Gestor de negócios – Diagnóstico Molecular Diagnósticos da ...sbpc.org.br/upload/congressos/2_Garantia_e_controle_da_qualidade... · 9Quando os valores de referência ... Mapa

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Declaração de Conflitos de Interesse

• Gestor de negócios – Diagnóstico Molecular

Diagnósticos da América S/A

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Diagnóstico MolecularDiagnóstico Molecular

• Discutir etapas e critérios necessários para garantir o controle de qualidade nos exames de Biologia Molecular.

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H I S T Ó R I C OH I S T Ó R I C O

•Diagnóstico Molecular: Critérios gerais ISO , PALC, CLSI, bulas e controles externos (PELM) – 2000 à 2003.

•Diagnóstico Molecular com certificação CAP: baseado em checklist específico –2003 até o momento.

•Diagnóstico Molecular com certificação CAP e checklist específico PALC – 2008.

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T E S T E S E M B I O L O G IA M O L E C U L ART E S T E S E M B I O L O G IA M O L E C U L AR

•Qualquer método que amplifique DNA/RNA independente da área.

•Todos os testes “home brew” (próprios).

•Mesmo se apenas 1 teste for realizado.

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DIAGNÓSTICO MOLECULARDIAGNÓSTICO MOLECULAR

Aplicação das técnicas de Biologia Molecular:

•Oncologia•Hematologia•Doenças infecciosas•Genética•Histocompatibilidade•Identificação humana

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G A R A N T I A D E Q U A L I D A D E

ASPECTOS GERAIS

•O Setor de Biologia Molecular deve ter um Programa de Garantia da Qualidade:Avaliação da qualidade analítica (CQE/CQI, PAC):

Análise critica.Limites de aceitabilidade. Critérios de avaliação.Indicadores.

•Programa de avaliação externa da qualidade.

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ASPECTOS GERAIS - Definições• Controle Externo: usado para monitorar ou medir a exatidão de um sistema analítico. Ex: ensaios de proficiência = amostra clinica.

• Controle de reação: monitora o funcionamento de uma reação, detectando inibidores. Previne falso-negativos.

• Controle Interno: usado para monitorar estabilidade e precisão da reação.

Presentes nos ensaios qualitativos e quantitativos.

Positivo, alto e baixo, negativo, branco de reação.

Genética: heterozigoto, homozigotonormal e mutado.

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ASPECTOS GERAIS

•Experiência ou especialização na área.

•Treinamento para os principiantes no setor e um programa de educação continuada para toda a equipe.

•Técnicos de nível superior.

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ROTINA DIAGNÓSTICO MOLECULAR

•Testes comerciais...•Testes próprios (In house)

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ROTINA DE TESTES COMERCIAIS

• Validação prévia e bem estabelecida.

• Registro FDA/Anvisa.

•Facilidade na importação.

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ROTINA DE TESTES PRÓPRIOS

Nos EUA...

•Os testes próprios são considerados“Reagentes analíto-específico” (ASR).

•Neste país existe uma legislação apropriada (que não é o caso do Brasil).

• É obrigado no laudo estar escrito que o teste foi desenvolvido, validado pelo laboratório e que o teste não foi aprovado pelo FDA.

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ROTINA DE TESTES PRÓPRIOS

•Descrição das etapas do processo.

•Especificação e sistemática de validação de insumos, reagentes e equipamentos.

•Sistemática de validação.

•Importação reagentes.

•Frase sugerida no laudo: Este teste foi desenvolvido e suas características avaliadas pelo (nome do laboratório).

No BRASIL...

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TESTES COMERCIAIS E PRÓPRIOS

Parâmetros comuns

•Testes de proficiência (CQE; PAC).

•Documentos sobre a validação do teste.

•Manuais de procedimento técnico.

•Documentação da Qualidade: análises e CQI.

•Manutenções e calibrações de equipamentos.

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GARANTIA DA QUALIDADE

Validações de testes

Testes comerciais e próprios

•Análise critica e aprovação todas as validações dos métodos antes de serem implementados na rotina.

•Para os testes comerciais, o laboratório deve verificar as características de desempenho informadas pelos fabricantes.

•Modificações nos procedimentos recomendados pelo fabricante são permitidas desde que validadas.

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Testes comerciais e próprios

• Amostras representativas de todos os resultados (genótipos) possíveis e acessíveis.

• Número representativo de cada tipo de amostra que será analisada.

• Validação estatística (quantitativa/qualitativa) ou clínica.

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Testes próprios... Planejamento

•Estudos de validação e características de desempenho:

sensibilidade analítica e diagnóstica (clínica).

especificidade analítica e diagnóstica (clínica).

precisão.

linearidade (ensaios quantitativos).

faixa reportável de resultados de pacientes.

intervalo de referência.

