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Biologia IV

Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo

Laboratório de Epidemiologia e Microbiologia Molecular(LEMiMo)

Grupo de Cristalografia

Microbiologia

• Microbiologia como ciência;

• Impactos sobre o homem;

• Tipos de organismos estudados;

• Células procarióticas e eucarióticas;

• Biossegurança

Aula Parte I

Aula Parte II

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• É a ciência que estuda os microrganismos – um grande e diverso grupo de organismos microscópicos- que podem ser encontrados como células únicas ou grupamentos celulares.

• Diferente dos organismos macroscópicos, os microrganismos são em geral capazes de realizar seus processos vitais de crescimento, geração de energia e reprodução, sem depender de outras células.

Microbiologia

http://www.ufrgs.br/alimentus/pao/fermentacao/fer_crescimento01.htm

Microbiologia como ciência

• O que estuda?

– Como ciência biológica básica: microrganismos como modelos para estudo de funções celulares de organismos superiores; as bases físicas e químicas que permitiram o surgimento da vida provêm de estudos com microrganismos.

– Como ciência biológica aplicada: trata de questões práticas importantes da medicina, agricultura e indústria.

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Microbiologia como ciência

Meta dos microbiologistas

Compreender como os

microrganismos atuam

Otimizar seus efeitos benéficos

Minimizar atividades danosas

Impactos sobre o Homem

© 2004 Pearson Education, Inc.

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Impactos sobre o Homem

Impactos sobre o Homem

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Células Procarióticas e Eucarióticas

Aula 1 - Parte I

Microbiologia FFI0751

Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo

Procariotos x Eucariotos

MitocôndriasCloroplastos

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Procariotos

Tamanho: 0,2 a 2 µm

Eucariotos

Eucariotos

Tamanho: 10 a 100 µm

Organelas delimitadas por membrana

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Ribossomos de procarioto e de eucarioto

DNA, RNA, Proteína

Transcrição Tradução

DNA RNA Proteína

Ribossomos de procarioto e de eucarioto

Ribossomos são caracterizados pelo coeficiente desedimentação, expresso em unidades Svedberg (S).

Procariotos: 70S contém uma subunidade grande (50S) e

uma pequena (30S)

Eucariotos: 80S contém uma subunidade grande (60S) e

uma pequena (40S)

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Diferenças entre ribossomos: procarioto x eucarioto

Ribossomos de procarioto e de eucarioto

EucariotosOrganelas Funções

Membrana citoplasmática Limite mecânico da célula, barreira seletiva com sistemas de transporte, permite interação entre as células e adesão à superfície, secreção

Citoplasma Ambiente para as organelas, local de muitos processos metabólicos

Microfilamentos, filamentos intermediários e microtúbulos

Estrutura para células e movimentos, forma o citoesqueleto

Retículo endoplasmático Transporte de materiais, participa da síntese de proteínas e lipídeos

ribossomos Síntese de proteínas

Complexo de Golgi Empacotamento e secreção de materiais para várias propostas, formação de lisossomo

Lisossomo Digestão intracelular

mitocôndria Produção de energia através do ciclo do ácido tricarboxílico, transporte de elétrons, fosforilação oxidativa e outras vias

Cloroplastos Fotossíntese (obtém energia da luz e libera CO2 e H2O)

Núcleo Local onde se encontra as informações genéticas, centro de controle da célula

Nucléolo Síntese de RNA ribossômico

Parede celular e película Forma e rigidez á célula

Flagelos e cílios Movimento

vacúolo Armazento e transporte temporário, digestão, equilíbrio osmótico (vacúolo contrátil)

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Co

mp

araç

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ntr

e o

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man

ho

s

Rickettsia ricketsi dentro de células do sangue (bactéria).

Procariotos x Eucariotos

http://pathmicro.med.sc.edu/Portuguese/immuno-port-chapter1.htm

Trypanosoma em esfregaço sangüíneo. A membrana ondulante e o núcleo são visíveis.

http://www.fortunecity.com/greenfield/eco/813/mod2aula4.html

http://anhembi.br/publique/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?infoid=1758&sid=203

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http://clubeaprendiz.googlepages.com/observa%C3%A7%C3%B5esmicrosc%C3%B3picas

Célula da mucosa bucal

Células da mucosa vaginal

http://www.pathology.com.br/papanicolaou/papanicolaou.html

Célula superficial, cujo citoplasma é avermelhado e cujo núcleo é picnótico,

entre duas células intermediárias. Há grande quantidade de bacilos de

Döederlein.

