RESULTADOS DEL ENSAYO INTERLABORATORIO PARA …bibliotecagbs.com/archivos/informe_interlaboratorio_mayo2004.pdfresultados del ensayo interlaboratorio para fangos activos (11 mayo 2004)

RESULTADOS DEL ENSAYO INTERLABORATORIO PARA FANGOS

ACTIVOS (11 mayo 2004)

GRUPO BIOINDICACIÓN SEVILLA, DEL GRUPO DE NEMATOLOGÍA Y

RECURSOS NATURALES (RNM-310)

ÍNDICE

1. Introducción

2. Participantes

3. Resultados

4. Análisis de datos

■ Caracterización macroscópica y microscópica del fango activado

■ Estudio de la microfauna: bacterias filamentosas y protozoos

■ Otros parámetros de interés: SSLM, SSVLM, V30 e IVF.

5. Conclusiones

■ Valores medios de la muestra estimados

■ Conclusiones generales

6. Término del circuito de ejercicios interlaboratorios (2003-2004) y reunión final.

7. Agradecimientos

8. Bibliografía

Anexo fotográfico (se adjunta en un documento aparte debido a su gran tamaño)

Anexo de recepción y emisión de resultados

www.grupobioindicacionsevilla.com

EJERCICIO INTERLABORATORIO (11 mayo 2004) 1

1. INTRODUCCIÓN

Con el objetivo de unificar criterios en los análisis de tipo microbiológico de fangos activos ("evaluación del fango: características macro- y microscópicas" y "evaluación de la microfauna: filamentos y protozoos"), GBS organiza ejercicios interlaboratorios con muestras de distintas características. Estos ensayos ofrecen la oportunidad de comparar los resultados y métodos con los demás laboratorios participantes a fin de detectar errores sistemáticos.

El ejercicio del día 11 de mayo de 2004 se realizó sobre una muestra puntual de Fango Activo, distribuida desde el Laboratorio de Nematología (Universidad de Sevilla) junto con los formatos de remisión de datos. En este ejercicio se han adjuntado las nuevas hojas de trabajo, que incorporan parámetros tales como concentración de sólidos en suspensión del licor mixto (SSLM), sólidos en suspensión volátiles (SSVLM), ensayo de decantabilidad en probeta o V30, índice volumétrico de fangos (IVF) y la cuantificación de las bacterias filamentosas en disolución con la asignación de una categoría numérica. También quedan recogidas algunas observaciones relacionadas con el estudio de la microfauna: densidad de amebas desnudas, larvas telotrocas, etc.

La metodología de trabajo está descrita en el “Manual de trabajo” de GBS disponible en www.grupobioindicacionsevilla.com. En estos momentos estamos trabajando sobre modificaciones en dicho manual de trabajo, que esperamos presentar a los participantes en la jornada final de interlaboratorios (apartado 6 del índice).

2. PARTICIPANTES

Durante este ejercicio, el total de participantes ha sido de 8, de los que 3 habían empleado ampliamente esta metodología, 3 poseen un nivel medio de experiencia al haber participado anteriormente en otros interlaboratorios y 2 apenas habían trabajado antes con esta metodología.

Para la mejor interpretación de algunos de los resultados que se mostrarán posteriormente, en la Tabla 1 se recoge el período transcurrido desde la toma de muestras hasta su análisis, para cada uno de los participantes.



http://www.grupobioindicacionsevilla.com/

Tabla 1. Días transcurridos en el análisis de la muestra desde su toma.

P1 P2 P4 P5 P6 P8 P9 P10 0 0 1 0 0 0 0 0

2,32

Pi= Participante 1-10

3. RESULTADOS

Los resultados más relevantes del análisis microscópico de la muestra, para cada uno de los participantes, se recogen en las Tablas 2 y 3. Se ha señalado en rojo un dato corregido en los resultados del participante 4, surgido tras la emisión del "resumen de resultados" que en su día se envió a cada participante.

Tabla 2. Resultados aportados por los participantes 1, 2, 4, 5 y 6.

