Apresentação simpósio microbiologia - RNAi

8/7/2019 Apresentação simpósio microbiologia - RNAi

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RNAi e terapia viralDoutorando Bruno Moreira Carneiro

Laboratório de Estudos GenômicosUNESP/IBILCE

IV Simpósio de GenéticaUNESP/IBILCE



RNAi

• Histórico

• Mecanismo de ação

• Componentes– RNAs

– Proteínas

• Processamento

• Aplicações

• Desenvolvimento

Terapia Viral

• Vírus da

imunodeficiência• Vírus respiratório

sincicial

•

Vírus da hepatite C• Vírus da Febre

Amarela





• dsRNA – > 30 nt

• miRNA – micro RNAs, 21-25 nt– Codificados por genes endógenos

– Podem reconhecer múltiplos alvos

• siRNA – short interfering RNA, 21-25 nt– Origem exógena

– Alvo específico

• Antisense RNA – ssRNA homólogo ao mRNA alvo

• Fita guia/passageira: reconhecidas pelo RISC



•

1989: Jorgesen – petúnias• Chalcone sintase – pigmentação

– Inserção de CHS quimérico

•

Efeito contrário: flores claras

• Co-supressão

– Gene endógeno + gene introduzido

•

Mecanismo desconhecido!– “os mecanismos de co-supressão são

desconhecidos … possível envolvimento doprocesso de metilação.” (Napoli, 1990)



•

1992: Romano & Macino - Neurosporacrassa

• Inserção de genes al-3 e al-1 – pigmentação

– 1/3 da linhagem perdeu a cor

• Espontaneamente regressível

• Similar à co-supressão

• Mecanismo também era desconhecido



•

Guo & Kemphues, 1995 – Caenorhabditis elegans

– Par-1: assimetria embrionária

• Antisense RNA Par-1: letal

– Técnica utilizada > 30 anos

• Sense (Controle) RNA Par-1: mesmoresultado!

• Artefato da pesquisa

– “As bases para o efeito da fita sense

estão sendo investigadas e não serão

discutidas posteriormente...”



RNAiFire & Mello, 1999



S e A/S inibem a tradução

ssRNA degradação rápida

dsRNA





- Contaminação das fitas S ou A/S

- dsRNA é o agente responsável





•

Mecanismo conservado em céls. Eucarióticas– Ausente em procariotos

X



He and Hannon, 2004

Preparação

Execução





• pri-miRNA -> pre-miRNA– Overhangs 3’

• Enzima RNAse-III nuclear

• Reconhecimento pri-miRNA?

– Tamanho do loop do hairpin

• Ausente em fungos e plantas

– Dicer?



•

Processamento de dsRNA ou pre-miRNA– overhangs 3’ e grupos fosfato

• RNAseIII citoplasmática

•

Domínios funcionais:– PAZ: ???

– 2x RNAse III

• Vários genes codificam Dicer

– Especificidade funcional?





• Componente RISC

• Expressa também Procariotos

– Sem função determinada

•

Atividade de procura de homologia– Ligação com mRNA

– Seleção da fita guia

• Família de proteínas

– Diferentes funções?

– Afinidades diferentes?



• RNA-Induced Silencing Complex

• Complexo efetor da RNAi

• 3 subunidades– Dicer

–

TRBP: recruta Ago2– Ago2

• Atividades associadas ao RISC– Degradação fita passageira

– Endonuclease

– Homologia

• Incorpora preferencialmente uma dasfitas do RNA– Antisense



• Menor estabilidade 5’ é incorporada ao RISC

– Normalmente antisense

• Se a estabilidade 5’ for similar, ambas as fitas são

incorporadas igualmente



Truncamento

Ligação imperfeita entresiRNA e miRNA com o

mRNA alvo

Preferencialmente 3’

Mecanismos?

Degradação

100% homologia commRNA

Ago é a endonucleaseresponsável

Busca de outras nucleases



• Identificação de função gênica

• Terapias

– Doenças do Olho

– Infecções virais

– Câncer

– Doenças degenerativas

• Biotecnologia

– Redução de alérgenos em plantas

– Diminuição na produção de toxinas



Ui, 2004

Fita S - 5' 1nt - G/C

Fita AS - 5' 1nt - A/U

5/7 nt Fita AS - devemser A/U

Amarzguioui, 2004

nt 1 - G/CA6

nt 19 - A/U

U1 e G19 ( - )

A/U nos 6 primeiros 3'



Reynolds, 2004







Terapias Virais







• Primeira descrição (Bitko, 2001)

– Inibição das proteínas virais F e P

– Redução na formação de sincício

– Sem resposta IFN (< 22nt)

– Qualquer ponto da infecção

– Dose resposta



• Descrição in vivo (Bitko, 2004/ Zhang, 2004)

– Administração intranasal

– Ausência de agente transfectante

– Saturação da maquinaria RNAi

– Inibição profilática/paliativa





• Próximos passos

– Fase IIa (20-300): dose/resposta

– Fase IIb: início jun/2010

–

Fase III (300-3000)• Liberação FDA!

– Fase IV

• Efeitos adversos longo prazo



• Primeiros trabalhos descritos em 2002

– Demonstraram a inibição do vírus in vitro

– Taxas de inibição altas (Jacque, 2002)

– Inibição do receptor celular CD4 (Novina,2002)

• In vivo (Kumar, 2008) - eficiente

– Inibição profilática

– Inibição paliativa

• Próximo passo?



Jacque, 2002Novina, 2002



Vandekerckhove, 2006



• Escape viral– Alta taxa de mutação

– siRNA para regiões conservadas e proteínascelulares

• Ausência de modelo animal viável– Símios: alto custo

– Quimeras camundogos/humanos

• Entrega dos siRNAs– siRNAs ligados a Abs. reconhecedoras de

céls. CD4+

– Vetores virais: NÃO!

X



• Não se replicam em cultura de células

– Culturas primárias: caras e laboriosas

• Ausência de modelo animal viável

• Alta diversidade genética

– 7 genótipos

– > 100 subtipos

– Quasiespécies



Wakita et al., 2005



• Primeiro trabalho em 2003(Randall, 2003)

– Replicons subgenômicos

– Redução na expressão de

proteínas

• Outros trabalhos

– Inibição da expressão de todas

as proteínas HCV

– Proteínas celulares



• Poucos laboratórios possuem JFH-1

• JFH-1 x siRNA - ?

• Interação vírus x célula

• Variabilidade genética

– 2 ou mais siRNAs

– Regiões conservadas

– Genes celulares





• In vitro

– Eletroporação

– Lipossomos

– Injeção/Microinjeção

– Nanopartículas

– Vetores virais

• In vivo

– Eletroporação: inviável

– Lipossomos: inespecífica/degradação– Injeção/Microinjeção: invasivo/caro

– Nano partículas: caro/toxicidade

– Vetores virais: imunicidade ao vetor



• Alterações químicas– Aumento da meia-vida

plasmática

• Anticorpos– Específicos

– Difícil ligação Abs. X siRNA

• Lipossomos marcados– Receptores celulares específicos

– SR-II: hepatócitos

• Uso tópico!– Mucosas

– HSV-2





Obrigado

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