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INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL
PERFIL MICROBIOLÓGICO E RESÍDUOS DE ANTIMICROBIANOS EM AMOSTRAS DE LEITE BOVINO DE PROPRIEDADES DA REGIÃO DE
CAMPINAS-SP
Aline Francielle da Silva dos Santos
Nova Odessa
Fevereiro – 2011
GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL
Perfil microbiológico e resíduos de antimicrobianos em amostras de leite bovino de propriedades da região de Campinas - SP
Aline Francielle da Silva dos Santos Orientador: Dra. Cláudia Rodrigues Pozzi
Nova Odessa Fevereiro, 2011
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação do Instituto de Zootecnia, APTA/SAA, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Produção Animal Sustentável.
Ficha elaborada pelo Núcleo de Informação e Documentação do Instituto de Zootecnia
Bibliotecária responsável – Ana Paula dos Santos Galletta - CRB8/7166
S233p Santos, Aline Francielle da Silva dos
Perfil microbiológico e ocorrência de resíduos de antimicrobianos em amostras de leite bovino em propriedades da região de campinas - SP. / Aline Francielle Da Silva Dos Santos. Nova Odessa - SP, 2010.
80p. : il.
Dissertação (Mestrado) - Instituto de Zootecnia. APTA/SAA. Orientador: Profª Dra Cláudia Rodrigues Pozzi
1. Mastite animal. 2. Bovinos - Doenças. I. Pozzi, Cláudia
Rodrigues. II. Título.
CDD 636.089 692
GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO
SECRETARIA DA AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL
CERTIFICADO DE APROVAÇÃO
PERFIL MICROBIOLÓGICO E RESÍDUOS DE ANTIMICROBIANOS
EM AMOSTRAS DE LEITE BOVINO DE PROPRIEDADES DA REGIÃO
DE CAMPINAS-SP
ALINE FRANCIELLE DA SILVA DOS SANTOS
Orientador: Dra. Cláudia Rodrigues Pozzi
Aprovado como parte das exigências para obtenção de título de MESTRE em Produção
Animal Sustentável, pela Comissão Examinadora:
Profª Dra. Cláudia Rodrigues Pozzi
Profº Dr. Jackson Barros do Amaral
Profº Dr. Roberto Bellizia Raia Júnior
Data da realização: 10 de Fevereiro de 2011.
Presidente da Comissão Examinadora Prof. Dra. Cláudia Rodrigues Pozzi
v
DEDICATÓRIA
À minha família incluindo meus pais Manoel e Luzia, pelo exemplo de amor e carinho; por nunca medirem esforços para proporcionarem a suas filhas condições de estudo, crescimento moral e
profissional; e minha irmã Camila pela amizade e apoio.
Ao meu esposo Fábio pelo seu companheirismo e dedicação; pelo intenso incentivo e apoio. Por ser sempre alguém com quem posso contar.
À minha orientadora Cláudia pela atenção e o cuidado com esta pesquisa, pelas instruções e correções, por ser uma orientadora no sentido real da palavra!
À minha amiga de todas as horas Thamires Martins, pela sua amizade sincera e por sua tão valiosa colaboração.
vi
AGRADECIMENTOS
À Deus, por ter me propiciado saúde e coragem para seguir em frente a cada dia. Por ter me acompanhado e ser o grande Autor de mais essa conquista. Aos idealizadores do Programa de Pós-Graduação em Produção Animal Sustentável, por fornecerem um curso voltado para as necessidades evidentes do setor. À Profª Dra. Cláudia Rodrigues Pozzi, pela orientação, ensinamentos, conselhos e incentivo ao longo desta importante etapa. À Profª Dra. Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro, pela constante colaboração, presença e apoio no desenvolvimento deste trabalho. Por sempre fazer o máximo que pôde. À companheira de laboratório Thamires Martins pela ativa participação, pela força e confiança mútua, descontração e companheirismo. Por ser alguém sempre dedicada e atenciosa, menina responsável e muito capaz. Muito Obrigada! Ao pesquisador Dr. Luis Alberto Ambrósio pelas instruções e pelos sábios ensinamentos estatísticos transmitidos. À pesquisadora Dra. Cecília José Veríssimo e ao Profº Dr. Roberto B. Raia Júnior pela participação na banca de qualificação com suas valiosas sugestões e apoio. Aos professores do Curso de Pós Graduação do Instituto de Zootecnia, pelos conhecimentos transmitidos, por proporcionarem oportunidade constante do nosso desenvolvimento teórico e técnico. A todos os pesquisadores do Instituto de Zootecnia setor Palmeira que de uma forma ou de outra contribuíram com este trabalho e com minha formação profissional. Aos funcionários do setor Palmeira, especialmente a Tereza, Ana Baião, Donizete, Creusa e Mariana, profissionais que tenho alta consideração e que nunca mediram esforços no auxílio à pesquisa e na solução de imprevistos, fazendo do planejado uma realidade. A todos que colaboraram com as etapas deste projeto incluindo as coletas e as análises laboratoriais. Aos colegas de pós-graduação pelos momentos de estudo, colaboração e amizade. Aos proprietários das fazendas por permitirem a inclusão dos dados de cada propriedade neste trabalho. Ao Instituo de Zootecnia pelo apoio e pelas instalações. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP pelo apoio financeiro para a execução deste projeto.
vii
"A maior vitória é derivada da satisfação interna de saber que você fez o seu melhor e
que você obteve o máximo daquilo que você deu.”
(Howard Cosell)
“O aprendizado nunca termina. Não existe parte da vida que não contenha lições. Se você está vivo, há lições para aprender.“
(Autor Desconhecido)
“A senda por onde Deus guia, pode estender-se através do deserto ou do mar, mas é
sempre um caminho seguro.”
(Ellen White)
viii
SUMÁRIO
RESUMO X
ABSTRACT XI LISTA DE FIGURAS XII LISTA DE TABELAS XIII LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS XV
1 INTRODUÇÃO 1
2 REVISÃO DE LITERATURA 3
2.1 Mastite 3 2.1.1 Mastite clínica e subclínica 3 2.1.2 Células somáticas 5 2.1.3 Imunidade da glândula mamária 8 2.1.4 Microrganismos causadores de mastite 9 2.1.5 Resíduos de antimicrobianos no leite 19 2.1.6 Testes para detecção de resíduos de antimicrobianos 24
3 MATERIAL E MÉTODOS 27
3.1 Material 27 3.1.1 Animais e localização das propriedades leiteiras 27 3.1.2 Características gerais das propriedades leiteiras 28 3.1.3 Esquema de colheita das amostras de leite 29
3.2 Métodos 29 3.2.1 Avaliação da ocorrência de mastite clínica e subclínica 29
3.2.2 Avaliação da presença de resíduo de antimicrobiano no leite 32 3.2.3 Análise estatística 32
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 33
4.1 Mastite clínica 33
4.2 Mastite subclínica 35
4.3 Contagem de células somáticas (CCS) nos tanques de resfriamento 37
4.4 Contagem de células somáticas (CCS) nos balões coletores 39
4.5 Contagem de células somáticas (CCS) nos balões coletores e California Mastitis Test (CMT) 43
ix
4.6 Isolamentos de agentes causadores de mastite 44
4.7 Escores do California Mastitis Test (CMT) e isolamentos microbiológicos 52
4.8 Resíduos de antimicrobianos 54 4.8.1 Resíduos de antimicrobianos nos tanques de resfriamento 54 4.8.2 Resíduos de antimicrobianos nos balões coletores 55 4.8.3 Resíduos de antimicrobianos nos quartos mamários 56 4.8.4 Resíduos de antimicrobianos e CMT 60
5. CONCLUSÕES 62
x
RESUMO
Perfil microbiológico e resíduos de antimicrobianos em amostras de leite bovino de
propriedades da região de Campinas - SP
O presente estudo foi conduzido para avaliar o perfil microbiológico e ocorrência de resíduos de antimicrobianos em amostras de leite provenientes de cinco propriedades leiteiras de uma linha de coleta de leite da região metropolitana de Campinas – SP. Foi avaliada a ocorrência de mastite clínica e subclínica pelo exame dos quartos mamários das fêmeas em lactação, utilizando-se os testes de triagem Tamis e CMT, respectivamente. Amostras de leite foram colhidas dos quartos mamários para isolamento e identificação dos agentes causadores de mastite. A contagem de células somáticas foi realizada nas amostras de leite dos balões coletores e tanques de resfriamento. A presença de resíduos de antimicrobianos foi avaliada nas amostras de leite dos quartos mamários, balões medidores e tanques de resfriamento através do teste microbiológico (Delvotest® SP). Os resultados apresentados pelo trabalho mostraram uma ocorrência de mastite clínica nas propriedades entre 2,32 a 16,66%. A propriedade B apresentou no segundo período de colheita de amostras 40,42% dos animais com escore máximo de CMT. As contagens de células somáticas nos tanques de resfriamento variaram entre 221 a 1.124 x 1000 cél./mL. Os resultados da CCS dos balões coletores e os níveis de CMT dos quartos mamários foram significantes (P<0,05), indicando que as diferenças na ocorrência de CMT foram associadas às classes de CCS. O perfil de isolamento das amostras apresentou 41,98% de resultados positivos. O maior número de patógenos isolados foram os dos gêneros Staphylococcus spp. (55,75%), Corynebacterium spp. (24,60%) e Streptococcus spp. (16,73%). A frequência de quartos mamários com isolamentos e níveis de CMT foi significante (P<0,05), indicando que as diferenças na ocorrência de isolamentos positivos e negativos foram associadas aos níveis de CMT. Os escores 2 e 3 de CMT ocorreram em maior porcentagem de quartos mamários com isolamentos positivos. A análise estatística para as frequências de quartos mamários com isolamentos em cada propriedade foi significante (P<0,05), indicando que as diferenças na ocorrência de isolamentos positivos e negativos foram associadas às características das propriedades. A análise de resíduos de antimicrobianos nos balões coletores e quartos mamários mostraram 8,33% e 4,30% de amostras no nível positivo, respectivamente. A análise estatística para as frequências de quartos mamários com CMT e níveis de resíduo, somando os escores 1 e 2 de CMT, foi significante (P<0,05). O CMT escore 3 ocorreu em maior porcentagem quando o resíduo foi positivo. Foi detectada a presença de resíduos de antimicrobianos em 5% dos tanques de resfriamento. Os resultados encontrados destacam a necessidade da implantação de políticas concentradas na atenção à qualidade do leite. Palavras-chave: Mastite, resíduos de antimicrobianos, contagem de células somáticas, California Mastitis Test.
xi
ABSTRACT
Microbiological profile and occurrence of antimicrobial residues in milk samples from
cows in the region of Campinas – SP
This study was conducted to evaluate the microbial profile and occurrence of antimicrobial residues in milk samples from five dairy farms a line of milk collection in the metropolitan region of Campinas - SP. We assessed of occurrence of clinical and subclinical mastitis by examination of the mammary glands of lactating females, using screening tests Tamis and CMT, respectively. Milk samples were collected from the mammary glands for isolation and identification of the causative agents of mastitis. The somatic cell count was performed on milk samples of balloons collectors and cooling tanks. The presence of antimicrobials was evaluated in samples of milk from mammary glands, balloons meters and cooling tanks through microbiological testing (Delvotest® SP) The results presented by the study showed an incidence of clinical mastitis on properties between 2.32 to 16.66%. Property B presented in the second period of sampling 40.42% of animals with a maximum score of CMT. The somatic cell counts in cooling tanks ranged from 221 to 1.124 x 1.000 cells/mL. The results of the CCS balloons collectors and CMT levels of mammary quarters were significant (P <0.05), indicating that differences in the occurrence of CMT are associated with classes of CCS. The profile of isolation of the samples showed 41.98% positive results. The greatest number of pathogens were isolated from the genera Staphylococcus spp. (55.75%), Corynebacterium spp. (24.60%) and Streptococcus spp. (16.73%). The frequency of mammary quarters with CMT and levels of isolation was significant (P <0.05), indicating that differences in the occurrence of positive and negative isolates were associated with levels of CMT. Scores 2 and 3 CMT occurred in a higher percentage of mammary quarters with positive isolations. Statistical analysis for the frequencies of mammary quarters with isolates of each property was significant (P <0.05), indicating that differences in the occurrence of positive and negative isolates were associated with characteristics of the properties. The analysis of antimicrobials in balloons collectors and mammary glands showed 8.33% and 4.30% of samples in the positive level, respectively. Statistical analysis for the frequencies of mammary quarters with CMT and residue levels, adding the scores of CMT 1 and 2 was significant (P <0.05). The CMT score of 3 occurred in higher percentages when the residue was positive. We detected the presence of residues of antibiotics in 5% of the cooling tanks. The results highlight the need to implement policies focused on attention to quality of milk. Keywords: Mastitis, residues of antibiotics, somatic cell count, California Mastitis Test.
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Localização das propriedades leiteiras na região metropolitana de Campinas-SP.............................................................................................................................................27
Figura 2 - Esquema do cronograma utilizado para realização das coletas .............................29
Figura 3 - Frequência relativa de ocorrência de mastite clínica de vacas em lactação de propriedades leiteiras na região metropolitana de Campinas-SP, 2010 .................................34
Figura 4 - Frequência relativa (%) dos escores negativo e positivo ao California Mastitis Test (CMT) dos quartos mamários de vacas em lactação nas propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010 ................................................................................... 37
Figura 5 – Contagem de células somáticas nos tanques de resfriamento das propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010........................................................38
Figura 6 - Contagem de células somáticas (CCS) nos balões coletores de propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010........................................................41
Figura 7 - Frequência relativa (%) das classes de CCS dos balões coletores em funções dos escores de CMT dos quartos mamários nas propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas–SP, 2010...............................................................................................................44
Figura 8 - Frequência relativa (%) de ocorrência do gênero Staphylococcus spp. nas amostras de leite dos quartos mamários das vacas em lactação............................................................ 48
Figura 9 - Perfil de isolamentos dos gêneros de leveduras e fungos filamentosos nas amostras de leite de quartos mamários de vacas em lactação................................................ 49
Figura 10 - Frequência relativa (%) de isolamentos negativos e positivos de agentes causadores de mastite nas propriedades da região metropolitana de Campinas-SP, 2010. Teste Qui – quadrado P <0,05.................................................................................................51
Figura 11 – Frequência relativa (%) de quartos mamários com isolamentos negativos e positivos frente aos escores de CMT ..................................................................................... 53
Figura 12 – Resíduos de antimicrobianos em amostras de leite de balões coletores de vacas em lactação de propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas – SP, 2010.........................................................................................................................................56
Figura 13 – Resíduos de antimicrobianos em amostras de leite de quartos mamários de vacas em lactação de propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas – SP, 2010.........................................................................................................................................57
Figura 14 – Frequência relativa (%) de escores de CMT de quartos mamários e resíduos antimicrobianos.......................................................................................................................61
xiii
LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Características de produção das propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010..................................................................................................................28 Tabela 2 - Características de manejo, higiene de ordenha, medidas de prevenção e controle de mastite nas propriedades leiteiras localizadas na região metropolitana de Campinas-SP, 2010......................................................................................................................................... 28 Tabela 3 - Frequência relativa (%) da ocorrência de mastite clínica de vacas em lactação em lactação de propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010..........................................................................................................................................33 Tabela 4 - Frequência relativa (%) dos escores do California Mastitis Test (CMT) dos quartos mamários de vacas em lactação nas propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010..................................................................................................................35 Tabela 5 - Frequência relativa (%) dos escores negativo e positivo no California Mastitis Test (CMT) dos quartos mamários de vacas em lactação nas propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010......................................................................................36 Tabela 6 - Contagem de células somáticas (CCS) nos tanques de resfriamento de propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010...................................38 Tabela 7 - Frequência relativa (%) da contagem de células somáticas (CCS) de balões coletores de leite de vacas em lactação das propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010..................................................................................................................40 Tabela 8 - Contagem de células somáticas (CCS) nos balões coletores de propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010.........................................................40 Tabela 9 – Frequência relativa (%) das classes de CCS dos balões coletores em funções dos escores de CMT dos quartos mamários nas propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010..................................................................................................................43 Tabela 10 - Frequência absoluta e relativa (%) de isolamentos microbiológicos das amostras de leite dos quartos mamários de vacas em lactação de propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010......................................................................................45 Tabela 11 - Frequências absoluta e relativa (%) dos agentes causadores de mastite nas amostras de leite dos quartos mamários de vacas em lactação de propriedades de leite da região metropolitana de Campinas-SP, 2010...........................................................................46 Tabela 12 - Frequência relativa (%) de ocorrência do gênero Staphylococcus spp. nas amostras de leite dos quartos mamários das vacas em lactação...............................................48
xiv
Tabela 13 – Frequências absoluta e relativa (%) de isolamentos negativos e positivos de agentes causadores de mastites nas propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010................................................................................................................. 50 Tabela 14 – Escores de CMT, frequências absoluta e relativa (%) dos isolamentos negativos e positivos de agentes causadores de mastite..............................................................................52 Tabela 15 - Resíduos de antimicrobianos em amostras de leite de tanques de resfriamento em propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas - SP, 2010.................................54 Tabela 16 - Resíduos de antimicrobianos em amostras de leite de balões coletores de vacas em lactação de propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas – SP, 2010..........................................................................................................................................55 Tabela 17 - Resíduos de antimicrobianos em amostras de leite de quartos mamários de vacas em lactação de propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas – SP, 2010..........................................................................................................................................57 Tabela 18 – Frequência absoluta de escores de CMT de quartos mamários e resíduos antimicrobianos........................................................................................................................61
xv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AOAC – Association of Analytical Communities
APHA – American Public Health Association
CBT – Contagem bacteriana total
CCS – Contagem de células somáticas
cél./mL – células por mililitro
CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência
CMT – California Mastitis Test
DIPOA – Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal
ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FDA – Food and Drug Administration
I.N.- Instrução Normativa
LMR – Limite máximo de resíduo
MAPA – Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento.
