CTfA,

15 SdrC, SdrE, FnbpA, SdrG/Fbe, alfa-toxina e Sbi foi realizada usando o

plasmídeo pQE-30.

B: Produção de vetor de expressão.

Para preparar o plasmídeo de expressão pET24d ou pQE-30

para ligação, ele foi similarmente digerido até a completitude com enzimas de

20 restrição apropriadas. Um excesso molar de aproximadamente 5 vezes dos

fragmentos digeridos em relação ao vetor preparado foi usado para programar

a reação de ligação. Uma reação de ligação padrão de —20 iit (-16°C, —16

horas), usando métodos bem conhecidos na arte, foi realizada usando T4

DNA ligase (-2,0 unidades/reação, Life Technologies). Uma alíquota da

25 ligação (-5 p.L) foi usada para transformar células eletro-competentes

M15(pREP4) ou BT21::DE3 de acordo com métodos bem conhecidos na arte.

Após um período de desenvolvimento de —2-3 horas a 37°C em —1,0 mL de

caldo LB, as células transformadas foram plaqueadas sobre placas de ágar LB

contendo ampicilina (100 µg/mL) e/ou canamicina (30µg/mL). Anticorpos

75

foram incluídos na seleção. Placas foram incubadas durante a noite a 37°C

por —16 horas. Colônias individuais ApR/KanR foram selecionadas com

palitos e usadas para "patch" inocular placas frescas LB ApR/KanR bem

como uma cultura de caldo LB Ap/Kan de —1,0 mL. Ambas as placas patch e

5 a cultura de caldo foram incubadas durante a noite a 37°C em uma incubadora

padrão (de placas) ou em um banho de água agitado. Uma análise de PCR

baseada em célula inteira foi empregada para verificar que transformantes

continham o inserto de DNA. Aqui, a cultura de caldo LB Ap/Kan de —1,0

mL noturna foi transferida para um tubo de polipropileno de 1,5 mL e as

10 células foram colhidas por centrifugação em uma microcentrífuga Beckmann

(-3 min., temperatura ambiente, —12.000 X g). A pelota celular foi suspensa

em —200 µL de água estéril, e uma alíquota de —10 µL foi usada para

programar uma reação PCR de volume final de —50 µL contendo os

iniciadores de amplificação tanto diretos quanto inversos. A etapa de

15 desnaturação inicial a 95°C foi aumentada para 3 minutos para garantir

rompimento térmico das células bacterianas e liberação de DNA plasmídeo.

Um ciclador térmico ABI Model 9700 e um perfil de amplificação térmica de

três etapas, de 32 ciclos, i.e. 95°C, 45 s; 55-58°C, 45 s, 72°C, 1 min., foram

usados para amplificar o fragmento BASB203 das amostras de transformante

20 lisado. Após amplificação térmica, uma alíquota de —' 20 µL da reação foi

analisada por eletroforese em gel de agarose (0,8 % de agarose em um tampão

Tris-acetato-EDTA (TAE)). Fragmentos de DNA foram visualizados por

iluminação UV após eletroforese em gel e coloração com brometo de etídio

Um padrão de tamanho molecular de DNA (escada de 1 kb, Life

25 Technologies) foi submetido à eletroforese em paralelo com as amostras de

teste e foi usado para estimar o tamanho dos produtos de PCR.

Transformantes que produziram o produto de PCR de tamanho esperado

foram identificados como cepas contendo um construto de expressão de

proteína. Cepas contendo plasmídeo de expressão foram então analisadas para

76

a expressão induzível de proteína recombinante.

C: Análise de expressão de transformantes positivos para PCR.

Uma alíquota da cultura de semente noturna (-1,0 mL) foi

inoculada em um frasco Erlenmeyer de 125 mL contendo —25 mL de caldo

5 LB Ap/Kan e foi crescida a 37°C com agitação (-250 rpm) até que a

turbidez da cultura alcançasse 0.D.600 de —0,5, i.e. fase mid-log

(normalmente cerca de 1,5 - 2,0 horas). Neste momento aproximadamente

metade da cultura (-12,5 mL) foi transferido para um segundo frasco de

125 mL e expressão de proteína recombinante foi induzida pela adição de

10 IPTG (solução de estoque 1,0 M preparada em água estéril, Sigma) para

uma concentração final de 1,0 mM. Incubação de ambas culturas não-

induzidas e induzidas por IPTG continuou por um adicional de —4 horas a

37°C com agitação. Amostras (-1,0 mL) de ambas as culturas não-induzida

e induzida foram removidas após o período de indução e as células foram

15 coletadas por centrifugação em uma microcentrífuga na temperatura

ambiente por —3 minutos. Pelotas celulares individuais foram suspensas em

—50 µL de água estéril, então misturadas com um volume igual de tampão

de amostra 2X Laemelli SDS-PAGE contendo 2-mercapto-etanol, e

deixadas em banho de água fervente por —3 min para desnaturar a proteína.

20 Volumes iguais (15µL) de ambos os lisados celulares brutos induzidos

por IPTG e não-induzidos foram carregados em duplicada sobre gel de

poliacrilamida glicerina/Tris 12% (espessura de 1 mm Mini-gels, Novex).

As amostras de lisado induzido e não-induzido foram submetidas à

eletroforese juntas com marcadores de peso molecular pré-corados

25 (SeeBlue, Novex) sob condições convencionais usando um tampão de

corrida padrão de SDS/Tris/glicina(BioRad). Após eletroforese, um gel foi

corado com azul brilhante coommassie R250 (BioRad) e então descorada

para visualizar a(s) proteína(s) nova(as) induzível(eis) por IPTG. O

segundo gel foi electroblotted sobre membrana de PVDF (tamanho de poro

77

de 0,45 micrômetro, Novex) por —2 horas a 4°C usando uma aparelhagem

de blotting BioRad Mini-Protean II e tampão de transferência de metanol

de Towbin (20 %). Bloqueio da membrana e incubações de anticorpo foram

realizados de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Um anticorpo

5 monoclonal anti-RGS (His)3, seguido por um segundo anticorpo de coelho

anti-camundongo conjugado em HRP (QiaGen), foram usados para

confirmar a expressão e a identidade da proteína recombinante.

Visualização do padrão reativo de anticorpo anti-His foi realizada quer

usando um substrato insolúvel ABT quer usando um Hyperfilm com o

10 sistema quimioluminescente Amersham ECL.

Exemplo 2 Produção de proteína recombinante

Cepa bacteriana

Uma cepa de expressão recombinante de E. coli M15(pREP4)

contendo um plasmídeo (pQE30) ou BL21::DE3 contendo plasmídeo pET24d

15 codificador de proteína estafilocócica foi usada para produzir massa celular

para purificação de proteína recombinante.

Meio

O meio de fermentação usado para a produção de proteína

recombinante consistiu de caldo 2X YT (Difco) contendo 100µg/mL de Ap

20 e/ou 30 pg/mL de Km. Antiespumante foi adicionado no meio para o

fermentador a 0,25 mL/L (Antifoam 204, Sigma). Para induzir expressão da

proteína recombinante, IPTG (Isopropil-(3-D-Tiogalactopiranosídeo) foi

adicionado no fermentador (1 mM, final).

Produção de proteínas recombinantes

25 Sob condições nativas

IPTG foi adicionado em uma concentração final de 1 mM e a

cultura foi crescida por 4 horas adicionais. A cultura foi então centrifugada a

6.000 rpm por 10 minutos e a pelota foi ressuspensa em tampão fosfato

(KH2PO4, K2HPO4 50 mM, pH 7) incluindo um coquetel de inibidor de

78

protease. Esta amostra foi submetida à lise de pressão francesa usando pressão

de 150.000 kPa (2 corridas). Após centrifugação por 30 minutos a 15.000

rpm, o sobrenadante foi reservado para purificação adicional e NaCl foi

adicionado para 0,5 M. A amostra foi então carregada em uma resina Ni-

5 NTA (coluna XK 16 Pharmacia, resina Ni-NTA Qiagen) condicionada em

KH2PO4, K2HPO4 50 mM, pH 7. Após carregamento da amostra, a coluna foi

lavada com Tampão A (NaH2PO4 0,2 M pH7, NaCl 0,3 M, glicerol 10%).

Para eluir a proteína ligada, uma gradiente escalonado foi usado no qual

proporções diferentes de tampão B (NaH2PO4 0,2 M pH7, NaCl 0,3 M,

10 glicerol 10% e imidazol 200 mM) foram adicionadas no tampão A. A

proporção de tampão B foi gradualmente aumentada de 10% para 100%.

Após purificação, a fração eluída contendo a proteína foi reunida, concentrada

e dialisada contra KH2PO4/K2HPO4 0,002 M pH7, NaCl 0,15 M.

Este método foi usado para purificar CTfA, SdrG, IsdA, IsaB,

15 HarA, Atl-glicosamina e alfa-toxina.

Sob condições desnaturantes

IPTG foi adicionado para uma concentração final de 1 mM e a

cultura foi crescida por 4 horas adicionais. A cultura foi então centrifugada a

6.000 rpm por 10 minutos e a pelota foi ressuspensa em tampão fosfato

20 (K2HPO4, KH2PO4 50 mM pH 7) incluindo um coquetel de inibidor de

protease. Esta amostra foi submetida à lise de pressão francesa usando pressão

de 150.000 kPa (2 corridas). Após centrifugação por 30 minutos a 15.000

rpm, a pelota foi lavada com tampão fosfato incluindo uréia 1 M. A amostra

foi centrifugada por 30 min a 15.000 rpm e a pelota foi ressuspensa em uréia

25 8 M, NaH2PO4 0,1 M, NaC1 0,5M, Tris-HC1 0,01 M pH 8 e mantida durante a

noite na temperatura ambiente. A amostra foi centrifugada por 20 minutos a

15.000 rpm e o sobrenadante foi coletado para purificação adicional. A

amostra foi então carregada em uma resina Ni-NTA (coluna XK 16

Pharmacia, resina Ni-NTA Qiagen) condicionada em uréia 8 M, NaH2PO4 0,1

79

M, NaC1 0,5 M, Tris-HC1 0,01 M pH 8. Após passagem do fluxo, a coluna foi

lavada sucessivamente com tampão A (uréia 8 M, NaH2PO4 0,1 M, NaCl 0,5

M, Tris 0,01 M, pH 8.0), tampão C (uréia 8 M, NaH2PO4 0,1 M, 0.5M NaCl,

Tris 0,01 M, pH 6,3), tampão D (uréia 8 M, NaH2PO4 0,1 M, NaC1 0,5 M,

5 Tris 0,01 M, pH 5.9) e tampão E (uréia 8 M, NaH2PO4 0,1 M, NaCl 0,5 M,

Tris 0,01 M, pH 4.5). A proteína recombinante foi eluída da coluna durante as

lavagens com tampão D e E. A proteína recombinante desnaturada pôde ser

solubilizada em solução destituída de uréia. Para este propósito, a proteína

desnaturada contida em uréia 8 M foi sucessivamente dialisada contra uréia 4

10 M, Na2PO4 0,1 M, Tris-HC1 0,01 M, pH 7,1, uréia 2 M, NaH2PO4 0,1 M, Tris-

HC1 0,01 M, pH 7,1, arginina 0,5 Me KH2PO4/K2HPO4 0,002 M pH7,1, NaC1

0,15 M, arginina 0,5 M.

Este método foi usado para purificar Ebh (fragmento H2),

AaA, SdrC, FnbpA, Sbi, Atl-amidase e IsaA.

15 As proteínas purificadas foram dialisadas por SDS-PAGE. Os

resultados de uma proteína purificada sob condições nativas (alfa-toxina) e de

uma proteína purificada sob condições desnaturantes (SdrC) são mostrados

em Figuras 3 e 4.

Exemplo 3 Preparação de conjugados de polisssacarídeo

20 capsular de S. aureus usando CDAP

Química de ativação e copulação para PS8 nativo usando

CDAP:

SA08-TT004

Ativação e copulação foram realizadas na temperatura

25 ambiente sob agitação contínua. 10 mg de polissacarídeo nativo foram

dissolvidos para obter uma concentração de PS final de 2,5 mg/mL em NaC1

0,2 M. A solução foi então ajustada para pH 6,0+/-0,2 antes da etapa de

ativação.

No tempo 0, 50 jat de uma solução de CDAP (100 mg/mL

80

recém-preparado em acetonitrila /WFI, 50/50) foram adicionados

manualmente para alcançar uma razão apropriada de CDAP/PS (0,5/1).

Após 1,5 minutos o pH foi elevado para pH 9,00+/-0,05 por

adição de NaOH 0,5 M.

5 Adição de NaOH demora cerca de 1 minutos e pH é

estabelecido em pH 9,00+/-0,05 até adição de veículo.

No tempo de 4,5 minutos, 1,5 mL de TT (10 mg/mL em NaC1

0,2 M) foram adicionados para alcançar a razão apropriada de Proteína /PS

(1,5/1); pH foi imediatamente ajustado para pH de copulação de 9,00+/0,05.

10 A solução é deixada por uma hora sob regulação de pH manual.

Após a etapa de copulação, 0,5 mL de glicina 2 M (razão

gly/PS (p/p): 7,5/1) foi adicionado; pH foi imediatamente ajustado para

9,00+/-0,05. A solução foi deixada por 30 minutos sob regulação de pH

manual. Então o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart de 5µm

15 e injetado em Sephacryl S400HR (XK16/100). A vazão de fluxo foi fixada

em 30 mL/h, usando NaC1 150 mIVI.

As frações de eluição foram analisadas por resorcina e por

OCA. Frações de interesse foram reunidas e filtradas sobre Sterivex 0,22 pm.

O conjugado resultante teve uma razão deTT/PS (p/p) final de

20 1,05 como avaliado pelos ensaios de resorcinol e de Lowry.

Exemplo 4 Preparação de conjugados de polissacarídeo

capsular de S. aureus usando CDAP em polissacarídeos de tamanho

ajustado

Química de ativação e copulação para PS8 de tamanho

25 ajustado usando CDAP

PS é pesado tendo por base conteúdo de umidade teórico de

10%. 2 g de PS úmido, nativo foram dissolvidos durante a noite em WFI em

uma concentração inicial de 10 mg/mL. Antes do ajuste de tamanho, a

solução de PS nativo foi clarificada em um filtro de corte de 5 gm.

81

Uma aparelhagem homogeneizadora EMLILSIFLEX C-50, na

qual a célula de homogeneização foi substituída por uma câmara de interação

Microfluidics F20Y-0.75µm, foi usada para reduzir o peso molecular e a

viscosidade do polissacarídeo antes da etapa de ativação.

5 A redução de tamanho foi realizada a 68.948 kPa durante os

10 primeiros ciclos e então a 103.421 kPa para os 60 ciclos seguintes. O

progresso da redução de tamanho foi seguido em processo pela medição da

viscosidade. O ajuste de tamanho foi interrompido após 70 ciclos quando o

alvo de 2,74 ± 0,2 mPa.s foi alcançado.

10 Ativação e copulação foram realizadas na temperatura

ambiente sob agitação contínua.

50 mg de polissacarídeo 8 de tamanho ajustado foram diluídos

para obter uma concentração final de PS de 5 mg/mL em NaCl 0,2 M.

No tempo 0, 375 µL de uma solução de CDAP (100 mg/mL

15 recém-preparada em acetonitrila/WFI, 50/50) foram adicionados

manualmente para alcançar a razão apropriada de CDAP/PS (0,75/1).

Após 1 minuto o pH foi elevado para pH 9,00+/-0,05 pela

adição de NaOH 0,5 M.

No tempo 2,5 minutos, 10 mL de TT a 10 mg/mL em NaC1 0,2

20 M NaCl foram adicionados para alcançar a razão apropriada de Proteína/PS

(2/1); pH foi imediatamente ajustado para pH de copulação de 9,00+/0,05. A

solução foi deixada por 55 minutos sob regulação de pH manual.

Após etapa de copulação, 2,5 mL de glicina 2 M (razão de

gly/PS (p/p): 7,5/1) foram adicionados; pH foi imediatamente ajustado para

25 9,00+/-0,05 pelo regulador. A solução foi deixada por 30 minutos sob

regulação de pH manual.

Então o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart de

5 µm e injetado em Sephacryl S400HR (XK26/100). A vazão de fluxo foi

fixada em 60 mL/h.

82

As frações de eluição foram analisadas por resorcinol e por

dosagem de proteína. Frações de interesse foram reunidas e filtradas em

Millipack200 de 0,22 µm.

O conjugado resultante possui uma razão final de TT/PS de

5 1,94.


capsular de S. aureus usando EDAC

Química de ativação e copulação usando EDAC:

Conjugado de polissacarídeo capsular de tipo 8 - TT de S.

10 aureu:

Derivação de PS

Ativação e copulação foram realizadas em temperatura


30 mg de polissacarídeo nativo foram diluídos para obter uma

15 concentração final de polissacarídeo de 5 mg/mL em água. A solução foi

ajustada para pH 4,5-5,0 com HCl 0,5 N e então 66 µg de ADH foram

adicionados (2,2 mg/mg PS). Após dissolução completa, 60 mg de EDAC

foram adicionados (2 mg/mg PS). Após 70 min o pH foi elevado para pH 7,5

com NaOH 1 N para interromper a reação. ADH livre foi removido por

20 purificação em Sephacryl S 1 00HR (XI( 16/40). A vazão de fluxo foi fixada

em 60 mL/h usando NaC1 0,2 M como tampão de eluição. Uma redução de

tamanho foi feita por sonificação de 15 min permitindo uma filtração em filtro

millex (0,22 µm).

Copulação

25 Toxóide de tétano foi adicionado em 5 a 10 mg de

polissacarídeo derivado em NaC1 0,2 M e o pH foi ajustado para pH 5,0 ou

pH 6,0 pela adição de HC1 0,5 N. EDAC foi dissolvido em tampão Tris 0,1 M

pH 7,5 e então adicionado durante um período de 10 min (1/5 vol cada 2

min). De acordo com as condições usadas (veja Tabela 6), a reação foi

83

interrompida após entre 30 e 180 minutos pela adição de Tris-HC11M de pH

7,5. Antes da purificação em Sephacryl S400HR, o conjugado foi clarificado

usando um filtro Minisart 5 µm . Alternativamente, o conjugado foi

clarificado por uma etapa de sonificação de 5 minutos. O conjugado foi então

5 injetado em Sephacryl S400HR (X1(16/100). A vazão de fluxo foi fixada em

30 mL/h usando NaCl 150 mM como tampão de eluição. A combinação de

eluição foi selecionada baseando-se em perfis de resorcinol e 1113CA (que

medem dosagem de polissacarídeo e de proteína respectivamente). O

conjugado foi filtrado em uma membrana de esterilização de 0,22 p.m

10 (Millipack 20) a 10 mL/min.

Tabela 5Conjugado Tempo de

copulação[PS (AH)](mg/mL)

[TT (AH)](mg/mL)

[reagente MAC](mg,/mg PS)

SA08-TT011 40 min 3,58 6,45 0,5/15A08-TT015* 180 min 2 4,0 0,25/15A08-TT017 30 min 3,75 7,5 0,25/15A08-TT018 50 min 3,75 7,5 0,10/1

Tabela 5: copulação feita em pH 6,0

Os conjugados resultantes possuem as seguintes características

mostradas em Tabela 6:

Tabela 6Conjugado razão inicial de

TT/PS (p/p)razão final deTT/PS (p/p)

Rendimento derecuperação de

PS (%)

Rendimento nafiltração (%)

5A08-TT011 2/1 2,43/1 48 995A08-TT015 2/1 2,40/1 53 1045A08-TT017 2/1 2,41/1 44 107SA08-TT018 2/1 2,40/1 42 106

15 Polissacarídeo de tipo 8 de S. aureus também foi tratado por

microfluidização antes de derivação com ADH

Derivação de PS

Ativação e copulação foram realizadas em temperatura


20 200 mg de polissacarídeo de tamanho ajustado são diluídos

para obter uma concentração final de PS de 10 mg/mL em água. Então 440

84

mg de ADH foram adicionados (2,2 mg/mg PS). A solução foi ajustada

para pH 4,7 com HC1 1 N antes da adição de 400 mg de EDAC (2 mg/mg

PS). Após 60 min o pH foi elevado para pH 7,5 com NaOH 5 M

para interromper a reação. A mistura foi concentrada em Amicon Ultra

5 (corte de 10.000 MWCO). Antes da purificação em Sephacryl S200HR

(X1(16/100), o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart de 5 pm.

A vazão de fluxo foi fixada em 30 mL/h usando NaC1 0,150 M como tampão

de eluição.

Copulação

10 100 mg de TT foram adicionados em 50 mg de polissacarídeo

derivado em NaCl 0,2 Ml. O pH foi ajustado para pH 5,0 ± 0,02 pela adição

de HC1 0,3 N. EDAC foi dissolvido em tampão Tris 0,1M de pH 7,5 e então

adicionado durante um período de 10 min (1/10 vol cada minuto). De acordo

com as condições usadas (veja Tabela 8), a reação foi interrompida após entre

15 30 e 180 minutos pela adição de Tris-HC1 1 M pH 7,5. Antes da purificação

em Sephacryl S400HR, o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart

de 5 1.1m . O conjugado foi então injetado em Sephacryl S400HR

(XK50/100). A vazão de fluxo foi fixada em 60 mL/h usando NaCl 150 mNI

como tampão de eluição. A combinação de eluição foi selecionada

20 tendo por base perfis de resorcinol e pBCA (que medem a dosagem de

polissacarídeo e de proteína respectivamente). Então, o conjugado foi

filtrado em uma membrana de esterilização de 0,22 pm (Millipack 20)

a 10 mL/min.

Tabela 7Conjugado Tempo de

copulação[PS-AH](mg/mL)

[TT] (mg/mL) [EDAC] (mg/mg PS)

5A08-TT045 65 min 3,83 7,66 0,1SA08-TT046 45 min 3,75 7,5 0,25A08-TT047 30 min 5,0 15,0 0,25A08-TT048 120 min 5,0 10,0 0,055A08-TT049* 50 min 5,0 10,0 0,1

* EDAC adicionado em "uma vez"

25

85

Tabela 8Conjugado Razão inicial de

TT/PS (p/p)Razão final deTT/PS (p/p)


PS (%)


SA08-TT045 2/1 2,20/1 57 1015A08-TT046 2/1 2,80/1SA08-TT047 3/1 Não purificado

por gel- -

5A08-TT048 2/1 3,35 30 1015A08-TT049 2/1 3,5 24 106


capsular de S. aureus Capsular usando EDAC em polissacarídeo 8 de S.

aureus de-O-acetilado

5 De-O-acetilação

NaOH 0,1 N foi adicionado em 16 mL de PS de

tamanho ajustado (10 mg/mL) para obter uma concentração final de

PS de 9 mg/mL e uma concentração final de NaOH de 0,1 N. Após um

tratamento de 1 ou 2 h a 37°C, o PS teve um nível de 0-acetilação de 35 e

10 12% (dosagem de Hestrin) respectivamente em comparação com o PS não

tratado.

NaOH 0,1 N foi adicionado em 19 mL de PS de

tamanho ajustado (10 mg/mL) para obter uma concentração final de PS

de 9,5 mg/mL e uma concentração final de NaOH de 0,05 N. Após um

15 tratamento de 1 ou 2 h a 37°C, PS teve um nível de 0-acetilação de 78

e 58% (dosagem de Hestrin) respectivamente em comparação com o PS não

tratado.

A etapa de derivação foi realizada como mostrado previamente

para um PS não tratado.

20 Tabela 9Conjugado Nível de 0-acetila ADH/PS p/p*5A08-TT056 35 9,35A08-TT057 12 13,1SA08-TT058 78 5,35A08-TT059 58 8,2

* ensaio TNBS

86

Remoção dos grupos 0-acetila resultou em uma

disponibilidade aumentada de grupos carboxílico reativos. De fato, o nível de

derivação de um PS possuindo apenas 12% de grupos 0-acetila foi ± 2,5-

vezes superior ao daquele possuindo 78% de grupos 0-acetila.

5 Copulação foi realizada como mostrado previamente para um

PS não tratado.

Tabela 10Conjugado Nível de O-

acetilaTempo decopulação

[PS-AH](mg/mL)

[TT](mg/mL)

[MAC](mg/mg PS)

SA08-TT056 35 45 min 2,87 5,74 0,55A08-TT057 12 30 min 2,62 5,24 0,55A08-TT058 78 50 min 3,16 6,32 0,55A08-TT059 58 40 min 2,53 5 0,5

Tabela 11Conjugado Razão inicial

de TT/PS (p/p)Razão final deTT/PS (p/p)

Rendimento derecuperação de PS

(%)


SA08-TT056 2/1 1,70/1 51,3 100SA08-TT057 2/1 1,78/1 63,0 105,45A08-TT058 2/1 2,08/1 46,3 99,65A08-TT059 2/1 1,86/1 50,8 99,2

Exemplo 7 Conjugação de dPNAG

10 Ativação e copulação de dPNAG:

Conjugados de dPNAG-TT

Os seguintes conjugados foram produzidos usando as

abordagens descritas aqui abaixo:

dPNAG-TT010: dPNAG-S-GMBS + DTT tratado TT-LC-SPDP

dPNAG-TT011: dPNAG-S-GMBS + DTT tratado TT-LC-SPDP

dPNAG-TT012: dPNAG-S-GMBS + DTT tratado TT-SPDP

dPNAG-TT014: dPNAG-SPDP + DTT tratado TT-SPDP

dPNAG-TT017:DTT tratado dPNAG-SPDP + TT-LC-SPDP

dPNAG-TT019: dPNAG-S-GMBS + DTT tratado TT-SPDP

dPNAG-TT020: dPNAG-S-GMBS +DTT tratado TT-SPDP

dPNAG

15 1 g de PNAG foi dissolvido em HC1 5 N em uma concentração

87

de 20mg/mL e foi incubado por 1 hora. Foi então neutralizado com NaOH 5

N. A solução foi clarificada em uma membrana de 5µm e purificada em

Sephacryl S400HR. Frações de interesse, correspondendo ao "tamanho

molecular médio" (veja, Infection e Immunity, 70: 4433-4440 (2002)), foram

5 reunidas e concentradas antes do tratamento de de-N-acetilação.

A solução foi ajustada em NaOH 1 M e deixada 24 horas a

37°C. Após neutralização, o produto foi submetido à diálise e concentração.

Ativação de dPNAG

S-GMBS (N-(y-Maleimido-butiriloxi)-sulfo-succimida, Pierce)

10 foi adicionada em dPNAG em NaCl 0,2 M (razão de S-GMBS/PS (p/p):1/1) e

incubado 2h na temperatura ambiente em pH 7,0 (regulação de pH usando

NaOH 1 M). GMBS em excesso e subprodutos foram removidos por

purificação em Toyopearl HW-40F usando PBS, EDTA 10 mM, NaC150 mM

pH 7,2 como tampão de eluição com uma vazão de fluxo fixada em 60 mL/h.

15 A combinação de eluição foi selecionada em função da densidade óptica

(UV=206 nm) e então concentrada em tubos Vivaspin 3.000 MWCO ou

Amicon Ultra 10.000 MWCO.

Copulação

dPNAG ativado por GMBS e TT-SPDP reduzido por DTT

20 foram misturados na temperatura ambiente. De acordo com as condições

usadas a reação foi interrompida após 20-120 min pela adição de cisteína (4

mg/mL em tampão fosfato de Na de pH 8,0) por 30 minutos. O conjugado foi

clarificado em um filtro de 5 gin e injetado em resina Sephacryl S300HR

(XK16/100) para purificação. Eluição foi realizada em NaC1 200 mM com

25 uma vazão de fluxo fixada em 30 mL/h. As frações de eluição foram

analisadas por hexosamina e por dosagem de proteína. Frações de interesse

foram reunidas e filtradas em Sterivex 0,22 p,m. O conjugado final foi testado

para composição de polissacarídeo (dosagem de hexosamina) e de proteína

(dosagem de Lowry).

88

Tabela 12Conjugado Nível de N-

acetilação[dPNAG]mg/mL

[TT]mg/mL

Escala PS(mg)

Tempo decopulação (min)

dPNAG-TT 010 10* 15 15 30 120dPNAG-TT 011 10* 12 24 20 120dPNAG-TT 012 10* 17,5 35 22 80dPNAG-TT 019 34 5 10 10 20dPNAG-TT 020 34 2 2 10 20

*Não realizado no lote usado na conjugação mas estimado em um lote prévio por NMRusando o mesmo método de N-acetilação.

Tabela 13Conjugado Razão inicial de

TT/PS (p/p)Razão final deTT/PS (p/p)


PS (%)


dPNAG-TT010 1/1 1,86/1 43 99dPNAG-TT011 2/1 2,86/1 56 99dPNAG-TT012 2/1 2,29/1 61 108dPNAG-TT019 2/1 1,45/1 81 97dPNAG-TT020 1/1 0,89/1 82 109

dPNAG-SPDP:

Um excesso molar de 5 vezes de SPDP (N-Succinimidil-3-(2-

5 Piridilditio)Propionato, MW: 312,4, Pierce) dissolvido em DMSO (dimetil-

sulfóxido, Merck) foi adicionado em 100 mg de dPNAG a 5mg/mL em

fosfato de Na 100 mM, pH 7,2) e incubado 1 h na temperatura ambiente.

Antes da purificação em Sephacryl S 100HR (XK16/40) a mistura reacional

foi concentrada para ± 6 mL em Amicon Ultra 10.000 MWCO (centrifugação

10 a 3000 rpm durante 28 min). Eluição foi realizada em tampão fosfato pH 7,4

com uma vazão de fluxo fixada em 60 mL/h. As frações de interesse (lidas em

206 nm) foram reunidas e concentradas para 1,1 mL em Amicon Ultra 10.000

MWCO (centrifugação a 3000 rpm durante 30 min).

TT-SPDP:

15 Um excesso molar de 15 vezes de SPDP (Pierce) dissolvido

em DMSO (dimetil-sulfóxido, Merck) foi adicionado em 1 g de TT (50

mg/mL) em fosfato de Na 100 mM, pH 7,2 e incubado 80 min na temperatura

ambiente. Então o produto foi injetado em Sephacryl S 100HR (XK16/40) e

eluído em acetato de Na 100 mM = pH 5,6, NaC1 100 mM, EDTA 1 mM com

89

uma vazão de fluxo fixada em 60 mL/h. A combinação de eluição foi

selecionada em função da densidade óptica (UV=280nm) e então concentrada

para 19,6 mL em Amicon Ultra 10.000 MWCO (centrifugação a 3000 rpm

durante 75 min).

5 TT-LC-SPDP foi produzido como TT-SPDP mas usando LC-

SPDP (6[3-(2piridilditio)-propionamidol-hexanoato de succinimidila, Pierce)

e em um tempo de incubação de 60 min.

TT-SH ou TT-LC-SH

DTT foi adicionado em TT-SPDP ou TT-LC-SPDP em uma

10 razão de DTT/TT (mg/mg) de 0,7/1. Após 2 h na temperatura ambiente, a

liberação de piridina-2-tiona foi seguida por sua absorbância característica em

343 nm. A proteína tiolada foi purificada de DTT em excesso por filtração em

gel (PD-10, Amersham). Após concentração em Amicon Ultra 10.000

MWCO, o conteúdo de proteína foi estimado por dosagem de Lowry.

15 dPNAG-SPDP + TT-SH ou TT-LC-SH (dPNAG-11014 e 016)

Copulação foi realizada na temperatura ambiente sob

condições de agitação e com uma razão inicial de TT/PS (p/p) de 2/1.

dPNAG e TT-SH foram misturados com o objetivo de obter

uma concentração final de PS de 20 mg/mL e uma concentração final de

20 proteína de40 mg/mL. Após 30 min, grupos sulfidrila não reagidos foram

extintos pela adição de 2-iodo-acetamida (Merck).

dPNAG e TT-LC-SH foram misturados com o objetivo de

obter uma concentração final de PS de 10 mg/mL e uma concentração final de

proteína de20 mg/mL. Após 75 min, grupos sulfidrila não reagidos foram

25 extintos pela adição de 2-iodo-acetamida (Merck).

Então o conjugado é clarificado usando um filtro Minisart de 5

µ,m e injetado em Sephacryl S300HR (XK16/100). Eluição foi realizada em

NaC1 200 mM com uma vazão de fluxo fixada em 30 mL/h.

As frações de eluição foram analisadas por dosagem de

90

hexosamina e por dosagem de proteína. Frações de interesse foram reunidas e

filtradas em Sterivex 0,22 p,m.

Os conjugados resultantes possuem uma razão final de TT/PS

(p/p) de 2,18 (TT-SH) e 2,24 (TT-LCSH).

5 Tiolação de dPNAG

11,6 mg de DTT (1,4-Ditiotreitol, Boerhinger Mannheim,

MW: 154,24) foram adicionados em 16,5 mg de dPNAG-SPDP. Após 2 h na

temperatura ambiente, a liberação de piridina-2-tiona foi seguida por sua

absorbância característica em 343 nm. O PS tiolado foi purificado do DTT em

10 excesso por filtração em gel (Toyopearl HW40F) e então concentrado para

860 µI, em Amicon Ultra 10.000 MWCO.

dPNAG-SH + TT-SPDP (dPNAG-TT017)

Copulação foi realizada na temperatura ambiente sob agitação

contínua e com uma razão inicial de relação TT/PS (p/p) de 1,7/1.

15 dPNAG-SH e TT-SPDP foram misturados com o objetivo de

obter uma concentração final de PS de 7,73 mg/mL e uma concentração final

de proteína de13,3 mg/mL. Após 90 min, grupos sulfidrila não reagidos foram

extintos pela adição de 2-iodo-acetamida (Merck).

Então o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart de

20 5µm e injetado em Sephacryl S300HR (XK16/100). Eluição foi realizada em

NaC1200 mM com uma vazão de fluxo fixada em 30 mL/h.

As frações de eluição são analisadas por dosagem de

hexosamina e por dosagem de proteína. Frações de interesse foram reunidas e

filtradas em Sterivex 0,22

25 O conjugado resultante possui uma razão final de TT/PS (p/p) de

2,74.

Exemplo 8 Formulação

Composições de adjuvante

Os conjugados foram inoculados quer não adjuvantados quer

91

adjuvantados com adjuvante A, possuindo a seguinte composição:

Composição de Adjuvante A

Qualitativa Quantitativa (por dose de 0,5 mL)

Lipossomos:

5 - DOPC 1 mg

- colesterol 0,25 mg

3DMPL 50 lig

QS21 50 µg

Tampão KH2PO4 13,124 mg

10 Tampão Na2HPO4 10,290 mg

NaC1 2,922 mg

(100 mM)

Solvente WFI q.s. ad 0,5 mL

pH 6,1

15 1. Concentração total de PO4 = 50 mM

Exemplo 9

Experimentos em animais.

Camundongos fêmeas CD-1, de 8 a 10 semanas de idade, são

obtidos de Charles River Laboratories, Kingston, Mass. Para estudos de

20 letalidade, cinco grupos de 9 a 11 camundongos CD-1 são desafiados

intraperitonealmente (i.p.) com diluições seriais de S. aureus crescida sobre

placas de CSA. Os tamanhos inoculares variam de -4010 a 108

CFU/camundongo. Mortalidade é avaliada em uma base diária por 3 dias. As

doses letais 50% (LD50s) são estimadas pelo uso de um modelo de probit da

25 relação de dose-resposta. A hipótese nula de LD50s comuns foi testada pelo

teste de taxa de probabilidade. Bacteremia subletal é iniciada por desafio dos

grupos de 8 a 20 pela rota intravenosa (i.v.) com — 2 x 108 CFU/camundongo

ou pela rota i.p. com — 2 x 107 CFU/camundongo. Após inoculação grupos de

animais separados são sangrados da cauda em tempos específicos, e os níveis

92

de bacteremia são estimados por contagens de placa quantitativa realizadas

em duplicata sobre placas de ágar de soja tríptica com sangue de ovelha 5%

(Becton Dickinson Microbiology Systems). Significância estatística é

determinada pela modificação de Welch do teste t de Student não-pareado.

5 Exemplo 10

Imunogenicidade de conjugados de dPNAG-TT e PS8-TT

de S. aureus

Grupos de 30 camundongos foram inoculados

subcutaneamente com conjugado de PS8-TT de S. aureus em uma dose de

10 sacarídeo de 3 µg, quer adjuvantado quer combinado com adjuvante A, nos

dias 0, 14, 28 e 42. No dia 0, os camundongos receberam uma primeira dose

de sacarídeo incluindo entre 0,001 e 0,013 µg. As outras três imunizações

foram feitas com uma dose de 0,3 µg em solução salina. No dia 55 soro foi

coletado dos camundongos e cada amostra de soro foi testada por ELISA para

15 avaliar a resposta imune contra PS8. Grupos de 10 camundongos foram

usados nos grupos de controle e estes foram inoculados com quer solução

salina quer solução salina contendo adjuvante A.

O PS8 purificado foi revestido a 2 µg/mL em solução salina

tamponada com fosfato (PBS) sobre placas de microtítulo de ligação alta

20 (Nunc Maxisorp) durante a noite a 4°C. As placas foram bloqueadas com

PBS-BSA 1% por 30 min na temperatura ambiente com agitação. Os anti-

soros de camundongos foram pré-diluídos 1/100, então diluições adicionais

duplas foram realizadas em microplacas que foram incubadas a 37°C por 1

hora. Após lavagem, anticorpo murino lavado foi detectado usando IgG

25 (H+L) de Cabra Anti-Camundongo affiniPure conjugada com peroxidase de

Jackson ImmunoLaboratories inc. (ref: 115-035-003) diluída 1:5.000 em

PBS-tween 0,05%. Os anticorpos de detecção foram incubados por 30

minutos na temperatura ambiente com agitação. A cor foi revelada usando 4

mg de OPD (Sigma) + 5 µL de H202 por 10 mL de tampão citrato 0,1 M de

93

pH 4,5 por 15 minutos no escuro na temperatura ambiente. A reação foi

interrompida com 50 µL de HC1, e a densidade óptica foi lida a 490 nm em

relação a 650 nm.

Os resultados foram expressados em títulos de ponto-médio e

5 o GMT foi calculado para 30 amostras (10 para controles). Os resultados são

mostrados em Tabela 14 abaixo.

Tabela 14

Conjugado Título de anti-PS8 (GMT)

não-adsorvido

Título de anti-PS8 (GMT)

Adjuvante A

SA08-TT011 4714 2109

SA08-TT015 2806 5631

SA08-TT017 3770 4396

SA08-TT018 5349 4748

Controle 50 50

Grupos de 30 camundongos foram inoculados

subcutaneamente com conjugados de dPNAG-TT de S. aureus (contendo

10 dPNAG que estava entre 10% e 30% N-acetilado) em uma dose de

sacarídeo de 0,31 µg em NaC1 200 mM, quer não-adjuvantado quer

combinado com adjuvante A. Os camundongos receberam três

inoculações nos dias 0, 14 e 28. No dia 41 ou 42 soro foi coletado dos

camundongos e cada amostra de soro foi testada por ELISA para avaliar a

15 resposta imune contra PNAG. Grupos de 10 camundongos foram usados

nos grupos de controle e estes foram inoculados com solução salina ou

com apenas adjuvante.

Anti-PNAG ELISA:

PNAG purificado (2,5 µg/mL) misturado com HSA metilado

20 (2,5 n/mL) diluído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) foi

revestido sobre placas de microtítulo de ligação alta (Nunc Maxisorp) durante

a noite a 4°C.

As placas foram bloqueadas com PBS-BSA 1%, 30 min na

RT com agitação. Os anti-soros de camundongos foram pré-diluídos

94

1/100, então diluições adicionais duplas foram feitas em microplacas e

incubadas na temperatura ambiente com agitação por 1 hora. Após

lavagem, anticorpo murino lavado foi detectado usando IgG (H+L) de

Cabra Anti-Camundongo affiniPure conjugada com peroxidase de Jackson

5 ImmunoLaboratories inc. (ref: 115-035-003) diluída 1:5.000 em PBS-

BSA 0,2%-tween 0,05%. Os anticorpos de detecção foram incubados por

30 minutos na temperatura ambiente com agitação. A cor foi revelada

usando 4 mg de OPD (Sigma) + 5µL de H202 por 10 mL de tampão

citrato 0,1 M de pH 4,5 por 15 minutos no escuro na temperatura

10 ambiente. A reação foi interrompida com 50 p,L de HC1, e a densidade

óptica foi lida a 490 nm em relação a 650 nm.

Um GMT foi calculado para 30 amostras (10 para controles).

Tabela 15Conjugado Anti-PNAG GMT não-

adsorvidoAnti-PNAG GMT

Adjuvante A

dPNAG-TT010 1371 28465

dPNAG-TT011 1133 40899

dPNAG-TT019 425 13429

dPNAG-TT020 656 10080

dPNAG-TT014 342 9806

dPNAG-TT017 203 8094

dPNAG-TT012 398 40509

dPNAG-TT016 719 7937

Controle 50 50

Exemplo 11 Imunogenicidade de conjugados de PS*-TT

15 preparados pelo método de CDAP

Resultados

Tabela 16Conjugado Anti PS8 GMT após três

inoculações em camundongosAnti-PS8 GMT após duas

inoculações em camundongosSAPS8-TT-04 Specol 207068 41326

SAPS8-TT-04 Adjuvante A 47405 15577SAPS8-TT-04 A1PO4 7380 4510

Specol 50Adjuvante A 50AIPO,' 50

95

Exemplo 12

Ensaio de opsonofagocitose.

O extermínio opsonofagocítica in vitro de S. aureus por

leucócitos polimorfonucleares de humano (PMNs) é realizada como descrito

5 em Xu et al. 1992 Infect. Immun. 60; 1358. PMNs de humano são preparados

de sangue heparinizado por sedimentação em dextrano T250 3%. A mistura

reacional opsônica (1 mL) contém — 106 PMNs em meio RPMI 1640

suplementado com 10% de soro fetal bovino termicamente inativado, —108

CFU de S-aureus, e 0,1 mL de soro de teste ou de preparação de IgG. Soro de

10 coelho hiper-imunizado é usado como um controle positivo, e 0,1 mL de soro

de coelho não-imune foi usado como uma fonte completa para as amostras de

IgG. As misturas reacionais são incubadas a 37°C, e amostras bacterianas são

transferidas a 0, 60, e 120 min para dentro de água e subseqüentemente

diluídas, espalhadas sobre placas de ágar de soja tríptica, e inoculadas a 37°C

15 para contagem bacteriana após incubação durante a noite.

Exemplo 13

Imunogenicidade de proteínas estafilocócicas em

camundongos e coelhos

Animais foram imunizados com proteínas estafilocócicas

20 purificadas com o propósito de gerar soros hiper-imunes. Camundongos

foram imunizados três vezes (dias 0, 14 e 28) com 10 µg de cada uma das

proteínas adjuvantadas em Specol. Coelhos foram imunizados três vezes (dias

0, 21 e 42) com 20 µg de cada uma das proteínas adjuvantadas em Specol.

Soros imunes foram coletados e avaliados em ELISA de anti-células inteiras

25 mortas e anti-proteína.

ELISA anti-proteína:

A proteína purificada foi revestida a 1 µg/mL em solução

salina tamponada com fosfato (PBS) sobre placas de microtítulo de ligação

alta (Nunc Maxisorp) durante a noite a 4°C. As placas foram bloqueadas com

96

PBS-BSA 1%, por 30 min na RT com agitação. As amostras de teste foram

então diluídas 1/1.000 e incubadas na temperatura ambiente por 1 hora com

agitação. Após lavagem, anticorpo de coelho ou murino foi detectado usando

IgG (H+L) de Cabra Anti-Camundongo AffiniPure conjugada com

5 peroxidase (ref: 115-035-003) ou IgG (H+L) de Cabra Anti-Coelho

AffiniPure (ref: 11-035-003) de Jackson ImmunoLaboratories inc. diluída

1:5000 em PBS-tween 0,05%. Os anticorpos de detecção foram incubados por

30 min. na temperatura ambiente com agitação. A cor foi revelada usando 4

mg de OPD (Sigma) + 5 µL H202 por 10 mL de tampão citrato 0,1 M de pH

10 4,5 por 15 minutos no escuro na temperatura ambiente. A reação foi

interrompida com 50 vtL de HC1, e a densidade óptica foi lida a 490 nm em

relação a 650 nm.

A O.D. para uma diluição de 1/1.000 de Pós III foi comparada

com a O.D. obtida com a mesma diluição de soros Pré-imunes.

15 Resultados gerados com soros de camundongos e de coelhos

são apresentados em Figura 5. Uma soroconversão boa contra cada antígeno

foi observada. Avaliação de soros direcionados contra SBI foi prejudicada

devido à atividade de ligação de Ig desta proteína.

ELISA anti-células inteiras mortas:

20 Células inteiras mortas (inativadas por calor ou formaldeído)

de S. aureus tipos 5 e 8 ou S. epidermidis cepa Hay foram revestidas a 20

µg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) sobre placas de

microtítulo de ligação alta (Nunc Maxisorp) durante a noite a 4°C com

evaporação. As placas foram bloqueadas com PBS-BSA 1% 30 min na

25 temperatura ambiente com agitação. Proteína A foi neutralizada pela adição

de 10 µg/mL de Anti-Proteína A de Galinha Purificada por Afinidade (ICL

ref: CPA-65A-2) diluída em PBS-tween 0,05% seguido por incubação por 1

hora na temperatura ambiente. As amostras de teste foram então diluídas duas

vezes sobre a microplaca em PBS-0,05% a partir de uma diluição inicial a

97

1/10 e incubadas por 1 hora na temperatura ambiente com agitação. Após

lavagem, anticorpo de coelho ou murino foi detectado usando IgG (H+L) de

Cabra Anti-Camundongo AffiniPure conjugada com peroxidase (ref: 115-

035-003) ou IgG (H+L) de Cabra Anti-Coelho AffiniPure (ref: 11-035-003)

5 de Jackson ImmunoLaboratories inc. diluída 1:5000 em PBS-tween 0,05%.

Os anticorpos de detecção foram incubados por 30 min. na temperatura

ambiente com agitação. A cor foi revelada usando 4 mg de OPD (Sigma) + 5

µI, H202 por 10 mL de tampão citrato 0,1 M de pH 4,5 for 15 minutos no

escuro, na temperatura ambiente. A reação foi interrompida com 50 ilL de

10 HC1, e a densidade óptica foi lida a 490 nm em relação a 650 nm.

Deve ser notado que os níveis de expressão de proteínas em

estafilococos variarão dependendo das condições de cultura. Portanto um

resultado negativo pode refletir a escolha de condições de cultura incorretas

em vez de uma falta de imunogenicidade.

15 Os resultados usando soros de camundongos são mostrados em

Tabela 17 e alguns dos gráficos são mostrados em figura 6. Um

reconhecimento fraco de S. aureus cepa 5 é observado com soros

direcionados contra SdrC, FnbpA, Ebh, Sbi e IsaA. Reconhecimento de S.

aureus cepa 8 é apenas observado com soro direcionado contra Sbi.

20 Reconhecimento fraco de S. epidermidis Hay é observado com soros

direcionados contra Atl amidase, MRPII, IsdA, lsaA, Ebh, Aaa e Sbi.

Uma seleção de resultados gerados usando soros de coelho é

mostrada em figura 7 e resumida em Tabela 18. Reconhecimento muito bom

das três cepas foi observado com IsaA e IsdB. Um reconhecimento fraco das

25 três cepas foi observado com HarA embora animais apenas receberam uma

injeção em vez de três injeções usadas para as outras proteínas.

Tabela 17Nome da proteína Reage sobre SA5 Reage sobre SA8 Reage sobre SE Hay

IsaA (+) (+) (+)

CTfA - (+) (+)Atl amidase - - ++

98

SdrG - - -Glicosamidase - - -

IsdA - - ++Alfa-toxina - - -

SrdC ++ (+) -Ebh + - +AaA - - ++MRPII - - ++

Sbi ++ ++ +++

FnbpA + + (+)

Tabela 18Nome da proteína Reage sobre SA5 Reage sobre SA8 Reage sobre SE Hay

IsaA -I--H- -Hf* -H-E

CTfA + ++ ++Atl amidase - ++ +

IsdB +++ +++ +++

SdrG + + +Glicosamidase - - -HarA (1 inject.) + + +

IsdA - - -Alfa-toxina - - +

SrdC - - -Ebh - + -AaA - - -MRPII - - ++Sbi - -+++

FnbpA - ++ ++

Exemplo 14

Eficácia de combinações de proteínas estafilocócicas em

um modelo de colonização nasal.

5 Quinze grupos de ratos de algodão foram inoculados com

combinações de oito antígenos estafilocócicos e cinco ratos de algodão que

atuaram como controles não foram tratados com antígeno. Estes dezesseis

grupos são os seguintes:

Grupo 1 - Atl-glicosamina, Atl-amidase, AAA, alfa-toxina, SdrC,

10 SdrG, Ebh, Sbi

Grupo 2 - Atl-glicosamina, Atl-amidase, IsdA, IsdB, CTfA, SdrC,

Ebh, FnbpA

Grupo 3 - Atl-glicosamina, Atl-amidase, HarA, IsdA, MRPII, IsdB,

AAA, alfa-toxina

99

Grupo 4 - Atl-glicosamina, HarA, IsdA, AAA, CTfA, IsaA, Ebh,

Sbi

FnbpA

5 Grupo 6 - IsdA, IsdB, AAA, alfa-toxina, CTfA, SdrG, Sbi, FnbpA

Grupo 7 - Atl-aminidase, IsdA, MRPII, AAA, IsaA, SdrG, Ebh,

FnbpA

Grupo 5 - HarA, MRPI1, AAA, alfa-toxina, CTfA, SdrC, Ebh,

Grupo 8 - Controle

Grupo 9 - Atl-glicosamina, IsdA, MRPII, alfa-toxina, IsaA, SdrC,

10 Sbi, FnbpA

Grupo 10 - Atl-glicosamina, MRPII, IsdB, AAA, CTfA, IsaA,

SdrC, SdrG

Grupo 11- Atl-aminidase, MRPII, IsdB, alfa-toxina, CTfA, IsaA,

Ebh, Sbi

15 Grupo 12 - Atl-glicosamina, HarA, IsdB, alfa-toxina, IsaA, SdrG,

Ebh, FnbpA

Grupo 13 - Atl-amidase, HarA, IsdB, AAA, IsaA, SdrC, Sbi,

FnbpA

Grupo 14 -Atl-glicosamina, Atl-amidase, HarA, MRPII, CTfA,

20 SdrG, Sbi, FnbpA

Grupo 15 - Atl-amidase, HarA, IsdA, alfa-toxina, CTfA, IsaA,

SdfC, SdrG

Grupo 16 - HarA, IsdA, MRPII, IsdB, SdrC, SdrG, Ebh, Sbi

Cada mistura de antígenos continha 3 µg de cada antígeno

25 misturados com um adjuvante feito de lipossomos contendo MPL e QS21. Os

ratos de algodão foram inoculados três vezes nos dias 1, 14 e 28 do

experimento. Duas semanas após inoculação, as eficácias das imunizações

foram ensaiadas usando um ensaio de colonização nasal como descrito em

Kokai-Kun et al. (2003) Antimicrob. Agents. Chemother. 47; 1589-1597.

