Normas e Rotinas Operacionais Do

NORMAS E ROTINAS OPERACIONAIS DOLABORATORIO DE NALISES CLNICAS

Setor de Coleta e RecepoProcedimento Operacionais Padres (POP)

1. CADASTRO E INFORMAES 1.1 Identificar o paciente

A chegar recepo do laboratrio, o paciente devera estar portanto requisio

medica com os exames solicitados pelo seu medico, a recepcionista ento ir

cadastra-lo, dando nfase ao nome, idade, sexo, endereo e/ou telefone. O cadastro

do paciente acompanha a identificao numrico controle do laboratrio.

1.2 Identificao de amostraCada cadastrado possui um numero de identificao, utilizando para etiquetas

os recipientes de coleta.

importante identificar sempre a parte lateral do frasco, e nunca a tampa,

principalmente em frascos de urina e fezes para evitar trocas de material.

1.3 Identificaes dos exames a serem realizados No laboratrio as amostras so registradas em fichas internas de seus

respectivos setores, nestas fichas constam a identificao numrica, o nome e a idade do paciente; em seguida as amostras e as fichas sero encaminhadas para os devidos setores.

1.4 Informaes ao paciente Na recepo do laboratrio o paciente ir receber as instrues de como deve

proceder para coleta das amostras. Para dosagem bioqumica o paciente orientado

sobre o perodo de jejum, sendo tambm necessrio o conhecimento dos

medicamentos que o paciente possivelmente esteja tomando.

Quando a coleta de sangue, orienta-se o paciente quanto ao esforo fisico, o

paciente deve vir ao laboratrio totalmente descansado para evitar qualquer alteraes

nos resultados de seus exames.

2 COLETA DE SANGUEO sangue colhido com o objetivo de estudar as freqncias alteraes dos seus

componentes quando o organismo acometido pr doenas. No laboratrio so

executados exames de vrios paciente ao mesmo tempo, torna-se imprescindvel que

uma sistematizao bem organizada de trabalho seja seguida, evitando-se os erros de

um modo geral, a perda de tempo e, especialmente, a troca dos resultados.

Cuidados tcnicos e de assepsia so tambm necessrios a fim de evitar a

contaminao do paciente, do operador e do sangue colhido. A coleta feita de

preferencia pela manha, com o paciente em jejum.

Muitos so os meios para obteno do sangue usado para o exame

hematolgico, como pr exemplo, sangue o veneno, capilar, arterial, puno da medula

ssea de ossos como o externo, tbia, ilaco e usado na maioria das vezes o venoso e o

capilar.

2.1 Sangue Venoso

A sua obteno feita pela funo das veias mais acessveis. As que so mais

facilmente funcionadas localizam-se nas regies do antebrao (veia mediana, ceflica e

baslica), do pescoo (jugulares internas e externas) e inguinais (femural). Na criana,

tambm se realiza na regio da fontanela frontal (seio longitudinal). A veia a preferida

nos exames rotineiros, pois apresenta freqentemente bom calibre e sua funo

pouco dolorosa. Antes da puno, avalia-se a orientao do vaso pela visualizao ou

pela palpao digital e fazer a agulha penetrar e aprofundar nessa direo.

2.2 Sangue capilar

freqente usado em crianas quando se empregam micrometodos ou em adultos

para alguns exames como estudos de plaquetas, citologia e citoquimica celular. A

coleta se faz aps puno da polpa digital dos dedos ou dos grandes artelho, na

criana. Pode-se ainda utilizar a regies laterais do calcanhar, nos recem nascidos.

3. RECEPO AO PACIENTE

O paciente recebido com cortesia e cordialidade; explicando os procedimentos aos

quais ele vai ser submetido, de modo a transmitir-lhe tranqilidade e segurana.

A coleta chama o paciente para a coleta de sangue, e de acordo com seu cadastro,

confirma o nome, a idade e os exames a sem realizados pelo paciente. A mesma

separa e identifica, na frente do paciente os tubos que sero utilizados para o material.

3.1 Condies para a coleta

Sala bem iluminada e ventilada;

Pia;

Cadeira reta com bracadeira regulvel ou maca;

Garrote;

Algodo hidrfilo;

lcool etlico a 70% ou lcool iodado a 1%;

Agulhas e lancetas descartveis;

Sistemas a vcuo: suporte, tubo e agulhas descartveis;

Tubo de ensaio com tampa;

Etiquetas para identificao de amostras;

Caneta;

Caixa descarpack;

Jaleco e mascara;

Luvas descartveis;

Estantes para tubos.

3.2 Identificao da amostraIdentificam-se os tubos para colocao da amostra. Escreva na etiqueta os dados do

paciente: nome, numero do registro, data da coleta.

3.3 Tecnica para Coleta de Amostra do Sangue Venoso

Coloca-se a agulha na seringa sem retirar a capa protetora. No tocando na

parte inferior da agulha;

Movimenta o embolo e pressione-o para retirar o ar;

Ajusta o garrote e escolha a veia;

Faz a anti-sepsia do local da coleta com algodo umedecido em lcool a 70%

ou lcool iodatdo a 1%. No tocando mais o local desinfetado;

Retira a capa da agulha e faz a puno;

Introduz a agulha na veia mediana, basilica ou ceflica, atingida a veia, aspira o

sangue;

Coleta-se aproximadamente 10 ml de sangue. Em crianas coleta 2 A 5 ML;

Retira o garote e em seguida a agulha;

Comprime o local puncionado com algodo embebido em lcool;

Retira a agulha da seringa e transfere o sangue para os tubos, quando for transferido para um tubo contendo anticoagulante. Agita suavemente para facilitar a

mistura do sangue como anticoagulante;

Ao transferir o sangue para um tubo de ensaio sem anticoagulante. Escorrer

delicadamente o sangue pela parede do tubo. Este procedimento evita a hemolise da

amostra. Descarta as agulhas e seringas nas caixas de descarpack;

Orienta o paciente a pressionar com algodo a parte puncionada, mantendo o

brao estendido, sem dobr-lo;

3.4Tecnica para coleta de amostra do sangue capilar Faz assepsia da poupa digital com lcool iodado.

Deixar secar.

Puncionar com lanceta ou agulha descartavel, desprezando-se a primeira gota

de sangue e absorvendo-a com papel de filtro ou algodo seco;

Sangue deve fluir espontaneamente, exercendo-se leve presso somente

quando necessrio;

Direciona o tubo de capilar na gota para que o sangue flua ps capilaridade;

Limpar o dedo com algodo e aplicar anti-sptico.

Anticoagulantes.

O sangue coletado com a proporo correta de Anticoagulantes utilizados.

EDTA; 1 a 2 mg para cada ml de sangue.

Heparina; 1 gota (5.000 U/ml) para cada ml de sangue.

Oxalato de K; 1 a 2 mg para cada ml de sangue.

Citrato de sdio; 0,5 ml para 4,5 ml de sangue.

3.6 Biossegurana na coleta Todo cuidado pouco na manipulao de materiais biolgicos, tais como soro,

sangue, secrees, fluidos orgnicos, tecidos, etc. Redobra-se as precaues, pois

esses materiais so potencialmente infectantes e muitas vezes esto contaminados

com agentes estiologicos diferentes do que se esta pesquisando, ou ainda

desconhecidos.

Usa-se sempre Equipamento de Proteo Individual (EPI): jaleco longo de

mangas compridas e punho retratil, luvas descartveis evita a formao e disperses

de aerossis so micro partculas solidas e liquidas com dimenses aproximadas entre

0,1 e 0,5 micra que podem, no caso de conter microorganismos, permanecer em

suspenso e plenamente viveis pr varias horas.

Jamais reencapa-se agulhas. Esse procedimento uma das principais causas

da contaminao de profissionais de sade por microorganismos, existentes no sangue

e em outros fluidos orgnicos, como por exemplo, o vrus da Hepatite B e o HIV. Aps a

coleta descartado esse material diretamente em caixas descarpack.

Reduz ao mximo o manuseio de resduos, em especial os pefurocortantes.

Descarta o rejeito perfurocortante diretamente em caixas descarpack.

4. EMISSAO DOS LAUDOS DOS EXAMES LABORATORIAISOs laudos esto disponveis no prazo acertado com o paciente, se por algum

motivo isto no for possvel, h uma justificativa e, sempre que possvel, o paciente

informado no mais curto prazo possvel.

Em caso de laudo que possa oferecer perigo iminente vida do paciente, o

laboratrio informa ao mdico assistente e/ou ao responsvel pelo paciente.

O laudo datado e assinado por profissional legalmente habilitado com o seu

nome completo e legvel, e o nmero do registro no conselho profissional.

4.1 Exames

Nome do exame;

Material utilizado;

Mtodo;

Intervalo de referencia com as respectivas unidades e valores de alerta;

Informaes necessrias interpretao dos resultados, quando indicada;

Concluses, quando indicadas.

EXAMES DE SANGUE

Acido urico

Capac. Total de lig. do ferro

Albumina

Cetonemia

Colesterol fracionado:

HDL

LDL

VLDL

Aldolase

Cloretos

Ferro colher pela amanh

Amilase

Creatinina

Triglicrides

Bilirrubinas

Eletroforese de protenas

Uria

Clcio

Fosfatase acida

Colesterol ( sem fracionamento)

Fosfatase alcalina

CPK total

Fsforo

CK MB

Frutosamina

Gama GT

Glicose

Hemoglobina glicosilada

Lipase

Potssio

Magnsio

Sdio

Mucoproteinas

Transaminases: TGO/AST; TGP/ALT

Velocidade de hemossedimentao (VHS)

Hemograma

Curva de fragilidade osmotica

Plaquetas

Tempo de protrombina

Tempo de tromboplastina parcial ativada PTTa

Reticulocitos

Eletroforese de hemoglobina

Pesquisa de drepancitos

Alfa 1 Glicoprotena acida

Fator reumatoide

Grupo sangneo e fator Rh

VDRL

Protenas C reativa

Anti HBs

Anticorpos antireoidianos:

- antireoglobulina

- antimicrossomal

Antiestreptolisina O

- Monoteste

- Paul Bunnell Davidsohn

- Epstein Baar (IFI ou ELISA)

- Anti VCA IgG e/ou IgM

Fan

HbeAg

Toxoplasmose IgG/IgM - ELISA - IFI HAI

HbsAg (Antigeno australia)

Chagas (T. Cruzii): - IFI HAI ELISA

HAV IgG/ IgM

Anti Hbe

Citomegalovrus IgG/IgM

HIV 1 e 2

EXAMES DE URINA ROTINA1) Entrega ao paciente um frasco etiquetado com o nmero de registro do mesmo.

2) Da as seguintes instrues ao paciente:

2.1 - Colher a primeira urina da manh2.2 - Antes de colher a urian, fazer um asseio com gua e sabo na genitlia

externa.

2.3 Desprezar as primeiras pores da urina e colher o restante no frasco coletor recebido do Labortorio.

2.4 - Trazer imediatamente para o Laboratorio dentro do laboratrio dentro do horrio previsto para recebimento de material ( 7:30 s 10:00 hs, manh ).

Obs: Paciente Os sexo feminino no devem colher urina no perodo menstrual.