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Validações de testes próprios. Análise qualitativa

Definição dos valores de referência e interpretação dos resultados. Ex: detectado/não detectado; selvagem homozigoto; heterozigoto ou homozigoto mutante.

Quando os valores de referência dependerem da situação clínica, as diretrizes para a interpretação dos resultados de pacientes devem ser definidas e documentadas.Ex: Ca de tiróide (gene RET).

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Validações de testes próprios

. Análise quantitativa

definição de controles em níveis diferentes (negativo, positivo baixo e alto).

linearidade. Ex: cargas virais

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F A S E P R É - A N A L Í T I C A

A documentação pré-analítica deve incluir, quando aplicável:•consentimento informado assinado pelo paciente ou responsável.•raça ou etnia.•heredograma.

Critérios documentados para a rejeição de amostras incluindo:•amostras mal identificadas.•material inadequado.•recipientes manipulados antes de darem entrada para os testes de biologia molecular.

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GARANTIA DE QUALIDADE

F A S E P R É - A N A L Í T I C A

•Alíquotas dos materiais: política para prevenir possíveis contaminações – recipiente primário.

•Processamento imediato das amostras ou conservação adequada para evitar degradação.

•Sistemática de comunicação ao requisitante caso a amostra seja inadequada.

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IDENTIFICAÇÃO HUMANA (PATERNIDADE)Comitê técnico

•Agendamento prévio.

•Local, data da coleta da amostra e Identificação do coletador da amostra.

•Cadastro completo dos participantes incluindo nome, etnia, parentesco.

•Termo de Consentimento assinado.

•História de transfusão nos últimos três meses e de transplante medula óssea em qualquer época.

•A identificação e informações da coleta devem ser conferidas pelos participantes do exame.

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IDENTIFICAÇÃO HUMANA (PATERNIDADE)Comitê técnico

•A qualidade da amostra deve ser avaliada, registrada no recebimento e mantidas com acesso limitado.

•Fluxo da Cadeia de custódia (coleta até recebimento do laudo).

•O laudo deve incluir um índice individual de paternidade (IP) para cada região estudada, um índice combinado (IPC), a probabilidade de paternidade percentual (PP) e a referência utilizada para cálculo da freqüência populacional.

•Dupla conferência especialmente nas exclusões.

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PATERNIDADE - INCLUSÃO

Ladder

Mãe

Filho

Suposto Pai

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PATERNIDADE - EXCLUSÃO

Ladder

Mãe

Filho

Suposto Pai

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Reagentes em geral,Primers e Sondas

Qualidade da água.Tamanho do fragmento esperado.Concentração do estoque.Conteúdo de bases CG.Sítios relevantes de enzimas de restrição.Temperatura de hibridização.Referencia na literatura e em caso de vírus, pesquisa de alinhamento com cepas divergentes.

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Alinhamento de algunssubtipos de HCV

ctagacgtcatcta6

ctaggcgtaaacta5

cc,tagacgca,c,gattta4

ctgggtgccgtccg3c

ctaggcgccgtccg3b

ctgggtgca,c,tg,atccg3a

taaagcatcatcta2b

taaggcgtcatcta2a/c

cc,taga,gcgtag,atcta1b

cc,tagacgtag,atcta1a

162158157156154153151150948281797245Genótipo

23a2b3a2b5433

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Mapa de primer

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F A S E A N A L Í T I C A

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2

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Extração de ácidos nucléicos

Amplificação

Detecção

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Extração

Os ácidos nucléicos devem ser extraídos e purificados por meio de métodos reportados na literatura ou validados pelo próprio laboratório.

Devem ser quantificados quando aplicável.

Para sistemas analíticos que tenham como alvo o RNA humano(ex: transcrição de genes), a integridade do RNA da amostra deve ser avaliada.

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Ensaios de amplificação

Eliminar carreamento (“carryover”) e resultados falso-positivos por meio do uso de barreiras físicas para minimização de aerossóis.

Eficácia amplificação: controles de reação –falso-negativo.

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Sistemas de detecção

1- Eletroforese em gel de agarose

Marcadores de peso molecular conhecido em intervalo compatível com o das bandas esperadas.

Quantidades padronizadas de ácido nucléico. Ex: ensaios com enzima de restrição.

Deve haver critérios objetivos para a interpretação dos resultados.

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FOTOS EM GÉIS DE AGAROSE

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2- Sequenciamento automático de DNA ( eletroforese capilar)

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No sequenciamento...

. Os ensaios de seqüenciamento devem ser otimizados de forma a garantir a presença de sinal detectável em todo o comprimento da região alvo.

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. A detecção de seqüências variantes, especialmente aquelas em estado de heterozigose, devem ser comparadas com seqüências referências (NCBI –GenBank).


