Luis P. Fonseca - Autenticação · Panificação Óleos e gorduras Enzimas em processos de Biocatálise/Biotransformação Processamento do amido Antibióticos Química fina Lição

DEQB

Engenharia Enzimática

Luis P. FonsecaMestrado em Engenharia Biológica

3º Ano – 2º Semestre – 2007/2008

Centro de Engenharia Biológica e Química,

Torre de Química, 8º piso, ext. 3065/3139

Lição de Biocatálise

Bibliografia geral

• - Cabral JMS, Aires-Barros MR, Gama M (eds.) “Engenharia Enzimática” Lidel-Edições Técnicas, Lda, Lisboa (Portugal) 2003.

• - H. W. Blanch and D. S. Clark “Biochemical Engineering”Marcel Dekker, NY, USA, Cap 6, 1997.

• - Buchholz K, Kasche V, Bornscheuer UT “Biocatalysts and Enzyme Tecnhology” Wiley-VCH, Darmstad (Germany) 2005.

• - D. Demirjian, P. Shah e F. Moris-Varas “ Screening for Novel Enzymes” em “Biocatalysis – From Discovery to Application” W.- D. Fessner (Ed.) Springer, Heidelberg, Germany, 2000.

• Tramper, “Multiphase Bioreactor Design”, Taylor and Francis Books, London, 2001.

DEQB


DEQB

Engenharia enzimática

1. Introdução

2. Produção de Enzimas

3. Isolamento e Purificação de Enzimas

4. Actividade e Estabilização de Enzimas

5. Métodos de Estabilização de Enzimas

6. Cinética de Biocatalisadores Imobilizados

7. Reactores Enzimáticos

8. Biocatálise em Solventes Orgânicos


DEQB

Engenharia enzimática1 Introdução


As primeiras aplicações de enzimas podem ser descritas como uma ARTE.

Estas aplicações têm origens na China antiga e no Japão, na manufactura de alimentos e bebidas alcoólicas em que eram usadas amilases e proteases de origem vegetal e microbiana.

Por exemplo, a produção de queijo era conseguida através da agitação de leite com um ramo de figueira, que liberta uma protease, a ficina, que promove a coagulação do leite.

DEQB


A biocatálise aplicada, COM UMA BASE CIENTIFICA, remonta ao final do século XIX, com a introdução de preparações padronizadas de renilasesno fabrico industrial do queijo. Contudo, a implementação de novas aplicações industriais de enzimas foi muito lenta, só surgindo de forma intensa nos últimos 30 anos.

Por exemplo, a aplicação de proteases, nomeadamente tripsina, na indústria de detergentes, assim como, as pectinases na indústria dos sumos demorou mais de 50 anos a ser comercializada a nível industrial e só em 1955 se concretiza a utilização industrial da glucoamilase na produção de dextrosea partir do amido.

Mais recentemente a utilização de tecnologias de ADN recombinado, que permitem a obtenção em larga escala de enzimas com elevada produtividade e o "design" mais adequado do enzima, são as principais razões para a importância actual dos enzimas a nível industrial.


DEQB


Actualmente a nível mundial há:

- 12 produtores principais de enzimas e cerca de 60 companhias mais pequenas que operam com produtos mais especializados.

- ~ 60% da capacidade instalada de produção de enzimas está concentrada na Europa.

- ~ 75% dos enzimas com aplicações industriais são hidrolases, que

actuam despolimerizando substâncias naturais (ex: amido, proteínas, …).

- As proteases representam o grupo principal, porque são utilizadas em

grandes quantidades nas indústrias dos lacticínios (coagulantes) e dos

detergentes, representando cerca de 40% das vendas totais.

- O segundo grupo mais importante corresponde às glicanases, utilizadas nas

indústrias da panificação, cerveja, amido e têxteis.


DEQB


O mercado mundial de enzimas passou de cerca de 400 milhões de dólares americanos, em 1983, para 1 bilião, em 1995. Estima-se que esse valor deverá duplicar até 2005.


DEQB



Mercado de enzimas em 1994 (à esquerda); previsão para 2005 (à direita).