3) - Paciente feminino no deve coletar a urina no dia em que fizer Exame de Contedo vaginal, pois a paciente dever estar sem asseio e para a coleta de urina

ter que assia-se antes.

EXAMES PARASITOLGICO FEZES1) Entrega ao paciente um frasco etiquetado com o numero de registro do

mesmo.

2) Colher o material e trazer para o Laboratorio no horrio estipulado

( 7:30 s 10:00 hs).

3) Se houver dificuldade de colher o material pela manha no dia do exame

marcado, pode colher na vspera e colocar na geladeira o frasco coletor.

EXAMES DE SECREO VAGINAL E SECREO URETRAL1) Se a paciente tambm tiver que realizar exame de URINA, o exame de

Secreo devera ser realizado no outro dia.

2) Para fazer exame de Secreo Vaginal a paciente deve vir ao

Laboratorio sem tomar banho ou sem realizar qualquer tipo de asseio.

3) No manter relao sexual 24 hs antes da realizao do exame,

abstinncia sexual de 24 hs.

5. ENTREGA DE RESULTADO1) Os exames de paciente particulares e SUS ficam no arquivo colocados

em ordem alfabtica.

2) Os exames de paciente atendidos pelo hospital so entregues ao mesmo

colocados no pronturio.

3) Observa-se o nome completo, idade do paciente.

4) Confere se o nome do paciente no exame com o nome que est na

requisio.

5) Retira-se o resultado e entrega ao paciente

6. EXAMES INCOMPLETOS

1) O exame s ser liberado quando o paciente trouxer o restante do material para complementar os tipos de exames que constam da requisio mdica.

2) Solicitamos ao paciente que traga no mximo ate 48 hs. Aps as analises efetuadas, o exame liberado normalmente.

Setor de Lavagem e EsterilizaoPROCEDIMENTO OPERACIONAIS PADRES (POP)A importancia de uma boa descontaminao de materiais (ESTERILIZAO) pea imprescindvel para um melhor desempenho dos trabalhos a serem executados em um

laboratrio de analises clinicas. O processo de esterilizao o comeo de tudo, sem a

mesma os resultados no sero satisfatorios. Faremos uma descrio dos mtodos que

so utilizados para a esetrilizao dos materiais do laboratorio.

1 OBJETIVOS1.1 Gerais

Tomar conhecimento dos cuidados na manipulao de materiais contaminados.

Devemos tambem ter o conhecimeto de lavagem, secagem empacotamento e

esterilizao de materiais reaproveitaveis.

1.2 Especificos Uns dos objetivos mais importantes, o conhecimento de como se deve usar as

maquinas, como: AUTOCLAVE, ESTUFA DE SECAGEM E ESTERILIZAO E TAMBM O DEIONIZADOR.

2. EQUIPAMENTO BSICOS

Autoclave

Estufa de secagem

Estufa de esterilizao

Deionizador

OBS: H de se destacar tambm os materiais usados no processo de lavagem. So estes:

Sabao

Hipoclorito 1%

3 METODO PARA ESTERILIZAR MATERIAIS:

1. O 1 passo colocar o material contaminado (cogulos e urina) so colocados

em frascos plsticos contendo hipoclorito a 1%, pr duas horas vida mdia do

hipoclorito.

2. 2 passo os materiais reutilizveis ex: vidrarias so colocados no hipoclorito a

1% pr 30 minutos,

3. 3 passo sabo dextran pr mais 30 minutos,

4. 4 passo lava-se em gua corrente pr 30 minutos,

5. 5 passo mais 30 minutos de molho em gua deionizada,

6. 6 passo so colocados na estufa de secagem.

Matrias da microbiologia1. Os materiais contaminados so colocados na autoclave pr 45 minutos 121C2. Depois que sair do autoclave, devemos seguir os mesmos passos a partir do 3

descrito acima;

3. Aps a secagem, leva o material para o balco de empacotamento e l, definitivamente separado. Ex: plstico, vidro, etc.

4. Depois de separado, o material colocado na estufa de auto preciso para esterilizao com fita teste. Deve-se salientar que materiais plsticos no devem ir para

a estufa de esterilizao, pois a mesma os danificar, devido sua alta temperatura que

gira em torno de 180C. O temo que o material deve ficar na estufa de esterilizao

de 2 hs. E com relao ao material plstico este e embalado e colocado na autoclave

de 15 a 20 minutos.

OBS: Para identificarmos um material autoclavado devemos verificar a fita teste, esta deve estar com listras queimadas. Com todos esses passos, ns faremos

uma boa esterilizao, pois a mesma os danificar, devido sua alta temperatura que

girar em torno de 180C. O tempo que o material deve ficar na estufa de esterilizao

de 2 hs. E com relao ao material plstico este e embalado e colocado na autoclave

de 15 a 20 minutos.

importante compreender a importancia da esterilizao em todo o processo

de trabalho em Laboratorio, bem como o uso de equipamentos essenciais

(AUTOCLAVE, ESTUFA DE ESTERILIZAO E SECAGEM E DEIONIZADOR), e procedimentos de lavagem e descontaminao de materiais.

4. DESCARTE DE MATERIAL CONTAMINADODeve haver POP para o descarte de material contaminado gerado no laboratorio, que

so aqueles despejos em estado slido, semi-solido, liquido ou pastoso, apresentando

caractersticas de toxidade e/ou atividade biologica, que podem afetar direta ou

indiretamente os seres vivos ou causar contaminao das aguas, do ar e do solo.

Procedimento para com os materiais.

Agulhas (e capilares de hematcrito): Uma vez terminada a coleta do sangue-amostra so desprezadas em caixas descarpack

Seringas: Aps o termino da coleta do material, tambem so descartaveis em caixas escarpack.

Algodao, gaze, papeis e material afins: Apos o uso devem ser descartados em sacos de lixo branco e reforados para posterior coleta pr servio especializados.

Swabs, especulos, espatulas, abaixadores de lingua, etc.: Proceder da forma descrita acima.

Urina: Acrescentar uma parte de soluo de hipoclotito de sodio a 1%. Deixa em contatoo pr 2 horas descarta no esgoto sanitario. Os frascos devem ser

descaratados em sacos de lixo brancos reforados para posterior coleta pr servios

especializados.

Fezes: descarta em saco de lixo reforados.

Sangue, coagulos e semelhantes: colocar todo o sangue e seus derivados em um recipiente de plastico resistente. Adicionar soluo de hipoclorito de sdio.

Deixar em contato pr 2 horas. Devido decomposio do hipoclorito em contato com o

sangue, deve-se adicionar mais hipoclorito, at no haver qualquer formao de

espuma.

Meios de cultura e despejos e bactriologicos: Dispensa o material o, a esterilizao em autoclave e descartar em lixo especial.

Lminas e lamnulas: No so descartas. Ao recuper-las so submetidas a um tratamento hipoclorito de sdio a 1% pr 30 minutos. Apos o processo, proceder a

lavagem e recuperao.

PROCEDIMENTO DE ROTINAHEMATOLOGIA MANUAL

HEMATOLOGIAA hematologia compreende o estudo das celulas sanguineas e coagulao.

Normalmente, os constituintes do sangue (hemacias, leuccitos e plaquetas)

permanecem em equilibrio sempre constante devido ao sistema hematopoitico, com

funo de formao hemoltica ou de destruio das clulas sanguineas. (O. LIMA,

1992)

OBJETIVOS O estudo no Laboratrio de hematologia consiste em analisar clulas

sanguineas e a coagulao atraves de exames hematolgicos, podendo assim

qualificar e diferenciar as clulas sanguineas.

Esses testes realizados possibiltam um diagnostico mais conclusivo, auxiliando

clnico no tratamento de uma patologia pr deficiencia hematologica.

HEMATCRITOConsiste em determinar em porcentagem a concentrao de eritrcitos em

dados volume de sangue no coagula. a razo entr o voluem deeritrcitos em relao

ao volume do sangue total. (O. LIMA, 1992)

MATERIAIS E MTODOS- Tubo capilar

- Bico de bunsen

- Centrfuga para microhematcrito

- Tabela para microhematcrito

O tubo de microhematcrito preenchido por capilaridade at da capacidade do

capilar. A extremidade vazia vedada pela chama do bico de bunsen. Colocar os

capilares na centrifuga para microhematcrito, com o cuidado de coloca a parte aberta

contra o apoio de borracha para evitar quebras e extravasamentos. A ponta selada fica

voltada para fora. recomendvel um centrifugao a 3.000 RPM/5 minutos.

Aps a centrifugao, o tubo apresenta uma coluna de sangue, incluindo o

plasma e uma coluna de eritrcitos. Devem ser medidos com o auxlio da tabela.

HEMOGLOBINA (Hb) o principal componente dos eritrcitos. um conjugado de protenas que

serve como transporte de O2 e CO2. (O. LIMA, 1992)

MATERIAIS E MTODOS - Tubos para centrfuga

- Padro (HiCN Cianetohemoglobina)

- Reagente de Drabkin

Tomar 3 tubos e proceder da seguinte maneira:

B P APadro - 20uL -Amostra - - 20 uLReag. de Drabkin 5.0uL 5.0uL 5.0uL

Hogenizar. Descansar em temperatura ambiente por 5 minutos. Leitura a 540

nm no espectrfotmetro. Zerar com o Branco.

ESFREGAOO exame de esfregao sangneo uma parte importante da avaliao

hematolgica. Para obter esfregaos satisfatrio, indispensvel que se tome certas

precaues:

- lminas devem estar limpas e desengorduradas;

- a gota de sangue no deve ser muito grande. Quanto maior a gota, mais espesso o

esfregao. O ideal uma gota de 20uL;

- O esfregao deve ser feito rapidamente, antes que ocorre a coagulao. (O. LIMA,

1992)

MATERIAIS E MTODOS - Lminas limpas e desengorduradas

- Lminas de extenso (extensora)

Colocar uma gota de sangue no final de uma lmina apoiada em uma superfcie

plana. Com o polegar e o indicador, segura-se o final da lmina de extenso contra a

superfcie da primeira lminas. Empurra-se a lmina de extenso a uma velocidade

moderada para frente at que o sangue tenha sido espelhado em um esfregao

moderadamente delgado. As lminas devem ser secas a temperatura ambiente e

depois corada para anlise ao microscpio.

conveniente confeccionar vrios esfregaos ao mesmo tempo. Marcar

sempre os esfregaos usando agulha ou lpis dermogrfico com o nome do paciente e

a data sobre a superfcie do mesmo.

COLORAOOs corantes de anilina usados em esfregaos sanguineos so de duas classes

gerais:

- corantes bsicos, como o azul de metileno;

- corantes cidos, como a eosina.

O ncleo das clulas toma as cores bsicas, como o azul de metileno, enquanto

que os corantes bsicos agem sobre os elementos citoplasmticos. Pertencem a este

grupo os corantes de Romanowsky. Os derivados mais usados do corante primitivo de

Romanowsky so: Giemsa. Leishman, Wrigth entre outros. Nesse setor foi usado o

corante Leishman. (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MTODOS- Suporte para lminas - Corante de Leishman

Colocar a lamina sobre o suporte. Verter 20 gotas do corante sobre a lamina ou

o suficiente para cobri-la. O lcool metilico (metanol) da soluo corante fixa o

esfregao.