Procariotos x Eucariotos

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O primeiro microscópico da história

Ampliação de 300x e resolução de 1 m

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Tipos de organismos estudados

Listeria monocytogenes (3000X, MEV)

Anabaena sp, 600X, MEV

Bactérias

Halobacterium sp, 1600X, MEV

Fungos

Mucor sp, 400X, MEVSaccharomyces cerevisiae, 800X, MEV

Aspergillus ustus, 600X, MEV

Vírus

Vírus da hepatite B, 50.000X, MEV Retrovirus – HIV, 14.500X, TEM

Vírus do mosaico do tabaco, 27.300X, MEV

Seres microscópios de natureza acelular

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Protozoários

Paramecium multimicronucleatum, 200X, MEV

Trypanosoma sp, 1000X, MEV

Ameba - pinocitose

Tipos de organismos estudados

Algas

Volvox aureus, 40X, MO

Volvox - Detalhe

Spirogyra sp, 100X, MO

Tipos de organismos estudados

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Vírus

Depende do ponto de vista agregações extremamente complexas de substâncias químicas ou microrganismos extremamente simples.

-Possuem um único tipo de ácido nucléico (DNA e RNA) e uma cobertura protéica envolvida por um envelope composto de lipídeos, proteínas e carboidratos;

-São parasitas intracelulares obrigatórios;

http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/virus/imagens/virus-1.jpg

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Principais marcos da evolução biológica

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Teoria da Endossimbiose

✓Aquisição de bactéria quimiorganotrófica (metabolismo aeróbio facultativo) mitocôndria;

✓Cianobactéria fotossíntese oxigênica cloroplasto

✓Núcleo surgiu espontaneamente em resposta ao tamanho do genoma do eucarioto remoto;

✓Hipótese do Hidrogênio:Primeiro Bacteria (consumidor de O2 e

produtor de H2) foi incorporado em Archaea;

Núcleo surge após passagem dos genes que produzem lipídeos para o hospedeiro sistema membranoso

Replicação e expressão mais eficientes

FORMAÇÃO DA CÉLULA

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Comparação de células Procarióticas e organelas Eucarióticas

Célula procariótica Célula Eucariótica Organelas Eucarióticas

DNA

Histonas

Ribossomos

Crescimento

Circular

Proteínas semelhantes às

histonas

70S

Fissão Binária

Linear

Sim

80S

Mitose

Circular

Não

70S

Fissão Binária

Semelhantes na sequência eSão inibidos pelos mesmos antibióticos

Sec. XIX

Duas grandes questões biológicas levaram ao desenvolvimento de técnicas laboratoriais essenciais:

O debate sobre a geração

espontânea

A natureza das doenças infecciosas

(Louis Pasteur) (Robert Koch)

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O experimento de Pasteur

Teoria do germe da doença

Experimentos de Pasteur: base das técnicas de assepsia.

• Pasteurização: para resolver problema de vinhos e cervejas que azedavam por causa das bactérias (álcool ácido acético).

• 72-75 °C por 15-20 segundos.

• Relação entre deterioração dos alimentos e os microrganismos colaborou para a “Teoria do germe da doença”.

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• Doenças: punição para os pecados individuais ou crimes. Causa: demônios nos detritos ou nos vapores dos pântanos.

• 1865: Pasteur descobre a causa da doença do bicho-da-seda (protozoário).

• 1860: Joseph Lister tratou ferimentos cirúrgicos com fenol – redução drástica de infecções e mortes.

Teoria do germe da doença

• Robert Koch, médico prático alemão, 1876: comprovou a teoria do germe da doença.

• Koch estudou o antraz (carbúnculo) – doença de gado e ovelhas – e descobriu o agente causador –Bacillus anthracis.

• Problema! Como afirmar que a bactéria presente no sangue do animal afetado é o agente causador da doença?

Teoria do germe da doença

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1. O organismo patogênico suspeito deve estar presente em todos os casos da doença e ausente em animais sadios.