100

Análise de regressão linear múltipla clássica foi realizada

sobre os dados usando programa de computador "Design Expert 6". A

presença de um antígeno foi codificada como +1 e a ausência de um antígeno

por -1. Usando a equação do modelo foi possível determinar quais antígenos

5 foram os antígenos chave que produziram um decréscimo grande no número

de colônias por nariz.

Resultados

Os resultados do ensaio de colonização nasal são mostrados

em Tabela 19. O grupo de controle teve um logCFU/nariz médio de 3,51335 e

10 um decréscimo em colonização nasal pôde ser visto para todos os grupos de

ratos de algodão com proteínas estafilocócicas. Grupos 4, 9 e 13 mostraram o

decréscimo mais alto em colonização nasal com um decréscimo de mais de 2

logs em CFU/nariz. Grupos 12 e 16 também deram bons resultados,

mostrando um decréscimo de cerca de logs em CFU/nariz.

15 Tabela 19Grupo LogCFU/nariz médio observado LogCFU/nariz predito

1 1,77527 2,035602 2,90435 2,526843 1,96556 2,230334 1,27748 1,218725 1,67304 1,931286 2,79745 2,981937 2,21481 2,307058 3,51355 3,473179 1,22480 1,4408010 2,03085 1,9320411 2,02522 1,8158112 1,53402 1,7099613 1,36063 1,4910014 2,31201 1,7390915 2,22979 1,9822316 1,58109 1,44004

A contribuição de antígenos específicos dentro da mistura de

antígenos foi calculada usando análise de regressão múltipla dos dados de

colonização nasal. O modelo final contém os sete melhores antígenos.

Resultados para estes antígenos são mostrados em Tabela 20. Dentro do

101

contexto da mistura de proteínas, a inclusão de HarA deu o decréscimo mais

alto em colonização nasal, seguido por IsaA, Sbi, SdrC, autolisina-

glicosamina, MRPII e Ebh.

Tabela 20 Efeitos em diferença de loqCFU/nariz e razão de

5 CFU/nariz para os sete melhores antígenos no modelo e valores de p

correspondentes. antígeno prob >F Estimativa de

efeitoRazão deredução

Efeitocumulativo

Razãocumulativa

HarA 0,033 -0,596 3,9 -0,596 3,9IsaA 0,046 -0,558 3,6 -1,154 14,3Sbi 0,077 -0,491 3,1 -1,645 44,2SdrC 0,22 -0,337 2,2 -1,982 96,0

Atl-glucos 0,238 -0,324 2,1 -2,306 202,2MRPII 0,239 -0,323 2,1 -2,629 425,3Ebh 0,297 -0,286 1,9 -2,914 821,0

1

REIVINDICAÇÕES

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de

compreender oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipos 5 e/ou 8 de

S. aureu, em que o oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipo 5 está

5 entre 30% e 100% 0-acetilado.

2. Composição imunogênica, caracterizado pelo fato de

compreender oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipos 5 e/ou 8 de

S. aureus, em que o polissacarídeo ou oligossacarídeo capsular de Tipo 8 está

entre 30% e 100% 0-acetilado.

10 3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 2,

caracterizada pelo fato de que o oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de

Tipo 5 está entre 30% e 100% 0-acetilado.

4. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de compreender PNAG

15 estafilocepa estafilocócica.

5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 4,

caracterizada pelo fato de que o PNAG está menos do que 40% N-acetilado.


reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente

20 oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipo 1, e/ou Tipo II e/ou Tipo

III de S. epidermidis.


reivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de compreender

adicionalmente um antígeno 336 de S. aureus 336.

25 8. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente

uma proteína estafilocócica ou seu fragmento.

9. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 8,

caracterizada pelo fato de que a proteína estafilocócica ou seu fragmento é

2

uma proteína ligante de componente extracelular selecionada do grupo



CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB,

5 Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP,


Fig e MAP.

10. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação

8, caracterizada pelo fato de que a proteína estafilocócica ou seu fragmento é

10 uma proteína transportadora selecionada do grupo consistindo de

transportador Imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador

de Mg2+, SitC e transportador Ni ABC.


8, caracterizada pelo fato de que a proteína estafilocócica ou seu fragmento é

15 uma toxina ou regulador de virulência selecionada do grupo consistindo de

alfa-toxina (HIa), mutante H35R de alfa-toxina, proteína ativadora de RNA

III (RAP).

12. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma

das reivindicações 8 a 11, caracterizada pelo fato de compreender 2 ou mais

20 proteínas estafilocócicas selecionadas de pelo menos 2 grupos diferentes

selecionados de:

a) pelo menos uma proteína ligante de componente

extracelular estafilocepa estafilocócica ou seu fragmento selecionada do

grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de

25 salivalSitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB

(FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, Lipase GehD,

SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1,

SSP-2, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio,

coagulase, Fig e MAP;

3

b) pelo menos uma proteína transportadora estafilocepa

estafilocócica ou seu fragmento selecionada do grupo consistindo de

transportador imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador

de Mg2+, SitC e transportador Ni ABC;

5 c) pelo menos um regulador de virulência estafilocepa

estafilocócica, toxina ou seu fragmento selecionada do grupo consistindo de

alfa-toxina (Hla), mutante H35R de alfa-toxina, proteína ativadora de RNA III

(RAP).


10 das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que um polissacarídeo

estafilocepa estafilocócica está conjugado em um carreador protéico.


das reivindicações 4 a 13, caracterizada pelo fato de que o PNAG está

conjugado em uma proteína carreadora.

15 15. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação

13 ou 14, caracterizada pelo fato de que a proteína carreadora compreende

uma proteína estafilocócica ou seu fragmento selecionada do grupo



20 CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB,

Cna, C1fB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP,


Fig, MAP, transportador Imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC,

transportador de Mg2+, SitC e transportador Ni ABC, alfa-toxina (Hla),

25 mutante H35R de alfa-toxina e proteína ativadora de RNA III (RAP).


13 ou 14, caracterizada pelo fato de que a proteína carreadora é toxóide de

tétano, toxóide de difteria, CRM197, proteína D de Haemophilus influenzae,

exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa, alfa-toxóide e pneumolisina

4

pneumocepa estafilocócica.

17. Composição imunogênica de acordo com a reivindicações

de 1 a 16, caracterizada pelo fato de que uma resposta imune é gerada contra

ambas S. aureus e S. epidermidis.

5 18. Vacina, caracterizada pelo fato de compreender a

composição imunogênica como definida nas reivindicações 1 a 17 e um

excipiente farmaceuticamente aceitável.

19. Método para preparar a vacina, caracterizado pelo fato de

compreender as etapas de misturar a composição imunogênica como definida

10 em as reivindicações 1 a 18 e adicionar um excipiente farmaceuticamente

aceitável.

20. Método para prevenir ou tratar infecção estafilocócica,

caracterizado pelo fato de compreender a etapa de administrar a vacina como

definida na reivindicação 18 a um paciente em necessidade da mesma.

15 21. Uso da composição imunogênica como definida nas

reivindicações 1 a17, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura da

vacina para o tratamento ou a prevenção de infecção estafilocócica.

22. Processo para conjugar oligossacarídeo ou polissacarídeo

capsular de Tipo 5 ou 8 de S. aureus, caracterizado pelo fato de compreender

20 as etapas de:

a) dissolver o oligossacarídeo ou polissacarídeo de Tipo 5 ou 8

em água ou em uma solução salina;

b) adicionar um agente de cianilação (por exemplo CDAP)

para formar um polissacarídeo ou oligossacarídeo ativado;

25 c) adicionar uma proteína carreadora de modo que grupos

amino reajam com o polissacarídeo ativado para formar uma ligação

covalente de isouréia.

23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado

pelo fato de que o oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipo 5 está

5

entre 30% e 100% 0-acetilado.

1/68

FIGURA 1

SEQ ID NO:1 seqüência de polipeptídeoML QVTDVS LRFGDRKL FEDVNI KFTEGNCYGL I GANGAGK S T FLK I L S GE LD S QTGHVS LGKNERLAVL KQDHYAYEDER

VLDVVIKGHERLYEVMKEKDE IYMKPDFSDEDGIRAAELEGE FAEMNIGWNAEADAANLL SGLG IDPTLIIDICKMAE LENNQ

KIKVLLAQSLFGEPDVLLLDEPTNGLDIPAISWLEDFLINFDNTVIVVSHDRHFLNNVCTHIADLDFGKIKVYVGNYDFW

YQSSQLAQKMAQEQNKKKEEKMKELQDF IARFSANASKSKQATSRKKQLEKIELDD I QPS SRRYPFVKFTPERE IGNDLL

I VQNLS KT IDGE KVLDNVS FTMNPNDICAI L IGDSE IAKTTLL KILAGEME PDEGS FKWGVTTSLSYFPICDNSE FFEGVNM

NLVDWLRQYAPEDEQTETFLRGFLGRMLFSGEEVICKICAS VLSGGE KVR CMLS KMMLS SANVL LLDEPTNHLDLES ITAVN

DGLKSFKGS I I FT S YD FEF INTIANRVIDLNKQGGVS KEIPYEEYLQEIGVLK

SEQ ID NO:2 seqüência de polipeptídeoMLQVTDVSLRFGDRICLFEDVNIKFTEGNCYGLIGANGAGKSTFLKILSGE IDSQTGHVSLGKDERLAVLKQDHFAYEDER

VLDVVI KGHERLYQVMKEKDE IYMKPDF SD EDG I RAAE LEGE FAEMNGWNAEADAAN LL S GLG IE PDLHDKNMS EL ENNQ

KVKVLLAQ S L FGD PD VL L LDE PTNGLD I PAI SWLEDFL INF ENTVI VVSHDRHF LNNVCTH IADLDFGKI ICL YVGNYD F W

YQS SQLA QKMAQEQN KKKEEKMKELQDF IAR F SANAS KSKQATSRKKQLEKI ELDD I QP S SRRY PYVKF TP ERE IGNDLL

TVENL S KT I DG EKVLDNVS FTMNP NDKA I LVGDS E IAKT TL L K I LAG EME PDEGT F KWGVTT S L S YF P KDNS E FFDGVDM

NLVEWLRQYAPEDEQTETFLRGFLGRMLFSGEEVKICICASVLSGGEKVRCMLS ICMMLS SANVLLLDEPTNHLDLES I TAVN

DGLKSFKGS II FTSYDFEFINTIANRVIDLNQAGALS KE VP YEEYLQE I GVLQNN

SEQ ID NO:3 seqüência de polipeptídeoMP I ITDVYAREVLDSRGNPTVEVEVLTESGAFGRALVPSGASTGEHEAVELRDGDKSRYLGKGVTICAVENVNE I IAPE I I

EGEFSVLDQVS IDKMMIALDG TPNKG KLGANAILG VS IAVARAAADLLGQPLYKYLGGFNGKQLPVPMMNIVNGGSHSDA

P IA FQE FM I L PVGATT F KE S LRWGTE I FIINL KS I L S KRGL ETAVGDEGGFAP KF EGT EDAVE T I I QA I EAAGY KP GE EVF

LGFDCASSEFYENGVYDYS KFEGEHGAKRTAAEQVDYLEQLVDKYP I I TI EDGMDENDWDG WKQL TERIGDRVQ LVGDDL

FVTNTEILAKGIENGIGNS I L IKVNQIGTLT ETFDAI EMAQICAG YT AVVSHRSGETED TT IAD IAVATNAGQI KTG S L SR

TDRIAKYNQL LR I EDE L F ET

AKYDGIKSFYNLDK

SEQ ID NO:4 seqüência de polipeptídeoMP I ITDVYARE VLDS RGNP TVEVEVLTES GAFGRALVPSGAS TGEHEAVELRDGD KS RY LGKGVTKAVENVNEMIAP E IV

EGEFSVLDQVS IDICMMIQLDGTHNKGICLGANAILGVS IAVARAAADLLGQPLYKYL GGFNGKQL PVPMMN IVNGGSHS DA

PIAFQEFMILPVGAESFKESLRWGAE I FHNL KS I LS ERGLE TAVGDEGGFAPRF EGTEDAVETI I ICAIEICAGYKPGEDVF

LGFDCASS EFYENGVYDYTKFEGEHGAKRSAAEQVDYLEELIGKYP I ITI EDGMD END WEGW KQLTDR IGDKVQ LVGDD L

FVTNTEILSKGIEQG IGNS I L IKVNQ IGTL TETFDAI EMAQICAG YTAVVS HRSGE TEDTTIAD IAVATNAGQIKTGS L SR

TDRIAKYNQLLRIEDELYETAKFEGIKSFYNLDK

SEQ ID NO:5 seqüência de polipeptídeoMKKIVTAT IATAGLAT IAFAGHDAQAAEQNNNGYNSNDAQ S YS YTYT I DAQGNYHYTWTGNWNPSQLTQNNTYYYNNYNT

YSYNNASYNNYYNHSYQYNNYTNNSQTATNNYYTGGSGASYSTTSNNVHVTTTAAPSSNGRS I SNGYASGSNL YT S GQ C T

YYVFDRVGGKIGS TWGNASNWANAAAS SGYTVNNTPKVGAI MQTTQGYYGHVAYVEGVNSNGSVRVSEMNYGHGAGVVT S

RT I SANQAGS YNF TH

SEQ ID NO:6 seqüência de polipeptídeoMKKIATATIATAGFATIAIASGNQAHASEQDNYGYNPNDPTSYSYTYTIDAQGNYHYTWKGNWHPSQLNQDNGYYSYYYY

NGYNNYNNYNNGYSYNNYSRYNNYSNNNQSYNYNNYNSYNTNSYRTGGLGASYSTSSNNVQVTTTMAP S SNGRS I S SGY T

S GRNLYTSGQCTYYVFDRVGGK I G S TWGNASNWANAAARAGYTVNNTPKAGAI MQTTQGAYGHVAYVE SVNS NGSVRV S E

MNY GYG PGVVTS RT I SAS QAAG YNFIH

SEQ ID NO:7seqüência de polipeptídeoMKKIATATIATAGIATFAFAHHDAQAAEQNNDGYNPNDPYSYSYTYTIDAEGNYHYTWKGNWS PDRVNTSYNYNNYNNYN

YYGYNNYSNYNNYSNYNNYNNYQSNNTQSQRTTQPTGGLGASYSTSS SNVHVTTTSAPSSNGVSLSNARSASGNLYTSGQ

CTYYVFDRVGGKIGSTWGNANNWANAAARSGYTVNNSPAKGAILQTSQGAYGHVAYVEGVNSNGSIRVSEMNYGHGAGVV

2/68

TSRTISASQAASYNYIH

SEQ ID NO:8 seqüência de polipeptídeomKICLVPLLLALLLLVAACGTGGKQSSDKSNGICLKVVTTNSILYDMAKNVGGDNVDIHSIVPVGQDPHEYEVICPKDIKICLTDADVI LYNGLNLETGNGWFEKALEQAGKSLICDICKVIAVS ICDVKP IYLNGEEGNKDKQD PHAWLSLDNGI KYVKT I QQTF I

DNDKICHKADYEKQGNKYIAQ LE ICLNNDSICDKFND I PKE QRAM ITSEGAF KYF S KQYG ITPGYIWE INTEKQGTPEQMRQA

IEFVKICHICLICHL LVETSVDKICAMESLSEETICKD I FGEVYTDS IGKEGTKGDSYY1CMFIKSNIETVHGSMK

SEQ ID NO:9 seqüência de polipeptídeoM1CKILALAIAFL I I LAACGNHSNHEHHSHE GICLKVVTTNS I LYDMVKRVGGNKVDVHS I VPVG QD PHE YEVKP ICD I KALT

DADVVFYNGLNLETGNGWFE KALDQAGKS T KDKNVIAASNNVKP I YLNGE EGNKNKQD PHAW L SLENG I KYVKT I QKS LE

HFIDKKDKSTYEKQGNAYI SKLEELNKDSKNKFDD I PKNQRAMMTSEGAF KYFAQQ FDVKPGY IWE INTEKQGTPGQMKQA

I KFVICDNHLKHLLVETS VDKKAMQSL SEETICKD IYG EVFTDS IGKEGTKGDSYYICMMKSNIDTIHGSMK

SEQ ID NO:10 seqüência de polipeptídeoMKKT IMAS SLAVALGVTGYAAGTGHQAHAAEVNVDQAHLVDLAHNHQDQLNAAP I ICDGAYD I HFVKDGFQYNFTSNGTTW

SWSYEAANGQTAGFSNVAGADYTTSYNQGSDVQSVSYNAQSSNSNVEAVSAPTYHNYSTSTTSSSVRLSNGNTAGATGSS

AAQIMAQRTGVSASTWAAI IARESNGQVNAYNPSGASGLFQTMPGWGPTNTVDQQINAAVICAYIC.AQGLGAWGF

SEQ ID NO:llseqüência de polipeptídeoMKKTVIASTLAVS LG IAGYGL SGHEAHAS ETTNVDICAHLVDLAQHNP E ELNAKPVQAGAYD I HFVDNGY QYNFT SNG S E W

S WS YAVAGSDADYTES SSNQEVSANTQSSNTNVQAVSAPTSSESRSYSTSTTSYSAP SHNYSSHSSSVRLSNGNTAGSVG

S YAAAQMAARTGVSAS T W EH I IARESNGQLHARNASGAAGLFQTMPGWGSTGSVNDQINAAYKAYKAQGLSAWGM

SEQ ID NO:12 seqüência de polipeptídeoMNYRDKI QKF S IRKYTVGTFS TV IATLVFLG FNT S QAHAAETNQPAS VVKQKQQSNNE QTENRESQVQNS QNS QNSQS LS

ATHENEQPNNSQANLVNQKVAQSSTTNDEQPASQNVNTKICDSATAATTQPDKEESKHKQNESQSANKNGNDNRAAHVENH

EANVVTAS D S SDNGNVQHDRNELQAF FDANYHDYRF IDRENAD SGT FNYVKG I FDKI NTLLG SNDP INNICD LQLAYKEL E

QAVALIRTMPQRQQTSRRSNRIQTRSVESRAAEPRSVSDYQNANSSYYVENANDGSGYPVGTYINASSKGAPYNLPTTPW

NTLKASDSKE IALMTAKQTGDGY QWVI KF'NKGHAPHQNMI FWFAL PAD QVPVGRTD FVTVNS DGTNVQWSHGAGAGANKP

LQQMWEYGVNDPDRSHDFKIRNRSGQVIYSWPTVHVYSLEDLSRASDYFSEAGATPATICAFGRQNFEYINGQKPAES PGV

P KVYT F I GQGDAS YT I S F KT QGPTVNKLYYAAGGRAL E YN QL FMY S QLYVE S T QDHQ QR LNGLR QVVNRTYR I GTT KRVE

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P IRLMIGFDY PDGYGNSETLVPVNLTVL PE IQHN I KFFKNDDTQNIAEKP FS KQAGHPVFYVYAGNQGNASVNLGGSVTS

I QPLRINLT SNENF TDICDWQ ITGI PRT LH I ENS TNRTNNAREFtNIELVGNLL PGDY FGT I RFGRKEQLFE IRVKPHTPT I

TTTAEQLRGTALQKVPVNI S G I PLDPSALVYLVAPTNQTTNGGSEADQ I PSGYT I LATGT PDGVHNT IT I RPQD YVVF I P

P VGKQ I RAVVYYNKVVASNMSNAVT I L PDD I P PT INNPVG INAKYYRGDEVNFTMGVSDRHS G I KNTT I TT L P SGWTSNL

T KSDNKNG S LA I TGRV S MNQAFNSD I T FKVSATDNVNNTTNDS Q S ICHVS I HVGKI S EDAHP I VLGNT E KVVVVNP TAVSN

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S FNIGD I KQY FTLSNGQAI PNGTFTNIT SDRT I PTAQE VS QMNAG TQL YHIVASNAYHKD TEDFYI SLKI VDVKQ PEGDQ

RVYRTSTYDLTTDE IS KVKQAF INANRDVITLAEGD I SVTNTPNGANVSTITVNINKGRLTKSFASNLANMNFLRWVNFP

QDYTVTWTNAKIANRPTDGGLSWSDDHKSL IYRYDATLGTQITTNDILTMLICATTTVPGLRNNITGNEICAQAEAGGRPNY

RTTGY SQSNATTDGQRQFTLNG QVIQ LDI INPSNGYGGQPVTNSNTRANHSNSTVVNVNEPAANGAGAFTIDHVVKSNS

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QSVTVPNTSQI TGTVDNNHQHVSATAPNVTS ATS ICT INL LATDT SGNTATTS FNVTVKP LRDKYRVGTS S TAANPVRIAN

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SMNNVTYTTQDEHG QVVTVTRNE SVDSNDSAS VTVTPQL QATTEGAVF I KGGDG FD FGHVERF IQNPPHGATVAWHDS PD

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PNNQQAGVQHLNVDVTYPG I SAAKRVPVTVNVYQFE F PQTTYTTTVGGTLASGTQAS GYAIIIMNASGL PTDGFTYKWNRD

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AMPTNLAGGS TTT I PVTVTYNDGSTEEVQES I FTKADKRELITAKNHLDDPVSTEGKKPGTITQYNNAMHNAQQQINTAK

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EAE TE ITAAQ RVIDNGDATAQQ I SDEKHRVDNAL TALNQAKFIDLTAD THALEQAVQQLNRTGTTTGICKPAS I TAYNNS IR

3/68

ALQSDLTSAKNSANAI I QKP I RTVQEVQSALTNVNRVNE RLTQAINQLVPLADNS AL RTAKT KLDEE INKSVTTDGMTQSS I QAYENAICRAG QTE TTNAQNV INNG DATDQQ I AAE KTKVEE KYNS LKQAI AGLTP DLAPL QTAKTQLQND IDQ PTS TTGMT SAS VAAFND KL SAARTKI QE I DRVLAS H PDVAT IRQNVTAANAAKTALDQARNGLTVD KAP LENAICNQLQH S I DTQTSTTGMTQDS INAYNAKLTAARNKVQQ INQVLAGS P TVDQINTNTSAANQAKSDLDHARQALTPDKAPLQNAKTQLEQS INQPTDTTGMTTAS LNAYN QICL QAARQICLT E INQVLNGNPTVQNINDKVAEANQAKDQLNTARQGLTLDRQPALTTLHGASNLNQAQQNNF TQQ INAAQNHAALET I KSNI TALNTAMT KL ICD SVADNNT I KS GQNYTDAT PANKQAYDNAVNAAKGVIGET T

NPTMDVNTVNQ KAA SVKS TKDALDGQQNL QRAKTEATNA I THASDLNQAQKNALTQQVNSAQNVQAVND I KQTTQSLNTAMTGL KRGVANHNQVVQ S DNYVNAD TNKKNDYNNAYNHAND I INGNAQH PV I T PS DVNNAL SNVTS KEHALNG EAKLNAAK

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AVS SAET I INQTANPTMSVDDVNRATSAVTTNKNALNGDEICLVQSKTDAARAIDALPHLNNAQICADVKSKINAASNIAGVNTVKQQGTDLNTAMGNLQGAINDEQT TLNS QNYQDATP S KICTAYTNAVQAAKD I LNKSNG QNKTICDQVTEAMNQVNSAKN

NLDGTRLLDQAKQTAKQQLNNMTHLTTAQKTNLTNQ INS G T TVAGVHTVQ S NANTLD QA1vINTLRQ S IANNDATKASEDYV

DANNDKQTAYNNAVAAAET I INANSN P E MNP S T I TQICAE QVNS S KTALNGD ENLATAKQNAKTYLNTL TS I TDAQICNNL ISQ IS SAT RVS GVD TVKQNAQHLD QAMANLQNG INNE S QVKS S EKYRDADTNKQQEYDNAI TAAKAILNKS TGPNTAQNAV

EAALQRVNTAKDALNGDAICL IAAQNAAKQHLG TL TH I TTAQRND LTNQ I S

SEQ ID NO:13 seqüência de polipeptídeoMGNLQTAINDKS G TLAS QNF LDADE Q KRNAYNQAI S AAET I LNKQTG PN TAKTAVE QALNNVN SAKHALNG T QNLNNAKQ

AA I TAINGAS DLNQKQKDALKAQAN GAQRVSNANDVQRNATELNTAMG QL QHA I AD KTNTLAS SKYVNADS TKQNAYTTK

VTNAEH I I SGTPTVVTTPSEVTAAANQVNSAKQELNGDERLRVAKQNANTAIDALTQLNTPQKAKLKEQVGQANRLEDVQ

SVQ TNGQS LNNAM KG LRD S IANETTVKASQNYTDAS PNNQSTYNSAVSNAKG I I NQ TNNP TMDT SAI TQAT TQVNNAKNG

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K I DQATTVAGVEAVS NTG TQLNTAMANLQNG INDKANTLAS ENYHDAD S DKKTAYTQAVTNAEN I LNKNS G SNLD KAAVE

NAL S QVTNA1CGALNGNHNL E QAKSNANT T INGLQHLTTAQKDICLICQQVQQAQNVAGVDTVKS SANTLNGAMGTLRNS I QD

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NLNKAQ KDALKAQVT SAQRVANVT S I QQ TANE LNTAMGQLQHG IDDENATKQ T Q KYRDAE Q S KKTAYD QAVAAAKA I LNK

Q TGSNSD KAAVDRAL QQVTS TICDALNGDAKLAEAKAAARQNLG TLNH I TNAQRTALEGQ INQATTVDGVNTVKTNANTLD

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AL I S GT PDVVVTP S E I TAALNKVT QAKND LNGNTNLATAKQNVQHAIDQL PNLNQAQRDEYS KQ I TQATLVPNVNAIQQA

4/68

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E TTRTAVKQDL TEVQALDQLMDALQQ S IADICDATRASSAYVNAEPNICICQAYDEAVQNAES I IAGLNNPT INKGNVSSATQ

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SEQ ID NO:15 seqüência de polipeptídeoMS GTLHNTVGSGI L P YQQE IR IKLTS NE P I ICDSEW S I TGY PNTLTL QNAVGRTNNATE KNLALVGH ID PGNY F I TVKFGD

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5/68

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6/68

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7/68

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8/68

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SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDNDSDLGNSSDKS TKDKLPDTGANEDYGSKGTLLGTLFAGL

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DKSNNSTEDKASQDKSKDHHNGKKGAAIGAGTAGLAGGAASKSASAASKPHASNNASQNHDEHDNHDRDKERKKGGMAKV

LLPLIAAVLIIGALAIFGGMALNNENNGTKENKIANTNICNNADESKDKDTSKDASEDKSKSTDSDKSKEDQDKATKDESD

NDQNNANQANNQAQNNQNQQQANQNQQQQQQRQGGGQRHTVNGQENLYRIAIQYYGSGSPENVEKIRRANGLSGNNIRNG

QQIVIP

SEQ ID NO:23 seqüência de polipeptídeom I EL I KMEGM I VVSNNNF EDDF EIÇNRQS I NPDE QQT EL KEDDKTNENICKEADS QNS L SNNSNQQ F P P RNAQRRKRRRE TATNQ SKQQDDKHQ KNSDAKTTE GS LDDRYDEAQLQQQHDKS QQQNKT E KQ S QDNRMICDGICDAA I VNGTS E S P EHKS KS T QN

RPGP KAQQQ KRKS ES TQ S KP S TNICDICKAATGAG IAGAAGVAGAAETS ICRHHNICKD KQDS KIISNHENDE KSVICNDDQKQSK

KGKKAAVGAGAAAGVGAAGVAHHNNQNKHHNEE KNSNQNNQ YNDQS EGKKKGGF MKI L L PL IAAI L I LGA IA I FGGMALN

NHNDSKSDDQKIANQSKICDSDKKDGAQSEDNKDICKSDSNKDKKSDSDKNADDDSDNSS SNPNATSTNNNDNVANNNSNYT

NQNQQDNANQNSNNQQATQGQQS HTVYGQENLYR IAI QYYGEGTQANVDKI KR ANGLS SNNIHNGQTLVI PQ

SEQ ID NO:24 seqüência de polipeptídeoMKN KLIAKS LLT IAAIG I TTTT IAS TADASEGYGPREKKPVS INBNIVEYNDGTFKYQSRPKFNSTPKYI KFKHDYNILE

FNDGTFEYGARPQFNKPAAKTDATIKKEQKLIQAQNLVREFEKTHTVSAHRICAQIÇAVNLVS FEYKVKICMVLQERIDNVLK

QGLVR

SEQ ID NO:25 seqüência de polipeptídeoMKTR I VS SVT TT L LLGS I LMNPVANAADS D IN I KTGT TD I GSNT TVKTGDLVTYDKENGMHKICVFYS F I DD KNHNICKL LV

I RT KGT IAG QY RVYSEEGANKSGLAW PSAF KVQL QL PDNEVAQ ISDYYPRNS IDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGG

L IGANVS IGHTLKYVQ PDFKT I LES PTDICKVGWKVI FNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQL FMKTRNGSMKAAENFLD PN

KASSLLSSGFS PDFATVITMDRIÇASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTICDKWTDRSSERYKIDWEICEEMTN

SEQ ID NO:26 seqüência de polipeptídeoMHMKNKYIS KL LVGAAT I TLATM ISNGEAKAS ENT QQT S TKHQT TQNNYVTDQQICAFYQVLHLKG I TEE QRNQYI KTL RE

HPERAQEVFSESLKDS KNPDRRVAQQNAFYNVL KNDNLTEQEKNNY IAQ IKENPDRSQQVWVESVQS SKAKERQNIENAD

KAIKDFQDNICAPHDKSAAYEANSKLPKDLRDKNNRFVEKVS I EKAI VRHDERVKS ANDAI S KLNEKDS I ENRRLAQREVN

KAPMDVKEHLQKQLDALVAQKDAEKKVAPICVEAPQIQSPQI EKPKAES PKVEVPQSICLLGYYQSLICDSFNYGYKYLTDTY

KS YKE KYDTAKYYYNTYY KYKGAI DQTVLTVLGSGS KS Y I QP LICVDDIÇNG Y LAKS YAQVRNYVT E S INTGKVLYTFYQNP

TLVKTAI KAQE TAS S I KNTLSNL LS FWK

SEQ ID NO:27 seqüência de polipeptídeoMT ICHY LNSKYQS EQRS SAMICK ITMGTAS I I LGSLVYIGADSQQVNAATEATNATNNQSTQVSQATSQPINFQVQKDGS SE

KSHMDD YMQH PGKVI KQNNKYY FQTVLNNAS FW KE YKFYNANNQELAT TVVNDNKKAD TRT INVAVEPGYKS LT TKVH I V

VPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAKPNNVKPVQPKPAQPKTPTEQTKPVQPKVEKVKPTVTTTSIÇVEDNHSTKVVST

DTTKDQTKTQTAHTVICTAQTAQEQNKVQTPVICDVATAKSESNNQAVSDNKSQQTNKVTKHNETPKQASKAKELPICTGLTS

VDNFISTVAFATLALLGSLSLLLFKRKESK

SEQ ID NO:28 seqüência de polipeptídeoMNKQQKE FKS F YS I RKS S LGvASVAI STLLLLMSNGEAQAAAEETGGTNTEAQPICTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVS

VS NKEVEAP TSETKEAKEVKEVKAP KETKAVKPAAKATNNTYP I LNQEL REAI KNPAI KDKDHSAPN SRP IDFEMKKENG

E QQF YHYAS S VKPARV I FTD S KP E IELGL Q SGQFwRKFEVYEGDICKL P I KLVS YD TVICD YAY I RFS VSNGT KAVK I VS S T

9/68

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LDEQVICSAITEFQNVQPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVICHP IKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQ

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PSKPTP S PVE ICE SQ KQDS QICDDNKQLPSVEKENDASSESGKDICTPATKPTKGEVESSSTTPTICVVSTTQNVAKPTTASSK

TTKDVVQTSAGSSEAKDSAPLQKANI KNTNDGHTQS QNNKNTQENKAKSLPQTGEESNICDMTLPLMALLALSS I VAFVL P

RKRKN

SEQ ID NO:29 seqüência de polipeptídeoMNNKKTATNRKGMI PNRLNKFS I RKYS VGTAS I LVGTTL I FGLSGHEAKAAEHTNGELNQS KNETTAP SENKTTEICVDS R

QL1CDNTQTATADQPKVTMSDSATVKETSSNMQ SPQNATASQSTTQTSNVTTNDKSSTTYSNETDKSNLTQAKNVSTTPKT

TT I KQRALNRMAVNTVAAP QQ GTNVNDKVH FTNIDIAIDKGHVNKTTGNTE FWAT S SDVL KL KANYT IDDSVKE GDT FTF

IÇYG QY FR PGS VRL P S QTQNLYNAQ GN I IAKG I YDS KTNTTTYT FTNYVDQ YTNVS GS FE QVA FAICRENATTDKTAYKMEV

TLGNDTYSKDVIVDYGNQKGQQL IS STNY INNEDLSRNMTVYVNQPKKTYTICETFVTNLTGYKFNPDAKNFKIYEVTDQN

Q FVDS FT PDT S KL KDVTGQ FDVI YSNDNKTATVDLLNGQS SSDKQY I I QQVAY PDNS S TDNG KIDYTLETQNG KS SWSNS

YSNVNGS S TANGDQ KKYNLGDYVWEDTN1CDGKQDANE KG I KGVYVILKDSNGKELDRTTTDENGKYQFTGLSNGTYSVEF

S T PAGYTP TTANAGTDDAVD S DGL TTTGVI ICDADNMT LDSGFYKTP KYS LGDYVWYD SNICDGKQDS TEKG I KGVKVTLQN

E KGEVIGTTETDENGKYR FDNLD SGKY KVI FEKPAGLTQTGTNTTEDDKDADGGEVDVT I TDHDD FT LDNGYYEEETSDS

DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS

DSDSDSDSDSDS DSDSDSDSDSDND SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS DSDSD SDSDSDSDS DSDSDSDSDSDSDSDS

DSD SD S D SD S DS DAG KHTPTKPMS TVICDQHICTAKALP ETG S ENNNSNNGTL FGGL FAALGS LLLFGRRKKQNK

SEQ ID NO:30 seqüência de polipeptídeoMNMKICICE KHAIRKKS IGVASVLVGTL I GFGLL S S KEADAS ENS VTQSDSASNE S KS NDS S SVS AAP KTDD TNVSDTKTS S

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NSPQNS TNAENVSTTQDTS TEATPSNNESAPQNTDASNKDVVS QAVNP S TP RMRAF S LAAVAADAPAAGTD I TNQ LTDVK

VTIDSGTTVYPHQAGYVICINYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTS TAKVP P IMAGD QVLANGVIDS DGNVI YT FT

DYVDNKENVTANITMPAY IDPENVTKTGNVTLTTGIGTNTASKTVL IDYEKYGQFHNL S I KGT IDQ IDKTNNTYRQT I YV

NPSGDNVVLPALTGNL I PNT KSNAL IDAKNTD I KVYRVDNANDL SESYYVNP SDFEDVTNQVR I S F PNANQYKVE FPT.DD

DQ ITTPYIVVVNGHIDPASTGDLALRSTFYGYDSNFIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGE IEP I PED

SDSDPGSDSGSDS NSDS GSDSGSDS T SDSGSDSASDSDSASDSDSASDSDSASDS DSASDSDSASDSDSASDSD SASDSD

SASDSDSASDSDSASDSDSASDSDSASDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD

SDSDSDSD SDSDSDSDSDSD SDSDSDSDSDSDS DSDSDSDSDSDSDSASDSDSDSDS E SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD

SESDSDSDSDSDSESDSDSDSDSDSDSASDSDSGSDSDS SSDSDSDSTSDTGSDNDSDSDSNSDSESGSNNITVVPPNS PK

NGTNASNKNEAKDSKEPLPDTGSEDEANTSL IWGLLAS LGSLLLFRRKKENKDKK

SEQ ID NO:31 seqüência de polipeptídeoMKNNLRYG I RKHICLGAAS VF LGTM I VVGMGQDKEAAAS E Q KTTTVEENGNS ATDNKT S E TQ TTATNVNH I EETQSYNATV

TEQPSNATQVTTEEAPKAVQAPQTAQPANVETVKEEEKPQVKETTQPQDNSGNQRQVDLT PKKVTQNQGTETQVEVAQPR

TAS ES KP RVTRS ADVAEAKEASDVS EVKGTDVTSKVTVESGS I EAPQGNKVE PHAGQRVVLKY KL KFADGLKRGDY FDFT

LSNNVNTYGVS TARKV PE I KNGSVVMATGE ILGNGNI RYT FTNEI EHKVEVTANLE INL F IDPKTVQSNGEQKITS KLNG

EETEKT IPVVYNPGVSNSYTNVNGS I ETFNKESNKF THIAY I KPMNGNQ SNTVSVTGTL TEGSNLAGGQP TVICVY EYLGK

ICDELPQSVYANTSDTNKFICDVTICEMNGKLSVQDNGSYS LNLDKLDKTYVIHYTGEYLQGSDQVNFRTELYGYPERAYKSY

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EPETPMP PT PEVP SEPETPTP PTPEVP SEPETPTP PT PEVP SEPETPTPPTPEVP SEP ETPT PPTPEVPAEPGKPVP PAK

EEPICKPSKPVEQGKVVTPVI E INEKVKAVAPTKKAQS KKSEL PETGGE ES TNKGML FGGL F S ILGLALLRRNKKNNKA

SEQ ID NO:32 seqüência de polipeptídeoMKKRIDYLSNKQNKYS I RRFTVGT TSVI VGAT I L FG I GNHQAQASEQSNDTTQ SS KNNASADS EKNNMI ETPQLNTTAND

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SELKNS QTLDLPQSS PQT I SNAQGTSKPSVRTRAVRSLAVAEPVVNAADAKGTNVNDKVTASNFICLIEKTTFDPNQSGNTF

MAANFTVTDKVKS GDY FTAKL PD S L TGNGDVDY S NS NNTMP I AD I KS TNGDVVAKATYD I LTICTYT FVF TDYVNNKEN I N

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RV LGNTWVY I KGYQD KI EES S GKVSATDTICLR I FEVNDTS KL SDSYYAD PNDSNLICEVTDQ F KNRI YY EH PNVAS I KFGD

I TKTYVVLVEGHYDNTGKNLIÇTQVIQENVDPVTNRDYS I FGWNNENVVRYGGGSADGDSAVNPKDPTPGP PVDPEP S PD P

EP EPTPDP EPS PDPEPE P S PDPDPDSDSDSDSGSDSD SGSDSDSESDSDSDSDSD SD SDSD SE SD SDSESDSD SDS DSDS

DSDSDSESDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSESDSESDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSDS

10/68

DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS

DSDSRVTPPNNEQICAPSNPKGEVNHSNKVSKQHKTDALPETGDKSENTNATLFGAMMALLGSLLLFRKRKQDHKEICA

SEQ ID NO:33 seqüência de polipeptídeoMICKQ I I SLGALAVAS SL FTWDNKADAIVTKDYS KESRVNEKS ICKGATVS DYYYWKI IDS LEAQFTGAIDLL EDYKYGDP I

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EHENVDL KQ FDICDGED KAT ICEVYDLVS E I DTLVVTYYADKDYGEHAKELRAICLDL I L GDTDNPHK I TNER I KKEM I DDLN

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EEPOLPKVGNQQEVKTTAGICAEETTQPVAQPLVKIPQETIYGETVKGPEYPTMENKTLQGE I VQGPDFLTME QNRPSLSD

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VTTHANGQVSYGARPTQKKPSKTNAYNVTTHANGQVSYGARPTYKKPSETNAYNVTTHANGQVSYGARPTQKKPSETNAY

NVTTHADGTATYGPRVTK

SEQ ID NO:67 seqüência de polipeptídeoMKSNLRYG I RKH ICLGAAS VFLGTM IVVGMGQEKEAAAS EQNNTTVEE SGS SATE S KAS E TQTTTNNVNT

IDETQSYSAT STEQP S KS TQVTTEEAPTTVQAP KVE TEMKSQEDLP SEKVADKET TGTQVD IAQPSNVS

E IKPRMKRSADVTAVSEKEVAEEAKATGTDVTNICVEVTESSLEGHNKDSNIVNPHNAQRVTLKYKWKFG

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HL SGYHKYYPYYPYYPYY PVQLTWNNGVAFYSN

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GY EGGQNS GNQ S F E EDTE EDKP KY EQGGN IVD I

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GGHNSVDFEEDTL PKVSGQNEGQQTI EEDTTPPTPPTPEVPS EPETPTPPTPEVP SEPGE PTPPKPEVP

SEPETPVPPTPEVPSEPGKPVPPAKEEPICKPS KPVEQGKVVTPVIE INE KVICAVAPTKQ KQS KKS EL PE

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A

SEQ ID NO:68 seqüência de polipeptídeoMKFKSL I TTTLALGV IAS TGANFNTNEAS AAAKP LDKS S STLHHGHSNIQ I PYT ITVNGTS QNI LS SLT

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YKYLNDKVKSVLKSERGI SDLDLKFAKQAKYTVY FKNGKKQVVNL KSD I FT PNL FSAKD IKKID IDVKQ

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KYVDLKTEYKD

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SEQ ID NO:69 seqüência de polipeptídeoMNICHHPKLRSFYS IRKSTLGVASVIVSTLFLITSQHQAQAAENTNTSDKISENQNNNATT

TQPPKDTNQTQPATQ PANTAKNYPAADESLICDAI KDPALENKEHD I GPREQVNFQLLDKN

NE TQYYHFFS IKDPADVYYTKKICAEVELDINTASTWKKFEVYENNQICLPVRLVSYS PVPE

DHAYIRFPVSDGTQELKIVSSTQ IDDGEETNYDYTKLVFAKPIYNDPSLVKSDTNDAVVT

NDQSS SVASNQTNTNTSNQNISTINNANNQPQATTNMSQPAQPKS S TNADQASSQPAHET

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GERQFYHYASTVEPATVI FTKTGP I I ELGLKTAS TW KKFEVYEGD KICL PVELVSYDSDKD

11/68

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DTS QNNTS EPLNVQTGQEGKVAD TDVAENS S TATNP KDAS DKADVI EPESDVVKDADNN I

DKDVQHDVDHLSDMSDNNHFDKYDLKEMDTQIAKDTDRNVDKDADNSVGMSSNVDTDKDS

NICNKDKVIQUTHIADICNNHTGICAAICLDVVICQNYNNTDKVTDKKTTEHLPSDIHKTVDKTV

KTKEICAGTPSKENICLSQSKMLPKTGETTSSQSWWGLYALLGMLALF IPKFRKES K

SEQ ID NO:70 seqüência de polipeptídeoMAETTQDQTTNKNVLDSNKVICATTEQAKAEVKNPTQN I SGTQVYQDPAIVQPKTANNKTG

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NDRS T INGE I SYMKNNYQNAFVHAFVDGDRI IETAPTDYLSWGVGAVGNPRF INVEIVHT

MD YAS FAR SMNNYAD YAAT QLQYYGL KP DSAEYD GNGTVWTHYAVS KY LGG TDHAD PHGY

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LFTTVYDICTGKPTKEVQKTFAVTKEASLGGNKFYLVKDYNSPTL IGWVKQGDVIYNNAKS

PVNVMQTYTVKPGT KLY S V P WGTYKQEAGAVS GT GNQT F KAT KQQQ I D KS I Y L FGTVNG K

SGWVSKAYLAVPAAP KKAVAQPKTAVK

SEQ ID NO: 71 seqüência de polipeptídeoMAYTVT KP QTTQTVS KI AQVKPNNTG I RASVY EKTAKNGAICYADRT FYVT KERAHGNETY

VLLNNTSHNI PLGW FNVICDLNVQNLGKEVKTTQKYTVNKSNNGLSMVPWGTKNQVILTGN

N IAQGT FNATKQVSVGKDVYLYGT INNRTGWVNAKDLTAPTAVKPTTSAAKDYNYTYV I K

NGNGYYYVTPNSDTAKYSLKAFNEQPFAVVKEQVINGQTWYYGICLSNGICLAW I KS TDLAK

EL I KYNQTGMTLNQVAQ I QAGLQYKPQVQRVPGKWTDAICFNDVICHAMDTKRLAQD PALKY

QFLRLDQPQN I S IDKINQFLKGKGVLENQGAAFNKAAQMYGINEVYL I SHALL ETGNGT S

Q LAKGADVVNNKVVTNSNT ICYFINVFG IAAYDNDP LR EG I KYAKQAGWDTVS KA I VGGAKF

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YK

SEQ ID NO:72 seqüência de polipeptídeoDRVLASHPDVATIRQNVTAANAAKSALDQARNGLTVDKAPLENAKNQLQHS IDTQTS TTG

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DKVTEANQAKDQLNTARQGLTLDRQPALTTLHGASNLNQAQQNNFTQQINAAQNH.AALET

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GNAQHPVITPSDVNNALSNVTSKEHALNGEAKLNAAKQEANTALGHLNNLNNAQRQNLQS

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KADVKS KINAASNIAGVNTVKQQGTDLNTAMGNLQGA INDE QTT LNSQNY QDAT PS KKTA

YTNAVQAAKD I LNKSNGQNKTICDQVT EAMNQVNSAKNNLDGTRLLD

SEQ ID NO: 73 seqüência de polipeptídeoAS TQHTVQSGES LWS IAQKYNTSVES I KQNNQLDNNLVF PGQVISVGGSDA QNT SNTS PQ

AGS AS SHTVQAGE S LN I I AS RYGVSVD QLMAANNLRGYL IMPNQTLQ I PNGGSGGTTPTA

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H

12/68

SEQ ID NO: 74 seqüência de polipeptídeoMNNKICTATNRKGM I PNRLNKFS IRKYSVGTAS I LVGTTL I FGLSGHEAKAAEHTNGELNQ

SICNETTAPSENKTTKICVDSRQLKDNTQTATADQPKVTMSDSATVKETSSNMQSPQNATAN

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DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS


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DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDNDSDSDSDSDSDAGKHTPAKPMSTVKDQHKTAKALPE

TGSENNNSNNGTLFGGLFAALGSLLLFGRRKKQNK

SEQ ID NO: 75 seqüência de polipeptídeoMNLLICKNICYS I RKY KVG I FS TL IGTVLLLSNPNGAQALTTDNNVQSDTNQATPVNSQDKD

VANNRGLANSAQNTPNQSATTNQATNQALVNHNNGS IVNQAT PT SVQS STPSAQNNNHTD

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AEPASNRP KKRSRRAAPADPNATPADPAAAAVGNGGAPVAITAPYTPTTDPNANNAGQNA

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13/68

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SEQ ID NO: 87 seqüência de polipeptídeo

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14/68

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GLFLAFRRRSTNK

15/68

FIGURA 2

SEQ ID NO:34 seqüência de polinucleotídeoATGTTACAAGTAACTGATGTGAGTITACGTTTTGGAGATCGTAAACTATTTGAAGATGTAAATATTAAATTTACAGAAGG

TAATTGTTATGGATTAATTGGTGCGAATGGTGCAGGTAAATCAACATTCTTAAAAATATTATCTGGTGAATTAGATTCTC

AAACAGGACATGTTTCATTAGGTAAAAATGAACGTCTAGCTGTTTTAAAACAGGACCACTATGCTTATGAAGATGAACGC

GTGCTTGATGTTGTAATTAAAGGTCACGAACGTCTTTATGAGGTTATGAAAGAAAAAGATGAAATCTATATGAAGCCAGA

TTTCAGTGATGAAGATGGTATCCGTGCTGCTGAACTTGAAGGTGAATTTGCAGAAATGAATGGTTGGAATGCTGAAGCTG

ATGCTGCTAACCTTTTATCTGGTTTAGGTATCGATCCAACTTTACACGATAAAAAAATGGCTGAATTAGAAAACAACCAA

AAAATTAAAGTATTATTAGCGCAAAGTTTATTCGGTGAACCAGACGTACTATTACTGGATGAGCCTACTAACGGTCTCGA

TATTCCAGCAATCAGTTGGTTAGAAGATTTCTTAATTAACTTTGATAATACTGTTATCGTAGTATCGCATGACCGTCATT

TCTTAAATAATGTATGTACTCATATCGCTGATTTAGACTTCGGTAAAATTAAAGTTTATGTTGGTAACTATGATTTTTGG

TATCAATCTAGTCAGTTAGCTCAAAAGATGGCTCAAGAACAAAACAAGAAAAAAGAAGAAAAAATGAAAGAGTTACAGGA

CTTTATTGCACGTTTCTCAGCTAACGCTTCTAAATCTAAACAAGCAACAAGTCGTAAAAAACAACTTGAGAAAATTGAAT

TAGATGATATTCAACCATCATCAAGAAGATATCCTTTCGTTAAATTCACGCCTGAGCGTGAGATTGGTAACGACTTATTA

ATCGTTCAAAATCTTTCTAAAACAATTGACGGCGAAAAAGTATTAGATAATGTATCATTCACAATGAATCCAAATGATAA

AGCGATTTTAATTGGAGATAGTGAAATTGCAAAAACAACATTACTTAAAATATTAGCTGGCGAAATGGAACCAGACGAAG

GTTCATTTAAATGGGGTGTTACTACATCATTAAGTTACTTCCCTAAAGATAACTCAGAGTTCTTTGAGGGTGTAAATATG

AATCTCGTTGATTGGTTAAGACAATATGCTCCTGAAGATGAACAAACAGAAACATTTTTACGTGGTTTCTTAGGTCGTAT

GTTATTTAGTGGTGAAGAAGTTAAGAAAAAAGCTAGTGTGCTTTCAGGTGGAGAAAAAGTACGTTGTATGCTAAGTAAAA

TGATGTTATCAAGTGCGAATGTACTTTTACTTGACGAACCTACTAACCACTTAGACTTAGA.AAGTATTACTGCTGTCAAT

GATGGTCTTAAATCATTTAAAGGTTCTATCATCTTTACTTCTTATGACTTCGAATTTATCAACACGATTGCAAACCGTGT

TATCGATTTAAATAAACAAGGCGGCGTTTCAAAAGAAATTCCATATGAAGAATACTTGCAAGAAATCGGCGTTTTAAAAT

AA

SEQ ID NO:35 seqüência de polinucleotídeoATGTTACAAGTAACTGATGTAAGTTTACGTTTTGGTGATCGTAAACTATTTGAAGATGTAAATATAAAATTTACAGAGGG