Deixar corar durante 15-20 minutos. Lavar em gua corrente e deixar secar.

Observar ao microscpio com objetiva de imerso.

CONTAGEM GLOBALA contagem dos elementos morfolgicos do sangue (eritrcitos, leuccitos e

plaquetas deve ser efetuado pala manh. Consiste em trabalhar com material aferido

com a finalidade de determinar o nmero dos elementos morfolgicos. Para isso,

necessrio diluir volume conhecido de sangue com determinada quantidade de lquido

diluidor. Conta-se as clulas na rea reticulada da cmara destinada para cada tipo de

clulas (ver Anexos) (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MTODOS- Cmara de Contagem (Camara de Neubauer)

- Lquidos diluidores (hayem, Turk, Oxalato de Amnia 1%)

- Pipetas graduadas e automticas

- Lamnulas

Contagem Global de LeuccitosValores de Referencia:

5.000 10.000 mm3

- 0.38 mL do lquido de Turk

- 20uL sangue

- Diluio = 1/20

Depois de homogeneizar o lquido de Turk com o sangue, umedecer a cmara de

lquido de Turk com o sangue, baixo da lamnula, inserir com auxlio da pipeta

automtica pequena quantidade da soluo diluda. Cuidado para evitar presena de

bolhas. Esperar 5 minutos a fim de que os glbulos se depositem. Observar ao

microscpio primeiramente com a objetiva de menor aumento e em seguida numa

objetiva de 40X. Fazer a contagem nos quadrantes destinados a leuccitos.

Contagem Global de PlaquetasValores de Referncisa:

150.000 400.000 mm3

- 0.38 mL oxalato de amni 1%

- 20uL sangue

- Diluio = 1:20

Depois de homogeneizar o oxalato de amnia 1% com o sangue, umedecer a

cmara de Neubauer e cobri-la com lamnula. Pr baixo da lamnula, inserir com o

auxilio da pipeta automtica pequena quantidade da soluo diluda. Cuidado para

evitar presena de bolhas. Esperar 10 minutos a fim de que as plaquetas se depositem.

Esperar em cmara mida. Observar ao microscpio primeiramente com a objetiva de

menor aumento e em seguida numa objetiva de 40X. Fazer a contagem nos quadrantes

destinados a plaquetas, que so os mesmo para contagem de eritrcitos.

VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAO (VHS) a velocidade com o qual os glbulos vermelhos vo para o fundo do tubo. Os

glbulos vermelhos que sedimentam porque a sua densidade maior que a do

plasma. A velocidade com que eles sedimentam porque a sua densidade maior que

a do plasma. A velocidade com que eles sedimentam varia, direta ou indiretamente com

vrios fatores. (O. LIMA, 1992)

MATERIAIS E MTODOS- Tubo de Westergren

- Estante de westergren

O mtodo de Westergren modificado produz os mesmos resultados que o mtodo de

Westergren original, mas emprega sangues na coagulado com EDTA ao invs de

citrato. Isso permite que o VHS seja realizado com a mesma amostra de sangue que os

outros estudos hematolgicos.

2 mL de sangue com EDTA bem misturados so diludos em 0.5 mL de cloreto de

sdio a 0.85% ou 0.5 mL de citrato de sdio a 3.8%. Uma pipeta de Westergren

completada at a marca 0 (zero) e colocada exatamente na vertical na estante

temperatura ambientem, sem vibraes ou exposio direta luz solar. Aps

exatamente 60 minutos, a distancia do topoo da coluna registrda em molmetros como

o valor da VHS. Se a demarcao entre o plasma e a coluna de clulas vermelhas

distinta, o nvel lido onde a densidade total aparece primeiro.

Valores de Referncia:Homens: 3-15 mm

Mulheres: 3-20 mm

Crianas: 3-12 mm

CLULAS LE (Lupus Eritematoso)Um anticorpo presente na frao globulina gama do soro dos pacientes de LES,

o chamado fator LE, reage com a nucleoprotena dos ncleos dos leuccitos. O

ncleo do fagcito acha-se comprimido na periferia da clula. A maior parte da regio

protoplasmtica ocupada pela massa nuclear transformada. O citoplasma reduz-se

estreita faixa na periferia do leuccitos. Na clulas LE, a estrutura da cromatina

substituda pr massa arredondada, homognea, de colorao prpura, de tamanho

varivel, mas usualmente maior que a hemcia. O fagcito pode englobar mais de

ncleo. (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MTODOS- Banho Maria a 37C

- Toma-se o sangue sem anticoagulante e coloca-se em Banho Maria a 37C/2hs.

Depois realiza-se o esfregao e observa-se ao microscopio. Deve-se sempre

realizar o exame FAN junto com o exame de clulas LE.

CONTAGEM DE RETICULCITOSOs reticulcitos so clulas vermelhas imaturas no nucleadas que contm

RNA e continuam a sintetizar hemoglobina aps a perda do ncleo. O sangue incubado

rapidamente em uma soluo de azul cresil brilhante ou azul metileno. No RNA

precipitado como um complexo corante ribonucleoprotenas. O complexo aparece

microscopicamente como uma rede azul escura ou grnulos azuis escuros que

permitem a identificao e contagem de reticulcitos. (O. LIMA, 1992)

MATERAIS E MTODOS- Esfregao sangneo

Conta-se o nmero de reticulcitos em 10 campos diferentes. O esfregao feito a

partir de 100uL de sangue + 1 gota de azul cresil brilhante.

Valores de Referncias:

0.5 - 2.0%

10 campos = total / 10 = nmero %

COAGULOGRAMATempo de Sangria (TS) o tempo necessario para a cessao da hemorragia, ocasionando por

pequena inciso, de dimenso padronizada, praticada artificialmente. (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MTODOS- Equipamento para puno digital

- Papel de filtro

- Cronmetro

Faz-se a assepsia da polpa digital ou do lbulo da orelha com a lanceta, fazer a

inciso e deixar o sangue fluir espontaneamente. Marcar no cronometro o incio no

momento do aparecimento da primeira gota. Com o papel de filtro absorver de 30

em 30 segundos a gota de sangue formada sem tocar a inciso. Quando cessar o

fluxo de sangue, parar o cronmetro. Quando cessar o fluxo de sangue, parar

cronmetro. O intervalo decorrido entre o aparecimento da primeira e da ultima gota

representa do tempo de sangria.

Valores de referncia:

1 6 minutos

Tempo de Protrombina Ativada (TAP) a prova de escolha para investigao do sistema extrnseco da coagulao

sangnea. uma prova de grande valor na demonstrao de deficincia dos fatores de

coagulao I, II, V, VII, X. (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MTODOS- Plasma citratado do paciente

- Soluo de tromboplastina

- Banho Maria a 37C

- Tubos de ensaio

- Soluo de cloreto de clcio a 0.025M

Coloca-se 100uL do plasma citratado do paciente + 100uL da suspenso de

tromboplastina no tubo de ensaio. Homogeneiza, adicionar rapidamente 100uL da

soluo de cloreto de clcio. Neste instante, acionar o cronmetro. Retirar o tubo do

BM e agit-lo suavemente, de 2 em 2 segundos, at o aparecimento do cogulo,

parando simultaneamente o cronmetro. O tempo consumido em segundos constitui

o TAP.

Valores de Referncia:

11 13 segundos

Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA)

a melhor prova para investigar as alteraes do mecanismo da coagulao

sangnea. Fatores que participam do sistema intrnseco esto envolvidos, com

exceo das plaquetas e do fator XIII, bem como do fator VII, do sistema extrnseco. (O.

LIMA, 1992)

MATERIAL E MTODOS- Plasma citratado do paciente

- Soluo de tromboplastina parcial

- Banho Maria a 37C

- Cronmetro

- Tubos de ensaio

- Soluo de cloreto de clcio a 0.025 M

Coloca-se 100uL de cefalina + 100uL plasma citratado do paciente. Homogeneiza e

encuba em Banho Maria a 37C/3 min. Aps esse tempo, adicionar rapidamente

100uL da soluo de cloreto de clcio. Neste instante, acionar o cronmetro. Agit-

lo suavemente, de 5 em 5 segundos. Ao fim de 30 segundos, retirar o tubo do BM e

agit-lo suavemente, observando o aparecimento do cogulo, parando

simultaneamente o cronmetro. O tempo consumido em segundos constitui o TTPA.


35 45 segundos

CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCCITOSConsiste em determinar a proporo existente entre as distintas variedades de

leuccitos. A contagem diferencial de leuccitos dos mais valiosos mtodos entre os

exames citolgicos do sangue. (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MTODOS- Esfregaos corados

Deve-se observar a lmina prximo cauda o esfegao onde quase no se

encontra roleaux e facilita a contagem. Total de 100 clulas.

FIBRINOGNIO

MATERIAIS E MTODOS- Tubo capilar

- Plasma

- Microcentrfuga

- Tabela de Hct

- Banho Maria a 56

Aspira-se o plasma no tubo capilar e encuba-se em Banho Maria a 56C/15 minutos.

Leva-se centrfuga para microhematcrito por 5 minutos / 3000 RPM. Faz-se a leitura

na tabela para Hct e multiplica o resultado por 92.


200 400 mg/dL

INDCES HEMATIMTRICOSVCM = Hct / Hem x 100 u3

HCM = Hb/ Hem x 100 pg

CHCM = Hb / 100%

PROCEDIMENTO DE ROTINA SOROLOGIA

MANUAL

SOROLOGIAO melhor diagnstico de um processo infeccioso a demonstrao do

patgeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biolgicos do hospedeiro. Nem

sempre possivel essa prtica pela ausncia do agente infeccioso ou pela pocua

sensibilidade dos mtodos ou por longos perodos exigidos para uma resposta

laboratorial.

Mtodos parasitolgicos ou microbiolgicos so deficientes para diagnstico de

algumas patologias. So utilizados mtodos imunolgicos, sorolgicos ou

imunoensaios. So tcnicas para a deteco e quantificao de Ag ou Ac, podendo

utiliza-se de reagentes marcados ou no. Comumente so utilizados marcadores

radiotaivos, enzimpaticos, fluorescentes e quimioluminescentes.

Os testes sorolgicos so feitos atravs de pesquisas de anticorpos pu

antgenos, sendo a reao Ag Ac, visualizada pr alguns mtodos como aglutinao,

precipitao, floculao e outros. Esses testes de pesquisa de Ag Ac desempenham

uma importante funo de diagnstico laboratorial clnico como complemento de outros

testes e provas, desde que sejam respeitadas suas indicaes e limitaes.

OBJETIVONo setor de sorologia, o principal demonstrar aos estagirios os princpios das

tcnicas mais usadas nos testes sorolgicos, assim sua importncia e identificao.

A alta sensibilidade dos testes utilizados garante um importancia no setor de

triagem sorolgica para seleo de pacientes que podem vir a ser doadores e recptores

de orgos, evitando transtornos ps-transfusionais.

A Cincia Sorologia tem como principal objetivo pesquisar anticorpos

especficos auxiliando, assim, no diagnstico individual de determinadas patologias com

tambm diferenciando as fases da doena.