MUESTREO

PARTICIPANTE 1 2 4 5 6MACROSCOPÍA 21 21 16,5 30 30MICROSCOPÍA 57 50 70 49 49

ÍNDICE DE FANGOS 78 71 86,5 79 79C. DE FILAMENTOS 2 4 3 2 2

FILAMENTO DOMINANTE Nostocoida l. II y III, Tipo 1701 Tipo 0411 Tipos 0041/0675 Tipo 1701 Tipo 1701FILAMENTO 2ario Haliscomenobacter hydrossis Tipo 021N y Tipo 1701 Tipo 1702 Tipos 1702 y 021N Tipo 021N

EFECTO FLÓCULO Disgregación Puentes interfloc., disgregación Ninguno Prácticamente nulo Sin efectosOTROS FILAMENTOS Beggiatoa Haliscomenobacter hydrossis T 1701, N. limicola II, Thiothrix II, T 021N --- ---

FILAMENTOS DISOLUC. No No No No NoCORTES DIAGONAL --- 0,65 --- --- ---m/mL FILAMENTOS 222,7 --- 55,7 111,36 130DENSIDAD ( org/L) 3.020.000 4.460.000 1.360.000 2.680.000 3.480.000

ÍNDICE DE SHANON 2,63 2,25 2,63 2,46ÍNDICE DE MADONI 9 9 9 10 10

CLASE MADONI Clase I Clase I Clase I Clase I Clase INÚMERO DE ESPECIES 10 10 9 12 9

GRUPO DOMINANTE Amebas Testáceas Bacteriófagos reptantes Bacteriófagos sésiles Bacteriófagos sésiles Bacteriófagos sésilesSSLM 1630 mg/L 1505 mg/L 1790 mg/L 1730 mg/L 1760 mg/L

SSVLM 1157 mg/L 1045 mg/L 1160 mg/L 1385 mg/L 1375 mg/LV30 90 mL/L 80 mL/L 90 mL/L 90 mL/L 95 mL/LIVF 55 mL/g 53,2 mL/g 50 mL/g

Categoría de fango "bueno". Valoración Fango de buena decantabilidad, color marrón Alto estado de oxidación del licor mezcla. Aná Pocos filamentos, anclados o arrollados en muchasmacroscópica adecuada, con ligeras espu- claro y aspecto esponjoso. lisis a las 24h de la toma de muestras. Clarifi ocasiones a las lórigas vacías (falta de flóculos).mas en superficie. Clara mejoría del clarifica- El IF indica que es un buen fango. cado con alta turbidez debido al crecimiento De forma similar, Vaginicola se ancla sobre fibras.

OBSERVACIONES do al aumentar el tiempo de decantación. Gran diversidad de protozoos. disperso, posible aumento en el transcurso de Filamentos asociados a deficiencias de oxígeno yCaracterísticas microscópicas adecuadas. Se observan manojos de filamentos entrela- tiempo hasta el análisis. Observación de abun- nutricional, por lo que podría interpretarse que elDiversidad protozoaria muy buena. Organis zados provocando puentes o disgregación dantes amebas testáceas sin actividad así co- fango se encontraba en buenas condiciones hastamos filamentosos asociados a bajos niveles flocular y una estructura difusa del flóculo. mo presencia de algunas especies bacterívoras que ocurrió algo que eliminó la mayoría de organis-de oxígeno y a cargas másicas bajas. La proliferación de estos "manojos" produce Posibles sobrecargas puntuales en el sistema, mos, dejando sus formas externas mas resistentes.

Fango estable y bien colonizado. Diversidad episodios de esponjamiento filamentoso. el cual se presenta estable aunque con síntomas Posibles causas: entrada fuerte C.O, tóxico o a unprotozoaria buena. Edad de fangos ligeramen Se podría decir que tiene baja carga másica de deterioro. Escaso crecimiento filamentoso abandono del sistema y que ahora se trate de recu-

te alta. y deficiencia en nutrientes. y flóculo muy mineralizado. Se observa en algu- perar. Nadadores libres que indican bacterias dis-nos filamentos (T 0041 y T 0675) reacción po- persas que se están liberando de los flóculos, muy

sitiva al Neisser. mineralizados e inactivos, probablemente.