2. O organismo suspeito deve ser cultivado em cultura pura.

3. Células de uma cultura pura do organismo suspeito devem provocar a doença em um animal sadio.

4. O organismo deve ser isolado e caracterizado como o mesmo encontrado originalmente.

Postulados de Koch

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1) Nem todos os microrganismos crescem em meios de cultura;

Não são cultivados em meio artificial:Treponema pallidum: sífilisMycobacterium leprae: lepraRiquétsias e vírus: multiplicam-se somente dentro das células

2) Um conjunto de sinais e sintomas podem ser os mesmos em várias doenças;

3) Um microrganismo pode causar várias doenças.

Exceções aos postulados de Koch

1910 – Paul Ehrlich – “Bala Mágica” para combater um patógeno sem prejudicar o hospedeiro

Dentre várias substâncias testadas salvarsan (derivado de arsênico) para o combate à Sífilis

Antes disso, a única substância utilizada pelos Europeus era a quinina, extraída de casca de árvore sul-americana para o tratamento da malária

Como controlar os microrganismos?

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-Alexander Fleming, médico e bacteriologista escocês

Contaminação por fungo em placa alerta para substância inibidora do crescimento bacteriano

1928, Penicillium notatum Penicilina

1940 – Importância médica da Penicilina

Como controlar os microrganismos?

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Sistemas de classificação

• 1735 – Carolus Linnaeus (botânico sueco)

– Propôs 2 Reinos: Animalia e Plantae; introduziu latim como língua comum.

• 1857 – Carl von Nägeli (botânico suíço): bactérias e fungos no reino Plantae.

• 1969 – Robert Whittaker (botânico americano)

– Criou o sistema de 5 Reinos – Monera, Protista, Fungi, Plantae e Animalia.

• 1978 – Carl Woese (microbiologista americano)

– Propôs o sistema de 3 Domínios (um nível acima de Reino): Bacteria, Archea e Eucarya, a partir da análise comparativa de sequências de RNA ribossômico.

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Sequências moleculares podem ser utilizadas paraconstruir árvores filogenéticas, que consistem em umailustração gráfica da história evolutiva

Árvores filogenéticas

1866 1969.

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Diferenças entre ribossomos: procarioto x eucarioto

Ribossomos de procarioto e de eucarioto

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rRNA 16S: várias regiões altamente conservadas (facilita alinhamento preciso de sequências) e variabilidade suficiente em outras regiões, tornando-o um excelente cronômetro filogenético.

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Regiões altamente conservadas que permitem alinhamento preciso das sequências

Variabilidade suficiente em outras regiões cronômetro evolutivo

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RNA ribossomal da subunidade menor (SSU RNAr, small subunit rRNA)

3 Domínios de Carl Woese

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Árvore filogenética universal

Análise do rRNA 16S rRNA 18S

Aquifex e Methanopyrus estão mais estreitamente relacionados aos organismos primitivos que, por exemplo, as espécies de Proteobacteria

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Biossegurança

Conjunto de procedimentos adotados com o objetivo de dar proteção e

segurança ao profissional e à sua equipe.

Para evitar disseminação e contaminações devem ser empregadas medidas de

controle de infecção como a utilização de equipamento de proteção individual

(EPI), esterilização de materiais, desinfecção de ambiente e equipamentos.

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Equipamentos de Proteção Individual (EPI)

Equipamentos de Proteção Coletiva (EPC)

Todo dispositivo ou produto de uso individual ou coletivo, utilizado pelo

trabalhador destinados a proteção de riscos que podem ameaçar a

segurança e a saúde no trabalho

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Jalecobranco

Gorro

Luvas

máscara

Óculos de proteção

Equipamentos de Proteção Individual (EPI)

A importância do Jaleco

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Níveis de Biossegurança

Biossegurança em Laboratórios de Pesquisa

Nível de Biossegurança (NB)

• NB é o nível de contenção que permita o trabalho em laboratório com materiais infecciosos de forma segura e com risco mínimo

• Existem quatro níveis de biossegurança: NB-1, NB-2, NB-3 e NB-4,crescentes no maior grau de contenção e complexidade do nível deproteção.

• O NB será determinado segundo o organismo de maior classe de riscoenvolvido no experimento.