MERCOSUL – Mercado Comum do Sul
mg/L – miligrama por litro
µl - microlitro
p.p.m – parte por milhão
p.p.b – parte por bilhão
UFC – Unidades formadoras de colônias
UHT – Ultra-high-temperature
YEPG – Yeast extract peptona agar
WMT – Wisconsin Mastitis Test
xvi
1
1 INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de medidas para uma produção sustentável tem sido assunto de
interesse público e privado, incluindo a comunidade científica. No setor agropecuário são de
extrema importância a adoção de estratégias que visem maximizar a produção, minimizar
custos e impactos ao meio ambiente e assegurar produtos de qualidade aos consumidores.
Dentro deste contexto, a atenção ao tratamento eficaz da mastite e também da aplicação de
medidas eficientes de prevenção e controle, dentre outros fatores, são formas de assegurar a
produção de leite de forma sustentável e garantir a qualidade do produto final.
Para atender a crescente demanda de mercados cada vez mais exigentes e garantir a
segurança alimentar o Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), por
intermédio do Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal (DIPOA) publicou
a Instrução Normativa Nº 51 – IN Nº 51 no ano de 2002. O regulamento normatiza a
produção de leite por segmento produtor, estabelece critérios e parâmetros de identidade e
qualidade do leite desde a ordenha, o resfriamento na propriedade rural e seu transporte a
granel. Estão incluídos no regulamento índices mais rígidos de contagem de células
somáticas (CCS), contagem bacteriana total (CBT), detecção de resíduos de antimicrobianos
e estabelecidos prazos em diferentes regiões do país para adequação dos produtores às
normas. Na região Sudeste espera-se que até meados de 2011 as contagens de células
2
somáticas no leite atinjam índices máximos de 400.000 cél./mL e contagem bacteriana total
até 100.000 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL, além dos limites máximos de
resíduos de antibióticos atendam aos preconizados no Programa Nacional de Controle de
Resíduos de Antimicrobiano (BRASIL, 2010).
Diversos trabalhos têm destacado a importância da implantação de políticas de
controle neste setor. Assim, acredita-se na melhor remuneração do produtor por parte da
indústria e consequentemente a melhoria da qualidade do leite consumido no Brasil. Dentro
deste contexto, o trabalho teve por objetivo geral avaliar o perfil microbiológico e a
ocorrência de resíduos de antibióticos no leite de vacas em lactação em propriedades leiteiras
da região de Campinas. Foram incluídos como objetivos específicos: avaliar a ocorrência de
mastite clínica nos quartos mamários de vacas em lactação através do teste Tamis, avaliar a
ocorrência de mastite subclínica nos quartos mamários de vacas em lactação através do CMT,
proceder à contagem de células somáticas (CCS) no leite do tanque de resfriamento e balões
medidores, avaliar o perfil microbiológico das amostras de leite dos quartos mamários das
vacas em lactação e avaliar a presença de resíduos de antimicrobianos em amostras de leite de
tanques de resfriamento, balões medidores e quartos mamários das vacas em lactação.
Espera-se que os resultados apresentados venham a contribuir com a melhoria de políticas
públicas no controle e prevenção das mastites e ocorrência de resíduos de antimicrobianos no
leite.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Mastite
A mastite é um processo inflamatório da glândula mamária que afeta de forma
abrangente a pecuária leiteira nacional e internacional. Esta enfermidade é responsável por
desencadear efeitos negativos sobre quantidade e a qualidade do leite (SHIM; SHANKS;
MORIN, 2004; WILSON et al., 2004; CHAGUNDA et al., 2006; CAO et al., 2007). A
resposta inflamatória é decorrente de uma reação a injúria e pode ser provocada por agentes
físicos, químicos ou biológicos. Entretanto, o processo inflamatório que ocorre na glândula
mamária mais prevalente entre os rebanhos leiteiros é de origem infecciosa (COSTA et al.,
2000a).
2.1.1 Mastite clínica e subclínica
O processo inflamatório se inicia quando a dilatação e a permeabilidade vasculares
aumentadas se combinam com a ativação de leucócitos circulantes, a fim de promover a
passagem de fluidos e células para os espaços teciduais. Os quatro sinais cardinais presentes
na inflamação aguda, enunciados por Celsus, estão presentes na mastite caracterizada na sua
4
forma clínica: o rubor, o tumor, o calor e a dor. A mastite clínica se manifesta através dos
sinais específicos da inflamação na glândula mamária e pode ou não estar acompanhada de
sinais sistêmicos. Enquanto a glândula torna-se edemaciada e avermelhada com aumento da
sensibilidade na palpação, o leite começa a apresentar alterações visíveis como a presença de
grumos, pus e aquosidade; os quais, por definição, são os sintomas clássicos de mastite
clínica (ANDERSON; WESEN; FETROW, 1991; BARNOUIM et al., 2005; ZHANG et al.,
2007; ZHAO e LACASSE, 2008).
Outra forma de apresentação, denominada de mastite subclínica, caracteriza-se pela
ausência de alterações visíveis no leite ou no úbere. Esta é a manifestação mais comum da
doença nos rebanhos modernos, acometendo entre 20% a 50% das vacas de um rebanho. As
perdas econômicas decorrentes da mastite subclínica são de difícil avaliação, mas os
especialistas concordam com o fato de que os custos com esta forma da doença são maiores
do que os custos com a mastite clínica. Assumindo uma prevalência média de 45%, a mastite
subclínica é estimada como causadora de prejuízos de U$180 a U$320 por caso.
Aproximadamente 70% destes prejuízos estão associados à redução da produção de leite
(ZHAO e LACASSE, 2008). Em grande parte esta redução na produção é consequencia dos
danos irreversíveis causados ao tecido mamário pelo processo inflamatório (OLIVER e
CALVINHO, 1995). Embora os antimicrobianos sejam muito úteis para o tratamento da
infecção, não agem diretamente na proteção da glândula às injúrias provocas pelos
microrganismos (ZHAO e LACASSE, 2008).
Segundo Philpot e Nickerson (1991) para cada caso clínico de mastite devem existir
entre 15 a 40 casos subclínicos. A mastite subclínica ocorre em todos os rebanhos leiteiros do
Brasil. Vários levantamentos realizados a partir de 1970 indicam alta prevalência desta
doença, com índices variando de 11,9% a 58,8% de vacas infectadas por rebanho. Além da
produção de leite, outras características produtivas como a produção de gordura e a duração
da lactação também são afetadas (PEREIRA; MACHADO; SARRÍES, 2001).
A mastite subclínica é caracterizada por um processo inflamatório moderado
resultante do desequilíbrio entre a patogenicidade do agente infeccioso e os mecanismos
celulares de defesa do animal (MECDONALD, 1979), os quais contribuem
5
consequentemente para o aumento variável da contagem de células somáticas (CCS) no leite.
Este aumento decorre principalmente da migração dos neutrófilos polimorfonucleares para o
úbere, a fim de eliminar o invasor. Estas células são componentes da imunidade inata e
correspondem à primeira linha de defesa contra as infecções bacterianas. Neste processo de
eliminação dos patógenos, os neutrófilos podem também causar injúria aos tecidos adjacentes
através do extravasamento intracelular de moléculas resultando em destruição do tecido
alveolar, redução nos índices de produção e alteração na composição do leite (BOUTET et
al., 2004; CUNHA et al., 2006). Para a detecção de mastite subclínica é necessário a
utilização de testes auxiliares, mas subjetivos, como: o California Mastitis Test (CMT), o
Wisconsin Mastitis Test (WMT), a condutividade elétrica do leite (NORBERG, 2004) ou um
teste objetivo como a contagem de células somáticas (CCS).
2.1.2 Células somáticas
As células somáticas são constituídas principalmente de dois tipos: células epiteliais
e células brancas. As células epiteliais estão presentes normalmente no leite e predominam
em glândulas não infectadas. As células brancas que predominam em uma glândula normal
não infectada são os macrófagos e na glândula mamária infectada predominam
principalmente os neutrófilos. Em mastites agudas os neutrófilos podem representar 100%
das células encontradas no leite e nas mastites crônicas as células T podem predominar. Os
linfócitos perfazem de 20 a 40% do total de células e o restante corresponde a macrófagos e
células epiteliais descamadas (PAAPE et al., 1979; DANIEL et al., 1991; ØDEGA°;
KLEMETSDAL, HERINGSTAD, 2003).
A elevada CCS afeta diretamente a qualidade do leite, pois está associada com
alterações nas proteínas, mudanças na composição dos ácidos graxos, lactose, concentração
de íons e minerais, aumento das atividades enzimáticas e pH do leite cru (WILSON;
GONZALEZ; DAS, 1997; OGOLA; SHITANDI; NANUA, 2007). A contagem de células
somáticas (CCS) no leite é o indicador mais usado em programas de controle e prevenção da
mastite em todo o mundo. Vários fatores podem influenciar a variação da CCS, sendo citadas
a ordem de parto, período de lactação, mês e estação do ano (CUNHA et al., 2008). No
6
entanto, a ocorrência de infecção na glândula mamária é o principal fator responsável pela
variação das CCS (HARMON, 1994).
Klastrup (1975) considerou a contagem de células somáticas (CCS) de até 300.000
cél./mL como máximo razoável para indicar o quarto mamário não infectado, pois o limite de
400.000 a 500.000 cél./mL incluia animais com isolamento de patógenos. Já Reichmuth
(1975) observou que contagens acima de 200.000 cél./mL aumenta significativamente a
probabilidade de isolamento de patógenos.
A contagem de células somáticas no tanque de resfriamento é essencialmente
influenciada pela prevalência e incidência de mastite clínica e subclínica, mas também
depende de fatores como parição, estágio da lactação, tipo de manejo e fatores ambientais,
como por exemplo, temperatura, umidade e estação do ano (OLDE RIEKERINK;
BARKEMA; STRYHN, 2007). A correlação entre a CCS média no tanque e a ocorrência de
mastite é alta e varia de 0,50 a 0,96. Sendo assim, a contagem de células somáticas (CCS) é
um indicador importante, principalmente, de mastite subclínica e uma ferramenta para a
avaliação do leite em termos de qualidade, higiene e também para o controle da doença
(EMANUELSON e FUNKE, 1991).
A baixa contagem de células somáticas confere ao leite qualidade sanitária e de
manejo e consequentemente confere maior valor na comercialização. Em países como os
Estados Unidos, Nova Zelândia e Austrália são requeridos índices na CCS menores que
400.000 cél./mL em todo o território nacional. Já no Canadá o índice é de 500.000 cél./mL
(SCHAIK; LOTEM; SCHUKKEN, 2002).
No Brasil, a utilização desta ferramenta na avaliação da qualidade do leite
produzido iniciou-se em 2005, após publicação da Instrução Normativa número 51 do
Ministério de Agricultura (MAPA) que estabeleceu prazos para adequação aos padrões de
CCS para as diferentes regiões do país, sendo as contagens de até 400.000 cél./mL o índice
máximo aceito pela fiscalização a partir de julho de 2011, para as regiões Sul, Sudeste
Centro-oeste (BRASIL, 2002). Entretanto, embora a elevação na CCS possa ser usada como
um indicativo para avaliação da saúde do úbere (KOIVULA et al., 2005), bem como para a
7
avaliação da resposta à infecção (HERINGSTAD et al., 2006), ela por si só é incapaz de
determinar uma infecção com total eficiência, isto porque os agentes infecciosos são
responsáveis por elevações variáveis na CCS (MALINOWSKI et al., 2006). Tanto na mastite
clínica como na subclínica os agentes podem causar desvios na curva de CCS, e tem sido
observado que patógenos específicos envolvidos nos casos de mastite clínica afetam a curva
diferentemente (HAAS et al., 2004).
Malinowski et al. (2006) ao avaliarem 18.713 amostras de leite constataram que
alguns agentes podem estar presentes mesmo em CCS abaixo do índice considerado
internacionalmente como fisiológico (200.000 cél./mL), indicando que a presença do agente
nem sempre recruta as células de defesa de forma aguda. Entretanto, a elevação exorbitante
na CCS está intimamente ligada às mastites causadas por Arcanobacterium pyogenes,
coliformes, Streptococcus agalactiae, fungos e leveduras, e Prototheca spp., estas últimas
espécies chegaram a apresentar entre 2 a 10 milhões de cél./mL
O California Mastitis Test (CMT) é utilizado na rotina de fazendas e é muito útil na
avaliação de mastites subclínicas e fornece uma estimativa do conteúdo de células somáticas
presentes no leite. O detergente iônico, um dos componentes do reagente utilizado no CMT,
rompe as células liberando os ácidos nucléicos celulares que, em contato com o detergente,
formam um complexo que modifica a viscosidade da mistura. Schalm, Carrol e Jain (1971)
estabeleceram cinco níveis de reação e relacionaram com o número de células somáticas
presentes no leite: negativo (máximo de 200000 cél./mL e 25% de polimorfonucleares); traço
ou suspeito (150.000-500.000 cél./mL, com 30 a 40% de polimorfonucleares), uma cruz ou
fracamente positivo (500.000-1.500.000 cél./mL, com 40 a 60% polimorfonucleares), duas
cruzes ou positivo (800.000 – 5.000.000 cél./mL, com 60 a 70% de polimorfonucleares) e três
cruzes ou fortemente positivo (com mais de 2.500.000 cél./mL, com 70 a 80% de
polimorfonucleares). Costa et al. (1996b) comparando a prova do CMT e o exame
microbiológico, encontraram uma concordância de 70,97% em 5.047 exames realizados,
confirmando o CMT como método auxiliar de diagnóstico de mastite. Entretanto, embora o
CMT seja um método eficiente ele também não reflete totalmente a situação; reações falso-
positivas e falso-negativas podem acontecer. Isto pode ser devido à subjetividade do teste.
Falso-positivos, associada com baixa especificidade, ocorrem quando há a presença de
8
células somáticas, mas não há a presença de agente infeccioso. A reação falso-negativa,
associada com baixa sensibilidade, ocorre quando o agente está presente na glândula, mas as
células somáticas não estão (DINGWELL et al, 2003). Neste caso, o processo infeccioso não
desencadeou uma resposta inflamatória, e os animais são considerados portadores
assintomáticos ou com a presença de uma infecção latente na glândula mamária. Reichmuth
(1975) salientou a importância de não confundir infecção com doença, uma vez que a
infecção é necessária para o desenvolvimento da doença, mas não o único componente para a
manifestação mórbida. Recomenda-se a utilização dos testes CMT, CCS e exames
bacteriológicos em programas de controle de mastites (DELLA LIBERA et al., 2003).
A mastite é resultado da falência de uma complexa relação entre três fatores:
resistência do hospedeiro, patógeno e meio ambiente. Os fatores de risco para esta infecção
no úbere podem ser inerentes ao animal ou decorrentes do ambiente. O primeiro inclui fatores
fisiológicos, imunológicos e anatômicos; o segundo inclui temperatura, estação do ano,
higiene, tipo de ordenha, nutrição, entre outros (WHIST; ØSTERA; SOLVERØD, 2006).
2.1.3 Imunidade da glândula mamária
A imunidade da glândula mamária é mediada por uma variedade de mecanismos
inespecíficos ou inatos e específicos que atuam isoladamente ou em conjunto para proteger o
úbere de infecções. O primeiro deles está constituído por barreiras físicas que incluem canal e
esfíncter do teto, os quais possuem propriedades defensivas como um mecanismo de oclusão
relativamente eficiente, a roseta “Furtenberg’s” e proteínas bactericidas (HILLERTON,
1996). Um mecanismo adicional de defesa do teto citado por Nickerson (1985) é o seu
revestimento por uma camada de queratina (composta por células epiteliais descamadas,
ácidos graxos e proteínas catiônicas).