TAATTGTTATGGATTAATTGGTGCAAATGGTGCTGGGAAATCTACATTCTTGAAGATTTTATCAGGCGAAATTGATTCAC

AGACTGGTCATGTATCTCTAGGTAAAGATGAGCGTTTGGCTGTGTTAAAACAAGATCATTTTGCTTATGAAGATGAACGT

GTTTTAGATGTTGTGATTAAAGGACATGAACGTTTGTATCAAGTGATGAAAGAGAAAGATGAAATTTATATGAAACCTGA

TTTCAGCGATGAGGACGGTATTCGCGCTGCAGAACTTGAAGGAGAATTTGCAGAAATGAACGGTTGGAATGCTGAAGCTG

ATGCTGCTAACTTATTATCAGGATTAGGCATAGAACCTGACTTACATGATAAAAATATGTCTGAACTTGAAA.ATAATCAA

AAAGTTAAGGTATTGTTAGCTCAAAGTTTATTTGGTGATCCTGACGTTCTTTTACTAGATGAGCCTACCAATGGTTTAGA

TATACCAGCAATAAGTTGGTTAGAAGACTTTTTAATTAATTTTGAAAATACTGTCATTGTCGTTTCGCATGACCGTCACT

TCTTAAATAATGTTTGTACTCATATTGCTGATTTAGACTTTGGCAAAATTAAACTTTATGTTGGTAACTATGATTTTTGG

TATCAATCAAGTCAATTAGCACAAAAAATGGCACAAGAACAAAATAAGAAAAAAGAAGAAAAAATGAAAGAGTTACAGGA

TTTCATCGCACGCTTCTCAGCAAATGCTTCTAAATCTAAACAGGCAACAAGTCGTAAGAAACAATTAGAAAAAATTGAAT

TAGATGATATCCAGCCATCATCTCGTAGATACCCTTACGTGAAATTTACTCCTGAACGTGAAATTGGAAATGATTTACTT

ACAGTAGAAAATCTTTCTAAAACAATTGACGGCGAAAAAGTACTAGACAATGTTTCATTCACTATGAATCCTAATGATAA

AGCTATTTTAGTTGGTGATAGCGAAATTGCTAAAACAACATTGTTAAAAATTTTAGCTGGAGAAATGGAACCAGATGAAG

GTACATTTAAATGGGGTGTAACGACATCTTTAAGTTACTTCCCTAAAGATAACTCTGAGTTCTTTGATGGTGTCGATATG

AATTTAGTTGAATGGTTACGTCAATACGCTCCAGAAGATGAACAAACTGAAACATTTTTACGTGGTTTCTTAGGTCGCAT

GTTATTTAGTGGTGAGGAAGTTAAGAAAAAAGCAAGCGTGCTTTCAGGTGGAGAAAAAGTACGTTGCATGTTAAGTAAAA

TGATGTTATCAAGTGCTAACGTACTTTTACTTGATGAGCCAACAAACCATTTAGATTTGGAAAGTATCACTGCTGTAAAT

GACGGATTAAAATCATTTAAAGGTTCTATCATCTTCACTTCTTATGATTTTGAATTTATTAATACAATCGCAAATCGAGT

GATTGACTTGAATCAAGCTGGTGCCCTTTCTAAAGAAGTACCTTATGAGGAATACTTACAAGAAATTGGTGTATTACAAA

ATAATTAA

SEQ ID NO:36 seqüência de polinucleotídeoATGCCAATTATTACAGATGTTTACGCTCGCGAAGTCTTAGACTCTCGTGGTAACCCAACTGTTGAAGTAGAAGTATTAAC

TGAAAGTGGCGCATTTGGTCGTGCATTAGTACCATCAGGTGCTTCAACTGGTGAACACGAAGCTGTTGAATTACGTGATG

GAGACAAATCACGTTATTTAGGTAAAGGTGTTACTAAAGCAGTTGAAAACGTTAATGAAATCATCGCACCAGAAATTATT

GAAGGTGAATTTTCAGTATTAGATCAAGTATCTATTGATAAAATGATGATCGCATTAGACGGTACTCCAAACAAAGGTAA

ATTAGGTGCAAATGCTATTTTAGGTGTATCTATCGCAGTAGCACGTGCAGCAGCTGACTTATTAGGTCAACCACTTTACA

AATATTTAGGTGGATTTAATGGTAAGCAGTTACCAGTACCAATGATGAACATCGTTAATGGTGGTTCTCACTCAGATGCT

CCAATTGCATTCCAAGAATTCATGATTTTACCTGTAGGTGCTACAACGTTCAAAGAATCATTACGTTGGGGTACTGAAAT

TTTCCACAACTTAAAATCAATTTTAAGCAAACGTGGTTTAGAAACTGCAGTAGGTGACGAAGGTGGTTTCGCTCCTAAAT

TTGAAGGTACTGAAGATGCTGTTGAAACAATTATCCAAGCAATCGAAGCAGCTGGTTACAAACCAGGTGAAGAAGTATTC

16/68

TTAGGATTTGACTGTGCATCATCAGAATTCTATGAAAATGGTGTATATGACTACAGTAAGTTCGAAGGCGAACACGGTGC

AAAACGTACAGCTGCAGAACAAGTTGACTACTTAGAACAATTAGTAGACAAATATCCTATCATTACAATTGAAGACGGTA

TGGACGAAAACGACTGGGATGGTTGGAAACAACTTACAGAACGTATCGGTGACCGTGTACAATTAGTAGGTGACGATTTA

TTCGTAACAAACACTGAAATTTTAGCAAAAGGTATTGAAAACGGAATTGGTAACTCAATCTTAATTAAAGTTAACCAAAT

CGGTACATTAACTGAAACATTTGATGCAATCGAAATGGCTCAAAAAGCTGGTTACACAGCAGTAGTTTCTCACCGTTCAG

GTGAAACAGAAGATACAACAATTGCTGATATTGCTGTTGCTACAAACGCTGGTCAAATTAAAACTGGTTCATTATCACGT

ACTGACCGTATTGCTAAATACAATCAATTATTACGTATCGAAGATGAATTATTTGAAACTGCTAAATATGACGGTATCAA

ATCATTCTATAACTTAGATAAATAA

SEQ ID NO:37 seqüência de polinucleotídeoATGCCAATTATTACAGATGTTTACGCTCGCGAAGTCTTAGACTCACGTGGTAACCCAACAGTTGAAGTTGAAGTATTAAC

TGAAAGCGGTGCTTTCGGACGTGCATTAGTACCTTCTGGTGCTTCTACTGGTGAACATGAAGCAGTTGAATTACGTGATG

GAGATAAATCACGTTATTTAGGTAAAGGTGTGACTAAAGCGGTAGAAAATGTTAACGAAATGATCGCACCAGAAATCGTT

GAAGGTGAATTTTCAGTTTTAGATCAAGTATCTATTGATAAAATGATGATTCAATTAGACGGTACACACAACAAAGGTAA

ATTAGGTGCAAATGCCATTTTAGGTGTTTCTATTGCCGTAGCTCGTGCAGCTGCTGACTTATTAGGTCAACCATTATATA

AATATTTAGGTGGATTTAATGGTAAACAATTGCCAGTACCTATGATGAATATTGTTAATGGTGGTTCTCACTCAGATGCA

CCAATTGCTTTCCAAGAGTTCATGATTTTACCTGTAGGTGCTGAGTCATTCAAAGAATCATTACGTTGGGGTGCAGAAAT

CTTCCATAACCTTAAATCAATCTTAAGTGAACGTGGTTTAGAAACTGCAGTAGGTGATGAAGGTGGTTTCGCTCCTAGAT

TTGAAGGCACTGAAGACGCTGTAGAAACTATTATTAAAGCTATCGAAAAAGCAGGATACAAACCAGGTGAAGATGTATTC

TTAGGATTTGACTGTGCTTCTTCTGAATTCTATGAAAATGGTGTTTATGATTACACTAAATTCGAAGGTGAACACGGTGC

TAAACGTAGTGCAGCAGAGCAAGTTGACTACTTAGAAGAATTAATTGGTAAATATCCAATCATCACTATTGAAGATGGTA

TGGATGAAAACGATTGGGAAGGTTGGAAACAATTAACTGATCGTATCGGTGATAAAGTTCAATTAGTTGGTGATGATTTA

TTCGTAACTAACACTGAAATTTTATCTAAAGGTATCGAACAAGGTATTGGTAACTCAATCTTAATCAAAGTAAACCAAAT

CGGTACATTAACTGAAACATTCGATGCTATTGAAATGGCTCAAAAAGCTGGATATACTGCGGTTGTATCTCACCGTTCTG

GTGAAACTGAAGATACTACAATTGCTGATATCGCAGTTGCTACAAATGCAGGCCAAATTAAAACAGGTTCATTATCTAGA

ACTGACCGTATTGCTAAATACAATCAATTATTACGTATTGAAGATGAATTATACGAAACAGCTAAATTTGAAGGAATTAA

ATCTTTCTACAATTTAGATAAATAA

SEQ ID NO:38 seqüência de polinucleotídeoATGAAAAAAATCGTTACAGCTACAATCGCTACAGCAGGACTTGCCACTATCGCATTTGCAGGACATGATGCACAAGCCGC

AGAACAAAATAACAATGGATATAATTCTAATGACGCTCAATCATACAGCTATACGTATACAATTGATGCACAAGGTAATT

ATCATTACACTTGGACAGGAAATTGGAATCCAAGTCAATTAACGCAAAACAACACATACTACTACAACAACTACAATACT

TATAGTTATAACAATGCATCTTACAATAACTACTATAATCATTCATATCAATACAATAACTATACAAACAATAGCCAAAC

AGCAACAAATAACTATTATACTGGTGGTTCAGGTGCAAGTTATAGCACAACAAGTAATAATGTTCATGTGACTACAACTG

CAGCGCCATCTTCAAATGGTCGTTCAATTTCTAATGGTTATGCATCAGGAAGTAACTTATATACTTCAGGACAATGTACT

TATTATGTATTTGATCGTGTTGGTGGGAAAATTGGTTCAACATGGGGTAACGCAAGTAATTGGGCTAACGCAGCTGCATC

ATCTGGCTATACAGTGAACAATACACCAAAAGTTGGTGCTATCATGCAAACAACACAAGGCTATTACGGTCATGTTGCTT

ACGTTGAAGGCGTTAACAGCAACGGTTCTGTTCGTGTTTCAGAAATGAACTATGGACATGGTGCTGGTGTGGTTACGTCT

CGTACAATTTCAGCAAACCAAGCAGGTTCATATAATTTCATTCATTAA

SEQ ID NO:39 seqüência de polinucleotídeoATGAAGAAAATCGCTACAGCTACTATCGCAACTGCAGGATTCGCTACAATCGCAATTGCATCAGGAAATCAAGCTCATGC

TTCTGAGCAAGATAACTACGGTTATAATCCAAACGACCCAACATCATATAGCTATACTTACACTATTGATGCACAAGGTA

ACTACCATTACACATGGAAAGGTAACTGGCATCCAAGTCAATTAAACCAAGATAATGGCTACTACAGCTATTACTACTAC

AATGGCTACAATAACTACAACAATTACAACAATGGTTATAGCTACAATAATTACAGCCGTTACAACAACTACTCAAATAA

TAATCAATCATATAACTACAATAACTATAATAGTTACAACACAAACAGCTACCGTACTGGTGGTTTAGGTGCAAGCTACA

GCACTTCAAGCAACAATGTTCAAGTAACTACAACTATGGCTCCATCATCAAATGGCCGTTCAATCTCAAGTGGTTATACT

TCAGGACGTAACTTATACACTTCTGGTCAATGTACATACTACGTATTTGATCGTGTAGGTGGTAAAATCGGTTCAACTTG

GGGCAATGCAAGTAACTGGGCTAACGCAGCTGCAAGAGCTGGTTACACAGTGAACAATACACCAAAAGCTGGTGCAATTA

TGCAAACAACTCAAGGTGCATACGGTCACGTTGCATACGTTGAAAGTGTTAACAGCAATGGTTCAGTAAGAGTTTCAGAA

ATGAACTATGGTTATGGCCCAGGTGTTGTAACTTCACGTACAATCTCAGCTAGCCAAGCTGCTGGTTATAACTTCATTCA

CTAA

SEQ ID NO:40 seqüência de polinucleotídeoATGAAAAAAATCGCTACAGCTACAATTGCAACTGCAGGAATCGCTACTTTCGCATTTGCACACCATGACGCACAAGCAGC

AGAACAAAATAATGATGGGTACAATCCAAACGACCCTTATTCATATAGCTACACTTACACAATCGATGCTGAAGGTAACT

ACCACTACACTTGGAAAGGTAACTGGAGTCCAGATCGTGTAAATACTTCATATAACTATAATAATTATAATAACTACAAC

TACTATGGTTACAATAACTATAGCAACTACAATAACTACAGTAATTACAACAATTACAACAACTATCAATCAAACAACAC

GCAATCACAAAGAACAACTCAACCGACTGGTGGTTTAGGCGCAAGCTATTCAACATCAAGTAGTAATGTTCACGTTACAA

17/68

CAACTTCTGCGCCATCATCAAACGGTGTATCTTTATCAAACGCTCGCTCAGCATCTGGTAACTTATACACTTCAGGTCAA

TGTACATATTATGTATTTGACAGAGTAGGTGGCAAAATCGGTTCAACGTGGGGTAACGCAAACAACTGGGCAAACGCTGC

AGCACGTTCTGGTTACACAGTAAACAATTCGCCTGCTAAAGGTGCAATCTTACAAACGTCACAAGGTGCATACGGACACG

TAGCATACGTTGAAGGTGTAAACAGCAATGGTTCAATCAGAGTTTCAGAAATGAACTACGGTCACGGTGCAGGTGTTGTC

ACTTCACGTACAATCTCTGCGAGCCAAGCTGCTTCATATAACTATATTCACTAA

SEQ ID NO:41 seqüência de polinucleotídeoATGAAAAAATTAGTACCTTTATTATTAGCCTTATTACTTCTAGTTGCTGCATGTGGTACTGGTGGTAAACAAAGCAGTGA

TAAGTCAAATGGCAAATTAAAAGTAGTAACGACGAATTCAATTTTATATGATATGGCTAAAAATGTTGGTGGAGACAACG

TCGATATTCATAGTATTGTACCTGTTGGTCAAGATCCTCATGAATATGAAGTTAAACCTAAAGATATTAAAAAGTTAACT

GACGCTGACGTTATTTTATACAACGGATTAAATTTAGAGACTGGTAACGGTTGGTTTGAAAAAGCCTTAGAACAGGCTGG

TAAATCATTAAAAGATAAAAAAGTTATCGCAGTATCAAAAGATGTTAAACCTATCTATTTAAACGGTGAAGAAGGCAACA

AAGATAAACAAGATCCACACGCATGGTTAAGTTTAGATAATGGTATTAAATACGTAAAAACAATTCAACAAACATTTATC

GATAACGACAAAAAACATAAAGCAGATTATGAAAAGCAAGGTAACAAATACATTGCTCAATTGGAAAAATTAAATAATGA

CAGTAAAGACAAATTTAATGACATTCCAAAAGAACAACGTGCCATGATTACAAGTGAAGGTGCCTTCAAGTACTTCTCAA

AACAATACGGTATTACACCAGGTTATATTTGGGAAATTAACACTGAAAAACAAGGTACACCTGAACAAATGAGACAAGCT

ATTGAGTTTGTTAAAAAGCACAAATTAAAACACTTATTAGTAGAAACAAGTGTTGATAAGAAAGCAATGGAAAGTTTATC

TGAAGAAACGAAGAAAGATATCTTTGGTGAAGTGTACACAGATTCAATCGGTAAAGAAGGCACTAAAGGTGACTCTTACT

ACAAAATGATGAAATCAAATATTGAAACTGTACACGGAAGCATGAAATAA

SEQ ID NO:42 seqüência de polinucleotídeoGTGAAAAAAATTCTCGCTTTAGCAATAGCATTTTTAATTATCCTTGCCGCATGTGGGAATCACAGTAACCATGAACATCA

CTCACATGAAGGAAAATTAAAAGTTGTAACTACAAACTCTATTCTCTATGACATGGTTAAACGTGTCGGTGGAAATAAGG

TCGATGTTCATAGCATCGTTCCAGTAGGACAAGACCCACATGAATATGAGGTTAAACCTAAAGATATTAAAGC.ATTAACA

GATGCTGACGTTGTATTTTATAACGGTTTAAACCTAGAAACTGGAAATGGTTGGTTTGAAAAAGCACTTGACCAAGCAGG

AAAATCAACAAAAGATAAAAATGTGATAGCAGCATCAAATAATGTTAAACCAATATACTTAAATGGTGAGGAAGGTAACA

AAAACAAACAAGATCCACATGCATGGTTAAGTTTAGAGAATGGAATTAAATACGTAAAAACAATACAAAAATCACTAGAA

CATCATGATAAAAAAGATAAGTCTACATATGAAAAACAAGGGAATGCATATATATCAAAATTAGAAGAACTTAATAAAGA

TAGTAAAAATAAATTTGATGACATACCCAAAAATCAACGTGCCATGATGACAAGTGAAGGTGCATTTAAATATTTTGCTC

AACAATTCGATGTTAAACCAGGTTATATTTGGGAGATAAACACAGAAAAACAAGGTACACCTGGTCAAATGAAACAAGCC

ATTAAATTTGTTAAAGATAATCATTTAAAACATTTATTAGTCGAAACAAGCGTAGATAAAAAAGCTATGCAAAGTTTATC

AGAAGAAACTAAGAAAGATATTTATGGTGAAGTATTTACCGACTCTATAGGTAAGGAAGGTACTAAAGGTGACTCATACT

ATAAAATGATGAAATCTAATATTGATACAATACATGGTAGTATGAAATAA

SEQ ID NO:43 seqüência de polinucleotídeoATGAAAAAGACAATTATGGCATCATCATTAGCAGTGGCATTAGGTGTAACAGGTTACGCAGCAGGTACAGGACATCAAGC

ACACGCTGCTGAAGTAAACGTTGATCAAGCACACTTAGTTGACTTAGCGCATAATCACCAAGATCAATTAAATGCAGCTC

CAATCAAAGATGGTGCATATGACATCCACTTTGTAAAAGATGGTTTCCAATATAACTTTACTTCAAATGGTACTACATGG

TCATGGAGCTATGAAGCAGCTAATGGTCAAACTGCTGGTTTCTCAAACGTTGCAGGTGCAGACTACACTACTTCATACAA

CCAAGGTTCAGATGTACAATCAGTAAGCTACAATGCACAATCAAGTAACTCAAACGTTGAAGCTGTTTCAGCTCCAACTT

ACCATAACTACAGCACTTCAACTACTTCAAGTTCAGTGAGATTAAGCAATGGTAATACTGCAGGTGCTACTGGTTCATCA

GCAGCTCAAATCATGGCTCAACGTACTGGTGTTTCAGCTTCTAC.ATGGGCTGCAATCATCGCTCGTGAATCAAATGGTCA

AGTAAATGCTTACAACCCATCAGGTGCTTCAGGTTTATTCCAAACTATGCCAGGTTGGGGTCCGACAAACACTGTTGACC

AACAAATCAACGCAGCTGTTAAAGCATACAAAGCACAAGGTTTAGGTGCTTGGGGATTCTAA

SEQ ID NO:44 seqüência de polinucleotídeoATGAAAAAAACAGTTATCGCTTCTACATTAGCAGTATCTTTAGGAATTGCAGGTTACGGTTTATCAGGACATGAAGCACA

CGCTTCAGAAACTACAAACGTTGATAAAGCACACTTAGTAGATTTAGCACAACATAATCCTGAAGAATTAAATGCTAAAC

CAGTTCAAGCTGGTGCTTACGATATTCATTTCGTAGACAATGGATACCAATACAACTTCACTTCAAATGGTTCTGAATGG

TCATGGAGCTACGCTGTAGCTGGTTCAGATGCTGATTACACAGAATCATCATCAAACCAAGAAGTAAGTGCAAATACACA

ATCTAGTAACACAAATGTACAAGCTGTTTCAGCTCCAACTTCTTCAGAAAGTCGTAGCTACAGCACATCAACTACTTCAT

ACTCAGCACCAAGCCATAACTACAGCTCTCACAGTAGTTCAGTAAGATTATCAAATGGTAATACTGCTGGTTCTGTAGGT

TCATATGCTGCTGCTCAAATGGCTGCACGTACTGGTGTATCTGCTTCAACATGGGAACACATCATTGCTAGAGAATCAAA

TGGTCAATTACATGCACGTAATGCTTCAGGTGCTGCTGGATTATTCCAAACTATGCCAGGTTGGGGTTCAACTGGTTCAG

TAAATGATCAAATCAATGCCGCTTATAAAGCATATAAAGCACAAGGTTTATCTGCTTGGGGTATGTAA

SEQ ID NO:45 seqüência de polinucleotídeoGTGAATTATCGTGATAAAATTCAAAAGTTTAGTATTCGTAAATATACAGTTGGTACATTTTCAACTGTCATTGCGACATT

GGTATTTTTAGGATTCAATACATCACAAGCACATGCTGCTGAAACAAATCAACCAGCAAGCGTGGTTAAACAGAAACAAC

18/68

AAAGTAATAATGAACAGACTGAGAATCGAGAATCTCAAGTACAAAATTCTCAAAATTCACAAAATAGTCAATCATTATCC

GCTACTCATGAAAATGAGCAACCAAATAATAGTCAAGCTAATTTAGTAAATCAAAAAGTAGCGCAATCATCTACTACTAA

TGATGAACAACCAGCATCTCAAAATGTAAATACAAAGAAAGATTCGGCAACGGCTGCGACAACACAACCAGATAAAGAAG

AAAGTAAGCATAAACAAAACGAAAGTCAATCTGCTAATAAAAATGGAAACGACAATAGAGCGGCTCATGTAGAAAATCAT

GAAGCAAATGTAGTAACAGCTTCAGATTCATCTGATAATGGTAACGTACAACATGACCGAAATGAATTACAAGCATTTTT

TGATGCAAATTATCATGATTATCGCTTTATTGACCGTGAAAATGCAGATTCTGGCACATTTAACTATGTAAAAGGCATTT

TTGACAAGATTAATACTTTATTAGGCAGTAATGATCCAATTAACAATAAAGACTTGCAACTTGCATACAAAGAATTGGAA

CAAGCTGTTGCTTTAATTCGTACAATGCCTCAACGTCAACAAACTAGCCGTCGATCAAACAGAATTCAAACGCGTTCTGT

TGAGTCTAGAGCTGCAGAGCCTAGATCAGTATCAGACTATCAAAATGCAAATTCATCATATTATGTTGAAAATGCTAATG

ATGGTTCAGGATATCCTGTAGGTACATATATCAATGCTTCTAGTAAAGGGGCGCCATATAATTTACCAACTACACCATGG

AATACATTGAAGGCCTCTGACTCAAAGGAAATTGCTCTTATGACAGCGAAACAAACTGGAGATGGCTACCAATGGGTTAT

TAAGTTTAATAAAGGACATGCTCCACATCAAAATATGATTTTCTGGTTTGCATTACCAGCAGACCAAGTGCCAGTAGGAA

GAACTGACTTTGTAACAGTTAATTCAGATGGAACAAATGTACAATGGAGTCATGGAGCAGGAGCAGGTGCAAATAAACCA

CTTCAACAAATGTGGGAATATGGAGTAAATGATCCTGATCGTTCACATGACTTTAAAATAAGAAATAGAAGTGGCCAAGT

AATATATAGCTGGCCAACTGTCCATGTTTATTCTTTAGAAGATTTATCTAGAGCGAGTGATTATTTTAGTGAAGCTGGAG

CGACACCTGCTACTAAAGCATTTGGTAGACAAAATTTTGAATATATTAATGGTCAAAAACCTGCTGAATCACCGGGTGTT

CCTAAAGTTTATACTTTCATCGGTCAAGGTGATGCAAGTTATACAATTTCATTTAAAACACAAGGTCCAACrGTTAATAA

ATTGTATTATGCAGCAGGTGGGCGTGCTTTAGAGTACAATCAATTATTTATGTACAGTCAACTATACGTCGAATCAACGC

AAGACCATCAACAACGTCTTAATGGTTTAAGACAAGTGGTTAATCGTACATATCGCATAGGTACAACTAAACGTGTAGAA

GTGAGTCAAGGAAATGTACAAACGAAAAAGGTATTAGAAAGTACAAACCTAAA.TATAGATGATTTTGTTGATGATCCTTT

AAGTTATGTTAAGACGCCGAGTAATAAAGTGTTAGGTTTTTACCCAACTAATGCAAATACTAACGCTTTTAGACCGGGGG

GCGTTCAAGAATTAAATGAATATCAATTAAGTCAATTATTTACTGATCAAAAATTACAAGAAGCAGCAAGAACTAGAAAC

CCAATAAGATTAATGATTGGTTTCGACTATCCTGATGGTTATGGTAATAGTGAAACTTTAGTTCCTGTTAACTTAACGGT

ATTACCTGAAATCCAACATAATATTAAATTCTTTAAAAATGACGATACTCAAAATATTGCTGAAAAACCATTTTCAAAAC

AAGCTGGGCATCCAGTTTTCTATGTATATGCAGGTAACCAAGGGAATGCTTCCGTGAATTTAGGTGGTAGCGTAACATCT

ATTCAACCATTACGTATTAATTTAACAAGTAATGAGAATTTTACAGATAAAGATTGGCAAATTACAGGTATTCCGCGTAC

ATTACACATTGAAAACTCGACAAATAGAACTAATAATGCTAGAGAACGTAACATTGAACTTGTTGGTAATTTATTACCAG

GGGATTACTTTGGTACGATACGTTTTGGACGTAAAGAACAATTATTTGAAATTCGTGTTAAACCACATACACCAACAATT

ACAACGACAGCTGAGCAATTAAGAGGTACAGCATTACAAAAAGTGCCTGTTAATAITTCGGGAATACCGTTGGATCCATC

GGCATTGGTTTATTTAGTTGCACCAACAAATCAAACTACGAATGGTGGTAGTGAGGCAGATCAAATACCATCTGGTTATA

CGATACTTGCGACTGGTACACCTGATGGGGTGCATAATACAATTACTATACGACCGCAAGATTATGTTGTATTCATACCA

CCTGTAGGTAAACAAATTAGAGCAGTAGTTTATTATAATAAAGTAGTTGCATCTAATATGAGTAATGCTGTTACTATTTT

GCCAGATGACATTCCACCAACAATCAATAATCCTGTTGGAATAAATGCCAAATACTATCGAGGCGACGAAGTCAACTTTA

CAATGGGAGTCTCTGATAGACATTCTGGTATAAAAAATACAACTATTACTACTTTGCCAAGTGGTTGGACATCAAATTTA

ACTAAATCCGACAACAAAAACGGCTCATTAGCTATTACAGGTAGAGTCTCTATGAATCAGGCATTTAACAGTGATATTAC

ATTTAAAGTATCAGCGACAGACAATGTCAATAATACGACAAATGATAGTCAATCTAAACATGTGTCAATTCATGTAGGTA

AAATTAGTGAAGATGCTCATCCGATTGTATTAGGAAATACTGAGAAAGTTGTAGTAGTCAATCCGACTGCTGTATCTAAT

GATGAAAAGCAAAGCATAATTACTGCCTTTATGAATAAAAACCAAAATATAAGAGGATATTTAGCATCAACTGATCCAGT

AACTGTCGATAATAATGGTAACGTCACATTACATTACCGTGATGGCTCATCAACAACGCTTGATGCTACAAATGTGATGA

CATACGAACCAGTTGTGAAATCTGAATATCAAACTGCCAATGCTGCTAAAACAGCAACGGTAACGATTGCTAAAGGACAA

TCATTTAATATTGGTGATATTAAACAATATTTTACTTTAAGTAATGGACAAGCTATTCCAAATGGCACATTTACAAATAT

TACATCTGATAGAACTATTCCAACTGCACAAGAAGTTAGTCAAATGAATGCAGGTACGCAGTTATATCATATAGTTGCTT

CAAATGCATATCATAAAGACACTGAAGATTTCTATATTAGTTTAAAAATCGTTGATGTGAAACAACCTGAAGGCGATCAA

CGTGTCTATCGTACGTCAACATATGATTTAACCACTGATGAAATCTCAAAAGTAAAACAAGCTTTTATTAATGCAAATAG

AGATGTAATTACGCTTGCCGAAGGTGATATTTCAGTTACAAATACACCTAATGGTGCTAATGTAAGTACTATTACAGTAA

ATATTAATAAAGGTCGATTAACGAAATCATTCGCGTCTAACCTAGCTAATATGAATTTCTTGCGTTGGGTTAATTTCCCA

CAAGATTATACAGTGACATGGACGAATGCAAAAATTGCAAACAGACCAACAGATGGTGGTTTATCATGGTCCGATGACCA

TAAATCTTTAATTTATCGTTATGATGCTACATTAGGCACACAAATTACAACTAATGATATTTTAACGATGCTAAAAGCGA

CTACTACAGTGCCTGGATTGCGTAATAATATTACTGGTAATGAAAAAGCACAAGCAGAAGCAGGTGGAAGACCAAACTAT

AGAACAACTGGTTATTCACAATCAAATGCGACAACTGATGGTCAACGTCAATTTACGTTGAATGGTCAAGTGATTCAAAT

ATTAGACATCATCAACCCTTCAAACGGTTATGGTGGGCAACCTGTTACAAATTCAAATACTCGTGCAAACCATAGTAACT

CAACTGTTGTTAACGTAAACGAACCGGCAGCTAATGGTGCTGGCGCATTTACAATTGACCACGTTGTAAAAAGTAATTCT

ACACATAATGCAAGTGATGCAGTTTATAAAGCGCAGTTATACTTAACGCCATATGGTCCAAAACAATATGTTGAACATTT

AAATCAAAATACAGGAAATACTACTGACGCTATTAACATTTATTTTGTACCAAGTGACTTAGTGAATCCAACAATTTCAG

TAGGTAATTACACTAATCATCAAGTGTTCTCAGGTGAAACATTTACAAATACGATTACAGCGAATGATAACTTTGGTGTG

CAATCGGTAACTGTACCAAATACATCACAAATTACAGGTACTGTTGATAATAACCATCAACATGTTTCTGCAACGGCACC

AAATGTGACATCAGCAACTAGTAAGACAATCAATTTATTAGCAACTGATACAAGTGGTAATACAGCTACAACTTCATTCA

ATGTAACAGTGAAACCTTTGCGTGATAAATATCGAGTTGGTACTTCATCAACGGCTGCTAATCCTGTTAGAATTGCCAAT

ATTTCGAATAATGCGACAGTATCACAAGCTGATCAAACGACAATTATTAATTCGTTAACGTTTACAAGTAATGCACCAAA

TAGAAACTATGCAACAGCAAGCGCAAATGAAATCACTAGTAAAACAGTTAGTAATGTCAGTCGTACTGGAAATAATGCCA

ATGTCACAGTAACTGTTACTCATCAAGATGGAACAACATCAACAGTGACTGTACCTGTAAAGCATGTCATTCCAGAAATC

19/68

GTTGCACATTCGCATTACACTGTACAAGGCCAAGACTTCCCAGCAGGTAATGGTTCTAGTGCAGCAGATTACTTTAAGTT

ATCTAATGGTAGTGCCATTCCAGATGCAACGATTACATGGGTAAGTGGACAAGCGCCAAATAAAGATAATACACGTATTG

GTGAAGATATAACAGTAACTGCACATATCTTAAT'TGATGGCGAAACAACGCCGATTACGAAAACAGCAACATATAAAGTA

GTAAGAACTGTACCGAAACATGTCTTTGAAACAGCCAGAGGTGTTTTATACCCAGGTGTTTCAGATATGTATGATGCGAA

ACAATATGTTAAGCCAGTAAATAATTCTTGGTCGACAAATGCGCAACATATGAATTTTCAATTTGTTGGAACATATGGTC

CTAACAAAGATGTTGTAGGTATATCAACGCGTCTTATTAGAGTGACTTATGATAATAGACAAACTGAAGATTTAACTATT

TTATCTAAAGTTAAACCTGACCCACCAAGAATTGACGCAAACTCTGTGACATATAAAGCAGGTCTTACAAACCAAGAAAT

TAAAGTTAATAACGTATTAAATAACTCGTCAGTAAAATTATTTAAAGCAGATAATACACCATTAAATGTCACAAATATTAcTCATGGTAGTGGTTTTAGTTCGGTTGTGACAGTAAGTGACGCGTTACCAAATGGCGGAATTAAAGCAAAATCTTcAATT

TCAATGAACAATGTGACGTATACGACGCAAGACGAACATGGTCAAGTTGTTACAGTAACAAGAAATGAATCTGTTGATTC

AAATGATAGTGCTTCTGTTACAGTAACACCACAATTACAAGCAACTACTGAAGGCGCTGTATTTATTAAAGGTGGCGACG

GTTTTGATTTCGGTCATGTAGAACGATTTATTCAAAATCCGCCACATGGGGCAACGGTCGCATGGCATGATAGTCCAGAT

ACATGGAAGAATACAGTCGGCAACACACATAAAACTGCGGTTGTAACATTACCTAGTGGTCAAGGTACGCGTAATGTTGA

AGTTCCAGTCAAAGTTTATCCAGTTGCTAATGCTAAGGCGCCATCACGTGATGTGAAAGGTCAAAATTTGACACATGGTA

CAAACGCTATTGATTACATTACATTTGATCCAAATACTAATACGAATGGTATTACAGCAGCATGGGCAAATAGACAACAA

CCAAATAACCAGCAAGCAGGCGTTCAACATTTAAATGTCGATGTCACATATCCAGGTATTTCAGCTGCTAAACGAGTTCC

TGTAACTGTGAACGTATATCAATTTGAATTCCCTCAAACTACTTATACAACAACAGTTGGTGGCACTTTAGCAAGTGGTA

CGCAAGCATCAGGATATGCACATATGCAAAACGCTTCAGGTTTACCAACAGATGGATTTACGTATAAATGGAATCGTGAT

ACTACGGGTACAAACGATGCAAACTGGGCAGCAATGAATAAACCAAATACTGCACAAGTCGTTAATGCAAAATATGATGT

CATCTATAATGGACATACATTTGCAACATCTTTACCAGCGAAATTTGTAGTAAAAGATGTTCAACCAGCGAAACCAACTG

TCACTGAAACAGCGGCAGGAGCGATTACAATTGCACCTGGTGCGAACCAAACAGTCAATACTCATGCTGGTAATGTTACG

ACATATGCTGACAAATTAGTTATTAAACGTAATGGAAATGTTGTAACGACATTTACACGTCGTAATAATACGAGCCCATG

GGTGAAAGAAGCATCAGCAGATAATGTAACAGGTATTGTTGGAACTAATAATGGTATTACTGTGGCAGCAGGTACTTTCA

ATCCTGCTGATACAATTCAAGTTGTTGCAACACAAGGTAGTGGCGAAACAATCAGTGACGAGCAACGTAGTGATGATTTC

ACAGTTGTCGCACCACAACCGAACCAAGCGACTACGAAAATTTGGCAAAATGGTCATATTGATATCACGCCTAATAATCC

ATCAGGACATTTAATTAATCCAACACAAGCAATGGATATTGCTTACACTGAAAAAGTGGGTAATGGTGCAGAACATAGTA

AGACAATTAATGTTGTTCGTGGTCAAAATAATCAATGGACAATTGCGAATAAGCCTGACTATGTAACGTTAGATGCACAA

ACTGGTAAAGTGACGTTCAATGCCAATACTATAAAACCAAATTCATCAATCACAATTACTCCGAAAGCAGGTACAGGTCA

CTCAGTAAGTAGTAATCCAAGTACATTAACTGCACCGGCAGCTCATACTGTCAACACAACTGAAATTGTGAAAGATTATG

GTTCAAATGTAACAGCAGCTGAAATTAACAATGCAGTTCAAGTTGCTAATAAACGTACTGCAACGATTAAAAATGGCACA

GCAATGCCTACTAATTTAGCTGGTGGTAGCACAACGACGATTCCTGTGACAGTAACTTACAATGATGGTAGTACTGAAGA

AGTACAAGAGTCCATTTTCACAAAAGCGGATAAACGTGAGTTAATCACAGCTAAAAATCATTTAGATGATCCAGTAAGCA

CTGAAGGTAAAAAGCCAGGTACAATTACGCAGTACAATAATGCAATGCATAATGCGCAACAACAAATCAATACCGCGAAA

ACAGAAGCACAACAAGTGATTAATAATGAGCGTGCAACACCACAACAAGTTTCTGACGCACTAACTAAAGTTCGTGCAGC

ACAAACTAAGATTGATCAAGCTAAAGCATTACTTCAAAATAAAGAAGATAATAGCCAATTAGTAACGTCTAAAAATAACT

TACAAAGTTCTGTGAACCAAGTACCATCAACTGCTGGTATGACGCAACAAAGTATTGATAACTATAATGCGAAGAAGCGT

GAAGCAGAAACTGAAATAACTGCAGCTCAACGTGTTATTGACAATGGCGATGCAACTGCACAACAAATTTCAGATGAAAA

ACATCGTGTCGATAACGCATTAACAGCATTAAACCAAGCGAAACATGATTTAACTGCAGATACACATGCCTTAGAGCAAG

CAGTGCAACAATTGAATCGCACAGGTACAACGACTGGTAAGAAGCCGGCAAGTATTACTGCTTACAATAATTCGATTCGT

GCACTTCAAAGTGACTTAACAAGTGCTAAAAATAGCGCTAATGCTATCATTCAGAAGCCAATAAGAACAGTGCAAGAGGT

ACAATCTGCGTTAACAAATGTAAATCGTGTCAATGAGCGATTAACGCAAGCAATTAATCAATTAGTACCTTTAGCTGATA

ATAGTGCTTTAAGAACTGCTAAGACGAAACTTGATGAAGAAATCAATAAATCAGTAACTACTGATGGTATGACACAATCA

TCAATCCAAGCATATGAAAATGCTAAACGTGCAGGTCAAACAGAAACAACAAATGCACAAAATGTTATTAACAATGGTGA

CGCGACAGACCAACAAATTGCCGCAGAAAAAACAAAAGTAGAAGAAAAATATAATAGCTTAAAACAAGCAATTGCTGGAT

TAACACCAGACTTGGCACCATTACAAACTGCAAAAACTCAGTTGCAAAATGATATTGATCAGCCAACGAGTACGACTGGT

ATGACAAGCGCATCTGTTGCTGCATTTAATGACAAACTTTCAGCAGCTAGAACTAAAATTCAAGAAATTGATCGCGTACT

AGCATCTCATCCAGATGTAGCAACGATTCGTCAAAACGTGACAGCAGCGAATGCTGCTAAAACAGCACTTGATCAAGCGC

GCAATGGCTTAACAGTCGATAAAGCACCTTTAGAAAATGCGAAAAATcAACTACAACATAGTATTGATACGCAAACAAGT

ACAACTGGTATGACACAAGACTCTATAAATGCATACAATGCGAAGTTAACAGCTGCACGTAATAAGGTTCAACAAATCAA

TCAAGTATTAGCAGGTTCACCTACTGTAGATCAAATTAATACAAATACGTCTGCAGCAAATCAAGCGAAATCTGATTTAG

ATCATGCACGTCAAGCGTTAACACCAGATAAAGCGCCGCTTCAAAATGCGAAAACGCAATTAGAACAAAGCATTAATCAA

CCAACAGATACAACAGGTATGACAACCGCTTCGTTAAATGCATACAACCAAAAATTACAAGCAGCACGTCAAAAGTTAAC

TGAAATTAATCAAGTGTTGAATGGCAACCCAACTGTCCAAAATATCAATGATAAAGTGGCAGAGGCAAACCAAGCTAAGG

ATCAATTAAATACAGCACGTCAAGGTTTAACATTAGATAGACAGCCAGCGTTAACAACATTACATGGTGCATCTAACTTA

AACCAAGCACAACAAAATAATTTCACGCAACAAATTAATGCTGCTCAAAATCATGCTGCGCTTGAAACAATTAAGTCTAA

CATTACGGCTTTAAATACTGCGATGACGAAATTAAAAGACAGTGTTGCGGATAATAATACAATTAAATCAGGTCAAAATT

ACACTGACGCAACACCAGCTAATAAACAAGCCTATGATAATGCAGTTAATGCGGCTAAAGGTGTCATTGGAGAAACGACT

AATCCAACGATGGATGTTAACACAGTGAACCAAAAAGCAGCATCTGTTAAATCGACGAAAGATGCTTTAGATGGTCAACA

AAACTTACAACGTGCGAAAACAGAAGCAACAAATGCGATTACGCATGCAAGTGATTTAAACCAAGCACAAAAGAATGCAT

TAACACAACAAGTGAATAGTGCACAAAACGTGCAAGCAGTAAATGATATTAAACAAACGACTCAAAGCTTAAATACTGCT

ATGACAGGTTTAAAAcGTGGcGTTGCTAATCATAACCAAGTCGTACAAAGTGATAATTATGTCAACGCAGATACTAATAA

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GAAAAATGATTACAACAATGCATACAACCATGCGAATGACATTATTAATGGTAATGCACAACATCCAGTTATAACACCAA

GTGATGTTAACAATGCTTTATCAAATGTCACAAGTAAAGAACATGCATTGAATGGTGAAGCTAAGTTAAATGCTGCGAAA

CAAGAAGCGAATACTGCATTAGGTCATTTAAACAATTTAAATAATGTACAACGTCAAAACTTACAATCGCAAATTAATGGTGCGCATCAAATTGATGCAGTTAATACAATTAAGCAAAATGCAACAAACTTGAATAGTGCAATGGGTAACTTAAGACAAG

CTGTTGCAGATAAAGATCAAGTGAAACGTACAGAAGATTATG CGGATGCAGATACAGCTAAACAAAATGCATATAACAGT

GCAGTTTCAAGTGCTGAAACAATTATTAATCAAACAGCTAATCCGACAATGTCTGTTGATGATGTTAATCGTGCAACTTC

AGCTGTTACTACTAATAAAAATGCATTAAATGGTGATGAAAAATTAGTACAATCTAAAACAGATGCTGCAAGAGCAATTG

ATGCATTACCACATTTAAATAATGCACAAAAAGCAGATGTTAAATCTAAAATTAATGCTGCATCAAATATTGCTGGTGTA

AATACCGTTAAACAACAAGGTACAGATTTAAATACAGCGATGGGTAACTTGCAGGGTGCAATCAATGATGAACAAACGAC

GCTTAATAGTCAAAATTATCAAGATGCGACACCTAGTAAGAAAACAGCATACACAAATGCGGTGCAAGCTGCGAAAGATA

TTTTAAATAAATCAAATGGTCAAAATAAAACGAAAGATCAAGTTACTGAAGCGATGAATCAAGTGAATTCGGCTAAAAAT

AACTTAGATGGTACGCGTTTATTAGATCAAGCGAAGCAAACAGCGAAACAGCAGTTAAATAATATGACGCATTTAACAAC

TGCACAAAAAACGAATTTAACAAATCAAATTAATAGTGGTACTACTGTTGCTGGTGTTCATACGGTTCAATCAAATGCCA

ACACATTAGATCAAGCGATGAATACGTTAAGACAAAGTATTGCTAACAATGATGCGACTAAAGCAAGTGAAGATTACGTA

GATGCTAATAATGATAAGCAAACAGCATATAACAACGCGGTAGCTGCTGCTGAAACGATTATTAATGCGAATAGTAATCC

AGAAATGAATCCAAGTACGATTACACAAAAAGCAGAGCAAGTGAATAGTTCTAAAACGGCACTTAACGGTGATGAAAACT

TAGCTACGGCAAAACAAAATGCGAAAACGTACTTAAACACATTAACGAGTATTACAGATGCTCAAAAGAACAATTTGATT

AGTCAAATTAGTAGTGCGACAAGAGTGAGTGGTGTTGATACTGTAAAACAAAATGCACAACATTTAGATCAAGCTATGGC

TAACTTACAAAATGGTATTAACAACGAATCTCAAGTGAAATCATCTGAGAAATATCGTGATGCTGATACAAATAAACAAC

AAGAGTATGATAATGCTATTACTGCAGCGAAAGCGATTTTAAATAAATCGACAGGTCCAAACACTGCGCAAAATGCAGTT

GAAGCAGCATTGCAACGTGTTAATACTGCGAAAGATGCATTGAATGGTGATGCAAAATTAATTGCAGCTCAAAACGCAGC

GAAACAACATTTAGGTACTTTAACGCATATCACTACAGCACAACGCAATGATTTAACAAATCAAATTTCA

SEQ ID NO:46 seqüência de polinucleotídeoATGGGTAACTTACAAACGGCTATCAACGATAAGTCAGGAACATTAGCGAGCCAAAACTTCTTGGATGCTCATGAGCAAAA

