IntroduoDoena de grande interesse mdico, cientfico e pblicoFreqente distrbio hereditrio da coagulaoCausada por: ausncia, deficincia severa ou defeitos na funo do fator VIII da coagulao

Dados HistricosRelatos antigos presentes no Talmud sugerem seu padro de herana h aproximadamente 2000 anosperda de sangue x reteno de sangueEm 1803, Otto descreveu seu padro de herana numa famlia de New Hampshire

Dados HistricosA Hemofilia ficou conhecida como doena Real por seu aparecimento entre os filhos da Rainha Victoria, da Gr-BretanhaSe disseminou s famlias reais europias atravs dos descendentes da Rainha VictoriaHemofilia A ou Hemofilia B?

DefinioA hemofilia A uma doena hereditria recessiva ligada ao cromossomo X que ocorre devido deficincia do fator VIII da coagulao ou a defeitos estruturais em suas molculasDistrbio clinicamente heterogneo devido quantidade de defeitos diferentes no gene do fator VIII

Epidemiologia uma doena que no respeita limites tnicos ou geogrficos a principal causa de sangramentos severos e a segunda principal causa de todos os distrbios congnitos que causam sangramentos, ficando atrs somente da doena de von Willebrand

EpidemiologiaIncidncia aproximada:- 1 em cada 5000 crianas do sexo masculino- em mulheres, de 1 para cada 25.000.000

Padro de HeranaDoena recessiva ligada ao cromossomo X

Padro de HeranaExpressa-se em todos os homens que a recebem, mas apenas nas mulheres homozigticas para a mutaoO homem afetado transmite o gene para todas as suas filhasMulheres carreadoras tm aproximadamente 50% de chance de transmitir os genes para seus filhosO gene jamais se transmite diretamente do pai para o filhoAproximadamente 30% dos casos decorrem de mutaes novas

Padro de HeranaMulheres afetadas:- Homozigticas recessivas- Hemizigticas para a mutao do fator VIII, como resultado de inativao desigual do cromossomo X (defeito na Lyonizao)Alguns casos:- Mulheres com sndrome de Turner- Casos de mosaicismo do cromossomo X

Apresentao ClnicaOcorre nas seguintes formas Leve: 31%*Moderada: 26%*Severa: 43%**Soucie, J. M.; Evatt, B.; Jackson, D.; Hemophilia Surveillance System Project Investigators : Occurrence of hemophilia in the United States. Am. J. Hemat. 59: 288-294, 1998.

Apresentao Clnica

ClassificaoNvel de Fator VIII (ativo)Achados ClnicosSeveraAt 1% do normalHemorragias e hemartroses espontneas, requerindo reposio de fator VIII.

Moderada2-5% do normalHemorragias secundrias a traumas ou cirurgias.

Leve6-30% do normalHemorragias secundrias a traumas ou cirurgias, raras hemorragias espontneas.

Hemartrose

Hematoma

Hematoma do lio-psoas

Outros AchadosPseudotumoresHematriaComplicaes neurolgicasHemorragias em mucosasSangramentos ps-cirrgicos

Hemorragia Intracraniana

Papel do Fator VIII na Coagulao Sangnea

HemostasiaEspasmo VascularFormao do tampo plaquetrioFormao do cogulo sangneoOrganizao fibrosaDissoluo da crase sangnea

Via IntrnsecaInicia com alterao no sangue ou exposio deste ao colgeno do vaso traumatizado

Fator VIII: cofator na via intrnseca da cascata de coagulao

Complexos EnzimticosComplexo X-ase: fator VIIIa + fator IXaAtivao do fator X

Complexo protrombinase ou ativador da protrombina: fator Xa + fator Va

Fator VIIIMesmo quando presente em concentraes relativamente baixas no plasma, a funo de coagulao mantidaSomente uma reduo substancial (maior que 70%) leva aos distrbios sangneos caractersticos da hemofilia A

Fator de von WillebrandCircula no plasma com o fator VIIIFunes:acentuar a sntese de fator VIIIproteger o fator VIII contra a proteliseaumentar a concentrao do fator VIII no stio da leso vascular

Estrutura do Gene do Fator VIII

Estrutura do Gene do Fator VIIIO gene est localizado no topo do brao longo do cromossomo X (Xq28)186 kb0,1% da constituio total do X26 xonsRNAm de 9kb

Estrutura do Gene do Fator VIII24 xons variam em comprimento (69 - 263 pares de bases)Os maiores xons so:xon 14: 3106 pbxon 26: 1958 pb

Estrutura do Gene do Fator VIIIntron 22separa os xons 22 e 23Contm a ilha CpGTem 2 transcries: F8A e F8BF8B: transcrito na mesma direo que o gene do fator VIII, usando um xon prprio mais os xons 23 a 26 do fator VIIIF8A: no contm ntrons e transcrito na direo oposta do gene do fator VIII

Estrutura do Gene do Fator VIIIntron 22H duas cpias de F8A adicionas, no localizadas tambm no cromossomo X implicadas em quase metade dos casos de hemofilia A severa, via mecanismo de inverso parcial.The Molecular Pathology of Haemophilia A. Review Article. http://europium.cfc.mrc.ac.uk.