Imunodifuso Radial Simples- Prncipio Antgeno ou Anticorpo permanecem fixados ao suporte e o outro se

difunde, at haver um halo de precipitao formado pr reao de Ag com o Ac ao

redor da inoculao.

- Materiais e Mtodos Toma-se uma placa com gel (gar misturado com a diluio apropriada de Ag especfico para Ac determinado) contendo orifcios onde, com ajuda

da micropipeta, ser adicionado 5uL do soro. Fecha a placa e guarda em forma

invertida em cmara mida, para que mantenha o meio mida, pr 48h a 72h.


IgG: 710 1520 mg/dL

IgM: 90 310 mg/dL

AGLUTINAOA reao de aglutinao caracterizada pela formao de agregados visveis

como resultado da interao de anticorpos especficos e partculas insolveis que

contm determinantes antignicos em sua superfcie.

A aglutinao pode ocorrer tanto com particulas que apresentam determinadas

antignicos naturais em sua superfcie (hemcias, bactrias, protozorios, etc.) como

com partculas inertes (ltex, poliestireno, etc.), ou mesmo com clulas antigenicamente

no relacionadas (hemcias, bactrias) s quais se absorvem ou se fixam antgenos

solveis.

As reaes podem ser de aglutinao direta ou indireta.

A) TESTE DA AGLUTINAO DIRETA- Princpio Aglutinao de partculas antignicas insolveis, em sua forma ntegra

ou fragmentada, na deteco de anticorpos especficos. Teste bastante utilizado para

classificao sanguinea, mononucleose infecciosa e brucelose.

- Materiais e Mtodos

Bruceloso (Antgeno Rosa Bengala): uma suspenso de bacilozs em colorao rosa, mistura o bacilo com amostras de pacientes e complexo Ag Ac se

aglutina.

Mononucleose: Toma-se uma placa de vidro e mistura-se uma gota do soro do paciente com o reagente que contm hemcias de cavalo (ag para mononucleose mais

Ac heterfilos).

Observa-se a presena de aglutinao. Como os anticorpos heterfilos, que

no so especficos para o vrus Epstein-Barr, podem aglutinar as hemcias de cavalo,

para o teste positivo realiza-se uma Segunda etapa. Nesta, mistura o soro com clulas

renais de cobaia, as quais removam quase todos os anticorpos heterfilos da

mononucleose infecciosa.

B) TESTE DA AGLUTINAO INDIRETA- Princpio As hemcias e as partculas inertes podem ser sensibilizadas por

adsorso passiva, devida aos contatos direto com os Ag solveis. So utilizados como

suportes na adsoro de protena solvel e Ag polissacardeos, funcionando como

sistema indicador da reao Ag-Ac.

AGLUTINAO DO LTEX

PCR (Protena C Reativa): reao de aglutinao em lminas, a qual particulas de latex sensibilizadas com Ac anti-PCR estabilizadas so aglutinadas em presena da

Protena C Reativa.

- Materiais e Mtodos - a) Determinao Qualitativa: Numa lmina de vidro, com reas para diferentes

testes, depositar sucessivamente em 3 subdivises, 1 gota de soro positivo, 1 gota de

soro negativo e 1 soro do soro a testar. Adicionar a cada uma delas 1 gota do reativo

ltex anti-PCR. Homogeneizar. Fazer movimentos suaves de rotao procedendo a

leitura aps cinco minutos.

b) Determinao Semi-Quantitativa: Em casode amostra positiva, realizar

sucessivas diluio do soro at que se encontre a maior diluio que ainda fornece

aglutinao. O procedimento da anlise o mesmo do teste qualitativo, porm, utiliza-

se as amostras diludas. Sendo a sensibilidade do teste de 7UI/mL, o clculo semi

quantitativo realizado da seguinte forma:

[ ] = 7 x (maior diluio positiva)

FR (Fator Reumatide)- Materiais e Mtodos a) Determinao Qualitativa: Pipetar 1 gota do soro do paciente em uma rea da

lmina e , sobre ela, 1 gota da suspenso de ltex sensibilizado com IgG humana

altamente purificada e estabilizada e suspensa em tampo glicina. Proceder da mesma

forma com os soros controle positivo e negativo. Fazer movimentos suaves de rotao,

sob uma boa fonte de luz, durante 2 minutos. Observar a formao de aglutinao.

b) Determinao Semi-Quantitativa: Em caso de amostra positiva, realizar

sucessivas diluies do soro at que se encontre a maior diluio positiva. O clculo

semi quantitativo realizado da seguinte forma:

[ ] = 25 x (maior diluio positiva)

ASLO (Anti-Estreptolisina O): Reao de aglutinao em lminas, a qual partculas de ltex sensibiladade com estreptolisina O estabilizada so aglutinadas em

presena de anti-estreptolisina. O reativo padronizado pr comparao com o padro

da OMS.

- Materiais e Mtodos- a) Determinao Qualitativa: Numa lmina de vidro, com reas para diferentes

testes, depositar sucessivamente em 3 subdivises, 1 gota de controle positivo, 1 gota

de controle negativo e1 gota do soro a testar. Adicionar a cada uma delas 1 gota do

latex sensibilidade com ASO. Homogeneizar. Fazer movimentos suaves de rotao.

Proceder a leitura em exatamente 2 minutos.

b) Determinao Semi-Quantitativa: Em caso de amostra positiva, a partir da

diluio 1/20, realizar sucessivas diluies de razo 2 a t 2560 em tampo glicocola. O

procedimento da anlise diludas. O ttulo de Ac ASO calculado da seguinte forma:

UI/mL = inverso da ltima diluio positiva x 10.

HEMAGLUTINAO INDIRETA

Hemcias esto entre os melhores suportes de Ag para os testes de

aglutinao, pois uma serie de Ag que pode ser ligada sua superfcie para fornecer

um sistema indicador sensvel na deteco de Ac, porm, sua superfcie complexa,

facilitando a ligao de muitos Ag e, frequentemente, acarreta a presena de Ac

heterfilos que devem ser removidos antes da execuo do teste.

CHAGAS- Princpio Eritrcitos de aves estabilizados, sensibilizados com compontes

antignicos Trypanossoma cruzi altamente purificados, mostram aglutinao quando

reagem com Ac contra esses antgenos presentes no soro do paciente.

- Materiais e Mtodos a) Determinao Qualitativa: Colocar a placa sobre um pano mido para

neutralizar as foras eletrostticas. Usar 1 cavidade da placa pr amostra, incluindo

sempre os controles positivo e negativo. Usar diluio do soro 1/32 com a soluo

diluente com os controles positivo e negativo. Transferir 25uL da suspenso

homognea de hemcias placa. Adicionar 25uL da suspenso homognea de hemcias

em cada cavidade. Agitar a placa pr vibrao mecnica pr 4 minutos. Deixar em

repouso por 1 a 2 horas temperatura ambiente, em locar livre de vibraes. Fazer a

leitura. Reao positiva como um tapete e reao negativa quando se depositam no

fundo da cavidade formando um boto.

b) Determinao Quantitativa: Em caso de amostra positiva, deve-se realizar

sucessivas diluies (titulao) a partir da diluio do soro de 1/32. Pipetar 25uL da

soluo diluente com 2-Mercaptoetanol, a partir da Segunda cavidade da placa, at a

diluio que se pretende estudar. Titular sempre deixando 25uL da diluio, desprezar

os ltimos 25uL. Pipetar 25uL da suspenso homognea de hemcias em todas as

cavidades. Agitar a placa pr vibrao mecnica por 4 minutos. Deixar em repouso pr

1 a 2 horas temperatura ambiente, em local livre de vibraes. Fazer a leitura.

TOXOPLAMOSE- Princpio Eritrcitos de aves estabilizados, sensibilizados com componentes

antignicos do Soxoplasma gonddi altamente purificados, mostram aglutinao quando

reagem com Ac contra esses antgenos presentes no soro do paciente.

- Materiais e Mtodos a) Determinao Qualitativa: Colocar a placa sobre um pano mido para

neutralizar as foras eletrostticas. Usar cavidade da placa por amostra, incluindo

sempre os controles positivo e negativo. Usar diluio do soro 1/16 com a soluo

diluente com 2-Mercaptonol. Fazer o mesmo com os controles positivo e negativo.

Transferir 25uL da diluio 1/16 de cada amostra e controles para as respectivas

cavidades da placa. Adicionar 25uL da suspenso homognea de hemcias em cada

cavidade. Agitar a placa pr vibrao mecnica pr 4 minutos. Deixar em repouso por 1

a 2 horas temperatura ambiente, em local livre de vibraes. Fazer a leitura. Reao

positiva quando as hemcias de depositam no fundo da cavidade como um tapete e

reao negativa quando se depositam no fundo da cavidade formando um boto.

b) Determinao Quantitativa: Em caso de amostra positiva, deve-se realizar

sucessivas diluies (titulao) a partir da diluio do soro de 1/32. Pipetar 25uL da

soluo diluente com 2-Mercaptoetanol, a partir da Segunda cavidade da placa, at a

diluio que se pretende estudar. Titular sempre deixando 25uL da diluio, desprezar

os ltimos 25uL. Pipetar 25uL da suspenso homognea de hemcias em todas as

cavidades. Agitar a placa por vibraes mecnicas pr 4 minutos. Deixar em repouso

pr 1 a 2 horas temperatura ambiente, em local livre de vibraes. Fazer a leitura.

FLOCULAO (VDRL)O teste de VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) emprega cristais de

colesterol que so sensibilizados com cardiolipina para a pesquisa de Ac na sfilis.

classificado como um teste no treponmico, usado como triagem ou controle da cura.

- Princpio Reao imunolgica de floculao utilizando antgeno de cardiopina, lecitina e colesterol em soluo alcolica, onde as partculas de Ag floculam

ao entrar em contato com o soro ou plasma (reagina).

- Materiais e Mtodos a) Determinao Qualitativa: Tem como objetivo a triagem e eliminao dos soros

no reagentes. Para isso, toma-se uma placa de Kline com suas cavidades

devidamente identificadas para cada reao. Pipetar 50uL da amostra a ser analisada e

dos soros controle positivo e negativo. Adicionar-se 25uL da suspenso antignica

cada cavidade, que ir reagir com os Ac presentes. Colocar lmina em agitador

mecnico pr 4 minutos. Fazer leitura em microscpio com objetiva de 10x.

b) Determinao Semi - Quantitativa: Tem como objetivo reduzir a pequenos

intervalos a quantidade de Ac presentes na amostra. Para tanto, dever ser feita

diluio da amostra em soluo salina. Proceder cada diluio do mesmo modo como

no teste qualitativo. O ttulo da amostra ser o da ltima diluio onde ainda se visualiza

a presena de agregados.

UROANLISECom a anlise da urina, iniciou-se a medicina laboratorial. Foram encontrados

hierglifos egpcios com desenhos de mdicos examinado frascos de urina em forma

de bexiga. Muitas vezes, esses mdicos nunca viam o paciente, apenas sua urina.