A rubrica “outros” inclui actualmente pelo menos 12 sectores:álcool, alimentação animal e rações, panificação, biotransformações

enzimáticas, diagnósticos, óleos e gorduras, aromatizantes, vinho e sumos,curtumes, papel e tratamentos de resíduos.

Qual uso dos enzimas e biocatalisadores pelo homem?

Qual uso dos enzimas pelo homem?


DEQB


DEQB



INDÚSTRIA DE DETERGENTES

- Hoje em dia, cerca de metade de todos os detergentes existentes no mercado contêm enzimas, em particular proteases, amilases, celulases e lipases.

- Os enzimas, além de aumentarem a eficiência de lavagem, permitem

trabalhar a temperaturas mais baixas e reduzir os períodos de lavagem e,

consequentemente, os gastos energéticos associados com a agitação.

- As 4 categorias de enzimas usados na indústria de detergentes são:

- proteases para remoção de resíduos proteicos,

- amilases para degradação do amido,

- lipases para a hidrólise de gorduras e

- celulases para melhoria da maciez da roupa e realce do brilho das cores.

DEQB



Para um enzima ser usado num detergente deve satisfazer alguns requisitos:

- Actividade e estabilidade adequadas para valores de pH alcalinos e manter-

se activo e estável numa gama de temperaturas bastante alargada (entre 10 a 60°C).

- Na formulação de detergentes para uso doméstico, o objectivo é desenvolver enzimas eficientes a baixas temperaturas.

- Adicionalmente, um enzima deve ser resistente à hidrólise e oxidação por

outras substâncias existentes nos detergentes, nomeadamente, proteases.

- A utilização de técnicas de engenharia genética veio permitir o “design” e

desenvolvimento de enzimas com as características desejadas em termos de

actividade e estabilidade.

DEQB



INDÚSTRIA FARMACÊUTICA

- O desenvolvimento e utilização de enzimas em aplicações médicas é cada

vez maior, reflectindo o potencial destes catalisadores biológicos para

aplicações in vivo.

- Nas aplicações biomédicas de enzimas pode-se destacar a utilização, desde o século XIX, de uma mistura impura de enzimas do pâncreas de porco,

chamada pancreatina. Este enzima é administrado oralmente como ajudante

da digestão de pessoas deficientes nessas enzimas devido a desordens

genéticas, remoções cirúrgicas do pâncreas ou envelhecimento precoce.

- Outro exemplo é o da lipase de Rhizopus arrhizus, que mantém a sua

actividade no ambiente ácido do estômago.

DEQB



Muitos outros enzimas tem sido usados como agentes terapêuticos.

Tabela -1 — Enzimas como agentes terapêuticos.

DEQB



APLICAÇÕES ANALÍTICAS E DIAGNÓSTICO

- O maior mercado dos enzimas analíticos reside actualmente nos diagnósticos clínicos in vitro.

- Cerca de 50 enzimas são hoje em dia testados e utilizados neste domínio. Este

mercado representava cerca de 100 milhões de dólares americanos em 1997, com especial destaque para a fosfatase alcalina e peroxidase do rábano.

- A fosfatase alcalina era extraída da mucosa intestinal de bovinos mas passou, a ser produzida por fermentação com microrganismos geneticamente manipulados.

- Os enzimas para fins de diagnóstico, devem possuir elevado grau de pureza, implicando a utilização de processos de purificação complexos e dispendiosos.

DEQB



- Os biossensores têm sido muito utilizados principalmente em análises

clínicas à urina e ao sangue. Neste último caso, com aplicações in vivo ou in vitro como sejam a medição do pH, oxigénio, ião sódio, glucose, ureia, drogas, etc.

- Na área das análises clínicas, uma aplicação importante de enzimas em

diagnóstico clínico relaciona-se com o controlo da glucose em pacientes

com diabetes e, mais recentemente, do colesterol.

Tabela 1 — Áreas de aplicação de biossensores.

