EXPERINCIA 8

EXPERINCIA 8 - CINTICA DE REAES ENZIMTICAS

Objetivo: Estudar reaes catalisadas por enzimas.

Usar espectofotmetro para acompanhar um processo cintico.

I. Introduo

Enzimas so protenas que catalisam reaes qumicas com uma eficincia formidvel. A enzima catalase, por exemplo, que catalisa a decomposio do perxido de hidrognio segundo a reao:

So catalisadores to eficientes que uma simples molcula da enzima pode decompor milhes de molculas de perxido de hidrognio por minuto, correspondendo a um aumento da velocidade da reao de 107 a 108 vezes.

A regio da molcula onde a enzima e o substrato interagem para formar um complexo denominado de centro ativo. Uma das explicaes para a eficincia da enzima que o complexo enzima-substrato (ES) apresenta uma conformao bem prxima do estado de transio da reao, reduzindo desta forma a energia de ativao da reao. A reao total se processa de acordo com o esquema abaixo,

onde (E) representa a enzima, (S) o substrato e (P) o produto.

Outra caracterstica importante da enzima a sua especificidade, cada enzima combina-se com o seu substrato bem especfico ou com uns poucos bem semelhantes em estrutura, sugerindo que uma enzima e substrato encaixam-se juntos como uma chave e fechadura.

Cintica; Medindo a velocidade inicial ( VO ) de uma reao simples (S ( P), quando esta catalisada por uma dada concentrao de enzima ( EO ) sob condies constantes de reao, verifica-se, que ( VO ) varia com a concentrao de substrato [S]. Fazendo um grfico de VO versus concentrao de [S], obtm-se uma curva hiperblica retangular, (Fig. 1 ao lado), que demonstra que, em baixas conc. de [S] a velocidade inicial diretamente proporcional conc. [S], e que, em conc. altas de [S], a velocidade inicial mxima (Vmax) e seu valor independe da conc. [S]. Desta forma a equao experimental que relaciona VO com [S] normalmente escrita na forma: Figura 1.

(1) Esta equao conhecida como equao de Michaelis-Menten e Km chamado de constante de Michaelis-Menten.

Experimentalmente, os valores de Vmax e Km podem ser determinados pelo mtodo de Lineweaver e Burk, que utiliza o fato de que o inverso da equao de uma hiprbole retangular a equao de uma reta, portanto, o inverso da equao 1 :

(2)

Fazendo um grfico de 1/VO versus 1/[S], obtm-se uma reta cujo coeficiente angular Km/Vmax e o coef. linear 1/Vmax (Fig 2) ao lado.

Figura 2

Nesta experincia vamos utilizar a enzima polifenoloxidase extrada da batata, na reao descrita abaixo:

Polifenoloxidase uma enzima que pertence ao grupo das oxidorredutase. Esta enzima catalisa a remoo do hidrognio (oxidao) do catecol passando-o para o oxignio molecular formando gua e a quinona correspondente.

II. Procedimento

1. Prepare 100 mL de catecol 0,005 M, se for necessrio.

2. Prepare extrato de batata amassando meia batata. Filtre o amassado recolhendo o lquido num bquer pequeno. Voc s precisa de (1,0 mL de extrato.

3. Ligue o termostato e coloque-o na temperatura desejada.

4. Ligue o espectrofotmetro e acerte, zero absorbncia no comprimento de onda () de 458 nm. Para operar corretamente o aparelho siga as instrues no manual ou pea ajuda ao professor.

5. Faa quatro cinticas com concentraes de catecol diferentes, como especificado abaixo.

a) Coloque 0,5 mL de catecol 0,005 M + 2,5 mL de gua numa cubeta, adicione uma gota de H2O2 10% em volume.

b) Coloque a cubeta no suporte de amostra do aparelho e deixe-a termostatizar por 3 minutos, acerte o zero absorbncia. Verifique se a cubeta est na posio correta.c) Agindo com rapidez adicione duas gotas de extrato de batata na cubeta, coloque a tampa na mesma e agite a soluo.

d) Coloque a cubeta no aparelho feche-o e faa a primeira leitura de absorbncia, disparando imediatamente o cronmetro.

e) Faa leituras de 20 em 20 segundos at aproximadamente 10 min. Ao terminar esta faa um espectro da soluo como indicado no item 7.

