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Melhoramento de Plantas e Indução de mutações
MUTAÇÕES INDUZIDAS
Definição: mutação provocada por incorporação de análogos de bases (Ex: 5-bromouracil ou 2-aminopurina), agentes físicos (Ex: luz U.V. e outros tipos de radiações) ou químicos (EMS, EES, Azida sódica...) em laboratório ou no ambiente, elevando as taxas de mutação em relação àquela esperada espontaneamente.
Princípios
- As mutações ocorrem ao acaso;- A mutação é um evento unicelular;- A maioria das mutações são deletérias;
Usos de mutações no melhoramento de plantas
1. Usos de mutações pontuais a) Espécies autógamas
- Mutação direta em variedades melhoradas;
- Cruzamentos:- mutantes com variedade original;- entre mutantes diferentes, de mesma variedade;- entre mutantes diferentes, originados de variedades diferentes;- mutantes com variedade diferente da original;- entre duas variedades carregando aparentemente a mesma mutação;
1. Usos de mutações pontuais (continuação)
b) Espécies alógamas
- Indução de mutações para aumento de variabilidade;- Indução de mutações em linhagens endogâmicas;
c) Indução de macho-esterilidade (autógamas e alógamas)
d) Plantas de propagação assexuada
- Indução de mutantes para uso direto (clonagem);
2. Usos de mutações cromossômicas e genômicas
a) Uso de translocações visando a transferência de características entre espécies ou gêneros;
b) Quebra de ligações genéticas;
c) Diploidização em híbridos inférteis;
d) Poliploidização;
3. Usos para resolver problemas especiais
a) Uso para a produção de plantas haplóides;
b) Uso para a produção de sexualidade transitória em plantas apomíticas;
c) Uso para reduzir a incompatibilidade em cruzamentos distantes;
d) Uso para estudos especiais de genética, fisiologia, morfologia, biologia molecular (genômica funcional) e processos bioquímicos, em plantas;
MUTAGÊNESE INDUZIDA
Usos práticos (resumo)
Correção de defeitos (em variedades elite);
Limitações de variabilidade genética;
Indução de mutações em plantas estéreis;
Indução de mutações em plantas com dificuldades ou desvantagens na realização de cruzamentos;
MUTAGÊNICOS
MUTAGÊNICOS FÍSICOS
Radiações ionizantes e não-ionizantes
1. Ionizantes: a energia da radiação produz ionizações
a) Radiações Eletromagnéticas Raios-gama, X, nêutronsb) Partículas: Alfa, beta, prótons e dêuterons
2. Não-ionizantes: a energia da radiação produz excitação
a) Luz U.V. (é uma radiação eletromagnética, mas não ionizante)
Tipos de radiação
Fonte Descrição Energia Perigos Proteção necessária
Penetração em tecidos
Raios-X Aparelho raios-X
Radiação Eletromagnética
50 a 300 kV
Perigosa penetrante
Poucos mm de chumbo
Poucos mm até vários cm
Raios-gama Radioisótopos ou Reatores nucleares
Radiação Eletromagnética
Acima vários MeV
Perigosa muito penetrante
Muitos cm de chumbo ou concreto de Alta densid.
vários cm
Nêutrons (rápidos, lentos e térmicos)
Reatores nucleares ou aceleradores
Párticula não-carregada (ligeiram. + pesada que o próton)
menos 1 eV até vários MeV
Muito perigosa
Proteção fina de concreto
Poucos mm até vários cm
Partículas Beta
Radioisótopos ou aceleradores
Elétron (+ ou -) ionizado, muito menos denso que partic. Alfa
Acima vários eV
Pode ser perigosa
proteção grossa de papel
Até vários mm
1 eV = 1,602 x 10-12 erg
Tipos de radiação
Fonte Descrição Energia Perigos Proteção necessária
Penetração em tecidos
Partículas Alfa Radioisótopos
Núcleo do He ionizado muito pesadamente
2 a 9 MeV Muito perigosa internamente
proteção fina de papel
Poucos mm
Prótons e Dêuterons
Reatores nucleares ou aceleradores
Núcleo do H Acima de vários GeV
Muito perigosa
Muitos cm de água ou parafina
até vários cm
Luz Ultra violeta
Lâmpadas UV.
Radiação eletromagnética
Poucos eV Menos perigosa pouco penetrante
proteção grossa de papel
Fração de mm
Dêuteron = Núcleo do deutério (2H - Hidrogênio pesado, isótopo estável do H), contêm 1 próton e 1 nêutron
RADIAÇÃO- X
Comprimento de onda de 0,001 a 10 nm, de acordo com a voltagem de pico (kVp)
Obtenção: elétrons são acelerados no vácuo e parados por alvo de Tungstênio ou Molibdênio: A desaceleração é acompanhada de emissão de radiação.