A forma mais frequênte de infecção da glândula é através da cisterna do teto e
ocorre depois que a primeira linha de defesa da glândula mamária constituída pelo canal e
esfíncter do teto é vencida. Embora a queratina do epitélio aja como uma barreira física e
química contra a penetração de microrganismos, esta não é sempre uma barreira suficiente
9
(ZHAO e LACASSE, 2008). Uma vez que o agente patogênico atravessa o canal do teto
passam a atuar fatores solúveis e as células fagocitárias da imunidade inespecífica. Dentre os
fatores solúveis a enzima lactoperoxidase é um dos mais importantes, por sua ampla ação
bactericida. As células somáticas representadas pelos neutrófilos são atraídas para o leite em
consequência da infecção e são atraídas por um complexo sistema, representadas
principalmente pelo sistema complemento (fragmento C5a). Quando o ambiente da glândula
mamária é favorável para o estabelecimento e multiplicação dos agentes infecciosos, os
produtos resultantes do metabolismo causam uma resposta inflamatória. A inflamação é
necessária para eliminar o microrganismo e restabelecer o equilíbrio no tecido mamário
(BENITES; MELVILLE; COSTA, 2003). O recrutamento de leucócitos para o tecido é um
fator importante deste processo, onde são também os responsáveis pela fagocitose dos
microrganismos (CUNHA et al., 2006). Durante o processo de infecção, as enzimas podem
destruir o epitélio mamário e favorecer o extravasamento de fluidos e células para o leite. As
células epiteliais da glândula mamária podem ser destruídas devido a: 1) ação dos produtos
celulares e extracelulares dos patógenos, 2) enzimas lisossomiais e produtos oxidativos
gerados durante a fagocitose e 3) proteases do sangue e linfocinas decorrentes da resposta
imune. O número de células somáticas no leite aumenta com a destruição do tecido mamário
e a intensidade da infecção, os alvéolos da glândula perdem a integridade estrutural e a
barreira sangue-leite é quebrada. Estes fluidos extracelulares extravasam para o leite e
mudanças visíveis no leite começam a ocorrer (ZHAO e LACASSE, 2008). Embora a
imunidade celular tenha um papel importante no desencadeamento e manutenção da resposta
imune, a fagocitose encontra-se prejudicada pela saturação das células fagocitárias com
micelas de caseína e glóbulos de gordura. Além disso, a população local de células
produtoras de anticorpos é reduzida na glândula mamária. Por isto, a maior parte das células
imunitárias presentes neste órgão tem origem sistêmica, chegando à glândula como
consequencia de uma agressão infecciosa.
2.1.4 Microrganismos causadores de mastite
Nas suas principais formas de apresentação, clínica e subclínica, já foram isoladas
cerca de 150 espécies de microrganismos responsáveis por sua etiologia (MALINOWSKI et
al., 2006; LOPES et al., 2008). Estão incluídos na lista os fungos filamentosos, leveduras,
10
algas, vírus e principalmente as bactérias. Estes microrganismos são classificados como
contagiosos ou ambientais dependendo da forma de transmissão (COSTA et al., 2000a;
ZHAO e LACASSE, 2008).
Os microrganismos contagiosos necessitam do animal para sobreviver, multiplicam-
se na glândula mamária, canal do teto ou sobre a pele e são transmitidos de uma vaca
infectada para uma vaca sadia principalmente durante a ordenha; a infecção por estes agentes
classifica a mastite também como contagiosa. As infecções contagiosas tendem a ser
subclínicas, de longa duração e apresentam elevadas contagens de células somáticas. As
mastites ambientais são causadas por microrganismos oportunistas que estão presentes no
ambiente em que o animal vive: cama, água, pasto, lama, vegetais em decomposição, entre
outros. A infecção da glândula por microrganismos ambientais pode ocorrer no período entre
as ordenhas ou durante a ordenha (COSTA et al., 2000a). A mastite ambiental se apresenta
principalmente na forma clínica, tem curta duração e tem baixa contagem de células
somáticas.
Dos agentes contagiosos, os gêneros mais prevalentes são Staphylococcus,
Streptococcus, Corynebacterium e Mycoplasma (YAMAMURA et al., 2007). Entre os
agentes ambientais estão os coliformes, os estreptococos ambientais e os enterococos;
leveduras predominantemente do gênero Candida, fungos filamentosos e algas do gênero
Prototheca (COSTA et al., 2000a). As leveduras têm sido relacionadas como patógenos
emergentes em função das mudanças verificadas nos sistemas de produção de leite e nos
programas de controle da mastite bovina. Diversas espécies dos gêneros Cryptococcus,
Rhodotorula, Trichosporon e Candida têm sido isoladas de leite obtido de animais
acometidos pela mastite, sendo as espécies de Candida geralmente as mais freqüentes
(COSTA et al., 2008).
2.1.4.1 Mastite bacteriana
A ocorrência de diferentes apresentações clínicas de uma patologia depende de
propriedades ou fatores de virulência que determinam o grau de patogenicidade do agente
infeccioso. Alguns destes fatores são componentes intrínsecos da estrutura bacteriana,
11
também denominados endotoxinas. Outros se constituem de diferentes exotoxinas, bem como
propriedades que conferem ao patógeno multirresistência a antibióticos (TRABULSI e
ALTERTHUM, 2005; RADOSTIS; BLOOD; GAY, 2002).
Os patógenos do gênero Staphylococcus constituem um dos principais agentes
causadores das mastites contagiosas devido a sua capacidade de penetração e instalação
profunda nos tecidos da glândula mamária, formação de microabcessos, resistência à
fagocitose e sobrevivência no interior dos fagócitos, dificultando a ação dos antibióticos
utilizados no tratamento da mastite (ARAUJO e ANDRIOLLI, 1996).
O gênero Staphylococcus compreende diversas espécies e subespécies e se encontra
amplamente distribuído na natureza, sendo encontradas principalmente na pele, membranas,
mucosas de aves e mamíferos. Atualmente são descritas 41 espécies dentro do gênero sendo a
maioria negativa a presença da enzima coagulase (EUZÉBY, 2007). A síntese da enzima, que
caracteriza e identifica as outras espécies do grupo, é restrita ao S.aureus, S.schleiferi subsps.
coagulase, S. intermedius, S. hyicus e S. delphini.
A coagulase livre é uma enzima produzida por algumas espécies de estafilococos,
principalmente o Staphylococcus aureus em plasma de coelho. Este teste tem sido utilizado
para a identificação dos Staphylococcus coagulase positivo de outras espécies não produtoras
de coagulase, Staphylococcus coagulase negativo. As infecções causadas por estes agentes
são associadas com quadros de mastites brandos e leucocitose, mas podem muitas vezes
causar mastite clínica intensa (TIMMIS e SCHULTTZ, 1984).
O Staphylococcus aureus destaca-se como microrganismo causador de mastite
contagiosa mais importante, de maior ocorrência nos rebanhos leiteiros no mundo, de difícil
controle devido sua resistência aos antimicrobianos. Algumas cepas produzem enterotoxinas
responsáveis por surtos de intoxicações alimentares em humanos. A capacidade de produzir
uma ou mais toxinas é encontrada em 30 a 50% das cepas (CARDOSO; CARMO; SILVA,
2000).
12
Nader Filho et al. (2007) avaliaram 72 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de
vacas com mastite clínica ou reagentes ao teste CMT e encontraram em 91,7% a capacidade
de produzir uma ou mais tipos de toxinas extracelulares. Segundo Refai et al. (1998) existem
evidências da associação entre atividade enzimática, capacidade de produção de toxinas
extracelulares e resistência a antimicrobianos.
Langoni et al. (1990) examinando 702 amostras de leite com mastite subclínica
encontraram a seguinte ocorrência de agentes: S.aureus 36,9%, S.epidermites 22,2%, C.bovis
4,8%, C.pyogenes 4,4%, S.uberis 4,3%, E.coli 4,0%, S. dysgalactaie 3,8%, S. agalactiae
3,7% e Candida albicans 3,8%.
Laranja e Machado (1994) estudaram o perfil microbiológico de amostras de leite de
1.683 vacas com mastite clínica e subclínica e encontraram dentro dos 983 isolamentos
positivos, 44,6% de Staphylococcus spp, 15,0% de Corynebacterium spp e 8,2% de
Streptococcus spp, 5,4% de fungos filamentosos e leveduras, 4,4% de Bacillus, 3,2% de
E.coli e 0,2% de Klebsiella. Quando considerado o isolamento tanto em cultura pura quanto
em cultura mista, a ocorrência de Staphylococcus spp passou para 55,6% e Corynebcterium
spp para 18%.
Fernandes et al. (2001) avaliaram 19.113 amostras de leite de vacas com mastite e a
maior prevalência de microrganismos isolados nas 8.848 amostras com crescimento foram
Staphylococcus coagulase positiva (30,1%), Corynebacterium bovis (22,5%), Staphylococcus
epidermites (13,1%) e Streptococcus spp (14,2%) além de isolados de Prototheca zoopfii,
Nocardia asteroides e Candida albicans.
Wunder Junior (2007) analisando 240 amostras de leite de animais com mastite
clínica e suclínica no Rio Grande do Sul isolou 250 agentes bacterianos em 218 amostras
(90,8%) e 65 agentes leveduriformes (16,25%). Os gêneros mais prevalentes foram:
Staphylococcus spp, Corynebacterium spp e Nocardia spp, respondendo por 88% dos
isolados.
13
Ribeiro et al. (2009) investigaram a presença de microrganismos patogênicos, a
sensibilidade e a multirresistência dos isolados aos antimicrobianos, a CCS e a presença de
resíduos de drogas no leite de vacas, com e sem mastite, produzido em sistemas orgânicos.
Foram avaliadas 148 vacas no período médio de lactação, das quais duas com mastite clínica,
72 com mastite subclínica e 74 sem mastite (controles), provenientes de quatro pequenas
propriedades do interior do Estado de São Paulo, certificadas como orgânicas.
Staphylococcus aureus (25,7%), Streptococcus spp. (21,4%), Corynebacterium bovis
(12,9%), Streptococcus agalactiae (4,3%) e Staphylococcus spp. (4,3%) foram os
microrganismos mais frequentemente isolados nos animais com mastite. Penicilina (53,5%),
ampicilina (41,6%) e neomicina (38,6%) foram os antimicrobianos que apresentaram as
maiores taxas de resistência frente aos isolados avaliados.
Dentre o amplo universo de agentes infecciosos responsáveis pelo desenvolvimento
das mastites, Leslie, Dohho e Meek (1983) consideram a existência de patógenos menores e
maiores, dependendo da resposta celular. Os patógenos considerados menores causam baixas
médias de contagens de células somáticas e são Corynebacterium spp e algumas espécies de
Staphylococcus coagulase negativo e os patógenos considerados maiores causam as mais
altas contagens médias de células somáticas e são os Staphylococcus aureus, coliformes e
Streptococcus spp.
Em estudo sobre a etiologia das mastites em bovinos Costa et al., (1985) isolaram
Corynebacterium bovis em 954 amostras (32,5%) de um total de 2.935 amostras oriundas de
17 municípios do estado de São Paulo. Em outro trabalho realizado no ano 2.000 o mesmo
autor e colaboradores realizaram exames microbiológicos em 31.625 amostras de leite de
11.805 animais de propriedades leiteiras de 07 regiões do estado de São Paulo e verificaram o
predomínio de Corynebacterium spp. (36,63%), Staphylococcus spp. (26,22%) e
Streptococcus spp. (18,39%) (COSTA et al., 2000a).
O papel do Corynebacterium bovis como agente da mastite é controverso. Alguns
autores o consideram como um microrganismo de menor relevância, mas outros afirmam sua
importância como causador de mastite clínica e como responsável por significativas
14
alterações celulares e aumentos nas taxas de isolamentos verificados no país (COSTA et al.,
1985; VICTÓRIA et al., 2005).
Brito et al. (1999) realizaram exames microbiológicos de 6.315 amostras de leite
obtidas de todos os quartos mamários de 1.609 vacas em lactação, originárias de 48 rebanhos
localizados na Zona da Mata e Campo das Vertentes no estado de Minas Gerais. No momento
da colheita das amostras foram realizados exames clínicos nos úberes e o Califórnia Mastite
Teste (CMT) do leite. Isolaram-se 3.919 microrganismos, sendo 3.637 de quartos mamários
com infecção por um único agente e 283 de infecção mista. As porcentagens dos agentes
isolados foram: Corynebacterium spp., 55,2%, Staphylococcus aureus, 19,2%,
Staphylococcus sp. coagulase negativos (SCN), 12,4%, Streptococcus agalactiae, 6,9%,
Streptococcus sp. esculina positivos (ESCPOS), 4,0%, Streptococcus sp. esculina negativos
(ESCNEG), 2,1%, leveduras, 0,1% e Pseudomonas spp., 0,1%. Além de causar infecção em
maior número de quartos mamários, Corynebacterium spp. foi o agente mais frequentemente
isolado em todos os rebanhos. Outros estudos têm chamado a atenção para a elevada
porcentagem de isolamento de C. bovis de quartos mamários, sendo muitas vezes o agente de
maior prevalência no rebanho. O maior isolamento de espécies deste gênero bacteriano em
rebanhos leiteiros está associado à falhas na desinfecção dos tetos mamários. O número de
isolamentos dos patógenos considerados secundários da mastite, Corynebacterium spp. e
Staphylococcus spp. coagulase negativos, foi maior em quartos mamários com escore
negativo no CMT.
Pardo et al. (1998) analisaram 664 amostras de leite de 83 vacas primíparas da raça
Holandesa. As amostras foram colhidas no primeiro e no sétimo dia após o parto. Dentre as
664 amostras analisadas, 488 (73,50%) foram negativas e 176 (26,50%) positivas para
microrganismos aeróbios. Foi observado um alto índice de mastite clínica (20,48%). Os
agentes isolados com maior freqüência foram os Staphylococcus spp coagulase negativo
(64,20%), Staphylococcus spp coagulase positivo (8,52%), Streptococcus spp (7,96%),
Actinomyces pyogenes (4,55%), Mycoplasma bovigenitalium (3,40%) e Escherichia coli
(2,84%). Foi observado um maior índice de patógenos no primeiro dia de colheita de
amostras (17,62%), quando comparado ao sétimo dia (8,88%).
15
Os Streptococcus spp. são considerados o segundo gênero de bactérias em
importância na etiologia da mastite em ruminantes, sendo precedido pelo grupo dos
estafilococos. Quatro espécies são encontradas nos rebanhos leiteiros, S.agalactiae, S.
dysgalactiae, S. bovis e S. uberis. Os estreptococos são cocos gram-positivos, catalase
negativos, colonizadores transitórios de pele e residentes de mucosas e podem ser isolados da
biota normal de diferentes espécies animais em diferentes sítios de colonização. Os
microrganismos que causam mastites são classificados no grupo dos contagiosos
(S.agalactiae) e as demais espécies são classificadas como ambientais pela capacidade de
sobreviver e multiplicar em sítios extramamários (DOUGLAS et al., 2000)
Os fatores de virulência presentes nas diferentes espécies incluem proteínas de
superfície, polissacarídeos capsulares, exotoxinas, enzimas (hemolisina, fibrinolisina entre
outras) e o fator CAMP (Christie-Atkins-Munch-Petersen). A identificação de alguns destes
fatores é utilizada como um dos critérios de identificação de espécies do gênero (SANTOS et
al., 2003).
O S. agalactiae é um importante patógeno responsável por infecções tanto no
homem quanto nos bovinos leiteiros. O reservatório é o úbere infectado, mas não existe
comprovação da transmissão de isolados entre homens e animais. A infecção intramamária
causada pelo agente está associada a elevadas contagens de células somáticas no leite de
bovinos e bubalinos e isolamentos em taxas que variam de 3,2 a 33% (BRITO et al., 1999;
COSTA et al., 2000a).
As bactérias são os agentes isolados com maior freqüência nos casos de mastite,
entretanto é cada vez mais comum a ocorrência de casos esporádicos de microrganismos de
origem ambiental, entre os quais se destacam as leveduras e fungos filamentosos
(KRUKOWSKI et al., 2000; MARQUES et al., 2006).
2.1.4.2 Mastite micótica
A maioria dos casos de mastite micótica é determinada pelas leveduras e em menor
grau pelos fungos filamentosos e geralmente sob a forma de surtos localizados. Estes
16
microrganismos são oportunistas e incluem-se como fonte de infecção na pele e secreção do
úbere, mãos do ordenhador, ordenhadeira, piso, alimento, palha, poeira, solo, medicamentos e
soluções desinfetantes (RICHARD et al., 1980). Merece ser digno de nota também o fato de
que sua incidência elevou-se com o advento da terapia antimicrobiana durante a década de 50
e 60. O uso intensivo e prolongado de antibióticos é um fator de contribuição para a mastite
micótica, pois propicia a alteração da microflora normal do hospedeiro, que serve como um
dos mecanismos naturais de defesa (CHENGAPPA et al., 1984). Embora de baixa
prevalência, é uma manifestação patológica importante, relacionada normalmente com as
práticas de manejo (KRUKOWSKI et al., 2000). Dois aspectos principais da rotina diária são
particularmente importantes: 1) higiene da ordenha 2) utilização de agentes antimicrobianos,
especialmente por via intramamária. A partir destes aspectos a mastite micótica pode ser
classificada sob duas formas: primária ou secundária (SPANAMBERG et al., 2009).
A mastite primária ocorre espontaneamente e não é precedida por infecção
bacteriana e/ou de tratamentos com antimicrobianos, e são mais diagnosticadas nas primeiras
semanas de lactação (SPANAMBERG et al., 2009). Um fator importante deste processo é a
inadequada higiene de ordenha, que pode permitir a passagem de agentes causadores de
mastite de uma glândula para a outra, convertendo uma doença basicamente esporádica numa
doença transmissível de proporções epidemiológicas (COSTA et al., 1995).
Já a mastite micótica secundária, que é a forma clínica mais encontrada, se
desenvolve após a administração de antimicrobiano intramamário para tratamento ou
prevenção de casos de mastite bacteriana (SPANAMBERG et al., 2009). Acredita-se que este
tipo de administração medicamentosa possa causar a redução da vitamina A, acarretando
injúrias ao epitélio do úbere e à fácil invasão pelo fungo. Algumas infecções intramamárias
por fungos podem resultar em morte dos animais afetados (KRUKOWSKI et al., 2000).