Tabla 3. Resultados aportados por los participantes 7, 8, 9, 10, 11 y 13.

MUESTREO

PARTICIPANTE 8 9 10MACROSCOPÍA 30 25,5 25,5MICROSCOPÍA 63 66 66

ÍNDICE DE FANGOS 93 91,5 91,5C. DE FILAMENTOS 2 2 2

FILAMENTO DOMINANTE Tipo 021N Tipos 1701/1702 Tipos 1702/1701FILAMENTO 2ario Tipo 1701 Tipo 021N Tipo 0041, Tipo 021N

EFECTO FLÓCULO Prácticamente nulo No apreciable Prácticamente nuloOTROS FILAMENTOS Tipo 0092 Tipo 1863 o Streptoc., Nostocoida, Hongos Nocardia, Nostocoida, T 1863, hongos

FILAMENTOS DISOLUC. No Ausentes NoCORTES DIAGONAL --- --- ---m/mL FILAMENTOS --- --- ---DENSIDAD ( org/L) 8.320.000 3.320.000 1.920.000

ÍNDICE DE SHANON 2,27 2,42 2,82ÍNDICE DE MADONI 9 10 10

CLASE MADONI Clase I Clase I Clase INÚMERO DE ESPECIES 9 11 12

GRUPO DOMINANTE Bacteriófagos sésiles Amebas testáceas Bacteriófagos sésilesSSLM --- --- ---

SSVLM --- --- ---V30 90 mL/L 90 mL/L 95 mL/LIVF --- --- ---

Características típicas de un fango proce- Fango muy mineralizado, de aspecto caracte- Muestra típica de fango activo de oxidacióndente de un proceso de oxidación total (baja rístico de un sistema de aireación prolongada. total, sobreestimada en la valoración de suscarga y alta edad de fango). Clarificado lim- Lórigas mayoritariamente vacías y organismos caracter. macro- y microscópicas, pero co-

OBSERVACIONES pio y muy buena decantación. Color de fan- enquistados (cambio brusco de condiciones rrespondiente a estados de depuración pocofo marrón oscuro. ambientales?). favorables. Filamentos indicadores de mala

Presencia de filamentos moderada, indicando oxigenación y reacciones Neisser atípicascomúnmente la ausencia de oxígeno. propias de deficiencias nutricionales; dispues-

tos sobre lórigas vacías en busca de anclaje.Amebas testáceas enquistadas y lórigasvacías que indican alteración/deterioro delproceso.



4. ANÁLISIS DE DATOS

En este apartado se realizará un análisis estadístico de los valores obtenidos en cada uno de los puntos en los que está dividido el análisis de fangos activos. Los parámetros estadísticos seleccionados son:

El cálculo de la media, que informa sobre el valor más probable de la variable a estudiar. Se afecta fuertemente por los valores extremos de la población.

La desviación estándar: muestra como de agrupados o dispersos se encuentran los valores. Si la varianza tiende a cero, quiere decir que la dispersión de los datos es muy baja y éstos se encuentran concentrados en torno a la media.

Coeficiente de Variación: es la desviación típica expresada como un porcentaje de la media. Es ampliamente utilizado cuando se quiere comparar la variación de dos o más poblaciones, independientemente de la magnitud de sus medidas.

Test de la Q de Dixon: tiene en cuenta la diferencia de los valores máximos y mínimos respecto a la media, inhabilitando aquéllos que superen el valor preestablecido para este estimador. Dada la dispersión natural de los datos biológicos, y más aún de este tipo de análisis que no presentan capacidad de contraste con un patrón, hemos preferido realizar una invalidación de medidas.



