UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS – UFAM

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS – FCF

BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS

RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA – DETERMINAÇÃO DE GLICOSE PELO MÉTODO

DA GLICOSE OXIDASE

ANA CAMILA DOS SANTOS – 21205148

LETÍCIA COUTINHO – 21201255

RAYSSA LAMANIERE – 21203555

MANAUS – AM

Setembro 2013

INTRODUÇÃO

A glicose oxidase (GOD) catalisa a oxidação da glicose para ácido glicônico e

peróxido de hidrogênio. Através de uma reação oxidativa de acoplamento catalisada

pela peroxidase (POD), o peróxido de hidrogênio formado reage com 4-aminoantipirina

e fenol, formando um complexo de cor vermelha (quinoneimina), cuja absorbância

medida em 500 nm é diretamente proporcional à concentração de glicose na amostra.

A Glucose Oxidase (GOD) é uma enzima que tem como fontes microbianas os fungos

Aspergillus niger, Penicillium notatum, Penicillium glaucum, Penicillium amagasakiense,

e Penicillium purpurogenum, mas a sua principal fonte de obtenção é o fungo

Aspergillus niger. É obtida, essencialmente, como um produto ou co-produto da

produção de gluconato (HATZIUIKOLAOU, D. G.; MACRIS, B. J., 1995).

Estruturalmente falando, trata-se de uma glicoproteína dimérica constituída por

duas cadeias de polipeptídios idênticas que são ligadas covalentemente por pontes de

sulfeto. Seu peso molecular varia de aproximadamente 130 a 175 KDa. É altamente

específica a D-glucose, mas apresenta baixa atividade quando o 2-deoxi-D-glucose, D-

manose e a D-galactose são utilizados como substratos. Sua atividade também é

inibida pelos íons Ag +, Hg2 e Cu2 (ROTHBERG, A.; WEEGAR, J.; SCHALIEN, R.;

FAGERVIK, K.; RYDSTRÖM, M.; LIND, K., 1999).

Catalisa a reação de oxidação β-D-glucose para a β-D-gluco-lactona utilizando

oxigênio molecular como aceptor de elétrons e produz simultaneamente peróxido de

hidrogênio, o qual mais tarde, pela ação de uma catalase, produzirá água e oxigênio.

Logos após, sem intervenção enzimática, ocorre uma hidrolise espontânea que

transforma o β-D-gluco-lactona em ácido glucônico (MIRÓN, J.; VÁZQUEZ, J. A.;

GONZÁLEZ, M. P.; MURADO, M. A., 2008; SCHMIDELL, W.; LIMA, U. de A.;

AQUARONE, E.; BORZANI, W., 2001).

O local onde esta enzima é produzida foi um ponto de discussão por muito

tempo. Hoje se sabe que ela é produzida tanto no meio intracelular quanto no meio

extracelular, e que ambas contribuem para a produção de ácido glucônico (LIU, J. Z.;

WENG, L. P.; ZHANG, Q. L.; XU, H.; JI, L. N., 2003).

A produção de GOD é aumentada em ambientes com alta concentração de

oxigênio e glicose, porém estudos mostram que nenhuma quantidade desta enzima

pode ser obtida em ambientes onde a concentração de oxigênio dissolvido é menor

que 7%. No entanto, estão sendo realizadas várias pesquisas com o objetivo de

otimizar a produção de GOD através da utilização de cepas mutantes de Aspergillus

niger. Nestes casos, há possibilidade de haver formação da enzima mesmo em

concentrações de oxigênio inferiores a 7% (LIU, J. Z.; WENG, L. P.; ZHANG, Q. L.; XU,

H.; JI, L. N., 2003; RAMZAN, M.; MEHMOOD, T., 2009).

OBJETIVO

- Determinar a concentração da glicose (g/100ml) em leite desnatado pelo método da

glicose-oxidase.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para a preparação da amostra, transferiu-se 25 ml de leite desnatado para um

tubo de centrífuga de 50 ml e foi adicionado a este 0,048g de HCl, a partir de 5 ml de

HCl 0,6 N, obtido por meio do seguinte cálculo:

36,51g HCl – 100% 14,60g HCl – 1M 8,76g HCl – 1000ml

x g HCl – 40% x g HCl – 0,6M x g HCl – 5ml

x = 14,60g HCl x = 8,76g HCl x = 0,048g HCl

Após isso, o tubo foi levado ao banho de gelo e centrifugado. O sobrenadante

resultante foi transferido para um béquer de 50 ml e neutralizado com 2,4 g de NaOH, a

partir de NaOH a 0,6 N, obtido por meio do seguinte cálculo:

40g NaOH – 1000 ml – 1M 24g NaOH – 1000 ml

x g NaOH – 1000 ml – 0,6M x g NaOH – 100 ml

x = 24g x = 2,4g NaOH

Posteriormente o sobrenadante foi colocado em um balão volumétrico de 50 ml

e completado com água destilada (diluição 1:2).

