Fundamentos de Engenharia Genética

Prof. Dr. Eduardo Honda

Porto Velho2008

Dogma Central da Biologia Molecular

O que é Engenharia Genética?É um conjunto de tecnologias que permitem a manipulação (modificação) de material genético in vitro

Também conhecida como Tecnologia do DNA Recombinante

Inclui o isolamento, cópia e multiplicação de genes, recombinação de genes, ou DNA de diferentes espécies, e transferência de genes de uma espécie para outra, contornando o processo reprodutivo

Clonagem Molecular

Para se estudar um determinado gene que codifica uma proteína ou RNA é preciso isolá-lo.

 Clonagem = fazer várias cópias idênticas

Clonagem de DNA isolar um fragmento específico de DNA do cromossomo, introduzi-lo num vetor capaz de replicá-lo, e fazer milhões de cópias idênticas

 

Clonagem Molecular

Isolamento de Novos organismos que produzem enzimas de interesse Biotecnológico.

Clonagem Molecular- Isolamento Gênico

Isolamento do DNA: PCR, Banco de cDNA.

Isolamento do DNA- PCR

Desnaturação do DNA Fita-Dupla

Isolamento do DNA- PCR

Após vários ciclos...

Amplificação do Fragmento gênico desejado !!!

Isolamento de DNA e Biblioteca de cDNA

As bibliotecas de DNA representam, teoricamente, todo o material genético de um organismo clonado em um vetor  

Tipos:

A) Genômica: - clonado diretamente do genoma.

B) cDNA:- feita a partir de mRNA .

Isolamento de DNA- Biblioteca genômica

Extração do DNA Genômico;

Clivagem com enzimas de restrição;

Ligação dos Fragmentos nos vetores;

Transformação Celular;

Replicação do vetor.

Biblioteca de cDNA

- mRNA de um tipo celular específico;

- “primer” de oligo dT e transcriptase reversa;

- DNA Polimerase I e dNTPs;

- Clonagem em um vetor de escolha

Clonagem Molecular- Requerimentos

1) Método para clivar o DNA alvo;2) Método para juntar 2 moléculas de DNA

covalentemente (inserto + vetor)- LIGAÇÃO!3) Célula hospedeira;4) Método para introduzir moléculas de DNA para

dentro da célula hospedeira que as possa duplicar;

5) Método para selecionar moléculas de DNA quimérico ou recombinantes;

6) Métodos para o screening da característica procurada .

Geração de moléculas recombinantes

- Clonagem Molecular -

CLONAGEM

Ligação de extremidades compatíveis

Sítio Múltiplo

de Clonage

m(Polylink

er)

As endonucleases de Restrição

Clonagem Orientada

As “Ferramentas”1) Enzimas

2) Vetores

3) Células hospedeiras

ENZIMAS

Enzimas de RestriçãoSão endonucleases que clivam o DNA em seqüências específicas chamadas sítio de restrição.

Quebram a ligação fosfodiéster

Os sítios de restrição são, geralmente, seqüências palindrômicas (mesma seqüência nos dois sentidos)

Enzymes for DNA manipulation – restriction enzymes

Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html

Enzimas de Restrição

Classes of Restriction Enzymes

Type Icleavage occurs 400-7000 bpfrom recognition site

Type IIcleavage occurs adjacent orwithin recognition site

Type IIIcleavage occurs 25-27 bpfrom recognition site

•Endonucleases sítio-específicas isoladas de procariotos

•Protegem a bactéria do ataque de vírus (fagos)

•Protegem seu próprio DNA metilando-o no sítio de restrição

•Enzimas do tipo II são as mais utilizadas em Biologia Molecular

EcoRI metilase

DNA LigasePromover a união de moléculas de DNA pela formação de uma ligação fosfodiéster entre uma extremidade 3’-OH e outra 5’-PO4.

DNA PolimerasesPolimerizam a molécula de DNA

a partir de uma extremidade 3´-OH e usando uma das fitas do DNA como molde.

