SERGIO ECHEVERRIGARAY INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA

UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL

ENOLOGIA NA ERA GENÔMICA

O QUE É GENÔMICA? - Numa definição ampla: Decifrar o genoma (a informação genética) dos organismos vivos, visando compreender a evolução, metabolismo e adaptação dos organismos.

PORQUE ESTUDAR O GENOMA DE LEVEDURAS ?

MATÉRIA PRIMA BIOTRANSFORMAÇÃO PRODUTO

Genoma de S. cerevisiae

Goffeau et al.,

1996

Science 274: 563-7

8 anos, 19 paises,

94 labs,

641 pessoas

12.495.682 pb

5770 ORFs

Genomas de leveduras Ashbya gossypii – completo Brettanomyces bruxellensis – parcial Candida albicans – parcial Candida dubliniensis – completo Candida glabrata – completo Candida lusitaniae – parcial Candida parapsilosis – parcial Candida tropicalis – parcial Cryptococcus neoformans – parcial Debaryomyces hansenii – completo Hanseniaspora uvarum - parcial Hanseniaspora vineae - parcial Kluyveromyces aestuarii – parcial Kluyveromyces lactis – completo Kluyveromyces marxianus – parcial Kluyveromyces thermotolerans – completo Kluyveromyces waltii – parcial Kluyveromyces wickerhamii – parcial Lodderomyces elongisporus – parcial Malassezia globosa – parcial

Pichia guillerrmondii – parcial Pichia pastoris – parcial Pichia sorbitophila – completo Pichia stipitis – completo Saccharomyces bayanus var uvarum – parcial Saccharomyces castelli – parcial Saccharomyces cerevisiae – completo Saccharomyces exiguus – parcial Saccharomyces kluyveri – completo Saccharomyces kudriawzevii – parcial Saccharomyces mikatae – parcial Saccharomyces paradoxus – parcial Saccharomyces pastorianus – parcial Saccharomyces servazzii – parcial Schizosaccharomyces cryophilus – parcial Schizosaccharomyces japonicus – paricial Schizosaccharomyces octosporus – parcial Schizosaccharomyces pombe – completo Torulaspora delbrueckii - completo Yarrowia lipolytica – completo Zygosaccharomyces rouxii - completo

GENOMA DE LEVEDURAS – APÓS 20 ANOS.

EVOLUÇÃO DO METABOLISMO DE

LEVEDURAS

Modificação do fluxo preferencial respiração vrs. fermentação. “Aumento do efeito Crabtree – fluxo glicolítico preferencial e a fermentação alcoólica como forma competitiva”. Clado Saccharomyces: Estratégia:

“make-accumulate-consume” (produzir-acumular-consumir)

Piskur et al. (2006)

Efeito Crabtree aumentado

Alto consumo de glicose

Alta capacidade de produção de energia

Catabolismo do etanol (ADH2, etc)

Modificação da regulação da respiração

Efeito Crabtree

Aumento de glicolise em

relação a respiração

Respiração obrigatória ou

preferencial

Fluxo glicolítico baixo

Marsit e Dequim (2015) FEMS

Surgimento das plantas com frutos (~150 M anos)

Saccharomyces paradoxus

Saccharomyces mikatae

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces kudriavzevii

Saccharomyces bayanus

Saccharomyces pastorianus

Saccharomyces exiguus

Saccharomyces servazzii

Saccharomyces castellii

Candida glabrata

Vanderwaltozyma polyspora

Zygosaccharomyces rouxii

Lachancea thermotolerans

Lachancea waltii

Lachancea kluyveri

Kluyveromyces lactis

Kluyveromyces marxianus

Eremothecium gossypii

Saccharomycodes ludwigii

Brettanomyces bruxellensis

Pichia angusta

Candida lusitaniae

Debaryomyces hansenii Pichia stipitis Pichia sorbitophila Candida guilliermondii

Candida tropicalis

Candida parapsilosis

Lodderomyces elongisporus Candida albicans Candida dubliniensis

Arxula adeninivorans

Yarrowia lipolytica Schizosaccharomyces pombe

Saccharomycotina

Duplicação do genoma - Aumento de transportadores

- Aumento de desidrogenases, etc

Perda de transpossons e de

introns - Genomas condensados

Ganho de reação sexual

e pequenos centrômeros

(300 milhões a 1 bilhão de anos)

Duplicações em tandem

Ganho de Megasatelites

(100.000.000 anos)

Ganho de gene HO

(150-300.000.000 anos)

Berbee and Taylor, 2006; James et al., 2006

A EVOLUÇÃO DOS GENOMAS EM LEVEDURAS

SEQUENCIAMENTO DE SACCHAROMYCES

1996 – Sequenciamento de S288c – linhagem de laboratório – derivada de isolado de figo CA

2005 – Sequenciamento de RM11-1a - segregante de Bb32 (levedura selvagem isolada de vinhedo da California).