Aplicações industriais de enzimas

Enzimas como produtos finaisAplicações analíticasDetergentesLimpeza e higieneFarmacêuticaAlimentação animal e rações

Enzimas como aditivos do processoTêxtilPeles e curtumesPapel e pasta de papelAçúcarCafé


DEQB


Aplicações industriais de enzimas

Enzimas na produção de alimentos e bebidasLacticíniosCervejaVinícola e sumosÁlcoolProteínaCarnePanificaçãoÓleos e gorduras

Enzimas em processos de Biocatálise/BiotransformaçãoProcessamento do amidoAntibióticosQuímica fina


DEQB


Biocatalisadores Industriais

• O termo biocatalisador é usado para enzimas puros, misturas de enzimas, formulações de enzimas, enzimas impuros, fragmentos celulares e células na forma livre ou imobilizada.

• Hoje em dia, são poucos os casos em que se usam plantas e animais para isolar enzimas, a maior parte dos enzimas industriais são produzidos por microorganismos em cultura submersa, nos fermentadores.

• O preço de um dado enzima depende do tamanho do mercado, competitividade e do desempenho do enzima (produtividade). Além disso, dependendo do tipo de aplicação pois em alguns casos não é necessário usar enzimas muito puros.

• Os enzimas analíticos e farmacêuticos têm o mercado mais pequeno em peso, varia de 1 kg a 1 tonelada, no entanto, financeiramente o mercado é considerável. Por exemplo, o Factor VIII, um enzima trombolítico tem um mercado mundial de 1 kg mas que corresponde a 1 milhão de dólares.


DEQB


Biocatalisadores Industriais

• Os enzimas analíticos e farmacêuticos têm o mercado mais pequeno em peso, varia de 1 kg a 1 tonelada, no entanto, financeiramente o mercado éconsiderável. Por exemplo, o Factor VIII, um enzima trombolítico tem um mercado mundial de 1 kg mas que corresponde a 1 milhão de dólares.


DEQB



DEQB


Bulk enzyme

Analytical

PharmaceuticalSpeciality

Biocatalisadores na área dos xaropes de glucose e fructose (HFCS)

DEQB



• Os xaropes de glucose HFCS (contendo 55% fructose) são largamente utilizados na indústria alimentar principalmente pela Coca- e Pepsi-Cola e outros refrigerantes.

• A fructose é mais adoçante do que a glucose e não acarreta os graves problemas associado á diabetes como os verificados com a glucose.

• Como não é possível a isomerização química destes açúcares e, por outro lado, não há outras fontes de fructose ainda economicamente disponíveis como seja a hidrólise da inulina, a descoberta de um processo enzimático de isomerizaçãodestes açúcares teve enorme impacto industrial na década de 60.

• Este processo baseia-se na utilização de células com elevada actividade (teor) ou de enzima imobilizado, a glucose isomerase e mais quando se verificou que este enzima não precisava de nenhum co-factor para realizar a isomerização.

DEQB



DEQB


Biocatalisadores na área dos adoçantes como o aspartame

DEQB


• O aspartame tem cerca de 200 vezes mais poder adoçante do que a sacarose muito usado em refrigerantes e outras bebidas.

• O aspartame tem um mercado de ~$1 B US do qual 75% do mercado é controlado pela Nutrasweet devido a protecção da patente de síntese por via química.

• Recentemente foram estabelecidos métodos de síntese por via biocatalitica e hoje em dia já produz e representa cerca de ~ 25% do mercado.

• O enzima que sintetisa o aspartame (asp-phe-methyl ester) é um processo enantio-selectivo que só reage entre o L-phe-oMe e não o D-phe-oMe o que permite a utilização de percursores (substratos) mais baratos pois o processo químico tem forçosamente de utilizar o L-phenylalanine-o-me previamente purificado por resolução racémica.

• Este enzima é regioselectivo e não reage com o grupo β-carbóxico do ácido aspártico e também não apresenta actividade de esterase e, por isso, não hidrolisa o éster pelo grupo metil o qual é essencial para o poder adoçante no grupo phe-o-me.

• Por outro lado, o este enzima não é facilmente desactivado pelo solvente orgânico ou termicamente o que permite que a reacção ocorra em solvente orgânico onde estes reagentes e produtos são mais solúveis.

Biocatalisadores na área dos adoçantes como o aspartame

DEQB


Biocatalisadores na área dos antibióticos penicilânicos semi-sintéticos

DEQB


DEQB


• O penicilina G foi descoberta por Fleming em 1932 e foi o primeiro antibiótico a ser usado de forma generalizada e já com grande importância terapêutica na 2ª Guerra Mundial.