Embora no contasse com os sofisticados mtodos atuais, eram capazes de obter

informaes diagnsticas a partir de observaes bsicas como cor, turvao, odor,

volume, viscosidade e at mesmo presena de acar, ao observarem que certas

amostras atraam formigas. interessante notar que essas mesmas caractersticas

urinrias ainda so relacionadas plos laboratrios hoje em dia. Contudo os modernos

mtodos de uroanlise ampliam seu campo de ao, abrangendo no s o exame fsico

mas tambm a anlise bioqumica e o exame microscpico do sedimento urinrio.

(STRASINGER, 1998)

Analisaremos tambm o LCR (Lquido Cefalorraquidiano). Trata-se de um

sistema fisiolgico destinado a distribuir nutrientes pelo tecido nervoso, retirar resduos

metablicos e servir de barreira mecnica para amortecimento dos traumatismos que

porventura atinjam o encfalo e a medula espinhal. (STRASINGER, 1998).

Por fim, faremos tambm uma anlise do lquido seminal. Com exceo da urina,

o lquido recebido com mais freqncia em laboratrios de anlises clnicas. As duas

principais razes para sua analise so avaliaes de casos de infertilidade e do estado

ps-vasectomia. (STRASINGER, 1998)

MATERIAIS E MTODOS

COLETA (STRASINGER, 1998)

URINA A amostra deve ser colhida em recipiente limpo e seco.

Recomenda-se o uso de recipientes descartveis por serem econmicos e pr

eliminarem a possibilidade de contaminao decorrente de lavagem incorreta.

O recipiente de amostra deve ser devidamente etiquetado, contendo data e

nome do paciente. As etiquetas devem ser postas sobre o recipiente e no sobre a

tampa.

A amostra deve ser entregue imediatamente ao laboratrio e analisada

dentro de uma hora. A amostra que no puder ser entregue ou analisada dentro desse

tempo devera ser refrigerada ou receber conservante qumico apropriado.

LCR O LCR normalmente colhido por puno lombar entre L3 e L4 ou

entre L4 e L5. As amostras geralmente so colhidas em tubos estreis, marcados 1,2 e

3, na ordem em que so obtidos. O tubo 1 usado par anlises bioqumicas e

sorolgicas, o tubo 2 destina-se contagem celular e o tubo 3 em geral usado par a

microbiologia, por ser o que menos probabilidade tem de conter clulas introduzidas

acidentalmente pelo procedimento de puno espinhal.

SMEN - Como a composio das fraes do smen varivel, sua coleta

deve ser bem feita para que a avaliao da fertilidade masculina seja precisa. Para

isso, os pacientes devem ser bem orientados. As amostras devem ser colhidas em

recipientes estreis aps trs dias de abstinncia sexual. No recomendvel o uso de

preservativos o uso de preservativos na coleta de amostras para os exames de

fertilidade, pois podem conter substancias espermaticidas. Sempre que possvel, a

amostra deve ser colhida em laboratrio, mas se isso no for vivel, dever ser mantida

em temperatura ambiente e entregue em at uma hora ao laboratrio. Dever ser

anotada a hora da coleta e no do recebimento.

CONSERVAO (STRASINGER, 1998)

URINA - O mtodo de conservao mais utilizado a refrigerao, capaz de

evitar a decomposio bacteriana da urina pelo perodo de uma noite. preciso deixar

que a amostra volte temperatura ambiente antes da anlise qumica com fitas

reativas. Existem vrias conservantes qumicos que podem ser utilizados, portanto

impossvel escolher aquele que se ajuste melhor s necessidades da anlise solicitada.

LCR - Amostras destinadas a outras anlises bioqumicas e sorolgicas devem

ser congeladas. O lquor da seo de hematologia dever ser refrigerado se no for

possvel fazer contagem celular do mesmo em uma hora; o da microbiologia mantido

temperatura ambiente e analisado o mais depressa possvel.

URINA TIPO I (STRASINGER, 1998)

TCNICA

- Num tubo uroanlise, colocar 10 mL de urina.

- Passar a fita reativa e anotar os resultados. Onde for positivo, colocar a alterao.

- Calibrar o tubo e centrifugar a 2500 RPM por 5 minutos.

- Inverter o tubo no container at que reste 1 ml.

- Contar na cmara de Neubauer.

EXAME FSICO E FITA REATIVA

Analisa-se macroscopicamente alguns aspectos da urina. Mergulha-se a fita na

urina e atravs de uma reao de cor analisada-se os seguintes itens:

- Cor: Varia de amarelo claro a mbar.

- Aspecto: Varia de levemente turvo a fortemente turvo.

- pH: Embora um indivduo sadio geralmente produza a primeira urina da

manh com pH ligeiramente cido, entre 5.0 e 6.0, o pH normal das outras amostras do

dia podem varias de 4.5 a 8.0.

- Densidade: uma medida da densidade das substncias qumicas dissolvidas

na amostra. Geralmente medida na fita reativa ou pelo refratmetro. A densidade

normal da urina varia de 1.010 a 1.030.

- Protenas: A constatao de protenas nem sempre significa doena renal,

mas sua presena realmente exige a realizao de outras anlises para verificar a

normalidade ou anormalidade do quadro.

- Glicose: devido sua utilidade na deteco e no controle do Diabetes melito, o

teste de glicosria a anlise bioqumica realizada com maior freqncia na urina.

- Corpos cetnicos: Normalmente no aparecem em quantidades mensurveis

na urina, pois toda gordura metabolizada completamente degradada e convertida em

dixido de carbono e gua.

- Sangue: Pode estar presente na forma de hemcias ntegras ou de

hemoglobina. Se encontrar Hemoglobina e mioglobina na cmara, ter que aparecer na

fita. Da pesquisa-se sangue oculto.

- Bilirrubina: Sua presena pode ser a primeira indicao de hepatopatia, e

muitas vezes detectada bem antes do desenvolvimento de ictercia.

- Urobilinognio: um pigmento biliar resultante da degradao da

hemoglobina. Aparece na urina porque, ao circular no sangue a caminho do fgado,

pode passar pelos rins e ser filtrado plos glomrulos.

- Nitrito: um mtodo rpido de detectar infeces do trato urinrio.

EXAME QUMICO E SEDIMENTOSCOPIA

Na cmara de Neubauer, conta-se os 4 quadrantes laterais (eritrcitos) e multiplica por

250 ou conta 1 quadrante e multiplica por 1000. Este ltimo mais utilizado. Faz-se

isso para contagem de hemcias e leuccitos. Procura-se por:

- Hemcias

- Leuccitos

- Clulas

- Cilindros: Pode ocorrer em exerccios fsicos intensos. Conta-se os 4

quadrantes e multiplica por 110. Os mais encontrados so os epiteliais e os hialinos. Se

tem cilindros, tem protenas.

- Bactrias: Podem apresentar bactrias nitrificantes e no nitrificantes. Se tem

bactrias, tem leuccitos.

- Leveduras: Ocorre quase sempre em glicosria e conta-se em cruzes de 1a 4.

- Muco

- Cristais: Caso encontrados, soltar resultados em cruzes de 1 a 4. Em RN

comum encontrar cristais de urato.

- Outros - Parasitas, espermatozides, clculos, artefatos, etc.

TESTES BIOQUMICOS

- Proteinuria2 mL de Ac. Sulfossaliclico a 3%

0,5 mL de urina

Homogeneizar.

Resultado: +

Formao de turvao

- Protena de 24 hs (Quantitativo) Homogeneizar a amostra e medir o volume com preciso.

Branco Amostracido Sulfossaliclico - 2.0 mLgua destiliada 2.0 mL -Amostra 0.5 mL 0.5 mL

Homogeneizar, aguardar 10 minutos em TA e verificar a Abs. em 560 nm.

Resultado:

Ptn 24 hs: volume 24 hs x Fator (1.74) x Abs. A

V.R.: at 150 mg/dL

- Protena Ortosttica ou Postural

Ocorre em paciente que permanece, longos perodos sentados ou em p, onde

os rins so comprimidos pelos rgos superiores - diminuio da reabsoro de

protena - proteinuria.

Coleta-se um amostra aps o paciente ter permanecido um perodo sentado (2

hs) - RESULTADO POSITIVO.

Para confirmao, coleta-se uma outra amostra, a primeira da manh -

RESULTADO NEGATIVO - Ptn Ortosttica ou Postural.

- Protena de Bence JonesMieloma mltiplo - Proliferao dos plasmcitos - Liberao de microglobulinas

(Bence Jones) - Baixo peso molecular - Proteinuria.

Levar cerca de 5 mL de urina ao BM 50 - 60C e levar ao BM 100 por 5 minutos. Se ficar lmpida, confirma-se Protenas de Bence Jones. Se continuar turvo,

pode ser qualquer outro tipo de protena.

Caracterstica: Desnatura aos 50-60 C e torna-se lmpida aos 100 C. Se der

positivo, confirmar com eletroforese ou contraimunoeletroforese.

- Glicosria2 mL de Reativo de Benedict

4 gotas de urina

Homogeneza. Coloca em banho fervente por 5 minutos.

+ Resultado:

Marron Tijolo: ++++

Verde com sedimento amarelo: +++

Verde sem sedimento amarelo: ++

Verde claro: +

Azul: Negativo

- Corpo Cetnicos1 mL de urina

6 gotas de Reativo de Imbert

Homogeneizar

Acrescentar 1 mL de hidrxido de Amnia vagarosamente pelas bordas do

tubo.

Resultado

Formao de halo roxo entre duas fases.

URINA TIPO II (STRASINGER, 1998)Faz-se a anlise tipo II geralmente em casos de cirrose, hepatopatias, anemia

hemoltica. Pesquisa-se:

PESQUISA DE HCG (STRASINGER, 1998)

- Gravidez com resultado negativoEstgio inicial

Gravidez ectpica

Trimestre final da gravidez

- Ausncia de gravidez com resultado positivo (raro)Menopausa - gonadotrofina hipofisria

Endocrinopatias - LH

-Resultado positivo com taxa elevada de HCH

Doenas trofoblsticas:

Mola hidatiforme

Coriocarcinoma

Reao de aglutinao em ltex

Imunocromatocrfico (Ac monoclonal)

Observaes:

- Esse hormnio aparece primeiramente no soro e, depois da sobrecarga

sangunea, excretado na urina.

- No trimestre final pode ocorrer HCG negativo em caso de aborto, com a placenta inativa.

- Doenas trofoblsticas liberam grande concentrao de HCG.- Pesquisa de HCG em homens: suspeita de CA de testculo.

- Urobilinognio2,5 mL de urina

0,5 mL reativo de Erlich

Positivo se forma colorao vermelha. Caso de positivo, realizar diluio

sucessivas, comeando com 1,0 mL de urina + 9,0 mL de gua destilada. Diluio de

1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160.

Adiciona 1,0 mL de reativo de Erlich.

Resultado:

Urobilinognio: 1/? EU (Unidade Erlich)

- Pigmentos Biliares1,0 mL cido ntrico

1,0 mL de urina, pelas bordas do tubo, vagarosamente.

Positivo se formar um halo verde.

- Pesquisa de Sangue OcultoCentrifugar 10 mL de urina a 2000 RPM pr 5 minutos.