Estrutura do Gene do Fator VIIIRNAmcodifica um polipeptdeo de 2351 aa, sendo que 19 aa so removidos durante sua secreo. Hoyer LW. Hemophilia A. N Engl J Med 1994;330:38-47.

Estrutura do Fator VIIIContm 3 domniosdomnio A: A1, A2, A3domnio B: nico e centraldomnio C: C1, C2

Domnio BCodificado pelo xon 14Parece exercer a funo de conexoFatores VIII recombinantes, cujo domnio B estava ausente, mantinham sua funo relativamente normal, mostrando, portanto, que pode ser dispensvel.

Hoyer LW. Hemophilia A. N Engl J Med 1994;330:38-47.

Domnio BO domnio B clivado, resultando em :cadeia leve: A3, C1, C2, de 80 kDacadeia pesada: A1, A2, de 200 kDa, contm tambm parte do domnio B

Ativao do Fator VIIISintetizado como um polipeptdeo de cadeia simplesAps a sntese clivado, por protease ainda indefinidaTorna-se um heterodmero

Ativao do Fator VIIIPela ao da trombina ou fator Xa, o fator VIII clivado nos stios 372 e 1689 da argininaEssa clivagem essencial para a liberao do fator VIII ligado ao FvW, permitindo que se ligue superfcie fosfolipdica e interaja com o fator IXa

Ativao do Fator VIIIA clivagem no stio 372 converte a cadeia pesada em 2 fragmentos: um de 54 kDa e outro de 44 kDaA clivagem no stio 1689, libera um pequeno fragmento da cadeia leve, separando o fator VIII do FvW. Assim o fator VIII fator VIIIa

Fator VIIIa composto pelos seguintes fragmentos:54 kDa da cadeia pesada44 kDa da cadeia pesada72 kDa da cadeia leveA etapa limitante na ativao do fator VIII a clivagem no stio 372

Fator VIIIaClivagens no essenciais: stio 740 da arginina, pela trombina ou fator Xaa cadeia pesada torna-se um fragmento de 92 kDaretira parte do domnio B da cadeia pesada

Desativao do Fator VIIIA funo de cofator do fator VIII rapidamente perdida:Pela protelise molecular que ocorre por dissociao de suas subunidades.Pela protena C ativada

Gentica Molecular

Gentica MolecularPontos de mutao:1/3 dos pontos de mutaes que ocorre no gene do fator VIII esto localizadas no dinucleotdeo CpG (ponto quente)Stio da endonuclease de restrio Taq1, que reconhece a seqncia TCGA. Essas mutaes so detectadas pela perda deste stio de clivagem. The Molecular Pathology of Haemophilia A. Review Article. http://europium.cfc.mrc.ac.uk.

Defeitos GenticosRearranjos gnicosSubstituio de Base nicamissense: substituio de um nico aminocidononsense ou mutao em parada: trmino prematuro na cadeia peptdicaDeleesGrandes deleesPequenas deleesInsero

Rearranjos GnicosConsistem basicamente em uma nica inverso responsvel por mais de 40% de todos os casos de hemofilia A severa.Grande inverso e translocao dos xons 1 a 22, juntamente com os ntrons, com os xons 23 a 26Mecanismo: recombinao homloga entre F8A e uma cpia extragnica de F8A

Rearranjos GnicosConseqncia: remoo da terminao C da protena codificada pelos xons 23-26, ocasionando uma perda completa na funo deste fatorDeteco: Southern blotting (enzima de restrio BclI e gene A como probe)

Rearranjos Gnicos35% dos casos de hemofilia A severa pela inverso com a cpia distal de F8A7% dos casos de hemofilia A severa pela inverso com a cpia proximal de F8A

The Molecular Pathology of Haemophilia A. Review Article. http://europium.cfc.mrc.ac.uk.

Rearranjos GnicosOrigem: quase exclusivamente proveniente de um nico erro no crossing-over durante a meiose espermatognica de um homem normalConcluso:Gera mulheres carreadoras desta mutao, mas sem histria familiar de hemofilia Amais de 40% dos casos de hemofilia A severa no tm histria familiar

Substituio de Base nicaH aproximadamente 309 tipos85% so mutaes missense14% so mutaes nonsense1% o splicing do RNAm est alterado ou ausenteNos pontos quentes o cdon do aa arginina (CGA, CGC, CGG) freqentemente afetado por mutaes

Substituio de nica baseMissense: fentipos variadosNonsense: levam a hemofilia A severa, por formar uma molcula de fator VIII truncado

Delees5% dos casos de hemofiliaFrequntemente associado hemofilia A severaOcorre tanto nas clulas germinativas femininas quanto nas masculinas

Grandes DeleesDelees desde 1kb at mais de 210 kbMecanismo mais provvel: recombinao no-homloga dos cromossomos na meiose I5% dos casos de hemofilia A severaDoena moderada: resultado do splicing do RNAm que deleta o xon 22 e os xons 23-24Alto risco para desenvolvimento de inibidores.