7. Faa um espectro do produto final da reao variando o comprimento de onda de 400 nm a 530 nm, anotando o valor da absorbncia a cada 10 nm. (no precisa repetir o item 7 para as outras cinticas).

2. Repita o item 5 variando as quantidades de catecol 0,005 M para 0,75 mL; 1,0; 1,5 mL, sempre completando o volume final na cubeta para 3,0 mL.

No final do experimento veja como armazenar corretamente ou tratar os resduos qumicos gerados.

III. Clculos

1. Calcule as conc. de catecol usadas na experincia, ou seja a concentrao final dentro da cubeta. Use esta conc. nos clculos.

2. Calcule a velocidade inicial (VO, coeficiente angular) para todas as cinticas realizadas (4) fazendo um grfico de absorbncia versus tempo, (Figura 3 ao lado).

3. Calcule Km e Vmax para a enzima, como mostrado na Fig 2

4. Faa um grfico com os valores obtidos no item 7, absorbncia versus comprimento de onda. (baseado no espectro, justifique porque as cinticas foram acompanhadas em 458 nm). Figura 3

IV. Ouestionro

1. Como podem ser definidas as enzimas? O que substrato?

2. Que fatores podem explicar a alta eficincia das enzimas como catalisadores?

3. Qual a definio e o significado de Km e Vmax na reao veja as unidades ?

4. O que inibidor enzimtico, quais os tipos de inibio e os principais fatores que diminuem a atividade de uma enzima para atuar como catalisador?

5. O que acontece se voc mudar o pH ou a temperatura do meio reacional e mantiver a concentrao de enzima e substrato constantes. Explique.

6. Cite dois exemplos de enzimas que atuam em sistemas biolgicos e explique a sua atuao.7. As enzimas podem ser desnaturadas quando em contato com soluo de surfactantes. Como isso pode ser explicado?

8. Com a ajuda da literatura, descreva sucintamente os 04 mecanismos principais atravs dos quais as enzimas podem acelerar uma reao: Catlise cido-Base; Toro de Substrato; Catlise Covalente; Diminuio da Entropia. 9.Que tipo de resduos qumicos foram gerados neste experimento e como foram tratados ou armazenados. Explique.

V. Bibliografia

1. Fsico-Qumica para Bilogos, J. Gareth Morris, Ed. 1972.

2. Princpios de Bioqumica, A.L. Lehniniger, Editora Sarvier 1991.3. CHANG, R.,Physical-Chemistry with Applications to Biological Systems. Macmillan Publishing Co. New York, 1981.

4. TINOCO, I. JR., SAUER, K.,WONG, J. C. -Physical Chemistry - Principles and Applications in Biological Sciencies Prentice - Hall, London.

So 04 os mecanismos principais atravs dos quais as enzimas aceleram uma reao:

1. Catlise cido-Base: Aminocidos do centro ativo, com cadeias laterais ionizveis, so capazes de liberar prtons durante a catlise. A histidina, a cistena, a tirosina e os aminocidos cidos (glutamato, aspartato) so importantes nestes processos.

1. Toro de Substrato: Pode ocorrer toro do substrato pela ligao do mesmo com o stio de ligao da enzima, alcanando o estado de transio e estimulando sua converso em produto.

1. Catlise Covalente: Ataques nucleoflicos ou eletroflicos de um radical do stio cataltico sobre o substrato, pode lig-lo covalentemente enzima e induzir a sua transformao em produto. Envolve com freqncia a participao de coenzimas.

1. Diminuio da Entropia: As enzimas posicionam o substrato no local correto da reao, facilitando os mecanismos anteriores.

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