As leveduras podem colonizar o canal do teto e/ou o teto e cisternas da glândula
sem causar doença. Caso uma mastite bacteriana ocorra, estas leveduras podem multiplicar e
invadir o parênquima afetado, causando a mastite micótica. Provavelmente as bactérias
comensais do úbere inibam a multiplicação destas leveduras e ao serem removidas por
antimicrobianos favoreçam a multiplicação das leveduras (SPANAMBERG et al., 2009).
17
A contaminação do leite por microrganismos indesejáveis, como os fungos, pode
causar alterações físico-químicas no mesmo, limitando sua durabilidade e de seus derivados,
além de determinar problemas econômicos e afetar a saúde pública (MELVILLE et al.,
2006). Em diversos países as leveduras têm sido descritas como causadoras de mastite
(KRUKOWSKI et al., 2000), e a grande maioria dos isolados pertencem aos gêneros
Candida, Cryptococcus e Trichosporon, porém muitos outros gêneros como Pichia,
Debaryomyces, Geotrichum e Rhodotorula, também podem estar presentes (LANGONI et al.,
1997; CHAROTA et al., 2001; RUZ-PERES, 2005).
A prevalência de mastite micótica é de aproximadamente 1% a 12% do total de
mastite de origem infecciosa. Em alguns rebanhos esse número pode aumentar em surtos,
geralmente por problemas de manejo, onde a maioria das vacas em lactação é afetada
(KRUKOWSKI e SABA, 2003).
Costa et al. (1993) relataram a ocorrência de mais de 30% de casos de mastite
micótica em animais com quartos mamários aparentemente normais. Estes autores relataram
que as leveduras estão presentes na glândula e superfície dos tetos e em condições adequadas
podem se instalar e produzir infecção. Observaram ainda que a terapia contra mastite
bacteriana não é só ineficaz contra as leveduras como pode se constituir como fator de risco
para infecções fúngicas.
Santos e Marin (2005) isolaram em 25,4% das amostras de leite pelo menos um
agente leveduriforme de casos de mastite clínica e subclínica, sendo nove espécies diferentes
pertencentes ao gênero Candida. Wunder Junior (2007) de um total de 240 amostras de leite
analisadas realizou o isolamento de 65 espécies de leveduras, sendo 23 em amostras de leite
de animais com mastite clínica e 42 amostras de leite de animais com mastite subclínica. O
autor identificou 10 gêneros diferentes, sendo Candida (38,5%) a mais prevalente, seguido
dos gêneros Pichia (20%), Cryptococcus e Rhodotorula (10,8%).
A inadequada higiene de ordenha permite a passagem de agentes causadores de
mastite de uma glândula para a outra, convertendo uma doença basicamente esporádica numa
doença potencialmente transmissível de grandes proporções epidemiológicas. A mastite
18
micótica, quando um problema no rebanho, está relacionada com a ordenha e outras práticas
envolvendo rápido e sucessivo contato dos quartos com pessoas ou equipamentos capazes de
agirem como veículos de transmissão (HOWARD e SMITH, 2003). A mastite causada por
fungos produz basicamente as mesmas manifestações clínicas que outros agentes, portanto é
difícil estabelecer diagnóstico fundamentado apenas nestas informações (STANOJEVIC e
KRNJAJIC, 2003). Redução do fluxo de leite, edema e maior firmeza da glândula afetada são
observados, juntamente com diversas anormalidades na aparência leite e resultados positivos
no CMT. Podem ocorrer picos febris, não relacionados com a disseminação fúngica. O grau
de severidade da doença e sua duração estão relacionados com o número de organismos que
penetram na glândula, o gênero do fungo envolvido e sua capacidade de crescer a 37- 40Cº
(HOWARD e SMITH, 2003).
A patogenicidade das leveduras não é muito documentada nos casos de mastites
clínicas. A grande maioria é considerada saprófita, porém em alguns casos são considerados
patógenos potenciais (RUZ-PERES et al., 2004). Num estudo experimental feito com
Candida krusei em bovino, verificou-se que entre 10.000 e 20.000 organismos ocasionaram
uma mastite clínica leve, sendo que 5.000.000 ou mais produziram uma mastite clínica severa
com efeitos sistêmicos, o que levou a conclusão de que a infecção e sua severidade podem
estar relacionadas com a quantidade do agente envolvido (FARNSWORTH e SORENSEN,
1974).
A infecção do úbere por Cryptococcus spp. causa uma mastite clínica severa,
caracterizada por inflamação inicial do quarto, picos febris, inapetência e queda brusca na
produção, que pode continuar indefinidamente (FARNSWORTH, 1977). Porém, a mastite
fúngica mais severa descrita é causada pelo Cryptococcus neoformans, que pode se estender
por semanas e meses, levando a supressão completa de fluxo de leite e causando efeitos
permanentes na produção da glândula afetada, quando o parênquima glandular é substituído
por tecido de granulação e muitos animais acabam tendo que ser sacrificados (INNES;
SEIBOLD; ARENTZEN, 1952).
Kitamura et al. (1990) descreveram um caso de mastite crônica, onde o animal
observado foi submetido a uma terapia medicamentosa com aplicação intramamária dos
19
antibióticos (penicillina e estreptomicina) e antimicótico (nistatina), e aplicação intramuscular
de hormônio (oxitocina). Sem sucesso na terapia e com o agravamento sintomatológico o
animal foi submetido à eutanásia. Os cortes histológicos do tecido mamário afetado
evidenciaram a presença de lesão supurativa com necrose extensa e a formação de células
gigantes. Nas lesões antigas, inúmeros elementos fúngicos foram cercados por numerosos
neutrófilos e tecido de granulação. Nas lesões mais recentes, muitas células gigantes foram
observadas fagocitando elementos fúngicos. A membrana basal do alvéolo envolvido e os
ductos estavam intactos nas lesões iniciais, enquanto foram destruídos nas mais avançadas.
Os autores concluíram que a terapia com antibióticos pode ter favorecido a invasão e o
crescimento de Candida maltosa, o aumento da patogenicidade do agente e a severidade da
lesão do tecido mamário (KITAMURA et al., 1990).
2.1.5 Resíduos de antimicrobianos no leite
A avaliação da qualidade do leite tem sido um ponto de intensa preocupação para a
saúde pública. A contagem de células somáticas, isolamento e identificação de patógenos e
detecção da presença de resíduos de antimicrobianos, têm sido fatores importantes na
avaliação da qualidade do produto (SCHAIK; LOTEM; SCHUKKEN, 2002).
Para proteger o consumidor, foram estabelecidos limites de segurança para os
resíduos de antimicrobianos, na forma de limites máximos de resíduos (LMR), também
conhecido como os níveis de tolerância (McEWEN; BLACK; MEEK, 1992). No Brasil,
estabelecer os limites máximos de resíduos (LMR’s) é competência do Ministério da Saúde.
No caso de não estarem estabelecidos por este Ministério, utilizam-se os limites
internalizados no MERCOSUL, os recomendados pelo Codex Alimentarius, os constantes nas
Diretivas da União Européia e os utilizados pelo Food and Drug Administration (FDA)
(BRASIL, 1995). Mas, embora existam índices máximos pré-estabelecidos, é comum a
violação destes (McEWEN; BLACK; MEEK, 1991).
Os antimicrobianos não são desejáveis no leite por inúmeras razões; além de
passarem uma imagem negativa dos produtos, podem causar efeitos deletérios na saúde
pública e causar prejuízos na produção de derivados (McEWEN; BLACK; MEEK, 1991). Os
20
riscos à saúde do consumidor são representados, principalmente, pelo desencadeamento de
fenômenos alérgicos em indivíduos sensíveis, pelos efeitos tóxicos, carcinogênicos, por
alterações no equilíbrio da flora intestinal e pela seleção de bactérias resistentes no trato
digestivo dos consumidores (COSTA, 1996a). Pode ocasionar a mudança na atividade
enzimática intestinal e alteração na contagem das bactérias intestinais normais, favorecendo
infecção por agentes patogênicos (TOLLEFSON e FLYNN, 2002).
Por estes e outros motivos, há um crescente interesse público e científico
relacionado à administração terapêutica e subterapêutica de antimicrobianos em animais
(WHITE e McDERMOTT, 2001; CAO et al., 2007). A relação entre o uso de
antimicrobianos em animais produtores de alimentos e o aparecimento de bactérias resistentes
tem sido objeto de estudo nacional e internacional (GUTERBOCK et al., 1993; WHITE e
MCDERMOTT, 2001; TOLLEFSON e FLYNN, 2002).
Algumas práticas realizadas nas fazendas foram identificadas como fatores de risco
para detecção de resíduos de antimicrobianos no leite. Booth e Harding (1986) conduziram
estudos em propriedades na Inglaterra onde resíduos de antibióticos foram detectados no
leite. Os autores responsabilizaram vários fatores pela ocorrência de resíduos, entre eles:
falha na observação do tempo de carência para o leite de vacas tratadas, transferência
acidental de leite contaminado para o tanque de mistura, falha na manutenção de registros dos
tratamentos e a não identificação dos animais tratados. Além dos referidos, outros estudos
identificaram como fatores importantes na ocorrência de resíduos no leite: o tratamento de
vacas secas (OLIVER; DUBY; TRITSCHLER, 1984; GREEN et al., 2002) e a persistência
de resíduos além do período de carência, em vacas em lactação tratadas com antibióticos
(SEYMOUR e JONES, 1988; MARTENIUK; AHL; BARTLETT, 1988).
Com o crescente uso de medicamentos veterinários em animais de produção, deu-se
início o Plano Nacional de Controle de Resíduos Biológicos em Alimentos de Origem
Animal que tem por objetivo operacionalizar sua competência legal de controlar e fiscalizar
resíduos de medicamentos veterinários em alimentos (BRASIL, 1995).
21
No Brasil os resíduos de antimicrobianos são determinados em algumas regiões,
mas ainda não atingiu os níveis necessários para um controle adequado, que garanta a
qualidade da matéria prima para o consumo e manufatura de derivados lácteos. Para que isso
ocorra, há necessidade de levantamentos que identifiquem os pontos críticos de contaminação
e que os proprietários de fazendas leiteiras sejam informados sobre os meios para reduzir o
risco da presença de resíduos de antimicrobianos no leite de consumo. Com isto evitam-se as
penalidades econômicas que já estão sendo aplicadas em algumas regiões do país, quando há
detecção de resíduos de antimicrobianos no leite. Da mesma forma que adotado nos países da
Europa e EUA, a venda destes medicamentos deveria ocorrer apenas com a prescrição do
médico veterinário (SANTOS e FONSECA, 2007; BRASIL, 1995).
Os antimicrobianos mais utilizados em animais de produção (leite, carne, ovo, etc.)
são os betalactâmicos (penicilinas, cefalosporinas), os aminoglicosídeos (estreptomicina,
neomicina, gentamicina), os macrolídeos (eritromicina), as tetraciclinas (oxitetraciclina e
clortetraciclinas) e as sulfonamidas (sulfametazina) (SANTOS e FONSECA, 2007). Os
antimicrobianos têm sido bastante utilizados nas fazendas e até em muitos casos, de maneira
indiscriminada (BISHOP; BODINE; JANZEN, 1980), seja para fins terapêuticos,
principalmente visando à cura das mastites, ou ainda incorporados à alimentação animal,
como suplemento dietético (NASCIMENTO; MAESTRO; CAMPOS, 2001).
Lederer (1991) em revisão sobre o assunto relata que após injeção de diversos tipos
de penicilina, constatou-se a presença de antibióticos no leite de vacas, durante 30 a 78 horas,
recomendando não ser conveniente consumir leite ordenhado nas 96 horas subseqüentes à
injeção de um antibiótico. Allison (1985) em uma pesquisa realizada em 1981 pelo Conselho
de Marketing do leite do Reino Unido constatou que 61% das amostras de leite resíduo-
positivas tinham como fonte contaminante antibiótico intramamário aplicados em vacas
lactantes, enquanto que 31% provinham da terapia de vaca seca e somente 6% era decorrente
de aplicações intramusculares.
A mastite é responsável pelo tratamento de vacas em lactação com antimicrobianos
(antibióticos e sulfonamidas). O processo inflamatório que envolve a glândula mamária
apresenta uma série de alterações patológicas que podem exercer influência sobre a
22
farmacocinética e farmacodinâmica de medicamentos de uso intramamário utilizados na
terapêutica da mastite e, daqueles administrados por via sistêmica, para tratamento desta ou
de outras afecções (COSTA, 1996a; OWENS et al., 1997).
A eficácia clínica de um antimicrobiano é de quantificação muito difícil, porque há
grandes variações na resposta individual e do rebanho, por causa do tipo de microrganismo
envolvido, localização dos sítios infectados, grau de resposta do tecido mamário, duração da
infecção e outros fatores. Tradicionalmente utiliza-se a via de administração intramamária,
numa tentativa de concentração do agente quimioterápico no local ativo da infecção
(REBHUM, 2000). O processo inflamatório associado ou não às práticas de antibioticoterapia
inadequadas aumenta o risco da presença de antibióticos no leite podendo, inclusive,
determinar períodos de eliminação além daqueles estabelecidos nas bulas dos medicamentos
(RAIA et al., 1999).
Raia Júnior (2001) verificou influência do processo inflamatório da glândula
mamária tratada por via intramamária no período de eliminação dos antimicrobianos no leite,
18,75% das amostras de animais tratados com cefacetril, 18,1% tratados com gentamicina e
11,1% tratados com tetraciclina apresentaram período de eliminação maior que o
recomendado pela bula. Índices maiores foram observados quando utilizadas associações de
penicilina e dihidroestreptomicina e sulfadiazina e trimetropin nos tratamentos de casos de
mastite clínica por via sistêmica.
Fagundes (2003) avaliou a persistência de resíduos de antimicrobianos no leite de
vacas tratadas no período seco e constatou a ocorrência de resíduos mesmo após o período
recomendado de descarte, independente do tipo de manejo e práticas de ordenha utilizadas e
do tipo de medicamento.
Raia Júnior (2001) avaliou 60 amostras de tanques resfriadores de diferentes
propriedades leiteiras e verificou uma correlação de 1,0 (r = 1, Spearman) entre à
porcentagem de ocorrência de resíduo de antimicrobianos nos tanques resfriadores e
incidência de mastite clínica. Amostras de leite de tanques resfriadores de propriedades
leiteiras que apresentaram alta porcentagem de mastite clínica foram relacionadas com a
23
detecção de resíduo de antimicrobianos no leite, reforçando ser a ocorrência de mastite
clínica um fator predisponente importante para a presença de resíduos no leite em tanques
resfriadores das propriedades. Ruegg e Tabone (2000) também observaram a influência da
mastite na presença de resíduos de antimicrobianos em tanques resfriadores de propriedades
leiteiras e verificaram que propriedades com maior ocorrência de resíduos apresentavam
contagem de células somáticas acima de 700.000 cél./ml.
Barros e Perches (1981) encontraram a presença de resíduos de antimicrobianos em
21,9% das amostras de leite tipo B comercializados no município de São Paulo. Gelli et al.
(1984) verificaram a presença de resíduos de antimicrobianos em 11,63% das 404 amostras
de leite pasteurizado comercializados em São Paulo.
Nascimento, Maestro e Campos (2001), avaliando 96 amostras de leite pasteurizado
(A, B e C) e Ultra-High Temperature (UHT), comercializados no município de
Piracicaba/SP, encontraram 50% de amostras com resíduos de antimicrobianos, sendo 34,8%
resíduos de antibióticos β-lactâmicos. A maior ocorrência de resíduos de antimicrobianos foi
detectada no leite pasteurizado tipo C.
A presença de resíduos de antimicrobianos no leite decorre principalmente do uso
abusivo destes medicamentos ou da utilização de maneira inadequada: uso de medicamentos
não recomendados e com farmacocinética não perfeitamente estabelecida, uso de doses
excessivas e não obediência ao período de carência do leite de animais em tratamento, além
de problemas idiossincrásicos de animais que apresentam uma prolongada retenção do
medicamento e em casos em que ocorre a antecipação do parto (COSTA, 1996a). Em relação
à presença de resíduos é importante orientar o produtor que deve ser informado dos
procedimentos para evitar que leite com resíduos antimicrobianos atinja os tanques de
resfriamento e cheguem à indústria e aos consumidores.
24
2.1.6 Testes para detecção de resíduos de antimicrobianos
A detecção de resíduos de antimicrobianos no leite pode ser feita através de
métodos indiretos e diretos. Um método de detecção na forma indireta consistia na infusão no
úbere da vaca de um antibiótico marcado, a excreção do leite permitia visualizar alteração de
cor e assim detectar a presença do antibiótico. A vantagem desta marcação com corante é que
imediatamente após a excreção do leite é possível identificar visualmente a alteração. Apesar
desta citação, a utilização mais comum são os métodos diretos, que incluem: inibição
microbiana, enzimáticos, aglutinação em látex, receptores microbianos, radioimunoensaio,
eletroforese e cromatografia. Estes métodos podem ser classificados como de triagem,
incluindo os imunológicos e de inibição microbiológicos, e confirmatórios, que inclui
técnicas sensíveis e específicas para a identificação e quantificação de resíduos de antibiótico
no leite. A técnica mais utilizada visando à segunda alternativa é a cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE). (SHENCK e CALLERY, 1998).