□ CARACTERIZACIÓN MACRO- Y MICROSCÓPICA DEL FANGO ACTIVO

- MACROSCOPÍA

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS

05

101520253035

1 2 4 5 6 8 9 10

participante

MACROSCOPÍA MEDIA

1 212 214 16,55 306 308 309 25,5

10 25,5MEDIA 25

VARIANZA 5,07

MACROSCOPÍA

Figura 1. Valor macroscópico de la muestra para cada uno de los participantes, así como lamedia y varianza. Ningún participante descartado.

Las categorías con las que fueron evaluadas cada una de las características macroscópicas de la muestra, por cada uno de los participantes, aparecen recogidas en la Tabla 4.

cqa

Tabla 4. Características macroscópicas de la muestra (turbidez del clarificado, flóculos ensuspensión en el clarificado, sedimentabilidad y olor) definidas por los participantes.

PARTICIPANTE TURBIDEZ FLÓC. EN SUSP. SEDIMENTAB. OLOR1 Media Media Alta Correcto2 Media Media Alta Correcto4 Alta Media Alta Correcto5 Baja Baja Alta Correcto6 Baja Baja Alta Correcto8 Baja Baja Alta Correcto9 Baja Media Alta Correcto10 Baja Media Alta Correcto

Tal y como se observa en la Figura 1, la valoración más negativa de las aracterísticas macroscópicas (16,5 sobre 30) es la del participante 4, el único ue definió turbidez "alta" (Tabla 4) y quien a su vez recepcionó y realizó el nálisis de la muestra más tarde (Tabla 1).



- MICROSCOPÍA

1 572 504 705 496 498 639 66

10 66MEDIA 59

VARIANZA 8,61

MICROSCOPÍA

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2 4 5 6 8 9 10

participantes

MICROSCOPÍA MEDIA

Figura 2. Valor microscópico de la muestra para cada uno de los participantes, así como la mediay varianza. Ningún participante descartado.

Las categorías con las que fueron evaluadas cada una de las características microscópicas de la muestra, por cada uno de los participantes, aparecen recogidas en la Tabla 5.

Tabla 5. Características microscópicas de la muestra (forma, tamaño, estructura, textura y coberturaflocular, filamentos en flóculos y en disolución, diversidad de especies) para cada uno de losparticipantes. Ningún participante descartado.

PARTICIPANTE FORMA TAMAÑO ESTRUCTURA TEXTURA COBERTURA FIL EN FLÓC. FIL EN DIS. DIV PROTOZ1 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% < 5 fil./flóc. Baja > 7 sp.2 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóc. Baja > 7sp.4 Regular Medio Compacta Fuerte 10-50% < 5 fil./flóc. Baja > 7 sp.5 Regular Medio Compacta Fuerte < 10% > 20 fil./flóc. Baja > 7 sp.6 Regular Medio Compacta Fuerte < 10% > 20 fil./flóc. Baja > 7 sp.8 Irregular Grande Compacta Fuerte 10-50% < 5 fil./flóc. Baja > 7 sp.9 Irregular Medio Compacta Fuerte 10-50% < 5 fil./flóc. Baja > 7 sp.10 Irregular Medio Compacta Fuerte 10-50% < 5 fil./flóc. Baja > 7sp.



- ÍNDICE DE FANGO

CATEGORÍA1 78 Bueno2 71 Bueno4 86,5 Óptimo5 79 Bueno6 79 Bueno8 93 Óptim9 91,5 Óptimo10 91,5 Óptimo

MEDIA 84 VARIANZA 8,05

ÍNDICE DE FANGO ( IF)

o

ÍNDICE DE FANGO (IF)

0

20

40

60

80

100

1 2 4 5 6 8 9 10

participante

ÍNDICE DE FANGO ( IF) MEDIA

Figura 3. IF (sumatorio de las características macro- y microscópicas) para cada uno de los participantes, así como lamedia y varianza. Ningún participante descartado.