“Graças à Penicilina... Voltaremos a Casa!”

DEQB


• Contudo, as penicilinas G e V produzidas com elevados rendimentos em cultura submersa, em fermentadores industriais de 50 – 100m3, começaram a mostrar uma ineficiência crescente para muitos microorganismos devido a resistência natural (β- lactamase) ou adquiriram tolerância por mutação genética.

• Por outro lado, a penicilina G e V só podiam ser administrados por via intravenosa devido à sua nula ou baixa estabilidade à acidez do estômago quando administrados por via oral.



DEQB


DEQB


• Contudo verificou-se que estas desvantagens eram parcial minimizadas com novos antibióticos quando os grupos fenilacetil ou fenóxiacetil foram removidos e substituídos por outros grupos funcionais, por exemplo, a fenilglicina ou a p-hidróxifenilglicina do qual resultou a ampicilina ou a amoxicilina.

• Estes novos antibióticos semi-sintécticos foram originalmente produzidos por via química e introduzidos no mercado pela Bayer em 1961.


Biocatalisadores na produção do 6-APA

DEQB


• O núcleo 6-APA (ácido 6-aminopenicilânico) obtidos da hidrólise da penicilina G ou V passou a ter uma grande procura e importância na área dos antibióticos β-lactâmicos.

• Inicialmente a hidrólise da penicilina era por via química usando condições de temperatura muito -20ºC, agentes químicos muito tóxicos para proteger os grupos funcionais e solventes orgânicos para realizar estas reacções.

• No final da década de 60 e início de 70 começou a explorar com enorme um enzima entretanto descoberto, a penicilina acilase (PGA), para levar a cabo esta hidrólise.

Hidrólise da Penicilina com biocatalisador em suspensãoDEQB


Suportes e métodos de imobilizaçãoDEQB






Imobilização de penicilina acilase(PGA) de E. coli industrial DEQB


Estabilidade operacional da PGADEQB


Estabilidade operacional da PGADEQB


Hidrólise Penicilina com biocatalisador em reactor de cestoDEQB


Antibióticos β-lactâmicos semi-sintéticosDEQB


Antibióticos β-lactâmicos semi-sintéticosDEQB


Biocatálise combinatorial nosantibióticos β-lactâmicosDEQB


Monitorização da glucose no sangue

Tabela : Crescimento global dos Diabetes

1.121.161.18Racio Mulher/Homem

17.123.825.2% nos países desenvolvidos

300154135População com Diabetes(milhões)

2025 2000 1995Estatisticas

Source: World Health Organisation

DEQB


Composto I(Fe4+=O, Porp•+)

Composto II(Fe4+=O, Porp)

Peroxidase

(Fe3+)

H2O

H2O2�AH +

H2O

GlucoseO2

Ácido glucónico

FAD

FADH2

Glucose Oxidase

AnAnáálise do lise do PerPeróóxidoxido de hidrogde hidrogéénionio

ReacReacçção de oxidaão de oxidaçção ão

da da glucoseglucoseAH2

�AH

AH2

Reacções catalíticas multi-enzimáticas

Análise directa do H2O2 e indirecta da glucose

DEQB


Fenol

Fenol

4 H2O++2 H2O2

NN

CH3

OCH3

NH2

OHHRP

+

O

NN

CH3

OCH3

N

Peróxido Fenol 4-AAP Quinoneimina (red dye)

Reacção de condensação 4-AAP/Fenol ou Reacção de Trinder

Reacção colorimétrica de redução do

H2O2 com a HRPDEQB


Conceito e aplicações de Tiras Teste “Test strip”

Tiras teste

Passo 1. Aplicação da amostra de sangue

Passo 2. Separação eritrócitos e filtração do soro

Passo 3. Reacção enzimática e formação do corante

DEQB


Composto I(Fe4+=O, Porp•+)

Composto II(Fe4+=O, Porp)

Peroxidase

(Fe3+)