Os limites máximos de resíduos de antimicrobianos nos alimentos são estabelecidos
na forma LMR (Codex Alimentarius) ou limite de tolerância ou de segurança (US FDA). O
limite máximo de resíduo (LMR) recomendado pelo Codex Alimentarius é definido como a
concentração máxima do medicamento (ppb) legalmente permitido ou reconhecido como
aceitável no alimento (BRITO, 2000).
Existem vários métodos de triagem para a detecção de resíduos de antibióticos em
leite que estão de acordo com as recomendações da Association of Official Analytical
Chemists (AOAC) e American Public Health Association (APHA), estando muitas delas
disponíveis comercialmente. O método de inibição microbiana pela presença de resíduos de
antimicrobiano no leite é o mais utilizado em virtude do custo e da capacidade de evidenciar
uma ampla gama de antibióticos e quimioterápicos, e se baseia na propriedade geral de que
todos os antimicrobianos inibem bactérias sensíveis (BARBERIO e SIGNORINI, 1996;
BRITO, 2000). Além dos testes microbiológicos, a partir das décadas de 70 e 80 foram
desenvolvidas técnicas de radioimunoensaio e enzimáticos que possibilitaram a determinação
de antibióticos β-lactâmicos, tetraciclinas, estreptomicina, eritromicina, novobiocina,
cloranfenicol e sulfonamidas. Testes para determinação de β-lactâmicos que se baseiam na
25
inibição de reações enzimáticas específicas e, finalmente, testes imunológicos que utilizam
anticorpos monoclonais (BISHOP; SENYK; DUCAN, 1992).
No teste microbiológico o resultado é visualizado pela alteração da coloração do
meio de cultura, devido à mudança de pH, as bactérias Bacillus stearothermophilus, Bacillus
subtilis, Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Escherichia coli, Bacillus megaterium ou
Streptococcus thermophilus, são semeadas em meio de crescimento (sólido ou líquido),
inoculadas com a amostra de leite e incubadas por um período de algumas horas
(MITCHELL et al., 1998). Fatores antibacterianos inespecíficos presentes no leite da vaca
com mastite e no colostro (lactoferrina e lisozima), altas contagens de células somáticas e
elevadas contagens totais de bactérias são alguns fatores relacionados que podem determinar
falsa positividade. O aquecimento prévio das amostras a 80°C, durante cinco minutos,
elimina as reações falso-positivas (AERTS; HOGENBOOM; BRINKMAN, 1995; RAIA
JUNIOR, 2001).
Existem diversos testes microbiológicos na forma de kits comerciais, que são fáceis
de utilizar; o Delvotest® SP é um teste rápido de inibição do crescimento microbiano e da
produção de ácido pelo microrganismo Bacillus stearothermophilos variedade calidolactis.
Na presença de resíduos de fármacos, a cor púrpura original do indicador não se altera. Seu
uso está aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) e é reconhecido e aprovado
pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC) desde 1982. O Delvotest® abrange
as principais classes de antibióticos utilizados em gado leiteiro, como os β lactâmicos,
tetraciclinas, sulfas e aminoglicosídeos. Possuem excelentes limites de detecção para cada
penicilina, cefalosporina e sulfas, razoável para as tetraciclinas, questionável para o
aminoglicosídeo gentamicina e péssimo para cloranfenicol (GORNI e CABRINI, 2003).
Outro método bastante utilizado para a detecção de resíduos de antimicrobianos no
leite é o imunoenzimático, conhecido como o Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Indiferente do objetivo da análise, todos os testes ELISA envolvem duas etapas básicas. Na
primeira etapa, um antígeno e um anticorpo, um conhecido e outro proveniente da amostra a
ser testada, são unidos para reagir, com a formação de imunocomplexos. Na segunda etapa, a
detecção da reação é conduzida pela adição de um reagente denominado enzima conjugada.
26
O conjugado é um antígeno ou um anticorpo quimicamente unido a uma enzima, como por
exemplo, a fosfatase alcalina. Quando o conjugado reage com o imunocomplexo é formado
um produto colorido. A intensidade de cor determina a presença ou ausência do antígeno ou
anticorpo primariamente desconhecido e permite a sua identificação (MITCHELL et al. 1998;
MORAES et al., 2009). O teste Snap® baseia-se no método Elisa e encontra-se disponível na
forma de kits específicos para grupos de antibióticos, incluindo kit para detecção de
tetraciclinas, para detecção de cloranfenicol e para detecção de β-lactâmicos (GORNI e
CABRINI, 2003).
As técnicas de maior sensibilidade para detectar resíduos de antimicrobianos no
leite correspondem às físico-químicas como a CLAE (COLLINS; BRAGA; BONATO,
1990). Entretanto para avaliações a campo são necessárias técnicas de triagem sensíveis, que
atinjam um amplo espectro de resíduos, mais rápidos e de custos mais baixos que permitam a
detecção precoce de resíduos Os testes de inibição bacteriana apresentam estas
características, principalmente a sensibilidade a um amplo espectro de antibióticos, ao
contrário dos testes imunoenzimáticos que são mais específicos sendo necessária a utilização
de vários testes simultâneos para uma única amostra (RAIA JUNIOR, 2006)
27
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material
3.1.1 Animais e localização das propriedades leiteiras
Durante o período experimental de dezembro de 2009 a fevereiro de 2010 foram
avaliados 20 tanques de resfriamento, 604 balões coletores e 2.363 quartos mamários de
cinco propriedades de leite tipo B e C que fazem parte de uma linha de leite da região
metropolitana de Campinas (RMC) (Figura 1).
Figura 1-Localização das propriedades leiteiras na região metropolitana de Campinas-SP.
28
3.1.2 Características gerais das propriedades leiteiras
As propriedades leiteiras foram caracterizadas por letras de A a E, e suas principais
características de produção, manejo, higiene de ordenha e medidas de prevenção e controle de
mastites estão dispostas nas tabelas 1 e 2.
Tabela 1 - Características de produção das propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010.
Características A B C D E
Tipo (Leite) B C B C C
Raça HPB/Jersey Pardo Suíço HPB / P.Suiço Mestiço Mestiço Vacas Lactação 110 12 69 25 43 Produção diária (L) 2.600 * 95 728 350 150 Ordenha/tipo Tanden Balde ao pé Tanden Balde ao pé Balde ao pé N° ordenhas 3 1 2 2 1 Resfriamento do leite Sim Sim Sim Sim Sim Assistência veterinária Sim Não Sim Não Não
* Valor correspondente aos dois tanques de resfriamento da propriedade.
Tabela 2 - Características de manejo, higiene de ordenha, medidas de prevenção e controle de mastite nas
propriedades leiteiras localizadas na região metropolitana de Campinas-SP, 2010.
Características A B C D E
Tamis Sim Sim Sim Não Sim Pré-dipp Sim Não Não Não Não Pós-dipp Sim Não Sim Não Não
Papel toalha descartável Sim Não Sim Não Não Higiene das instalações Boa Media Boa Ruim Media
Tratamento - Mastite Via intramamária β-lactâmicos β-lactâmicos Tetraciclina β-lactâmicos β-lactâmicos
Aminoglicosideos Via sistêmica β-Lactâmicos
Não Não Não Não
Quartos mamários nº total de quartos mamários 864 96 864 384 208 nº total de quartos mamários
examinados 833 93 848 381 208
29
3.1.3 Esquema de colheita das amostras de leite
Amostras de leite foram colhidas quinzenalmente dos quartos mamários de vacas
em lactação, balões coletores e tanques de resfriamento durante o período de 45 dias em todas
as propriedades (Figura 2) exceto nas propriedades B e E. Nestas propriedades (B e E) foram
realizadas colheitas das amostras dos quartos mamários e balões coletores em apenas dois
períodos: períodos 1º e 2º na propriedade B e períodos 3º e 4º na propriedade E, entretanto a
amostra do tanque de resfriamento foi coletada normalmente em todos os períodos (4)
propostos inicialmente no trabalho.
Nas propriedades que utilizavam sistema de ordenha tipo balde ao pé a ordenha de
cada animal foi realizada individualmente, seguida pela colheita da amostra de leite do balde;
após esse procedimento, o leite do animal ordenhado foi adicionado ao tanque de
resfriamento, seguindo-se então com a ordenha do próximo. Este procedimento foi adotado
para evitar desvios na contagem de células somáticas (CCS) ocasionados pela diluição do
leite entre animais.
Períodos Figura 2 – Esquema do cronograma utilizado para realização das coletas.
3.2 Métodos
3.2.1 Avaliação da ocorrência de mastite clínica e subclínica
A ocorrência de mastite clínica e subclínica das cinco propriedades leiteiras foram
avaliadas pelo exame dos quartos mamários dos animais em lactação, utilizando-se os testes
de triagem Tamis e CMT, respectivamente.
1º 2º 3º 4º
1º dia 15º dia 30º dia 45º dia
30
3.2.1.1 Mastite clínica
Os quartos mamários avaliados que apresentaram leite com grumos nos primeiros
jatos no exame de Tamis e ou alterações visíveis da glândula mamária (edema, calor, rubor e
dor), foram classificados como casos de mastite clinica.
3.2.1.2 Mastite subclínica
A mastite subclínica foi avaliada com o auxílio do California Mastitis Test (CMT) e
classificada em escores (THIERS et al. 1999).
De cada quarto mamário foi retirado uma amostra de leite à qual foi adicionado, na
mesma proporção, um detergente aniônico (alquil - lauril sulfato de sódio) capaz de
emulsionar os lipídios das membranas dos leucócitos presentes no leite, com consequente
liberação do material nucléico. Ocorre uma gelificação da mistura leite-reativo proporcional à
quantidade de células presentes classificada em diferentes escores, que correspondem às
diferentes intensidades do processo inflamatório. O teste de CMT foi classificado em escores
negativo, 1, 2 ou 3, de acordo com ausência ou aumento da viscosidade da mistura, sendo
considerados como casos de mastite subclínica a partir do escore 1.
As amostras de leite para a contagem de células somáticas dos balões coletores ou
baldes e tanques de resfriamento foram colhidas em frascos plásticos estéreis contendo
conservante bromotimol. A Contagem de células somáticas foi realizada no Laboratório
Clínica do Leite (ESALQ - USP), utilizando-se o aparelho SOMACOUNT TM 300*¹
(“Bentley Analytical Instruments for Dairy Industry”).
3.2.1.3 Isolamento e identificação dos agentes causadores de mastite
As amostras de leite foram colhidas, assepticamente de todos os quartos mamários,
para isolamento e identificação microbiológica dos agentes causadores de mastite. Antes da
colheita o quarto mamário foi lavado com água, seco com papel toalha descartável e
submetida à antissepsia com algodão embebido em álcool iodado (1.000 ml de álcool 70%
31
GL: 20 ml iodo 2,5%). A seguir amostras de 2 a 5 ml de leite foram colhidas em frascos
estéreis, identificadas com o número do animal e quarto mamário. O material foi congelado
imediatamente após a coleta e encaminhado ao “Laboratório da Qualidade do leite” do
Instituto de Zootecnia (IZ-APTA) da Secretaria de Agricultura e Abastecimento do Estado de
São Paulo (SAA), para isolamento e identificação microbiológica e avaliação de resíduos de
antimicrobianos.
No laboratório, alíquotas de leite (10µl) foram cultivadas em placas de Petri
contendo ágar sangue preparado com 5% (v/v) de sangue desfibrinado de carneiro e
incubadas em aerobiose a 37oC por 72 horas com leituras após 24, 48 e 72 horas. As colônias
isoladas foram observadas quanto à morfologia, tamanho, pigmentação e presença de
hemólise. Os microrganismos isolados foram observados pelo microscópio óptico por meio
de esfregaços corados pelo método de Gram. As técnicas microbiológicas para a identificação
das bactérias foram empregadas conforme descrito por Murray et al., (1999) e a classificação
de acordo com Buchanan e Gibbons (1974).
Alíquotas de leite (10 µl) também foram cultivadas em placas de Petri contendo
ágar Sabouraud dextrose acrescido de cloranfenicol (100mg/L). Após a incubação de 3 a 10
dias a 22-25°C as colônias de cada tipo morfológico diferente foram descritas e mantidas em
ágar Sabouraud dextrose acrescido com cloranfenicol e ágar Yeast Extract Peptona Glucose
(YEPG).
A identificação dos fungos filamentosos foi realizada através de padrões
morfológicos como características macroscópicas dos cultivos e microscópicas das colônias
através da técnica de microcultivos em lâmina em ágar Sabouraud dextrose acrescido de
cloranfenicol, conforme RIDELL (1950). Os fungos filamentosos foram classificados
segundo os compêndios: RAPER e FENNELL, 1965; ARX, 1974; NELSON; TOUSON;
MARASAS et al., 1983; BARNETT; PAYNE; YARROW, 2000).
As leveduras isoladas foram identificadas por testes padrões morfológicos (macro e
microscópicos) através de microcultivos em agar fubá Tween 80, testes de assimilação de
açúcares (auxonograma) através dos kits API 20CR (BioMérieux), teste de assimilação de
32
fontes de nitrogênio (peptona e lisina), teste de fermentação de glicose (zimograma) e prova
da urease (YARROW, 1998; NEUFELD, 1999; SIDRIM e ROCHA, 2004). Utilizou-se para
identificação das leveduras a chave de classificação de Barnett, Payne e Yarrow (2000).
3.2.2 Avaliação da presença de resíduo de antimicrobiano no leite
As análises foram realizadas com teste microbiológico comercial (Delvotest® SP).
Os testes obedeceram às recomendações do fabricante obedecendo a seguintes metodologias:
foram adicionados volumes de 0,1 ml das amostras de leite a serem analisadas, em ampolas
(Delvotest®) com B. stearothermophilus var. calidolactis, em meio de ágar com indicador.
Estas ampolas permaneceram em banho-maria a 64°C por 3 horas para o Delvotest® SP.
Após este período foram realizadas as leituras considerando-se positivos os testes que não
apresentavam uma mudança da cor púrpura para amarela. Para diminuir a ocorrência de
falso-positivos, pela interferência de substâncias antimicrobianas naturais do leite (lisozima,
lactoferrina), as amostras de leite foram previamente aquecidas em banho-maria a 80°C
durante 5 minutos (RAIA JÚNIOR, 2001).
Para validação do método foram utilizados controle negativo e controle positivo. O
controle negativo do kit foi preparado utilizando leite cru tipo B de vaca sem tratamento por
longo período e isento de resíduos. O controle positivo do kit foi preparado através da
fortificação de amostras de leite negativas com uma solução de penicilina (potassium G
penicillin - MERCK), nas seguintes concentrações: 1.5ppb; 3.0ppb; 4.5ppb e 6.0ppb.
3.2.3 Análise estatística
A análise estatística foi realizada pelo teste Qui-quadrado (χ2) e teste Kruskal-
Wallis empregando-se o “Software Graphpad Instat” (2003).
33
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Mastite clínica
Os resultados da frequência relativa da ocorrência de mastite clínica nos quartos
mamários das vacas em lactação nas propriedades leiteiras durante o período experimental
encontram-se dispostos na tabela 3 e ilustrados na figura 3.
Tabela 3 - Frequência relativa (%) da ocorrência de mastite clínica de vacas em lactação de propriedades
leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010.
Propriedades 1° Período 2º Período 3° Período 4° Período
A 03,73 05,45 4,38 5,00 B 16,66 16,66 ... ... C 03,17 02,89 4,23 0,95 D ... ... 2,32 2,32 E ... ... 0,00 0,00
... - não disponível.
34
3,73
5,45
4,38
5
16,66
16,66
3,17
2,89
4,23
0,95
2,32
2,32
000%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
Freq
uênc
ia R
elat
iva
A B C D E
Propriedades
Mastite Clínica
1° Período 2º Período 3° Período 4° Período
Figura 3 - Frequência relativa de ocorrência de mastite clínica de vacas em lactação de
propriedades leiteiras na região metropolitana de Campinas-SP, 2010.
Os resultados indicaram que três propriedades, A, B e C, apresentaram índices de
mastite clínica superiores ao aceito internacionalmente, que segundo Reneau (1993) deve ser
inferior a 3%. A propriedade B apresentou índices bastante elevados nos dois períodos
avaliados (16,66 %).
Esses resultados corroboram com os encontrados por Bueno et al. (2002) que em
levantamento realizado em 5 propriedades leiteiras na região de Pirassununga, estado de São
Paulo, encontraram em 201 animais avaliados, 14,29% de animais com mastite clinica, sendo
que a menor frequência de mastite clínica estava em torno de 3,45%. Recentemente Ribeiro
et al. (2007), monitorando propriedades leiteiras no Rio Grande do Sul, diagnosticaram
mastite clínica em 1,22% dos quartos mamários avaliados.