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Designados em ordem crescente, pelo grau de proteção proporcionado ao pessoal dolaboratório, meio ambiente e à comunidade:

O nível de Biossegurança 1, é o nível de contenção laboratorial que se aplica aoslaboratórios de ensino básico, onde são manipulados os microrganismos pertencentes aclasse de risco 1 (não causam doenças nos homens ou outros animais). Não é requeridanenhuma característica de desenho, além de um bom planejamento espacial e funcional e aadoção de boas práticas laboratoriais. Exemplos: Bacillus subtilis

O nível de Biossegurança 2 diz respeito ao laboratório em contenção, onde sãomanipulados microrganismos da classe de risco 2 (causam doenças nos homens ou outrosanimais). Se aplica aos laboratórios clínicos ou hospitalares de níveis primários dediagnóstico, sendo necessário, além da adoção das boas práticas, o uso de barreiras físicasprimárias (cabine de segurança biológica e equipamentos de proteção individual) esecundárias (desenho e organização do laboratório). Exemplos: Vírus da Febre Amarela eSchistosoma mansoni.

Níveis de Biossegurança

Centers for Disease Control and Prevention - CDC. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 4a. ed. U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, 1999. 250p.

Níveis de BiossegurançaNB-1

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Níveis de BiossegurançaNB-2

O nível de Biossegurança 3 é destinado ao trabalho com microrganismos da classe de risco 3(causam graves doenças nos homens ou outros animais) ou para manipulação de grandesvolumes e altas concentrações de microrganismos da classe de risco 2. Para este nível decontenção são requeridos além dos itens referidos no nível 2, desenho e construçãolaboratoriais especiais. Deve ser mantido controle rígido quanto a operação, inspeção emanutenção das instalações e equipamentos e o pessoal técnico deve receber treinamentoespecífico sobre procedimentos de segurança para a manipulação destes microrganismos.Exemplo: Mycobacterium tuberculosis

O nível de Biossegurança 4, ou laboratório de contenção máxima, destina-se a manipulação de microrganismos da classe de risco 4 (causam doenças nos homens ou outros animais representando grande risco para os trabalhadores de saúde, sendo alto o risco de transmissibilidade na comunidade), onde há o mais alto nível de contenção, além de representar uma unidade geográfica e funcionalmente independente de outras áreas. Esses laboratórios requerem, além dos requisitos físicos e operacionais dos níveis de contenção 1, 2 e 3, barreiras de contenção (instalações, desenho equipamentos de proteção) e procedimentos especiais de segurança. Exemplo: Vírus Ebola.

Centers for Disease Control and Prevention - CDC. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 4a. ed. U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, 1999. 250p.

Níveis de Biossegurança

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Níveis de BiossegurançaNB-3

•Fluxo de ar sempre de fora para dentro;

•Filtro de ar para troca de ar do ambiente;

•Usar equipamento de contenção de bioaerossol

Biossegurança em Laboratórios de Pesquisa

Laboratório – NB3

Respirador Com filtro HEPA

Níveis de BiossegurançaNB-3

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Níveis de BiossegurançaNB-4

Sala de troca de roupas

http://www.niaid.nih.gov/topics/BiodefenseRelated/Biodefense/PublicMedia/labtour/Pages/bsl9.aspx

Níveis de BiossegurançaNB-4

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Níveis de BiossegurançaNB-4

Níveis de BiossegurançaNB-4

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http://www.agricultura.gov.br/comunicacao/noticias/2014/08/lanagromg-e-o-primeiro-do-brasil-

com-nivel-de-biosseguranca-maximo

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NUNCA PIPETE COM A BOCA!!!

Instrumentos

Pipetas e pipetadores

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Pipeta Pastuer

Pipetas automáticas

Ponteiras

Tortora, et al, 6ª ed, 2000

Conceitos importantes!!

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Limpar a bancada com álcool 70% ANTES E DEPOIS

dos experimentos!!

Zona Asséptica

Bico de Bunssen

O bico de Bunssen e a zona asséptica/de segurança

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AlçaAgulha

Materiais

Haste

Cabo

Autoclave

Câmara de biossegurança / fluxo laminar

Instrumentos

Esterilização pelo calor úmido (vapor sob pressão)

Em geral: 15 a 20 minutos a 121ºC

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Equipamentos

Estufa

Equipamentos

Uma vez cultivado o microrganismo no meio de cultura, deve-se incubá-lo a uma temperatura ótima de crescimento por pelo menos 24h!

Geralmente:Bactérias : 35-37°CFungos: 25-30°C

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Como cultivar os microrganismos??

Onde isolar?

Meios de cultura: Material nutriente preparado no laboratório para o

crescimento de microrganismos.

Fazer a partir de pós desidratados;Comprar meios preparados (prontos para o uso)

Onde colocar?