ACGTAATGCTTACAATCAAGCTATATCAGCTGCCGAAACCATTTTAAATAAACAAACTGGACCGAATACAGCGAAAACAG

CGGTTGAACAAGCACTTAATAATGTTAATAGTGCGAAACATGCATTAAATGGTACGCAAAACTTAAATAATGCGAAACAA

GCAGCGATTACAGCAATTAATGGCGCATCTGATTTAAATCAAAAACAAAAAGATGCATTAAAAGCACAAGCTAATGGTGC

TCAACGCGTATCTAATGCAAATGATGTACAACGTAATGCGACTGAACTGAACACGGCAATGGGTCAATTACAACATGCCA

TCGCAGATAAGACGAATACGTTAGCAAGCAGTAAATATGTCAACGCCGATAGCACTAAACAAAATGCTTACACAACTAAA

GTTACCAATGCTGAACATATTATTAGCGGTACGCCAACGGTTGTTACAACACCTTCAGAAGTAACAGCTGCAGCTAATCA

AGTAAACAGCGCGAAACAAGAATTAAATGGTGACGAAAGATTACGTGTTGCAAAACAAAACGCCAATACTGCTATTGATG

CATTAACGCAATTAAATACTCCTCAAAAAGCTAAATTAAAAGAACAAGTGGGACAAGCCAATAGATTAGAAGACGTACAA

TCTGTTCAAACAAATGGACAATCATTGAACAATGCAATGAAAGGCTTAAGAGATAGTATTGCTAACGAAACAA.CAGTCAA

AGCAAGTCAAAACTATACAGACGCAAGTCCGAATAACCAATCAACATATAATAGCGCTGTGTCAAATGCGAAAGGTATCA

TTAATCAAACTAACAATCCAACTATGGATACTAGTGCGATTACCCAAGCTACAACACAAGTGAATAATGCTAAAAATGGT

TTAAACGGTGCTGAAAACTTAAGAAATGCACAAAACACTGCTAAGCAAAACTTAAATACGTTATCACACTTAACAAATAA

CCAAAAATCTGCAATCTCATCACAAATTGATCGTGCAGGTCATGTGAGTGAGGTAACAGCTGCTAAAAATGCAGCAACTG

AGTTAAACGCGCAAATGGGCAACTTGGAACAAGCTATCCATGATCAAAACACAGTTAAACAAGGTGTTAACTTCACTGAT

GCAGATAAAGCTAAACGTGATGCTTATACAAATGCGGTAAGCAGAGCAGAAACAATTCTGAATAAAACGCAAGGTGCAAA

TACGTCTAAACAAGATGTTGAAGCGGCTATTCAAAATGTTACAAGTGCTAAAAATGCATTGAATGGTGATCAAAACGTTA

CAAATGCGAAGAATGCAGCTAAAAATGCATTAAATAACTTAACGTCAATTAATAATGCACAAAAACGTGACTTAACAACT

AAAATTGATCAAGCAACAACAGTAGCTGGTGTTGAAGCGGTATCTAATACAGGTACACAATTGAATACAGCGATGGCTAA

CTTGCAAAATGGTATTAATGATAAAGCGAATACTTTAGCGAGCGAAAACTATCATGATGCTGATTCAGATAAGAAAACTG

CTTATACTCAAGCCGTTACGAACGCAGAAAATATTTTAAATAAAAATAGTGGATCAAATTTAGATAAAGCTGCCGTTGAA

AACGCGTTGTCACAAGTGACAAATGCGAAAGGTGCCCTAAATGGTAACCATAATTTAGAGCAAGCTAAATCAAATGCAAA

CACTACTATAAACGGCCTTCAACATTTAACAACAGCACAAAAAGATAAATTGAAACAACAAGTGCAACAAGCACAAAATG

TTGCAGGTGTAGATACTGTTAAATCAAGTGCCAACACATTAAATGGTGCTATGGGTACGTTAAGAAATAGCATACAAGAT

AACACAGCTACGAAAAATGGCCAAAACTATCTTGATGCTACAGAACGTAACAAAACAAACTATAACAATGCTGTTGATAG

TGCTAATGGTGTCATTAATGCAACAAGCAATCCAAATATGGATGCTAATGCAATTAACCAAATCGCTACACAAGTGACAT

CAACGAAAAATGCATTAGATGGTACACATAATTTAACGCAAGCGAAACAAACAGCAACAAATGCCATCGATGGTGCTACT

AACTTAAATAAAGCGCAAAAAGATGCGTTAAAAGCACAAGTTACAAGTGCGCAACGTGTTGCAAATGTAACAAGTATCCA

ACAAACTGCAAATGAACTTAATACAGCTATGGGTCAATTACAACATGGTATTGATGATGAAAATGCAACAAAACAAACTC

AAAAATATCGTGACGCTGAACAAAGTAAGAAAACTGCTTATGATCAAGCTGTAGCTGCTGCGAAAGCAATTTTAAATAAA

CAAACAGGTTCCAATTCAGATAAAGCAGCAGTTGACCGTGCATTACAACAAGTAACAAGTACGAAAGATGCATTGAATGG

GGATGCTAAACTGGCAGAAGCGAAAGCGGCAGCTAGACAAAACTTAGGTACTTTAAACCATATTACGAATGCACAACGTA

CTGCGTTAGAAGGTCAAATCAATCAAGCGACGACTGTTGATGGCGTTAATACTGTAAAAACAAATGCCAATACATTAGAC

GGCGCTATGAATAGCTTACAAGGTGCAATCAATGATAAAGATGCGACATTAAGAAATCAAAATTATCTTGATGCAGATGA

ATCAAAACGAAATGCATATACGCAAGCTGTCACAGCGGCTGAAGGCATTTTAAATAAACAAACAGGTGGTAACACATCTA

AAGCAGACGTTGATAATGCATTAAATGCAGTTACAAGAGCGAAAGCGGCTTTAAATGGTGCTGAAAACTTAAGAAATGCG

AAAACTTCAGCAACAAATACGATTAATGGTTTACCTAACTTAACACAATTACAAAAAGACAACTTGAAGCATCAAGTTGA

21/68

ACAAGCGCAAAATGTAGTTGGTGTAAATGGTGTTAAAGATAAAGGTAATACATTAAATACTGCCATGGGTGCATTACGTA

CAAGTATCCAAAATGATAATACGACGAAAACAAGTCAAAATTATCTTGATGCATCTGATAGCAACAAAAATAATTACAAT

ACTGCTGTAAATAATGCAAATGGTGTTATTAATGCAACGAACAATCCAAATATGGATGCTAATGCGATTAATGACATGGC

AAATCAAGTCAATACAACAAAAGCAGCGTTAAATGGTGCACAAAACTTAGCTCAAGCTAAAACAAATGCGACGAACACAA

TTAACAACGCGCAAGACTTAAACCAAAAACAAAAAGATGCATTAAAAACACAAGTTAACAATGCACAACGTGTATCTGAT

GCAAATAACGTTCAACATACAGCTACTGAATTGAACGGTGCGATGACAGCACTTAAAGCAGCTATTGCGGATAAAGAAAG

AACAAAAGCAAGCGGTAATTATGTCAATGCTGATCAAGAAAAACGTCAAGCGTATGATTCAAAAGTGACTAACGCTGAAA

ATATCATTAATGGTACACCAAATGCGACATTAACAGTCAATGACGTAAATAGTGCGGCATCACAAGTCAATGCGGCTAAA

ACAGCATTAAATGGTGATAACAACTTACGTGTAGCGAAAGAGCATGCTAACAATACAATTGACGGCTTAGCACAATTGAA

TAATGTACAAAAAGCAAAATTAAAAGAACAAGTTCAAAGTGCAACTACATTAGATGGTGTTCAAACTGTTAAAAATAGTT

CTCAAACGTTGAATACAGCGATGAAAGGCTTAAGAGATAGTATTGCGAATGAAGCAACGATTAAAGCAGGTCAAAACTAC

ACTGACGCAAGTCCAAATAATCGTAACGAGTACGACAGCGCAGTTACTGCAGCAAAAGCAATCATTAATCAAACATCGAA

CCCAACGATGGAACCAAATACTATTACGCAAGCAACATCACAAGTGACAACTAAAGAACATGCATTAAATGGTGCGCAAA

ACTTAGCTCAAGCTAAGACAACAGCGAAAAACAACTTGAATAACTTAACATCAATTAACAATGCACAAAAAGATGCGTTA

ACGCGTAACATTGATGGTGCAACTACAGTAGCTGGTGTAAATCAAGAAACTGCAAAAGCAACAGAATTAAATAACGCAAT

GCACAGTTTACAAAATGGTATCAATGATGAGACACAAACAAAACAAACTCAGAAATACCTAGATGCTGAGCCAAGTAAGA

AATCAGCTTATGATCAAGCAGTAAATGCAGCAAAAGCAATTTTAACAAAAGCTAGTGGTCAAAATGTAGACAAAGCAGCA

GTTGAACAAGCATTACAAAATGTGAACAGTACGAAGACGGCGTTGAACGGTGATGCGAAATTAAATGAAGCTAAAGCTGC

TGCGAAACAAACGTTAGGTACATTAACACACATTAATAATGCACAACGTAATGCGTTAGATAATGAAATTACACAAGCAA

CAAATGTTGAAGGTGTTAATACAGTTAAAGCCAAAGCGCAACAATTAGATGGTGCTATGGGTCAATTAGAAACATCAATT

CGTGATAAAGACACGACGTTACAAAGTCAAAATTATCAAGATGCTGATGATGCTAAACGAACGGCTTATTCTCAAGCAGT

AAATGCAGCAG CAACTATTTTAAATAAAACAGC TGGAGGAAATACACCTAAAGCAGATGTCGAAAGAGCAATGCAAGCTG

TTACACAAGCCAATACTGCATTAAACGGTATTCAAAACTTAGAACGTGCGAAACAGGCTGCGAACACAGCGATTACAAAT

GCTTCGGACTTAAATACAAAACAAAAAGAAGCATTGAAAGCACAAGTAACAAGTGCAGGACGCGTATCTGCAGCAAATGG

TGTTGAACATACTGCGACTGAATTAAATACTGCGATGACAGCTTTAAAACGTGCCATTGCTGATAAAGCTGACACAAAAG

CTAGTGGTAATTATGTCAATGCTGATGCGAATAAACGCCAAGCATATGATGAAAAAGTGACAGCTGCAGAACATATCGTT

AGTGGTACACCAACACCAACGTTAACACCATCAGATGTTACAAATGCAGCAACGCAAGTAACGAATGCGAAGACGCAGTT

AAACGGTAATCATAATTTAGAAGTAGCGAAACAAAATGCTAACACAGCAATTGATGGTTTAACTTCTTTAAATGGTCCGC

AAAAAGCAAAACTTAAAGAACAAGTGGGTCAAGCGACGACGTTGCCAAATGTTCAAACTGTTCGTGATAATGCACAAACA

TTAAACACTGCAATGAAAGGTCTACGAGATAGCATTGCGAATGAAGCAACGATTAAAGCAGGTCAAAACTACACAGATGC

AAGTCAAAACAAACAAAATGACTACAACAATGCAGTCACTGCAGCAAAAGCAATCATTGGTCAAACAACTAGTCCATCAA

TGATTGCGCAAGAAATTAATCAAGCGAAAGACCAAGTGACAGCTAAACAACAAGCGTTAAACGGTCAAGAAAACTTAAGA

ACTGCGCAAACAAATGCGAAGCAACATTTGAATGGCTTAAGTGACTTAACTAATGCACAAAAAGATGCAGCGAAACGCCA

AATCGAAGGTGCAACGCATGTTAATGAAGTAACACAAGCGCAAAATAATGCGGACGCATTAAATACAGCTATGACGAACT

TGAAAAATGGTATTCAAGATCAAAATACGATTAAGCAAGGTGTTAACTTCACTGATGCAGATGAAGCGAAACGTAATGCA

TATACAAATGCAGTGACGCAAGCTGAACAAATTTTAAATAAAGCACAAGGTCCAAATACTGCAAAAGACGGTGTCGAAAC

TGCGTTACAAAATGTACAACGTGCTAAAAACGAATTGAACGGTAATCAAAATGTTGCGAACGCTAAGACAACTGCGAAAA

ATGCATTGAATAACCTTACATCAATTAATAATGCACAAAAAGCAGCATTGAAATCACAAATTGAAGGTGCGACAACAGTT

GCAGGTGTAAATCAAGTGTCTACAATGGCATCTGAATTAAATACTGCAATGAGCAACTTACAACGTGGTATTAATGACGA

AGCAGCTACAAAAGCAGCTCAGAAATATACTGAAGCAGATAGAGATAAACAAACTGCATACAATGATGCTGTAACAGCAG

CTAAAACGTTATTAGATAAAACAGCTGGTTCAAATGACAATAAAGTAGCCGTTGAACAAGCATTACAACGTGTGAATACT

GCTAAAACAGCATTAAATGGTGACGCGCGATTAAATGAAGCGAAGAACACAGCTAAACAACAATTAGCGACAATGTCACA

TTTAACTAATGCTCAAAAAGCAAACTTAACAGAACAAATTGAACGTGGTACAACTGTTGCTGGTGTTCAAGGCATCCAAG

CAAATGCTGGTACTTTAAATCAAGCAATGAATCAATTAAGACAAAGTATTGCTTCTAAAGATGCGACTAAATCAAGCGAA

GATTATCAAGACGCGAATGCAGATTTACAAAATGCATACAATGATGCGGTAACTAATGCTGAAGGTATTATTAGTGCAACGAATAACCCTGAAATGAATCCTGATACAATTAACCAAAAAGCGAGCCAAGTGAACAGTGCGAAGTCTGCATTGAACGGTG

ATGAAAAATTAGCAGCAGTAAAACAAACTGCGAAATCAGATATCGGTCGTTTGACAGACTTGAACAATGCACAACGAACT

GCGGCAAATGCTGAAGTGGATCAAGCACCAAATCTTGCAGCTGTCACAGCGGCTAAAAATAAAGCAACATCGTTAAACAC

AGCGATGGGTAATTTGAAACATGCACTTGCTGAAAAGGATAATACGAAACGTAGTGTCAATTACACAGATGCGGATCAAC

CAAAACAACAAGCGTATGATACTGCAGTTACACAAGCAGAAGCAATTACTAATGCAAATGGCAGTAACGCGAATGAAACA

CAAGTTCAAGCAGCGCTTAACCAATTGAATCAAGCTAAAAACGACTTGAATGGTGATAATAAAGTTGCTCAAGCGAAAGA

AACAGCAAAACGTGCATTAGCTTCATATAGTAACTTGAATAACGCGCAATCAACTGCAGCAACTAGTCAAATTGACAATG

CAACGACAGTAGCAGACGTAACTGCTGCACAAAATACTGCTAATGAATTAAATACAGCAATGGGTCAACTTCAAAATGGT

ATTAATGACCAAAACACTGTTAAACAACAAGTGAACTTTACAGATGCTGACCAAGGTAAGAAAGATGCTTACACAAATGC

TGTTACGAATGCTCAAGGTATTTTAGATAAAGCAAACGGTCAAAATATGACAAAAGCACAAGTTGAAGCTGCATTAAATC

AAGTAACGACTGCTAAGAATGCTTTAAACGGTGATGCAAATGTAAGACAAGCAAAATCAGATGCGAAAGCAAACTTAGGT

ACATTAACACACTTAAATAATGCACAAAAACAAGATTTAACATCACAAATCGAAGGTGCAACAACAGTCAACGGTGTAAA

TAGTGTTAAAACGAAAGCACAAGACTTAGATGGTGCAATGCAACGATTAGAGTCAGCAATCGCAAATAAAGATCAAACTA

AAGCGAGCGAAAACTACATTGACGCAGATCCAACTAAGAAAACAGCATTTGATAATGCCATCACACAAGCTGAATCTTAC

TTAAATAAAGATCATGGTACGAATAAAGATAAGCAAGCTGTTGAACAAGCAATTCAAAGTGTAACGTCTACTGAAAATGC

TTTGAACGGTGACGCGAACTTACAATGCGCTAAAACTGAAGCTACACAAGCTATCGATAACTTGACACAATTGAATACAC

22/68

CGCAAAAAACA.GCATTGAAACAACAAGTGAATGCTGCACAACGCGTATCAGGTGTAACTGATCTGAAAAATAGTGCTACA

TCACTTAATAATGCGATGGATCAATTAAAACAAGCAATTGGTGATCATGACACAATTGTAGCTGGTGGTAATTACACTAA

CGCAAGTCCTGATAAACAAGGTGCTTACACTGATGCATATAATGCTGCGAAGAATATCGTAAATGGTTCACCTAATGTGA

TTACAAATGCAGCAGATGTTACTGCGGCAACACAACGTGTCAATAATGCTGAAACAAGTTTAAATGGTGATACAAACTTA

GCAACTGCGAAGCAACAAGCTAAAGATGCATTACGTCAAATGACACATTTATCTGATGCACAAAAACAAAGTA.TTACTGG

TCAAATTGATAGCGCGACACAAGTAACTGGTGTACAAAGTGTGAAAGACAATGCAACAAATCTTGACAATGCAATGAATC

AACTTCGAAATAGTATTGCGAATAAAGATGAAGTAAAAGCGAGTCAACCATATGTTGATGCAGATACAGATAAACAAAAT

GCATACAATACAGCAGTTACAAGTGCTGAAAATATCATTAATGCAACGAGTCAGCCAACACTTGATCCATCTGCAGTAAC

ACAAGCAGCTAATCAAGTGAACACTAACAAAACTGCGCTTAATGGTGCGCAAAACTTAGCAAATAAAAAGCAAGAAACAA

CTGCTAACATCAACCGATTAAGTCATTTAAACAATGCTCAAAAGCAAGATTTAAATACACAAGTGACAAATGCACCAAAT

ATTAGCACAGTAAATCAAGTGAAAACTAAAGCTGAACAATTAGATCAAGCAATGGAACGTTTAATCAACGGAATCCAAGA

CAAAGATCAAGTGAAACAAAGTGTTAACTTTACAGATGCAGATCCAGAAAAACAAACAGCATACAACAATGCGGTAACTG

CTGCTGAAAATATTATTAATCAAGCAAATGGTACAAATGCGAACCAATCACAAGTTGAAGCAGCACTTTCAACTGTAACA

ACTACTAAACAAGCGTTGAATGGTGATAGAAAAGTAACAGATGCTAAAAACAATGCAAACCAAACATTATCTACGTTAGA

TAACTTAAACAATGCACAAAAAGGTGCTGTTACTGGAAACATCAATCAAGCGCACACTGTAGCTGAAGTAACGCAAGCCA

TTCAAACCGCTCAGGAACTGAATACAGCGATGGGTAACTTGAAAAATAGCTTGAATGATAAAGACACTACACTTGGCAGT

CAAAACTTTGCAGATGCAGATCCAGAGAAGAAAAATGCATACAATGAAGCGGTTCGTAATGCTGAAAATATTTTAAATAA

ATCTACAGGTACGAACGTGCCTAAAGATCAAGTTGAAGCAGCTATGAATCAAGTGAATACTACAAAAGCAGCGCTTAATG

GTACTCAAAACCTTGAAAAAGCGAAACAACACGCAAATACAGCAATTGACGGTTTAAGCCATTTAACAAATGCACAAAAA

GAGGCATTAAAACAATTGGTACAACAATCGACTACTGTTGCAGAAGCACAAGGTAATGAACAAAAAGCAAACAATGTTGA

TGCAGCAATGGACAAATTACGTCAAAGTATTGCAGATAATGCGACAACAAAACAAAACCAAAATTATACTGATGCAAGTC

CGAATAAAAAGGATGCGTACAATAATGCTGTCACAACTGCACAAGGTATTATTGATCAAACTACAAACCCTTCATTAGAT

CCGACTGTTATCAATCAAGCTGCTGGACAAGTAAGCACGTCTAAAAATGCTTTAAATGGTAATGAAAACTTAGAGGCAGC

GAAGCAACAAGCAACGCAATCTTTAGGTTCATTAGACAACTTAAATAATGCGCAAAAACAAGCTGTTACTAATCAAATTA

ATGGCGCGCATACTGTTGATGAAGCAAATCAAATTAAGCAAAATGCGCAAAACTTAAATACTGCGATGGGTAACTTGAAA

CAAGCGATAGCTGATAAAGATGCTACGAAAGCAACAGTTAACTTCACTGATGCAGATCAAGCAAAACAACAAGCATATAA

CACTGCAGTTACAAATGCTGAAAATATCATTTCAAAAGCTAATGGTGGTAATGCAACACAAACTGAAGTTGAACAAGCAA

TCCAACAAGTAAATGCAGCAAAACAAGCATTAAATGGTAATGCCAACGTTCAACATGCAAAAGACGAAGCAACAGCATTA

ATTAATAACTCTAATGATCTTAACCAAGCACAGAAAGATGCATTAAAACAACAAGTACAAAATGCAACTACTGTAGCTGG

TGTAAACAATGTTAAACAAACGGCGCAAGAGTTAAACAATGCGATGACACAATTAAAACAAGGCATTGCAGATAAAGAAC

AAACAAAAGCTGATGGTAACTTTGTCAATGCAGATTCTGACAAGCAAAATGCATATAATCAAGCAGTAGCGAAAGCTGAA

GCATTAATTAGTGGTACGCCTGATGTTGTCGTTACACCTAGCGAAATTACTGCAGCGTTAAATAAAGTTACGCAAGCTAA

AAATGATTTAAATGGTAATACAAACTTAGCAACGGCGAAACAAAATGTTCAACATGCTATTGATCAATTGCCAAACTTAA

ACCAAGCGCAACGTGATGAATACAGCAAACAAATCACGCAAGCAACACTTGTACCAAACGTCAATGCTATTCAACAAGCG

GCAACAACGCTTAATGACGCGATGACACAATTGAAACAAGGTATTGCGAATAAAGCACAAATTAAAGGTAGCGAGAACTA

TCACGATGCTGATACTGACAAGCAAACAGCATATGATAATGCAGTAACAAAAGCAGAAGAATTGTTAAAACAAACAACAA

ATCCAACAATGGATCCAAATACAATTCAACAAGCATTAACTAAAGTGAATGACACAAATCAAGCACTTAACGGTAATCAA

AAATTAGCTGATGCCAAACAAGATGCTAAGACAACACTTGGTACACTAGATCATTTAAATGATGCTCAAAAACAAGCGCT

AACAACTCAAGTTGAACAAGCACCAGATATTGCAACAGTTAATAATGTTAAGCAAAATGCTCAAAATCTGAATAATGCTA

TGACTAACTTAAACAATGCATTACAAGATAAAACTGAGACATTAAATAGCATTAACTTTACTGATGCAGATCAAGCTAAG

AAAGATGATTATACTAATGCGGTTTCACATGCAGAAGGTATTTTATCTAAAGCAAATGGCAGCAATGCAAGTCAAACTGA

AGTGGAACAAGCGATGCAACGTGTGAACGAAGCGAAACAAGCATTGAATGGTAATGACAATGTACAACGTGCAAAAGATG

CAGCGAAACAAGTAATTACAAATGCAAATGATTTAAATCAAGCGCAAAAAGATGCATTAAAACAACAAGTCGATGCTGCG

CAAACTGTTGCAAATGTAAACACGATTAAGCAAACAGCACAAGATTTAAATCAAGCAATGACACAATTGAAACAAGGTAT

TGCAGATAAAGACCAAACTAAAGCAAATGGTAACTTTGTCAATGCTGATACTGATAAGCAAAATGCATATAACAATGCGG

TAGCGCATGCTGAACAAATCATTAGTGGTACACCAAATGCAAACGTGGATCCACAACAAGTGGCTCAAGCGTTACAACAA

GTGAATCAAGCTAAGGGTGATTTAAACGGTAACCACAACTTACAAGTTGCTAAAGACAATGCAAATACAGCCATTGATCA

GTTACCAAACTTAAATCAACCACAAAAAACAGCATTAAAAGACCAAGTGTCGCATGCAGAACTTGTTACAGGTGTTAATG

CTATTAAGCAAPATGCTGATGCGTTAAATAATGCAATGGGTACGTTGAAACAACAAATTCAAGCGAATAGTCAAGTACCA

CAATCAGTTGACTTTACACAAGCGGATCAAGACAAACAACAAGCTTATAACAATGCAGCTAACCAAGCGCAACAAATCGC

AAATGGCACACCAACACCTGTATTGGCGCCTGATACAGTAACAAAAGCAGTTACAACTATGAATCAAGCGAAAGATGCAT

TAAACGGTGATGAAAAATTAGCGCAAGCGAAACAAGATGCTTTAGCAAATCTTGATACGTTACGTGACTTAAATCAACCA

CAACGTGATGCATTACGAAACCAAATCAATCAAGCACAAGCTTTAGCTACAGTTGAACAAACTAAACAAAATGCACAAAA

TGTGAATACAGCAATGGGTAACTTGAAACAAGGTATTGCAAATAAAGATACTGTGAAAGCAAGTGAGAACTACCACGATG

CTGATGTCGATAAGCAAACAGCATATACAAATGCAGTGTCTCAAGCGGAAGGTATTATCAATCAAACGACAAATCCAACG

CTTAACCCAGATGACATTACTCGTGCATTAACTCAAGTGACTGATGCTAAAAATAGCTTAAACGGTGAAGCTAAATTAG C

CACTGAAAAGCAAAATGCTAAAGATGCCGTAAGTGGAATGACGCATTTAAACGATGCTCAAAAACAAGCATTAAAAGGTC

AAATCGATCAATCGCCTGAAATTGCTACAGTGAACCAAGTTAAACAAACAGCAACGAGCCTAGATCAAGCAATGGATCAA

TTATCACAAGCTATTAATGATAAAGATCAAATATTAGCGGACGGTAATTACTTAAATGCAGATCCTGACAAACAAAATGC

GTATAAACAGGCAGTAGCAAAAGCTGAAGCATTATTGAATAAACAAAGTGGTACTAATGAAGTACAAGCACAAGTTGAAA

GCATCACTAATGAAGTGAACGCAGCGAAACAAGCATTAAATGGTAATGACAATTTGGCAAATGCAAAACAACAAGCAAAA

23/68

CAACAATTGGCGAACTTAACACACTTAAATGATGCACAAAAACAATCATTTGAAAGTCAAATTACACAAGCGCCACTTGT

TACAGATGTCACTACGATTAATCAAAAAGCACAAACGTTAGATCATGCGATGGAATTATTAAGAAATAGTGTTGCGGATA

ATCAAACGACATTAGCGTCTGAAGATTATCATGATGCAACTGCGCAAAGACAAAATGACTATAACAAAGCTGTAACAGCT

GCTAATAATATCATTAATCAAACTACATCGCCTACGATGAATCCAGATGATGTTAATGGTGCAACGACACAAGTGAATAA

TACGAAAGTTGCATTAGATGGTGATGAAAACCTTGCAGCAGCTAA.ACAACAAGCAAACAACAGACTTGATCAATTAGATCATTTGAATAATGCGCAAAAGCAACAGTTACAATCACAAATTACGCAATCATCTGATATTGCTGCAGTTAATGGTCACAAA

CAAACAGCAGAATCTTTAAATACTGCGATGGGTAACTTAATTAATGCGATTGCAGATCATCAAGCCGTTGAACAACGTGG

TAACTTCATCAATGCTGATACTGATAAACAAACTGCTTATAATACAGCGGTAAATGAAGCAGCAGCAATGATTAACAAAC

AAACTGGTCAAAATGCGAACCAAACAGAAGTAGAACAAGCTATTACTAAAGTTCAAACAACACTTCAAGCGTTAAATGGA

GATCATAATTTACAAGTTGCTAAAACAAATGCGACGCAAGCAATTGATGTTTTAACAAGCTTAAATGATCCTCAAAAAAC

AGCATTAAAAGACCAAGTTACAGCTGCAACTTTAGTAACTGCAGTTCATCAAATTGAACAAAATGCGAATACGCTTAACC

AAGCAATGCATGGTTTAAGACAGAGCATTCAAGATAACGCAGCAACTAAAGCAAATAGCAAATATATCAACGAAGATCAA

CCAGAGCAACAAAACTATGATCAAGCTGTTCAAGCCGCAAATAATATTATCAATGAACAAACTGCAACATTAGATAATAA

TGCGATTAATCAAGTAGCGGCAACTGTGAATACAACGAAAGCAGCATTACATGGTGATGTGAAATTACAAAATGATAAAG

ATCATGCTAAACAAACGGTTAGCCAATTAGCACATCTAAACAATGCACAAAAACATATGGAAGATACGTTAATTGATAGT

GAAACAACTAGAACAGCAGTTAAGCAAGATTTGACTGAAGTACAAGCATTAGATCAACTTATGGATGCATTACAACAAAG

TATTGCTGACAAAGATGCAACACGTGCGAGCAGTGCATATGTCAATGCAGAACCGAATAAAAAACAAGCCTATGATGAAG

CAGTTCAAAATGCTGAGTCTATCATTGCAGGATTAAATAATCCAACTATCAATAAAGGTAATGTATC.AAGTGCGACTCAA

GCAGTAATATCATCTAAAAATGCATTAGATGGTGTTGAACGATTAGCTCAAGATAAGCAAACTGCTGGAAATTCTCTAAA

TCATTTAGATCAATTAACACCAGCTCAACAACAAGCGCTAGAAAATCAAATTAATAATGCAACAACTTGTGATAAAGTGG

CTGAAATCATTGCACAAGCGCAAGCATTAAATGAAGCGATGAAAGCATTAAAAGAAAGTATTAAGGATCAACCACAAACT

GAAGCAAGTAGTAAATTTATTAACGAGGATCAAGCGCAAAAAGATGCATATACGCAAGCAGTACAACACGCGAAAGATTT

GATTAACAAAACAACTGATCCTACATTAGCTAAATCAATCATTGATCAAGCGACACAGGCAGTGACTGATGCTAAAAACA

ATTTACATGGTGATCAAAAACTAGCTCAAGATAAGCAACGTGCAACAGAAACGTTAAATAACTTGTCTAACTTGAATACA

CCACAACGTCAAGCACTTGAAAATCAAATCAATAATGCAGCAACTCGTGGTGAAGTAGCACAAAAATTAACTGAAGCACA

AGCACTTAACCAAGCAATGGAAGCTTTACGTAATAGCATTCAAGATCAACAACAAACAGAATCTGGTAGCAAGTTTATTA

ATGAAGATAAACCGCAAAAAGATGCTTACCAAGCAGCAGTTCAAAATGCAAAAGATTTAATTAACCAAACAGGTAATCCA

ACGCTTGATAAAGCACAAGTTGAACAATTGACACATGCTTTTAAACAAGCTAAAGATAACCTACACGGTGATCAAAAACT

TGCAGACGATAAACAACATGCGGTTACTGATTTAAATCAATTAAATGGTTTGAATAATCCGCAACC-TCAAGCACTTGAAA

GCCAAATAAACAACGCAGCAACTCGTGGCGAAGTAGCGCAAAAATTAGCTGAAGCAAAAGCGCTTGATCAAGCAATGCAA

GCATTACGAAATAGTATTCAAGATCAACAACAAACGGAAGCGGGTAGCAAGTTTATCAATGAAGATAAACCGCAAAAAGA

TGCTTACCAAGCAGCAGTTCAAAATGCAAAAGATTTAATTAACCAAACAGGTAATCCAACACTCGACAAATCACAAGTAG

AACAATTAACACAAGCAGTAACAACTGCAAAAGATAATCTACATGGTGATCAAAAACTTGCTCGTGATCAACAACAAGCA

GTAACAACTGTAAATGCATTGCCAAACTTAAATCATGCACAACAACAAACATTAACTGATGCTATAAATGCAGCGCCTAC

AAGAACAGAGGTTGCACAACATGTTCAAACTGCTACTGAACTTGATCACGCGATGGAAACATTGAAAAATAAAGTTGATC

AAGTGAATACAGATAAGGCTCAACCAAATTACACTGAAGCGTCAACTGATAAAAAAGAAGCAGTAGATCAAGCGTTACAA

GCTGCACAAAGCATTACAGATCCAACTAATGGTTCAAATGCGAATAAAGACGCTGTAGAACAAGCATTAACTAAGCTTCA

AGAAAAAGTGAATGAGTTAAATGGTAATGAGAGAGTCGCTGAAGCTAAAACACAAGCGAAACAAACTATTGACCAATTAA

CACATTTAAATGCTGATCAAATTGCAACTGCTAAACAAAATATTGATCAAGCGACGAAACTTCAACCAATCGCTGAATTA

GTAGATCAAGCAACGCAATTGAACCAATCAATGGATCAATTACAACAAGCAGTTAATGAACATGCTAACGTTGAGCAAAC

TATAGATTACACACAAGCAGATTCAGATAAGCAAAAGGCTTATAAACAAGCGATTGCTGATGCTGAAAATGTATTGAAAC

AAAATGCGAATAAGCAACAAGTGGATCAAGCACTTCAAAATATTTTAAATGCAAAACAAGCATTAAATGGTGATGAACGT

GTAGCACTTGCTAAAACAAATGGTAAACATGACATCGACCAATTGAATGCATTAAACAATGCTCAACAAGATGGATTTAA

AGGTCGCATCGATCAATCAAACGATTTAAATCAAATCCAACAAATTGTAGATGAGGCTAAGGCACTTAATCGTGCAATGG

ATCAATTGTCACAAGAAATCACTGGCAATGAAGGACGCACGAAAGGTAGCACGAACTATGTCAATGCAGATACACAAGTC

AAACAAGTATATGATGAAGCGGTTGATAAAGCGAAACAAGCACTTGATAAATCGTCTGGGCAAAACTTAACTGCAGAACA

AGTTATCAAATTAAATGATGCAGTCACTGCAGCTAAGAAAGCATTAAATGGTGAAGAAAGACTTAATAATCGTAAAGCTG

AAGCATTACAAAGATTGGATCAATTAACACATCTAAACAATGCTCAAAGACAATTAGCAATCCAACAAATTAATAATGCT

GAAACGCTAAATAAAGCATCTCGAGCAATTAATAGAGCAACTAAATTAGATAATGCAATGGGTGCAGTACAACAATATAT

TGACGAACAGCACCTTGGTGTTATCAGCAGCACAAATTACATCAATGCAGATGACAATTTGAAAGCAAATTATGATAATG

CAATTGCGAATGCAGCACATGAGTTAGATAAAGTGCAAGGTAATGCAATTGCAAAAGCTGAAGCAGAGCAATTGAAACAA

AATATTATCGATGCTCAAAATGCATTAAATGGAGACCAAAACCTTGCAAATGCCAAAGATAAAGCAAATGCGTTTGTTAA

TTCGTTAAATGGATTAAATCAACAGCAACAAGATCTTGCACATAAAGCAATTAACAATGCCGATACTGTATCAGATGTAA

CAGATATTGTTAATAATCAAATTGACTTAAATGATGCAATGGAAACATTGAAACATTTAGTTGACAATGAAATTCCAAAT

GCAGAGCAAACTGTCAATTACCAAAACGCTGACGATAATGCTAAAACAAACTTCGATGATGCCAAACGTCTAGCAAATAC

ATTGCTAAATAGTGATAACACAAATGTGAATGATATCAATGGCGCAATCCAAGCAGTCAATGATGCAATCCATAATCTTA

ATGGTGATCAACGACTACAAGATGCTAAAGACAAGGCAATTCAATCAATTAATCAAGCTTTAGCTAATAAGCTAAAAGAA

ATCGAAGCTTCAAATGCGACGGATCAAGACAAGCTTATTGCGAAAAATAAAGCAGAAGAATTGGCAAACAGCATCATCAA

CAACATTAATAAAGCAACAAGTAATCAGGCTGTATCTCAAGTTCAAACAGCAGGCAACCACGCGATTGAACAAGTGCATG

CTAATGAAATACCAAAAGCAAAAATTGATGCCAATAAAGACGTTGATAAGCAAGTTCAAGCATTAATTGACGAAATTGAT

CGAAATCCAAATCTAACAGATAAGGAAAAACAAGCACTTAAAGATCGTATTAATCAAATACTTCAACAAGGTCATAACGA

24/68

CATTAACAATGCGCTGACTAAAGAAGAAATTGAACAAGC TAAAGCACAACTTGCGCAAGCATTACAAGACATCAAAGATT

TAGTGAAAGCTAAAGAAGATGCGAAACAAGATGTTGATAAACAAGTTCAAGCATTAATTGACGAAATCGATCAAAATC CA

AATCTAACAGATAAGGAAAAACAAGCACTTAAAGATCGTATTAATCAAATACTTCAACAAGGTCATAACGGCATTAACAA

TGCGATGACTAAAGAAGAAATTGAACAAGCCAAAGCACAACTTGCACAAGCATTAAAAGAAATTAAAGATTTAGTGAAAG

CTAAAGAAAATGCGAAACAAGATGTTGATAAACAAGTTCAAGCATTAATTGACGAAATCGATCAAAATCCAAATCTAACA

GATAAGGAAAAACAAGCGCTTAAAGATCGAATCAATCAAATACTGCAACAAGGTCATAACGACATTAACAATGCGATGAC

TAAAGAAGAAATTGAACAAGCCAAAGCACAACTTGCACAAGCATTACAAGACATCAAAGATTTAGTGAAAGCTAAAGAAG

ATGCGAAAAATGCAATAAAAGCCTTAGCTAATGCGAAGCGTGATCAAATCAATTCAAATCCAGATTTAACACCTGAGCAA

AAAGCAAAAGCGCTCAAAGAAATTGACGAAGCTGAAAAACGAGCACTACAAAACGTTGAGAATGCTCAAAC TATAGATCA

ATTAAATCGAGGATTAAACTTAGGTTTAGATGACATTAGAAATACACATGTATGGGAGGTTGATGAACAACCTGCTGTAA

ATGAAATTTTTGAAGCAACACCTGAGCAAATCCTAGTTAATGGTGAACTCATTGTACATCGTGATGACATCATTACAGAA

CAAGATATTCTTGCACACATAAACTTAATTGATCAGCTTTCAGCAGAAGTTATTGATACACCATCAACTGCAACGATTTC

TGATAGCTTAACAGCAAAAGTTGAAGTTACATTGCTTGATGGATCAAAAGTGATTGTTAATGTTCCTGTAAAAGTTGTAG

AAAAAGAATTGTCAGTAGTCAAACAACAGGCAATTGAATCAATCGAAAATGCGGCACAACAAAAGATTGATGAAATCAAT

AATAGTGTGACATTAACACTGGAACAAAAAGAAGCTGCAATTGCAGAAGTTAATAAGCTTAAACAACAAGCAATTGATCA

TGTTAACAATGCACCTGATGTTCATTCAGTTGAAGAAATTCAACAACAAGAACAAGCGTATATTGAACAATTTAATCCAG

AACAATTTACGATTGAACAAGCAAAATCAAATGCAATTAAATCGATTGAAGATGCAATTCAACATATGATTGATGAAATC

AAAGCTCGTACTGATCTAACAGATAAAGAGAAGCAAGAAGC TATTGCTAAGTTAAATCAATTAAAAGAACAAGCAATTCA

AGCGATTCAACGTGCGCAAAGCATCAGTGAAATAACTGAGCAATTGGAACAATTTAAAGCTCAAATGAAAGCAGCTAATC

CAACAGCAAAAGAACTAGCTAAACGCAAGCAAGAAGCTATTAGTAGAATTAAAGACTTTTCAAATGAAAAAATAAATAGT

ATTCGAAATAGTGAAATTGGCACAGCTGATGAAAAACAAGCAGCAATGAATCAAATTAACGAAATTGTGCTTGAAACAAT

TAGAGATATTAATAATGCGCATACATTACAGCAAGTTGAGGCTGCAT TGAACAATGGTATTGCTCGAATTTCAGCAGTAC

AAATTGTAATATCTGATCGTGCTAAACAATCGTCAAGTACTGGAAATGAATCTAATAGCCATTTAACAATTGGTTATGGA

ACTGCAAATCATCCATTTAACAGTTCGACTATTGGACATAAAAAGAAACTTGATGAAGATGATGACATTGATCCAC TTCA

TATGCGTCACTTTAGTAATAATTTCGGTAATGTTATTAAAAACGCTATTGGTGTGGTGGGTATCTC TGGCTTACTAGCTA

GTTTCTGGTT CTTCATTGCCAAACGTCGTCGTAAAGAAGATGAAGAGGAAGAATTAGAAATAAGAGATAATAATAAAGAT

TCAATAAAAGAGACTTTAGACGATACAAAACATTTACCACTTTTATTTGCGAAACGTCGCAGAAAAGAAGATGAAGAAGA

TGTTACTGTTGAAGAAAAAGATTCGCTAAATAATGGCGAGTCACTCGATAAAGTTAAACATACGCCGTTCTTCTTACCAA

AACGTCGTCGTAAAGAAGATGAAGAAGATGTGGAAGTTACAAATGAAAACACAGATGAAAAAGTGTTGAAAGATAACGAA

CATTCACCACTCTTATTCGCAAAACGACGCAAAGATAAAGAGGAAGATGTTGAAACAACAACTAGTATTGAATCTAAAGA

TGAGGACGTTCCTTTATTATTGGCTAAAAAGAAAAATCAAAAAGATAACCAATCCAAAGACAAAAAGTCAGCATCAAAAA

ATACTTCTAAAAAGGTAGCAGCTAAAAAGAAGAAAAAGAAATCTAAGAAAAATAAAAAA

SEQ ID NO:47 seqüência de polinucleotídeoTTGAATAATCGTGATAAATTACAAAAATTTAGTATTCGAAAATACGCAATTGGAACATTTTCTACTGTGATTGCAACACT

TGTGTTCATGGGTATCAATACAAACCATGCAAGTGCCGACGAGTTGAA TCAAAATCAAAAGTTAATTAAACAATTAAATC

AAACAGATGATGATGATTCGAATACGCATAGTCAAGAAATCGAAAATAACAAACAAAATTCTAGTGGGCAGACTGAATCA

TTACGTTCATCAACTAGTCAAAATCAAGCAAATGCACGACTGTCGGATCAATTCAAAGACACTAATGAAACATCGCAACA

ATTACCTACAAATGTTTCGGATGATAGTATCAATCAATCGCATAGTGAAGCAAATATGAATAACGAACCATTGAAAGTTG

ATAATAGTACTATGCAAGCACATAGTAAAATAGTAAGCGATAGCGATGGGAATGCTTCTGAAAATAAACATCATAAACTA

ACAGAAAATGTACTTGCAGAAAGCCGAGCAAGTAAAAATGACAAAGAGAAAGAGAATCTACAAGAGAAAGATAAATCGCA

GCAAGTACATCCACCATTAGATAAAAATGCATTACAAGCTTTTTTTGACGCATCATATCACAATTACAGAATGATTGATA

GAGATCGTGCGGATGCAACAGAATATCAAAAAGTCAAATCTACT TTTGACTACGTCAATGACTTACTAGGTAATAATCAA

AATATTCCTTCAGAACAGCTTGTTTCGGCATATCAACAATTAGAGAAAGCATTAGAACTTGCACGTACGTTACCACAACA

ATCTACTACAGAAAAACGTGGTAGAAGAAGTACGAGAAGTGTTGTTGAGAAT CGTTCATCAAGAAGCGATTACTTAGATG

CTAGAACTGAATATTATGTTTCAAAAGACGATGATGATTCTGGTTTCCCTCCTGGTACTTTCTTCCATGCTTCAAATAGA

AGATGGCCTTATAATTTACCAAGATCTAGGAACATCTTACGTGCTTCTGATGTACAAGGTAATGCTTATATCACTACAAA

ACGACTTAAAGATGGATATCAATGGGATATTTTATTTAATAGTAATCATAAAGGGCATGAATATATGTACTATTGGTTTG

GACTTCCAAGTGATCAAACACCAACTGGTCCAGTAACTTTCACTATTATCAACCGTGATGGTTCAAGTACATCTACTGGT

GGCGTTGGATTTGGATCAGGTGCACCACTACCTCAATTTTGGAGATCAG CAGGTGCTATTAATTCTAGCGTAGCGAATGA

TTTTAAACATGGCTCCGCTACAAATTATGCATTTTATGATGGTGTTAATAATTTTTCTGACTTTGCTAGAGGGGGAGAAT

TATACTTCGACAGAGAAGGCGCTACACAAACTAATAAATATTATGGCGATGAAAACTTCGCATTGCTAAATAGTGAGAAA

CCAGATCAAATAAGAGGATTAGATACAATATATAGTTTTAAAGG TAGTGGTGATGTAAGTTATCGTATTTCATTTAAAAC

TCAAGGAGCTCCAACTGCAAGATTGTATTATGCTGCTGGCGCGCGTTCTGGTGAATATAAACAAGCAACGAACTATAACC

AACTCTATGTCGAACCTTATAAGAATTATCGAAATCGAGTACAGTCAAATGTCCAAGTTAAAAATCGTACACTTCATTTA

AAAAGAACAATCAGACAATTCGATCCTACATTACAGAGAACTACTGATGTTCCTATTTTGGATAGTGACGGTTCCGGAAG

TATTGATTCGGTATACGACCCATTAAGTTATGTAAAGAATGTGACTGGTACAGTCCTAGGTATTTATCCATCTTATCTTC

CTTATAATCAGGAAAGATGGCAGGGAGCTAATGCAATGAATGCCTATCAAATTGAAGAACTTTTTTCACAAGAAAATCTT

CAAAATGCAGCACGTTCAGGCCGTCCAATTCAATTTCTTGTAGGTTTTGATGTTGAAGATAGCCATCATAACCCTGAAAC

TCTTTTACCAGTAAATTTATATGTAAAACCTGAGTTAAAACATACAATTGAGTTATATCACGATAATGAAAAACAAGATA

GAAAGGAATTTTCAGTATCGAAA

25/68

SEQ ID NO:48 seqüência de polinucleotídeoATGAGTGGAACGCTTCATAACACTGTAGGATCAGGAATATTACCTTATCAACAAGAGATACGTATCAAACTTACTAGTAA

TGAACCAATTAAAGATAGTGAATGGTCTATTACAGGATATCCTAACACGCTTACATTACAAAACGCTGTGGGTAGAACAA

ATAATGCTACTGAAAAAAACTTAGCTCTTGTTGGTCATATTGATCCAGGAAATTATTTCATCACTGTTAAGTTTGGTGAT

AAAGTAGAACAATTTGAAATTAGATCAAAACCAACTCCACCAAGAATCATTACAACTGCTAATGAATTACGTGGAAATCC

TAACCATAAGCCTGAAATAAGAGTAACAGATATACCAAATGATACTACTGCTAAAATCAAACTTGTGATGGGCGGAACCG

ATGGCGATCATGATCCAGAAATAAATCCATATACTGTCCCTGAAAACTACACAGTAGTTGCAGAAGCATACCATGATAAT

GATCCAAGTAAAAATGGGGTCTTAACATTCCGTTCATCAGACTACCTTAAAGATCTACCATTAAGCGGTGAATTAAAGGC

AATTGTTTATTACAATCAATATGTACAATCAAACTTTAGTAAAAGCGTTCCGTTTAGTAGCGATACAACACCACCTACAA

TTAATGAACCGGCAGGACTAGTTCATAAGTATTACAGGGGAGATCATGTAGAAATTACTCTTCCAGTCACTGATAATACT

GGCGGTTCAGGTTTAAGAGATGTAAACGTCAATTTACCTCAAGGTTGGACAAAAACCTTTACAATCAATCCTAATAATAA

TACTGAGGGTACGCTTAAGTTAATTGGTAATATACCTAGTAATGAAGCATATAATACGACATATCATTTCAATATTACTG

CAACCGATAATTCTGGAAATACAACAAATCCAGCTAAAACCTTTATTTTAAATGTTGGTAAGTTGGCTGATGATTTAAAT

CCAGTCGGATTATCTAGAGATCAACTACAATTAGTGACAGACCCTTCTTCATTATCTAATTCCGAACGAGAAGAGGTAAA

AAGAAAAATAAGTGAAGCAAATGCTAATATAAGATCATATTTATTACAAAATAACCCAATACTCGCTGGAGTAAACGGCG

ATGTTACATTTTATTATAGAGATGGTTCTGTAGATGTTATTGATGCTGAAAATGTAATCACATATGAGCCCGAAAGAAAA

TCCATTTTCAGTGAAAATGGTAATACAAATAAAAAAGAAGCAGTAATCACTATTGCTAGAGGACAAAACTATACCATTGG

TCCAAACTTAAGAAAATATTTCTCATTAAGTAATGGTTCGGATTTACCTAATAGAGATTTCACCTCTATATCAGCTATTG

GATCTTTACCTTCATCGAGTGAAATTAGTCGACTCAATGTTGGAAATTATAACTATAGAGTTAATGCTAAAAATGCTTAT

CATAAGACTCAACAAGAACTTAATTTAAAACTTAAAATAGTAGAGGTTAATGCACCTACTGGTAATAATCGTGTATATAG

AGTTAGTACTTATAATTTAACTAA'TGATGAAATCAATAAAATCAAACAAGCATTTAAAGCAGCTAATTCTGGACTTAATT

TAAACGATAACGATATCACTGTTTCGAATAACTTTGACCATAGAAATGTTAGTAGTGTGACAGTAACTATACGTAAGGGC

GATTTGATAAAAGAGTTTTCATCAAATCTCAATAATATGAATTTCTTACGTTGGGTTAATATAAGGGATGATTATACCAT

TTCGTGGACTTCTAGTAAGATTCAAGGTAGAAATACAGATGGTGGATTAGAATGGTCACCAGATCATAAATCACTTATTT

ATAAATATGATGCAACATTAGGTAGACAAATAAATACTAATGACGTGTTAACTTTACTTCAAGCAACAGCTAAAAACTCA

AATTTACGTTCAAATATCAATAGTAATGAAAAACAGTTAGCAGAACGAGGGTCTAATGGGTATTCTAAATCTATAATTAG

AGATGATGGCGAGAAATCTTATTTACTTAACTCAAATCCTATTCAAGTATTAGACTTAGTAGAACCAGATAATGGTTACG

GTGGACGTCAAGTCAGTCATTCTAACGTTATATATAATGAAAAAAATTCTTCTATCGTAAATGGTCAAGTTCCAGAAGCT

AATGGGGCATCCGCTTTTAATATTGATAAAGTTGTTAAAGCTAATGCGGCAAATAATGGTATTATGGGTGTTATCTATAA

GGCACAATTATACTTAGCACCATACAGTCCAAAAGGTTACATTGAAAAATTAGGCCAAAATTTAAGCAATACCAATAACG

TGATTAATGTTTATTTTGTGCCTTCTGATAAAGTAAATCCTAGTATAACTGTAGGTAATTACGACCATCATACGGTATAT

TCTGGTGAAACATTTAAAAATACTATCAATGTAAATGATAATTATGGATTAAATACAGTAGCTTCTACAAGTGATAGTGC

AATTACTATGACCAGAAACAACAACGAGTTAGTAGGTCAGGCTCCTAATGTTACTAATAGCATAAATAAAATTGTAAAAG

TTAAAGCCACAGATAAAAGTGGAAATGAAAGTATTGTTTCTTTCACAGTAAATATAAAACCATTAAACGAGAAATATAGA

ATAACAACTTCATCAAGTAATCAAACACCAGTGAGAATTAGTAATATTCAAAACAATGCTAACCTTTCAATTGAAGATCA

AAATAGAGTAAAATCTTCACTCAGCATGACTAAAATTTTAGGTACAAGAAATTATGTCAATGAGTCAAATAATGACGTTC

GTAGTCAAGTTGTAAGTAAAGTAAATAGAAGTGGGAACAATGCTACAGTTAATGTTACAACTACATTTTCTGATGGTACA

ACTAATACAATAACCGTTCCAGTTAAACATGTGTTATTAGAAGTTGTACCTACTACTAGAACAACAGTAAGAGGACAACA

ATTTCCAACCGGCAAAGGAACTTCCCCAAATGATTTCTTTAGTTTAAGAACGGGAGGTCCAGTTGATGCGAGAATAGTTT

GGGTTAATAATCAGGGACCCGATATAAATAGTAATCAAATTGGTAGAGATTTAACATTACACGCTGAAATATTCTTTGAT

GGTGAAACAACACCAATTAGAAAAGATACTACTTACAAACTTAGTCAATCTATTCCAAAGCA.AATATATGAAACAACTAT

CAATGGTCGATTTAATTCATCAGGTGATGCATATCCAGGAAATTTTGTTCAAGCAGTAAATCAATATTGGCCAGAACATA

TGGACTTCAGATGGGCCCAAGGATCAGGCACACCAAGTTCTCGTAATGCAGGTTCATTTACTAAAACAGTTACGGTAGTT

TATCAAAACGGCCAAACTGAAAACGTTAATGTACTATTCAAAGTCAAACCAAATAAACCTGTTATTGATAGTAATAGTGT

GATTTCAAAAGGACAATTAAATGGTCAACAAATTTTAGTTCGAAATGTTCCACAAAATGCACAAGTCACTCTATATCAAT

CAAATGGAACTGTTATTCCTAATACAAATACAACTATAGATTCTAATGGTATAGCTACTGTAACAATTCAAGGCACTCTA

CCAACCGGAAATATTACTGCTAAAACCTCAATGACAAATAATGTAACGTACACTAAACAAAATAGTAGTGGAATTGCTTC

AAATACAACTGAAGATATAAGTGTTTTTTCAGAAAACAGTGATCAAGTAAATGTTACCGCTGGCATGCAAGCTAAAAATG

ATGGTATTAAAATAATTAAAGGTACAAACTATAATTTTAATGACTTCAATAGTTTCATAAGTAATATACCAGCCCATTCT

ACTCTTACATGGAACGAGGAGCCTAATAGTTGGAAAAACAACATCGGTACTACAACAAAAACTGTTACAGTTACTCTACC

TAATCATCAAGGTACGAGAACTGTAGATATTCCAATAACAATCTATCCAACAGTTACAGCTAAGAATCCAGTAAGAGATC

AAAAAGGACGAAACTTAACCAATGGTACTGACGTTTATAATTATATTATTTTTGAAAATAATAACCGTCTTGGAGGAACA

GCTTCTTGGAAAG.ACAATCGTCAACCTGATAAAAACATAGCCGGTGTACAAAA'TTTAATTGCACTTGTTAATTATCCTGG

CATATCTACACCATTAGAAGTTCCTGTTAAAGTGTGGGTATATAATTTTGATTTCACTCAACCTATCTACAAAA'TTCAAG

TAGGAGATACATTCCCTAAAGGAACATGGGCAGGCTATTACAAACATCTTGAAAATGGAGAGGGATTACCAATAGATGGT

TGGAAATTTTATTGGAACCAGCAAAGTACAGGAACTACTAGTGATCAATGGCAATCATTAGCATATACTAGAACTCCTTT

TGTTAAAACTGGTACTTATGATGTCGTTAATCCTAGCAACTGGGGTGTTTGGCAAACATCACAATCAGCTAAATTTATAGTTACAAATGCTAAACCTAATCAACCAACCATAACTCAGTCTAAAACTGGTGATGTAACAGTAACACCTGGTGCTGTGCGT