2007 – Sequenciamento de YJM789 – segregante de patógeno oportunista de paciente imuno-comprometido.

2008 – Sequenciamento de M22 – isolado de vinhedo italiano. YPS163 – isolado de solo de um carvalho americano – Pensilvânia AWRI1631 – segregante da levedura enológica sul-africana N96 2009 - Sequenciamento de JAY291 – haploide segregante de PE-2 – bioetanol – Brasil EC1118 – Pris-de-Mousse – S. cerevisiae var bayanus – levedura enológica diploide Sigma 1278 b - linhagem de laboratório 2010 – Sequenciamento de Foster’s O – levedura de cerveja -Ale beer Foster’s B – levedura de cerveja - Ale beer Vin13 – Levedura de vinho tolerante a baixa temperatura AWRI 796 – Levedura enológica sul-africana (vinho tinto) CLIB 215 – Levedura de panificação

2011 – 15 genótipos de Saccharomyces cerevisiae

HOJE >80 GENOMAS NO Saccharomyces Genome Database

CEPAS ENOLÓGICAS AWRI 1631 – segr. comercial S Africa AWRI 796 - vinho tinto S Africa BC 187 – segr. vinho tinto California EC 1118 – lev. comercial L 1528 – vinho tinto Chile QA23 – comercial (vinho verde) T73 – vinho tinto Espanha VIN 13 – vinho branco S Africa VL 3 – vinho branco França

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Genomas Saccharomyces

O GENOMA DE SACCHAROMYCES – O QUE ELES NOS DIZ?

Duplicação genômica

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GLUTAMATO SINTASE GENE atggctgaagcaagcatcgaaaagactcaaattttacaaaaatatctagaactggaccaa agaggtagaataattgccgaatacgtttggatcgatggtactggtaacttacgttccaaa ggtagaactttgaagaagagaatcacatccattgaccaattgccagaatggaacttcgac ggttcttctaccaaccaagcgccaggccacgactctgacatctatttgaaacccgttgct tactacccagatcccttcaggagaggtgacaacattgttgtcttggccgcatgttacaac aatgacggtactccaaacaagttcaaccacagacacgaagctgccaagctatttgctgct cataaggatgaagaaatctggtttggtctagaacaagaatacactctatttgacatgtat gacgatgtttacggatggccaaagggtgggtacccagctccacaaggtccttactactgt ggtgttggtgccggtaaggtttatgccagagacatgatcgaagctcactacagagcttgt ttgtatgccggattagaaatttctggtattaacgctgaagtcatgccatctcaatgggaa ttccaagtcggtccatgtaccggtattgacatgggtgaccaattatggatggccagatac tttttgcacagagtggcagaagagtttggtatcaagatctcattccatccaaagccattg aagggtgactggaacggtgccggttgtcacactaacgtttccaccaaggaaatgagacaa ccaggtggtatgaaatacatcgaacaagccatcgagaagttatccaagagacacgctgaa cacattaagttgtacggtagcgataacgacatgagattaactggtagacatgaaaccgct tccatgactgccttttcttctggtgtcgccaacagaggtagctcaattagaatcccaaga tccgtcgccaaggaaggttacggttactttgaagaccgtagaccagcttccaacatcgac ccatacttggttacaggtatcatgtgtgaaactgtttgcggtgctattgacaatgctgac atgacgaaggaatttgaaagagaatcttcataa