A variação da frequência relativa sobre a ocorrência de mastite clínica entre as
propriedades está intimamente ligada às características de produção e manejo dos animais. A
elevada ocorrência de mastite clínica na propriedade B, apesar de ter um rebanho de animais
de raça leiteria especializada, demonstra manejo de ordenha inadequado sem a utilização de
cuidados mínimos de prevenção e controle como a desinfecção dos tetos, utilização de papel
35
toalha individual e descartável, higiene das instalações e número reduzido de ordenhas. A
propriedade A, por sua vez, apesar das suas características de produção e manejo adequadas,
apresentou entre o segundo e quarto período de coleta, índices que variaram entre 4,38 a
5,45%, indicando a necessidade de rastreamento dos pontos críticos que possam estar
contribuindo para a elevação na ocorrência de mastite clínica. O processo inflamatório da
glândula mamária e o nível de infecção de um rebanho ocorrem por vários fatores, entre eles,
treinamento inadequado de mão de obra, falha no sistema mecânico de ordenha, número de
lactações da vaca, número de ordenhas e tipo de microrganismo isolado (HARROP et al.,
1975; MC DERMOTT et al., 1983; HOLMES; KAMOTE; MACKENZIE, 1996).
4.2 Mastite subclínica
Os resultados de frequência relativa dos diferentes escores de CMT dos quartos
mamários de vacas em lactação obtidos nos diferentes períodos por propriedade leiteira
encontram-se expressos na tabela 4.
Tabela 4 - Frequência relativa (%) dos escores do Califórnia Mastitis Test (CMT) dos quartos mamários de
vacas em lactação nas propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010.
CMT Propriedades Períodos 0 1 2 3
1 76,88 4,72 9,90 8,49 2 61,35 23,67 5,80 9,18 3 67,31 19,23 9,13 4,33
A
4 71,36 7,77 9,22 11,65 1 31,91 25,53 12,76 29,79
B 2 29,79 14,89 14,89 40,42 1 87,32 3,75 3,29 5,63 2 67,77 14,22 11,85 6,16 3 83,57 7,98 3,75 4,69
C
4 72,98 13,27 9,00 4,74 1 54,16 26,04 9,37 10,42 2 44,21 31,58 11,58 12,63 3 64,21 10,53 3,16 22,11
D
4 65,26 8,42 14,74 11,58 3 81,25 0,00 18,75 0,00 E 4 84,76 2,44 7,32 5,49
36
A maioria das propriedades (A, C, D e E) apresentaram grande parte dos seus
resultados negativos ao exame do CMT, com índices variando de 44,21% a 87,32%, enquanto
que a propriedade B apenas 29,79% dos quartos mamários foram negativos ao CMT. Na
última coleta 40,42% das amostras da propriedade B apresentaram o nível máximo de escore
no CMT (escore 3) (Tabela 4). Ribeiro et al. (2007) ao monitorarem propriedades leiteiras do
Rio Grande do Sul encontraram 31,17% de mastite subclínica e Pereira et al. (2007)
encontraram índices variando de 18,63 a 89,70% de mastite subclínica no estado de Minas
Gerais.
A tabela 5 e figura 4 demonstram os resultados do CMT subdivididos em escores
positivos e negativos e as frequências relativas de mastite subclínica nas propriedades. A
propriedade B teve destaque na frequência relativa de mastite subclínica no rebanho com
índice de 69,1%, seguida da propriedade D que apresentou frequência relativa de 43,0%.
Tabela 5 - Frequência relativa (%) dos escores negativo e positivo no California Mastitis Test (CMT) dos
quartos mamários de vacas em lactação nas propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP,
2010.
Propriedades CMT Negativo CMT Positivo
A 69,2 30,8
B 30,9 69,1
C 77,9 22,1
D 57,0 43,0
E 83,0 21,0
De acordo com o presente trabalho, 20% das propriedades analisadas apresentaram
ocorrência de mastite subclínica em 69,1% dos quartos mamários e 80% das propriedades
apresentaram ocorrência de mastite subclínica entre 21 e 43% dos quartos mamários. Estes
resultados corroboram com os encontrados por Pereira et al. (2007) que observaram que
54,83% dos rebanhos avaliados no estado de Minas Gerais apresentaram índices de mastite
subclínica superiores a 50%, enquanto que 19,35% dos rebanhos apresentaram índices
superiores a 70%.
37
69,2
30,8
30,9
69,1
77,9
22,1
57
43
83
21
0
20
40
60
80
100
120
Freq
.Rel
ativ
a
A B C D E
Propriedades
Mastite Subclínica
CMT Negativo CMT Positivo
Figura 4 - Frequência relativa (%) dos escores negativo e positivo ao California
Mastitis Test (CMT) dos quartos mamários de vacas em lactação nas propriedades
leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010.
Langenegger et al. (1970), examinando 2187 vacas através do CMT, encontraram
que 429 (20%) apresentavam reação positiva ao CMT. Nader Filho, Shocken-Iturrino, Rossi
Jr. (1983), estudando 468 vacas pertencentes a 6 rebanhos leiteiros da região de Barretos,
encontraram 56 animais (11,97%) positivos ao CMT.
Os resultados encontrados acrescentam-se aos levantamentos realizados de 1970 até
hoje no Brasil, que apontam alta frequência desta doença nos rebanhos brasileiros, com
índices variando de 11,9% a 58,8% de vacas infectadas, sendo que todos os rebanhos leiteiros
do país apresentam mastite subclínica em maior ou menor grau (PEREIRA; MACHADO;
SARRIES, 2001).
4.3 Contagem de células somáticas (CCS) nos tanques de resfriamento
Os resultados das contagens de células somáticas (CCS) realizadas nos tanques de
resfriamento das propriedades leiteiras estão dispostos na tabela 6 e figura 5. Os resultados
38
mostram que em certos períodos as propriedades apresentaram contagens superiores a
750.000 cél./mL; sendo que a propriedade B ultrapassou a contagem de 1.000.000 cél./mL.
Estes dados são preocupantes uma vez que infringem o valor máximo estabelecido pela
Instrução Normativa nº51 (BRASIL, 2002).
Tabela 6 - Contagem de células somáticas (CCS) nos tanques de resfriamento de propriedades leiteiras da
região metropolitana de Campinas-SP, 2010.
A1 A2 B C D E
Média 438,25 423,25 693,5 630,00 670,25 680,5
Desvio Padrão da Média 291,90 157,46 433,67 188,39 143,73 123,07
Valor Mínimo 221,00 297,50 271,00 459,00 546,00 503,00
Valor Máximo 869,00 645,00 1124,0 827,00 813,00 784,00
Mediana 331,50 376,50 689,50 617,00 661,00 717,50 Teste de Kruskall - Wallis (P > 0, 05).
Figura 5 – Contagem de células somáticas nos tanques de resfriamento das propriedades
leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP.
Os padrões e normas para a produção de leite no país devem atender os critérios
pré-estabelecidos pela legislação, em especial à IN nº51, que estabelece para a região sul,
0
200
400
600
800
1000
1200
CC
S
A1 A2 B C D EPropriedades
CCS nos Tanques de Resfriamento
Média Desvio da Média Valor Mínimo Valor Máximo Mediana
39
sudeste e centro oeste o limite na contagem de células somáticas de até 750.000 cél./mL
(BRASIL, 2002).
A correlação entre a média de CCS no tanque de resfriamento e a ocorrência de
mastite é alta e varia de 0,50 a 0,96 (EMANUELSON e FUNKE, 1991). Elevada CCS no
tanque geralmente indica perda de produção de leite, sendo que a manutenção de baixa CCS
no tanque é um indicativo de boa saúde da glândula (SCHUKKEN et al., 1990).
Assim como a contagem de células somáticas (CCS) do leite de uma vaca permite a
quantificação do grau de infecção da glândula mamária, a avaliação periódica da CCS do leite
do tanque do rebanho permite a determinação da incidência média de mastite no rebanho
(MACHADO et al., 2000). Embora, nesse trabalho não tenham sido encontradas diferenças
estatísticas significantes na CCS dos tanques de resfriamento entre as propriedades leiteiras, a
observação de Machado (2000) corrobora com o presente trabalho, visto que a propriedade
com maior freqüência de mastite clínica e subclínica, a propriedade B, apresentou as maiores
contagens de células somáticas no tanque de resfriamento (1.124 x 103 cél./mL).
Os dados mostram que a situação atual dos rebanhos é preocupante, porque está em
desacordo com IN nº 51 e muito acima dos observados em países desenvolvidos. Segundo
Wells e Ott (1998), a média anual de CCS nos tanques dos EUA é menor que 350.000
cél./mL.
4.4 Contagem de células somáticas (CCS) nos balões coletores
Os resultados das contagens de células somáticas realizadas nos balões coletores
estão dispostos na tabela 7.
Nos diferentes períodos de colheita das amostras a propriedade C apresentou entre
57% a 70% das vacas em lactação com CCS abaixo de 200.000 cel/mL, seguida da
propriedade A que apresentou frequência entre 43% a 72% para o mesmo valor. Harmon
(2001) afirmou que o limite de até 200.000 cél/mL é o mais indicado para estimar a saúde da
glândula mamária e que CCS ≥200.000 cél/mL é sugestivo de processo inflamatório ou
40
infeccioso. No presente trabalho, algumas propriedades (B, D e E) apresentaram CCS
superiores ao proposto na literatura em muitos momentos; a propriedade B apresentou entre
73 a 82% das amostras leite com resultados acima de 1.000.000 cél./mL nos balões coletores,
seguida da propriedade D que apresentou mais de 25% das amostras em todas as coletas com
contagens semelhantes.
Tabela 7 - Frequência relativa (%) da contagem de células somáticas (CCS) de balões coletores de leite de vacas
em lactação das propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010.
Propriedade A Propriedade B Propriedade C Propriedade D Propriedade E
Período 1º 2º 3º 4º 1º 2º 3º 4º 1º 2º 3º 4º 1º 2º 3º 4º 1º 2º 3º 4º
< 200 52 43 72 52 0 0 ... ... 69 70 57 59 ... 38 29 33 ... ... 0 40 ≥200 e <400 15 13 7 19 9 9 ... ... 13 11 20 15 ... 17 21 17 ... ... 25 20
≥400 e < 750 7 20 6 15 9 9 ... ... 4 9 11 13 ... 8 13 8 ... ... 75 13
≥751e <1000 4 13 6 4 9 0 ... ... 6 2 0 2 ... 8 13 17 ... ... 0 7
CC
S x
1.00
0 cé
l/mL
≥1001 22 11 9 11 73 82 ... ... 9 7 11 11 ... 29 25 25 ... ... 0 20 ...- não avaliado.
A análise estatística realizada (Tabela 8 e Figura 6) revelou que houve diferença
significante na CCS nos balões coletores entre as propriedades, exceto entre as propriedades
A e E; D e E.
Tabela 8 - Contagem de células somáticas (CCS) nos balões coletores de propriedades leiteiras da região
metropolitana de Campinas-SP, 2010.
Propriedades Média x103 cél/mL
Mediana x103 cél/mL
Mínimo x103 cél/mL
Máximo x103 cél/mL Desvio padrão
A 520 163 3 9969 1051
B 1827 1542 289 5684 1287
C 393 86 1 6380 868
D 760 377 1 4276 897
E 591 321 3 2881 698 Teste de Kruskall - Wallis (P < 0, 001) – Houve diferença significante entre A e B; A e C; A e D; B e C; B e D; B e E; C e D.
Teste de Kruskall – Wallis (P > 0, 05) – Não houve diferença significante entre A e E; D e E
41
0
2000
4000
6000
8000
10000C
CS
(103 c
él./m
L)
Média Mediana Mínimo Máximo Desvio padrão
CCS nos Balões Coletores
Propriedade A Propriedade B Propriedade C Propriedade D Propriedade E
Figura 6 - Contagem de células somáticas (CCS) nos balões coletores de propriedades
leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010.
As variações na contagem de CCS podem estar relacionadas com o tipo de agente
envolvido. As bactérias responsáveis pela mastite podem ser classificadas como patógenos
principais e secundários. Os patógenos principais mais comuns incluem o S. aureus, S.
agalactiae, coliformes, estreptococos e enterococos de origem ambiental. Mastites causadas
por estes patógenos resultam em grandes variações na composição do leite e na CCS
(HARNON, 1994).
Wilson, Gonzalez e Das (1997) verificaram que a CCS média para animais com
isolamento de S. aureus e S. agalactiae foi de 440.000 e de 640.000 células/mL,
respectivamente. Staphylococcus spp. coagulase negativa e Corinebacterium bovis são
considerados patógenos secundários, e infecções por estes microrganismos causam moderado
processo inflamatório com CCS excedendo de duas a três vezes em relação a glândulas
mamárias não infectadas (HARMON, 1994).
Brito et al. (1999) verificaram grande variação da CCS e de percentual de quartos
mamários com CMT positivo em função dos agentes isolados, e o efeito específico de
42
patógenos na variação da CCS pode ser usado em programas de controle da mastite (HAAS;
BARKEMA; VEERKAMP, 2002).
Brito et al. (1999) mostraram grande variação da CCS e de percentual de quartos
mamários com CMT positivo em função dos agentes isolados. A variação na CCS entre os
animais afetados pelo mesmo agente pode estar relacionada às características inerentes ao
próprio animal. Além disso, o valor da CCS também é influenciado pela ordem de parto,
período de lactação, estação do ano e manejo do rebanho conforme Harmon (1994) e
Schepers et al. (1997).
Os resultados encontrados reforçam as observações de que a CCS está ligada às
características de manejo dos animais e características das propriedades. Coentrão et al.
(2008) avaliaram os fatores de risco para a mastite subclínica (CCS > 200.000 cél./ml) em
2.657 vacas, de 24 rebanhos do estado de Minas Gerais. Os pesquisadores concluíram que os
principais fatores de risco para ocorrência de mastite subclínica em vacas leiteiras estavam
ligados às características dos animais, do manejo inadequado, à inexistência de treinamento
dos ordenadores, a não utilização de serviços laboratoriais para identificação dos patógenos
causadores de mastites e a utilização de equipamentos de ordenha sem manutenção periódica.
Alguns trabalhos destacam também a influência do tipo de ordenha na CCS, e
observam que a ordenha mecânica, seja ela de circuito fechado ou de balde ao pé, favorece o
aumento da CCS no leite das propriedades. Barbosa, Benedetti e Guimarães (2009) ao
compararem três tipos de ordenha, a mecânica de circuito fechado, mecânica balde ao pé e
manual, observaram que a ordenha mecânica apresentou maior coeficiente de variação na
CCS, pois obteve valores máximos e mínimos muito distantes. A ordenha manual apresentou
os menores valores de CCS tanto no máximo quanto no mínimo, o que refletiu em menor
média da CCS.
Segundo Knappstein e Reichmuth (2002) a ordenha mecânica quando comparada
com a manual leva vantagem em relação à saúde do úbere, no que diz respeito à velocidade e
diminuição do tempo de operação, mas que as falhas no controle das máquinas de ordenha,
no que diz respeito à pulsação e linha de vácuo, podem trazer sérios danos à glândula
43
mamária, principalmente leite residual e lesões de tetos. Entretanto, eles ressaltam que não é
necessariamente o tipo de ordenha o responsável pela infecção da glândula mamária e sim o
nível de higiene e o manejo da propriedade, e que estes estão diretamente relacionados à CCS
cujos valores aumentam quando ocorrem estas irregularidades.
Alguns trabalhos comprovaram que alguns procedimentos simples podem contribuir
para o melhor desenvolvimento do sistema leiteiro. A importância do manejo, não somente
durante a ordenha, foi descrita por Barkema et al. (1999) e Ott e Novak (2001), em estudos
sobre fatores de risco para mastite, e evidenciada no presente estudo. A imersão dos tetos em
solução desinfetante após a ordenha, o tratamento à secagem de todos os animais, o
tratamento imediato dos casos clínicos e a segregação de animais no momento da ordenha
(ALLORE et al., 1998; BERRY e HILLERTON, 2002) podem contribuir para a redução dos
casos de mastite e alta CCS.
4.5 Contagem de células somáticas (CCS) nos balões coletores e California Mastitis Test (CMT)
A tabela 9 e figura 7 apresentam os resultados da análise estatística realizada entre
as diferentes classes de CCS dos balões coletores associados com os escores de CMT obtidos
nas avaliações dos quartos mamários das vacas em lactação.
Tabela 9 – Frequência relativa (%) das classes de CCS dos balões coletores em funções dos escores de CMT dos
quartos mamários nas propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010.
Classes de CCS (x1.000 cel//mL) CMT 0 CMT 1 CMT 2 CMT 3
CCS 1 (< 200) 90,19 88,59 81,87 77,78
CCS 2 (≥ 200 e <400) 3,69 2,66 4,68 3,70
CCS 3 (≥ 400 e <750) 2,23 3,42 5,26 3,17
CCS 2 (≥ 750 e <1000) 0,97 2,28 1,17 3,17
CCS 5 (≥ 1000) 2,92 3,04 7,02 12,17
CCS – Contagem de células somáticas
CMT – California Mastitis Test
Teste de Qui-quadrado P < 0,05
44
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Freq
uênc
ia r
elat
iva
(%)
CMT 0 CMT 1 CMT 2 CMT 3
CCS 1 CCS 2 CCS 3 CCS 4 CCS 5
Figura 7 – Frequência relativa (%) das classes de CCS dos balões coletores em
funções dos escores de CMT dos quartos mamários nas propriedades leiteiras
da região metropolitana de Campinas – SP, 2010.