Exe: Taq polimerase

Transcriptase reversa

Polimeriza uma fita de DNA a partir de um molde de RNA

Isolada dos retrovírus

Aplicação: síntese de cDNA

VETORES

Os Vetores

São moléculas de DNA que irão propagar o DNA clonado.

 Características desejadas: Características desejadas:

•Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;

• Marca genética para selecionar a célula Marca genética para selecionar a célula contendo o vetor (resistência a drogas ou marcas contendo o vetor (resistência a drogas ou marcas auxotróficas);auxotróficas);

•Sítios de clonagem únicos.Sítios de clonagem únicos.

Tipos de vetoresPlasmídios

Bacteriófagos (fagos)

Cosmídios

Cromossomos artificiais de levedura (YAC)

Vetores especiais para plantas, células de insetos e mamíferos

PlasmídiosMoléculas de DNA fita dupla circulares e de replicação autônoma (ORI);

Têm marcas de seleção para resistência a antibióticos ou complementação auxotrófica.

Sequências de

DNA de um vetor

de expressão de E.

coli

Vetores de expressão

Transformação Bacteriana

Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html

Células podem ser selecionados em placas com antibiótico. Alguns plasmídios utilizam o gene da B-galactosidase.

O gene da beta-galactosidase é interrompido quando um fragmento de DNA é clonado. O substrato "X-gal“ fica azul se o gene da beta-gal permanece intacto, isto é a enzima está ativa. As colônias brancas na presença de X-gal significa a presença de DNA recombinante no plasmidio.

Bacteriófagos

Infectam células de E. coli e o DNA se duplica na célula hospedeira.

Ex: Fago  

Vetores baseados no fago

Foram retirados 20 Kb do genoma do fago necessários para integração/excisão para serem substituídos por DNA exógeno e formar um genoma de 50 Kb que é empacotado in vitro.

Genomas maiores ou menores não são empacotados.

Ciclo lítico compulsório

Clonando no Fago λ

Cosmídios

• São plasmídios contendo as extremidas “cos” do fago λ

• Capacidade de clonagem: 40 Kb

Cromossomos artificiais

CÉLULAS HOSPEDEIRAS

Células hospedeirasCaracterísticas:

Permitir a duplicação do vetor;

Permitir a seleção do vetor (sensibilidade a drogas ou auxotrofia);

Não pode representar perigo ao meio ambiente;

Não deve modificar o DNA exógeno;

Podem ser procariotos (E. coli) ou eucariotos (leveduras, células vegetais, cultura de células de insetos e mamíferos).

Métodos de introdução do DNA na célula hospedeira

Transformação com cloreto de cálcio (bactérias);

Transdução (fagos empacotados in vitro);

Transfecção (células de mamíferos);

Eletroporação (leveduras e bactérias);

Biolística ou “bombardeamento” (plantas);

Microinjeção (ovos e oócitos).

O canhão gênico é uma nova forma de transformação celular.

Esta arma usa uma particula de bombardeamento - Biolística

Inserindo genes nas células

Adapted from Human Genetics, Ricki Lewis

Microinjeção

Transformação Bacteriana

Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html

Células podem ser selecionados em placas com antibiótico. Alguns plasmídios utilizam o gene da B-galactosidase.

Clonando no Fago λ

Seleção de clones recombinantes

resistência e sensibilidade a antibióticos;

requerimentos nutricionais (auxotrofia);

formação de placas de lise

Identificação de um clone de

interesse

- hibridação com sonda radioativa- anticorpo específico

Screening

Aplicações da Engenharia Genética

Análise da estrutura/função de genes Produção de proteínas de interesse

industrial e terapêutico Engenharia proteica Criação de organismos transgênicos Terapia gênica Diagnóstico molecular (doenças

parasitárias e genéticas) Teste de paternidade / medicina

forense Arqueologia molecular / evolução

Plantas Transgênicas

Animais Transgênicos

Microinjeção de DNA no núcleo Microinjeção de DNA no núcleo de ovo fertilizado de de ovo fertilizado de

camundongo - gene do fator de camundongo - gene do fator de crescimento humanocrescimento humano

Biofármacos Recombinantes

Terapia Gênica

Adição do gene terapêutico

Substituição do gene terapêutico

Uso de vírus