Un 50% de los participantes definió la categoría de IF "bueno", mientras que otro 50% delimitó la categoría "óptimo". No obstante, puesto que la puntuación en la categoría "bueno" se sitúa en la mayoría de los casos muy próxima a los valores máximos del intervalo definido para esta categoría (a su vez los valores más bajos de la categoría inmediata, "óptimo"), consideramos que estos resultados no han de ser interpretados como una situación de dispersión. Es decir, se trata ésta de una muestra que por sus características se encuentra en una situación intermedia entre ambas categorías de fango, lo que ha propiciado que la varianza inherente a este tipo de controles, haya dado lugar a un reparto equivalente entre ambas clases de fango.



□ ESTUDIO DE LA MICROFAUNA: BACTERIAS FILAMENTOSAS Y PROTOZOOS

- ABUNDANCIA DE BACTERIAS FILAMENTOSAS (CATEGORÍA NUMÉRICA)

1 22 44 35 26 28 29 2

10 2MEDIA 2,38

VARIANZA 0,74INTERV CONF

INTERV CONF

PARTICIP DESCA 2MEDIA CORREG 2,14VAR CORREG 0,38

CATEGORÍA BACTERIANA

ABUNDANCIA FILAMENTOS (CATEGORÍA)

0

1

2

3

4

5

1 2 4 5 6 8 9 10

participante

CATEGORÍA BACTERIANA MEDIA

Figura 4. Abundancia de bacterias filamentosas (categoría numérica) para cada uno delos participantes, así como la media y varianza calculadas. Descartado el participante 2.



- DENSIDAD PROTOZOARIA

1 3,022 4,464 1,365 2,686 3,488 8,329 3,32

10 1,92MEDIA 3,57

VARIANZA 2,14INTERV CONF

PARTICIP DESCARTADO 8MEDIA CORREG 2,89VAR CORREG 1,03

DENSIDAD PROTOZOARIA (10exp 6) DENSIDAD DE PROTOZOOS (10 exp6)

0123456789

1 2 4 5 6 8 9 10

participantein

div/

L (1

0 ex

p6)

DENSIDAD PROTOZOARIA (10exp 6) MEDIA

Figura 5. Densidad de microorganismos (protozoos y metazoos) para cada uno de los participantes,así como la media y varianza. Descartado el participante 8.

- ÍNDICE DE SHANNON

1 2,62 2,24 2,35 2,66 2,48 2,29 2,4

10 2,82MEDIA 2,48

VARIANZA 0,20

ÍNDICE DE SHANNON3523672

ÍNDICE DE SHANNON

00,5

11,5

22,5

3

1 2 4 5 6 8 9 10pa r t i c i pa nt e

ÍNDICE DE SHANNON MEDIA

Figura 6. Índice de Shannon (medida de la diversidad de la muestra) para cada uno de losparticipantes, así como la media y varianza. Ningún participante descartado.



- ABUNDANCIA DE BACTERIAS FILAMENTOSAS (OTROS SISTEMAS DE CUANTIFICACIÓN)

A continuación, en las Tablas 6 y 7, se recogen los resultados referentes a métodos en experimentación para la cuantificación de bacterias filamentosas, denominados "otros sistemas de cuantificación", al no tratarse de los procedimientos tradicionales que emplean criterios subjetivos de cuantificación. Tan sólo cinco participantes han cumplimentado este apartado, de los que cuatro emplearon la técnica basada en el cálculo de los "m·mL-1 filamentos" y tan sólo uno empleó la técnica de "cortes con la diagonal".

Con relación a la primera técnica, el análisis de los datos determinó que el participante a descartar debía ser el 1, lo que daba lugar a una media corregida de 99 m mL-1 y una varianza de 38. En el segundo tipo de determinación, por falta de datos con los que comparar el resultado aportado por el participante 2, no podemos extraer ningún tipo de conclusión.