AATATACTAATAAGTGGGACAAATGATTATATCCAAGCATCTGCAGATAAGATTGTTATTAATAAAAATGGAAATAAATT

AACTACATTTGTTAAAAATAATGATGGTCGTTGGACTGTTGAAACTGGGTCACCTGACATAAATGGTATCGGACCAACAA

26/68

ATAACGGAACTGCTATATCTTTAAGTCGATTAGCAGTTAGACCTGGGGATTCAATAGAAGCAATAGCGACTGAAGGTTCC

GGAGAAACTATAAGTACTTCAGCAACTAGTGAAATTTATATTGTCAAAGCTCCACAACCTGAACAAGTAGCAACTCATAC

TTATGATAATGGAACATTCGATATATTACCTGACAATTCACGTAATTCTTTAAATCCAACTGAACGTGTCGAAATTAATT

ACACTGAAAAATTAAATGGCAATGAAACACAAAAATCATTCACTATTACTAAAAATAACAACGGCAAATGGACGATAAAT

AATAAACCAAATTATGTCGAGTTCAATCAGGATAATGGTAAAGTTGTATTTTCGGCCAATACAATTAAACCTAATTCTCA

AATTACAATAACTCCTAAAGCAGGTCAGGGTAACACTGAAAACACAAATCCTACTGTAATTCAAGCACCTGCGCAACATA

CT'TTAACAATCAATGAAATTGTTAAAGAACAGGGTCAAAATGTGACTAATGATGATATTAATAATGCGGTTCAAGTGCCA

AATAAAAATAGAGTTGCGATTAAACAAGGAAACGCTCTTCCAACAAATTTAGCTGGTGGTAGTACATCACATATTCCAGT

AGTTATTTATTACAGTGATGGAAGTTCTGAAGAAGCTACTGAGACTGTTAGAACTAAAGTTAATAAAACCGAATTAATCA

ATGCTCGTCGTCGACTAGATGAAGAAATTAGTAAAGAGAACAAAACACCATCAAGTATCAGAAACTTTGATCAAGCTATG

AATCGTGCTCAATCACAAATTAATACAGCTAAAAGTGATGCTGACCAAGTTATAGGCACAGAATTTGCAACACCTCAACA

AGTAAATTCAGCTTTATCTAAAGTTCAAGCGGCACAAAATAAAATAAATGAAGCTAAAGCATTATTACAAAACAAGGCTG

ATAATAGTCAACTTGTGAGAGCAAAAGAACAATTACAACAATCGATTCAACCAGCCGCTTCAACTGATGGTATGACTCAA

GATAGCACAAGGAACTACAACAATAAACGCCAAGCAGCTGAACAAGCAATACAACATGCAAATAGCGTTATAAATAATGG

AGATGCAACATCCCAACAAATTAATGATGCTAAAAACACAGTTGAACAGGCACAGAGAGATTATGTTGAAGCTAAAAGCA

ACTTACGTGCTGATAAGTCACAGTTACAAAGCGCTTATGATACGTTAAATAGAGATGTTTTAACAAATGATAAAAAGCCA

GCATCTGTAAGACGCTATAATGAAGCCATTTCAAATATTAGAAAAGAATTAGATACAGCTAAAGCGGATGCAAGTAGTAC

TTTGCGAAACACCAATCCTTCCGTTGAACAAGTTAGAGACGCTTTAAATAAAATAAATACTGTTCAACCTAAAGTGAATC

AAGCAATTGCTTTACTTCAACCAAAAGAAAATAATTCAGAACTTGTACAAGCTAAAAAACGTTTACAAGACGCTGTAAAT

GACATACCTCAAACACAAGGTATGACACAACAAACAATTAATAATTATAATGACAAACAACGTGAAGCTGAAAGAGCACT

TACATCTGCACAAAGAGTGATTGATAATGGGGATGCTACAACTCAAGAAATTACTTCTGAAAAATCTAAAGTAGAGCAAG

CAATGCAAGCTTTAACTAATGCTAAAAGTAATCTGAGAGCTGATAAGAATGAGTTACAGACTGCATATAACAAATTAATT

GAGAACGTATCTACCAATGGTAAAAAACCGGCGAGTATACGTCAATACGAAACAGCCAAAGCCAGAATACAAAATCAAAT

TAATGATGCTAAAAATGAAGCGGAGCGAATTTTAGGTAATGATAATCCACAAGTATCACAAGTAACTCAAGCATTGAACA

AAATCAAAGCTATTCAACCAAAATTAACAGAAGCTATCAACATGCTTCAAAACAAAGAAAATAATACAGAATTAGTCAAT

GCTAAAAACAGACTTGAAAATGCAGTAAATGATACAGATCCAACACACGGTATGACTCAAGAAACAATTAATAATTACAA

CGCTAAAAAGCGAGAAGCTCAAAATGAAATACAAAAAGCGAACATGATTATTAATAATGGAGATGCTACTGCTCAAGATA

TTTCTTCTGAAAAATCTAAAGTAGAGCAAGTATTACAAGCATTACAAAATGCTAAGAATGACTTAAGAGCTGATAAAAGA

GAATTACAGACTGCATACAATAAACTTATACAAAATGTTAATACCAATGGTAAAAAACCATCTAGTATTCAAAACTATAA

GTCTGCAAGACGAAATATCGAAAACCAATATAATACCGCTAAAAATGAAGCACATAATGTTCTTGAAAATACAAACCCTA

CTGTAAATGCAGTAGAAGATGCTTTACGTAAGATAAATGCAATTCAACCAGAGGTTACAAAAGCTATTAATATACTTCAA

GATAAAGAAGATAATAGCGAACTTGTTAGAGCAAAAGAAAAATTAGATCAAGCGATTAATAGTCAACCATCACTAAATGG

TATGACTCAAGAATCTATTAATAATTACACAACAAAACGTAGAGAAGCACAAAATATAGCAAGTTCTGCTGACACTATTA

TTAATAATGGGGATGCATCTATTGAACAAATAACAGAAAATAAAATTCGAGTTGAAGAGGCAACTAATGCACTTAACGAA

GCAAAACAACATTTAACGGCAGATACAACTTCTTTAAAAACTGAAGTACGGAAATTAAGTAGGAGAGGCGACACAAACAA

CAAAAAGCCTAGCAGTGTTAGTGCTTATAACAATACTATTCATTCGCTACAATCTGAAATTACACAGACTGAAAATAGAG

CAAATACTATCATCAATAAGCCTATTCGTTCTGTTGAAGAAGTAAATAATGCATTGCATGAAGTAAACCAATTGAACCAA

CGCTTAACAGATACAATTAACTTATTACAACCTTTAGCGAATAAAGAAAGCTTAAAAGAAGCTCGTAATCGACTTGAAAG

TAAAATTAATGAAACCGTTCAAACAGACGGTATGACTCAACAATCTGTTGAGAATTATAAGCAAGCTAAAATAAAAGCTC

AAAATGAATCTAGTATTGCACAAACTCTTATTAATAATGGTGATGCATCTGATCAAGAAGTTTCTACAGAAATAGAAAAA

TTAAATCAAAAGCTGTCTGAATTAACAAATTCAATCAATCACTTAACAGTTAATAAAGAACCTTTAGAAACTGCCAAAAA

TCAGTTACAAGCAAATATTGACCAAAAACCTAGCACTGATGGTATGACGCAACAATCTGTACAAAGCTATGAACGTAAAC

TACAAGAAGCCAAAGATAAAATAAACTCAATTAATAATGTCTTAGCTAACAATCCAGATGTTAATGCTATCAGAACAAAC

AAAGTTGAGACGGAACAAATCAATAATGAATTAACACAGGCGAAACAAGGTCTTACTGTTGATAAACAACCATTGATTAA

TGCAAAAACTGCTTTGCAACAAAGTCTAGATAATCAACCAAGTACTACTGGTATGACTGAAGCAACAATTCAAAATTATA

ACGCTAAACGTCAAAAAGCAGAGCAAGTTATACAAAATGCAAATAAAATTATTGAAAACGCTCAACCTAGTGTACAACAA

GTGTCTGATGAGAAATCTAAGGTAGAGCAAGCACTCAGTGAATTGAACAACGCCAAATCAGCGCTTAGAGCTGATAAACA

AGAATTACAGCAAGCATATAATCAGTTGATTCAACCAACGGATTTAAATAATAAGAAACCAGCTTCTATCACTGCGTACA

ATCAAAGATATCAACAATTTAGTAACGAATTGAACAGCACTAAAACAAATACAGATCGCATTTTAAAAGAGCAAAATCCA

AGTGTAGCTGATGTCAACAATGCACTAAATAAAGTAAGAGAAGTACAACAAAAATTAAACGAAGCCAGAGCACTTTTACA

AAATAAAGAAGATAATAGTGCACTAGTTCGAGCCAAAGAACAACTTCAACAGGCAGTTGACCAAGTCCCTTCAACAGAAG

GTATGACGCAACAAACTAAAGATGATTACAATTCAAAACAACAAGCTGCTCAACAAGAAATATCAAAAGCACAACAAGTT

ATCGATAATGGCGATGCGACTACACAACAAATTTCTAACGCCAAAACAAATGTTGAACGCGCTTTAGAAGCATTAAATAA

TGCAAAAACTGGTTTAAGAGCAGATAAAGAGGAACTTCAAAATGCATATAATCAATTAACTCAAAATATTGATACGAGCG

GTAAAACGCCTGCAAGTATCAGGAAATACAATGAAGCTAAGTCACGTATTCAAACTCAAATTGATTCAGCTAAAAATGAA

GCAAACAGTATTTTAACAAATGACAATCCTCAAGTATCACAAGTGACTGCTGCGTTAAACAAAATAAAAGCTGTTCAACC

TGAAT'TAGATAAAGCGATAGCAATGCTTAAAAATAAAGAGAATAATAATGCATTGGTTCAAGCGAAACAACAACTTCAAC

AAATTGTTAATGAAGTAGATCCAACACAAGGCATGACAACAGATACTGC TAATAACTATAAATCAAAAAAACGTGAAGCT

GAAGATGAAATACAAAAAGCTCAACAAATCATTAACAATGGCGATGCCACTGAGCAACAAATTACTAACGAAACAAATAG

AGTAAATCAAGCGATTAATGCAATAAACAAAGCCAAAAACGATTTACGTGCTGATAAGTCTCAATTGGAAAATGCTTATA

ACCAATTAATACAAAATGTTGATACAAATGGTAAAAAACCTGCTAGTATTCAACAATACCAAGCTGCTCGACAAGCTATT

27/68

GAGACGCAATACAATAACGCTAAATCAGAAGCACATCAAATTCTTGAAAATAGTAACCCTTCAGTTAATGAAGTAGCACA

AGCATTACAAAAAGTTGAAGCTGTACAACTTAAAGTTAATGACGCGATTCATATACTTCAAAATAAAGAGAATAATAGTG

CACTTGTCACAGCTAAAAATCAACTTCAGCAATCAGTTAATGATCAACCATTAACAACAGGTATGACTCAAGATTCTATT

AATAACTATGAAGCTAAGAGAAATGAGGCTCAAAGTGCTATCAGAAATGCAGAAGCTGTCATCAACAATGGCGATGCAAC

TGCAAAACAAATTTCAGACGAGAAATCTAAAGTTGAACAAGCACTAGCACATTTGAATGATGCTAAACAGCAATTAACTG

CAGATACTACTGAATTACAAACAGCAGTTCAACAATTAAACAGAAGAGGCGATACAAATAATAAAAAGCCAAGAAGTATC

AATGCATATAATAAAGCAATTCAATCATTAGAAACACAAATTACTTCTGCTAAAGATAATGCCAACGCTGTGATACAAAA

ACCTATACGTACTGTTCAAGAGGTAAATAATGCATTACAACAAGTAAATCAGTTGAATCAACAATTAACTGAAGCAATTA

ATCAACTTCAACCGCTATCAAATAATGATGCATTAAAAGCTGCAAGATTAAATTTAGAAAATAAAATTAATCAAACTGTA

CAAACTGATGGTATGACACAACAATCTATAGAGGCTTATCAAAACGCTAAACGCGTAGCCCAAAATGAATCTAACACTGC

TTTAGCATTAATTAATAACGGCGATGCCGATGAACAACAAATTACAACTGAAACAGACCGAGTCAATCAGCAAACTACAA

ACTTAACTCAAGCAATTAACGGGTTAACAGTTAATAAAGAACCATTAGAAACCGCTAAAACAGCGTTACAAAATAACATC

GACCAGGTACCTAGTACAGATGGTATGACTCAGCAATCTGTTGCAAATTATAATCAAAAACTACAAATAGCTAAAAACGA

AATTAACACAATTAATAACGTTTTAGCGAACAATCCAGATGTTAATGCAATCAAAACGAATAAAGCAGAAGCGGAACGAA

TCAGTAACGATTTAACACAAGCTAAGAATAACTTACAAGTTGATACTCAACCTTTAGAAAAAATAAAAAGACAACTTCAA

GATGAAATTGATCAAGGTACTAACACAGATGGAATGACTCAAGATTCAGTGGATAATTACAATGATAGCTTAAGTGCAGC

AATTATAGAAAAAGGCAAAGTAAATAAATTACTTAAACGTAATCCGACAGTAGAACAAGTTAAAGAGAGCGTTGCTAATG

CACAACAAGTCATACAAGATTTACAAAATGCTCGAACTTCACTTGTTCCAGACAAAACTCAACTTCAAGAAGCTAAAAAT

AGATTAGAAAACAGTATTAACCAACAAACAGATACTGACGGCATGACTCAAGATTCGCTTAACAATTATAATGATAAATT

AGCAAAAGCTAGACAAAACCTTGAAAAAATATCTAAAGTTTTAGGTGGTCAACCTACTGTAGCTGAAATTAGACAAAATA

CAGATGAAGCAAATGCACATAAACAAGCATTAGACACTGCACGTTCTCAACTTACATTAAATAGAGAGCCATATATCAAT

CATATTAATAATGAAAGTCATTTAAATAACGCGCAAAAAGATAATTTTAAAGCTCAAGTTAACTCAGCACCTAATCATAA

TACTTTAGAAACGATTAAAAATAAGGCTGATACTTTAAATCAATCTATGACAGCATTAAGTGAAAGTATTGCAGATTACG

AAAATCAAAAACAACAAGAAAATTATTTAGATGCATCTAACAATAAACGTCAAGACTATGACAATGCAGTCAATGCGGCT

AAAGGTATTTTAAACCAAACTCAAAGTCCGACAATGAGTGCTGATGTGATTGATCAAAAAGCTGAAGATGTTAAACGTAC

GAAAACTGCGTTAGATGGAAATCAAAGATTAGAAGTTGCTAAACAACAAGCACTTAATCATTTAAATACCTTAAATGATT

TAAACGATGCTCAGCGACAAACTTTAACTGATACTATAAATCACTCTCCAAACATCAATTCAGTGAATCAAGCTAAAGAA

AAAGCTAATACTGTTAACACAGCAATGACTCAACTGAAACAAACTATTGCTAACTATGACGATGAATTGCATGACGGCAA

TTACATTAATGCAGATAAAGACAAAAAAGATGCTTATAATAACGCTGTTAACAATGCTAAACAACTGATTAATCAATCTG

ATGCTAATCAAGCACAACTTGATCCAGCTGAAATTAATAAAGTTACACAAAGAGTCAATACGACTAAAAATGATCTAAAT

GGTAATGACAAATTGGCTGAAGCTAAAAGAGATGCTAATACAACCATTGATGGTTTAACTTATCTAAATGAAGCTCAACG

TAACAAAGCTAAAGAAAATGTAGGCAAAGCTTCTACAAAAACAAATATTACGAGTCAGTTACAAGATTACAATCAATTGA

ATATTGCTATGCAAGCATTACGTAACAGTGTGAACGACGTTAACAATGTTAAAGCAAATAGCAATTATATAAATGAAGAT

AATGGTCCAAAAGAAGCTTACAATCAAGCCGTTACTCATGCTCAAACATTGATAAATGCACAATCTAACCCTGAAATGAG

CCGTGACGTAGTAAATCAAAAAACACAAGCAGTAAATACTGCCCATCAGAATTTACATGGACAACAAAAGTTAGAACAAG

CACAAAGTAGTGCTAATACAGAAATCGGTAACTTACCAAACTTAACTAATACTCAAAAAGCTAAAGAAAAGGAACTGGTA

AATAGTAAACAAACTCGTACGGAAGTACAAGAACAACTTAACCAAGCTAAGTCACTAGATAGTTCTATGGGCACGTTAAA

ATCATTAGTTGCTAAACAACCTACAGTACAAAAAACAAGTGTTTATATTAACGAAGATCAACCTGAGCAATCTGCCTACA

ATGATTCCATTACAATGGGACAAACTATAATTAATAAAACAGCTGATCCAGTACTTGATAAAACTTTAGTTGATAACGCA

ATCAGTAACATTTCAACTAAAGAGAATGCACTGCATGGTGAACAAAAATTAACAACTGCTAAAACGGAAGCAATTAATGC

ACTTAATACATTAGCTGATTTAAACACACCTCAGAAAGAGGCTATTAAAACAGCTATTAACACTGCTCATACAAGAACTG

ATGTAACTGCAGAGCAAA.GTAAGGCTAATCAAATAAATAGTGCAATGCACACGTTGAGACAAAACATTTCTGACAACGAA

TCAGTAACAAACGAAAGTAATTATATTAACGCTGAACCCGAAAAACAACATGCCTTTACTGAGGCTCTAAATAATGCTAA

AGAAATAGTTAATGAACAACAAGCCACTCTTGATGCCAATTCAATTAACCAAAAAGCACAAGCGATTCTTACTACTAAAA

ATGCTTTAGATGGTGAAGAACAATTACGTCGTGCTAAAGAAAATGCCGATCAAGAAATCAATACGTTAAATCAATTGACTGATGCGCAAAGAAATAGTGAAAAAGGTTTAGTCAACAGTTCTCAAACTAGAACAGAAGTTGCTTCTCAATTAGCAAAAGC

TAAAGAACTAAATAAGGTGATGGAACAACTGAATCACCTTATCAATGGTAAAAACCAAATGATAAATAGCAGTAAATTTA

TCAATGAAGATGCGAACCAACAACAAGCATATTCAAATGCGATTGCAAGTGCAGAAGCGCTTAAAAACAAATCACAAAAC

CCTGAATTAGATAAAGTAACAATTGAACAAGCAATTAATAATATTAATTCTGCAATTAACAATCTAAACGGTGAAGCTAA

ACTGACTAAAGCTAAAGAAGATGCTGTTGCTTCAATAAACAACCTAAGCGGATTAACAAACGAGCAAAAAACAAAAGAAA

ATCAAGCCGTTAATGGCGCTCAAACTAGAGACCAAGTTGCTAATAAATTACGTGATGCTGAAGCATTAGATCAATCAATGCAAACATTACGTGACTTAGTTAACAATCAAAATGCAATACATTCAACAAGTAATTATTTTAACGAGGATTCAACTCAAAA

GAATACTTATGATAATGCAATTGATAATGGCTCGACATATATAACTGGTCAACACAATCCAGAATTAAATAAATCTACTA

TTGATCAAACGATTAGCCGAATTAACACAGCTAAAAATGATTTACATGGTGTAGAAAAGTTACAAAGAGATAAGGGAACT

GCTAATCAAGAAATTGGACAATTAGGTTATTTAAATGACCCTCAAAAATCTGGTGAGGAATCCTTAGTCAACGGTTCAAA

TACACGTTCTGAAGTAGAAGAGCATCTTAATGAAGCTAAATCATTAAATAATGCAATGAAACAATTAAGAGATAAAGTAG

CTGAAAAGACTAATGTCAAACAAAGTAGCGATTACATTAATGATTCAACTGAACATCAACGTGGGTATGATCAAGCACTT

CAAGAAGCAGAAAATATTATTAATGAAATCGGTAATCCAACATTAAATAAATCGGAAATTGAACAAAAGTTACAACAATTGACTGACGCTCAAAATGCGTTACAAGGTTCACATCTATTAGAAGAAGCTAAAAATAATGCGATTACTGGAATCAATAAAC

TTACAGCATTAAATGATGCACAACGTCAAAAAGCAATTGAAAATGTTCAAGCACAGCAGACAATCCCAGCAGTTAATCAA

CAATTAACTTTGGATAGAGAAATAAATACTGCAATGCAAGCTTTACGAGATAAAGTAGGCCAACAAAATAACGTTCACCA

28/68

ACAAAGTAATTATTTCAATGAAGATGAACAACCAAAACATAACTATGATAATTCTGTACAAGC CGG TCAAACTATTATTG

ATAAAC TT CAAGAT C CAATCATGAACAAAAATGAAA.TTGAGCAGGCTATTAAT CAAATCAATACGACTCAAACAGCGTTA

AGTGGAGAAAATAAATTACACACTGAC CAAGAAAGCACAAATAGACAAATAGAAGGTTTATCTAGTTTGAACACAGCTCA

AATCAACGCCGAAAAAGATTTAGTCAATCAAGCTAAAACAAGAACAGATGTTGCTCAAAAGTTAGCTG CAGCTAAAGAAA

TAAATTCTGCTATGAGTAATTTAAGAGATGGCATTCAAAATAAAGAGGACATCAAACGTAGCAGTGCATATATCAACGCA

GATCCGACTAAAGTTACAGCTTACGATCAAGCACTACAGAACGCAGAAAATAT CATCAATGCCACA.CCAAACGTAGAGCT

TAATAAAG C TACAATTGAACAAGCGCTATCACGCGTTCAACAAGCACAACAAGATC T TGATGGTGTTCAACAATTAGCTA

ATGCTAAACAACAAGCTACACAAACTGTCAATGGGTTAAATAGCTTAAATGACGGTCAAAAGCGTGAATTAAATCTATTA

ATTAATT CAGC TAATAC C CG TACAAAAGTACAAGAAGAATTAAACAAAGCAAC TGAAT TGAAC CATGCGATGGAAGCTTT

AAGAAACAGTGTTCAAAACGTTGATCAAGTAAAACAAAGTAGCAATTATG TCAATGAAGATCAACCTGAACAGCACAATT

ATGATAATGCTGTCAATGAAGCTCAAGCTACAATCAACAACAATGCTCAACCTGTTCTAGACAAATTAGCTATAGAACGT

TTAACTCAAACTGTTAACACTACAAAAGATGCATTACATGGTGCTCAAAAA.CTGACACAAGACCAACAAGCTG CTGAAAC

TGGAATACGTGGTTTAACGAGTCTCAATGAACCTCAGAAAAATGCTGAAGTAGCTAAAGTAACTGCAG CAACAACACGTG

ATGAAGTGAGAAATATTCGTCAAGAAG CAACAACATTAGATAC TGCAATGC TTGGTTTACGTAAAAGCAT TAAAGATAAA

AACGATACTAAAAATAGTAGTAAATATATTAATGAGGATCATGACCAACAACAAGCTTATGACAATGCTGTAAATAATG C

TCAACAAGTTATCGATGAAACTCAAGCAACGTTAAGCTCAGATACAATCAATCAATTGGCAAATGC CGTAACTCAAGCTA

AAT C TAAT CTT CATGGAGATACTAAACTACAACACGATAAAGATAGTGCTAAACAAA C GATTGCTCAATTACAGAATTTG

AATT CAGCTCAAAAACATATGGAAGATT C TTTAATTGATAATGAAT CTACACGTACGCAAGT C CAACACGATTTAACAGA

AG CT CAAGC TTTAGATGG TTTAATGGG TG C C TTAAAAGAAAGTATTAAAGATTATACTAATATTGTTTCAAACGGTAATT

ACATCAATGCGGAACCATCTAAGAAACAAG CATATGATGCAGCTGTACAAAATGCTCAAAATATAATAAATGGAACGAAT

CAAC CAACAATTAATAAAGGTAATGT CACTACAGCAACACAAACCGTGAAAAATAC TAAAGATGC CTTAGACGGTGAT CA

TAGATTAGAGGAAGCTAAAAATAATGC CAAT CAAACAAT CAGAAAT C TAT CTAATTTGAACAATGC C CAAAAAGATGCAG

AGAAAAAT C TAGTTAATAGCGCAT CAACATTAGAACAAGTTCAACAAAACTTACAAAC CGCT CA.ACAATTAGATAATGCT

ATGGGTGAG TTAC GACAAAGTAT TGCTAAAAAAGATCAAGTGAAAGCAGATAGTAAATAT CTAAATGAAGAT C CTCAAAT

TAAGCAAAACTATGATGATGCAGTTCAACGTGTTGAAACTATTATTAACGAAACTCAAAACCCTGAATTACTTAAAGCAA

ACATTGAC CAAGCAACT CAAT C C GT TCAAAATG CAGAACAAG C T TTACATGGTGCTGAAAAATTAAATCAAGACAAACAA

ACGTCTTCGACAGAACTAGATGGATTAACAGATTTAACAGATGCACAACG TGAAAAAC TCAGAGAACAAATTAACAC TT C

TAATAGTAGAGATGATATTAAGCAAAAAATTGAGCAAGCAAAAGCACTAAATGACGCAATGAAAAAACTTAAAGAACAAG

TTGCGCAAAAAGATGGTGTTCATGCTAACAGTGATTATACAAATGAAGA CALAAAAAGA A AATAATG CA

CTTAAACAAGCGGAAGACATTATTAATAACAG CTCAAATCCTAACTTAAATGCACAAGACATTACTAATGCTTTAAATAA

TATTAAACAAG CACAAGATAAC C T TCATGGAGCT CAAAAATTACAGCAAGACAAAAATACAACTAAT CAAGC CATTGGTA

ACTTAAATCAT CT TAAT CAAC C T CAAAAAGATGCGCTTATACAAGC TATTAATGGAG CTACAT C TAGGGAC CAAG TTGCA

GAAAAACTTAAAGAGGC CGAAGCGCTTGATGAAGCTATGAAACAACTTGAAGAT CAAG TGAAT CAAGATGATCAAATTT C

AAATAGCAGC C CATT CATAAATGAAGACT CAGACAAACAAAAAACTTATAATGATAAAAT C CAAG C TGCAAAAGAAATAA

TTAATCAAACATCTAAT C CAAC C TTAGATAAACAAAAAATTGCTGATACACTT CAAAATATTAAAGATG CAGTGAATAAT

TTACATGGTGAT CAAAAATTAGCTCAAT C TAAACAAGATGCTAATAATCAATTAAAT CAT TTAGATGACTTAACCGAAGA

ACAAAAAAAC CATTTTAAACCGTTAATTAATAATGCTGATAC TCGAGATGAGG TAAATAAACAAC TAGAGATTGCTAAAC

AATTAAATGGTGATATGAGTACACTTCATAAAGTCATAAATGATAAAGATCAAATTCAACATTTAAGCAATTACATTAAT

GCTGATAATGATAAAAAACAAAATTATGATAATGCTATTAAAGAAGCTGAGGATTTAA.TTCATAATCATCCAGATACATT

AGATCATAAAGCATTACAAGATTTATTAAACAAGATAGAC CAAGCGCATAACGAATTAAATGGAGAATC CAGATTTAAAC

AGGC TTTAGACAATGCTTTAAACGACATAGATAGC TTAAACAG T CTCAATGTT C CACAACGC CAAACTGTTAAGGATAAC

ATCAAC CATGTGACAACT C TAGAAAG TTTAGCTCAAGAATTGCAGAAAGCAAAAGAGCTTAATGATGCTATGAA.AGCAAT

GAGAGATAGCATTATGAATCAAGAGCAAATT CG TAAA.AATAGCAATTATACTAATGAAGAC TTAGCTCAACAAAATGC CT

ATAATCATGCAGTAGATAAAATAAATAACATTATTGGTGAAGACAATGCGACGATGGATCCTCAAATAATCAAACAAGCA

ACTCA_AGATATAAATACAGCTATAAATGGATTAAATGGAGATCAAAAACTTCAAGATGCAAAGACAGATGCTAAACAACA

AATTACTAACTTTACTGG TTTAACTGAACCACAAAAACAAGCATTGGAAAACATCATTAACCAACAAACAAGCAGAGCAA

ATGTTGCTAAACAG TTAAGT CATGCTAAATT CTTAAATGGAAAAATGGAAGAATTAAAAGTTGCAGTAG C CAAAGCGT CA

TTAGTAAGACAAAATAGTAACTATATTAATGAAGATGT C T CTGAAAAAGAAGCATATGAACAAGC TAT CGCAAAAGGT CA

GGAAATAATTAATTCAGAAAATAATCCAACAATAAGTAGTACTGATATCAATCG TAC CATT CAAGAAAT TAATGATGCTG

AACAAAATCTTCATGGTGATAATAAATTAAGACAAGCACAGGAAATTGCAAAGAATGAAATACAAAATCTAGACGGATTA

AATTCAG CT CAAATAACAAAATTAAT C CAAGATATAGGCAGAACAACAACTAAAC C TG CAGTAACTCAGAA.ACTAGAAGA

AG CAAAAG CAATAAACCAAGCTATGCAACAACTTAAACAAAGTATAGCCGATAAGGATGCTACTCTAAATTCTAGTAACT

ATCTCAATGAAGATTCTGAGAAAAAGTTAGCGTACGATAATG CTGTAAGCCAAGCTGAACAACTCATAAATCAACTTAAC

GAC C CAACTATGGATATAAG TAATATTCAAGCTATTACT CAAAA.GGTCATT CAAG CAAAA.GATTCATTG CACGGTGCGAA

TAAACTTGC.ACAAAATCAAGCAGATTCAAATTTAATAATAAATCAATCAACAAATTTAAATGATAAACAAAAGCAAGCAT

TAAATGACTTAATTAATCATGCTCAAACTAAACAGCAAGTGGCAGAAATAATTG CACAAGCTAATAAGTTAAATAACGAA

ATGGGCACACTAAAA.ACACT C GTAGAAGAACAGT CAAACGTT CATCAACAAAGTAAATATATTAATGAAGAT C CGCAAG T

TCAAAATATTTATAATGACTCCATTCAAAAAGGTCGAGAAATATTAAACGGCACTACAGATGATGTTTTAAACAACAATA

AAATAGCAGATG C CATT CAAAACATTCATTTAACTAAAAACGATTTACATGG TGAT CAAAAATTACAAAAAGCACAACAA

GATGCA.ACCAATGAATTAAACTATTTAACAAATCTAAACAATTCTCAAAGACAAAG CGAG CATGATGAGATTAACTCTGC

T C CTTCAAGAAC TGAAG TTT CTAATGATTTAAAT CATGC TAAAGCACTTAATGAAGCTATGCG T CAACTTGAGAATGAAG

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TTGCTCTTGAAAACAGTGTTAAAAAATTAAGCGACTTTATCAATGAAGATGAAGCGGCACAAAATGAATATAGTAATGCA

CTTCAAAAAGC TAAAGACATTATCAACGGCGTTCCAAGTAGCACTTTAGATAAAGCTACAATTGAAGATGCTTTATTAGA

ATTGCAAAATGCTAGAGAAAGTTTACATGGTGAGCAAAAACT TCAAGAGG CTAAAAATCAAGCTGTTGCTGAAATTGATA

ATTTACAAGCATTAAATCCTGGACAGGT TCTTGCTGAAAAAACATTAGT TAACCAAG CATCAACCAAACCAGAAGTTCAA

GAAGCCTTACAAAAAGCAAAAGAACTTAATGAAGCTATGAAAGCACTGAAAACTGAAATAAATAAAAAAGAACAAATCAA

GGCTGATAGTAGATATGTAAATGCTGACAGTGGTCTTCAAGCAAATTACAATTCTGCGTTAAATTATGGTTCTCAAATTA

TTGCAACTACCCAACCACCAGAGCTTAATAAAGATGTAATAAATAGAGCAACTCAAACGATTAAAACTGC TGAAAATAAT

TTAAATGGGCAATCTAAATTAGCAGAGGCTAAGTCAGACGGAAATCAAAGCATCGAACATTTGCAAGGATTAACACAATC

ACAAAAAGATAAACAACATGATTTAATTAATCAAGCTCAAACTAAACAACAGGTAGATGATATCGTAAATAACTCTAAAC

AATTAGATAACTCTATGAATCAACTACAACAAATTGTTAACAATGACAATACAGTAAAACAAAATAGTGATTTCATTAAT

GAAGATTCCAGCCAACAGGATGCTTATAATCATGCAATTCAAGCAGCAAAAGATTTGATAACTGCTCATCCAACTATCAT

GGATAAAAATCAAATAGATCAAGCTATTGAAAATATCAAACAAGCACTTAATGATTTACACGGTAGTAATAAACTATCAG

AAGATAAAAAAGAAGCTTCAGAACAACTACAAAACCTTAATAGCTTGACGAACGGGCAAAAAGATACGATTTTAAATCAT

ATTTTCAGTGCACCAACAAGAAGCCAAGTAGGAGAAAAAATTGCAAGTGCTAAACAATTAAATAATACAATGAAAGCACT

TAGAGATTCTATTGCTGATAATAATGAAATTTTACAAAGTAGTAAGTACTTCAATGAAGATTCTGAACAACAAAATGCTT

ATAATCAAGCCGTAAATAAAGCTAAAAATATAATTAATGATCAACCAACACCAGTAATGGCAAATGATGAGATTCAAAGT

GTCCTAAATGAAGTTAAACAAAC TAAAGATAATTTACATGGTGATC.AAAAACTTGCTAACGACAAGACAGATGCTCAAGC

AACATTAAATGCGTTAAATTAC TTAAATCAAGCGCAAAGAGGTAATC TTGAAACTAAAGTT CAAAAC TCTAATTC TAGAC

CAGAAGTACAAAAAGTAGTTCAATTAGCAAATCAACTTAATGATGC GATGAAAAAATTAGATGATGCTTTAAC TGGTAAT

GACGCAATAAAACAAACGAGTAATTATATTAATGAAGATACT TC TCAACAAGTTAACTTTGATGAGTATACAGATAGAGG

TAAAAACATAGTTGCTGAACAAACAAATCCAAATATGTCTC CAACTAATATTAACACTATTGCTGATAAAATTACTGAAG

CTAAAAACGATTTACATGGCGTACAAAAACTAAAACAAGCTCAACAACAGTCCATCAATACTATTAATCAAATGACTGGT

CTAAACCAAGCTCAAAAAGAACAATTAAATCAAGAAATTCAACAAACTCAAAC C CGTTCTGAAGTACATCAAGTAATTAA

TAAAGCACAAGCTT TAAATGATTCAATGAATACTTTACGTCAAAGTATTACTGATGAACATGAAGTTAAACAAACAAGTA

ACTACATCAATGAAACTGTTGGTAATCAAACTGCATATAACAATGCCGTTGATCGTGTAAAACAAATAATCAATCAAACA

TCTAATCCAACTATGAATCCTTTAGAGGTGGAACGTGCAACATCAAATGTAAAAATTTCTAAAGATGCACTTCATGGTGA

ACGTGAATTGAATGACAATAAAAATTCAAAAACTTTTGCAGTCAATCACTTAGATAACCTCAATCAAGCTCAAAAAGAAG

CATTAACTCATGAAATTGAACAAGCAACTATAGTTTCACAAGTAAATAATATCTATAACAAAGCGAAAGCTTTAAATAAT

GATATGAAAAAACTTAAAGATATCGTTGCTCAACAAGATAATGTGAGACAATCAAACAAT.T.ATATAAACGAGGATAGTAC

ACCTCAAAATATGTACAACGATACAATTAATCATGCACAATCAATCATTGATCAAGTAG CAAACCCTACGATGTCTCATG

ACGAAATAGAGAATGCAATCAATAACATAAAGCATGCCATCAATGCACTCGATGGAGAACATAAATTACAACAAGCAAAA

GAAAATGCAAACTTATTGATTAATAGTT TAAACGATTTAAATG CACCACAAAGAGATGCCATAAATAGAT TGGTTAATGA

AGCTCAAACAAGAGAAAAAGTAGCTGAACAACTTCAAAGTG CTCAAGCTTTAAATGACGCTATGAAGCATTTAAGAAACA

GCATTCAAAATCAATCATCCGTAAGACAAGAGAGCAAATATATTAATGCAAGTGATGCTAAAAAAGAGCAATATAATCAC

GCAGTTAGAGAAGTCGAAAATATTATCAATGAACAACATCCAACATTGGATAAAGAAATAATTAAGCAACTAACGGATGG

TGTAAATCAAGCGAATAATGACTTAAATGGCGTTGAATTATTAGATGCTGATAAGCAAAACGCACATCAATCGATACCTA

CATTGATGCACTTAAATCAAGCACAACAAAACGCATTAAATGAAAAAATTAATAACGCAGTTACCAGAACTGAAGTTGCG

GCTATTATTGGCCAAGCAAAACTACTCGATCATGCTATGGAGAATTTAGAAGAAAGTATCAAAGATAAAGAGCAAGTCAA

ACAGTCAAGTAACTATATTAATGAAGATTCTGATGTTCAAGAAACATACGATAACGCCGTTGATCATGTGACAGAAATAC

TTAATCAAACAGTAAATCCAACTTTATCTATTGAAGATATAGAGCATGCTATCAACGAAGTTAATCAAGCGAAAAAACAA

CTCAGAGGTAAACAAAAACTTTATCAAACTATCGATTTAGCTGATAAAGAATTAAGTAAATTGGATGATTTAACATCACA

ACAAAGCAGTTCAATATCTAATCAAATATATACTGCTAAAACGAGAACAGAAGTTGCCCAAGCAATTGAAAAAGCAAAAT

CATTAAATCATGCAATGAAAGCACTTAACAAAGTATATAAAAATGCAGATAAAGTGTTAGATAGTAGTCGATTCATTAAC

GAAGATCAACCTGAAAAAAAGGCGTATCAACAAGCTATAAATCATGTTGATT CAATCATTCATAGACAAACAAATCCTGA

AATGGATCCAACAGTAATCAATAGCATAACTCATGAACTCGAAACAGCTCAAAATAACTTACATGGTGATCAGAAACTTG

CTCATGCACAACAAGATGCCGCTAATGTAATTAATGGTC TAATTCATCTTAATGTTGCTCAACGTGAGGTAATGATAAAT

ACGAATACAAATGCTACAACACGCGAAAAAGTTGCAAAGAACTTAGATAATGCTCAAGCTCTTGATAAAGCTATGGAAAC

ACTACAACAAGTAGTTGCTCATAAAAATAATATATTGAACGATAGTAAATATTTAAATGAAGATTCAAAATATCAACAAC

AATACGATCGAGTTATTGCTGATGCCGAACAACTACTTAATCAGACAACAAATCCAACATTAGAACCTTATAAAGTCGAT

AT TGTTAAGGATAATGTCCTAGCTAACGAAAAAATACTATTTGGCG CAGAAAAA.CTATCATATGACAAATCAAATG CAAA

TGATGAAATTAAACATATGAATTATCTTAATAATGCACAAAAGCAATCTATAAAAGATATGATTTCTCACGCAGCATTAA

GAACTGAAGTTAAACAACTTCTGCAACAAG CTAAAATCCTTGATGAAG CCATGAAATCACTTGAAGATAAAACTCAAGTA

GTGATTACAGATACTACTTTGCCTAATTACACTGAAGCTTCAGAGGATAAA.AAGGAAAAAGTAGACCAAACTGTATCACA

TGCTCAAGCGATTATTGATAAAATAAATGGCTCAAATGTAAGTTTAGATCAAGTACGACAAGCACTAGAACAATTAACTC

AAGCATCAGAAAACCTCGATGGTGATCAGCGAGTTGAAGAAGCTAAAGTTCATGCTAATCAAACAATTGATCAATTAACA

CATCTTAATTCATTACAACAACAAAC TGCGAAAGAAAGTGTTAAAAACGCAACAAAACTAGAAGAAATCGCTACTGTTAG

TAACAATGCTCAGGCATTAAACAAAGTAATGGGTAAATTAGAACAATTCATTAATCATGCTGATTCTGTTGAAAATAGTG

ATAATTATAGACAAGCCGACGACGACAAAATCATCGCT TATGATGAAGCACT TGAACATGGACAAGATATACAAAAAACT

AACGCAACCCAAAATGAAACAAAACAAGCGTTACAACAATTAATATATGCAGAAACATCGTTAAATGGTTTCGAAAGATT

AAATCATGCTAGACCACGAGCTTTAGAATATATCAAATCACTAGAAAAAATAAACAATGCTCAAAAGTCTGCTTTAGAGG

ATAAAGTAACGCAATCGCATGATTTATTAGAATTAGAACATATTGTCAACGAGGGCACAAAC CTCAATGACATTATGGGT

30/68

GAATTAGCTAACGCAATCGTTAATAACTATGCTCCAACCAAAGCAAGTATAAATTATATTAACGCCGATAACCTACGCAA

AGATAACTTTACTCAAGCTATCAACAATGCACGTGATGCACTCAACAAAACTCAAGGTCAGAACTTAGATTTCAATGCAATTGATACATTTAAAGATGATATATTCAAAACTAAAGATGCACTTAACGGTATTGAACGTTTAACAGCTGCAAAATCAAAA

GCAGAAAAACTAATTGATAGTTTAAAATTTATTAATAAAGCTCAATTCACACATGCAAATGATGAAATTATGAATACTAA

TTCTATTGCACAATTGTCTAGAATCGTGAATCAAGCATTTGATTTAAATGATGCAATGAAATCTTTAAGAGATGAACTTA

ATAATCAAGCTTTTCCTGTCCAAGCAAGCTCAAATTATATAAATTCAGATGAAGATTTAAAACAACAATTTGACCATGCT

TTAAGTAATGCTCGAAAAGTTCTTGCAAAAGAAAATGGTAAAAATTTAGATGAAAAACAAATTCAGGGACTCAAACAAGT

GATTGAGGATACTAAAGATGCTTTAAATGGTATCCAACGTTTATCAAAAGCTAAAGCTAAAGCAATTCAATACGTACAATCTTTATCTTATATCAATGATGCACAGCGTCATATTGCTGAAAATAATATTCACAACTCTGATGATTTATCATCTTTAGCA

AATACATTATCTAAAGCTAGTGATTTAGATAATGCAATGAAAGACTTACGAGATACTATAGAAAGTAATTCAACTTCTGT

TCCAAATAGTGTGAATTATATTAATGCTGATAAGAATTTACAAATTGAATTTGATGAGGCGCTACAACAAGCAAGTGCAACAAGTTCTAAAACTTCAGAAAATCCAGCAACGATTGAAGAAGTATTAGGTCTTAGTCAAGCCATTTACGATACAAAAAAT

GCATTAAATGGTGAACAACGACTTGCAACTGAGAAGAGCAAAGATCTAAAATTAATAAAAGGATTAAAAGATTTAAATAA

AG CACAACTTGAAGATGTCACAAACAAGGTAAATTCAGCAAATACTTTAACAGAGTTATCTCAGCTCACTCAATCAACGT

TAGAATTAAACGATAAAATGAAATTATTGAGAGATAAGCTTAAAACTTTAGTAAATCCTGTTAAAG CAAGTTTAAATTAT

AGAAACGCTGATTATAATTTAAAACGTCAATTTAACAAAGCTTTAAAAGAAGCTAAAGGCGTATTAAATAAAAATAGCGGTACAAATGTCAATATCAATGACATTCAACATCTTTTAACACAAATAGATAATGCTAAAGACCAATTAAATGGTGAACGAC

GTCTAAAAGAACATCAACAAAAATCTGAAGTATTTATTATTAAAGAATTAGATATACTTAATAATGCTCAAAAAGCTGCA

ATAATTAATCAGATTAGAGCGTCTAAAGACATTAAAATAATTAATCAAATCGTTGATAATGCAATAGAATTAAATGATG C

TATGCAAGGTTTAAAAGAACATGTAGCTCAATTAACAGCAACTACAAAAGACAACATTGAATATTTAAATGCTGATGAAG

ACCATAAATTACAATATGATTACGCTATCAACTTAGCGAATAATGTTCTTGACAAAGAAAACGGTACAAATAAAGACGCT

AATATCATAATTGGAATGATTCAAAACATGGATGATGCTAGAGCACTTCTAAATGGAATTGAAAGACTTAAAGATGCTCA

AACAAAAGCACATAA.TGACATTAAAGATACGCTCAAACGTCAACTTGATGAAATTGAACACGCTAATGCAACATCAAATT

C TAAAGCTCAAGCTAAACAAATGGTAAATGAGGAAGCTAGAAAAGCGCTTTCTAATATTAATGACGCAACATCAAATGAT

TTAGTTAATCAAGCAAAAGATGAAGGGCAATCTGCAATTGAACACATACATGCAGATGAATTACCTAAAGCAAAACTAGATGCTAATCAAATGATTGACCAAAAAGTTGAAGATATAAATCACTTAATTAGTCAAAATCCAAACTTATCAAATGAAGAAA

AAAATAAACTAATATCTCAAATTAATAAGTTAGTAAATGGAATTAAGAATGAAATTCAACAAGCTATAAACAAACAACAA

ATAGAAAATG CTACAACAAAACTAGATGAAGTCATTGAAACTACTAAAAAATTAATTATCG C CAAAG CAGAAG CTAAACAAATGATAAAAGAGTTATCACAAAAGAAACGAGATGCAATAAAT`AACAACAC•TGATT-T-AACALLi.i CAAAAGGCACATG

CTTTAGCAGATATTGATAAAACAGAAAAAGATGCACTTCAACATATCGAAAATTCTAATTCAATTGATGATATCAATAAC

AATAAAGAGCATGCATTTAATACTTTAGCTCATATCATTATTTGGGATACTGATCAGCAACCATTAGTTTTTGAACTACC

TGAATTGAGCCTTCAAAATGCTCTAGTAACAAGTGAGGTGGTTGTTCACAGAGATGAAACTATTTCATTAGAATCTATAA

TTGGAGCTATGACTTTAACTGATGAACTTAAAGTCAATATTGTTTCATTACCGAACACTGATAAAGTAGCTGATCACCTA

ACCGCTAAAGTTAAGGTTATTTTAGCTGATGG CTCATATGTCACTGTAAATGTTC CAGTCAAAGTTGTAGAAAAAGAATT

ACAAATAGCTAAAAAGGATGCTATAAAAACAATTGATGTTCTGGTAAAACAAAAAATCAAAGATATAGATTCTAATAACG

AATTAACGTCTACTCAACGTGAAGATGCAAAAGCTGAAATTGAAAGATTGAAAAAGCAAGCCATCGATAAAGTGAATCAT

TCAAAATCGATTAAAGATATTGAAACAGTAAAACGAACTGATTTTGAAGAAATAGATCAGTTTGATCCTAAACGCTTTAC

G CTAAATAAAGCTAAAAAGGATATCATTACTGATGTTAATACTCAAATCCAAAATGGTTTCAAAGAAATTGAAACAATAA

AAGGTTTAACTTCTAATGAAAAAACTCAGTTTGATAAACAATTAACTGCACTACAAAAAGAATTTTTAGAAAAAGTCGAG

CATG CTCATAATTTAGTAGAATTAAATCAATTACAACAAGAGTTTAATAATAGATATAAACATATTTTAAAC CAAG CACA

TTTACTAGGTGAAAAACATATAGCAGAACATAAATTAGGATATGTTGTAGTAAACAAAACTCAGCAAATACTAAATAATC

AATCTGCTTCTTACTTTATAAAACAATGGGCACTTGATAGAATTAAACAAATTCAACTAGAAACGATGAATTCAATTCGT

GGTGCGCATACCGTACAAGATGTACACAAAGCATTATTACAAGGTATAGAGCAAATCTTGAAAGTAAATGTAAGTATTAT

AAATCAATCTTTCAACGATTCCTTGCATAACTTTAATTATCTTCATTCAAAATTTGATGCTAGATTAAGAGAAAAGGATG

TTGCAAACCATATCGTACAAACTGAAACATTCAAAGAAGTTCTAAAAGGAACGGGTGTTGAACCAGGTA.AAATCAACAAAGAAACACAGCAACCAAAACTTCATAAGAATGATAATGATAGCCTATTCAAACATTTAGTTGATAATTTCGGCAAAACTGT

AGGTGTTATTACATTAACTGGTTTACTTTCTAGTTTCTGGTTAGTTTTGGCTAAAAGACGTAAAAAAGAAGAAGAAGAAA

AACAATCGATAAAAAATCATCACAAAGATATTCGTCTTTCAGATACTGATAAAATAGATCCAATIGTAATAACTAAG CGT

AAAATAGATAAAGAAGAACAAATTCAAAACGATGACAAACATTCAATTCCAGTTGCTAAACATAAGAAATCTAAAGAAAA

GCAATTGAGTGAAGAGGATATTCA'TTCAATCCCCGTCGTTAAGCGTAAACAAAACAGTGATAACAAAGATACAAAACAGA

AGAAAGTTACTTCTAAAAAGAAGAAAACGCCTCAGTCAACTAAAAAAGTTGTAAAAACCAAAAAGCGTTCTAAAAAG

SEQ ID NO:49 seqüência de polinucleotídeoATGAGAGATAAGAAAGGACCGGTAAATAAAAGAGTAGATTTTCTATCAAATAAATTGAATAAATATTCAATAAGAAAATT

TACAGTTGGAACAGCATCTATTTTAATTGGCTCACTAATGTATTTGGGAACTCAACAAGAAGCAGAAGCAGCTGAAAACA

ATATTGAGAATCCAACTACATTAAAAGATAATGTCCAATCAAAAGAAGTGAAGATTGAAGAAGTAACAAACAAAGACACT

GCACCACAAGGTGTAGAAGCTAAATCTGAAGTAACTTCAAACAAAGACACAATCGAACATGAAGCATCAGTAAAAGCTGA

AGATATATCAAAAAAGGAGGATACACCAAAAGAAGTAG CTAATGTTG CTGAAGTTCAGC CGAAATCGTCAGTCACTCATA

ACGCAGAGGCACCTAAGGTTAGAAAAGCTCGTTCTGTTGATGAAGGCTCTTTTGATATTACAAGAGATTCTAAA.AATGTA

GTTGAATCTACCCCAATTACAATTCAAGGTAAAGAACATTTTGAAGGTTACGGAAGTGTTGATATACAAAAAAACCCAAC

AGATTTAGGGGTATCAGAGGTAACCAGGTTTAATGTTGGTAATGAAAGTAATGGTTTGATAGGAGCTTTACAATTAAAAA

31/68

ATAAAATAGATTTTAGTAAGGATTTCAATTTTAAAGTTAGAGTGGCAAATAACCATCAATCAAATACCACAGGTGCTGAT

GGTTGGGGGTTCTTATTTAGTAAAGGAAATGCAGAAGAATATTTAACTAATGGTGGAATCCTTGGGGATAAAGGTCTGGT

AAATTCAGGCGGATTTAAAATTGATACTGGATACATTTATACAAGTTCCATGGACAAAACTGAAAAGCAAGCTGGACAAG

GTTATAGAGGATACGGAGCTTTTGTGAAAAATGACAGTTCTGGTAATTCACAAATGGTTGGAGAAAATATTGATAAATCA

AAAACTAATTTTTTAAACTATGCGGACAATTCAACTAATACATCAGATGGAAAGTTTCATGGGCAACGTTTAAATGATGT

CATCTTAACTTATGTTGCTTCAACTGGTAAAATGAGAGCAGAATATGCTGGTAAAACTTGGGAGACTTCAATAACAGATT

TAGGTTTATCTAAAAATCAGGCATATAATTTCTTAATTACATCTAGTCAAAGATGGGGCCTTAATCAAGGGATAAATGCA

AATGGCTGGATGAGAACTGACTTGAAAGGTTCAGAGTTTACTTTTACACCAGAAGCGCCAAAAACAATAACAGAATTAGA

AAAAAAAGTTGAAGAGATTCCATTCAAGAAAGAACGTAAATTTAATCCGGATTTAGCACCAGGGACAGAAAAAGTAACAA

GAGAAGGACAAAAAGGTGAGAAGACAATAACAACACCAACACTAAAAAA.TCCATTAACTGGAGAAATTATTAGTAAAGGT

GAATCGAAAGAAGAGATCACAAAAGATCCGATTAATGAATTAACAGAATACGGACCAGAAACGATAGCACCAGGTCATCG

AGACGAATTTGATCCGAAGTTACCAACAGGAGAGA.AAGAAGAAGTTCCAGGTAAACCAGGAATTAAGAATCCAGAAACAG

GAGACGTAGTTAGACCACCGGTCGATAGTGTAACA.AAATATGGACCTGTAAAAGGAGACTCGAT'TGTAGAAAA.AGAAGAA

ATTCCATTCGAGAAAGAACGTAAATTTAATCCTGATTTAGCACCAGGAACAGAAAAAGTAACAAGAGAAGGACAAAAAGG

TGAGAAGACAATAACGACACCAACACTAAAAAATCCATTAACTGGAGAAATTATTAGTAAAGGTGAATCGAAAGAAGAGA

TCACAAAAGATCCGATTAATGAATTAACAGAATACGGACCTGAAACAATAGCGCCAGGTCATCGAGACGAATTTGATCCG

AAGTTACCAACAGGAGAGAAAGAAGAAGTTCCAGGTAAACCAGGAATTAAGAATCCAGAAACAGGAGACGTAGTTAGACC

GCCGGTCGATAGCGTAACAAAATATGGACCTGTAAAAGGAGACTCGATTGTAGAAAAAGAAGAAATTCCATTCAAGAAAG

AACGTAAATTTAATCCTGATTTAGCACCAGGGACAGAAAAAGTAACAAGAGAAGGACAAAAAGGTGAGAAGACAATAACG

ACGCCAACACTAAAAAATCCATTAACTGGAGAAATTATTAGTAAAGGTGAATCGAAAGAAGAAATCACAAAAGATCCGAT

TAATGAATTAACAGAATACGGACCAGAAACGATAACACCAGGTCATCGAGACGAATTTGATCCGAAGTTACCAACAGGAG

AGAAAGAGGAAGTTCCAGGTAAACCAGGAATTAAGAATCCAGAAACAGGAGATGTAGTTAGACCACCGGTCGATAGCGTA

ACAA.AATATGGACCTGTAAAAGGAGACTCGATTGTAGAAAAAGAAGAAATTCCATTCGAGAAAGAACGTAAATTTAATCC

TGATTTAGCACCAGGGACAGAAAAAGTAACAAGAGAAGGACAAAAAGGTGAGAAGACAATAACGACGCCAACACTAAAAA

ATCCATTAACTGGAGAAATTATTAGTAAAGGTGAATCGAAAGAAGAAATCACAAAAGATCCAGTTAATGAATTAACAGAATTCGGTGGCGAGAAAATACCGCAAGGTCATAAAGATATCTTTGATCCAAACTTACCAACAGATCAAACGGAAAAAGTACC

