Identificaأ§أ£o de genes com variaأ§أ£o de expressأ£o ... DEDALUS -Acervo -CQ 1/111111111111111 11111

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    UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

    Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos Área de Bromatologia

    Identificação de genes com variação de expressão

    durante o amadurecimento da banana

    pela aplicação de técnicas de análise diferencial

    Adriana de Godoy

    Tese para obtenção do grau de

    Doutor

    Orientador: Prof. Dr. João Roberto Oliveira do Nascimento

    São Paulo

    2006

    /ggtJ:J

  • DEDALUS - Acervo - CQ

    1/111111111111111 11111 11111 11111 11111 1111111111 11111 IlIlrllll 1111

    30100012661

    Ficha Catalográfica Elaborad.a pela Divisão de Biblioteca e

    Documentação do Conjunto das Químicas da USP.

    Godoy, Adriana de G589i Identificação de genes com variação de expressão durante

    o amadurecimento da banana pela aplicação de técnicas de análise diferencial/Adriana de Godoy. -- São Paulo, 2006.

    131 p.

    Tese (doutorado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental

    Orientador : Nascimento, João Roberto Oliveira do

    1. Banana : Bioquímica dos alimentos 2 . Controle gênico 3. Expressão gênica 4. Regulação gênica I. T. 11. Nascimento, João Roberto Oliveira do, orientador. .

    641.3477 CDD

  • A Celso, Carmen e Gustavo pela ajuda e incentivo no decorrer

    de toda minha formação pessoal e profissional

    e

    À Luciana e Luiz

    pelo companherismo e apoio

    incondicional no meu Doutorado

  • AGRADECIMENTOS

    A meu orientador Prof. Or. João R. O. Nascimento pela paciência, atenção e por ter me

    iniciado em um novo universo do conhecimento, ao Prof. Or. Franco M. Lajolo por todo

    suporte e infra-estutura laboratorial oferecida para a execução dos experimentos, ao

    Prof. Or. Eduardo Purgatto pela parceria e atenção dispensada, à Profl. O~. Beatriz

    Cordenunsi pelas amostras de banana, à Profa . O~. Maria Inês Genovese pelas

    oportunidades, ao Prof. Or. Fernando Moreno por ceder seu laboratório para alguns

    dos experimentos. E aos demais docentes do departamento que contribuíram para

    minha formação. Às amigas Fernada e Janaina pelos parâmetros fisiológicos das

    bananas.

    Aos amigos que sempre estiveram presentes no decorrer do meu .doutorado: Amanda,

    Ana Paula, Maurício, Milana e Thomas.

    Aos meus colegas de bancada que me ajudaram em alguns dos experimentos: Adair,

    Clarice, Fernanda, João Paulo, Renato, Marcelo e Rodrigo.

    Aos meus colegas de laboratório: Aderuza, Ana Cris, Cláudia, Claudinéia, Eliana, Jack,

    Lena, Malu, Márcia, Patrícia, Priscila, Rosecler, Neuza e Selma.

    Aos técnicos: Alberto, Lúcia, Márcia, Marcelo e Tânia.

    Aos funcionários da FCF e em especial a Lurdinha por todo o suporte e assistência.

    À CAPES pela bolsa e à FAPESP pelo apoio financeiro ao laboratório projeto temático

    (02/12452-9).

  • SUMÁRIO

    1. RESUMO ........................................................................................................ 9

    2. ABSTRACT .................................................................................................. 10

    3. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 11

    4. OBJ ETIVO .................................................................................................... 22

    5. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 23

    5.1. Frutos .................................................................................................................. 23

    5.2. Extração de RNA total ........................................................................................ 24

    5.3. Quantificação de RNA e DNA ............................................................................ 25

    5.4. Eletroforese em gel de agarose ......................................................................... 25

    5.5. Síntese da fita-única de cDNA ........................................................................... 26

    5.6. Síntese de cDNA dupla-fita ................................................................................ 26

    5.7. Purificação de RNA poli A+ a partir de RNA total ............................................. 26

    5.8. "Differential display" RT-PCR ............................................................................ 27 5.8.1. Isolamento e re-amplificação dos fragmentos de DNA ...................................... 31

    5.9. Biblioteca de subtração ..................................................................................... 33 5.9.1. Síntese de cDNA fita-única e dupla-fita de amostra "teste r" e "driver" ........... 33 5.9.2. Digestão com Rsa I e ligação do adaptador na amostra "teste r" ..................... 34 5.9.2. Digestão com Rsa I e ligação do adaptador na amostra "teste r" .: ................... 35 5.9.3. Hibridizações .......................................................................................................... 35 5.9.4. Amplificação por PCR ............................................................................................ 36

    5.10. Purificação dos fragmentos de DNA ............................................................... 37

    5.11. "Northern-blotting" reverso ............................................................................. 37

    5.12. Análise densitométrica .................................................................................... 40

    5.13. Clonagem .......................................................................................................... 41

    5.14. Sequenciamento ............................................................................................... 42

    5.15. "Northern-blotting" .......................................................................................... 43

    6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 45

    6.1. Amostragem de bananas ................................................................................... 45 6.1.1. Primeira amostragem de bananas ........................................................................ 45 6.1.2. Segunda amostragem de bananas ....................................................................... 47

    6.2. Extração de RNA total ........................................................................................ 49

    6.3. "Differential Display" RT-PCR ........................................................................... 51 6.3.1. Clone DD-V1 ............................................................................................................ 62 6.3.2. Clone DD-V2 ............................................................................................................ 66 6.3.3. Clone DD-V3 ............................................................................................................ 70 6.3.4. Clone DD-V4 .............................. .............................................................................. 72 6.3.5. Clone DD-M1 ..................... : ..................................................................................... 74 6.3.6. Clone DD-M2 ........................................................................................................... 78 6.3.7. Clone DD-M3 ........................................................................................................... 83 6.3.8. Clone DD-M4 ........................................................................................................... 88

  • 6.3.9. Clone DO-MS ........................................................................................................... 92

    6.4. Biblioteca de subtração de cO NA ..................................................................... 94 6.4.1. Clone 85-1 ............................................................................................................... 96 6.4.2. Clone 85-2 ............................................................................................................. 102 6.4.3. Clone 85-3 ............................................................................................................. 107 6.4.4. Clone 85-4 ............................................................................................................. 112 6.4.5. Clone 85-5 ............................................................................................................. 116

    7. CONCLUSÃO ................................................................................................ 119

    8. REFERÊNCiAS .............................................................................................. 121

  • LISTA DE FIGURAS

    Figura Resumo da técnica "differential display" RT-PCR 29

    Figura 2 Resumo da técnica biblioteca de subtração de cDNA 34

    Figura 3 Parâmetros fisiológicos do amadurecimento da banana 47

    Figura 4 Parâmetros fis iológicos do amadurecimento da banana 49

    Figura 5 Eletroforese de RNA total 51

    Figura 6 Gel de "differential display"