Seqüência referência Qualidade da seqüência

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Genotipagem do virus da Hepatite C

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Site de Interpretações de resultados - HIV

Escolher um método . Usar nomenclatura padrão para descrever as mutações e polimorfismos. Ex: sites

Escolher a região a ser analisada

Analisar mutações

http://hivdb.stanford.edu/index.html

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Site de Interpretações de resultados - HIV

HIVdb: Algorítimo de interpretação resistência genotípica SeqID: Date: 27-Aug-2007

Drug Resistance InterpretationNRTI Resistance Mutations:M41L, T215YNNRTI Resistance Mutations:NoneOther Mutations:None

Intermediate resistanceTDF

SusceptibleFTC

Intermediate resistanceDDI

Intermediate resistanceD4T

Intermediate resistanceAZT

Intermediate resistanceABC

Susceptible3TC

SusceptibleTMC125

SusceptibleNVP

SusceptibleEFV

SusceptibleDLV

http://hivdb.stanford.edu/index.html

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BANCO DE DADOS

"

•Utilizar banco de dados atualizado. Ex: Fibrose cística.

Name: 175insTNucleotide Change: insertion of T after 175Consequence: frameshiftExon happened: 1

•www.genet.sickkids.on.ca/cftr

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. Validação das seqüências

Critérios para validar e interpretar os dados do seqüenciamento (dados primários).

Seqüência das fitas “sense” e “anti-sense” em heterozigotos, alelos raros e combinações raras de alelos.

Confirmação periódica por fitas complementares quando utilizar somente uma seqüência para analise.

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Seqüenciadores automáticos de DNA

Capilar

Placa gel de poliacrilamida

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Sistemas de detecção3- PCR em tempo Real

Para testes quantitativos, os resultados do controle interno devem estar dentro do intervalo especificado e os controles positivos alto e baixo dentro da média e seu desvio padrão previamente estabelecido.

Para testes que geram resultados baseados em Tm, devem ser definidos e monitorados intervalos estreitos de temperatura (= +/- 2,5 ºC).

Lotes novos de todos os reagentes, controles e curvas padrão devem ser testados e validados.

Os sistemas multiplex devem ser otimizados para evitar perda da eficiência da amplificação (competição).

Validação de nova versão de softwares com controles conhecidos.

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GEL DE AGAROSE X PCR EM TEMPO REAL

Controles de reação

Gel de agarose

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PCR EM TEMPO REAL

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4. Ensaios tipo arranjo (Microarrays)

A integridade do DNA bem como sua marcação (sondas de hibridização) deve ser verificada e monitorada.

A qualidade dos arranjos deve ser verificada de acordo com as especificações do fabricante.

Para ensaios quantitativos (expressão gênica, cargas virais) deve ser usado níveis de controles para uma ou mais sondas e ainda um branco de reação a cada corrida.

Avaliação periódica nas funções do softwares.

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MICROARRAYS de DNA

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5. Hibridação in situ com fluorescência(FISH)Titulação sondas.

Validação de tecido e sondas controles para verificar a sensibilidade e especificidade do ensaio.

O resultado é interpretado levando em consideração a morfologia do tecido/célula.Verificação do microscópio/filtros.

Revisão lâminas (controles) para avaliar o sinal, o background e a morfologia.

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FISH

vermelho CCND1; verde IgH; amarelo (11;14)

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F A S E P Ó S - A N A L Í T I C A

.Testes Qualitativos e quantitativos:

Testes qualitativos que usam um valor de ponto de corte (cutoff) para a distinção entre os resultados positivos e negativos, a rotina deve ser avaliada de acordo com os critérios preconizados pelo fornecedor ou validados pelo setor

Critérios para interpretação de resultados bem como desempenho de cada ensaio. Ex: avaliação padrão de bandas, linearidade e sensibilidade.

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. Testes Quantitativos:

Ter os métodos para o cálculo dos resultados e unidades descritos de maneira clara

A faixa de trabalho (Range) do ensaio deve ser definida e o desempenho deve ser monitorado a cada corrida com o uso de controles negativo e positivos baixo e alto. Monitoramento de rotina (calculo CV)

Para detecção de sinais quantitativos deve haver critérios para a realização e avaliação do(s) controle(s) de reação(ões), seja(m) ela(s) efetuada(s) pelo fabricante ou pelo laboratório.

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TESTES QUALITATIVOS E QUANTITATIVOS

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Detecção de falhas nas reações

•É importante monitorar para saber se algum problema está começando a acontecer no processo.

•Investigação da causa.

•Ação corretiva sem impacto ao cliente.

•Necessidade de nova amostra –comunicação imediata.

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• Análise de consistência (correlatos clínicos).

• Devem ser gerados resultados preliminares, quando apropriado.

• Discrepâncias entre os achados da biologia molecular e a clínica ou outros achados de laboratório devem ser investigadas e documentadas, e devem ser tomadas ações corretivas quando indicadas.