GLUTAMATO SINTASE MAEASIEKTQILQKYLELDQRGRIIAEYVWIDGTGNLRSKGRTLKKRITSIDQLPEWNFDGSSTNQAPGHDSDIYLKPVAYYPDPFRRGDNIVVLAACYNNDGTPNKFNHRHEAAKLFAAHKDEEIWFGLEQEYTLFDMYDDVYGWPKGGYPAPQGPYYCGVGAGKVYARDMIEAHYRACLYAGLEISGINAEVMPSQWEFQVGPCTGIDMGDQLWMARYFLHRVAEEFGIKISFHPKPLKGDWNGAGCHTNVSTKEMRQPGGMKYIEQAIEKLSKRHAEHIKLYGSDNDMRLTGRHETASMTAFSSGVANRGSSIRIPRSVAKEGYGYFEDRRPASNIDPYLVTGIMCETVCGAIDNADMTKEFERESS

DO GENOMA AO METABOLISMO DE Saccharomyces

A “teia metabólica” e suas interações.

RESPOSTA DA LEVEDURAS A DISTINTAS CONDIÇÕES AMBIENTAIS: EXPRESSÃO GÊNICA

Microarray: controle vrs. acetaldeido -1g/L (6310 genes) Aranda e del Olmo, 2004

Expressão gênica em resposta a distintas fontes de nitrogênio. Godard et al. 2007

?

Condição natural - Principalmente aeróbica - Limitação de açúcar, etc. - Alta competição com outros microrganismos - Formação de biofilmes

Condição industrial - Principalmente anaeróbica - Alta concentração de açúcares. - Estresse osmótico, etanólico, oxidativo, etc. - Alta concentração celular - Limitação de nitrogênio, etc.

As leveduras evoluíram se adaptando geneticamente as condições industriais?

Adaptados de Liti et al, 2009

Relação entre cepas de Saccharomyces baseada em 7544 SNPs.

1 a 1,4 substituições por kb entre leveduras

de vinho e 5 a 6 substituições por kb entre leveduras de

vinho e outras.

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Distância baseada em genomas completos de Saccharomyces (Nijkamp et al. 2012)

vinhedos

vinho

cerveja

Laboratório

Bioetanol

Analise baseada em 60331 SNPs – 146 linhagens de Saccharomyces Vermelho- fermentações Verde- carvalhos Laranja- frutos Cinza- outros

Almeida et al. (2015)

SABEMOS: - AS LEVEDURAS ENOLÓGICAS REPRESENTAM UM GRUPO MONOFILÉTICO E

CONSEQUENTEMENTE TEM UMA MESMA ORIGEM.

- PARECE EVIDENTE QUE AS LEVEDURAS EVOLUIRAM SE ADEQUANDO À UTILIZAÇÃO HUMANA.

NÃO SABEMOS: - HOUVE UM PROCESSO DE DOMESTICAÇÃO PROPRIAMENTE DITO? - ESTA ORIGEM COMUM ESTÁ ASSOCIADA A ORIGEM RESTRITA DAS VIDEIRAS?

- COMO EVOLUIRAM TÃO RAPIDAMENTE? (Genome Renewal –Mortimer, 2000)

- COMO SE ESPALHARAM PELO MUNDO?

- QUAL É O PAPEL DE OUTROS ORGANISMOS NO PROCESSO?

?

PARA TENTAR RESPONDER ALGUMAS DESTAS PERGUNTAS VAMOS VER O QUE AS LEVEDURAS

ENOLÓGICAS TEM EM COMUM!!!

O QUE AS LEVEDURAS ENOLÓGICAS APRESENTAM DE DIFERENTE DO RESTANTE?

Análise discriminante do comportamento fermentativo de cepas de S. cerevisiae de várias origens em mosto vínico sintético. - DW (peso seco) - Produção de gás carbônico - Tempo para consumir 75% do açúcar - Produção de acetato de butila - Produção de butirato de etila

Camarasa et al. 2011

O QUE AS LEVEDURAS ENOLÓGICAS APRESENTAM DE DIFERENTE DO RESTANTE?

VÁRIAS CEPAS DE SACCHAROMYCES INDUSTRIAIS APRESENTAM ORFs (POTENCIAIS GENES) AUSENTES NA CEPA REFERÊNCIA S288C E VICE-VERSA (Engel e Cherry, 2013) - QUE GENES SÃO ESSES? - COMO AFETAM O COMPORTAMENTO DAS LEVEDURAS?

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RFs

JAY291- Bioetanol genes de termotolerância, tolerância a estresse e capacidade fermentativa. EC1118- vinho Genes relacionados ao metabolismo e transporte de açúcar e nitrogênio, produção de ésteres, tolerância ao estresse, entre outros.