O teste Qui-quadrado para as frequências de classes de CCS e os escores de CMT foi
significante a 5 % de probabilidade (P< 0,05) (χ2 = 57.667, 12 GL, P = 0, 000), indicando que
as diferenças na ocorrência de CMT estavam associadas às classes de CCS, sendo que a CCS
nos balões coletores aumentou com os maiores escores de CMT. Este resultado destaca a
importância do CMT como ferramenta auxiliar na identificação de amostras com CCS
elevadas. A concordância entre o CMT e a CCS encontrada no presente trabalho também foi
encontrada por outros autores (BATRA e MCALLISTER, 1984; VIANNI e NADER FILHO,
1989; COSTA et al., 1996b; DELLA LIBERA, 1998).
4.6 Isolamentos de agentes causadores de mastite
Os resultados dos isolamentos microbiológicos estão dispostos na tabela 10 e
mostram que 58,02% das amostras de leite dos quartos mamários foram negativas para
isolamento de agentes microbianos e 41,98% das amostras dos quartos mamários foram
positivas ao isolamento de agentes.
45
Tabela 10 - Frequências absoluta e relativa (%) de isolamentos microbiológicos das amostras de leite dos
quartos mamários de vacas em lactação de propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas, 2010.
Isolamentos Frequência Absoluta Frequência Relativa (%)
Negativos 1371 58,02 Positivos 992 41,98
Esses resultados aproximam-se dos encontrados na literatura. Beloti et al. (1997),
trabalhando com 295 amostras de leite, obtiveram crescimento bacteriano em 223 (75,60%)
amostras. Costa, Coutinho e Teixeira (1986) relataram o crescimento bacteriano em 88,79%
entre as 2.533 amostras de leite procedentes de 32 propriedades leiteiras, de dezoito
municípios do estado de São Paulo.
No presente trabalho, os gêneros mais isolados foram Staphylococcus (55,75%),
Corynebacterium (24,60%), Streptococcus (16,73%), seguidos por leveduras e fungos
filamentosos com 4,74% e 2,62%, respectivamente (Tabela 11). Estes resultados estão de
acordo com trabalhos que apontam para o Staphylococcus spp. como o principal agente
causador de mastite no Brasil.
Langenegger et al. (1970) encontraram 53,1% de S.aureus dentre 429 vacas com
exame microbiológico positivo. No mesmo estudo também foram isolados S. agalactiae
(24,7%), S. dysgalactiae (17,2%) e S.uberís (4,6%). Nader Filho; Shocken-Iturrino; Rossi Jr.,
(1983) encontraram dentre as amostras positivas obtidas 52,08% de S. aureus, 14,58% de S.
dysgalactiae, 10,42% de S. agalactiae, 8,33% de S. uberis e 6,25% de S. epidermidis.
Langoni et al. (1990), examinando 702 amostras de leite com mastite subclínica, encontraram
a seguinte ocorrência de agentes: S. aureus 36,9%, S. epidermidis 22,2%, C. bovis 4,8%. C.
pyogenes 4,4%, S. uberis 4,3%, E. coli 4,0%, S. dysgalactaie 3,8%, S. agalactiae 3,7% e
Candida albicans 3,8%.
No presente trabalho o gênero Corynebacterium foi o segundo mais isolado
(24,60%), este resultado destaca o aumento da importância do C. bovis como agente
etiológico causador de mastite. Costa et al. (1985) isolaram C. bovis em 954 amostras
(32,50%) de um total de 2.935 oriundas de 17 municípios do estado de São Paulo.
46
Fernandes et al. (2001) avaliarem 19.113 amostras de leite de vacas em lactação
com mastite e a maior prevalência de microrganismos isolados nas 8.848 amostras com
crescimento positivo foram: Staphylococcus coagulase positiva (30,1%), Corynebacterium
bovis (22,5%), Staphylococcus epidermites (13,1%) e Streptococcus spp. (14,2%).
Laranja e Machado (1994) estudaram o perfil microbiológico de 1.683 vacas com
mastite clínica e subclínica e encontraram dentro dos 983 isolamentos positivos, 44,6% de
Staphylococcus spp., 15,0% de Corynebacterium spp. e 8,2% de Streptococcus spp., 5,4% de
fungos filamentosos e leveduras. Quando considerado o isolamento tanto em cultura pura
quanto em cultura mista, a ocorrência de Staphylococcus spp. passou para 55,6% e
Corynebcterium spp. para 18%.
Estes trabalhos reforçam a tendência verificada que aponta o C. bovis como segundo
agente, em termos de frequência de isolamento, em trabalhos realizados no Brasil.
Tabela 11 – Frequências absoluta e relativa (%) dos agentes causadores de mastite nas amostras de leite dos
quartos mamários de vacas em lactação de propriedades de leite da região metropolitana de Campinas-SP, 2010.
Isolamentos Frequência Absoluta Frequência Relativa
Bactérias
Staphylococcus spp. 553 55,75 Corynebacterium spp. 244 24,60
Streptococcus spp. 166 16,73
Fungos Filamentosos e Leveduras
Candida spp. 32 3,23 Aspergillus spp. 18 1,81
Criptococcus spp. 05 0,50 Trichosporon spp. 05 0,50 Penicillium spp. 04 0,40 Geotrichum spp. 03 0,30 Acremonium spp. 02 0,20
Fusarium spp. 01 0,10 Mucor spp. 01 0,10 Pichia spp. 01 0,10
Rhodotorula spp. 01 0,10
47
Dentre o gênero Staphylococcus, o Staphylococcus coagulase negativa apresentou a
maior frequência de isolamentos (45,93%), seguida do Staphylococcus coagulase positiva
(28,57%), Staphylacoccus aureus (17,90%) e Staphyloccocus spp. (7,59%) (Tabela 12 e
Figura 8).
Bactérias do gênero Staphylococcus ocupam um papel destacado na etiologia das
infecções intramamárias do gado leiteiro. As espécies coagulase-negativas, comumente
isoladas de leite bovino, são consideradas patógenos secundários e, em geral, causam reação
inflamatória moderada na glândula mamária (HARMON e LANGLOIS, 1989; BRAMLEY et
al., 1996).
A espécie S. aureus é considerada um patógeno primário e tem sido o agente mais
freqüentemente isolado tanto de infecções clínicas como subclínicas (WATTS, 1988;
BOOTH, 1995; BRAMLEY et al., 1996; BRITO et al., 1999). As taxas de isolamento são
variáveis de acordo com diferentes autores, entretanto, o mesmo tem sido considerado como
de maior significado nas infecções intramamárias. Quanto a sua participação nas mastites,
sejam clínicas ou subclínicas, encontraram-no em 16,9% e 76,5% dos casos, respectivamente
(FERREIRO, 1985; LANGENEGGER; FIGUEIREDO; REZENDE, 1986). Mastite
subclínica causada pelo S. aureus é uma das mais freqüentes e problemáticas manifestações
do agente nos rebanhos leiteiros, devido a sua natureza crônica e baixas taxas de cura
(OGOLA; SHITANDI; NANUA, 2007). Além disso, S. aureus é mundialmente reconhecido
como causador de várias doenças purulentas (BEAN e RIFFIN, 1990), sendo também uma
das mais importantes causas de intoxicação alimentar (OMOE et al., 2002; OLIVEIRA,
2003).
Algumas características de virulência do S. aureus contribuem para a persistência
desta bactéria no tecido mamário (SANTOS et al. 2003) e o uso inadequado de antibióticos
no tratamento da doença pode gerar o aparecimento de cepas resistentes e comprometer a
eficiência do tratamento (BARBERIO, GIETL, DALVIT; 2002). De acordo com Brito et al.
(2001), diversos estudos sobre a sensibilidade antimicrobiana realizados no Brasil com
patógenos envolvidos na mastite bovina demonstram um aumento crescente no padrão de
resistência, principalmente para S. aureus.
48
Langoni et al. (1991) isolaram o S. aureus em 35,53% das 702 amostras de leite
procedentes de vaca com mastite subclínica. Castrejón e Perea (1994) relataram a sua
presença em 85% dos 50 casos de mastite clínica, e Obritzhauser, Deutz e Fuchs (1995) em
27,3% dos casos. Os resultados encontrados no presente estudo (17,90%) acrescentam-se aos
muitos trabalhos presentes na literatura e reforçam a necessidade de políticas públicas e
privadas de controle e manejo a fim de se evitar o comprometimento da saúde pública.
Tabela 12 - Frequência relativa (%) de ocorrência do gênero Staphylococcus spp. nas amostras de leite dos
quartos mamários das vacas em lactação
Perfil do gênero Staphylococcus Total Frequência Relativa (%) Staphylococcus spp. 042 07,59
Staphylococcus coagulase positiva 158 28,57 Staphylococcus coagulase negativa 254 45,93
Staphylococcus aureus 099 17,90
Frequência relativa (%) de ocorrência do gênero Staphylococcus spp.
17,97,59
28,57
45,93
Staphylococcus spp. Staphylococcus coag. positiva
Staphylococcus coag. negativa Staphylococcus aureus
Figura 8 – Frequência relativa (%) de ocorrência do gênero Staphylococcus
spp. nas amostras de leite dos quartos mamários das vacas em lactação.
Quanto aos aspectos de saúde pública, relacionados à produção de enterotoxinas
pelo S. aureus, De Freitas e Magalhães (1990), estudando a enterotoxigenicidade de 93
amostras de S. aureus encontraram 1,07 % produtoras de enterotoxina biótipo A, reconhecida
como a principal implicada em casos de toxinfecções alimentares. Amostras de S. aureus
49
enterotoxigênicos têm sido isoladas de leite pasteurizado, iogurte caseiro, leite em pó,
achocolatados e sorvetes, bem como de outros subprodutos lácteos. A fonte de contaminação
pode ser tanto o leite oriundo de vacas com mastite como os manipuladores envolvidos
(OMBUI; ARIMI; KAYHURA, 1992). Sabe-se que a intoxicação estafilocócica não é de
notificação compulsória e desta forma é impossível precisar a sua real incidência. Mead et al.
(1999) estimaram nos Estados Unidos a ocorrência de 185.060 casos anuais.
A figura 9 mostra o perfil de isolamentos de leveduras e fungos filamentosos. O
gênero Candida spp. foi o mais isolado dentre as leveduras (43,33%), seguido dos gêneros
Trichosporum spp. (6,84%) e Criptococcus spp. (6,84%). O gênero Aspergillus spp. foi o
fungo filamentoso mais frequentemente isolado (24,65%).
Os resultados encontrados corroboram com os achados por Costa et al., (1993), os
quais relataram a ocorrência de mais de 30% de casos de mastite micótica em animais com
quartos mamários aparentemente normais e relataram que as leveduras estão presentes na
glândula e superfície dos tetos e em condições adequadas podem se instalar e produzir
infecção e os de Santos e Marin (2005) que isolaram em 25,4% das amostras de leite pelo
menos um agente leveduriforme de casos de mastite clínica e subclínica.
Frequência relativa (%) de ocorrência de Leveduras e Fungos filamentosos
6,84
6,84
24,65
43,33
Candida spp. Trichosporon spp. Criptococcus spp. Aspergillus spp.
Figura 9 – Perfil de isolamentos dos gêneros de leveduras e fungos
filamentosos nas amostras de leite de quartos mamários de vacas em lactação.
50
Wunder Junior (2007) de um total de 240 amostras de leite analisadas realizou o
isolamento de 65 espécies de leveduras, sendo 23 em amostras de leite de animais com
mastite clínica e 42 amostras de leite de animais com mastite subclínica. O autor identificou
10 gêneros diferentes, sendo Candida (38,5%) a mais prevalente, seguido dos gêneros Pichia
(20%), Cryptococcus e Rhodotorula (10,8%).
Apesar de os fungos filamentosos estarem amplamente distribuídos na natureza, eles
são apenas esporadicamente isolados de casos de mastite, enquanto que as leveduras são os
fungos que mais frequentemente estão relacionados às infecções da glândula mamária em
animais produtores de leite (CHENGAPPA et al., 1984; AALBAEK et al., 1994). O perfil de
isolamento micótico encontrado no presente trabalho pode estar relacionado às características
da propriedade, visto que propriedades específicas (propriedades A e C) de exploração mais
intensiva e de maior produção leiteira apresentaram a maior freqüência dos isolamentos. Este
dado reforça a necessidade de pesquisas focalizadas e mais aprofundadas sobre o assunto.
Na tabela 13 e figura 10 são apresentadas as frequências de quartos mamários com
isolamentos de agentes causadores de mastite em cada propriedade. Houve diferença
significante a 5% de probabilidade (P < 0,05) (χ2 = 20.045, 4 GL, P = 0,000), indicando que
a propriedade A apresentou a menor frequência de agentes nos quartos mamários examinados
(38,42 %) e a propriedade D foi a que apresentou maior frequência de isolamentos (51,44 %).
Tabela 13 – Frequência absoluta e relativa (%) de isolamentos negativos e positivos de agentes causadores de
mastites nas propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas-SP, 2010.
Propriedades Isolamento Negativo F.R.* (%) Isolamento
Positivo F.R.*(%)
A 513 61,58 320 38,42 B 49 52,69 44 47,31 C 499 58,84 349 41,16 D 185 48,56 196 51,44 E 125 60,10 83 39,90
* Frequência Relativa Teste Qui – quadrado P < 0,05
51
0
10
20
30
40
50
60
70
Freq
uênc
ia r
elat
iva
(%)
Negativos PositivosPropriedades
A B C D E Figura 10 - Frequência relativa (%) de isolamentos negativos e positivos de
agentes causadores de mastite nas propriedades da região metropolitana de
Campinas-SP, 2010.
Estes resultados corroboram com a literatura ao reafirmar a importância da
sistematização das técnicas no manejo a fim de evitar a infecção da glândula mamária. As
duas propriedades citadas (A e D) apresentavam diferenças discrepantes no manejo e higiene
das instalações e animais (Tabela 2), esse fato foi, sem dúvida, muito importante para os
resultados encontrados.
Os resultados observados reforçam o fato de que diversas medidas sanitárias devem
ser adotadas durante o processo de ordenha para minimizar a transmissão de agentes
causadores de mastites que podem ser transferidos ao leite depreciando sua qualidade
microbiológica. Destacam-se a máquina de ordenha, as mãos do ordenhador e lesões nos tetos
dos animais como fatores importantes que expõem a superfície dos tetos aos microrganismos
(AMARAL et al. 2004). A higienização prévia dos tetos previne a mastite sendo de grande
importância na redução do número de microrganismos patogênicos no leite (NADER FILHO
et al., 1982).
52
Como observaram Laranja e Machado (1994), é comum que os produtores atendam
às medidas terapêuticas (antibioticoterapia) de combate à mastite. Já as práticas de controle
preventivas, baseadas em higiene e manejo são muitas vezes desconhecidas ou mal aplicadas
pelos produtores.
4.7 Escores do California Mastitis Test (CMT) e isolamentos microbiológicos
Os resultados dos escores do California Mastitis Test (CMT) e a frequência de
isolamentos positivos e negativos de agentes causadores de mastite estão dispostos na tabela
14 e ilustrados na figura 11. Houve diferença significante a 5% de probabilidade (P < 0,05)
(χ2 = 85.283, 3 GL, P = 0,000), entre as diferenças de agentes negativos e positivos isolados
de quartos mamários de vacas em lactação nos diferentes escores de CMT, sendo que no
CMT de escores 2 e 3 ocorreram as maiores frequências de quartos mamários com agentes
positivos.
Tabela 14 – Escores de CMT, frequências absoluta e relativa (%) dos isolamentos negativos e positivos de
agentes causadores de mastite.
CMT Isolamento Negativo F.R. (%)* Isolamento
Positivo F.R. (%)* Total de QM**
0 1055 44,65 601 25,43 1656 1 154 6,52 141 5,97 295 2 78 3,30 123 5,21 201 3 84 3,55 127 5,37 211
Total 1371 58,02 992 41,98 2363 * Frequência Relativa ** Quartos mamários Teste Qui-quadrado P < 0,05
53
Figura 11 – Frequência relativa (%) de quartos mamários com isolamentos
negativos e positivos frente aos escores de CMT.
Como é expresso na tabela 14 e ilustrado pela figura 11, amostras de leite de quartos
mamários com escore negativo no CMT foram positivas no cultivo microbiológico (25,43%).
Este dado observado mostra que apesar da detecção de quartos mamários não reagentes ao
CMT, não se pode afirmar com segurança a ausência de microrganismos na glândula
mamária (COSTA et al., 2001). Estes animais são classificados por Costa et al. (2001) como
portadores, pois apesar de não apresentarem reação positiva ao teste de CMT, apresentam
resultado positivo ao exame microbiológico. E isto é compreensível por se tratar de uma
doença com significante diversidade de etiologia, sintomatologia, alterações anátomo-
patológicas e manifestações clínicas (BENITES, 1996).
Em contrapartida, quartos mamários positivos ao CMT, mas sem isolamento
microbiológico podem ocorrer em função de um processo inflamatório de origem não
infecciosa. (VOLTOLINI et al., 2001). O exame microbiológico negativo de uma amostra de
leite colhida de um animal com elevada CCS seria possível, pois alguns agentes infecciosos
eliminados pelo leite, em quantidades mínimas, talvez não fossem detectados num único
exame laboratorial. Como outras provas diagnósticas, o resultado de um exame isoladamente
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
CMT 0 CMT 1 CMT 2 CMT 3
Freq
uênc
ia r
elat
iva
(%)
Agente Negativo Agente Positivo
54
representa apenas um momento dentre a enorme diversidade biológica e deve ser interpretado
em conjunto a outras observações clínicas. Altas CCS podem ser atribuídas, entre outros
fatores, a processos traumáticos assépticos, alterações fisiológicas decorrentes da fase da
lactação, número de lactações e idade do animal (DELLA LIBERA, 1998).
