PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE

CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA EM

DEAE -CELULOSE

• Os assuntos abordados nessa aula são:

- Dosagem de proteínas

- Métodos cromatográficos para separação de

proteinas e para a separação de imunoglobulinas

unespProf. Helio José Montassier

Métodos de Isolamento de Biomoléculas

O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede

os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D

e a compreensão de suas propriedades biológicas.

Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou

seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína

individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais

eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.

Métodos de

purificação

1 proteína

isolada

Proteínas de uma célula

Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:

1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração)

2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)

3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)

Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas

moléculas:

4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que

interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)

Métodos de Isolamento de Biomoléculas

Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas.

Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo

de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas

tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.

Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:

Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar

separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?

Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração:

separação de moléculas pela massa molecular

géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros

Cromatografia de troca iônica:

separação de moléculas pela carga elétrica

géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente

Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):

separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso

géis possuem carácter hidrofóbico

Cromatografia de afinidade:

separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante

géis possuem ligante específico ligado covalente à resina

Método de Dosagem de Proteínas das Frações

Gama-Globulinas Precipitadas com Sulfato de

Amônio.

Método de BRADFORD

Cromatografia de Troca Iônica em

DEAE-Celulose para Purificação de

IgG Bovina

2.- Método para preparação da coluna deDEAE–celulose para a

separação de Ig G

2.1.- Materiais

2.1.1- DEAE – celulose previamente embebido e carregado por tratamento

com soluções de ácido (HCl) em seguida álcali (NaOH).

2.1.2- Fração gamaglobulina previamente precipitada com sulfato de

amônio e dialisada com o mesmo tampão de eluição a ser usado na coluna

de DEAE – celulose. A concentração protéica dessa coluna deve ser

previamente determinada.

2.1.3.- Coluna cromatográfica pequena (seringa de 10ml) já montada e

preparada para ser preenchida com DEAE-celulose e acompanhada de

cânulas de pequenas pinças para regulagem do fluxo da coluna.

2.1.4.- Tampão fosfato 0,01M pH 8,0.

2.1.5.- Frascos pequenos de coleta (frascos do tipo penicilina), rotulados

com a numeração de 1 a 15.

2.2.- Método

2.2.1.- Deixe o volume de tampão imediatamente acima da coluna abaixar

abrindo cuidadosamente a coluna, e aproveite para regular o fluxo da coluna

para 12 gotas por minuto. Quando não houver mais tampão acima da resina e

com a coluna fechada, deve ser adicionada a solução de gama globulina, com

muito cuidado e com o auxílio da micropipeta. Em seguida, abrir vagarosamente

a coluna para deixar a solução de gama globulina entrar na resina, fechando a

coluna quando isso ocorrer. Adicionar, a seguir, com muito cuidado, um volume

de tampão de eluição. Conectar com o frasco de tampão com cânula e sifonado

de modo a permitir um fluxo continuado de tampão para a coluna de resina. Abrir

o fluxo da coluna, começar a colher as frações de 3 ml cada uma, aferindo o

fluxo novamente para 12 gotas por minuto.

2.2.2.- Testar de cada fração colhida, por coloração rápida e com reativo

apropriado em uma microplaca, a presença de proteína, misturando-se l da

fração com l do reativo.

2.2.3.- Faça a leitura das frações colhidas em espectrofotômetro UV, no

comprimento de onda de 280nm, contra um branco de tampão fosfato 0,005M

pH 8,0.

2.2.4.- Faça um pool das frações com maior concentração proteíca e armazene

a -20ºC para ser testada na próxima aula, por imunoeletroforese.

Gama-Globulina

3ml

12 gotas/min

Assunto 04- figura 01

Co

nce

ntr

açã

o

Tempo ou volume

Coletor de

frações

Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica

Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou

matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão),

banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas.

Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:

Tempo 1

Mais tampão é

colocado na

coluna,

forçando os

componentes

da amostra a

interagirem

com a resina

Componentes da

amostra se

separam e saem

da coluna com

diferentes

volumes de

tampão

Tempo 2 Tempo n

Líquido

que sae

da coluna

é

recolhido

em tubos

de um

coletor de

frações

Os componentes da mistura são

separados por interação diferenciada

com a resina, com base em

propriedades moleculares como:

• massa molecular

• carga elétrica

• solubilidade

• afinidade

Amostra com

diferentes

componentes

Resina

embebida

em

tampão

Tempo zero

Um cromatograma, como o

gráfico ao lado, é a maneira

usual de se representar o

resultado de uma

cromatografia.

Cromatografia de troca iônica

A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou

negativa, em uma ampla faixa de pH.

Trocadora de ânions Trocadora de cátions

DEAE CM

Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva),

como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem

carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica

Adsorção

Eluição

++

+

+

++

+

+

Moléculas com a mesma carga,

ou sem carga, não interagem com a resina,

sendo as primeiras a sair da coluna

Adição de sal ao tampão resulta em

competição entre os íons em solução

e as moléculas adsorvidas na resina.

Na+Cl- +

A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas:

1) adsorção das proteínas com carga contrária à

resina, e saída da coluna das proteínas com a

mesma carga;

2) eluição das proteínas adsorvidas.