AGGTAAACCAGGAATCAAGAATCCAGACACAGGAAAAGTGATCGAAGAGCCAGTGGATGATGTGATTAAACACGGACCAA

AAACGGGTACACCAGAAACAAAAACAGTAGAGATACCGTTTGAAACAAAACGTGAGTTTAATCCAAAATTACAACCTGGT

GAAGAGCGAGTGAAACAAGAAGGACAACCAGGAAGTAAGACAATCACAACACCAATCACAGTGAACCCATTAACAGGTGA

AAAAGTTGGCGAGGGTCAACCAACAGAAGAGATCACAAAACAACCAGTAGATAAGATTGTAGAGTTCGGTGGAGAGAAAC

CAAAAGATCCAAAAGGACCTGAAAACCCAGAGAAGCCGAGCAGACCAACTCATCCAAGTGGCCCAGTAAATCCTAACAAT

CCAGGATTATCGAAAGACAGAGCAAAACCAAATGGCCCAGTTCATTCAATGGATAAAAATGATAAAGTTAAAAAATCTAA

AATTGCTAAAGAATCAGTAGCTAATCAAGAGAAAAAACGAGCAGAATTACCAAAAACAGGTTTAGAAAGCACGCAAAAAG

GTTTGATCTTTAGTAGTATAATTGGAATTGCTGGATTAATGTTATTGGCTCGTAGAAGAAAGAATTAA

SEQ ID NO:50 seqüência de polinucleotídeoATGGGCAAACGTAGACAAGGTCCTATTAATAAAAAAGTGGATTTTTTACCTAACAAATTAAACAAGTATTCTATAAGAAA

ATTCACTGTTGGTACGGCCTCAATATTACTTGGTTCGACACTTATTTTTGGAAGTAGTAGCCATGAAGCGAAAGCTGCAG

AAGAAAAACAAGTTGATCCAATTACACAAGCTAATCAAAATGATAGTAGTGAAAGATCACTTGAAAACACAAATCAACCT

ACTGTAAACAATGAAGCACCACAGATGTCTTCTACATTGCAAGCAGAAGAAGGAAGCAATGCAGAAGCACCGAATGTTCC

AACTATCAAAGCTAATTCAGATAATGATACACAAACACAATTTTCAGAAGCCCCTACAAGAAATGACCTAGCTAGAAAAG

AAGATATCCCTGCTGTTTCTAAAAACGAGGAATTACAATCATCACAACCAAACACTGACAGTAAAATAGAACCTACAACT

TCAGAACCTGTGAATTTAAATTATAGTTCTCCGTTTATGTCCTTATTAAGCATGCCTGCTGATAGTTCATCCAATAACACTAAAAATACAATAGATATACCGCCAACTACGGTTAAAGGTAGAGATAATTACGATTTTTACGGTAGAGTAGATATCCAAAGTAATCCTACAGATTTAAATGCGACAAATTTAACGAGATATAATTATGGACAGCCACCTGGTACAACAACAGCTGGTGCAGTTCAATTTAAAAATCAAGTTAGTTTTGATAAAGATTTCGACTTTAACATTAGAGTAGCAAACAATCGTCAAAGTAATACAACTGGTGCAGATGGTTGGGGCTTTATGTTCAGCAAGAAAGATGGGGATGATTTCCTAAAAAACGGTGGTATCTTACGTG

AAAAAGGTACACCTAGTGCAGCTGGTTTCAGAATTGATACAGGATATTATAATAACGATCCATTAGATAAAATACAGAAA

CAAGCTGGTCAAGGCTATAGAGGGTATGGGACAT'TTGTTAAAAATGACTCCCAAGGTAATACTTCTAAAGTAGGATCAGG

TACTCCATCAACAGATTTTCTTAACTACGCAGATAATACTACTAATGATTTAGATGGTAAATTCCATGGTCAAAAATTAA

ATAATGTTAATTTGAAATATAATGCTTCAAATCAAACTTTTACAGCTACTTATGCTGGTAAAACTTGGACGGCTACGTTA

TCTGAATTAGGATTGAGTCCAACTGATAGTTACAATTTTTTAGTTACATCAAGTCAATATGGAAATGGTAATAGTGGTAC

ATACGCAGATGGCGTTATGAGAGCTGATTTAGATGGTGCAACATTGACATATACTCCTAAAGCAGTCGATGGAGACCCAA

TTACATCAACTAAGGAAATACCATTTAATAAAAAACGCGAATTTGATCCAAACTTAGCGCCAGGTACAGAAAAAGTCGTT

CAAAAAGGTGAACCAGGAATTGAAACAACAACAACACCAACTTATGTCAATCCTAATACTGGAGAAAAAGTAGGTGAAGG

CACACCTACAACAAAGATCACTAAACAACCAGTGGATGAAATCGTTCATTATGGTGGCGAAGAAATCAAGCCAGGACATA

AAGATGAATTTGATCCAAATGCACCGAAAGGTAGTCAAACAACGCAACCAGGTAAGCCAGGAGTTAAAAATCCTGATACAGGCGAAGTAGTCACACCACCAGTGGATGATGTGACAAAATATGGTCCAGTTGATGGAGATCCGATTACGTCAACGGAAGAAATTCCATTCGACAAGAAACGTGAATTCAATCCTGATTTAAAACCAGGTGAAGAGCGTGTTAAACAAAAAGGTGAACCAGGAACAAAAACAATTACAACACCAACAACTAAGAACCCATTAACAGGGGAAAAAGTTGGCGAAGGTGAACCAACAGAAAAA

ATAACAAAACAACCAGTAGATGAAATCACAGAATATGGTGGCGAAGAAATCAAGCCAGGCCATAAGGATGAATTTGATCC

32/68

GAACGCACCGAAAGGTAGCCAAGAGGACGTTCCAGGTAAACCAGGAGTTAAAAATCCTGATACAGGCGAAGTAGTCACAC

CACCAGTGGATGATGTGACAAAATATGGTCCAGTTGATGGAGATCCGATTACGTCAACGGAAGAAATTCCGTTTGATAAA

AAACGCGAATTTGATCCAAACTTAGCGCCAGGTACAGAGAAAGTCGTTCAAAAAGGTGAACCAGGAACAAAAACAATTAC

AACACCAACAACTAAGAACCCATTAACAGGAGAAAAAGTTGGCGAAGGTGAACCAACAGAAAAAATAACAAAACAACCAG

TGGATGAAATCGTTCATTATGGTGGCGAAGAAATCAAGCCAGGCCATAAGGATGAATTTGATCCGAACGCACCGAAAGGT

AGCCAAGAGGACGTTCCAGGTAAGCCAGGAGTTAAAAATCCTGATACAGGCGAAGTAGTCACACCACCAGTGGATGATGT

GACAAAATATGGTCCAGTTGATGGAGATCCGATTACGTCAACGGAAGAAATTCCATTCGACAAGAAACGTGAATTCAATC

CTGATTTAAAACCAGGTGAAGAGCGTGTTAAACAAAAAGGTGAACCAGGAACAAAAACAATTACAACACCAACAACTAAG

AACCCATTAACAGGGGAAAAAGTTGGCGAAGGTGAACCAACAGAAAAAGTAACAAAACAACCAGTGGATGAAATCGTTCA

TTATGGTGGCGAAGAAATCAAGCCAGGCCATAAGGATGAATTTGATCCAAATGCACCGAAAGGTAGCCAAGAAGACGTTC

CAGGTAAACCAGGAGTTAAAAACCCTGATACAGGCGAAGTAGTTACTCCACCAGTGGATGATGTGACAAAATATGGTCCA

GTTGATGGAGATCCGATTACGTCAACGGAAGAAATTCCGTTTGATAAAAAACGCGAATTTGATCCAAACTTAGCGCCAGG

TACAGAGAAAGTCGTTCAAAAAGGTGAACCAGGAACAAAAACAATTACAACACCAACAACTAAGAACCCATTAACAGGAG

AAAAAGTTGGCGAAGGTGAACCAACAGAAAAAATAACAAAACAACCAGTGGATGAGATCGTTCATTATGGTGGCGAAGAA

ATCAAGCCAGGCCATAAGGATGAATTTGATCCGAACGCACCGAAAGGTAGTCAAACAACGCAACCAGGTAAGCCAGGAGT

TAAAAATCCTGATACAGGCGAAGTAGTCACACCACCAGTGGATGATGTGACAAAATATGGTCCAGTTGATGGAGATCCGA

TTACGTCAACGGAAGAAATTCCGTTTGATAAAAAACGCGAATTTGATCCAAACTTAGCGCCAGGTACAGAGAAAGTCGTT

CAAAAAGGTGAACCAGGAACAAAAACAATTACAACGCCAACAACTAAGAACCCATTAACAGGAGAAAAAGTTGGCGAAGG

TGAACCAACAGAAAAAATAACAAAACAACCAGTGGATGAGATTGTTCATTATGGTGGTGAACAAATACCACAAGGTCATA

AAGATGAATTTGATCCAAATGCACCTGTAGATAGTAAAACTGAAGTTCCAGGTAAACCAGGAGTTAAAAATCCTGATACA

GGTGAAGTTGTTACCCCACCAGTGGATGATGTGACAAAATATGGTCCGAAAGTTGGTAATCCAATCACATCAACGGAAGA

GATTCCATTTGATAAGAAACGTGTATTTAATCCTGATTTAAAACCAGGTGAAGAGCGCGTTAAACAAAAAGGTGAACCAG

GAACAAAAACAATTACAACACCAATATTAGTTAATCCTATTACAGGAGAAAAAGTTGGCGAAGGTAAATCAACAGAAAAA

GTCACTAAACAACCTGTTGACGAAATTGTTGAGTATGGTCCAACAAAAGCAGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTAA

ACCAGCGGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTACGCCAGCAGAACCAGGTAAACCAGCGG

AACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGT

ACGCCAGCAGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTACGCCAGC

AGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTACGCCAGCAGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTACGCCAACACAATCAG

GTGCACCAGAACAACCAAATAGATCAATGCATTCAACAGATAATAAAAATCAATTACCTGATACAGGTGAAAATCGTCAA

GCTAATGAGGGAACTTTAGTCGGATCTCTATTAGCAATTGTCGGATCATTGTTCATATTTGGTCGTCGTAAAAAAGGTAA

TGAAAAATAA

SEQ ID NO:51 seqüência de polinucleotídeoATGAAGAAACTATATACATCTTATGGCACTTATGGATTTTTACATCAAATAAAAATCAATAACCCGACCCATCAACTATT

CCAATTTTCAGCATCAGATACTTCAGTTATTTTTGAAGAAACTGATGGTGAGACTGTTTTAAAATCACCTTCAATATATG

-AAGTTATTAAAGAAATTGGTGAATTCAGTGAACATCATTTCTATTGTGCAATCTTCATTCCTTCAACAGAAGATCATGCA

TATCAACTTGAAAAGAAACTGATTAGTGTAGACGATAATTTCAGAAACTTTGGTGGCTTTAAAAGCTATCGTTTGTTAAG

ACCTGCTAAAGGTACAACATATAAAATTTATTTCGGATTTGCTGATCGACATGCATACGAAGACTTTAAGCAATCTGATG

CCTTTAATGACCATTTTTCAAAAGACGCATTAAGTCATTACTTTGGTTCAAGCGGACAACATTCAAGTTATTTTGAAAGA

TATCTATACCCAATAAAAGAATAG

SEQ ID NO:52 seqüência de polinucleotídeoATGTATTTATATACATCTTATGGGACTTACCAATTTTTAAATCAAATTAAACTTAATCATCAAGAACGTAGTTTATTTCA

ATTTTCCACTAATGATTCCTCAATAATCTTAGAAGAGTCTGAGGGAAAATCAATCTTAAAACATCCTAGTGCATATCAAGTGATTGATAGCACAGGTGAATTTAACGAACATCATTTTTATAGTGCTATTTTTGTCCCTACATCTGAAGATCATCGTCAA

CAGCTAGAGAAAAAATTATTACTCGTAGACGTACCTTTAAGAAATTTTGGTGGTTTTAAAAGCTATCGTTTATTAAAACC

CACTGAGGGGTCTACCTACAAAATTTACTTTGGTTTTGCAAATCGAACAGCATATGAAGATTTCAAAGCTTCTGATATAT

TTAATGAAAACTTTTCAAAAGATGCATTGAGCCAATACTTTGGTGCTAGTGGTCAACATTCTAGCTACTTTGAAAGATAT

TTATATCCAATAGAAGATCATTAA

SEQ ID NO:53 seqüência de polinucleotídeoATGATTAACAGGGATAATAAAAAGGCAATAACAAAAAAGGGTATGATTTCAAATCGCTTAAACAAATTTTCGATTAGAAA

GTATACTGTAGGAACTGCATCGATTTTAGTAGGTACGACATTGATTTTTGGTCTAGGGAACCAAGAAGCTAAAGCTGCTG

AAAACACTAGTACAGAAAATGCGAAACAAGATGATGCAACGACTAGTGATAATAAAGAAGTAGTGTCGGAAACTGAAAAT

AATTCGACAACAGAAAATGATTCAACAAATCCAATTAAGAAAGAAACAAATACTGATTCACAACCAGAAGCTAAAGAAGA

ATCAACTACATCAAGTACTCAACAACAGCAAAATAACGTTACAGCTACAACTGAAACTAAGCCTCAAAACATTGAAAAAG

AAAATGTTAAACCTTCAACTGATAAAACTGCGACAGAAGATACATCTGTTATTTTAGAAGAGAAGAAAGCACCAAATTAT

ACAAATAACGATGTAACTACAAAACCATCTACAAGTGAAATTCAAACAAAACCAACTACACCTCAAGAATCTACAAATAT

TGAAAATTCACAACCGCAACCAACGCCTTCAAAAGTAGACAATCAAGTTACAGATGCAACTAATCCAAAAGAACCAGTAA

ATGTGTCAAAAGAAGAACTTAAAAATAATCCTGAGAAATTAAAAGAATTAGTTAGAAATGATAACAATACAGATCGTTCA

33/68

ACTAAACCAGTTGCTACAGCTCCAACAAGTGTTGCACCAAAACGATTAAATGCGAAAATGCGTTTTGCAGTTGCACAACC

AGCAGCAGTTGCTTCAAATAATGTAAATGACTTAATTACAGTTACGAAACAGACGATCAAAGTTGGCGATGGTAAAGATA

ATGTGGCAGCAGCGCATGACGGTAAAGATATTGAATATGATACAGAGTTTACAATTGACAATAAAGTCAAAAAAGGCGAT

ACAATGACGATTAATTATGATAAGAATGTAATTCCTTCGGATTTAACAGATAAAAATGATCCTATCGATATTACTGATCC

ATCAGGAGAGGTCATTGCCAAAGGAACATTTGATAAAGCGACTAAGCAAATCACATATACATTTACAGATTATGTAGATA

AATATGAAGATATAAAAGCACGTTTAACTTTATACTCATATATTGATAAGCAAGCAGTACCTAATGAAACTAGTTTGAAT

TTAACGTTTGCAACAGCAGGTAAAGAAACTAGCCAAAACGTTTCTGTTGATTATCAAGACCCAATGGTTCATGGTGATTC

AAACATTCAATCTATCTTTACAAAGTTAGATGAAAACAAACAAACTATTGAACAACAAATTTATGTTAATCCTTTGAAAA

AAACAGCAACTAACACTAAAGTTGATATAGCTGGTAGTCAAGTAGATGATTATGGAAATATTAAACTAGGAAATGGTAGT

ACCATTATTGACCAAAATACAGAAATAAAAGTTTATAAAGTTAACCCTAATCAACAATTGCCTCAAAGTAATAGAATCTA

TGATTTTAGTCAATACGAAGATGTAACAAGTCAATTTGATAATAAAAAATCATTTAGTAATAATGTAGCAACATTGGATT

TTGGTGATATTAATTCAGCCTATATTATCAAAGTTGTTAGTAAATATACACCTACATCAGATGGCGAACTAGATATTGCT

CAAGGTACTAGTATGAGAACAACTGATAAATATGGTTATTATAATTATGCAGGATATTCAAACTTCATCGTAACTTCTAA

TGACACTGGCGGTGGCGACGGTACTGTTAAACCTGAAGAAAAGTTATACAAAATTGGTGACTATGTATGGGAAGACGTTG

ATAAAGACGGTGTCCAAGGTACAGATTCGAAAGAAAAGCCAATGGCAAACGTTTTAGTTACATTAACTTACCCGGACGGT

ACTACAAAATCAGTAAGAACAGATGCTAACGGTCATTATGAATT CGGTGGTTTGAAAGACGGAGAAACTTATACAGTTAA

ATTCGAAACGCCAGCTGGATATCTTCCAACAAAAGTAAATGGAACAACTGATGGTGAAAAAGACTCAAATGGTAGTTCTA

TAACTGTTAAAATTAATGGTAAAGATGATATGTCTTTAGACACTGGTTTTTATAAAGAACCTAAATATAATCTTGGTGAC

TATGTATGGGAAGATACAAATAAAGATGGTATCCAAGATGCTAATGAACCTGGTATCAAAGATGTTAAGGTTACATTAAA

AGATAGTACTGGAAAAGTTATTGGTACAACTACTACTGATGCCTCGGGTAAATATAAATTTACAGATTTAGATAATGGTA

ACTATACAGTAGAATTTGAAACACCAGCAGGTTACACGCCAACGGTTAAAAATACTACAGCTGAAGATAAAGATTCTAAT

GGTTTAACAACAACAGGTGTCATTAAAGATGCAGATAATATGACATTAGACAGTGGTTTCTATAAAACACCAAAATACAG

TTTAGGTGATTATGTTTGGTACGACAGTAATAAAGACGGTAAACAAGATTCAACTGAAAAAGGTATCAAAGATGTTAAAG

TTACTTTAT TAAATGAAAAAGGCGAAGTAAT TGGAACAACTAAAACAGATGAAAATGGTAAATATCGTTTCGATAATTTA

GATAGCGGTAAATACAAAGTTATTTTTGAAAAG CCTGCTGGCTTAACACAAACAGTTACAAATACAACTGAAGATGATAA

AGATGCCGATGGTGGCGAAGTTGACGTAACAATTACGGATCATGATGATTTCATACTTGATAACGGATACTTCGAAGAAG

ATACATCAGACAGTGATTCAGACTCAGACAGTGATTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCAGACAGTGATTCAGACTCA

GATAGCGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGACTCAGATAG CGACTCAGACT CAGACAGCGACTCAGACTCAGATAGCGA

CTCAGATTCGGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATT

CAGACAGTGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGACTCAGACAGTGACTCAGACTCAGACAGCGATTCAGATTCAGATAGC

GACTCAGATTCGGACAGTGATTCAGACTCAGATAGCGACT CAGATTCAGACAGCGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGA

CTCAGACAGTGATTCAGACTCAGATAGCGATTCGGACTCGGATGCAGGAAAACATACACCTGTTAAACCAATGAGTACTA

CTAAAGACCATCACAATAAAGCAAAAGCATTACCAGAAACAGGTAGTGAAAATAACGGCTCAAATAACGCAACGTTATTT

GGTGGATTATTTGCAGCATTAGGTTCATTATTGTTATTCGGTCGTCGCAAAAAACAAAACAAATAA

SEQ ID NO:54 seqüência de polinucleotídeoATGATTAATAAAAAAAATAATTTACTAACTAAAAAGAAACCTATAGCAAATAAATCCAATAAATATGCAATTAGAAAATT

CACAGTAGGTACAGCGTCTATTGTAATAGGTGCAACATTATTGTTTGGTTTAGGTCATAATGAGGCCAAAGCCGAGGAGA

ATTCAGTACAAGACGTTAAAGATTCGAATACGGATGATGAATTATCAGACAGCAATGATCAGTCTAGTGATGAAGAAAAG

AATGATGTGAT CAATAATAATCAGTCAATAAACACCGACGATAATAACCAAATAATTAAAAAAGAAGAAACGAATAACTA

CGATGGCATAGAAAAACGCTCAGAAGATAGAACAGAGTCAACAACAAATGTAGATGAAAACGAAGCAACATTTTTACAAA

AGACCCCTCAAGATAATACTCATCTrACAGAAGAAGAGGTAAAAGAATCCTCATCAGTCGAATCCTCAAATTCATCAATT

GATACTGCCCAACAACCATCTCACACAACAATAAATAGAGAAGAATCTGTTCAAACAAGTGATAATGTAGAAGATTCACA

CGTATCAGATTTTGCTAACTCTAAAATAAAAGAGAGTAACACTGAATCTGGTAAAGAAGAGAATACTATAGAGCAACCTA

ATAAAGTAAAAGAAGAT TCAACAACAAGTCAGC CGTCTGGCTATACAAATATAGATGAAAAAATTTCAAATCAAGATGAG

TTATTAAATTTACCAATAAATGAATATGAAAATAAGGCTAGACCATTATCTACAACATCTGCCCAACCATCGATTAAACG

TGTAACCGTAAATCAATTAGCGGCGGAACAAGGTTCGAATGTTAATCATTTAATTAAAGTTACTGATCAAAGTATTACTG

AAGGATATGATGATAGTGAAGGTGTTATTAAAGCACATGATGCTGAAAACTTAATCTATGATGTAACTTTTGAAGTAGAT

GATAAGGTGAAATCTGGTGATACGATGACAGTGGATATAGATAAGAATACAGTTCCATCAGATTTAACCGATAGCTTTAC

AATACCAAAAATAAAAGATAATTCTGGAGAAATCATCGCTACAGGTACTTATGATAACAAAAATAAACAAATCACCTATA

CTTTTACAGATTATGTAGATAAGTATGAAAATATTAAAGCACACCTTAAATTAACGTCATACATTGATAAATCAAAGGTT

CCAAATAATAATACCAAGT TAGATGTAGAATATAAAACGGCCCT TTCATCAGTAAATAAAACAATTACGGTTGAATATCA

AAGACCTAACGAAAATCGGACTGCTAACCTTCAAAGTATGTTTACAAACATAGATACGAAAAATCATACAGTTGAGCAAA

CGATTTATATTAACCCTCTTCGTTATTCAGCCAAGGAAACAAATGTAAATATTTCAGGGAATGGTGATGAAGGTTCAACA

ATTATAGACGATAGCACAATAATTAAAGTTTATAAGGTTGGAGATAATCAAAATTTACCAGATAGTAACAGAATTTATGA

TTACAGTGAATATGAAGATGTCACAAATGATGATTATGCCCAATTAGGAAATAATAATGATGTGAATATTAATTTTGGTA

ATATAGATTCACCATATATTATTAAAGTTATTAGTAAATATGACCCTAATAAGGATGATTACACGACTATACAGCAAACT

GTGACAATGCAGACGACTATAAATGAGTATACTGGTGAGTTTAGAACAGCATCCTATGATAATACAATTGCTTTCTCTAC

AAGTTCAGGTCAAGGACAAGGTGACTTGCCTCCTGAAAAAACTTATAAAATCGGAGATTACGTATGGGAAGATGTAGATA

AAGATGGTATTCAAAATACAAATGATAATGAAAAACCGCTTAGTAATGTATTGGTAACTTTGACGTATCCTGATGGAACT

TCAAAATCAGTCAGAACAGATGAAGATGGGAAATATCAATTTGATGGATTGAAAAACGGATTGACTTATAAAATTACATT

34/68

CGAAACACCTGAAGGATATACGCCGACGCTTAAACATTCAGGAACAAATCCTGCACTAGACTCAGAAGGTAATTCTGTAT

GGGTAACTATTAATGGACAAGACGATATGACGATTGATAGTGGATTTTATCAAACACCTAAATACAGCTTAGGGAACTAT

GTATGGTATGACACTAATAAAGATGGTATTCAAGGTGATGATGAAAAAGGAATCTCTGGAGTTAAAGTGACGTTAAAAGA

TGAAAACGGAAATATCATTAGTACAACTACAACCGATGAAAATGGAAAGTATCAATTTGATAATTTAAATAGTGGTAATT

ATATTGTTCATTTTGATAAACCTTCAGGTATGACTCAAACAACAACAGATTCTGGTGATGATGACGAACAGGATGCTGAT

GGGGAAGAAGTTCATGTAACAATTACTGATCATGATGACTTTAGTATAGATAACGGATACTATGATGACGAATCGGATTC

CGATAGTGACTCAGACAGCGACTCAGATTCCGATAGTGATTCAGACTCCGATAGCGACTCGGATTCAGACAGCGACTCAG

ATTCAGACAGCGACTCGGATTCTGATAGCGACTCGGATTCAGACAGCGACTCAGACTCAGACAGTGATTCAGATTCAGAC

AGCGACTCAGATTCCGATAGTGATTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCTGATAGTGATTCAGACTCAGACAGTGATTC

AGATTC.AGACAGCGACTCAGATTCCGATAGTGATTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCCGATAGTGATTCAGACTCAG

ACAGCGACTCAGATTCTGATAGTGATTCAGACTCAGACAGTGATTCAGATTCCGATAGTGATTCAGACTCCGATAGCGAC

TCAGACTCGGATAGTGACTCAGATTCTGATAGTGATTCAGACTCAGACAGTGATTCGGATTCCGATAGTGATTCAGACTC

AGACAGCGACTCAGATTCTGATAGTGATTCAGACTCAGACAACGACTCAGATTTAGGCAATAGCTCAGATAAGAGTACAA

AAGATAAATTACCTGATACAGGAGCTAATGAAGATTATGGCTCTAAAGGCACGTTACTTGGAACTCTGTTTGCAGGTTTA

GGAGCGTTATTATTAGGGAAACGTCGCAAAAATAGAAAAAATAAAAATTAA

SEQ ID NO:55 seqüência de polinucleotídeoATGTCTAATAATTTTAAAGATGACTTTGAAAAAAATCGTCAATCGATAGACACAAATTCACATCAAGACCATACGGAAGA

TGTTGAAAAAGACCAATCAGAATTAGAACATCAGGATACAATAGAGAATACGGAGCAACAGTTTCCGCCAAGAAATGCCC

AAAGAAGAAAAAGACGCCGTGATTTAGCAACGAATCATAATAAACAAGTTCACAATGAATCACAAACATCTGAAGACAAT

GTTCAAAATGAGGCTGGCACAATAGATGATCGTCAAGTCGAATCATCACACAGTACTGAAAGTCAAGAACCTAGCCATCA

AGACAGTACACCTCAACATGAAGAGGAATATTATAATAAGAATGCTTTTGCAATGGATAAATCACATCCAGAACCAATCG

AAGACAATGATAAACACGAGACTATTAAAGATGCAGAAAATAACACTGAGCATTCAACAGTTTCTGATAAGAGTATAGCT

GAACAATCTCAGCAACCTAAACCATATTTTGCAACAGGTGCTAACCAAGCAAATACATCAAAAGATAAACATGATGATGT

AACTGTTAAGCAAGACAAAGATGAATCTAAAGATCATCATAGTGGTAAAAAAGGCGCAGCAATTGGTGCTGGAACAGCGG

GTGTTGCAGGTGCAGCTGGTGCAATGGGTGTTTCTAAAGCTAAGAAACATTCAAATGACGCTCAAAACAAAAGTAATTCT

GACAAGTCGAATAACTCGACTGAGGATAAAGCGTCTCAAGATAAGTCTAAAGATCATCATAATGGCAAAAAAGGTGCAGC

GATCGGTGCTGGAACAGCAGGTTTGGCTGGAGGCGCAGCAAGTAAAAGTGCTTCTGCCGCTTCAAAACCACATGCCTCTA

ATAATGCAAGCCAAAACCATGATGAACATGACAATCATGACAGAGATAAAGAACGTAAAAAAGGTGGCATGGCCAAAGTA

TTGTTACCATTAATTGCAGCTGTACTAATTATCGGTGCATTAGCGATATTTGGAGGCATGGCATTAAACAATCATAATAA

TGGTACAAAAGAAAATAAAATCGCGAATACAAATAAAAATAATGCTGATGAAAGTAAAGACAAAGACACATCTAAAGACG

CTTCTAAAGATAAATCAAAATCTACAGACAGTGATAAATCAAAAGAGGATCAAGACAAAGCGACTAAAGATGAATCTGAT

AATGATCAAAACAACGCTAATCAAGCGAACAATCAAGCACAAAATAATCAAAATCAACAACAAGCTAATCAAAATCAACA

ACAGCAACAACAACGTCAAGGTGGTGGCCAAAGACATACAGTGAATGGTCAAGAAAACTTATACCGTATCGCAATTCAAT

ACTACGGTTCAGGTTCACCGGAAAATGTTGAAAAAATTAGACGTGCCAATGGTTTAAGTGGTAACAATATTAGAAACGGT

CAACAAATCGTTATTCCATAA

SEQ ID NO:56 seqüência de polinucleotídeoGTGATTGAATTAATTAAAATGGAAGGGATGATAGTTGTGTCTAATAATAATTTTAAAGATGATTTCGAAAAGAATCGTCA

ATCTATTAATCCAGACGAACAGCAAACAGAATTAAAAGAAGATGATAAAACAAATGAAAATAAAAAAGAAGCTGACTCTC

AAAACAGTTTATCTAATAACTCAAATCAACAATTTCCTCCGAGAAATGCCCAACGACGAAAAAGACGTAGAGAGACAGCA

ACTAATCAAAGCAAACAACAAGACGACAAACATCAAAAAAATAGTGACGCTAAAACTACAGAAGGTTCATTAGATGACCG

TTATGACGAAGCACAGTTACAGCAACAACATGATAAATCGCAACAACAAAATAAAACTGAAAAACAATCACAAGATAATA

GAATGAAAGATGGAAAAGATGCAGCTATTGTAAATGGAACATCTGAGTCACCAGAACATAAATCAAAATCAACACAAAAT

AGACCCGGCCCTAAAGCTCAACAACAAAAGCGTAAATCAGAAAGTACGCAATCAAAACCGTCAACAAACAAAGATAAAAA

AGCAGCTACAGGTGCTGGAATAGCTGGTGCAGCTGGTGTTGCTGGTGCAGCAGAAACATCCAAACGTCATCATAATAAAA

AAGATAAACAAGATTCTAAACACTCAAACCATGAGAATGACGAAAAATCTGTTAAAAATGATGACCAAAAGCAATCTAAA

AAAGGCAAAAAAGCAGCAGTCGGTGCTGGCGCAGCTGCAGGAGTTGGTGCGGCTGGTGTTGCGCATCATAATAATCAAAA

TAAACATCATAATGAGGAAAAAAATTCTAATCAAAACAATCAGTACAATGACCAATCAGAAGGTAAGAAAAAAGGTGGTT

TCATGAAAATCTTGTTACCACTTATAGCAGCCATTCTTATTCTAGGTGCAATAGCAATATTCGGTGGTATGGCTCTAAAT

AATCACAACGATAGTAAAAGTGATGACCAAAAAATAGCGAATCAAAGTAAGAAAGACTCAGATAAAAAAGATGGTGCGCA

ATCCGAAGATAACAAAGACAAAAAATCTGATAGTAACAAAGACAAAAAATCTGATTCTGATAAGAACGCAGATGATGACT

CTGATAATAGTTCCTCAAATCCTAACGCTACTTCAACTAATAATAACGATAATGTAGCCAATAATAACTCAAATTATACA

AACCAAAATCAACAAGATAATGCAAACCAAAATAGCAATAATCAACAGGCAACTCAAGGTCAACAATCACATACAGTATA

CGGTCAAGAAAACTTATATCGTATCGCCATACAATATTATGGAGAAGGAACTCAAGCTAACGTAGATAAAATTAAACGTG

CGAATGGATTAAGCAGTAATAATATTCATAATGGTCAAACATTAGTTATTCCTCAATAA

SEQ ID NO:57 seqüência de polinucleotídeoATGAAAAATAAATTGATAGCAAAATCTTTATTAACAATAGCGGCAATTGGTATTACTACAACTACAATTGCGTCAACAGC

AGATGCGAGCGAAGGATACGGTCCAAGAGAAAAGAAACCAGTGAGTATTAATCACAATATCGTAGAGTACAATGATGGTA

35/68

CTTTTAAATATCAATCTAGACCAAAATTTAACTCAACACCTAAATATATTAAATTCAAACATGACTATAATATTTTAGAA

TTTAACGATGGTACATTCGAATATGGTGCACGTCCACAATTTAATAAACCAGCAGCGAAAACTGATGCAACTATTAAAAA

AGAACAAAAATTGATTCAAGCTCAAAATCTTGTGAGAGAATTTGAAAAAACACATACTGTCAGTGCACACAGAAAAGCAC

AAAAGGCAGTCAACTTAGTTTCGTTTGAATACAAAGTGAAGAAAATGGTCTTACAAGAGCGAATTGATAATGTATTAAAA

CAAGGATTAGTGAGATAA

SEQ ID NO:58 seqüência de polinucleotídeoATGAAAACACGTATAGTCAGCTCAGTAACAACAACACTATTGCTAGGTTCCATATTAATGAATCCTGTCGCTAATGCCGC

AGATTCTGATATTAATATTAAAACC GGTACTACAGATATTGGAAGCAATACTACAGTAAAAACAGGTGATT TAGTCACTT

ATGATAAAGAAAATGGCATGCACAAAAAAGTATTTTATAGTTTTATCGATGATAAAAATCACAATAAAAAACTGCTAGTT

ATTAGAACGAAAGGTACCATTGCTGGTCAATATAGAGTT TATAGCGAAGAAGGTGCTAACAAAAGTGGTTTAGCCTGGCC

TTCAGCCTTTAAGGTACAGTTGCAACTACCTGATAATGAAGTAGCTCAAATATCTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG

ATACAAAAGAGTATATGAGTACTTTAACTTATGGATTCAACGGTAATGTTACTGGTGATGATACAGGAAAAATTGGCGGC

CTTATTGGTGCAAATGTTTCGATTGGTCATACACTGAAATATGTTCAACCTGATTTCAAAACAATTT'TAGAGAGCCCAAC

TGATAAAAAAGTAGGCTGGAAAGTGATATTTAACAATATGGTGAATCAAAAT'TGGGGACCATATGATAGAGATTCTTGGA

ACCCGGTATATGGCAATCAACTTTTCATGAAAACTAGAAATGGTTCTATGAAAGCAGCAGAGAACTTCCTTGATCCTAAC

AAAGCAAGTTCTCTATTATCTTCAGGGTTTTCACCAGACTTCGCTACAGTTATTACTATGGATAGAAAAGCATCCAAACA

ACAAACAAATATAGATGTAATATACGAACGAGTTCGTGATGACTACCAATTGCATTGGACTTCAACAAATTGGAAAGGTA

CCAATACTAAAGATAAATGGACAGATCGTTCTTCAGAAAGATATAAAATCGATTGGGAAAAAGAAGAAATGACAAATTAA

SEQ ID NO:59 seqüência de polinucleotídeoATACACATGAAAAATAAATATATCTCGAAGTTGCTAGTTGGGGCAGCAACAATTACTTTAGCTACAATGATTTCAAATGG

GGAAGCAAAAGCGAGTGAAAACACGCAACAAACTTCAACTAAGCACCAAACAACTCAAAACAAC TACGTAACAGATCAAC

AAAAAGCTTTTTATCAAGTATTACATCTAAAAGGTATCACAGAAGAACAACGTAAC CAATACATCAAAACATTACGCGAA

CACCCAGAACGTGCACAAGAAGTATTCTCTGAATCAC TTAAAGACAGCAAGAACCCAGACCGACGTGTTGCACAACAAAA

CGCTTTTTACAATGTTCTTAAAAATGATAACTTAACTGAACAAGAAAAAAATAATTACATTGCACAAATTAAAGAAAACC

C TGATAGAAGCCAACAAGTTTGGGTAGAATCAGTACAATC TTCTAAAGCTAAAGAACGTCAAAATATTGAAAATGCGGAT

AAAGCAATTAAAGAT TTCCAAGATAACAAAGCAC CACACGATAAATCAGCAGCATATGAAGCTAACTCAAAATTACCTAA

AGATTTACGCGATAAAAATAACCGC TTTGTAGAAAAAGTTTCAATTGAAAAAGCAATCGTTCGTCATGATGAGCGTGTGA

AATCAGCAAATGATGCAATCTCAAAATTAAATGAAAAAGATTCAATTGAAAACAGACGTTTAGCACAACGTGAAGTTAAC

AAAGCACCTATGGATGTAAAAGAGCATTTACAGAAACAATTAGACGCATTAGTAGCTCAAAAAGATGCTGAAAAGAAAGT

GGCGCCAAAAGTTGAGGCTCCTCAAATTCAATCACCACAAATTGAAAAACCTAAAGCAGAATCACCAAAAGTTGAAGTCC

CTCAATCTAAATTATTAGGTTACTACCAATCATTAAAAGATTCATT'TAACTATGGTTACAAGTATTTAACAGATACTTAT

AAAAGCTATAAAGAAAAATATGATACAGCAAAGTACTACTATAATACGTACTATAAATACAAAGGTGCGATTGATCAAAC

AGTATTAACAGTACTAGGTAGTGGTTCTAAATCTTACATCCAACCATTGAAAGTTGATGATAAAAACGGCTACTTAGCTA

AATCATATGCACAAGTAAGAAACTATGTAACTGAGTCAATCAATACTGGTAAAGTATTATATACTTTCTACCAAAACCCA

ACATTAGTAAAAACAGCTATTAAAGCTCAAGAAACTGCATCATCAATCAAAAATACATTAAGTAATTTATTATCATTCTG

GAAATAA

SEQ ID NO:60 seqüência de polinucleotídeoATGACAAAACATTATTTAAACAGTAAGTATCAATCAGAACAACGTTCATCAGCTATGAAAAAGATTACAATGGGTACAG C

ATCTATCATTTTAGGTTCCCTTGTATACATAGGCGCAGACAGCCAACAAGTCAATGCGGCAACAGAAGCTACGAACGCAA

CTAATAATCAAAGCACACAAGTTTCTCAAGCAACATCACAACCAATTAATTTCCAAGTGCAAAAAGATGGCTCTTCAGAG

AAGTCACACATGGATGACTATATGCAACACC C TGGTAAAGTAATTAAACAAAATAATAAATATTATTTCCAAACCGTGTT

AAACAATGCATCATTCTGGAAAGAATACAAATTTTACAATGCAAACAATCAAGAATTAGCAACAACTGTTGTTAACGATA

ATAAAAAAGCGGATACTAGAACAATCAATGTTGCAGTTGAACCTGGATATAAGAGCTTAACTACTAAAGTACATATTGTC

GTGCCACAAATTAATTACAATCATAGATATACTACGCATTTGGAATTTGAAAAAGCAATTCCTACATTAGCTGACGCAGC

AAAACCAAACAATGTTAAACCGGTTCAACCAAAACCAGCTCAACCTAAAACACCTACTGAGCAAACTAAACCAGTTCAAC

C TAAAGTTGAAAAAGTTAAACCTACTGTAACTACAACAAGCAAAGTTGAAGACAATCACTCTACTAAAGTTGTAAGTACT

GACACAACAAAAGATCAAACTAAAACACAAACTGCTCATACAGTTAAAACAGCACAAACTGCTCAAGAACAAAATAAAGT

TCAAACACCTGTTAAAGATGTTGCAACAGCGAAATCTGAAAGCAACAATCAAGCTGTAAGTGATAATAAATCACAACAAA

CTAACAAAGTTACAAAACATAACGAAACGCCTAAACAAGCATCTAAAGCTAAAGAATTACCAAAAACTGGTTTAACTTCA

GTTGATAACTTTATTAGCACAGTTGCCTTCGCAACACTTGCCCTTTTAGGTTCATTATCTTTATTACTTTTCAAAAGAAA

AGAATCTAAATAA

SEQ ID NO:61 seqüência de polinucleotídeoATGAACAAACAGCAAAAAGAATTTAAATCATTTTATTCAATTAGAAAGTCATCACTAGGCGTTGCATCTGTAGCGATTAG

TACACTTTTATTATTAATGTCAAATGGCGAAGCACAAGCAGCAG CTGAAGAAACAGGTGGTACAAATACAGAAGCACAAC

CAAAAACTGAAGCAGTTGCAAGTCCAACAACAACATCTGAAAAAGCTCCAGAAACTAAACCAGTAGCTAATGCTGTCTCA

36/68

GTATCTAATAAAGAAGTTGAGG C CCCTACTTCTGAAACAAAAGAAG CTAAAGAAGTTAAAGAAGTTAAAGC CC CTAAGGA

AACAAAAGCAGTTAAACCAGCAGCAAAAGCCACTAACAATACATATCC TATTTTGAATCAGGAACTTAGAGAAGCGATTA

AAAACC C TGCAATAAAAGATAAAGATCATAGCGCACCAAACTCTCGTCCAATTGATTTTGAAATGAAAAAAGAAAATGGT

GAGCAACAATTTTATCATTATGCCAGC TC TGTTAAACCTGC TAGAGTTATTTTCAC TGATTCAAAACCAGAAATTGAATT

AGGATTACAATCAGGTCAATTTTGGAGAAAATTTGAAGTTTATGAAGGTGACAAAAAGTTGCCAATTAAATTAGTATCAT

ACGATACTGTTAAAGATTACGC TTACATTCGC TTC TC TGTTTCAAATGGAACAAAAGCCGTTAAAATTGTAAGTTCAACT

CACTTCAATAACAAAGAAGAAAAATACGATTACACATTAATGGAATTCGCACAACCAATTTATAACAGTGCAGATAAATT

CAAAACTGAAGAAGATTATAAAGC TGAAAAATTATTAGCGCCATATAAAAAAGCGAAAACAC TAGAAAGACAAGTTTATG

AATTAAATAAAATTCAAGATAAAC TTCCTGAAAAATTAAAGGCTGAGTACAAGAAGAAATTAGAGGATACAAAGAAAGC T

TTAGATGAGCAAGTGAAATCAGCTATTAC TGAATTCCAAAATGTACAACCAACAAATGAAAAAATGAC TGATTTACAAGA

TACAAAATATGTTGTTTATGAAAGTGTTGAGAATAACGAATCTATGATGGATACTTTTGTTAAACACCC TATTAAAACAG

GTATGCTTAACGGCAAAAAATATATGGTCATGGAAAC TAC TAATGACGATTACTGGAAAGATTTCATGGTTGAAGGTCAA

CGTGTTAGAACTATAAGCAAAGATGC TAAAAATAATAC TAGAACAATTATTTTC C CATATGTTGAAGGTAAAAC TCTATA

TGATGCTATCGTTAAAGTTCACGTAAAAACGATTGATTATGATGGACAATACCATGTCAGAATCGTTGATAAAGAAGCAT

TTACAAAAGCCAATACCGATAAATCTAACAAAAAAGAACAACAAGATAACTCAGCTAAGAAGGAAGCTACTCCAGCTACG

C CTAGCAAAC CAACACCATCAC C TGTTGAAAAAGAATCACAAAAACAAGACAGC CAAAAAGATGACAATAAACAATTAC C

AAGTGTTGAAAAAGAAAATGACGCATC TAGTGAGTCAGGTAAAGACAAAACGC CTGC TACAAAACCAACTAAAGGTGAAG

TAGAATCAAGTAGTACAAC TC CAACTAAGGTAGTATC TACGACTCAAAATGTTGCAAAACCAACAACTGC TTCATCAAAA

ACAACAAAAGATGTTGTTCAAACTTCAGCAGGTTCTAGCGAAGCAAAAGATAGTGCTCCATTACAAAAAGCAAACATTAA

AAACACAAATGATGGACACACTCAAAGCCAAAACAATAAAAATACACAAGAAAATAAAGCAAAATCATTACCACAAACTG

GTGAAGAATCAAATAAAGATATGACATTAC CATTAATGG CATTACTAGCTTTAAGTAGCATCGTTGCATTCGTATTAC CT

AGAAAACGTAAAAACTAA

SEQ ID NO:62 seqüência de polinucleotídeoATGAATAATAAAAAGACAGCAACAAATAGAAAAGGCATGATACCAAATCGATTAAACAAATTTTCGATAAGAAAGTATTC

TGTAGGTAC TGCTTCAATTTTAGTAGGGACAACATTGATTTTTGGGTTAAGTGGTCATGAAGC TAAAGCGGCAGAACATA

CGAATGGAGAATTAAATCAATCAAAAAATGAAACGACAGC C C CAAGTGAGAATAAAACAACTGAAAAAGTTGATAGTCGT

CAACTAAAAGACAATACGCAAACTGCAAC TGCAGATCAGCCTAAAGTGACAATGAGTGATAGTGCAACAGTTAAAGAAAC

TAGTAGTAACATGCAATCACCACAAAACGCTACAGCTAGTCAATCTACTACACAAACTAGCAATGTAACAACAAATGATA

AATCATCAACTACATATAGTAATGAAACTGATAAAAGTAATTTAACACAAGCAAAAAACGTTTCAACTACAC C TAAAACA

ACGACTATTAAACAAAGAGCTTTAAATCGCATGGCAGTGAATACTGTTGCAGC TC CACAACAAGGAACAAATGTTAATGA

TAAAGTACATTTTACGAACATTGATATTGCGATTGATAAAGGACATGTTAATAAAACAACAGGAAATACTGAATTTTGGG

CAACTTCAAGTGATGTTTTAAAATTAAAAGCGAATTACACAATCGATGATTCTGTTAAAGAGGGCGATACATTTAC TTTT

AAATATGGTCAATATTTCCGTCCAGGTTC TGTAAGATTACCTTCACAAACTCAAAATTTATATAATGCCCAAGGTAATAT

TATTGCAAAAGGTATTTACGATAGTAAAACAAATACAACAACGTATACTTTTACGAATTATGTAGATCAATACACAAATG

TTAGCGGTAGC TTTGAACAAGTCGCATTTGCGAAACGTGAAAATGCAACAAC TGATAAAACTGCTTATAAAATGGAAGTA

ACTTTAGGTAATGATACATATAGTAAAGATGTCATTGTCGATTATGGTAATCAAAAAGGTCAACAACTTATTTCGAGTAC

AAATTATATTAATAATGAAGATTTGTCACGTAATATGACTGTTTATGTAAATCAACCTAAAAAGACCTATACAAAAGAAA

CATTTGTAACAAATTTAACTGGTTATAAATTTAATCCAGATGCTAAAAACTTCAAAATTTACGAAGTGACAGATCAAAAT

CAATTTGTGGATAGTTTCAC C CCAGATACTTCAAAACTTAAAGATGTTACTGGTCAAT T CGATGTTATTTATAGTAATGA

TAATAAGACGGCGACAGTAGATTTATTGAATGGTCAATCTAGTAGTGATAAACAGTACATCATT CAACAAGTTGCTTATC

CAGATAATAGTTCAACAGATAATGGGAAAATTGATTATACTTTAGAAACACAAAATGGAAAAAGTAGTTGGTCAAACAGT

TATTCAAATGTGAATGGCTCATCAACTGCAAATGGCGAC CAAAAGAAATATAATCTAGGTGAC TATGTATGGGAAGATAC

AAATAAAGATGGTAAACAAGATGCCAATGAAAAAGGGATTAAAGGTGTTTATGTCATTCTTAAAGATAGTAACGGTAAAG

AATTAGATCGTACGACAACAGATGAAAATGGTAAATATCAGTTCACTGGTTTAAGCAATGGAACTTATAGTGTAGAGTTT

TCAACACCAGCCGGTTATACACCGACAACTGCAAATGCAGGTACAGATGATGCTGTAGATTCTGATGGAC TAACTACAAC

AGGTGTCATTAAAGACGCTGACAACATGACATTAGATAGTGGATTCTACAAAACACCAAAATATAGTTTAGGTGATTATG

TTTGGTACGACAGTAATAAAGATGGTAAACAAGATTCGACTGAAAAAGGAATTAAAGGTGTTAAAGTTACTTTGCAAAAC

GAAAAAGGCGAAGTAATTGGTACAACTGAAACAGATGAAAATGGTAAATACCGC TTTGATAATTTAGATAGTGGTAAATA

CAAAGTTATCTTTGAAAAGCCTGCTGGTTTAACTCAAACAGGTACAAATACAAC TGAAGATGATAAAGATGCCGATGGTG

GCGAAGTTGATGTAACAATTACGGATCATGATGATTTCACACTTGATAATGGCTACTACGAAGAAGAAACATCAGATAGT

GACTCAGATTCGGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGATAGTGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGA

CTCAGATAGCGACTCAGACAGCGACTCAGACTCAGATAGTGATTCAGATTCGGACAGCGACTCAGATTCAGACAGCGAAT

CAGATTCGGATAGCGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGACAGCGACTCAGATTCAGACAGTGACTCAGACTCAGACAGC

GACTCAGATTCAGACAGCGATTCAGATTCGGATAGCGACTCAGAT TCAGATAGCGATTCGGACTCAGACAACGACTCAGA

TTC TGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGACAGCGACTCAGATTCAGACAGCGATTCAGATTCAGATA

GCGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGCGACTCAGACTCAGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACTCA

GACAGCGATTCAGATTCGGATAGCGATTCAGATTCAGATGCAGGTAAACATACTCCGACTAAACCAATGAGTACGGTTAA

AGATCAGCATAAAACAGCTAAAGCATTACCAGAAACAGGTAGTGAAAATAATAATTCAAATAATGGCACATTATTCGGTG

GATTATTCGCGGCATTAGGATCATTATTGTTATTCGGTCGTCGTAAAAAACAAAATAAATAA

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SEQ ID NO:63 seqüência de polinucleotídeoATGAATATGAAGAAAAAAGAAAAACACGCAATTCGGAAAAAATCGATTGGCGTGGCTTCAGTGCTTGTAGGTACGTTAAT