Nuestra experiencia sí que parece indicarnos que el método más preciso es el de recuento de intersecciones con la diagonal de la cámara Neubauer improved (Arnáiz et al., 1999). La particularidad de esta técnica reside en que, para mayor comodidad, es necesario el empleo de un objetivo 20x, el cual permite visualizar en un único campo la totalidad de la diagonal de la cámara sobre la que ha de realizarse el recuento. Trabajar con el objetivo de 10x es prácticamente inútil, pues con una magnificación tan pequeña resulta complicado visualizar las intersecciones de los filamentos con la cuadrícula. Por otra parte, emplear el objetivo de 40x dificulta enormemente el seguimiento de la diagonal en la cámara, al requerir varios campos para cubrir completamente la diagonal formada por los 20 cuadros sobre los que ha de realizarse el recuento. En cualquier caso, resulta recomendable el uso de esta cámara pues, a diferencia con la Fuchs-Rosenthal, su profundidad es inferior y también el volumen de muestra contenido en la lámina de agua, situación que facilita la labor de recuento.

Consideramos que éste es precisamente el apartado en el que menos progresos se han logrado durante el transcurso del circuito de ejercicios. Trataremos de ahondar en esta cuestión durante el año próximo, aunque insistimos en que se tratan de métodos experimentales. Si algún participante necesita conocer algún detalle en particular sobre esta cámara (referencias, casas comerciales, etc.) o tiene preguntas u observaciones sobre esta técnica, puede ponerse en contacto con nosotros.



- ÍNDICE DE MADONI

En la Figura 7 se representa el SBI o Método Madoni atendiendo a la categoría numérica estimada por cada uno de los participantes. En la Figura 8, el SBI es representado atendiendo a la "clase" final de fango.

1 92 94 95 106 108 99 10

10 10MEDIA 9,5

VARIANZA 0,53

MÉTODO MADONIÍNDICE DE MADONI

5

6

7

8

9

10

1 2 4 5 6 8 9 10

participante

MÉTODO MADONI MEDIA

Figura 7. Índice de Madoni (1-10) para cada uno de los participantes, así como la media yvarianza calculadas. Ningún participante descartado.

CLASE MADONI

100%

0%

0%

0% Clase IClase IIClase IIClase IV

Figura 8. Clase Madoni (I-IV) definida por el total de participantes.



- Nº ESPECIES PROTOZOARIAS

1 102 104 95 126 98 99 11

10 12MEDIA 10,3

VARIANZA 1,28

Nº DE ESPECIES PROTOZOARIAS

Nº ESPECIES PROTOZOOS

02468

101214

1 2 4 5 6 8 9 10pa r t i c i pa nt e

Nº DE ESPECIES PROTOZOARIAS MEDIA

Figura 9. Número de especies protozoarias identificadas por cada uno de los participantes, asícomo la media y varianza. Ningún participante descartado.

- GRUPO FUNCIONAL DOMINANTE (PROTOZOOS)

GRUPO DOMINANTE

50

37,5

12,5

Amebas testáceas

Bacterióf agos sésiles

Bacterióf agos reptantes

1 Amebas testáceas2 Bacteriófagos reptantes4 Bacteriófagos sésiles5 Amebas testáceas6 Amebas testáceas8 Bacteriófagos sésiles9 Amebas testáceas

10 Bacteríofagos sésiles

GRUPO DOMINANTE

Figura 10. Grupo funcional dominante determinado para el cálculo del Método Madoni porcada uno de los participantes.



- IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS FILAMENTOSAS

En la Tabla 8 se exponen los filamentos dominante, secundario así como "otros filamentos" identificados durante el examen microscópico, por el total de participantes.

Tabla 6. Filamentos dominantes, secundarios y otros filamentos presentes en la muestra segúnel criterio de cada participante.