Tipos:Hard: Maior pico de voltagem do equipamento, menor comprimento de onda, maior penetração, menor poder ionizante = parecido com os raios-gama usado para radioterapia
Soft: maior comprimento de onda; usado para exames
RADIAÇÃO- X
Vantagens:
- Mais facilmente disponíveis;- Fácil manipulação, mais baratos;- Menores cuidados de vigilância e contaminação;
Desvantagens:
- Menor homogeneidade (maior variação na energia);- Dificuldade de uso para tratamentos prolongados;- Limitação do tamanho do material a ser tratado;
RADIAÇÃO- GAMA
Raios-gama apresentam menor comprimento de onda e maior energia por fóton (em comparação com os raios-X);
Raios gama monoenergéticos são obtidos por radioisótopos
60Co - meia vida de 5,3 anos (metal)
137Cs - meia vida de 30 anos ( cloreto ou sulfato)
Vantagens: - Tratamentos prolongados;- Diferentes tipos e partes de plantas;- Usos em casa de irradiação, casa de vegetação e campo;
NÊUTRONS
Obtenção: reatores nucleares (pela fissão nuclear do Urânio 235) ou em aceleradores de partículas;
Classificação de acordo com a energia:
-Nêutrons rápidos: (maior energia);
- Nêutrons térmicos: (energia é reduzida por moderadores de C ou H);
LUZ ULTRA VIOLETA
- Obtenção: lâmpadas de U.V.
- O efeito biológico varia com o comprimento de onda.
- Usar luz com comprimento de onda na faixa de 2.500 e 2.900 nm: região de máxima absorção de luz pelos ácidos nucléicos;
Uso limitado: - baixa penetrabilidade em tecidos – associação com cultura de tecidos;- maior uso para bactérias e microorganismos;- uso em grãos de pólen;
UNIDADES DE RADIAÇÃO
Dose absorvida : Rad e Gray (Gy)
Rad: quantidade de energia absorvida por massa de matéria irradiada
100 rad; 500 rad, 1 Krad etc...
1Gy = 100 rad logo 1 Krad = 10 Gy
UNIDADES DE RADIAÇÃO
Dose emitida: Roentgen (R)
R: medida indireta: número de íons produzidos no ar por uma radiação ionizante;
100 R; 500 R, 1 KR, etc...
Para finalidades práticas: 1 R = 1 Rad
EQUIPAMENTOS
Fontes de raios-gama
- Fonte Gamma Cell;- Fonte de sala;- Fonte de casa de vegetação;- Fonte Gamma field;- Fonte de piscina (Urânio 235);
Aparelho de raios-X
Fonte de raios-gama (Gamma Cell)
Fonte de raios-gama (câmara de irradiação)
Fonte de raios-gama (Gamma Field)
Fonte de piscina
MUTAGÊNICOS QUÍMICOS
Grupos principais (Manual on Mut. Breed., 1977)
1. Bases análogas [Exs: 5- Bromo-uracil (BU), 5-bromo-deoxiuridina (BUdR), 8-ethoxi-cafeína (EOC), Hidrazida maleica (MH),...]
2. Antibióticos (Exs: azaserina, mitomicina C, estreptonigrina, actinomicina D)
3. Agentes alquilantes (Exs: gás mostarda, EMS, MMS, MNU, ...)
4. Azida sódica (NaN3)
MUTAGÊNICOS QUÍMICOS
Grupos principais (Manual on Mut. Breed., 1977)
5. Hidroxilamina (NH2OH)
6. Ácido nitroso (HNO2)
7. Acridinas (C13H9N) – agente intercalante de DNA e RNA
Mutagênico Natureza Densidade (g/ml)
Solubilidade em água
Peso molecular
(g/mol)
EMS Liq. Incolor 1,203 8% 124
EI Liq. Incolor 0,832 qq. proporção 43
DES Liq. Incolor 1,177 qq. proporção 154
Azida Sólido branco
1,846 qq. proporção 65
Propriedades físicas e químicas de alguns mutagênicos químicos (IAEA, 1977)
Cálculo
Tratamento 500 ml de solução 0,03 M de EMS
Qual o volume de EMS ???
Cálculo
Tratamento 500 ml de solução 0,03 M de EMS
Qual o volume de EMS ???