Pequenas DeleesVariam desde 1 a 86 pares de bases distribudos pelos xons.Associadas a doena severa e moderadaA maioria so mutaes do tipo frameshift

InseresVariam em tamanho de 1 par de bases a 2,1 kbTodas associadas a doena severaInsero L1 (LINE 1) similaridade ao DNA da transcriptase reversa retroviral

Diagnstico ClnicoSangramentosArticulaesMsculosTGIHemorragias espontneas

Diagnstico Laboratorial TTPAPlaquetas, TP, tempo de sangramento normaisFvW normal

Diagnstico GenticoMutaes de base nica PCR + seqenciamentoInverses Southern blotting (probe F8A)Delees Grandes delees Southern blottingPequenas delees PCR + seqenciamentoInseres Southern blotting

Diagnstico DiferencialHemofilia B Deficincia de fator IXDoena de von WillebrandFvW deficiente ou anormalTempo de sangramento prolongadoPadro autossmico dominante

Aconselhamento GenticoHistria familiarExames laboratoriais:PCRSouthern blottingPredisposio formao de inibidores

Aconselhamento GenticoPCR + SeqenciamentoMutaes de base nicaDificuldadesGrande tamanho da regio codificadora No detecta rearranjos onde a seqncia de xons esteja inalteradaPequenas delees

Southern blottingGrandes deleesInseresInverses

Diagnstico Pr-NatalPor qu?Assistncia psicolgicaAssistncia hospitalarComplicaes Determinao do sexoanlise citogentica1979: fetoscopia assistida por ECO = sangue fetal

Diagnstico Pr-NatalAmniocentese12-14 semana de gestao

Vilosidades Corinicas9-11 semana de gestaotranscervical x transabdominal

TratamentoRestituio da atividade deficienteManejo clnicocentros especializadosequipes multidisciplinaresavaliaes peridicasprogramas de exercciosboa higiene oral

TratamentoDerivados plasmticos XFator VIII recombinante

TratamentoDerivados PlasmticosAnos 70Crioprecipitado / Plasma frescoTransmisso de agentes infecciososProcessos de inativao viralFormao de inibidoresProfilaxia: 3 vezes/semana

TratamentoFator VIII RecombinanteIncio da dcada de 90Excelente eficciaAlta correlao entre dose X nveis fator VIIMeia-vida: 8-12 horasProfilaxia: 3 vezes/semana

Tratamento

Derivados PlasmticosFator VIII Recombinante segurana? (inativao viral) + seguros + baratos + caros (2-3 vezes) disponibilidade maior baixa disponibilidade inibidores: 10-15% inibidores: 10-15% + utilizados

TratamentoAnticorpos contra o fator VIII10-20% dos pacientes hemoflicosDistrbios severos da craseTTPA prolongadoAc inativam plasma normal

TratamentoSchwaab R, Brackmann HH, Meyer C, et al. Haemophilia A: mutation type determines risk of inhibitor formation. Thromb Haemost 1995;74:1402-6.

Grf1

0.04

0.07

0.34

0.36

0.38

Formao de Inibidores

Formao de Inibidores X Tipo de Mutao

Plan1

Mutaes MissensePequenas DeleesInverses (ntron 22)Grandes DeleesMutaes Nonsense

4%7%34%36%38%

Plan2

Plan3

Tratamento

TratamentoLewis et al. (1985) Tx HepticoPcte hemoflico + cirrose por hepatite viralPs-operatrio: nveis quase normais de fator VIII

TratamentoSangramentosMenores: atingir 25% dos valores normais de fator VIIIModerados (hematomas musculares): atingir 50%Grandes sgtos / cirurgias: atingir 100%Dose1U fator VIII = 1 ml plasmaVolume plasmtico = 40 ml/KgVolume de distribuio do fator VIII = 1,5 vez o volume do plasma100% 60 unidades/Kg

TratamentoDesmopressinaAnlogo da vasopressina liberao e nveis de fator VIII e FvW Hemofilia A leve a moderada

Doenas SecundriasFatores plasmticos (agentes infecciosos)Cirrose HepticaVrus da hepatite B, CCa hepatocelularSIDAHIVInibidores da proteaseTrombocitopenia imuneMetade da dcada de 80: 60-70% dos hemoflicos contaminados (EUA e Europa Ocidental)

Terapia GnicaCandidatas ideaisProduo endgena contnuaVetores viraisIntroduo do gene em fibroblastos da pele ex vivo

Terapia GnicaRoth et al.: Nonviral transfer of the gene encoding coagulation factor VIII in patients with severe hemophilia A. N Engl J Med 2001;344:1735-42.4/6 pactes: nveis detectveis de fator VIII (2 pactes: > 1,0%)Nenhum pcte desenvolveu inibidores pctes dose de fator VIII recombinante sgtos10 meses aps: indetectveis

Terapia GnicaIntroduo do gene em fibroblastos (eletroforese)Implantao dos fibroblastos no peritneo

Terapia Gnica

Hemofilia A Realidade80% dos pacientes no recebem qualquer tipo de ttoProduo e purificao do fator VIII extrado do leite de animais transgnicos

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