Com isso, foi utilizado o método da glicose-oxidase para determinar a glicose na

amostra. Então foi pipetado 4 ml do reagente de glicose oxidase nos tubos de ensaio

G1 (amostra), G2 (padrão) e G (branco), posteriormente levados ao banho-maria a

37°C. Após isso, adicionou-se 40 l de leite ao tubo G1, 40 L do padrão de glicose ao

tubo G2 e 40 l de água destilada ao tubo G, ambos incubados a 37°C. O

espectrofotômetro foi calibrado com o tubo G e posteriormente mediu-se a absorbância

da amostra e do padrão. As absorbâncias obtidas seguem de acordo com a tabela 1:

TABELA 1. Absorbâncias da amostra e do padrão

Tubo de Ensaio Valor da Absorbância

G1 0,002

G2 0,292

Ao final, foi feito o cálculo para obter a concentração em gramas da glicose em

100 ml de leite, que resultou em 1.369 x 10-3 g de glicose, como é mostrado a seguir:

Glicose (mg/dL) = 0,002/0,292 x 100 (mg/dL) x 2 (fator de diluição)

Glicose (mg/dL) = 1,369 mg

1000 mg – 1 g

1,369 mg – x

x = 1.369 x 10-3 g de glicose

Com base em um manual de contagem de carboidratos (AGUIAR, A. C. B.;

OLIVEIRA, H. S. D.; GRASSIOLLI, S. M., 2011), onde tem-se que há, no leite

desnatado, 10g de carboidratos em 200 ml, e sendo a glicose constituinte dessa

quantidade, observou-se que se diminuíssemos esse volume pela metade (100 ml)

seriam obtidos aproximadamente 5g de carboidratos, e o valor resultante do

experimento em questão encontra-se dentro dessa quantidade.

CONCLUSÃO

A quantidade de glicose em gramas foi 1.369 x 10-3g em 100 ml de leite

desnatado e pode ser obtida com sucesso pelo método da glicose-oxidase,

apresentando um valor, após a análise de algumas estimativas, provavelmente dentro

do proposto por manuais de contagem de carboidratos, que é de 10g de carboidratos

por 200 ml (aproximadamente um copo) de leite de vaca desnatado.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

HATZIUIKOLAOU, D. G.; MACRIS, B. J. Factors regulating production of glucose

oxidase by Aspergillus niger. Enzyme and Microbial Technology, vol. 17, Elsevier

Science Inc (1995) p. 530-534.

LIU, J. Z.; WENG, L. P.; ZHANG, Q. L.; XU, H.; JI, L. N. Optimization of glucose

oxidase production by Aspergillus niger in a benchtop bioreactor using response

surface methodology. World Journal of Microbiology & Biotechnology 19 (2003) p.

317-323.

MIRÓN, J.; VÁZQUEZ, J. A.; GONZÁLEZ, M. P.; MURADO, M. A. Joint effect of

nitrogen and phosphorus on glucose oidase production by Aspergillus niger:

Discussion of an experimental design with risk of co-linearity. Biochemical

Engineering Journal 40 (2008) p. 54-63.

RAMZAN, M.; MEHMOOD, T. Enhanced production of glucose oxidase from UV-

mutant of Aspergillus niger. African Journal of Biotechnology, vol. 8 (2009) p. 288-

290.

ROTHBERG, A.; WEEGAR, J.; SCHALIEN, R.; FAGERVIK, K.; RYDSTRÖM, M.; LIND,

K. Optimization of an Aspergillus niger glucose oxidase production process.

Bioprocess Engineering 21, Springer-Verlag (1999) p. 307-312.

SCHMIDELL, W.; LIMA, U. de A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. Biotecnologia

Industrial. Engenharia Bioquímica, vol. 2, São Paulo: Edgard Blücher. 1. ed. 2001.

AGUIAR, A. C. B.; OLIVEIRA, H. S. D.; GRASSIOLLI, S. M. Manual de contagem de

carboidratos. Porto Alegre: Instituto da Criança com Diabetes, 2011. p. 35. Disponível

em: <http://www.icdrs.org.br/arquivos/pdf/Manual-Contagem-Carboidratos.pdf>. Acesso

em: 5 set. 2013.