CGGTTTTGGACTACTCAGCAGTAAAGAAGCAGATGCAAGTGAAAATAGTGTTACGCAATCTGATAGCGCAAGTAACGAAA

GCAAAAGTAATGATTCAAGTAGCGTTAGTGCTGCACCTAAAACAGACGACACAAACGTGAGTGATACTAAAACATCGTCA

AACACTAATAATGGCGAAACGAGTGTGGCGCAAAATCCAGCACAACAGGAAACGACACAATCATCATCAACAAATGCAAC

TACGGAAGAAACGCCGGTAACTGGTGAAGCTACTACTACGACAACGAATCAAGCTAATACACCGGCAACAACTCAATCAA

GCAATACAAATGCGGAGGAATTAGTGAATCAAACAAGTAATGAAACGACTTCTAATGATACTAATACAGTATCATCTGTA

AATTCACCTCAAAATTCTACAAATGCGGAAAATGTTTCAACAACGCAAGATACTTCAACTGAAGCAACACCTTCAAACAA

TGAATCAGCTCCACAGAATACAGATGCAAGTAATAAAGATGTAGTTAGTCAAGCGGTTAATCCAAGTACGCCTAGAATGA

GAGCATTTAGTTTAGCGGCAGTAGCTGCAGATGCACCGGCAGCTGGCACAGATATTACGAATCAGTTGACAGATGTGAAA

GTTACTATTGACTCTGGTACGACTGTGTATCCGCACCAAGCAGGTTATGTCAAACTGAATTATGGTTTTTCAGTGCCTAA

TTCTGCTGTTAAAGGTGACACATTCAAAATAACTGTACCTAAAGAATTAAACTTAAATGGTGTAACTTCAACTGCTAAAG

TGCCACCAATTATGGCTGGAGATCAAGTATTGGCAAATGGTGTAATCGATAGTGATGGTAATGTTATTTATACATTTACA

GACTATGTTGATAATAAAGAAAATGTAACAGCTAATATTACTATGCCAGCTTATATTGACCCTGAAAATGTTACAAAGAC

AGGTAATGTGACATTGACAACTGGCATAGGAACCAATACTGCTAGTAAGACAGTATTAATCGACTATGAGAAATATGGAC

AATTCCATAATTTATCAATTAAAGGTACGATTGATCAAATCGATAAAACAAATAATACGTATCGCCAAACAATTTATGTC

AATCCAAGCGGAGATAACGTTGTGTTACCTGCCTTAACAGGTAATTTAATTCCTAATACAAAGAGTAATGCGTTAATAGA

TGCAAAAAACACTGATA'TTAAAGTTTATAGAGTCGATAATGCTAATGATTTATCTGAAAGTTATTATGTGAATCCTAGCG

ATTTTGAAGATGTAACTAATCAAGTTAGAATTTCATTTCCAAATGCTAATCAATACAAAGTAGAATTTCCTACGGACGAT

GACCAAATTACAACACCGTATATTGTAGTTGTTAATGGCCATATTGATCCTGCTAGTACAGGTGATTTAGCACTACGTTC

GACATTTTATGGTTATGATTCTAATTTTATATGGAGATCTATGTCATGGGACAACGAAGTAGCATTTAATAACGGATCAG

GTTCTGGTGACGGTATCGATAAACCAGTTGTTCCTGAACAACCTGATGAGCCTGGTGAAATTGAACCAATTCCAGAGGAT

TCAGATTCTGACCCAGGTTCAGATTCTGGCAGCGATTCTAATTCAGATAGCGGTTCAGATTCTGGCAGTGATTCTACATC

AGATAGTGGTTCAGATTCAGCGAGTGATTCAGATTCAGCAAGTGATTCAGACTCAGCGAGTGATTCAGATTCAGCAAGTG

ATTCAGATTCAGCAAGTGATTCAGATTCAGCAAGTGATTCAGACTCAGCAAGTGATTCAGATTCAGCAAGTGATTCAGAT

TCAGCAAGCGATTCAGATTCAGCGAGCGATTCAGATTCAGCGAGCGATTCAGATTCAGCGAGTGATTCCGACTCAGCGAG

CGA'TTCAGACTCAGATAGTGACTCAGATTCCGATAGCGATTCCGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGACAGCGATTCTG

ACTCAGACAGCGATTCTGACTCAGACAGTGACTCAGATTCCGATAGCGATTCTGACTCAGACAGTGACTCAGATTCCGAT

AGCGATTCAGATTCAGACAGTGATTCAGACTCAGATAGCGATTCAGATTCCGACAGTGACTCAGACTCAGACAGCGATTC

AGATTCCGATAGCGATTCAGATTCCGACAGTGACTCAGATTCCGATAGTGACTCGGATTCAGCGAGTGATTCAGATTCAG

ATAGCGATTCAGAATCAGATAGTGACTCAGACTCAGACAGTGATTCAGATTCAGATAGTGACTCAGACTCAGACAGCGAT

TCAGAATCAGATAGTGACTCCGATTCAGACAGCGATTCAGAATCAGATAGTGACTCCGATTCAGATAGCGATTCGGATTC

AGCGAGTGATTCAGACTCAGGTAGTGACTCCGATTCATCAAGTGATTCAGATTCCGATTCAACGAGTGACACAGGATCAG

ACAACGACTCAGACAGTGATTCAAATAGCGATTCCGAGTCAGGTTCTAACAATAATGTAGTTCCGCCTAATTCACCTAAA

AATGGTACTAATGCTTCTAATAAAAATGAGGCTAAAGATAGTAAAGAACCATTACCAGATACAGGTTCTGAAGATGAAGC

GAATACGTCACTAATTTGGGGATTATTAGCATCATTAGGTTCATTACTACTTTTCAGAAGAAAAAAAGAAAATAAAGATA

AGAAATAA

SEQ ID NO:64 seqüência de polinucleotídeoGTGAAAAACAATCTTAGGTACGGCATTAGAAAACATAAATTGGGAGCAGCATCAGTATTCTTAGGAACAATGATCGTTGT

TGGGATGGGACAAGATAAAGAAGCTGCAGCATCAGAACAAAAGACAACTACAGTAGAAGAAAATGGGAATTCAGCTACTG

ATAATAAAACAAGTGAAACACAAACAACTGCTACTAACGTTAATCATATAGAAGAAACTCAATCATATAACGCAACAGTA

ACAGAACAACCGTCAAACGCAACACAAGTAACAACTGAAGAAGCACCAAAAGCAGTACAAGCACCACAAACTGCACAACC

AGCAAATGTAGAAACAGTTAAAGAAGAAGAGAAACCTCAAGTTAAGGAAACGACACAACCTCAAGACAATAGCGGAAATC

AAAGACAAGTAGATTTAACACCTAAAAAGGTTACACAAAATCAAGGGACAGAAACACAAGTTGAAGTGGCACAGCCAAGA

ACGGCATCAGAAAGTAAGCCACGTGTGACAAGATCAGCAGATGTAGCGGAAGCTAAGGAAGCTAGTGACGTTTCAGAAGT

TAAAGGCACAGATGTTACAAGTAAAGTTACAGTAGAAAGTGGTTCTATTGAGGCACCTCAAGGAAATAAAGTAGAGCCAC

ATGCTGGTCAACGTGTCGTATTGAAATACAAATTGAAATTCGCAGATGGATTAAAAAGAGGAGATTATTTTGATTTTACA

TTATCAAATAATGTAAATACTTATGGGGTTTCAACAGCTAGAAAGGTACCAGAGATTAAAAATGGCTCAGTTGTAATGGC

TACAGGTGAGATCTTAGGGAATGGTAACATAAGATATACATTTACTAACGAAATTGAACACAAGGTAGAGGTAACAGCTA

ATTTAGAAATCAACTTATTTATTGACCCTAAAACTGTACAAAGCAATGGAGAACAAAAGATTACTTCTAAATTAAATGGT

GAAGAAACAGAAAAAACAATACCAGTTGTTTATAATCCAGGTGTTAGCAATAGTTATACAAATGTAAATGGATCAATTGA

AACATTTAATAAAGAATCTAATAAATTTACACATATAGCTTATATTAAGCCAATGAATGGAAACCAGTCAAACACTGTAT

CAGTAACAGGGACGTTGACTGAAGGTAGTAATTTAGCTGGTGGACAACCTACTGTTAAAGTATATGAATATCTAGGGAAA

AAAGATGAATTGCCACAAAGTGTTTATGCAAATACATCAGATACTAACAAATTCAAAGATGTAACAAAGGAAATGAATGG

AAAATTGAGTGTGCAAGACAATGGTAGTTACTCATTGAATTTAGATAAGTTGGATAAAACGTATGTCATTCATTATACAG

GTGAATATTTGCAAGGGTCAGATCAGGTTAATTTTAGAACTGAATTATATGGGTATCCAGAACGAGCATATAAATCTTAC

TATGTTTATGGGGGATATCGTTTAACTTGGGATAATGGTTTAGTTTTATATAGCAATAAAGCTGACGGCAATGGTAAAAA

TGGACAAATTATTCAAGATAATGATTTTGAATATAAAGAAGATACTGCAAAAGGAACTATGAGCGGGCAGTACGATGCCA

AGCAAATTATTGAAACAGAAGAAAATCAAGACAATACACCGCTTGACATTGATTACCACACAGCTATAGATGGTGAGGGT

38/68

GGTTATGTTGATGGGTATATTGAAACAATAGAAGAAACGGATTCATCAGCTATTGATATCGATTACCATACTGCTGTGGATAGTGAAGTGGGTCACGTTGGAGGATACACTGAGTCCTCTGAGGAATCAAATCCAATTGACTTTGAAGAATCGACACATG

AAAATTCAAAACATCACGCTGATGTTGTTGAATATGAAGAGGATACAAATCCAGGTGGTGGCCAAGTAACAACTGAGTCT

AACTTAGTTGAATTTGACGAAGAGTCTACAAAAGGTATTGTAACTGGCGCAGTGAGCGACCATACAACAATTGAAGATAC

GAAAGAATATACGACTGAAAGTAATCTGATTGAACTAGTAGATGAACTACCTGAAGAACATGGTCAAGCACAAGGACCAATCGAGGAAATTACTGAAAACAATCATCATATTTCTCATTCTGGTTTAGGAACTGAAAATGGTCACGGTAATTATGGCGTG

ATTGAAGAAATCGAAGAAAATAGCCACGTTGATATTAAGAGTGAATTAGGTTACGAAGGTGGCCAAAATAGCGGTAACCA

GTCATTCGAGGAAGACACAGAAGAAGACAAACCTAAATATGAACAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTCGACAGTGTACCTCAAATTCATGGTCAAAATAAAGGTGACCAGTCATTCGAAGAAGATACAGAGAAAGACAAGCCTAAATATGAACAT

GGCGGTAATATCATTGATATCGACTTCGACAGTGTGCCACAAATTCATGGATTCAATAAGCATAATGAAATTATTGAAGA

AGATACAAACAAAGATAAACCTAATTATCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGACTTTGAAGAAGATACACTTCCAAAAG

TAAGCGGCCAAAATGAAGGTCAACAAACGATTGAAGAAGATACAACGCCGCCAACGCCACCGACACCAGAAGTACCGAGT

GAGCCGGAAACACCAATGCCACCGACACCAGAAGTACCGAGTGAGCCGGAAACACCAACGCCACCAACACCAGAGGTACC

AAGTGAGCCGGAAACACCAACACCACCGACTCCGGAAGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAACACCACCGACACCAGAAGTGCCGAGTGAGCCAGAAACACCAACACCGCCAACACCAGAGGTACCAGCTGAACCTGGTAAACCAGTACCACCCGCAAAA

GAAGAACCTAAAAAGCCTTCTAAACCAGTGGAACAAGGTAAAGTAGTAACACCTGTTATTGAAATCAATGAAAAGGTTAA

AGCAGTGGCACCAACTAAAAAAGCACAATCTAAGAAATCTGAACTACC TGAAACAGGTGGAGAAGAATCAACAAACAAAG

GTATGTTGTTCGGCGGATTATTCAGCATTCTAGGTTTAGCATTATTACGCAGAAATAAAAAGAATAACAAAGCATAA

SEQ ID NO:65 seqüência de polinucleotídeoTTGAAAAAAAGAATTGATTATTTGTCGAATAAGCAGAATAAGTATTCGATTAGACGTTTTACAGTAGGTACCACATCAGT

AATAGTAGGGGCAACTATACTATTTGGGATAGGCAATCATCAAGCACAAGCTTCAGAACAATCGAACGATACAACGCAAT

CTTCGAAAAATAATGCAAGTGCAGATTCCGAAAAAAACAATATGATAGAAACACCTCAATTAAATACAACGGCTAATGATACATCTGATATTAGTGCAAACACAAACAGTGCGAATGTAGATAGCACAACAAAACCAATGTCTACACAAACGAGCAATAC

CACTACAACAGAGCCAGCTTCAACAAATGAAACACCTCAACCGACGGCAATTAAAAATCAAGCAACTGCTGCAAAAATGC

AAGATCAAACTGTTCCTCAAGAAGCAAATTCTCAAGTAGATAATAAAACAACGAATGATGCTAATAGCATAGCAACAAAC

AGTGAGCTTAAAAATTCTCAAACATTAGATTTACCACAATCATCACCACAAACGATTTCCAATGCGCAAGGAACTAGTAA

ACCAAGTGTTAGAACGAGAGCTGTACGTAGTTTAGCTGTTGCTGAACCGGTAGTAAATGCTGCTGATGCTAAAGGTACAA

ATGTAAATGATAAAGTTACGGCAAGTAATTTCAAGTTAGAAAAGACTACATTTGACCCTAATCAAAGTGGTAACACATTT

ATGGCGGCAAATTTTACAGTGACAGATAAAGTGAAATCAGGGGATTATTTTACAGCGAAGTTACCAGATAGTTTAACTGG

TAATGGAGACGTGGATTATTCTAATTCAAATAATACGATGCCAATTGCAGACATTAAAAGTACGAATGGCGATGTTGTAG

CTAAAGCAACATATGATATCTTGACTAAGACGTATACATTTGTCTTTACAGATTATGTAAATAATAAAGAAAATATTAAC

GGACAATTTTCATTACCTTTATTTACAGACCGAGCAAAGGCACCTAAATCAGGAACATATGATGCGAATATTAATATTGC

GGATGAAATGTTTAATAATAAAATTACTTATAACTATAGTTCGCCAATTGCAGGAATTGATAAACCAAATGGCGCGAACA

TTTCTTCTCAAATTATTGGTGTAGATACAGCTTCAGGTCAAAACACATACAAGCAAACAGTATTTGTTAACCCTAAGCAA

CGAGTTTTAGGTAATACGTGGGTGTATATTAAAGGCTACCAAGATAAAATCGAAGAAAGTAGCGGTAAAGTAAGTGCTAC

AGATACAAAACTGAGAATTTTTGAAGTGAATGATACATCTAAATTATCAGATAGCTACTATGCAGATCCAAATGACTCTA

ACCTTAAAGAAGTAACAGACCAATTTAAAAATAGAATCTATTATGAGCATCCAAATGTAGCTAGTATTAAATTTGGTGAT

ATTACTAAAACATATGTAGTATTAGTAGAAGGGCATTACGACAATACAGGTAAGAACTTAAAAACTCAGGTTATTCAAGA

AAATGTTGATCCTGTAACAAATAGAGACTACAGTATTTTCGGTTGGAATAATGAGAATGTTGTACGTTATGGTGGTGGAA

GTGCTGATGGTGATTCAGCAGTAAATCCGAAAGACCCAACTCCAGGGCCGCCGGTTGACCCAGAACCAAGTCCAGACCCA

GAACCAGAACCAACGCCAGATCCAGAACCAAGTCCAGACCCAGAACCGGAACCAAGCCCAGACCCGGATCCGGATTCGGA

TTCAGACAGTGACTCAGGCTCAGACAGCGACTCAGGTTCAGATAGCGACTCAGAATCAGATAGCGATTCGGATTCAGACA

GTGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGAATCAGATAGCGATTCAGAATCAGATAGCGACTCAGATTCAGATAGCGATTCA

GATTCAGATAGCGATTCAGAATCAGATAGCGATTCGGATTCAGACAGTGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGAATCAGA

TAGCGACTCAGAATCAGATAGTGAGTCAGATTCAGACAGTGACTCGGACTCAGACAGTGATTCAGACTCAGATAGCGATT

CAGACTCAGATAGCGATTCAGACTCAGACAGCGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGAATCAGACAGCGACTCAGACTCA

GATAGCGACTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGCGATTCAGACTCAGACAGCGACTCAGACTCAGACAGCGA

CTCAGACTCAGATAGCGATTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGCGATTCGGACTCAGACAGCGATTCAGATT

CAGACAGCGACTCAGACTCGGATAGCGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGACTCGGATAGCGACTCGGATTCAGATAGT

GACTCCGATTCAAGAGTTACACCACCAAATAATGAACAGAAAGCACCATCAAATCCTAAAGGTGAAGTAAACCATTCTAA

TAAGGTATCAAAACAACACAAAACTGATGCTTTACCAGAAACAGGAGATAAGAGCGAAAACACAAATGCAACTTTATTTG

GTGCAATGATGGCATTATTAGGATCATTACTATTGTTTAGAAAACGCAAGCAAGATCATAAAGAAAAAGCGTAA

SEQ ID NO:66 seqüência de polinucleotídeoATGAAAAAGCAAATAATTTCGCTAGGCGCATTAGCAGTTGCATCTAGCTTATTTACATGGGATAACAAAGCAGATGCGAT

AGTAACAAAGGATTATAGTAAAGAATCAAGAGTGAATGAGAAAAGTAAAAAGGGAGCTACTGTTTCAGATTATTACTATT

GGAAAATAATTGATAGTTTAGAGGCACAATTTACTGGAGCAATAGACTTATTGGAAGATTATAAATATGGAGATCCTATC

TATAAAGAAGCGAAAGATAGATTGATGACAAGAGTATTAGGAGAAGACCAGTATTTATTAAAGAAAAAGATTGATGAATA

TGAGCTTTATAAAAAGTGGTATAAAAGTTCAAATAAGAACACTAATATGCTTACTTTCCATAAATATAATCTTTACAATT

39/68

TAACAATGAATGAATATAACGATATTTTTAACTCTTTGAAAGATGCAGTTTATCAATTTAATAAAGAAGTTAAAGAAATA

GAGCATAAAAATGTTGACTTGAAGCAGTTTGATAAAGATGGAGAAGACAAGGCAACTAAAGAAGTTTATGACCTTGTTTC

TGAAATTGATACATTAGTTGTAACTTATTATGCTGATAAGGATTATGGGGAGCATGCGAAAGAGTTACGAGCAAAACTGG

ACTTAATCCTTGGAGATACAGACAATCCACATAAAATTACAAATGAGCGTATAAAAAAAGAAATGATCGATGACTTAAAT

TCAATTATAGATGATTTCTTTATGGAGACTAAACAAAATAGACCGAATTCTATAACAAAATATGATCCAACAAAACACAA

TTTTAAAGAGAAGAGTGAAAATAAACCTAATTTTGATAAATTAGTTGAAGAAACAAAAAAAGCAGTTAAAGAAGCAGACG

AATCTTGGAAAAATAAAACTGTCAAAAAATACGAGGAAACTGTAACAAAATCTCCTGTTGTAAAAGAAGAGAAGAAAGTT

GAAGAACCTCAATTAC CTAAAGTTGGAAACCAGCAAGAGGTTAAAACTACGGCTGGTAAAGCTGAAGAAACAACACAAC C

AGTGGCACAGCCATTAGTAAAAATTCCACAAGAAACAATCTATGGTGAAACTGTAAAAGGTCCAGAATATCCAACGATGG

AAAATAAAACGTTACAAGGTGAAATCGTTCAAGGTCCCGATTTTCTAACAATGGAACAAAACAGACCATCTTTAAGCGAT

AATTATACTCAACCGACGACACCGAACCCTATTTTAGAAGGTCTTGAAGGTAGCTCATCTAAACTTGAAATAAAACCACA

AGGTACTGAATCAACGTTGAAAGGTATTCAAGGAGAAT CAAGTGATATTGAAGTTAAACCTCAAGCAACTGAAACAACAG

AAGCTTCTCAATATGGTCCGAGACCGCAATTTAACAAAACACCTAAGTATGTGAAATATAGAGATGCTGGTACAGGTATC

CGTGAATACAACGATGGAACATTTGGATATGAAGCGAGACCAAGATTCAACAAGCCAAGTGAAACAAATGCATACAACGT

AACGACAAATCAAGATGGCACAGTATCATACGGAGCTCGCCCAACACAAAACAAGCCAAGTGAAACAAACGCATATAACG

TAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATACGGTGCTCGCCCAACACAAAAAAAGCCAAGCAAAACAAATGCATACAAC

GTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATATGGCGCTCGCCCGACACAAAAAAAGCCAAGCAAAACAAATGCATATAA

CGTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATACGGAGCTCGCCCGACATACAAGAAGCCAAGCGAAACAAATGCATACA

ACGTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATATGGCGCTCGCCCGACACAAAAAAAGCCAAGCGAAACAAACGCATAT

AACGTAACAACACATGCAGATGGTACTGCGACATATGGGCCTAGAGTAACAAAATAA

SEQ ID NO:77 seqüência de polinucleotídeoGTGAAAAGCAATCTTAGATACGGCATAAGAAAACACAAATTGGGAGCGGCCTCAGTATTCTTAGGAACAATGATCGTTGT

TGGAATGGGACAAGAAAAAGAAGCTGCAGCAT CGGAACAAAACAATACTACAGTAGAGGAAAGTGGGAGTTCAGCTACTG

AAAGTAAAGCAAGCGAAACACAAACAACTACAAATAACGTTAATACAATAGATGAAACACAATCATACAGCGCGACATCA

ACTGAGCAACCATCAAAATCAACTCAAGTAACAACAGAAGAAGCACCAACAACTGTGCAAGCACCAAAAGTAGAAACCGA

AATGAAATCACAAGAAGATTTACCATCAGAAAAAGTTGCTGATAAGGAAACTACAGGAACTCAAGTTGACATAGCTCAAC

CAAGTAACGTCTCAGAAATTAAACCAAGAATGAAAAGATCAGCTGACGTTACAGCAGTTTCAGAGAAAGAAGTAGCGGAA

GAAGCTAAAGCGACAGGTACAGATGTAACAAATAAAGTGGAAGTTACTGAAAGCTCTTTAGAAGGACATAATAAAGATTC

GAATATTGTTAATCCGCATAATGCTCAAAGAGTAACTTTAAAATACAAATGGAAATTTGGAGAAGGAATTAAGGCAGGAG

ATTATTTTGATTTCACATTAAGTGATAATGTTGAAACACATGGTATATCAACACTGCGTAAAGTTCCGGAGATAAAAAGT

TCAACAGAAGATAAAGTTATGGCAAATGGTCAAGTTATAAATGAACGTACAATTCGCTATACATTTACTGATTATATAAA

TAACAAAAAAGATTTAACTGCTGAATTAAACTTAAACCTATT CATTGACCCAACAACAGTGACAAAGCAAGGGAGTCAAA

AAGTTGAAGTAACACTAGGTCAAAATAAAGTCTCAAAAGAATTTGATATCAAATATTTAGACGGCGTTAAAGATAGAATG

GGTGTTACTGTTAATGGTCGTATTGATACTTTGAATAAAGAAGAGGGTAAATTTAGCCATTTTGCATATGTGAAGCCTAA

CAACCAGTCGTTAACTTCTGTCACAGTAACTGGTCAAGTAACATCTGGATATAAACAAAGTGCTAATAATCCAACAGTCA

AAGTATATAAACACATTGGTTCAGATGAATTAGCTGAAAGTGTTTATGCAAAGCTTGATGATACCAGTAAATTTGAAGAT

GTGACTGAAAAAGTAAATCTATCTTACACAAGTAATGGTGGGTACACATTGAACCTTGGCGATTTAGATAATTCGAAAGA

CTATGTAATTAAATATGAAGGTGAATATGATCAAAATGCTAAGGATCTAAATTTCCGAACACATCTTTCAGGATATCATA

AATACTACCCATACTATCCTTATTACCCGTATTATCCAGTTCAATTAACTTGGAACAACGGTGTTGCATTTTACTCTAAT

AATGCTAAAGGCGATGGTAAAGATAAACCAAATGAT CC TATCATTGAGAAGAGTGAACCAATTGATTTAGACATTAAATC

AGAGCCACCAGTGGAGAAGCATGAATTGACTGGTACAATCGAAGAAAGTAACGATTCTAAGCCAATTGATTTTGAATATC

ATACAGCTGTTGAAGGTGCAGAAGGTCATGCAGAAGGTATTATTGAAACTGAAGAAGATTCTATTCATGTGGATTTTGAA

GAATCTACACATGAAAATTCAAAACATCACGCTGATGTTGTTGAATATGAAGAGGATACAAACCCAGGTGGTGGCCAAGT

AACAACTGAGTCTAACTTAGTTGAATTTGACGAAGAGTCTACAAAAGGTATTGTAACTGGCGCAGTGAGCGACCATACAA

CAGTTGAAGATACGAAAGAATATACAACTGAAAGTAAT CTGATTGAATTAGTGGATGAATTACCTGAAGAACATGGTCAA

GCACAAGGGCCAATCGAGGAAATTACTGAAAACAAT CATCATATTTCTCATTCTGGTTTAGGAACTGAAAATGGTCACGG

TAATTATGGCGTGATTGATGAAATCGAAGAAAATAGCCACGTTGATATTAAGAGTGAATTAGGTTATGAAGGTGGCCAAA

ATAGCGGTAATCAGTCATTCGAGGAAGACACAGAAGAAGATAAACCTAAATATGAACAAGGTGGTAATATCGTAGATATC

GATTTCGACAGTGTACCTCAAATTCATGGTCAAAATAATGGTAACCAGTCATTCGAGGAAGACACAGAAGAAGACAAGCC

TAAGTATGAACAAGGTGGTAACATCATTGATATCGACTTCGACAGTGTGCCACAAATTCATGGATTCAATAAGCATAATG

AAATTATTGAAGAAGATACAAACAAAGATAAAC CTAATTATCAATTTGGTGGACACAACAGTGTTGATTTTGAAGAAGAT

ACACTTCCAAAAGTAAGTGGTCAAAATGAAGGTCAACAAACGATTGAAGAAGATACAACGCCGCCAACACCGCCAACACC

AGAGGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAACACCACCAACACCAGAAGTACCGAGTGAGCCAGGCGAACCAACGCCACCAA

AACCGGAAGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAGTACCACCAACAC CAGAGGTACCATCTGAACCTGGTAAACCAGTAC CA

CCTGCTAAAGAAGAACCrAAAAAACCTTCTAAACCAGTGGAACAAGGTAAGGTAGTAACACCTGTTATTGAAATCAATGA

AAAGGTTAAAGCAGTGGCACCAACTAAACAAAAACAATCTAAGAAATCTGAACTACCTGAAACAGGTGGAGAAGAATCAA

CAAACAAAGGTATGTTGTTCGGCGGATTATTCAGCATTCTAGGTTTAGTATTATTACGCAGAAATAAAAAGAATAACAAA

GCATAA

40/68

SEQ ID NO:78 seqüência de polinucleotídeoATGAAATTTAAGTCATTGATTACAACAACATTAGCATTAGGCGTTATAGCATCAACAGGAGCAAACTTTAATACTAACGA

AGCATCTGCCGCAGCTAAGCCATTAGATAAATCATCAAGTACATTACACCATGGACATTCTAACATCCAGATTCCATATA

CAATTACTGTGAACGGTACAAGCCAAAACATTTTATCAAGCTTAACATTTAATAAGAATCAAAATATTAGTTATAAAGAT

ATAGAGAATAAAGTTAAATCAGTTTTATACTTTAATAGAGGTATTAGTGATATCGATTTAAGACTTTCAAAGCAAGCGGA

ATATACGGTTCATTTTAAAAATGGAACAAAAAGAGTTATCGATTTGAAATCAGGTATCTACACAGCTGACTTAATCAATA

CAAGTGACATTAAAGCTATCAGTGTTAACGTAGATACTAAAAAGCAACCTAAAGATAAAGCTAAAGCAAATGTTCAAGTG

CCATATACAATCACAGTGAACGGCACAAGCCAAAACATTTTATCAAACCTAACATTTAATAAAAATCAAAATATTAGTTA

CAAAGATTTAGAGGGTAAAGTTAAATCAGTTTTAGAATCAAATAGAGGTATTACTGATGTTGATTTAAGACTTTCGAAGC

AAGCGAAATATACAGTTAATTTTAAAAATGGAACGAAGAAAGTTATCGATTTGAAATCAGGTATTTACACAGCGAATTTA

ATCAATTCAAGTGATATTAAAAGTATCAATATTAACGTAGATACAAAAAAACATATCGAAAATAAAGCTAAAAGAAACTA

TCAAGTTCCATATTCAATTAATCTAAATGGTACATCTACAAACATTTTATCGAATCTTTCATTTTCAAATAAACCTTGGA

CAAATTACAAAAATTTAACTAGTCAAATAAAATCAGTACTGAAGCATGATAGAGGTATTAGTGAACAAGATTTAAAATAT

GCTAAGAAAGCTTATTATACTGTTTATTTTAAAAATGGTGGTAAAAGAATCTTACAGTTAAATTCAAAAAATTACACAGC

AAACTTAGTTCATGCGAAAGATGTTAAGAGAATTGAAATTACTGTTAAAACAGGAACTAAAGCGAAAGCAGACAGATATG

TACCATACACAATTGCAGTAAATGGCACATCAACACCAATTTTATCAAAACTAAAAATTTCGAATAAACAATTAATTAGT

TACAAATATTTAAACGACAAAGTGAAATCTGTATTAAAAAGTGAAAGAGGTATCAGTGATCTTGACTTAAAATTTGCGAA

ACAAGCAAAATATACAGTATATTTCAAAAATGGAAAGAAACAAGTAGTGAATTTAAAATCAGACATCTTTACACCTAATT

TATTTAGTGCCAAAGATAT'TAAAAAGATTGATATTGATGTAAAACAATACACTAAATCAAAAAAAAAAATAAATAAATCT

AATAATGTGAAATTCCCAGTAACAATAAATAAATTTGAAAACATAGTTTCAAATGAATTTGTGTTCTATAATGCAAGCAA

AATTACAATTAATGATTTAAGTATAAAACTTAAATCAGCAATGGCAAATGATCAAGGGATAACTAAACATGACATAGGAC

TTGCTGAACGCGCAGTGTATAAAGTGTATTTTAAAAATGGTTCGTCAAAATATGTAGACTTAAAAACTGAGTATAAAGAT

GAAAGAGTATTTAAAGCAACTGACATTAAAAAGGTAGATATTGAACTTAAATTCTAA

SEQ ID NO:79 seqüência de polinucleotídeoATGAACAAACATCACCCAAAATTAAGGTCTTTCTATTCTATTAGAAAATCAACTCTAGGC

GTTGCATCGGTCATTGTCAGTACACTATTTTTAATTACTTCTCAACATCAAGCACAAGCA

GCAGAAAATACAAATACTTCAGATAAAATCTCGGAAAATCAAAATAATAATGCAACTACA

ACTCAGCCACCTAAGGATACAAATCAAACACAACCTGCTACGCAACCAGCAAACACTGCG

AAAAACTATCCTGCAGCGGATGAATCACTTAAAGATGCAATTAAAGATCCTGCATTAGAA

AATAAAGAACATGATATAGGTCCAAGAGAACAAGTCAATTTCCAGTTATTAGATAAAAAC

AATGAAACGCAGTACTATCACTTTTTCAGCATCAAAGATCCAGCAGATGTGTATTACACT

AAAAAGAAAGCAGAAGTTGAATTAGACATCAATACTGCTTCAACATGGAAGAAGTTTGAA

GTCTATGAAAACAATCAAAAATTGCCAGTGAGAC TTGTATCATATAGTCCTGTACCAGAA

GACCATGCCTATATTCGATTCCCAGTTTCAGATGGCACACAAGAATTGAAAATTGTTTCT

TCGACTCAAATTGATGATGGAGAAGAAACAAATTATGATTATACTAAATTAGTATTTGCT

AAACCTATTTATAACGATCCTTCACTTGTAAAATCAGATACAAATGATGCAGTAGTAACG

AATGATCAATCAAGTTCAGTCGCAAGTAATCAAACAAACACGAATACATCTAATCAAAAT

ATATCAACGATCAACAATGCTAATAATCAACCGCAGGCAACGACCAATATGAGTCAACCT

GCACAACCAAAATCGTCAACGAATGCAGATCAAGCGTCAAGCCAACCAGCTCATGAAACA

AATTCTAATGGTAATACTAACGATAAAACGAATGAGTCAAGTAATCAGTCGGATGTTAAT

CAACAGTATCCACCAGCAGATGAATCACTACAAGATGCAATTAAAAACCCGGCTATCATC

GATAAAGAACATACAGCTGATAATTGGCGACCAATTGATTTTCAAATGAAAAATGATAAA

GGTGAAAGACAGTTCTATCATTATGCTAGTACTGTTGAACCAGCAACTGTCATTTTTACAAAAACAGGACCAATAATTGAATTAGGTTTAAAGACAGCTTCAACATGGAAGAAATTTGAA

GTTTATGAAGGTGACAAAAAGTTACCAGTCGAATTAGTATCATATGATTCTGATAAAGAT

TATGCCTATATTCGTTTCCCAGTATCTAATGGTACGAGAGAAGTTAAAATTGTGTCATCT

ATTGAATATGGTGAGAACATCCATGAAGAC TATGATTATACGCTAATGGTCTTTGCACAG

CCTATTACTAATAACCCAGACGACTATGTGGATGAAGAAACATACAATTTACAAAAATTA

TTAGCTCCGTATCACAAAGCTAAAACGTTAGAAAGACAAGTTTATGAATTAGAAAAATTA

CAAGAGAAATTGCCAGAAAAATATAAGGCGGAATATAAAAAGAAATTAGATCAAACTAGA

GTAGAGTTAGCTGATCAAGTTAAATCAGCAGTGACGGAATTTGAAAATGTTACACCTACA

AATGATCAATTAACAGATTTACAAGAAGCGCATTTTGTTGTTTTTGAAAGTGAAGAAAAT

AGTGAGTCAGTTATGGACGGCTTTGTTGAACATCCATTCTATACAGCAACTTTAAATGGT

CAAAAATATGTAGTGATGAAAACAAAGGATGACAGTTACTGGAAAGATTTAATTGTAGAA

GGTAAACGTGTCACTACTGTTTCTAAAGATCCTAAAAATAATTCTAGAACGCTGATTTTC

CCATATATACCTGACAAAGCAGTTTACAATGCGATTGTTAAAGTCGTTGTGGCAAACATT

GGTTATGAAGGTCAATATCATGTCAGAATTATAAATCAGGATATCAATACAAAAGATGATGATACATCACAAAATAACACGAGTGAACCGCTAAATGTACAAACAGGACAAGAAGGTAAG

GTTGCTGATACAGATGTAGCTGAAAATAGCAGCACTGCAACAAATCCTAAAGATGCGTCT

41/68

GATAAAGCAGATGTGATAGAACCAGAGTCTGACGTGGTTAAAGATGCTGATAATAATATT

GATAAAGATGTGCAACATGATGTTGATCATTTATCCGATATGTCGGATAATAATCACTTC

GATAAATATGATTTAAAAGAAATGGATACTCAAATTGCCAAAGATACTGATAGAAATGTG

GATAAAGATGCCGATAATAGCGTTGGTATGTCATCTAATGTCGATACTGATAAAGACTCT

AATAAAAATAAAGACAAAGTCATACAGCTGAATCATATTGCCGATAAAAATAATCATACT

GGAAAAGCAGCAAAGCTTGACGTAGTGAAACAAAATTATAATAATACAGACAAAGTTACT

GACAAAAAAACAACTGAACATCTGCCGAGTGATATTCATAAAACTGTAGATAAAACAGTG

AAAACAAAAGAAAAAGCCGGCACACCATCGAAAGAAAACAAACTTAGTCAATCTAAAATG

CTACCAAAAACTGGAGAAACAACTTCAAGCCAATCATGGTGGGGCTTATATGCGTTATTA

GGTATGTTAGCTTTATTCATTCCTAAATTCAGAAAAGAATCTAAATAA

SEQ ID NO:80 seqüência de polinucleotídeoGCTGAGACGACACAAGATCAAACTACTAATAAAAACGTTTTAGATAGTAATAAAGTTAAA

GCAACTACTGAACAAGCAAAAGCTGAGGTAAAAAATCCAACGCAAAACATTTCTGGCACT

CAAGTATATCAAGACCCTGCTATTGTCCAACCAAAAACAGCAAATAACAAAACAGGCAAT

GCTCAAGTAAGTCAAAAAGTTGATACTGCACAAGTAAATGGTGACACTCGTGCTAATCAA

TCAGCGACTACAAATAATACGCAGCCTGTTGCAAAGTCAACAAGCACTACAGCACCTAAA

ACTAACACTAATGTTACAAATGCTGGTTATAGTTTAGTTGATGATGAAGATGATAATTCA

GAAAATCAAATTAATCCAGAATTAATTAAATCAGCTGCTAAACCTGCAGCTCTTGAAACG

CAATATAAAACCGCAGCACCTAAAGCTGCAACTACATCAGCACCTAAAGCTAAAACTGAA

GCGACACCTAAAGTAACTACTTTTAGCGCTTCAGCACAACCAAGATCAGTTGCTGCAACA

CCAAAAACGAGTTTGCCAAAATATAAACCACAAGTAAACTCTTCAATTAACGATTACATT

TGTAAAAATAACTTAAAAGCACCTAAAATTGAAGAAGATTATACATCTTACTTCCCTAAA

TACGCATACCGTAACGGCGTAGGTCGTCCTGAAGGTATCGTAGTTCATGATACAGCTAAT

GATCGTTCGACGATAAATGGTGAAATTAGTTATATGAAAAATAACTATCAAAACGCATTC

GTACATGCATTTGTTGATGGGGATCGTATAATCGAAACAGCACCAACGGATTACTTATCT

TGGGGTGTCGGTGCAGTCGGTAACCCTAGATTCATCAATGTTGAAATCGTACACACACAC

GACTATGCTTCATTTGCACGTTCAATGAATAACTATGCTGACTATGCAGCTACACAATTA

CAATATTATGGTTTAAAACCAGACAGTGCTGAGTATGATGGAAATGGTACAGTATGGACT

CACTACGCTGTAAGTAAATATTTAGGTGGTACTGACCATGCCGATCCACATGGATATTTA

AGAAGTCATAATTATAGTTATGATCAATTATATGACTTAATTAATGAAAAATATTTAATA

AAAATGGGTAAAGTGGCGCCATGGGGTACGCAATCTACAACTACCCCTACTACACCATCA

AAACCAACAACACCGTCGAAACCATCAACTGGTAAATTAACAGTTGCTGCAAACAATGGT

GTCGCACAAATCAAACCAACAAATAGTGGTTTATATACTACTGTATACGACAAAACTGGT

AAAGCAACTAATGAAGTTCAAAAAACATTTGCTGTATCTAAAACAGCTACATTAGGTAAT

CAAAAATTCTATCTTGTTCAAGATTACAATTCTGGTAATAAATTTGGTTGGGTTAAAGAA

GGCGATGTGGTTTACAACACAGC TAAATCACCTGTAAATGTAAATCAATCATATTCAATC

AAACCTGGTACGAAACTTTATACAGTACCTTGGGGTACATCTAAACAAGTTGCTGGTAGT

GTGTCTGGCTCTGGAAACCAAACATTTAAGGCTTCAAAGCAACAACAAATTGATAAATCA

ATTTATTTATATGGCTCTGTGAATGGTAAATCTGGTTGGGTAAGTAAAGCATATTTAGTT

GATACTGCTAAACCTACGCCTACACCAACACCTAAGCCATCAACACCTACAACAAATAAT

AAATTAACAGTTTCATCATTAAACGGTGTTGCTCAAATTAATGCTAAAAACAATGGCTTA

TTCACTACAGTTTATGACAAAACTGGTAAGCCAACGAAAGAAGTTCAAAAAACATTTGCT

GTAACAAAAGAAGCAAGTTTAGGTGGAAACAAATTCTACTTAGTTAAAGATTACAATAGT

CCAACTTTAATTGGTTGGGTTAAACAAGGTGACGTTATTTATAACAATGCAAAATCACCT

GTAAATGTAATGCAAACATATACAGTAAAACCAGGCACTAAATTATATTCAGTACCTTGG

GGCACTTATAAACAAGAAGCTGGTGCAGTTTCTGGTACAGGTAACCAAACTTTTAAAGCG

ACTAAGCAACAACAAATTGATAAATCTATCTATTTATTTGGAACTGTAAATGGTAAATCT

GGTTGGGTAAGTAAAGCATATT'TAGCTGTACCTGCTGCACCTAAAAAAGCAGTAGCACAA

CCAAAAACAGCTGTAAAA

SEQ ID NO: 81 seqüência de polinucleotídeoGCTTATACTGTTACTAAACCACAAACGACTCAAACAGTTAGCAAGATTGCTCAAGTTAAA

CCAAACAACACTGGTATTCGTGCTTCTGTTTATGAAAAAACAGCGAAAAACGGTGCGAAA

TATGCAGACCGTACGTTCTATGTAACAAAAGAGCGTGCTCATGGTAATGAAACGTATGTA

TTATTAAACAATACAAGCCATAACATCCCATTAGGTTGGTTCAATGTAAAAGACTTAAAT

GTTCAAAACTTAGGCAAAGAAGTTAAAACGACTCAAAAATATAC TGTTAATAAATCAAAT

AACGGCTTATCAATGGTTCCTTGGGGTACTAAAAACCAAGTCATTTTAACAGGCAATAAC

42/68

ATTGCTCAAGGTACATTTAATGCAACGAAACAAGTATCTGTAGGCAAAGATGTTTATTTA

TACGGTACTATTAATAACCGCACTGGTTGGGTAAATGCAAAAGATTTAACTGCACCAACT

GCTGTGAAACCAAC TACATCAGCTGCCAAAGATTATAACTACACTTATGTAATTAAAAAT

GGTAATGGTTATTACTATGTAACAC CAAATTCTGATACAGCTAAATACTCATTAAAAGCA

TTTAATGAACAACCATTCGCAGTTGTTAAAGAACAAGTCATTAATGGACAAAC TTGGTAC

TATGGTAAATTATCTAACGGTAAATTAGCATGGATTAAATCAACTGATTTAGCTAAAGAA

TTAATTAAGTATAATCAAACAGGTATGACATTAAACCAAGTTGCTCAAATACAAGCTGGT

TTACAATATAAACCACAAGTACAACGTGTACCAGGTAAGTGGACAGATGCTAAATTTAAT

GATGTTAAGCATGCAATGGATACGAAGCGTTTAGCTCAAGATCCAG CATTAAAATATCAA

TTCTTACGCTTAGACCAACCACAAAATATTTCTATTGATAAAATTAATCAATTCTTAAAA

GGTAAAGGTGTATTAGAAAAC CAAGGTGCTGCATTTAACAAAGCTGCTCAAATGTATGGC

ATTAATGAAGTTTATCTTATCTCACATGCCCTATTAGAAACAGGTAACGGTACTTC TCAA

TTAGCGAAAGGTGCAGATGTAGTGAACAACAAAGTTGTAACTAACTCAAACACGAAATAC

CATAACGTATTTGGTATTGCTGCATATGATAACGATCCTTTACGTGAAGGTATTAAATAT

GCTAAACAAG CTGGTTGGGACACAGTATCAAAAGCAATCGTTGGTGGTGCTAAATTCATC

GGCAACTCATATGTAAAAGCTGGTCAAAATACACTTTACAAAATGAGATGGAATCCTGCA

CATCCAGGAACACACCAATATGCTACAGATGTAGATTGGGCTAACATCAATGCTAAAATC

ATCAAAGGCTACTATGATAAAATTGGCGAAGTCGGCAAATACTTCGACATCCCACAATAT

AAA

SEQ ID NO: 82 seqüência de polinucleotídeoGATCGTGTATTAGCCTCACATC CAGATGTTGCGACAATACGTCAAAACGTGACAGCAGCG

AATGCCGCTAAATCAGCACTTGATCAAGCACGTAATGGCTTAACAGTCGATAAAGCGCCT

TTAGAAAATGCGAAAAATCAACTACAACATAGTATTGACACGCAAACAAGTACAACTGGT

ATGACACAAGACTCTATAAATGCATACAATGCGAAGTTAACAGCTGCACGTAATAAGATT

CAACAAATCAATCAAGTATTAGCAGGTTCACCGACTGTAGAACAAATTAATACAAATACG

TCTACAGCAAATCAAGCTAAATCTGATTTAGATCATGCACGTCAAGCTTTAACACCAGAT

AAAGCGCCGCTTCAAACTGCGAAAACGCAATTAGAACAAAGCATTAATCAACCAACGGAT

ACAACAGGTATGACGACCGCTTCGTTAAATGCGTACAACCAAAAATTACAAG CAGCGCGT

CAAAAGTTAACTGAAATTAATCAAGTGTTGAATGGCAACC CAACTGTCCAAAATATCAAT

GATAAAGTGACAGAGGCAAACCAAGCTAAGGATCAATTAAATACAGCACGTCAAGGTTTA

ACATTAGATAGACAGCCAGCGTTAACAACATTACATGGTGCATCTAACTTAAACCAAGCA

CAACAAAATAATTTCACGCAACAAATTAATGCTGCTCAAAATCATGCTGCGCTTGAAACA

ATTAAGTCTAACATTACGGCT TTAAATACTGCGATGACGAAATTAAAAGACAGTGTTGCG

GATAATAATACAATTAAATCAGATCAAAATTACACTGACGCAACACCAGCTAATAAACAA

GCGTATGATAATGCAGTTAATGCGGCTAAAGGTGTCATTGGAGAAACGACTAATCCAACG

ATGGATGTTAA CACAGTGAACCAAAAAGCAGCATCTGTTAAATCGACGAAAGATGCTTTA

GATGGTCAACAAAACTTACAACGTGCGAAAACAGAAGCAACAAATGCGATTACGCATGCA

AGTGATTTAAACCAAGCACAAAAGAATGCATTAACACAACAAGTGAATAGTGCACAAAAC

GTGCAAGCAGTAAATGATATTAAACAAACGACTCAAAGCTTAAATACTGCTATGACAGGT

TTAAAACGTGGCGTTGCTAATCATAACCAAGTCGTACAAAGTGATAATTATGTCAACGCA

GATACTAATAAGAAAAATGATTACAACAATGCATACAACCATGCGAATGACATTATTAAT

GGTAATGCACAACATCCAGTTATAACACCAAGTGATGTTAACAATGCTTTATCAAATGTC

ACAAGTAAAGAACATGCATTGAATGGTGAAGCTAAGTTAAATGCTGCGAAACAAGAAGCG

AATACTGCATTAGGTCATTTAAACAATTTAAATAATGCACAACGTCAAAACTTACAATCG

CAAATTAATGGTGCGCATCAAATTGATGCAGTTAATACAATTAAGCAAAATGCAACAAAC

TTGAATAGTGCAATGGGTAACTTAAGACAAGCTGTTGCAGATAAAGATCAAGTGAAACGT

ACAGAAGATTATGCGGATGCAGATACAGCTAAACAAAATGCATATAACAGTGCAGTTTCA

AGTGCCGAAACAATCATTAATCAAACAACAAATCCAACGATGTCTGTTGATGATGTTAAT

CGTGCAACTTCAGCTGTTACTTCTAATAAAAATG CATTAAATGGTTATGAAAAATTAGCA

CAATCTAAAACAGATGCTGCAAGAGCAATTGATGCATTACCACATTTAAATAATGCACAA

AAAGCAGATGTTAAATCTAAAATTAATGCTGCATCAAATATTGCTGGCGTAAATACTGTT

AAACAACAAGGTACAGATTTAAATACAGCGATGGGTAACTTGCAAGGTGCAATCAATGAT

GAACAAACGACGCTTAATAGTCAAAACTATCAAGATGCGACACCTAGTAAGAAAACAGCA

TACACAAATGCGGTACAAGCTGCGAAAGATATTTTAAATAAATCAAATGGTCAAAATAAA

ACGAAAGATCAAGTTACTGAAGCGATGAATCAAGTGAATTCTGCTAAAAATAACTTAGAT

43/68

GGTACGCGTTTATTAGAT

SEQ ID NO: 83 seqüência de polinucleotídeoGCTTCTACACAACATACAGTACAATCTGGTGAATCATTATGGAGTATTGCTCAAAAATAC

AACACTTCAGTAGAGAGTATTAAACAAAATAAC CAATTAGATAACAACTTGGTATTCC CT

GGTCAAGTTATCTCAGTAGGTGGAAGTGATGCACAAAATACGTCAAACACTTC TCCACAA

GC TGGTTCAGCATCATCTCATACTGTACAAGCTGGTGAATCATTAAATATCATTGCTAGC

AGATATGGTGTTTCAGTTGATCAATTAATGGCAGCCAATAACTTACGTGGTTATTTAATT

ATGCCTAACCAAACATTACAAATTCCTAATGGTGGATCAGGTGGTACAACACCAACAGCT

ACAACAGGTAGCAATGGCAATGCATCATCTTTTAATCAC CAAAATTTATACACTGCTGGT

CAATGTACATGGTACGTATTTGACCGTCGTGCTCAAGC TGGTAGTCCAATTAGCACATAT

TGGTCAGACGCTAAGTATTGGGCTGGTAACGCAGCTAATGATGGTTACCAAGTAAACAAC

ACACCATCAGTTGGTTCAATTATGCAAAGCACACCTGGTCCATATGGTCATGTTGC TTAT

GTTGAACGTGTCAATGGTGATGGTAGTATCTTGAT TTCTGAAATGAATTACACATATGGT

CCATACAATATGAACTACCGTACAATTCCAGCTTCAGAAGTTTCTAGCTATGCATTCATC

CATTAA

SEQ ID NO:84 seqüência de polinucleotídeoATGAATAATAAAAAGACAGCAACAAATAGAAAAGGCATGATAC CAAATCGATTAAACAAA