FILAMENTOS DOMINANTE SECUNDARIO OTROS

1 N. limicola II y III, Tipo 1701 Haliscomenobacter hydrossis Beggiatoa2 Tipo 0411 Tipos 021N y 1701 H. hydrossis4 Tipo 0041 y Tipo 0675 Tipo 1702 T. 1701, N. limicola II, Thiothrix II, T. 021N5 Tipo 1701 Tipos 1702 y 021N ---6 Tipo 1701 Tipo 021N ---8 Tipo 021N Tipo 1701 Tipo 00929 Tipos 1701 y 1702 Tipo 021N Tipo 1863 o Streptoc., Nostocoida, Hongos

10 Tipos 1702 y 1701 Tipo 0041 y Tipo 021N Nocardia, N. limicola II, T 1863, hongos

Los organismos filamentosos determinados como dominantes y secundarios presentaron diferencias entre los distintos participantes, como se deduce de la Tabla 6. Sin embargo, aunque no haya existido confluencia en el establecimiento de ambas categorías, la mayoría de los participantes ha seleccionado los Tipos 1701 y 021N como los más frecuentes en la muestra: en algunos casos como dominantes y en otros como secundarios. Tan sólo el participante 4 incluyó a ambos tipos como "otros filamentos".

El reducido crecimiento filamentoso de esta muestra, se entiende que ha dificultado el establecimiento del orden de abundancia.

La mayoría de participantes determinó que los efectos del crecimiento filamentoso no repercutían sobre el estado del flóculo de fango activo, ni mediante formación de puentes interfloculares ni con la disgregación de la estructura del flóculo.



- LISTADO DE ESPECIES DE PROTOZOOS Y GRUPOS DE METAZOOS

En la Tabla 7 se recogen, por grupos funcionales, las especies de protozoos y los grupos de metazoos observados por la totalidad de participantes.

Tabla 7. Protozoos y grupos de metazoos observados por el total de participantes.

Pequeños flagelados AusentesGrandes flagelados AusentesAmebas desnudas Presentes Amebas testáceas Euglypha sp., Difflugia sp., Centropyxis sp.

Carnívoros nadadores Coleps sp. Carnívoro nadador sin identificar

Carnívoros suctores AusentesUronema sp.

Paramecium sp.Bacteriófago nadador sin identificar

Lembadion sp.Holophrya sp.Prorodon sp.Aspidisca sp.

Bacteriófagos reptantes Acineria uncinataBacteriófagos reptantes sin identificar

Vaginicola sp.Bacteriófagos sésiles Thuricola sp.

Bacteriófagos sésiles sin identificarRotíferos

Metazoos NematodosAnélidos

Gastrotricos

Especies de protozoos y Grupos de metazoos

Bacteriófagos nadadores



En la Tabla 8 se recoge el conjunto de especies observado por cada uno de los participantes.

Tabla 8. Especies observadas por cada uno de los participantes.

PARTICIPANTE

24

6

9

10 Thuricola sp., Rotíferos, Nematodos, Anélidos

1

5

8

Euglypha sp., Arcella sp., Centropyxis sp., Coleps sp., Lembadion sp., Prorodon sp., Aspidisca sp., Acineria sp., B. reptante (?),

Difflugia sp., Arcella sp., Centropyxis sp., Coleps sp., Holophrya sp., Aspidisca sp., Thuricola sp., RotíferosG. flagelados, Amebas testáceas, Amebas desnudas, Coleps sp., Bacteriófago nadador, Aspidisca sp., Thuricola sp., Rotíferos,

Amebas testáceas (3 sp.), Lembadion sp., Holophrya sp., Coleps sp., Aspidisca sp., Thuricola sp., Rotíferos

Arcella sp., Euglypha sp., Centropyxis sp., Coleps sp., Prorodon sp., Aspidisca sp., Thuricola sp., Rotíferos, Gastrotricos

Gastrotricos

Nematodos

ESPECIES OBSERVADASCentropyxis sp., Euglypha sp., Arcella sp., Coleps sp., Paramecium sp., Aspidisca sp., Vaginicola sp., Rotíferos, Gastrotricos,

Amebas desnudas y testáceas, C. nadador, Paramecium sp., Aspidisca sp., Acineria sp., B. sésil, Rotíferos, Nematodos

Difflugia sp., Arcella sp., Centropyxis sp., Coleps sp., Holophrya sp., Lembadion sp., Aspidisca sp., Thuricola sp., Rotíferos,

Nematodos

- RELACIÓN DE PORCENTAJES DE PROTOZOOS

En la Tabla 9 se recoge la abundancia relativa de cada grupo funcional estimada por cada participante.