Desprezar todo o sobrenadante

Acrescentar 6 gotas do Reativo de Benzidina

Positivo se formar um colorao de azul a verde.

Reativo de Benzidina:

Uma porode Benzina

1,0 mL H2O2

1,0 mL de cida actico 50%

Homogeneizar

Preparar o reativo somente na hora do uso.

HCG de 24 horas

Sucessivas diluio a comear de 1 / 2.

Resultado:

Volume de 24 hs x ultima diluio positiva x 2,5 = ? UI/24 horas

LQUIDO CORPORAIS (STRASINGER, 1998)

- ANLISES DO LCRA) Exame fsicoAspecto:

Antes de centrifugar: vermelho / turvo

Depois de centrifugar: deve diferenciar o LCR

Para diferenciar Puno Traumtica de hemorragia Intracraniana.

1) Aps centrifugao

PT: forma sedimento (boto de hemcias e sobrenadante lmpido)

HI: no forma sedimento.

2) Distribuio desigual de sangue nos tubos

PT: a quantidade de sangue vai diminuindo nos tubos.

HI: Os trs tubos permanecem vermelho por igual.

3) Formao de cogulo

PT: no forma cogulo

HI: forma cogulo

B) Exames microscpicoa) Contagem Global

- Leuccitos:--- mm

- Hemcias: 0-5 / mm; RN.: at 100/mm

Homogeneizar o material e preencher a cmara de Fuchs Rosenthal.

Contar todos os quadrantes e dividir o nmero de clulas contadas por 3.

b) Contagem Diferencial

Concentrar o material e fazer esfregao com a cmara de Suta.

Corar com Leishman, Wright ou Giemsa.

Contar 100 Clulas:

- neutrfilos (Meningite bacteriana)

- linfcitos (Menegite viral)

- eosinofilos (Neurocisticercose)

- moncitos (Meningite turbelosa e fngida)

C) Exame qumicoGlicose (60% glicose plasmtica)

Protena: 15 - 40 mg/dL

- ESPERMOGRAMAA) Fases

1 fase: Liquefao primria ou virtual

2 fase: Coagulao (durao at 30 minutos)

3 fase: Liquefao secundaria. Ausncia dessa fase INFERTILIDADE

B) Contagem GlobalHomogeneizar a amostra e diluir em 1/40 (3.9 mL solvente fisiolgico + 100uL

de esperma).

Preencher a cmara de Neubauer.

Contar SPTZ em objetiva de 40 X nos quadrantes laterais e central, multiplicar o

nmero o contado por 80.000.

Se a quantidade de SPTZ for muito elevado, contar apenas o quadrante central

e multiplicar por 400.000.

Resultados expressos em mL. V.R.: 60 milhes/mL

C) Viabilidade Em um tubo, colocar uma gota de esperma e acrescentar 2 gotas de eosina +

2gotas de nigrosina.

Confeccionar esfregao e secar rapidamente.

Verificar a quantidade de SPTZ vivos (brancos) e mortos (vermelhos) - Objetiva

de imerso.

Vivos: mais do que 70%

Mortos: menos do que 30%

PROCEDIMENTO DE ROTINA PARASITOLOGIA

EXAME PARASITOLOGIA DE FEZES

O exame utilizado no diagnstico das parasitoses intestinais e tem como

objetivo o encontro de trofozotas e cistos de protozorios e ovos ou larvas de

helmintos. Um resultado parasitolgico negativo no exclui a possibilidade de infeco

por parasitas, levando em considerao a idade da infeco e as "fases negativas" de

determinados parasitas, como a Girdia lamblia, por exemplo. Os ovos de Taenia sp.

(solitria) e Enterobius vermicularis (oxirus) raramente so encontrados nas fezes,

sendo mais comumente encontrados na regio perianal.

Os seguintes parasitas intestinais so patognicos e devem ser erradicados:

- Ascaris lumbricoides

- Capillaria heptica

- Clonorchis sinensis

- Blastocystis hominis

- Cyclospora

- Cryptosporidium (quando em imunodeprimidos)

- Dientamoeba fragilis

- Dipylidium caninum

- Diphyllobotrium latum

- Entamoeba hispolytica

- Enterobius vermiculares

- Girdia lamblia

- Hymenolepis diminuta

- Hymenolepis nana

- Isospora belli

- Isospora spp.

- Microspordia

- Progonimus westermani

- Strongyloides stercoralis

- Trichuris trihiura

- Schistosoma mansoni

- Ancilostomideos

No necessria medio quando so encontrados os seguintes parasitas no

patognicos:

- Chilomastix mesnili

- Cryptosporidium (quando em imunocompetendes)

- Endolinax nana

- Entamoeba coli

- Entamoeba hartmani

- Iodanoeba btschlii

MATERIAL / AMOSTRA

A amostra fecal deve ser colhida diretamente no frasco ou em um urinol, ou

ainda em jornal ou papel limpo, e transferidas diretamente para o frasco coletor. O

frasco coletor deve estar livre de anti-spticos, agentes germicidas, de gotas de leo e

de urina, para evitar a destruio de formas vegetativas dos parasitas. Fezes obtidas de

vasos sanitrios no podem ser utilizadas.

Cada amostra dever apresentar no mnimo, as seguintes informaes: nome

do paciente, nmero de identificao, nome do mdico, data e horrio da colheita, e

dever vir acompanhada do pedido mdico indicando qual o procedimento laboratorial a

ser seguido.

Os recipientes com amostras fecais recebidos de pacientes com AIDS devero

ser protegidos por um invlucro de plstico e identificados com etiquetas vermelha ou

HIV positivo.

O ideal para a certeza diagnstica a realizao de exames em trs amostras

obtidas em dias alternados.

O uso de laxantes s indicado caso haja uma srie de exames negativos em

pacientes com suspeita clnica. Nestes casos administrar laxantes salinos. leos

minerais (nujol etc.) e compostos de bismuto e magnsio no devem ser empregados

por interferirem no resultado dos exames. As fezes obtidas por uso de laxantes devem

ser levadas imediatamente ao laboratrio.

O tempo de colheita da amostra fecal influncia diretamente na identificao

dos parasitas. Por essa razo amostra fecais diarricas e pastosas devem ser levadas

ao laboratrio aps no mximo, 30 minutos aps a evacuao. As amostras fecais

slidas devem ser entregues no laboratrio at 2 horas sem refrigerar e no mximo at

14 horas se mantidas sob refrigerao (no congelar!).

Quanto ao uso de medicamentos, o ideal no ter usado anti-parasitrios e

antibiticos nas ltimas 3 semanas e antidiarricos e antiinflamatrios nas 72 horas que

antecedem a coleta.

METODOS

- Tcnicas de concentrao: mtodos de Faust (centrifugao-flutuao em soluo

saturada de sulfato de zinco) e mtodo de Lutz ou Hoffman, Pons Er Janes)

sedimentao espontnea em gua)

- Exame direto fresco: realizado se a amostra for diarrica ou se apresentar muco,

pus ou sangue.

- Exame quantitativo para contagem de ovos de helmintos nas fezes: mtodos de Kato-

Katz.

- Tcnica de isolamento de larvas de nematdeos: mtodos de Rgai.

PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES

O teste realizado no auxilio ao diagnstico de leses sangrantes da mucosa

de pores baixas do trato digestrio (especialmente leses dos clons) e como

mtodos de triagem no diagnostico precoce do cncer dos clons em indivduos acima

dos 40 anos.

A pesquisa de sangue oculto nas fezes deve ser precedida de dieta rigorosa por

quatro dias, da qual se excluem as carnes, os vegetais verdes (clorofila) e os

medicamentos base de ferro; e deve ser feita em amostra fecal recentemente emitida.

MTODO DE EXAME DIRETO FRESCO

Um procedimento simples e eficiente para o estudo das fezes, permitindo

observar as formas trofozotas vivas dos protozorios. Os esfregaos com fezes frescas

e no fixadas so preparados com solues salina fisiolgica a 0,85% e de Iodo de

Lugol, separadamente. Os esfregao devero ser sistemticos e completamente

examinados atravs de objetiva de microccpio de pequeno aumento (10x) e com

pequena intensidade de luz. A confirmao dos parasitas deve ser realizada com

objetiva de grande aumento (40 x).

SOLUO SALINA FISIOLGICA A 0,85%

Cloreto de sdio (NaCI) ---------------------------------------------------------------------------- 8,5 g

gua destilada-deionizada ----------------------------------------------------------------------1000 ml

MTODO DE CENTRFUGO-FLUTUAO EM SOLUO DE SULFATO DE ZINCO

(MTODO DE FAUST et al., 1938)

Procedimento utilizado para diagnostico de cistos de protozorios e ovos de larvas de

helmintos, ovos grandes de trematdeos, de cestdeos e infrteis de Ascaris

lumbricoides no so concentrados por este mtodo, devido sua densidade ser maior

do que a da soluo ser sulfato de zinco utilizada, no permitindo sua flutuao. um

mtodo imprprio para fazer contendo grande quantidade de gordura.

Colocar 1 ou 2 g de fezes coletadas de vrias partes do boldo fecal em frasco

contendo 10 mL de gua corrente.

Homogeneizar e filtrar a suspenso atravs de gaze dobrada quatro vezes, e

receber o filtrado em um tubo cnico de centrfuga de 15 mL.

Adicionar gua corrente at completar 2/3 da capacidade do tubo. Centrifugar a

2.500 r.p.m por 60'.

Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 mL de gua corrente ao sedimento,

antes de ressuspend-lo. Completar com gua corrente 2/3 do volume do tubo,

agitar e centrifugar.

Repetir a etapa anterior at que o sobrenadante apresente-se relativamente

claro.

Depois que o ltimo sobrenadante descartado, adicionar a 1 a 2 mL de soluo

de sulfato de zinco (d= 1,18 g/mL) e ressuspender o sedimento. Completar com

o mesmo reagente at 0,5 cm da borda do tubo e centrifugar.

Cuidadosamente, remover o tubo da centrifuga e, sem agitao, coloc-lo em

uma estante em posio vertical.

Com uma ala de arame (dimetro de 5 e 7 mm) tocar o centro da membrana

formada na superfcie, transferindo varias aladas para uma lmina de

microscpica.

Colocar 1 gota de Lugol e lamnula. Examinar no microscpio ptico em aumento

de 100x.

SOLUO DE SULFATO DE ZINCO (d= 1,18 g/mL)

- sulfato de zinco (ZnSo4) ------------------------------------------------------------------------- 330 g

- gua destilada-deionizada --------------------------------------------------------------------- 670 mL

Ajustar a densidade da soluo com densitmetro pela adio de sal ou gua e filtrar

em papel-filtro.

MTODO DE SEDIMENTAO ESPONTNEA EM AGUA

(MTODO DE LUZTZ, 1919; HOFFMAN, PONS E JANER, 1934)

Mtodo indicado para pesquisa de ovos e larvas de helmintos e cistos de

protozorios. Fundamenta-se na sedimentao espontnea em gua, havendo uma

necessidade mnima de vidrarias e sendo dispensvel o uso de reagentes e

centrifugao.