PM = 124 g/mol 0,03 M = 3,72 g em 1 Ld = 1,203 g/ml = 1,86 g em 500 ml
1,203 g - 1 ml 1,86 g - x ml
x = 1,546 ml
Temperatura (oC) DES (h) EMS (h)
40 0,32 7,92
30 1,00 25,9
20 3,34 93,1
10 13,1 378
0 27,6 796
Meia-vida* (em horas) de DES e EMS em várias temperaturas (IAEA, 1977)
* Meia-vida: Tempo na qual metade da concentração do mutagênico reagiu com a água para formar ácido e álcool.
Mutagênico Químico
Mutagênico Químico
EFEITOS DOS MUTAGÊNICOS
EFEITOS FISIOLÓGICOS (M1; V1M1)
EFEITOS GENÉTICOS (M2; M3… V2M1; V3M1…)
Redução:Redução: Taxa de germinação Sobrevivência Altura de planta Número de brotos
Mutações gênicasMutações cromossômicas
Aumento: Esterilidade
ImportânciaImportância Seleção de doses: LD 30 – 50 GR 30 – 50
- Já está mais que comprovada a existência de alta correlação entre efeitos fisiológicos (geração M1 ou M1V1) e frequência de mutações nas gerações sucessivas M2, M3 e etc... ( ou M1V2, M1 V3...).
-Sendo assim, os testes de sensibilidade aos mutagênicos auxiliam reduzindo o tempo para a execução dos experimentos de indução de mutações em plantas.
MATERIAIS E MÉTODOS DE TRATAMENTO
- Todas as partes das plantas podem ser tratadas com mutagênicos;
- Propágulos apresentam diferenças na sensibilidade;
- Exemplos:
Sementes de feijão - aproximadam. - 250 GyGrão de pólen - aproximadam. - 1.000 GyExplantes in vitro - aproximadam. - 10 Gy
QUAIS PARTES DA PLANTA DEVEM SER TRATADOS COM MUTAGÊNICO ??
Resp. Depende dos objetivos do trabalho e do método de propagação da planta
a) Irradiação de plantas inteirasPlantas grandes – Campos de irradiação Gamma field Plantas pequenas – Câmara de irradiação
b) Sementes - material favorito Vantagens: - manuseio mais simples; - grande número de indivíduos em pouco espaço;- possível modificar as condições ambientais;- fácil de ser enviado a longas distâncias;- luz UV. pouco efeito, devido a baixa penetrabilidade;
c) Grãos de Pólen (óvulos também)Vantagens: evitam quimerismo;
menor volume;possível usar luz UV. (pólen);
Desvantagens: dificuldades de obtenção; viabilidade decai rapidamente;
d) Propágulos de PPV. Estolões, gemas axilares, bulbos, cormos, borbulhas, folhas...
e) Explantes (Cultura de células e de tecidos) Meristemas, calos, células em suspensão, folhas, protoplastos...
Vantagem: Possível usar luz UV. e mutagênicos químicos
Uso de grãos de pólen na mutagênese induzida
A
AA
A
AA
A A
AA
a
Aa
A
Gametas não irradiados (somente A)
X
Geração M 1 Genótipo AA(sem mutação)
Geração M 2 Genótipo AA(sem mutação)
Genótipos AA ou Aa (sem quimerismo)
Genótipos AA, Aa ou aa
Gametas irradiados (A ou a)
MutagênicoMutaçãorecessiva
Uso de grãos de pólen na mutagênese induzida
Gametas não irradiados (somente a)
X
Geração M 1 Genótipo aa(sem mutação)
Geração M 2 Genótipo aa(sem mutação)
Genótipos Aa ou aa (sem quimerismo)
Genótipos AA, Aa ou aa
Gametas irradiados (A ou a)
Mutagênicoa
aa
aa
a
aa
aa
aa
a
A Mutaçãodominante
mutagênese induzida em organismos diplóides
AA
(quimerismo)
Produção de Gametas A e a
AA
AAAA
AAAA
Geração M 0
Mutagênico
AA
AA
AAAa
AAAa
Geração M 1
(segregação)A partir daGeração M 2 aaAA Aa
mutagênese induzida em organismos diplóides
aa
(quimerismo)
Produção de Gametas A e a
aa
aaaa
aaaa
Geração M 0
Mutagênico
aa
aa
aaAa
aaaa
Geração M 1
(segregação)A partir daGeração M 2 aaAA Aa
Cálculo da frequência de mutantes
-Vários métodos : usa-se mais frequentemente a % de mutantes em 100 (ou 1.000) plantas da geração M2
-Mutantes em geral ou mutantes de clorofila
Cálculo da frequência de mutações
- usa-se mais frequentemente a % de mutações de uma dada característica em 100 (ou 1.000) plantas da geração M2
MUTANT DATABASE - IAEA
http://mvgs.iaea.org/AboutMutantVarieties.aspx
http://mvgs.iaea.org/AboutMutantVarieties.aspx