H2O

H2O2 H2O

2H+

Glucose

O2

Ácidoglucónico

FAD

FADH2

Glucose Oxidase

Transferência directa de

electrões

Elé

ctro

do

Sensor de Sensor de PerPeróóxidoxido

Glucose SensorGlucose Sensor

e-

e-

Eap

pl<

0.6

V(v

ersu

sS

CE

)

Biossensores amperométricos de 3ª geração

DEQB


H2O

H2O2

Glucose

O2

Ácidoglucónico

FAD

FADH2

Glucose Oxidase

Glucose SensorGlucose Sensor

Elé

ctro

do

e-

Eap

pl<

0.6

V(v

ersu

sS

CE

)

Biossensores amperométricos de 2ª geração

DEQB


Compostos redox no

transporte dos

electrões

Figura : YSI 23A Enzyme electrode for glucose

Monitorização da glucose no sangue – case study

Figura : Productos originais da MediSense


Figura: FreeStyle Meter - três passos para a monitorização do sangue.

Inserção Tira Teste PicadaSaturação com gota de

sangue da membrana sobreo detector


DEQB


Figura: Accu-Chek analisador de glucose no dedo.


DEQB


Figure : Precision Xtraanalisador de Glucose e cetonas devido ao risco cada vez maior dos doentes com diabetes novas doenças resultantes de acumulação de cetonas no sangue que podem provocar coma ou morte (“diabetic ketoacidosis” - DKA).


DEQB


Tabela : Alguns acontecimentos na história do desenvolvimento commercial de Biossensor de Glucose no sangue

DATA ACONTECIMENTO 1916 Publicação da primeira imobilização de proteínas: adsorção da

invertase em carvão activado 1922 Primeiro eléctrodo de pH de vidro 1956 Invenção do eléctrodo de oxigénio 1962 Primeira descrição de um biosensor: um eléctrodo enzimático

amperométrico de glucose 1973-75 Primeiro biosensor commercial:

Yellow Springs Instruments biosensor de glucose 1976 Primeiro pancreas artificial (Miles) 1982 Primeira fibra óptica-utilizada num biosensor de glucose 1984 Primeiro biosensor amperométrico de glucose com mediadores:

ferroceno com glucose oxidase imobilizada para detecção de glucose 1987 Lançamento do biossensor de glucose no sangue: MediSense ExacTech 1992 Lançamento do analizador portátil de sangue: i-STAT 1996 Lançamento do Glucocard 1996 Abbott adquire a MediSense por 867 milhões USD 1998 Lançamento do biosensor de glucose no sangue: LifeScan FastTake 1998 Fusaõ da Roche e Boehringer Mannheim para formar Roche

Diagnostics 2001 LifeScan adquire o negócio de testes de glucose da Inverness Medical

por 1.3 bilhões de USD 2003 i-STAT é adquired pela Abbott por 392 milhões USD 2004 Abbott adquire TheraSense por 1.2 bilhões USD


DEQB

Figura: MiniMed analisador de glucose para implante corporal.


DEQB


Figura: Micro-agulha de silício desenvolvida num sensor de glucosepara implante corporal .


DEQB


Aplicações de sistemas de células em biotransformação convencional

Tratamento de águas residuaisOclusão em polímeros de polietileno glicol

Bactérias nitrificantes

Tratamento de águas residuaisOclusão em alginatoCianobactérias

Produção de cervejaAdsorção em cerâmica porosaSaccharomyces cerevisiae

Produção de ciclodextrinasOclusão em poliuretanosBacillus circulans

Conversão de ácido fumárico a ácido L-málico

Oclusão em k-carragéneoBrevibacterium flavum

Hidrólise de sacaroseAdsorçãoSaccharomyces cerevisiae

Produção de ácido L-aspártico a partir de ácido fumárico e amónia

Oclusão em poliacrilamida ou em

k-carragéneo

Escherichia coli

Hidroxilação 11b de cortexolonaOclusão em poliacrilamida ou

alginato de cálcio

Curvularia lunata

Desidrogenação D1 de cortisol a prednisolona

Oclusão em alginato de cálcioArthrobacter simplex

Conversão de acrilotinitrilo a acrilamida

Oclusão em poliacrilamidaRhodococcus rhodochrus J1

Células

Sistema reaccionalMétodo de imobilizaçãoBiocatalisador

DEQB


Aplicações de sistemas de enzimas em biocatálise convencional

Produção de 7-ACA (1 passo reaccional)