- Colocar cerca de 5g de fezes, coletados de vrias partes do bolo fecal, em um corpo

graduado ou em bequer de 250 mL. Completar o volume de 50 a 60 mL com gua

corrente e homogeneizar.

- Preparar a suspenso adicionando 100 mL de gua corrente.

- Filtrar essa suspenso de gaze dobrada quatro vezes, recolhendo-se em clices de

sedimentao com capacidade de 125 mL.

- Se necessria adicionar gua corrente at completar aproximadamente 3/4 do volume

do clice cnico. Deixar a suspenso em repouso durante 1 a 2 horas.

- Com uma longa pipeta capilar ou em canudo plstico, colher uma pequena poro do

sedimento e depositar sobre uma lmina de microscpica. Se o sedimento estiver muito

espesso, diluir com uma gota de soluo salina a 0,85% ou gua corrente.

- Colocar 1 gota de Lugol e cobrir com lamnula. Examinar no microscpio ptico em

aumento de 100 x.

OBS: A amostra pode ser sedimentada por um tempo maior, a fim de aumentar a

concentrao de cistos de protozorios e ovos leves de helmintos no sedimento.

MTODO MODIFICADO DE KATO-KATZ

(KATO, 1960; KATZ, CHAVES & PELLEGRINO, 1972)

um mtodo de esfregao espesso em celofane, amplamente utilizado na

rotina para determinar quantitativamente o nmero de ovos por grama de fezes (OPG).

- Colocar a amostra fecal sobre papel absorvente.

- Comprimir a tela metlica (60 ou 80 malhas) ou de nilon (105 malhas) sobre as

fezes, fazendo com que parte passe atravs das malhas.

- Remover as fezes que passam atravs das malhas e transferi-las para o orifcio de um

carto retangular (3 cm x 4 cm x 1,37 mm, com orifcio central de 6 mm de dimetro),

colocado sobre uma lmina de microscpica.

- Depois de preencher o orifcio do carto com a amostra, remov-lo com cuidado,

deixando as fezes na lmina.

- Cobrir as fezes com uma lamnula de celofane, invertendo e pressionando a lmina

sobre o papel absorvente.

- Deixar a preparao em repouso para clarificao da amostra durante 30 minutos a 34

- 40C ou temperatura ambiente por 1 a 2 horas.

- Examinar a preparao no microscpio ptico em aumento de 100 x.

- Contar o nmero de ovos.

- O nmero de ovos presentes na preparao multiplicado pelo fator 23 dar o nmero

de ovos por grama (OPG) de fezes.

SOLUO AQUOSA GLICERINADA DE VERDE MALAQUITA

- soluo aquosa de verde malaquita a 3% (m/v) ------------------------------------------- 1 mL

- soluo aquosa de fenol a 6% (m/v) -------------------------------------------------------- 100 mL

- glicerina -------------------------------------------------------------------------------------------- 100 mL

MTODO PARA ISOLAMENTO DE LARVAS DE NEMATIDEOS

(MTODO DE RUGAI, MATTOS & BRISOLA, 1954)

Este mtodo fundamenta-se no termo e hidrotropismo positivo das larvas de

nematdeos, indicado para pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis.

- Estender, sobre a abertura de um recipiente contendo fezes, gaze dobrada quatro

vezes, e repuxar as extremidades para trs.

- Encher, com aproximadamente 70 a 100 mL de gua corrente aquecida a 40 - 50 C,

um clice cnico de sedimentao (capacidade 125 mL).

- Transferir o recipiente com as fezes para o interior do clice de sedimentao, de

modo que o lquido alcance toda a extenso da abertura do recipiente, cuidando para

no haver formao de bolhas de ar.

- Deixar em repouso durante 60 minutos.

- Colher o sedimento entre lmina e lamnula no menor aumento do microscpio ptico,

ou em um vidro de relgio, com auxilio de uma lupa.

COPROTEST- Princpio: Centrfugo-sedimentao.- Finalidade: Pesquisa de ovos, cistos e larvas.

Abra o frasco cuidado cuidadosamente para no derramar o contedo;

Colher a amostra e colocar na cavidade do coletor;

Agite o frasco vigorosamente por mais ou menos 2 minutos;

Em um tubo graduado, colher 7 mL da amostra, acrescentando 1 gota de

detergente e 3 ml de acetato de etila comercial;

Tampe o tubo, agite e centrifugue a 1.500 RPM/ 2 minutos;

Despreze o sobrenadante com cuidado;

Acrescente 1 gota de lugol e 1 gota de soluo fisiolgica ao sedimento;

Ressuspenda o sedimento, colha 1 gota na lmina e cubra com lamnula;

Observar ao microscpio com aumentos de 10X e 40X.

PROCEDIMENTO DE ROTINA MICROBIOLOGICA

MICROBIOLOGIA

Nos ltimos 30 anos, a Microbiologia e Imunologia evoluram

extraordinariamente como cincia multidisciplinares, em relao estreita com a Biologia

Molecular.

No campo da Microbiologia Geral, enormes progressos foram realizados com

referncia anatomia qumica e morfolgica da clula bacteriana, biossntese da

macromolcula e gentica de m. o. Tudo isso contribui fundamentalmente Gentica

Moderna. (BIER, 1990).

OBJETIVOS

O objetivo dos estudos no setor de Microbiologia demonstrar aos alunos

estagirios uma viso ampla das principais tcnicas e mtodos dentro de um

laboratrio, com fins diagnsticos. Observa-se tambm uma padronizao e

simplificao da metodologia utilizada na identificao desses microorganismos.

MEIOS DE CULTURA

Para o cultivo de bactrias podem ser utilizados meios lquidos, slidos ou

semi-slidos. Meios lquidos permitem o crescimento indiferenciado de todas as

bactrias contidas na amostra promovendo turvao do meio. Meios slidos

possibilitam crescimento de amostras de bactrias puras. Sua consistncia slida

devido adio de gar e o simi-slido contm menor quantidade gar e utilizado

geralmente para verificar a motibilidade das bactrias.

Meio slido 1.5% de agar

Meio semi-slido 0.4% de agar

Classificao- Meio Diferencial Permitem a distino entre 2 ou mais tipos de bactrias pela

simples observao das caractersticas apresentadas pelas colnias que nele se

desenvolvem. Ex: gar Sangue; Meio de MacConkey.

- Meio Seletivo Meios que contm substancia capazes de inibir o crescimento de

determinados grupos de bactrias sem restringir o crescimento de outras. Ex: gar

Sangue; Meio de MacConkey.

- Meio de Enriquecimento Rico em nutrientes que proporcionam o aumento do

nmero de bactrias.

Preparo de Meios

Forma preparados meios de cultura, para utilizao durante o estagio, seguindo

a formula indicada pelo fabricante de cada meio.

Tcnicas de Semeadura

- Esgotamento Consiste em espalhar o material biolgico com auxilio da ala, fazendo estrias prximos at o esgotamento do material, para que haja um bom isolamento das

bactrias.

- Atapetamento Geralmente utilizado para contagem de bactrias de amostra urinaria,

onde utiliza-se a ala da Dirigalsky.

- Espalhamento Utilizado para espalhar todo o material biolgico por toda a placa,

com auxlio da ala de platina em, pelo menos, 3 sentidos.

- Semeadura em tubos Podem apresentar-se em forma de gar inclinado, lquidos ou

semi-slidos. Para a inoculao, usa-se a ala bacteriolgica e na transferncia de

cultura pura e placas para tubos usa-se agulha bacteriolgica.

Colorao de GRAM

A maioria das amostras colhidas, quando se suspeita de infeco bacteriana,

deve se aplacada a lminas de vidro, coradas pelo Gram e examinadas ao microscpio.

- A lmina fixada e tratada com soluo de cristal violeta 1 a 2 minutos;

- Lavar com gua e escorrer;

- Descorar rapidamente pelo lcool a 95%;

- Lavar com gua e escorrer;

- Cobrir com soluo de fucsina, durante 30 segundos para contra corar;

- Lavar com gua, secar com papel de filtro, observar na objetiva de imerso (100x).

Diferenciao de Bactrias Para bactrias Gram positivas faz-se a prova da catalase, onde reao positiva

indentifica Staphylococcus e a reao negativa identifica Streptococcus.

1) Identificao de Bacterias

- PROVA DA CATALASE Os staphylococcus produzem a enzima catalase

(peroxidase) que capaz de decompor o perxido de hidrognio (H2O2) em O2O.

Execuo: preparar um suspenso do crescimento bacteriano em H2O destilada

na superfcie da lmina e adicionar 1 a 2 gotas de H2O2 a 3%. O aparecimento de

bolhas indica reao positiva. O aparecimento de bolhas indica reao positiva.

Para a diferenciao entre as espcies de Staphylococcus, necessrio

proceder s provas bioqumicas, a partir de amostra isolada.

- PROCA DA COAGULASE A coagulase ligada esta localizada na superfcie da

parede clulas e reage com caldeias e do fibrinognio plasmtico, provocando a

formao de cogulo visvel, resultando em uma reao positiva.

Coagulase + - S. aureus

Coagulase - - S. epidemeridis ou S. saprophyticus

- PROVA DA DNASE Determina a atividade da enzima desoxirribonuclease produzida

por amostras de S. aureus.

Execuo: Semeadura da amostra em gar DNAase. Incubar a placa a 35

37C / 18-24 hs. Cobrir a placa com soluo de cido clordrico a 1N. Resultado positivo

se d pela formao de um halo ao redor da colnias e resultado negativo evidencia

truvao uniforme em toda superfcie do meio.

- TESTE DE SENSIBILIDADE NOVOBIOCINA Diferencia os staphylococcus

coagulase negativos de importncia mdica.

Execuo: Semeia-se o microorganismo em gar sangue e aplica-se disco de

Novobiocina. Incuubar a placa a 35 37 C / 18-24 hs. Formando-se um halo de

sensibilidade caracteriza-se presena de S. epidermidis.

ESQUEMA:

Catalase + - Staphylococcus

Catalase - - Staphylococcus

S. aureus S. epidermidis S. saprophyticusCoagulase + - -DNAase + - -Sensibilidade

Novobiocina

Sensvel Sensvel Resistente

2) Identificao de StreptococcusA designao mais utilizada tem por base os tipos de hemlise em placas de

gar sangue:

- Hemlise total - -hemoltico

- Hemlise parcial hemoltico

- Ausncia de hemlise Y hemoltico

As colnias podem ser repicadas para caldo HBI por 6 a 8 horas ou retiradas do

crescimento inicial em gar sangue para realizao das provas de identificao.

- TESTE CAMP Principio dado pela atividade hemoltica do staphylococcus

produtor de beta lisina em eritrcito fundamentada por um fator extracelular, de

constituio protica, produzida pelo estrephytococcus de grupo B, chamado fator

CAMP. Uma reao beta-hemoltica acentuada quando estes m.o. reagem

sinergicamente, em placas de gar sangue.

Execuo: Semeia-se uma estria de Staphylococcus aureus produtor de beta

lisina no centro de uma placa de gar sangue feita com sangue de carneiro. Estria,

perpendicularmente, o strephytococcus a ser identificado, de modo que as estrias no

se toquem. Incubar a placa a 37C/ 24hs. Um alargamento da zona do lise no ponto de

interseo entre as duas estrias, que toma a forma de ponta de lana, evidencia-se

prova positiva para S. agalactiae, strephytococcus Hemoltico do grupo B.