O QUE AS LEVEDURAS ENOLÓGICAS APRESENTAM DE DIFERENTE DO RESTANTE?

EXEMPLOS DE CONJUNTOS GÊNICOS E GENES INDIVIDUAIS CARACTERÍSTICOS DE LEVEDURAS ENOLÓGICAS

1- Inativação de AQY2 e AQY1 (aquaporina) – tolerância a estresse osmótico

2- Translocação VIII-XVI e/ou XV-XVI com geração do alelo SSU-R1 (resistência aumentada ao sulfito)

3- Aumento do número de cópias de CUP1 – resistência a cobre.

4- Duas mutações no promotor de FLO11- características de leveduras de véu.

5- Variante alélico de HXT3- alta capacidade de transporte de frutose.

6- Duplicação e translocação de regiões (QTLs) associadas ao metabolismo de nitrogênio e uso de

aminoácidos

7- Hiper-expressão de genes associados a estresse oxidativo.

8- Modificação da regulação de genes (>50 genes) associados a autofagia e apoptose.

E muitas outras, mais de 5000 alterações em regiões gênicas e regulatórias!!!!

ALTERAÇÕES GENÔMICAS EM LEVEDURAS ENOLÓGICAS – ex. EC1118

Comparação de polimorfismos nucleotídicos (EC1118 vrs): - 46825 com S288C - 19142 com RM11-1A - 18315 com AWRI1631

A análise do genoma de EC1118 mostra que esta apresenta: - 77 genes ausentes em S288C dos quais 35 localizados em três

regiões particulares. - KHR1 (toxina killer resistente ao calor) - MPR1 (acetiltransferase – estresse oxidativo e etanol)

- >100 genes presentes em S288C estão ausentes em EC1118 - MST27 (formação de vesículas) e PTM8 (proteína de membrana regulada

por ferormônio)- ausente em várias cepas de vinho.

Novo et al., 2009

Vários dos genes (blocos gênicos) presentes em leveduras enológicas S. cerevisiae tem origem em transferência horizontal de genes (HTG) de: - Kluyveromyces (Lachancea) thermotolerans – transportadores de açúcares e nitrogênio. - Torulaspora microellipsoides – simporter com alta afinidade por frutose, xilitol desidrogenase, transporte de

oligopeptídeos ricos em glutamato (FOT1-2). - Lachancea kluyveri - ? - Zygosaccharomyces bailli e Z. rouxii – pseudogenes, genes relacionados com transporte e metabolismo de

açúcares e nitrogênio, genes relacionados com estresse osmótico. - Eremothecium gossypii - tranpossase - Saccharomyces paradoxus – SUC2, HPF1 (alfa-1,4-glucosidase), AWA1 (GPI-anchored protein) aumento da

hidrofobicidade de parede celular - Saccharomyces kudiawzevii – tolerância a estresse entre os quais baixas temperaturas, liberação de tióis (4-MMP) - Saccharomyces mikatae - ? - Saccharomyces uvarum – metabolismo de nitrogênio (asparaginase, oxiprolinase), tolerância a baixas

temperaturas.

TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE GENES: EVENTOS MÚLTIPLOS NA EVOLUÇÃO DAS LEVEDURAS ENOLÓGICAS.

ISTO É SÓ O INÍCIO

“CABE A NOS EXPLORARMOS E INCORPORARMOS ESTES, E OUTROS

CONHECIMENTOS, NA PRÁTICA ENOLÓGICA!!!!”

--- (acesso 2015) Saccharomyces genome database (SGD). (www.yeastgenome.org) Almeida, P. et al. (2015) A population genomics insight into the Mediterranean origins of wine yeast domestication. Molec. Ecol.

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genomic approach. G3 (Genes/genomes/genetics) 1: 263- 281. Borneman, A. R. et al. (2008) Comparative genome analysis of a Saccharomyces cerevisiae wine strain. Yeast Res. 8: 1185-1195. Borneman, A. R. et al. (2011) Whole-genome comparison reveals novel genetic elements that characterize the genome of

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nitrogen signaling. BMC Genomics 15: 495. Engel, S.R.; Cherry, J.M. (2013) The new modern area of yeast genomics: community sequencing and the resulting annotation of

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BIBLIOGRAFIA PRINCIPAL