Em outros casos, também pode ser consequência da ação bactericida dos leucócitos
que no momento da amostragem já haviam destruído as bactérias ou outros patógenos
(VOLTOLINI et al., 2001). Os resultados expressos na tabela 14, ao mostrarem ausência de
isolamentos de agentes microbiológicos em algumas amostras positivas ao CMT, estão de
acordo com os observados na literatura.
4.8 Resíduos de antimicrobianos
4.8.1 Resíduos de antimicrobianos nos tanques de resfriamento
Na tabela 15 estão discriminados os resultados das amostras de leite de tanques de
resfriamento para a presença de resíduos de antimicrobianos.
Tabela 15 - Resíduos de antimicrobianos em amostras de leite de tanques de resfriamento em propriedades
leiteiras da região metropolitana de Campinas - SP, 2010.
Tanque de Resfriamento N Frequência Relativa (%)
Negativo 19 95 Positivo 01 05
Total 20 100 N = Número de tanques avaliados
Do total de tanques de resfriamentos avaliados nas propriedades leiteiras para a
presença de resíduo de antimicrobianos 5% foram positivos ao teste microbiológico
(Delvotest ®SP). A amostra de leite do tanque de resfriamento positiva ao teste
microbiológico para detecção de resíduo antimicrobiano está relacionada à propriedade
leiteira (B) que apresentou alta porcentagem de mastite clínica (Tabela 3). Esses resultados
corroboram com os encontrados por Meek et al., (1986), Ruegg e Tabone (2000) e Raia
55
Júnior (2001) que também observaram a influência da mastite clínica na presença de resíduos
de antimicrobianos em tanques de resfriamento em propriedades leiteiras.
4.8.2 Resíduos de antimicrobianos nos balões coletores
Na tabela 16 ilustrada pela figura 12 estão discriminados os resultados das análises
para a presença de resíduos de antimicrobianos nas amostras de leite de balões coletores de
vacas em lactação de propriedades leiteiras. Resíduos de antimicrobianos foram detectados
nos balões coletores no nível limite variando entre 0,00% e 1,85% e no nível positivo
variando entre 0,00% e 8,33%, apenas a propriedade E não apresentou resíduos no leite.
Assim, podemos observar que os tanques de refrigeração estão sendo abastecidos
por leite contaminado com resíduos de antimicrobianos, mas devido ao efeito de diluição esta
contaminação não é detectada nos taques através deste teste.
Tabela 16 - Resíduos de antimicrobianos em amostras de leite de balões coletores de vacas em lactação de
propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas – SP, 2010.
*Negativo *Limite *Positivo Propriedade ***F.A. ***F.R. (%) F.A. F.R.(%) F.A. F.R. (%)
Total por propriedade
A 205 94,91 01 0,46 10 4,63 216 B 022 91,67 00 0,00 02 8,33 024 C 212 98,15 04 1,85 00 0,00 216 D 094 97,92 00 0,00 02 2,08 096 E 052 100,00 00 00 00 00 052
Total 587 97,19 05 0,83 13 2,15 604 * Código de resposta do Delvotest® SP (negativo, limite e positivo).
**F.A. = Frequência absoluta.
***F.R. (%) = Frequência relativa.
56
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Freq
uênc
ia r
elat
iva
(%)
A B C D EPropriedades
Limite Positivo
Figura 12 – Resíduos de antimicrobianos em amostras de leite de balões coletores
de vacas em lactação de propriedades leiteiras da região metropolitana de
Campinas – SP, 2010.
4.8.3 Resíduos de antimicrobianos nos quartos mamários
Na tabela 17 ilustrada pela figura 13 estão discriminados os resultados das análises
para a presença de resíduos de antimicrobianos nas amostras de leite dos quartos mamários de
vacas em lactação nas propriedades leiteiras.
Resíduos de antimicrobianos foram detectados nos quartos mamários das
propriedades no nível limite variando entre 1,05% a 2,15% e no nível positivo variando entre
0,47% a 4,30%. Todas as propriedades avaliadas apresentaram nas amostras de leite dos
quartos mamários resíduos de antimicrobiano, nos níveis limite e positivo, sendo assim, os
balões estão sendo abastecidos com leite contaminado, entretanto, conforme mostra a tabela
14, em 3 propriedades não se detectou resíduo no nível limite e em 2 propriedades não se
57
detectou resíduo no nível positivo nos balões, provavelmente, devido ao efeito de diluição do
leite de cada quarto mamário quando são enviados para o balão.
Tabela 17 - Resíduos de antimicrobianos em amostras de leite de quartos mamários de vacas em lactação de
propriedades leiteiras da região metropolitana de Campinas – SP, 2010.
Negativo Limite Positivo Propriedades *F.A. **F.R. (%) F.A. F.R. (%) F.A. F.R. (%)
Total por Propriedades
A 804 96,52 10 1,20 19 2,28 833 B 087 93,55 02 2,15 04 4,30 093 C 831 98,00 13 1,53 04 0,47 848 D 373 97,90 04 1,05 04 1,05 381 E 204 98,08 03 1,44 01 0,48 208
Total 2.299 97,4 32 1,35 32 1,35 2.363 *F.A. = Frequência absoluta.
**F.R. (%) = Frequência relativa.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Freq
uênc
ia r
elat
iva
(%)
A B C D EPropriedades
Limite Positivo
Figura 13 – Resíduos de antimicrobianos em amostras de leite de quartos mamários
de vacas em lactação de propriedades leiteiras da região metropolitana de
Campinas – SP, 2010.
58
A distribuição de tetos nas classes do Delvotest ®SP mostrou que a propriedade B
apresentou maior proporção de tetos nas classes 2 e 3 (6,45% dos tetos) e a propriedade E a
menor proporção (1,92% dos tetos), porém estas diferenças não foram significantes pelo
teste Qui-quadrado a 5% de probabilidade (P<0,05) ( χ2 = 9.450, 4 GL, P = 0,051). É possível
que uma amostragem maior fosse o suficiente para revelar significância estatística neste
resultado, visto que a diferença foi mínima com um valor de P = 0, 051.
A propriedade B além de apresentar resultados de destaque na ocorrência de
resíduos de antimicrobianos no leite, incluído a presença de resíduos no tanque de
resfriamento, também apresentou maior ocorrência de mastite clínica e subclínica. Este
resultado ressalta alguns aspectos já propostos na literatura, incluindo a relação da mastite
clínica e subclínica com a ocorrência de resíduos no leite. Raia Júnior (2006) verificou que a
presença do processo inflamatório na glândula mamária, assim como, a sua intensidade,
mastite clínica ou subclínica, são fatores determinantes para a ocorrência de resíduos de
antimicrobianos no leite. Animais com mastite clínica tratados com antimicrobianos
apresentaram maior ocorrência de resíduos (47,7%) em relação aos animais com mastite
subclínica (34,9%). E, por sua vez, nos animais tratados sem mastite a ocorrência de resíduos
foi muito mais baixa (9,5%).
Nas propriedades com sistema intensivo de produção que apresentavam um bom
manejo de ordenha (A e C), os animais com mastite clínica que estavam em tratamento eram
identificados e o leite descartado, mesmo assim foram detectados resíduos antimicrobianos
em quartos mamários no nível limite e positivo. Em uma destas propriedades (A), apesar da
identificação dos animais, não existia nenhuma planilha com a data de início e fim do
tratamento, bem como a data de liberação desse leite, este fato compromete o total controle
do período necessário para o descarte e favorece o aparecimento de resíduos do leite. A outra
propriedade (C), além da identificação dos animais em tratamento, existia uma planilha com a
data de início e fim do tratamento e o dia da liberação do leite à Cooperativa, baseado no
período de carência estipulado pelo fabricante do produto utilizado, entretanto esta planilha
não estava acessível a todos os ordenhadores. Estas observações permitem identificar alguns
dos pontos importantes no manejo da propriedade para o controle da qualidade do leite.
59
De acordo com alguns autores, para uma grande parte dos antimicrobianos
utilizados no tratamento de mastite foram realizados estudos farmacocinéticos bem
planejados, conduzidos para definir o período de descarte apropriado do leite, enquanto que,
para outros as recomendações foram formuladas com base em dados limitados. Para garantir
a segurança alimentar e evitar resíduos de antimicrobianos, veterinários e fazendeiros devem
manter registros confiáveis de todos os animais tratados no rebanho, não apenas dos casos de
mastite e que sejam obedecidos os períodos recomendados de descarte do leite. Os autores
citados também preconizaram que fazendeiros sejam orientados e treinados para realizar teste
de detecção de resíduos na propriedade (PYÕRÃLÃ, 2002; McEWEN; BLACK; MEEK,
1991).
No Brasil as pesquisas realizadas (COSTA et al., 1999; RAIA et al., 1999; RAIA,
2001) têm constatado a presença desses resíduos em período superior ao recomendado pela
indústria farmacêutica. Alguns fatores que podem contribuir para uma maior persistência de
resíduos no leite têm sido avaliados por pesquisadores nacionais e estrangeiros (MITCHELL
et al., 1998; FAGUNDES, 2003).
Após o tratamento intramamário, muitos fatores podem contribuir para a presença
de resíduos de antimicrobianos no leite. Com a intenção de diminuir prejuízos econômicos
causados pelo tratamento da mastite, ainda é comum observar na prática, o descarte do leite
apenas da glândula tratada por via intramamária. No entanto, também foi verificada a
presença de resíduo nos quartos não tratados de animais tratados por esta via (COSTA et al.,
2000b; COELHO, 2003).
Coelho (2003) verificou que do total de animais avaliados, 397 quartos de glândulas
mamárias de 139 vacas holandesas em lactação, de cinco rebanhos leiteiros, 14,3% das
amostras de leite de quartos não tratados apresentaram resíduo de antimicrobiano,
independente do medicamento utilizado por via intramamária na glândula com mastite
(betalactâmicos, aminoglicosídeos e associações de antimicrobianos). Deve-se referir ainda,
que no mesmo estudo Coelho (2003) verificou resíduo em 7,5% dos 139 animais pesquisados
nas três glândulas não tratadas, adjacentes à tratada por via intramamária, utilizando teste
microbiológico comercial do Delvotest®. Este resultado é altamente significante, uma vez
60
que quanto maior o número de quartos resíduo-positivos, maior é o volume de leite
contaminado e consequentemente mais elevado será o risco de comprometimento do leite da
mistura do tanque de resfriamento.
Raia Júnior (2001), avaliando a persistência de resíduo antimicrobiano no leite de
vacas tratadas por via intramamária em relação ao período de carência estipulado pelo
fabricante, detectou resíduo antimicrobiano do grupo dos betalactâmicos em 18,75% das
amostras, 18,1 % para o grupo dos aminoglicosideos e 11,1% para o grupo das tetraciclinas.
Outro aspecto importante a ser considerado é a relação entre o volume de leite
produzido e a ocorrência de resíduos de antimicrobianos. Segundo o estudo realizado por
Raia Júnior (2006), ao avaliar a influencia da produção leiteira diária dos animais, observou-
se que os animais com menor produção leiteira (<20L/dia) apresentaram uma maior
ocorrência de resíduos no leite (70,7%).
Smith et al. (2004) com base em resultados de pesquisa e na Food Animal Residue
Avoidance Databank (FARAD) recomendaram que o leite de vacas com produção menor do
que 30 libras/dia (cerca de 15L/dia) seja testado após 7 dias do tratamento com ceftiofur antes
de ser liberado para consumo, pois vacas que produzem pequenos volumes de leite podem ter
um período de carência mais prolongado. Esta observação de Smith et al. (2004) corrobora
com as características da propriedade B em relação ao volume médio de produção.
4.8.4 Resíduos de antimicrobianos e CMT
A distribuição dos níveis de resíduos antimicrobianos nas amostras de leite de
quartos mamários de vacas em lactação nos escores de CMT está expressa na tabela 18
ilustrada pela figura 14. Houve diferença estatística significante a 5% de probabilidade (P <
0,05) (χ2 = 117.111, 4 GL, P = 0,000), quando somados os escores de CMT 1 e 2 e níveis de
resíduo, indicando que as diferenças na ocorrência de escores de CMT estão associadas aos
níveis de resíduo, sendo que o CMT de escore 3 ocorreu em maior porcentagem quando o
resíduo de antimicrobiano analisado pelo Delvotest ® SP foi no nível positivo (Figura 14).
61
Tabela 18 – Frequência absoluta de escores de CMT de quartos mamários e resíduos antimicrobianos.
CMT
Resíduo 0 1 2 3 *QM 1 1636 285 196 182 2299 2 13 5 2 12 32 3 7 5 3 17 32
*QM 1656 295 201 211 2363 *QM - quartos mamários avaliados
Teste Qui-quadrado P < 0,05
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
RESIDUO 1 RESIDUO 2 RESIDUO 3
Freq
uenc
ia r
elat
iva
(%)
CMT 0 CMT 1 CMT 2 CMT 3
Figura 14 – Frequência relativa (%) de escores de CMT de quartos mamários e
resíduos antimicrobianos.
Os resultados encontrados no presente trabalho estão de acordo com os observados
por Ruegg e Tabone (2000) que ao avaliarem a relação entre resíduos de antibióticos e as
contagens de células somáticas verificaram que o risco da presença do resíduo aumenta
paralelamente ao aumento da CCS. Os autores notaram que a presença de resíduos de
antibióticos no leite estava fortemente associada à CCS > 700.000 cél./mL. O presente
trabalho também indicou que as maiores ocorrências de resíduos de antimicrobianos
relacionam-se as amostras que apresentam maiores escores no CMT, que reflete uma maior
contagem de células somáticas.
62
5. CONCLUSÕES
Os resultados encontrados permitem concluir que a linha de leite proposta para estudo
apresenta diversos pontos que necessitam de melhorias. Mesmo estando localizada em uma
região privilegiada pelo conhecimento técnico/científico, cercada de universidades e centros
de pesquisa, a sustentabilidade e qualidade do sistema estavam comprometidas em muitos
aspectos e momentos.
Algumas propriedades estiveram muito abaixo do mínimo necessário para a produção
de um leite com qualidade. Medidas simples para a prevenção da mastite como lavagem dos
tetos, uso do pré e pós dipping e secagem dos tetos com papel descartável, não eram adotadas
em todas as propriedades, além de apresentarem falhas na limpeza e higiene das instalações.
Estas características favoreceram a instalação de agentes infecciosos e a elevada contagem de
células somáticas nos tanques de resfriamento.
A propriedade B apresentou grandes problemas na produção do leite em conseqüência
das péssimas técnicas de manejo que utilizava, esta propriedade era a única propriedade que
dispunha de um rebanho leiteiro homogêneo; que possivelmente estava sendo mal explorado.
Este fato contribui, entre outros, para destacar a necessidade de pesquisas voltadas para raças
específicas e a graduação e identificação das suas características particulares.
63
A ocorrência de isolamentos microbiológicos positivos esteve ligada estatisticamente
às características das propriedades e destacou a importância da adoção de técnicas de
prevenção e manejo como meios eficientes para minimizar a instalação de agentes
infecciosos.
Houve relação entre os resultados do California Mastitis Test (CMT) e a contagem de
células somáticas, reafirmando o CMT como importante ferramenta no diagnóstico de
quadros inflamatórios.
A associação do CMT, da CCS e do exame microbiológico contribuíram para a
melhor identificação do perfil técnico de cada propriedade e destacou pontos importantes de
controle.
O isolamento microbiológico apontou para a necessidade de estratégias de controle
visando os agentes mais freqüentes (Staphylococcus, Corynebacterium e Streptococcus),
além de atentar para agentes ambientais e agentes secundários como possíveis
desencadeadores de processos inflamatórios e comprometimento da qualidade do leite e
saúde do animal.
O Corynebacterium foi o segundo gênero mais encontrado nos isolamentos
microbiológicos positivos. Este fato destacou a importância do gênero nos rebanhos
brasileiros.
Os rebanhos estudados apresentaram alta ocorrência de mastite clínica e subclínica,
refletindo esta realidade através do Tamis, CMT e CCS.
Os níveis elevados de mastite clínica das propriedades leiteiras contribuíram com a
presença de resíduos de antimicrobianos nos quartos mamários, balões medidores de leite e
tanques de resfriamento.
64
A detecção de resíduos de antimicrobianos nos quartos mamários e balões coletores
comprovam, entre outros, que os tanques de resfriamento estão sendo abastecidos com leite
contaminado.
A ocorrência de resíduos de antimicrobianos no tanque de resfriamento evidenciou o
comprometimento da qualidade do leite e da segurança alimentar e apontou para a
inexistência dos pontos de controle de qualidade.
Os resultados encontrados revelam a grande necessidade da implantação de políticas
públicas e privadas no setor produtivo do leite a fim de minimizar o comprometimento da
produção, qualidade do leite e saúde do consumidor. Inclui principalmente a conscientização
e treinamento técnico dos produtores e afins e a fiscalização sanitária do produto.
65
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