- PROVA DA BILE ESCULINA Os strephylococcus do grupo D em meio com

bile na concentrao de 4%, hidrolisam a esculina, originando a esculitina a qual reage

com citrato frrico contido no meio, provocando o escurecimento do meio em torno das

colnias.

Execuo: Semeia-se 2 a 3 colnias, da placa de gar sangue, em tubo com

gar bile esculina esculinado. Incubar a placa a 37 C/24hs. O escurecimento em torno

do crescimento evidencia-se prova positiva.

- PROVA DE TOLERNCIA A 6.5% DE NACL Os strephytococcus do grupo

D em meio contendo 6.5% de NaCl e modificam sua colorao so classificados como

enterococos , os negativos so os no enterococos.

Execuo: Inocula-se 2 a 3 colonias suspeitas em caldo HBI contendo 6.5% de

NaCl, 1% de glicose e um sistema indicador de pH. Incubar a placa a 37C/24hs. O

crescimento com conseqente mudana de colorao do meio indica se tratar de

amostras E. faecalis.

- TETE BA BACITRACINA Em concentrao de 0.04 mg, a bacitracina age

seletivamente sobre os strephytococcus hemoltico do grupo A de Lacenfield

inibindo a sntese do peptidoglicano e alterando a seletividade da membrana celular.

Com isso, impedindo que as bactrias se desenvolvam na regio do meio de cultivo

onde houve a difuso do sal, acarretando a formao de um halo de inibio.

Execuo: Inocular na superfcie de uma placa de gar sangue colnias

suspeitas, vindas do caldo HBI ou da placa incial. Aps secagem, aplica-se o disco de

bacitracina no centro da rea semeada, pressionando levemente para conferiir

aderncia. Incubar a placa a 37C/24hs. Resultado positivo para S. pyogens do grupo

A conferido com o aparecimento de um halo de inibio.

- TESTE DA OPTOQUINA A optoquina (cloridrato de estilhidrocuprena) altera

seletivamente a membrana celular do S. pneuminiae, servindo como os

estrephytococcus ao grupo viridans.

Execuo: Semear de 2 a 3 colonias da bactrias suspeita em plac de gar

sangue. Aps secagem, aplica-se o disco de optoquina, na concentrao de mg no

centro da rea semeada, pressionando levemente para conferir aderncia. Incubar a

placa a 37 C/24Hs, em jarra com vela. Crescimento de halo de inibio de 14 a 18 mm

indica sensibildade caracterisitca de S. pneumoniae. Em caso de resitencia optoquina

com bile sculina negativa, trata-se de S. viridans.

Enterobacteias (bastonetes Gram negativos)

Os bastonetes Gram negativos encontrados em laboratrios so classificados

em 2 grupos:

- Produo de cidos a partir da oxidao da glicose.

Principais gneros: Pseudomonas, Alcaligenes e Acinetobacter.

- Produo de cidos a partir da fermentao da glicose.

Principais genereos: famlia enterobacteriaceae (oxidase negativos) e os no

pertencentes a essa famlia (oxidase positivos).

PROVAS BIOQUMICAS- URIA

Determina a capacidade de um m. o. em degradar enzimaticamente molculas

de uria do meio, formando carbonato de amnia. A hidrlise catalisada de forma

especifica pela urase produzindo 2 molculas de amnia. O vermelho de fenol que

funciona como indicador, torna o meio rosa-avermelhado quando a reao for positiva.

- MILIa) LISINA Baseia-se na produo de lisina descarboxilase e liberao de gs

sulfdrico. A reao positiva favorecida com o aparecimento de cor prpura, que

coincide com a cor inicial do meio. Reao negativa caracterizada por uma colorao

amarelada. A produo de H2S evidenciada pelo aparecimento de um precipitado

negro.

b) MOTILIDADE Caracterizada pelo aparecimento de turvao uniforme em

toda extenso do meio. Bactrias imveis crescem apenas no local da inoculao.

c) INDOL evidenciado aps degradao do aminocido triptofano pelas

triptofanases. A positividade conferida pela adio do Reativo de Kovacs, onde se

forma um anel vermelho na camada superficial do meio.

- CITRATOBaseia-se na utilizao do citrato como nica fonte de carbono. Utiliza-se o

bromotimol como indicador de pH, que oferece colorao amarela em meio cido e azul

em meio alcalino.

- TSIDetermina a habilidade de um m. o. em utilizar carboidratos especficos

existentes no meio bsico com ou sem produo de gs ou H2S.

a) FERMENTAO DA GLICOSE Observa-se no fundo do tubo a

degradao protica que insuficiente para reverter o pH cido estabelecido, mantendo

o meio amarelo.

b) FERMENTAO DA LACTOSE E SACAROSE o tubo permanece amarelo

no pice do meio devido a alta concentrao de cidos produzidos.

c) PRODUO DE GS Evidencia-se o aparecimento de bolhas ou

rachaduras no meio.

d) PRODUO DE H2S- Reao com sulfato ferroso contido no meio,

resultando em um precipitado negro.

- FENILALANINAPara se fazer a leitura, deve-se adicionar 4 gotas de cloreto frrico que reage

com o cido fenilpirvico. Se positivo, promove colorao verde. Se negativo, promove

colorao amarela.

- VMPara se fazer a leitura, acrescenta-se 5 gotas de vermelho de metila, eu por ser

um indicador cido, indica o grau de acidez por modificao de cor. Reao positiva

dada por cor vermelha (pH = 4.5) e negativa com cor amarela (pH= 6.0).

- VP Evidencia a capacidade da bactria em produzir compostos neutros, a partir da

fermentao da glicose.

UROCULTURA- Coleta Faz-se assepsia no local antes da coleta. Coleta-se o segundo jato

usando frasco estril.

- Conservao Manter o material na geladeira pra inibir o crescimento bacteriano.

Meios de Culturaa) CLED Meio no seletivo, diferencial para fermentao da lactose, formando

colnias azuis quando lactose negativa.

Utiliza-se como tcnica de semeadura o mtodo da ala calibrada de 0.01uL ou

0.001 uL, para que se possa fazer a contagem das colonias e posteriormente

diagnosticar se h infeco ou no.

- abaixo de 10.000 ufc/mL contaminao

- entre 10.000 e 100.000 ufc/mL suspeita

- acima 100.000 ufc/mL infeco

TESTE DE SENSIBILIDADE ANTIMICROBIANOSI Preparo do Inoculo

Com o auxilio da ala, toca-se em uma colnia tranferindo-as pra um tubo de

soluo salina ou em caldo BHI para novo crescimento e depois em soluo salina.

Posteriormente compara essa turvao com a escala 0.5 de Mac Farland.

II SemeaduraUmedecer o swab estril no inoculo aferido e aplic-loo em varias direes na

placa com meio Mueller Hinton, obtendo cresciemnto uniforme.

III Tcnica Colocar os discos, com o auxilio de uma pina, pression-los levemente contra

a superfcie do meio, mantendo uma distancia de 20 mm da boda e de 30 mm entre

eles. Incubar a placa em posio invertida a 37C/ 18hs. A leitura deve ser feita com

halmetro ou rgua atravs do fundo da placa.

CULTURA DE SECREO VAGINAL E URETRALA coleta da secreo vaginal e da uretral feita no laboratrio, se utilizado de

cureta (para a vaginal) ou ala de platina (para a uretral).

Uma parte do material colocado em 1 mL de soluo salina estril, e outra

parte olocada na forma de esfregao na regio central de uma lamina para

microscpio. Este material, em lmina, observado em microscpio ptico ao aumento

de 1000 vezes com leo de imerso e descrito:

bactria (morfologia e Gram);

leveduras;

parasitas;

muco;

clulas epiteliais;

flora aplobionte.

Para essa observao utiliza-se a Colorao de Gram, que realizada nesse

esfregao aps o mesmo ter sido fixado passando-se lmina 3 vezes por sobre a

chama do bico de busen. Feito isso, em um suporte prprio, cobre-se a lmina com

uma camada de corante cristal violeta por aproximadamente 1 minuto; aps, recobre-se

a lmina com uma nova camada de lugol a 5% por mais 1 minuto. Em seguida

despreza-se o material que esta sobre a lmina e recobre-se a lmina com lcool

acetona, formando uma camada por sobre a lmina, por 1 minuto. Aps, enxaguar em

gua corrente. Em seguida, recobre-se, novamente, a lmina com fucsina para a

Colorao de Gram por mais 1 minuto. A seguir, lavar em gua corrente, colocar em

suporte prprio para escorrer e secar.

Aps feita a observao e determinados os parmetros, seguir o esquema

descrito abaixo:

ESTREPTOCOCOS NO BETAHEMOLITICO

Calatase (-)

(+)

Streptococcus sp

Caldo glicosado

gram

estreptococo

estafilococo Alfa ou gama hemolitico

Verificar registro de hemlise no g ar-sangue primario

(R) optoquina bile-esculina (-)

antibiograma

Verificar origem do material para originar provas

(S) optoquina bile solvel

Bile-escilina (+)

S. pneumoniase grupo D (S. faecalis e outros)

CULTURA DE FEZES (COPROCULTURA)

Para a realizao desse exame, as fezes so recolhias em recipiente prprio e

estril e entregues ao laboratrio num perodo Maximo de 2 horas aps a coleta.

No setor, com uma ala de platina, coletado uma poro das fezes e colocada

em caldo selenito, que vai estufa a 37 C por um perodo de 24 horas. Aps este

perodo, com uma ala de platina, recolhe-se parte desse caldo e semeia-se em estufas

a 37C por 24 horas. Havendo crescimento, faz-se o Gram e as provas bioqumicas

pertinentes conforme o esquema abaixo:

FEZES

CALDO SELENITO

BEM SS

GRAM

COCCOS BACILOS

NEG POS NEG POS

Tubo Rugai Sem importancia Tubo Rugai Calase

TSIclnica,

provavelmente TSI VM, VPMili contaminao Mili Plasmaco

Citrto CitratoHalo de hemlise

(R) a 6,5% NaCI(R) penicilia

(S) a 6,5% NaCI(S) penicilia

Indol Indol NitritoTSI

Citrato + = meio torna-se azul

TSI H2 S + = meio torna-se negro;

- Gs ++ aparecimento de bolhas no meio;

- Lactose += A/A ou A/K K= alcalina=vermelho

(+)= K/K A= cido=amarelo

Mili motilidade ++ observa-se o caminho da bactria no local da picada;

- lisina += o meio torna-se amarelo;

- indol += o reativo de Kovacs torna-se vermelho

CULTURA DE ESCARRO

Para a cultura do escarro, podemos encontrar apenas solicitaes de

bacterioscopia como, por exemplo, pesquisa de BK; mas quando a solicitao for de

cultura de escarro, devemos proceder como na cultura de secrees (exceto a coleta);

Nas pesquisa de BK fazemos um esfregao, na regio central de uma lmina,

de poro do escarro rica em material sanguinolento (hemoptase). Aps secar esse

esfregao com a lmina por sobre o a cham

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