Placas de Petri;

Tubos de ensaio.

Como escolher o meio para o isolamento?

A) origem do material a ser analisado;

B) A espécie que se imagina estar presente;

C) Necessidades nutricionais dos organismos.

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Agar foi descoberto no Japão (Kanten) a partir de algas marinhas e é utilizado emcomidas. Holandeses passaram a usar agar em alimentos;

Fannie Hess, esposa do pesquisador Walter Hess utilizava agar em geléias. Waltertestou em meios de cultura e escreveu para Robert Koch

Até cerca de 1880, as culturas eram todas líquidas. Koch havia tentado usar gelatina,mas esta derretia a 37C. Ao ver a utilidade do agar, Robert Koch passou a utilizá-lo emmeios de cultura para o cultivo de bacilos da tuberculose.

Meios Líquidos, semi-sólidos e sólidos

AGAR

✓Sem cor

✓Sem gosto

✓Sem odor

✓Gelatinoso

✓Bactérias não o degradam!

Diferentes concentrações de ágar diferentes estados físicos

Sólidos contém agentes solidificantes, principalmente ágar (cerca de 1 a 2,0 %);

Semi-sólidos a quantidade de ágar é de 0,075 a 0,5 %, dando uma consistência

intermediária, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas

de oxigênio ou a verificação da motilidade e também para conservação de culturas;

Líquidos sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para

ativação das culturas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas, dentre outros.

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H2O

H2OH2O

H2O

Autoclavar

121°C por 20 minutos

Distribuir em placasestéreis

Meio autoclavado = Calor!!

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Tubos de ensaio

Placas de Petri

Materiais

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Inóculo: material a ser semeado, colocado no meio de cultura.

Incubação: bactérias 37°C / 24 horas; Fungos 25-30°C / HORAS A DIAS!

Durante a incubação as células individuais se multiplicam e produzem um grande

número de células = Colônia - visível a olho nu.

Cada colônia é uma cultura pura com ancestral único.

Colônia

Todas as células em uma colônia têm o mesmo parentesco.

Isolamento de microrganismos em Cultura Pura

Objetivo dos métodos:

Diminuir a população microbiana, assim as células individuais estarão

localizadas a uma certa distância umas das outras.

Para obter uma cultura pura, uma colônia individual da cultura mista é

transferida de um meio para outro em placa ou tubo.

Isolamento de colônias para posteriormente obter cultura pura

Cultura mista

Cultura pura

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Lavagem das mãos

http://www.123rf.com/photo_12253447_print-of-dirty-palm-with-cartoon-germs.html

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Lavagem das mãos

Indicação de lavagem das mãos:

SempreQue as mãos estiverem sujas

Antes e apósPreparo de materiais e/ou equipamentosO uso de luvasA aula de microbiologia

Com o uso concomitante de luvasApós coleta de sangueAdministração de hemoderivadosHigienização de paciente

O uso das luvas não substitui a lavagem das mãos!!!

Lavagem das mãos

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Lavagem das mãos

- Retirar jóias, relógio, pulseiras (acúmulo de bactérias não removidas)

- Abrir a torneira com a mão dominante quando não houver pedal

- Molhar as mãos- Aplicar de 3 a 5 mL de sabão líquido nas mãos

- Ensaboar as mãos, formando espuma, friccionando-as por 15 a 30 segundos, atingindo todas as suas faces

- Enxaguar, deixando a água penetrar nas unhas e espaços interdigitais (mão em forma de concha). Retirar toda a espuma e os resíduos de sabão, sem deixar respingar água na roupa e no piso.

- Secar as mãos com papel toalha descartável. Se a torneira for manual, usar o mesmo papel-toalha para fechá-la

Lavagem das mãos

HOJE: LAVAR AS MÃOS COMO ESPECIFICADO E PASSAR ÁLCOOL 70%!!

X XPeça para um amigo

Álcool 70%

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Verificação das lavagens das mãos

Antes Depois

Diminuição do número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC)

Placas com 24h a 37°C e 5 dias a 4°C

Bibliografia:

- Madigan, M.T. et al. Microbiologia de Brock. São Paulo:Prentice-Hall, 10ª ed., 2004. (ou mais recente!)

- Tortora, G.J. et al. Microbiologia. Porto Alegre: ArtMed, 8ªed., 2005. (ou mais recente!)