• Estatísticas dos resultados de testes moleculares de maneira que permita o acompanhamento do desempenho analítico, a avaliação de tendências populacionais.

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LAUDOS

Protocolos para a liberação de laudos.

Informação suficiente para que a decisão clinica possa ser feita de forma apropriada:• Resultado com respectiva unidade

de medição.• Valores de referência.• Técnica usada/versão kit.• Gene estudado.• Achados não usuais com registro.• Retificação se pertinente.

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LAUDOS• Especialmente nos testes de genética molecular:

Informação interpretativa ou relevante no resultado da análise – ciência e revisão pelo especialista na área.

Confidencialidade.

Linguagem clara, estimativa da chance de detecção da mutação e o risco residual de ser portador de uma ou mais das mutações não testadas, quando aplicável (ex: fibrose cística, câncer de mama e ovário...).

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LAUDOS•Recomendações para que o paciente receba aconselhamento genético pré e pós-teste para implicações e esclarecimentos do resultado do teste.

• Discussão das limitações dos achados e das implicações clínicas da mutação detectada (ou do resultado negativo) com respeito à herança recessiva ou dominante, o risco de recorrência, a penetrância, a gravidade e estimativa de falso-positivo.

• Deve ser usada nomenclatura padrão internacionalpara designar genes e mutações. (http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/)

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REGISTROS - RASTREABILIDADE

Amostras (boa qualidade) devem ser guardadas por um período de tempo que permita a solicitação de um novo teste.Lote.Laudos.dados brutos.Membranas.auto-radiografiasfotografias de géislâminas de hibridização in situ

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EQUIPAMENTOS

• Plano de manutenção preventiva em comum acordo com o fornecedor.

• Termocicladores: verificação periódica da temperatura dos poços individuais ou de uma amostra significativa deles.

•Luminômetros, densitômetros: os níveis aceitáveis de contagem de fundo devem ser medidos e registrados a cada dia ou a cada uso.

•Inter-equipamentos: garantir a reprodutibilidade.

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EQUIPAMENTOS

•Processadores de filmes fotográficos:Manutenção adequada das fontes de luz

UV protegidas por barreiras.

•Espectrofotômetros:checagem periódica dos filtros.

Calibração regular da leitura dos comprimentos de onda de acordo com as instruções do fabricante.

Curvas de calibração, elas devem ser repetidas ou verificadas regularmente.

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EQUIPAMENTOS DE PROTEÇÃO INDIVIDUAL (EPI)

. Obrigatoriedade do uso de luvas, óculos de segurança, máscara, avental, etc...

. Devem ser tomadas medidas de proteção (EPC ou EPI) para prevenir os riscos causados por líquidos voláteis. Ex: cabine de biossegurança certificada pelo menos anualmente, capelas exaustão.

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CONTAMINAÇÃOSistemática para prevenção de

contaminação das amostras pelo operador:

Utilização de cabines de PCR•Fluxo unidirecional•Áreas pré e pós-amplificação

Plano de descontaminação para previnircontaminação do sistema analítico: ribonucleases, produto de PCR.

Licença CNEN para manipulação e descarte devem ser atendidas e o laboratório ter um plano PGRSS

Plano de descarte para brometo de etídeo

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DIFICULDADES NO CONTROLE DA QUALIDADE EM BIOLOGIA MOLECULAR

Testes oferecidos pelo CAP- Alto custo- Dificuldades na importação:

. Falta de registro do controle.

. Condições inadequadas devido à problemas na alfândega (classificação de itens -NCM).

. Análise crítica: documentação e ações corretivas.

. Inexistência de programa alternativo de controles (todos analítos devem ser contemplados).

1. O laboratório não participa de um programa externo de qualidade (CAP/PALC).

2. Testes de Proficiência:

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DIFICULDADES NA GARANTIA DE QUALIDADE EM BIOLOGIA MOLECULAR

Ensaios com e sem proficiência pelo CAP e PELM

Adenovirus

Dengue

Herpes 6

HTLV 1-2

Parvovírus

Identificação de bactérias

Programa alternativo

de controle

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Validação de ensaio de testes in house:• Falta de legislação apropriada no

Brasil como nos EUA para a aprovação de novos testes.

• Dificuldade de obtenção de painel de amostras estáveis conforme solicitação do PALC/CAP.

3. Validações

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4. Pessoal

• Não existe certificado de “Patologia Molecular” no Brasil.

• Os profissionais que trabalham com Biologia molecular, em geral, vieram de laboratórios de pesquisa onde as normas de qualidade não são sistematizadas como em um laboratório clínico.

• Necessidade de treinamento específico na área, no CAP e PALC.

• Treinamento inspetores/auditores.

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5. Espaço físico

•Equipamentos

•Trabalho técnico

•Análise

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SETOR DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR

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[email protected]

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