TTTTCGATAAGAAAGTATTC TGTAGGTACTGCTTCAATTTTAGTAGGGACAACATTGATT

TTTGGGTTAAGTGGTCATGAAGCTAAAGCGGCAGAACATACGAATGGAGAATTAAATCAA

TCAAAAAATGAAACGACAGCC CCAAGTGAGAATAAAACAACTAAAAAAGTTGATAGTCGT

CAACTAAAAGACAATACGCAAACTGCAACTGCAGATCAGCCTAAAGTGACAATGAGTGAT

AGTGCAACAGTTAAAGAAACTAGTAGTAACATGCAATCACCACAAAACGCTACAGCTAAT

CAATCTACTACAAAAACTAGCAATGTAACAACAAATGATAAATCATCAACTACATATAGT

AATGAAACTGATAAAAGTAATTTAACACAAGCAAAAGATGTTTCAACTACACCTAAAACA

ACGACTATTAAACCAAGAACTTTAAATCGCATGGCAGTGAATAC TGTTGCAGCTC CACAA

CAAGGAACAAATGTTAATGATAAAGTACATTTTTCAAATATTGACATTGCGATTGATAAA

GGACATGTTAATCAGACTACTGGTAAAAC TGAATTTTGGGCAACTTCAAGTGATGTTTTA

AAATTAAAAGCAAATTACACAATCGATGATTCTGTTAAAGAGGGCGATACATTTACTTTT

AAATATGGTCAATATTTC CGTCCAGGATCAGTAAGATTAC C TTCACAAACTCAAAATTTA

TATAATGCCCAAGGTAATATTATTGCAAAAGGTATTTATGATAGTACAACAAACACAACA

ACATATACTTTTACGAAC TATGTAGATCAATATACAAATGTTAGAGGTAGCTTTGAACAA

GTTGCATTTGCGAAACGTAAAAATGCAACAAC TGATAAAACAGCTTATAAAATGGAAGTA

ACTTTAGGTAATGATACATATAGCGAAGAAATCATTGTCGATTATGGTAATAAAAAAGCA

CAACCGCTTATTTCAAGTACAAACTATATTAACAATGAAGATTTATCGCGTAATATGACT

GCATATGTAAATCAAC C TAAAAATACATATACTAAACAAACGTTTGTTAC TAATTTAACT

GGATATAAATTTAATC CAAATGCAAAAAACTTCAAAATTTACGAAGTGACAGATCAAAAT

CAATTTGTGGATAGTTTCAC CCCTGATACTTCAAAACTTAAAGATGTTACTGATCAATTC

GATGTTATTTATAGTAATGATAATAAAACAGC TACAGTCGATTTAATGAAAGGCCAAACA

AGCAGCAATAAACAATACATCATTCAACAAGTTGC TTATCCAGATAATAGTTCAACAGAT

AATGGAAAAATTGATTATACTTTAGACACTGACAAAACTAAATATAGTTGGTCAAATAGT

TATTCAAATGTGAATGGCTCATCAACTGCTAATGGCGACCAAAAGAAATATAATCTAGGT

GACTATGTATGGGAAGATACAAATAAAGATGGTAAACAAGATGC CAATGAAAAAGGGATT

AAAGGTGTTTATGTCATTCTTAAAGATAGTAACGGTAAAGAATTAGATCGTACGACAACA

GATGAAAATGGTAAATATCAGTTCACTGGTTTAAGCAATGGAACTTATAGTGTAGAGTTT

TCAACACCAGC CGGTTATACAC CGACAACTGCAAATGTAGGTACAGATGATGCTGTAGAT

TCTGATGGACTAACTACAACAGGTGTCATTAAAGACGCTGACAACATGACATTAGATAGT

GGATTCTACAAAACACCAAAATATAGTTTAGGTGATTATGTTTGGTACGACAGTAATAAA

GATGGTAAACAAGATTCGACTGAAAAAGGAATTAAAGGTGTTAAAGTTAC TTTGCAAAAC

GAAAAAGGCGAAGTAATTGGTACAACTGAAACAGATGAAAATGGTAAATACCGCTTTGAT

AATTTAGATAGTGGTAAATACAAAGTTATC TTTGAAAAACCTGCTGGCTTAACTCAAACA

GGTACAAATACAACTGAAGATGATAAAGATGCCGATGGTGGCGAAGTTGATGTAACAATT

ACGGATCATGATGATTTCACACTTGATAATGGCTACTACGAAGAAGAAACATCAGATAGC

GACTCAGATTCTGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGATAGCGAC TCA

GATTCAGACAGCGATTCAGACAGCGACTCAGACTCAGATAG CGATTCAGATTCAGACAGC

GACTCAGAC TCAGACAGCGATTCAGAC TCGGATAG C GAC TCAGACTCAGATAGCGAC TCA

GATTCGGATAGCGACTCAGACTCAGATAGCGATTCAGATTCAGATAGCGATTCGGACTCA

GACAGTGATTCAGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATT C TGACAGCGATTCAGAC TCA

44/68

GACAGCGACTCAGACTCAGACAGTGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGC

GACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGATAGCGATTCGGACTCAGACAACGACTCA

GATTCAGATAGCGAT TCAGATTCAGATAGCGACTCAGATTCGGACAGCGATTCAGACTCA

GATAGCGATTCAGACTCAGACAGCGATTCAGATTCAGATAGCGACT CAGACTCAGATAGC

GACTCAGACTCGGATAGCGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGCGATTCG

GACTCAGACAACGACTCAGATTCAGATAGCGATTCAGATTCAGATGCAGGTAAACATACT

CCGGCTAAACCAATGAGTACGGTTAAAGATCAGCATAAAACAGCTAAAG CATTAC CAGAA

ACAGGTAGTGAAAATAATAATTCAAATAATGGCACATTATTCGGTGGATTATTCGCGGCATTAGGATCATTATTGTTATTCGGTCGTCGTAAAAAACAAAATAAATAA

SEQ ID NO: 85 seqüência de polinucleotídeoATGAATTTGTTAAAGAAAAATAAATATAGTATTAGGAAGTATAAAGTAGGCATATTCTC T

ACTTTAATCGGAACAGTTTTATTACTTTCAAACCCAAATGGTGCACAAGCCTTAACTACG

GATAATAATGTACAAAGCGATACTAATCAAGCAACACCTGTAAATTCACAAGATAAAGAT

GTTGCTAATAATAGAGGTTTAGCAAATAGTGCGCAGAATACACCTAATCAATCTGCAACA

AC CAATCAAGCAACGAATCAAGCATTGGTTAATCATAATAATGGTAGTATAGTAAATCAA

GCTACGCCAACATCAGTGCAATCAAGTACGCCTTC.AGCACAAAACAATAATCATACAGAT

GGCAATACAACAGCAACTGAGACAGTGTCAAACGCTAATAATAATGATGTAGTGTCGAAT

AATACCGCATTAAATGTACCAACTAAAACAAATGAAAATGGTTCAGGAGGACATCTAACT

T TAAAGGAAATTCAAGAAGATGTTCGTCATTCTTCAAATAAAC CAGAGCTAGTTGCAATT

GCTGAACCAGCATCTAATAGACCGAAAAAGAGAAGTAGACGTGCGGCACCGGCAGATC CT

AATGCAACTCCAGCAGATCCAGCGGCTGCAGCGGTAGGAAACGGTGGTGCACCAGTTGCA

ATTACAGCGCCATATACGCCAACAACTGATCCTAATGCCAATAATGCAGGACAAAATGCA

CCTAACGAAGTGCTGTCATTTGATGACAA.TGGTATTAGACCAAGTACCAACCGTTCTGTG

CCAACAGTAAACGTTGTTAATAACTTGCCGGGCTTCACACTAATCAATGGTGGCAAAGTA

GGGGTGTTTAGTCATGCAATGGTAAGAACGAGCATGTTTGATTCAGGAGATAATAAGAAC

TATCAAGCACAAGGAAATGTAATTGCATTAGGTCGTATACATGGAACTGATACGAATGAC

CATGGCGATTTTAATGGTATCGAGAAAGCATTAACAGTAAATCCGAATTCTGAATTAATC

TTTGAATTTAATACAATGACTACTAAAAACGGTCAAGG CGCAACAAATGTTATTAT CAAA

AATGCTGATACTAATGATACGATTGCTGAAAAGACTGTTGAAGGCGGTCCAACTTTGCGT

TTATTTAAAGTAC CTGATAATGTGAGAAATCTCAAAAT TCAATTTGTAC CTAAAAATGAC

GCAATAACAGATGCGCGTGGCATTTATCAACTAAAAGATGGTTACAAATACTATAGCTTT

GTTGACTCTATCGGACTTCATTCTGGGTCACATGTTTTTGT TGAAAGACGAACAATGGAT

C CAACAGCAACAAATAATAAAGAGTTTACTGTAACAACATCATTAAAGAATAATGGTAAT

TCTGGTGCTTCTCTAGATACAAATGACTTTGTATATCAAGTTCAATTACCTGAAGGTGTT

GAATATGTGAACAATTCATTGACTAAAGATTTTCCAAGTAACAATTCAGGCGTTGATGTT

AATGATATGAATGTTACATATGATGCAGCAAATCGTGTGATAACAATTAAAAGTAC TGGA

GGAGGTACAGCAAACTCTCCGGCACGACTTATGC CTGATAAAATACTCGATTTAAGATAT

AAATTACGTGTAAATAATGTGCCGACACCAAGAACAGTAACATTTAACGAGACATTAACG

TATAAAACATATACACAAGATTTCATTAATTCAGCTGCAGAAAGTCATACTGTAAGTACA

AATCCATATACTATCGATATCATCATGAATAAAGATGCATTACAAGCCGAAGTTGACAGA

CGTATTCAACAAGCTGATTATACATTTGCGTCATTAGATATCTTTAATGGTCTGAAACGA

CGCGCACAAACGATTTTAGATGAAAATCGTAACAATGTAC CATTAAATAAAAGAGTTTCT

CAAGCATATATTGATTCATTAACTAATCAAATGCAACATACGTTAATTCGAAGTGTTGAT

GCTGAAAATGCAGTTAATAAAAAAGTTGAC CAAATGGAAGATTTAGTTAATCAAAATGAT

GAATTGACAGATGAAGAAAAACAAGCAGCAATACAAGTTATCGAGGAACATAAAAATGAA

ATAATTGGTAATATTGGTGAC C AAACGACTGATGATGGCGTTACTAGAATCAAAGATCAA

GGTATACAGACCTTAAGTGGGGATACTGCAACACCGGTTGTTAAACCAAATGCTAAAAAA

GCAATACGTGATAAAGCAACGAAACAAAGGGAAATTATCAATGCAACAC CAGATGCTACT

GAAGACGAGATTCAAGATGCACTAAATCAATTAGCTACGGATGAAACAGATGCTATTGAT

AATGTTACGAATGCTACTACAAATGCTGACGTTGAAACAGCTAAAAATAATGGCATCAAT

ACTATTGGAGCAGTTGTTCCTCAAGTAACTCATAAAAAAGCTGCAAGAGATGCAATTAAC

CAAGCAACAGCAACGAAAAGACAACAAATAAATAGTAATAGAGAAGCAACTCAGGAAGAG

AAAAATGCAGCATTGAACGAATTAACTCAAGCAACCAACCATGCTTTAGAACAAATCAAT

CAAGCAACAACAAATGCTAATGTTGATAACGCCAAAGGAGATGGTCTAAATGCCATTAAT

CCAATTGCTCCTGTAACTGTTGTTAAGCAAGCTGCAAGGGATGCCGTATCACATGATG CA

CAACAACATATCGCAGAGATCAATGCTAATC CTGATGCGACTCAAGAAGAAAGACAAG CA

GCAATTGACAAAGTGAATGC TGCTGTAACTGCAGCAAACACAAACATTTTAAACGC TAAT

45/68

ACCAATGCTGATGTTGAACAAGTAAAGACAAATGCGATTCAAGGAATACAAGCAATTACA

CCAGCTACAAAAGTAAAAACAGATGCAAAAAATGCCATCGATAAAAGTGCGGAAACGCAA

CATAATACGATATTTAATAATAATGATGCGACGCTCGAAGAACAACAAGCAGCACAACAA

TTACTTGATCAAGCTGTAGCCACAGCGAAGCAAAATATTAATGCAGCAGATACGAATCAA

GAAGTTGCACAAGCAAAAGATCAGGGCACACAAAATATAGTAGTGATTCAACCGGCAACA

CAAGTTAAAACGGATACTCGCAATGTTGTAAATGATAAAGCGCGAGAGGCGATAACAAAT

ATCAATGCTACAACTGGCGCGACTCGAGAAGAGAAACAAGAAGCGATAAATCGTGTCAAT

ACACTTAAAAATAGAGCATTAACTGATATTGGTGTGACGTCTACTACTGCGATGGTCAAT

AGTATTAGAGACGATGCAGTCAATCAAATCGGCGCAGTTCAACCGCATGTAACGAAGAAA

CAAACTGCTACAGGTGTATTAAATGATTTAGCAACTGCTAAAAAGCAAGAAATTAATCAA

AACACAAATGCAACAACTGAAGAAAAGCAAGTGGCTTTAAATCAAGTGGATCAAGAGTTA

GCAACGGCAATTAATAATATAAATCAAGCTGATACAAATGCGGAAGTAGATCAAGCGCAA

CAATTAGGTACAAAAGCAATTAATGCGATTCAGCCAAATATTGTTAAAAAACCTGCAGCA

TTAGCACAAATCAATCAGCATTATAATGCTAAATTAGCTGAAATCAATGCTACACCAGAT

GCAACGAATGATGAGAAAAATGCTGCGATCAATACTTTAAATCAAGACAGACAACAAGCT

ATTGAAAGTATTAAACAAGCTAACACAAATGCAGAAGTAGACCAAGCTGCGACAGTAGCA

GAGAATAATATCGATGCTGTTCAAGTTGATGTAGTAAAAAAACAAGCAGCGCGAGATAAA

ATCACTGCTGAAGTGGCGAAGCGTATTGAAGCGGTTAAACAAACACCTAATGCAACTGAC

GAAGAAAAGCAGGCTGCTGTTAATCAAATCAATCAACTTAAAGATCAAGCAATTAATCAA

ATTAATCAAAACCAAACAAATGATCAGGTAGACACAACTACAAATCAAGCGGTAAATGCT

ATAGATAATGTTGAAGCTGAAG.TAGTAATTAAAACAAAGGCAATTGCAGATATTGAAAAA

GCTGTTAAAGAAAAGCAACAGCAAATTGATAATAGTCTTGATTCAACAGATAATGAGAAA

GAAGTTGCTTCACAAGCATTAGCTAAAGAAAAAGAAAAAGCACTTGCAGCTATTGACCAA

GCTCAAACGAATAGTCAGGTGAATCAAGCAGCAACAAATGGTGTATCAGCGATTAAAATT

ATTCAACCTGAAACAAAAGTTAAACCAGCTGCACGTGAAAAAATCAATCAAAAAGCGAAT

GAATTACGTGCTAAGATTAATCAGGATAAAGAAGCAACAGCAGAAGAAAGACAAGTAGCA

CTAGATAAAATCAATGAATTTGTAAATCAAGCCATGACAGATATTACGAATAATAGAACA

AATCAACAAGTTGATGATACAACAAGTCAAGCGCTTGATAGCATTGCTTTAGTGACGCCT

GACCATATTGTTAGAGCAGCTGCTAGAGATGCAGTTAAGCAACAATATGAAGCTAAAAAG

CGCGAAATTGAGCAAGCGGAACATGCGACTGATGAAGAAAAACAAGTTGCTTTAAATCAA

TTAGCGAATAATGAAAAACGTGCATTACAAAACATCGATCAAGCAATAGCGAATAATGAT

GTGAAACGTGTTGAAACAAATGGCATTGCTACACTAAAAGGTGTACAACCTCATATTGTA

ATTAAGCCTGAAGCACAACAAGCAATAAAAGCAAGTGCAGAAAATCAAGTAGAATCAATA

AAAGATACACCACATGCAACAGTTGATGAATTAGATGAAGCGAATCAATTAATTAGCGAC

ACACTCAAACAAGCGCAACAAGAAATAGAAAATACAAATCAAGATGCTGCTGTTACTGAT

GTTAGAAATCAAACAATCAAGGCAATAGAGCAAATAAAACCTAAAGTAAGACGTAAACGA

GCTGCGCTTGATAGCATTGAAGAAAATAATAAAAATCAACTCGATGCAATCCGAAATACG

TTGGATACTACTCAAGATGAAAGAGATGTTGCTATTGATACTTTAAATAAAATTGTAAAT

ACAATTAAAAATGACATTGCACAAAACAAAACGAATGCAGAAGTGGATCGAACTGAGACT

GATGGCAACGACAACATCAAAGTGATTTTACCTAAAGTTCAAGTTAAACCAGCAGCGCGT

CAATCTGTTGGTGTAAAAGCCGAAGCTCAAAATGCACTAATCGATCAAAGCGATTTATCA

ACTGAAGAAGAAAGACTAGCTGCTAAACATTTAGTAGAACAAGCACTTAATCAGGCTATT

GATCAGATCAATCATGCAGATAAGACTGCCCAAGTTAATCAAGATAGTATAAATGCTCAA

AATATTATTTC.AAAAATTAAACCAGCGACAACAGTTAAAGCAACAGCATTACAACAAATT

CAAAATATCGCTACAAATAAAATTAATTTAATTAAAGCAAATAACGAAGCGACAGATGAA

GAACAAAATATTGCAATAGCACAAGTTGAAAAAGAGTTAATTAAAGCTAAACAACAAATT

GCTAGTGCAGTGACTAATGCAGATGTGGCATATTTATTGCATGATGAGAAAAACGAAATT

CGTGAAATCGAACCTGTTATTAACAGAAAGGCGTCTGCTCGAGAACAATTGACAACATTA

TTCAACGATAAAAAACAAGCAATTGAAGCGAATATTCAAGCAACGGTAGAAGAAAGAAAT

AGTATATTAGCACAGTTACAAAATATTTATGACACTGCTATTGGACAAATTGATCAAGAT

CGTAGCAATGCACAAGTTGATAAAACAGCATCATTAAATCTACAAACAATACATGATTTA

GATGTACATCCTATTAAAAAGCCAGATGCTGAAAAAACGATTAATGATGATCTTGCACGC

GTCACTGCT£TAGTGCAAAATTATCGAAAAGTAAGTAATCGTAATAAGGCTGATGCATTA

AAAGCTATAACTGCTTTAAAATTACAAATGGATGAAGAATTAAAAACAGCACGCACTAAT

GCTGATGTTGATGCAGTTTTAAAACGATTTAATGTTGCATTAAGCGATATAGAAGCAGTA

ATTACTGAAAAAGAAAATAGCTTACTGCGAATTGATAACATTGCTCAACAAACATATGCG

AAATTCAAAGCGATCGCAACACCAGAACAATTAGCTAAAGTAAAAGTATTAATTGATCAA

TATGTTGCAGATGGCAATAGAATGATTGATGAAGATGCGACATTAAATGACATCAAACAA

CACACGCAATTCATTGTTGATGAAATTTTAGCAATTAAATTACCAGCTGAAGCGACGAAA

GTATCACCAAAAGAAATTCAGCCAGCTCCAAAAGTTTGTACGCCTATTAAAAAAGAAGAG

ACACATGAATCGCGCAAAGTTGAAAAAGAACTTCCAAATACAGGTTCTGAAGGAATGGAT

46/68

TTACCATTGAAAGAATTTGCACTGATTACAGGTGCGGCTTTGTTAGCTAGAAGACGTACT

AAAAACGAAAAAGAATCATAA

SEQ ID NO: 86 seqüência de polinucleotídeoGAGGAGAATTCAGTAC.AAGACGTTAAAGATTCGAATACGGATGATGAATTATCAGACAGC

AATGATCAGTCTAGTGATGAAGAAAAGAATGATGTGATCAATAATAATCAGTCAATAAAC

ACCGACGATAATAACCAAATAATTAAAAAAGAAGAAACGAATAACTACGATGGCATAGAA

AAACGCTCAGAAGATAGAACAGAGTCAACAACAAATGTAGATGAAAACGAAGCAACATTT

TTACAAAAGACCCCTCAAGATAATACTCATCTTACAGAAGAAGAGGTAAAAGAATCCTCA

TCAGTCGAATCCTCAAATTCATCAATTGATACTGCCCAACAACCATCTCACACAACAATA

AATAGAGAAGAATCTGTTCAAACAAGTGATAATGTAGAAGATTCACACGTATCAGATTTT

GCTAACTCTAAAATAAAAGAGAGTAACACTGAATCTGGTAAAGAAGAGAATACTATAGAG

CAACCTAATAAAGTAAAAGAAGATTCAACAACAAGTCAGCCGTCTGGCTATACAAATATA

GATGAAAAAATTTCAAATCAAGATGAGTTATTAAATTTACCAATAAATGAATATGAAAAT

AAGGCTAGACCATTATCTACAACATCTGCCCAACCATCGATTAAACGTGTAACCGTAAAT

CAATTAGCGGCGGAACAAGGTTCGAATGTTAATCATTTAATTAAAGTTACTGATCAAAGT

ATTACTGAAGGATATGATGATAGTGAAGGTGTTATTAAAGCACATGATGCTGAAAACTTA

ATCTATGATGTAACTTTTGAAGTAGATGATAAGGTGAAATCTGGTGATACGATGACAGTG

GATATAGATAAGAATACAGTTCCATCAGATTTAACCGATAGCTTTACAATACCAAAAATA

AAAGATAATTCTGGAGAAATCATCGCTACAGGTACTTATGATAACAAAAATAAACAAATC

ACCTATACTTTTACAGATTATGTAGATAAGTATGAAAATATTAAAGCACACCTTAAATTA

ACGTCATACATTGATAAATCAAAGGTTCCAAATAATAATACCAAGTTAGATGTAGAATAT

AAAACGGCCCTTTCATCAGTAAATAAAACAATTACGGTTGAATATCAAAGACCTAACGAA

AATCGGACTGCTAACCTTCAAAGTATGTTTACAAACATAGATACGAAAAATCATACAGTT

GAGCAAACGATTTATATTAACCCTCTTCGTTATTCAGCCAAGGAAACAAATGTAAATATT

TCAGGGAATGGTGATGAAGGTTCAACAATTATAGACGATAGCACAATAATTAAAGTTTAT

AAGGTTGGAGATAATCAAAATTTACCAGATAGTAACAGAATTTATGATTACAGTGAATAT

GAAGATGTCACAAATGATGATTATGCCCAATTAGGAAATAATAATGATGTGAATATTAAT

TTTGGTAATATAGATTCACCATATATTATTAAAGTTATTAGTAAATATGACCCTAATAAG

GATGATTACACGACTATACAGCAAACTGTGACAATGCAGACGACTATAAATGAGTATACT

GGTGAGTTTAGAACAGCATCCTATGATAATACAATTGCTTTCTCTACAAGTTCAGGTCAA

GGACAAGGTGACT TGCCTCCTGAAAAAACTTATAAAATCGGAGATTACGTATGGGAAGAT

GTAGATAAAGATGGTATTCAAAATACAAATGATAATGAAAAACCGCTTAGTAATGTATTG

GTAACTTTGACGTATCCTGATGGAACTTCAAAATCAGTCAGAACAGATGAAGATGGGAAA

TATCAATTTGATGGATTGAAAAACGGATTGACTTATAAAATTACATTCGAAACACCTGAA

GGATATACGCCGACGCTTAAACATTCAGGAACAAATCCTGCACTAGACTCAGAAGGTAAT

TCTGTATGGGTAACTATTAATGGACAAGACGATATGACGATTGATAGTGGATTTTATCAA

ACACCTAAATACAGCTTAGGGAACTATGTATGGTATGACACTAATAAAGATGGTATTCAA

GGTGATGATGAAAAAGGAATCTCTGGAGTTAAAGTGACGTTAAAAGATGAAAACGGAAAT

ATCATTAGTACAACTACAACCGATGAAAATGGAAAGTATCAATTTGATAATTTAAATAGT

GGTAATTATATTGTTCATTTTGATAAACCTTCAGGTATGACTCAAACAACAACAGATTCT

GGTGATGATGACGAACAGGATGCTGATGGGGAAGAAGTTCATGTAACAATTACTGATCAT

GATGACTTTAGTATAGATAACGGATACTATGATGACGAA

SEQ ID NO: 88 seqüência de polinucleotídeo

ATGATTAACAGGGATAATAAAAAGGCAATAACAAAAAAGGGTATGATTTCAAATCGCTTAAACAAATTTTCGATTAGAAA

GTATACTGTAGGAACTGCATCGATTITAG TAGGTACGACATTGATTTTTGGTCTAGGGAACCAAGAAGCTAAAGCTGCTG

AAAACACTAGTACAGAAAATGCGAAACAAGATGATGCAACGACTAGTGATAATAAAGAAGTAGTGTCGGAAACTGAAAAT

AATTCGACAACAGAAAATGATTCAACAAATCCAATTAAGAAAGAAACAAATACTGATTCACAACCAGAAGCTAAAGAAGA

ATCAACTACATCAAGTACTCAACAACAGCAAAATAACGTIACAGCTACAACTGAAACTAAGCCTCAAAACATTGAAAAAG

AAAATGTTAAACCTTCAACTGATAAAACTGCGACAGAAGATACATCTGTTATTTTAGAAGAGAAGAAAGCACCAAATTAT

ACAAATAACGATGTAACTACAAAACCATCTACAAGTGAAATTCAAACAAAACCAACTACACCTCAAGAATCTACAAATAT

TGAAAATTCACAACCGCAACCAACGCCTTCAAAAG TAGACAATCAAGTTACAGATGCAACTAATCCAAAAGAACCAGTAA

ATGTGTCAAAAGAAGAACTTAAAAATAATCCTGAGAAATTAAAAGAATTAGTTAGAAATGATAACAATACAGATCGTTCA

ACTAAACCAGTTGCTACAGCTC CAACAAGTGTTGCACCAAAACGATTAAATGCCIA A ATGCGTTTTGCAGTTGCACAACC

AGCAGCAGTTGCTTCAAATAATGTAAATGACTTAATTACAGTTACGAAACAGACGATCAAAGTTGGCGATGGTAAAGATA

ATGTGGCAGCAGCGCATGACGGTAAAGATATTGAATATGATACAGAGTTTACAATTGACAATAAAGTCAAAAAAGGCGAT

ACAATGACGATTAATTATGATAAGAATGTAATTCCTTCGGATTTAACAGATAAAAATGATCCTATCGATATTACTGATCC

ATCAGGAGAGGTCATTGCCAAAGGAACATTTGATAAAGCGACTAAGCAAATCACATATACATTTACAGATTATGTAGATA

AATATGAAGATATAAAAGCACGTTTAAL rrrATACTCATATATTGATAAGCAAGCAGTACCTAATGAAACTAGTTTGAAT

TTAACurn. GCAACAGCAGGTAAAGAAACTAGCCAAAACGTTTCTGTTGATTATCAAGACCCAATGGTTCATGGTGATTC

AAACATTCAATCTATCTTTACAAAGTTAGATGAAAACAAACAAACTATTGAACAACAAATTTATGTTAATCCTTTGAAAA

AAACAGCAACTAACACTAAAGTTGATATAGCTGGTAGTCAAGTAGATGATTATGGAAATATTAAACTAGGAAATGGTAGT

47/68

ACCATTATTGACCAAAATACAGAAATAAAAGTTTATAAAGTTAACCCTAATCAACAATTGCCTCAAAGTAATAGAATCTA

TGATTTTAGTCAATACGAAGATGTAACAAGTCAATTTGATAATAAAAAATCATTTAGTAATAATGTAGCAACATTGGATT

TTGGTGATATTAATTCAGCCTATATTATCAAAGTTGTTAGTAAATATACACCTACATCAGATGGCGAACTAGATATTGCT

CAAGGTACTAGTATGAGAACAACTGATAAATATGGTTATTATAATTATGCAGGATATTCAAACTTCATCGTAACTIVTAA

TGACACTGGCGGTGGCGACGGTACTGTTAAACCTGAAGAAAAGTTATACAAAATTGGTGACTATGTATGGGAAGACGTTG

ATAAAGACGGTGTCCAAGGTACAGATTCGAAAGAAAAGCCAATGGCAAACGTTTTAGTTACATTAACTTACCCGGACGGT

ACTACAAAATCAGTAAGAACAGATGCTAACGGTC.ATTATGAATTCGGTGGITTGAAAGACGGAGAAACTTATACAGTTAA

ATTCGAAACGCCAGCTGGATATCTTCCAACAAAAGTAAATGGAACAACTGATGGTGAAAAAGACTCAAATGGTAGTTCTA

TAACTGTTAAAATTAATGGTAAAGATGATATGTCTTTAGACACTGG=TATAAAGAACCTAAATATAATCTTGGTGAC

TATGTATGGGAAGATACAAATAAAGATGGTATCCAAGATG CTAATGAACCTGGTATCAAAGATGTTAAGGTTACATTAAA

AGATAGTACTGGAAAAGTTATTGGTACAACTACTACTGATGCCTCGGGTAAATATAAATITACAGATTTAGATAATGGTA

ACTATACAGTAGAATTTGAAACACCAGCAGGTTACACGCCAACGGTTAAAAATACTACAGCTGAAGATAAAGATTCTAAT

GGTTTAACAACAACAGGTGTCATTAAAGATGCAGATAATATGACATTAGACAGTGGITTCTATAAAACAC CAAAATACAG

TITAGGTGATTATGMGGTACGACAGTAATAAAGACGGTAAACAAGATTCAACTGAAAAAGGTATCAAAGATGTTAAAG

TTACTTTATTAAATGAAAAAGGCGAAGTAATTGGAACAACTAAAACAGATGAAAATGGTAAATATCGTTTCGATAATTTA

GATAGCGGTAAATACAAAGTTATTTTTGAAAAGCCTGC TGGCTTAACACAAACAGTTACAAATACAACTGAAGATGATAA

AGATGCCGATGGTGGCGAAGTTGACGTAACAATTACGGAT CATGATGATTTCATACTTGATAACGGATACTTCGAAGAAG

ATACATCAGACAGTGATTCAGACTCAGACAGTGATTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCAGACAGTGATTCAGACTCAGATAGCGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGACTCAGACAGCGACTCAGACTCAGATAGCGA

CTCAGATTCGGACAGCGATTCAGACTCAGATAG CGACTCAGATTCAGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATT

CAGACAGTGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGACTCAGACAGTGACTCAGACTCAGACAGCGATTCAGATTCAGATAGC

GACTCAGATTCGGACAGTGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGACAGCGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGACTCAGACAGTGATTCAGACTCAGATAGCGATTCGGACTCGGATGCAGGAAAACATACACCTGTTAAACCAATGAGTACTA

CTAAAGACCATCACAATAAAGCAAAAGCATTACCAGAAACAGGTAGTGAAAATAACGGCTCAAATAACGCAACGTTAMT

GGTGGATTATTTGCAGCATTAGGTTCATTATTGTTATTCGGTCGTCGCAAAAAACAAAACAAATAA


ATGCTAAACAGAGAAAATAAAACGGCAATAACAAGGAAAGGCATGGTATCCAATCGATTAAATAAATTTTCGATTAGAAA

GTACACAGTGGGAACAGCATCAATTTTAGTAGGTACAACATTAATTTTTGGTCTGGGGAACCAAGAAGCAAAGGCTGCAGAAAGTACTAATAAAGAATTGAACGAAGCGACAACTTCAGCAAGTGATAATCAATCGAGTGATAAAGTTGATATGCAGCAA

CTAAATCAAGAAGACAATACTAAAAATGATAATCAAAAAGAAATGGTATCATCTCAAGGTAATGAAACGACTTCAAATGG

GAATAAATTAATAGAAAAAGAAAGTGTACAATCTACCACTGGAAATAAAGTTGAAGTTTCAACTGCCAAATCAGATGAGC

AAGCTTCACCAAAATCTACGAATGAAGATTTAAACACTAAACAAACTATAAGTAATCAAGAAGCGTTACAACCTGATTTGCAAGAGAATAAATCAGTGGTAAATGTTCAACCAACTAATGAGGAAAACAAAAAGGTAGATGCCAAAACTGAATCAACTAC

ATTAAATGTTAAAAGTGATGCTATCAAGAGTAATGATGAAACTCTTGTTGATAACAATAGTAATTCAAATAATGAAAATA

ATGCAGATATCAITTTGCCAAAAAGTACAGCACCTAAACGTTTGAATACAAGAATGCGTATAGCAGCAGTACAGCCATCA

TCAACAGAGGCTAAAAATGTTAATGATTTAATCACATCAAATACAACATTAACTGTCGTTGATGCAGATAAAAACAATAA

AATCGTACCAGCCCAAGATTATTTATCATTAAAATCACAAATTACAGTTGATGACAAAGTTAAATCAGGTGATTATTTCA

CAATTAAATACTCAGATACAGTACAAGTATATGGATTGAATCCGGAAGATATTAAAAATA'rTGGTGATATTAAAGATCCA

AATAATGGTGAAACAATTGCGACTGCAAAACATGATACTGCAAATAATTTAATTACATATACATTTACAGATTATGTTGA

TCGATTTAATTCTGTACAAATGGGAATTAATTATTCAATTTATATGGATGCTGATACAATTCCTGTTAGTAAAAACGATG

TTGAGrTTAATGTTACGATAGGTAATACTACAACAAAAACAACTGCTAACATTCAATATCCAGATTATGTTGTAAATGAGAAAAATTCAATTGGATCAGCGTTCACTGAAACAGTITCACATGTTGGAAATAAAGAAAATCCAGGGTACTATAAACAAAC

GATTTATGTAAATCCATCGGAAAATTCITTAACAAATGCCAAACTAAAAGTTCAAGCTTACCACTCAAGTTATCCTAATAATATCGGGCAAATAAATAAAGATGTAACAGATATAAAAATATATCAAGTTCCTAAAGGTTATACATTAAATAAAGGATAC

GATGTGAATACTAAAGAGCTTACAGATGTAACAAATCAATACTTG CAGAAAATTACATATGGCGACAACAATAGCGCTGT

TATTGATTTTGGAAATGCAGATTCTGCTTATGTTGTAATGGTTAATACAAAATTCCAATATACAAATAGCGAAAGCCCAA

CACTTGTTCAAATGGCTACTITATCTTCAACAGGTAATAAATCCGTTTCTACTGGCAATGCTTTAGGATITACTAATAAC

CAAAGTGGCGGAGCTGGTCAAGAAGTATATAAAATTGGTAACTACGTATGGGAAGATACTAATAAAAACGGTGTTCAAGAATTAGGAGAAAAAGGCGTTGGCAATGTAACTGTAACTGTATTTGATAATAATACAAATACAAAAGTAGGAGAAGCAGTTA

CTAAAGAAGATGGGTCATACTTGATTCCAAACTTACCTAATGGAGATTACCGTGTAGAATTTTCAAACTTACCAAAAGGT

TATGAAGTAACCCCTTCAAAACAAGGTAATAACGAAGAATTAGATTCAAACGGCTTATCTTCAGTTATTACAGTTAATGG

CAAAGATAACTTATCTGCAGACTTAGGTATTTACAAACCTAAATACAACTTAGGTGACTATGTCTGGGAAGATACAAATAAAAATGGTATCCAAGACCAAGATGAAAAAGGTATATCTGGCGTAACGGTAACATTAAAAGATGAAAACGGTAACGTGTTAAAAACAGTTACAACAGACGCTGATGGCAAATATAAATTTACTGATTTAGATAATGGTAATTATAAAGTTGAATTTACTAC

ACCAGAAGGCTATACACCGACTACAGTAACATCTGGTAGCGACATTGAAAAAGACTCTAATGGTTTAACAACAACAGGTGTTATTAATGGTGCTGATAACATGACATTAGATAGTGGATTCTACAAAACACCAAAATATAATITAGGTAATTATGTATGG

GAAGATACAAATAAAGATGGTAAGCAGGATTCAACTGAAAAAGGTATTTCAGGCGTAACAGTTACATTGAAAAATGAAAACGGTGAAG rrri ACAAACAACTAAAACAGATAAAGATGGTAAA TATCAATTTACTGGATTAGAAAATGGAACTTATAAAGTTGAATTCGAAACACCATCAGGTTACACACCAACACAAGTAGGTTCAGGAACTGATGAAGGTATAGATTCAAATGGTACATCAACAACAGGTGTCATTAAAGATAAAGATAACGATACTATTGACTCTGGTTTCTACAAACCGACTTACAACTTAGGTGA

CTATGTATGGGAAGATACAAATAAAAACGGTGITCAAGATAAAGATGAAAAGGGCATITCAGGTGTAACAGTTACGTTAAAAGATGAAAACGACAAAGTTTTAAAAACAGTTACAACAGATGAAAATGGTAAATATCAATTCACTGATTTAAACAATGGAACTTATAAAGTTGAATTCGAGACACCATCAGGTTATACACCAACITCAGTAACTTCTGPAn ATGATACTGAAAAAGNITCTAATGGTTTAACAACAACAGGTGTCATTAAAGATGCAGATAACATGACATTAGACAGTGGTTTCTATAAAACACCAAAATATAGTTTAGGTGATTATGTTTGGTACGACAGTAATAAAGACGGCAAACAAGATTCAACTGAAAAAGGTATCAAAGATGTTAAAGTTACTTTATTAAATGAAAAAGGCGAAGTAATTGGAACAACTAAAACAGATGAAAATGGTAAATACTGCTITGATAATTTAGATAGCGGTAAATACAAAGTTATTTTTGAAAAGCCTGCTGGCTTAACACAAACAGTTACAAATACAACTGAAGATGATAAAGATGCAGATGGTGGCGAAGTTGACGTAACAATTACGGATCATGATGATTTCACACTTGATAACGGATACTTCGAAGAAGATACATCAGACAGCGATTCAGACTCAGATAGTGACTCAGACAGCGACTCAGACTCAGACAGCGACTCAGACTCAGACAGTGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGCGACTCAGATTCGGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACT

CAGATTCAGATAGCGATTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGCGATTCGGACTCAGACAGCGATTCAGACTCA

GATAGCGACTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGCGATTCGGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGACAGCGA

48/68

TTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGACAGCGATTCAGA CTCAGATAGMACTCAGACTCAGACAGTGATTCAGATT

CAGACAGCGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCGGACAGCGACTCAGACTCTGATAGCGACTCAGACTCAGACAGT

GATTCAGACAGCGATTCAGACTCGGATGCAGGAAAACATACACCTGTTAAACCAATGAGTACTACTAAAGACCATCACAA

TAAAGCAAAAGCATTACCAGAAACAGGTAGTGAAAATAACGGCTCAAATAACGCAACGTTATTTGGTGGATTATTTG CAG

CATTAGGTTCATTATTGTTATTCGGTCGTCGCAAAAAACAAAACAAATAA


ATGGCTAAATATCGAGGGAAACCGTTTCAATTATATGTAAAGTTATCGTGTTCGACAATGATGGCGACAAGTATCA I PT

AAcGAATATCTTGCCGTACGATGCCCAAGCTGCATCTGAAAAGGATACTGAAATTACAAAAGAGATATTATCTAAGCAAG

ATTTATTAGACAAAGTTGACAAGGCAATTCGTCAAATTGAGCAATTAAAACAGTTATCGGCTTCATCTAAAGAACATTAT

AAAGCACAACTAAATGAAGCGAAAACAGCATCGCAAATAGATGAAATCATAAAACGAGCTAATGAGTTGGATAGCAAAGA

CAATAAAAGTTCTCACACTGAAATGAACGGTCAAAGTGATATAGACAGTAAATTAGATCAATTGCTTAAAGATTTAAATG

AGGTTTCTTCAAATGTTGATAGGGGTCAACAAAGTGGCGAGGACGATCTTAATGCAATGAAAAATGATATGTCACAAACG

GCTACAACAAAACATGGAGAAAAAGATGATAAAAATGATGAAGCAATGGTAAATAAGGCGTTAGAAGACCTAGACCATTT

GAATCAGCAAATACACAAATCGAAAGATGCATCGAAAGATACATCGGAAGATCCAGCAGTGTCTACAACAGATAATAATC

ATGAAGTAGCTAAAACGCCAAATAATGATGGTTCTGGACATGTTGTGTTAAATAAATTCCTTTCAAATGAAGAGAATCAA

AGCCATAGTAATCGACTCACTGATAAATTACAAGGAAGCGATAAAATTAATCATGCTATGATTGAAAAATTAGCTAAAAG

TAATGCCTCAACGCAACATTACACATATcATAAACTGAATACGTTACAATCTTTAGATCAACGTATTGCAAATACGCAAC

TTCCTAAAAATCAAAAATCAGACTTAATGAGCGAAGTAAATAAGACGAAAGAGCGTATAAAAAGTCAACGAAATATTATT

TTGGAAGAACTTGCACGTACTGATGATAAAAAGTATGCTACACAAAGCA rrrTAGAAAGTATATTTAATAAAGACGAGGC

AGTTAAAATTCTAAAAGATATACGTGTTGATGGTAAAACAGATCAACAAATTGCAGATCAAATTACTCGTCATATTGATC

AATTATCTCTGACAACGAGTGATGATTTATTAACGTCATTGATTGATCAATCACAAGATAAGTCGCTATTGATTTCTCAA

ATTTTACAAACGAAATTAGGAAAAGCTGAAGCAGATAAATTGGCTAAAGATTGGACGAATAAAGGATTATCAAATCGCCA

AATCGTTGACCAATTGAAGAAACATTTTGCATCAACTGGCGACACGTCTTCAGATGATATATTAAAAGCAATTTTGAATA

ATGCCAAAGATAAAAAACAAGCAATTGAAACGATTTTAGCAACACGTATAGAAAGACAAAAGGCAAAATTACTGGCAGAT

TTAATTACTAAAATAGAAACAGATCAAAATAAAATTTTTAATTTAGTTAAATCGGCATTGAATGGTAAAGCGGATGATTT

ATTGAATTTACAAAAGAGACTCAATCAAACGAAAAAAGATATAGATTATATTTTATCACCAATAGTAAATCGTCCAAGTT

TACTAGATCGATTGAATAAAAATGGGAAAACGACAGATTTAAATAAGTTAGCAAATTTAATGAATCAAGGATCAGATTTA

TTAGACAGTATTCCAGATATACCCACACCAAAGCCAGAAAAGACGTTAACACTTGGTAAAGGTAATGGATTGTTAAGTGGATTATTAAATGCTGATGGTAATGTATCTTTGCCTAAAGcGGGGGAAACGATAAAAGAACATTGGTTGCCGATATCTGTAA

TTGTTGGTGCAATGGGTGTACTAATGATTTGGTTATCACGACGCAATAAGTTGAAAAATAAAGCATAA


ATGAAAAAATTAGCAACAGTAGGTTCTTTAATTGTAACAAGCACTTTAGTATTCTCAAGTAT

GCCTTTTCAAAATGCGCATGCCGACACAACTTCAATGAATGTGTCGAATAAACAAAGCCAAA

ATGTACAAAATCATCGTCCTTATGGCGGAGTAGTACCACAAGGAATGACGCAAGCACAATATACTGAATTAGAGAAAGCTTTACCCCAATTAAGCGCTGGCAGTAATATGCAAGACTATAATAT

GAAATTGTATGATGCGACGCAAAATATTGCTGATAAATACAATGTGATAATTACAACTAATGTAGGGGTATTTAAACCACATGCTGTTAGAGATATGAATGGCCATGCGTTACCTTTAACAAAAGATGGCAATTTTTATCAAACGAATGTAGATGCAAATGGTGTTAATCATGGTGGTAGTGAAAT

GGTGCAAAATAAAACAGGTCATATGAGTCAACAAGGCCATATGAATCAGAACACACACATGAACCAACAGCCACACATGCAACAAGGTCATATGCAATCATCAAACCATCAAATGATGAGTCCAAAAGCAAATATGCATTCATCAAATCATCAAATGAACCAAAGTAACAAAAAAGTTTTACCAGCTGCTGGTGAAAGTATGACATCAAGTATTCTTACTGCAAGTATTGCCGCACTACTATTAGTATCTGGGTTATTCTTAGCATTTAGACGACGTTCAACAAATAAATAA

49/68

A

B

FIGURA 3

Purificação de alfa-toxina

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 15

10 5 2 1µ1

50/68

90

FIGURA 4

Purificação de SdrC

M Iniciação Fri C D E

MW 1µI 2µ1 5111 10µ1

51/68

FIGURA 5

O.D. em dil

uiçã

o de soro de 1/1

.000

4

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

Elisa anti-atl-amidase

7

7

Combinação Combinação BlccamundongosamundongosPré Pós III

Combinação Combinação Blccoelho coelhoPré Pós III

O.D. em dil

uiçã

o de soro de 1/1

.000

Elisa anti-alfa-toxina

3.5

2.5

2

1.5

0.5

Combinação Combinação BkcamundongowamundongosPré Pós III


O.D. em dil

uiçã

o de soro de 1/1

.000

Elisa anti-EbH

3.5

2.5

2

1.5

0.5

OCombinação Combinação Blc Combinação Combinação Bkcamundongos camundongos coelho coelhopré Pós III Pré Pós III

52/68

FIGURA 5

O.D. em dil

uiçã

o de soro de 1/1

.000

4

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

Anti-SdrG ELISA

CombinaçãocamundongoscamundongosPré Pós III

Combinação Blc CombinaçãocoelhoPré

CombinaçãocoelhoPós III

Blc

oo

Anti-Atl-glucosaminidase ELISA

o

3.5

o

2O 2.5oo17Oeas 1.5•_

E 0.5

oO Combinação Combinação

camundongos camundongosPré Pós III

Blc CombinaçãoCombinaçãocoelho coelhoPré Pós III

Blc

oo

▪ 4

euO 3

Anti-MRP ELISA

3.5

ot4 2.5N• 2oleu0, 1.5

"O 1

E 0.5eu

O Combinação CombinaçãocamundoncescamundongosPré Pós III

Blc Combinação Combinaçãocoelho coelhoPré Pós III

Blc

53/68

FIGURA 5

O.D.

em diluição de soro de 1/1.000 Anti-Sbi ELISA

4

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

0Combinação Combinação B1ccamundongoscamundongosPré Pós III

Combinação Combinaçãocoelho coelhoPré Pós III

Bic

O.D. em dil

uiçã

o de soro de 1/1

.000

Anti-IsdA ELISA

oCombinação Combinação BiccamundongoscamundongosPré Pós III


Anti-SdrC ELISA

ooR

3.5

2• 2.5co

2otas 1.5tr

E 0.5to• o• Combinação Combinação Bic CombinaçãcCombinação

camundongos camundongos coelho coelhoPré Pós III Pré Pós III

Blc

54/68

FIGURA 5

O.D. em dil

uiçã

o de soro de 1/1

.000

Anti4saA ELISA

3.5

2.5

2

1.5

0.5

Combinação Combinação 13Ic Combinação Combinação BEcamundongos camundongos coelho Pré coelho Pós IIIPré Pós III

O.D.

em dil

uiçã

o de soro de 111

.000

Anti-FnbpA ELISA

4

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

CombinaçãoCombinaçãocamundongos camundongos

Pré Pós III

81c Combinação Combinação Blccoelho Pré coelho Pós III

55/68

FIGURA 5

O.D. em dil

uiçã

o de soro de 1/1

.000

4

3.5

3

2.5

1.5

1

0.5

0

CombinaçãocamundongosPré

Anti-atl-AaA ELISA

CombinaçãocamundongosPós III

BlcCombinação Biccoelho Pré coelho Pós III

o

- 3.5e.)

O -o

3

o• 2.5

2oteu• 1.5•—=

E• 0.5

• 0Ó Combinação

camundongosPré

Anti-ClfA ELISA

CombinaçãocamundongosPós III

Blc CombinaçOombinação 13tcoelho Pré coelho Pós III

56/68

A

B

C

FIGURA 6

Soros de camundongo anti-SdrC

2

1.5

0.5 ... .fie..„.....i,

................

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10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480

2

1.5cio

0.5


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Diluições

2

1.5

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Diluições

57/68

A

B

C

FIGURA 6

Soros de camundongo anti-FnbpA

2

1.5

0.5

0 .4,---4,-

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10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480

2

1.5

oE 1c

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0.5


O , • , , •

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Diluições

1.5

CiEccr,cn

0.5


0 ON 0 0 O 0 soo q94 95)

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Diluições

58/68

FIGURA 6

Soros de camundongo anti-EbH

2

1.5

0.5

-"-ia , , ,

10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480

2

1.5CioE 1coa)nt

0.5

o


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Diluições


...„..--e--............

10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480

Diluições

59/68

FIGURA 6

2

soros de camundongo anti-Sbi

T

1.5

1

0.5

0 i i

10 20 40 80 160 320 640 1280

•

2560

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5120

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10240

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20480

2

1.5ci

coE lo

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o ,12 o 00 X00 O,15) O 4bo e$1),95ZI

Diluições

3

2.5

d 2

E 1.5c09 1

0.5

o


10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480

Diluições

60/68

• FIGURA 6

A

B

soros de camundongo anti-CIfA

2

1.5

0.5

10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480

1.5

oEccrb

0.5


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2 4'0 X60

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Diluições

1.5ci

EcOQf

0.5


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10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480

Diluições

61/68

A

B

C

FIGURA 7

3.5

soros de coelho anti-IsaA

3

2.5

2

1.5

1

0.5

O

10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480


4

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5 • •

O

• •

, I---, ç 1

10 40 160 640 2560 10240


3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

O , , i ,-----,----i--- -

10 40 160 640 2560 10240

62/68

FIGURA 7

DO 490

-620

3.5

3

2.5

2

1.5

0.5

o

soros de coelho anti IsdB

10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480

Diluições


4

3.5

3

2.5

2

1.5

1 .----

0.5

0 , 1

ci,30 çp •o bc,, #No ,tio bo, 'bo Nçz.O n51,0 O

1, rf? •r q, rotx


3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

O 1.

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Sbo NÇ,o n51, ço .,.(1, ro <,),,,,

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63/68

A

B

C

FIGURA 7

DO 490-620

3.5

3

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2

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1

0.5

soros de coelho anti-HarA

10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480

Diluições


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64/68

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FIGURA 7soros de coelho anti-Sdrg

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O10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480

soros de coelho anti-Sdrg

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soros de coelho anti-Sdrg

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65/68

A

B

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FIGURA 7soros de coelho anti-Sbi

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10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480

soros de coelho anti-Sbi

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soros de coelho anti-Sbi

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66/68

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FIGURA 7

soros de coelho anti-C1Fa

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10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480

soros de coelho anti-CIFa

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soros de coelho anti-CIFa

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FIGURA 7

soros de coelho anti-Fnbpa

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68/68

A

B

C

FIGURA 7

soros de coelho anti-Atl amidase

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10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480

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Diluições

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Diluições

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1

RESUMO

"COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA, MÉTODOS PARA

PREPARAR A VACINA, E PARA PREVENIR OU TRATAR INFECÇÃO

ESTAFILOCÓCICA, USO DA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E,

5 PROCESSO PARA CONJUGAR OLIGOSSACARlDEO OU

POLISSACARlDEO CAPSULAR"

A presente invenção refere-se às composições imunogênicas

compreendendo oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipos 5 e/ou 8

de S. aureus possuindo entre 30 e 100% de O-acetilação. Vacinas, métodos de

10 tratamento usando [sic] e processos para preparar uma composição

imunogênica compreendendo polissacarídeos capsulares de Tipos 5 e/ou 8

com 30-100% de 0-acetilação também são descritos.

Documents

*11.11 pl .1 II 11111 1111 ADI