Cefalosporina c amidase

Produção de 7-ACA (2 passos reaccionais)

Adsorção em resinas de permuta iónica à base de estireno

D-amino ácido oxidase7-ACA amidase

Remoção ou eliminação de ureia de bebidas alcoólicas

Oclusão em alginato e k-

carragéneo,

Urease

Hidrólise de lactose no leiteResina de permuta iónica àbase de polímeros de fenol formaldeído, fibras de triacetatode celulose

b-galactosidase

Produção de L-amino ácidos, resolução de misturas racémicas de amino ácidos

Oclusão em gel de

poliacrilamida, Adsorção iónicaDEAE-Sephadex

Amino acilase

Isomerização de glucose em frutose

Adsorção em resinas de permuta iónica

Glucose isomerase

Hidrólise da penicilina em 6-APA

Reticulação glutaraldeído, ligação covalente a suportes orgânicos sintéticos, oclusão em fibras de poliacrilonitrilo(PAN), fibras de triacetato decelulose

Penicilina acilase

Enzimas

Sistema reaccionalMétodo de imobilizaçãoBiocatalisador

DEQB


Exemplos de processos industriais em biocatálise não convencional

MeadAcetato de etiloPeroxidase do rábanoPolimerização de fenol

Energy BiosystemsÓleo(substrato)

Rhodococcus sp.Dessulfurização

UpjonhToluenoArthrobacter simplexDesidrogenação de esteróides

Bayer Sumitomo, Chemie Linz AG; BASF; Schering Plough

Vários

Subtilisina(imobilizada)Lipase

Hidrólise de ésteres

Nippon Miningn-hexadecanoNoccardia corallinaEpoxidação 1-octeno

CompanhiaSolventeBiocatalisadorReacção

DEQB


Compostos produzidos por biocatálise em escala industrial

LiaseL-DOPAL-Tirosina

D-Amidase e L-amidaseD-alanina e L-alaninaAlaninamida

Streptomyces carbophilusPravastatinaMevastatina

Desidratase, Achromobacterxylosoxidans

L-carnitinaCrotonobetaina

LipasesR-amidas, S-aminas, álcoois enantiomericamente puros

Misturas racémicas de aminasou de álcoois

NitrilaseÁcido R-mandélicoMandelonitrilo

Compostos quirais

HidrataseNicotinamida3-Cianopiridina

Achromobacter xylosoxidansÁcido 6-OH-nicotinicoNiacina

Compostos N-heterocíclicos

Penicilina acilasesÁcido 6-aminopenicilânicoPenicilinas (G ou V)

TripsinaOligolisinaL-lisina

TermolisinaAspartameÁcido L-aspártico/Éster metílico de fenilalanina

Amónia liaseÁcido L-aspárticoÁcido fumárico

Amino-ácidos, péptidos, penicilinas

BiocatalisadorProdutoSubstratoDEQB


Arthrobacter simplexPrednisonaCortisona

Arthrobacter simplexPrednisolonaCortisol

Rhizopus arrhizus11a-OH-progesteronaProgesterona

Mycobacterium sp.Androstadiona, androstadienodiona, 9a-OH-

androstadiona

Sitosterol, colesterol

Esteróides

LipaseÁcidos gordosTriglicéridos

Penicillium roquefortiCetonas metiladasÁcidos gordos

Ácidos gordos e derivados

Acetobacter sp.L-sorboseD-Sorbitol

Ciclodextrina-glucosiltransferase

CiclodextrinasAmilose

Glucose isomereaseFrutoseGlucose

Amiloglucosidase + pululanaseGlucoseDextrinas

a-AmilaseDextrinasAmido

Hidratos de carbono

BiocatalisadorProdutoSubstrato

Compostos produzidos por biocatálise em escala industrial (cont)

DEQB


Documents

Luis P. Fonseca - Autenticação · Panificação Óleos e gorduras Enzimas em processos de Biocatálise/Biotransformação Processamento do amido Antibióticos Química fina Lição