++

+

+

++

+

+

+

++

No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou

trocadora de ânions, como o DEAE-celulose):

Para a eluição, as condições de adsorção da coluna

(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a

interação entre as proteínas e a resina.

Mais frequentemente utiliza-se um aumento da

concentração do sal no tampão, pois alterações

de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a

precipitar dentro da coluna.

PIácido

+

básico

-neutro

-COOH -COO

-NH3

H+

+

-

H+

-NH2

Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica

O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico

das proteínas na amostra e das condições escolhidas de pH e de força iônica.

Proteína P.I.

Pepsina <1,0

Ovalbumina galinha 4,6

Albumina sérica humana 4,9

Tropomiosina 5,1

Insulina bovina 5,4

Fibrinogênio humano 5,8

Gama-globulina 6,6

Colágeno 6,6

Mioglobina equina 7,0

Hemoglobina humana 7,1

Ribonuclease A bovina 7,8

Citocromo C equino 10,6

Histona bovina 10,8

Lisozima, galinha 11,0

Salmina, salmão 12,1

Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas

Proteínas apresentam carga positiva quando em meio

ácido em relação ao seu PI, e carga negativa, quando em

meio alcalino em relação ao seu pI.

Nesse caso, a referência para se dizer que o meio é ácido

ou básico é o PI da proteína, e não o pH do meio.

A carga das proteínas varia em função do pH do meio, pois o

pH influencia o estado de dissociação das cadeias laterais dos

aminoácidos ácidos e básicos.

Carboximetil~celulose

(trocadora de cátions)Dietilaminoetil~celulose

(trocadora de ânions)

Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica

Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo

com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do

tampão de eluição.

As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas,

sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina).

_

=

=_

+

++++

(+)

(+)

(+)

(+)

0. 10 M

0. 15 M

0. 20 M

Eluição NaCl

Não retidas

DEAE++

0. 10 M

0. 15 M

0. 20 M

Eluição NaCl

+

(-)

(-)

(-)

+++

_ =

=

_(-)

Não retidas

CM

Tipos de Resina de troca Iônica

Tipos de Resina de troca Iônica

Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.

NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES

Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH2N+(CH3)3 Troca aniônica

resina de polistireno

Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO3-H Troca Catiônica

resina de polistireno

DEAE-celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas

- CH2CH2N+(C2H5)2 ácidas e neutras

CM-celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas

- CH2COOH básicas e neutras

DEAE -Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração

básico - CH2CH2N+(C2H5)2 e troca iônica de proteínas

ácidas e neutras

CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração

ácido - CH2COOH e troca iônica de proteínas

básicas e neutras

* Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio- Gel: Bio Rad Laboratories

Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular

grãos (beads) da

resina com poros grão da resina poroso

proteína grande

proteína pequena

Tampão

“empurra”

moléculas

através da

resina

tubos

Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes

volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os

canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o

percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída.

Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com

pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de

volume morto (Vo).

Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um

volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).

Moléculas com massas diferentes

Fluxo do tampão

Cromatografia de afinidade:

Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao

ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou

por competição com o ligante livre

Desprezar

proteínas não

retidas

Lavagem

Eluição

pH 2,0 ou sal

Antígeno A

puro

Anti-A

interage

apenas

com a

proteína A

-

Mistura de proteínas

Coluna

empacotada

com esse gel

Partículas de

gel recobertas

de anticorpos

anti-A

Adsorção

Complexo

Ag-AC é

desfeito

Um dos métodos mais

eficientes para a

purificação de proteínas,

possibilitando um alto

rendimento com número

reduzido de etapas.

A separação de

moléculas tem como

base a interação

específica do analito

(molécula-alvo) com um

ligante imobilizado na

matriz. Forças

envolvidas nessa

interação podem ser não

covalentes

(eletrostáticas,

hidrofóbica, pontes de H)

ou covalentes (p.e.,

ponte dissulfeto).

Ex: cromatografia de imunoafinidade

Ligante

grupo-específico

Especificidade

Proteína A Região Fc de IgG

Proteína G Região Fc de IgG

Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil-

Cibacron Blue Várias enzimas, albumina

lisina Plasminogênio, RNA ribossomal

arginina proteinases tipo tripsina

benzamidina proteinases tipo tripsina

calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina

heparina Fatores de coagulação, lipases,

hormônios, receptores estoróides, etc

Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos

de His expostos

1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo

- análogos de substratos ou inibidores de enzimas

- agonistas ou antagonistas de receptores

- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos

- ligantes com “tag” ou “marcação”

- glutationa-S-transferase

- poli-Histidina

2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:

Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade

8-AEA-cAMP

8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic

monophosphate

(ligante para proteínas com afinidade por cAMP

ou cGMP)

Sítios de ligação das proteínas

A, G e L à imunoglobulina, que

permitem a purificação de

anticorpos por cromatografia

de afinidade

Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento

estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade

ou impede sua ligação à resina.

A introdução de um braço espaçador (alguns C) diminue o risco.

Estratégias para acoplamento de ligantes à resina

Reagente Alvo no ligante

Braço espaçador covalente entre

a resina e o ligante

Ligação reversível não covalente

ligante

Molécula-alvo (analito)

Preparo da resina de afinidade:

Passo 1. Ativação da resina

Passo 2. Acoplar

o ligante