Tabla 9. Porcentajes de abundancia de los distintos grupos funcionales obtenidos por cadauno de los participantes.

PARTICIPANTE G. FLAG (%) AMEBAS (%) TESTÁCEAS (%) C. NADAD (%) C. SUCTOR (%) B. NADAD (%) B. REPT (%) B. SÉSIL (%) METAZOOS (%)1 0 0 38 3 0 5 25 21 82 0 10 26 4 0 2 52 3 34 0 0 28 0 0 16 21 32 35 0 0 33 8 0 11 14 30 46 0 0 55 5 0 11 6 22 28 1 21 31 5 0 1 4 34 39 0 0 38 4 0 5 23 23 7

10 0 0 27 9 0 11 19 28 5

Abreviaturas: G. FLAG: grandes flagelados; AMEBAS: amebas desnudas; TESTÁCEA: amebas testáceas. C. NADAD: carnívoros nadadores; C. SUCTOR: carnívoros suctores; B. NADAD: bacteriófagos nadadores; B.REP: bacteriófagos reptantes; B. SÉSIL: bacteriófagos sésiles; METAZOOS: metazoos.



□ OTROS PARÁMETROS DE INTERÉS: SSLM, SSVLM, V30 e IVF.

En la Tabla 10 se recogen los datos referentes a la concentración de sólidos en suspensión del licor mixto (SSLM), sólidos en suspensión volátiles (SSVLM), ensayo de decantabilidad en probeta (V30) e índice volumétrico de fangos (IVF).

Tabla 10. Valores en la concentración de sólidos en suspensión (totales y volátiles), V30 e IVFaportados por los participantes, así como las medias, varianzas y coeficientes de variación.Ningún participante descartado.

PARTICIPANTES SSLM (mg/L) SSVLM (mg/L) V30 (mL/L) IVF (mL/g)1 1630 1157 90 552 1505 1045 80 53,24 1790 1160 90 505 1730 1384 90 526 1760 1373 95 548 - - 909 - - 9010 - - 95 -

MEDIA 1.683 1.224 90 53VARIANZA 116,3 148,7 4,6 1,9

COEF. VARIACIÓN 6,9 12,1 5,1 3,6

--

Entre las medidas de dispersión de los datos se ha incluido el Coeficiente de Variación al tratarse de poblaciones de datos con valores medios distintos y por tanto con desviaciones típicas también diferentes.



5. CONCLUSIONES

□ VALORES MEDIOS ESTIMADOS DE LA MUESTRA ANALIZADA

En la Tabla 11 se recogen los valores medios de los principales parámetros que definen la calidad de la muestra estudiada.

CONCLUSIONES GENERALES

han obtenido como compendio de las observ

a calidad del agua tratada, pues l

mayor

Tabla 11. Valores medios estimados de la muestra analizada a partir de los resultados obtenidospor el total de participantes, calculados como la media aritmética de los valores numéricos.

ÍNDICE DE FANGO 84 (óptimo)CATEGORÍA BACTERIANA 2

IDENTIFICACIÓN DE FILAMENTOS Tipos 1701 y 021NEFECTOS DE LOS FILAMENTOS No apreciables

DENSIDAD PROTOZOARIA APROXIMADA 2,9 x 106 individuos por LÍNDICE DE MADONI 9 o 10

CLASE MADONI Clase INº DE ESPECIES ENCONTRADAS 10

GRUPO DOMINANTE A. testáceas/ Bacteriófagos sésilesRENDIMIENTO SEGÚN MADONI Muy bueno

RESULTADOS MEDIOS ESTIMADOS DE LA MUESTRA

□

Las presentes conclusiones se aciones realizadas por el total de participantes.

- Calidad previsible del agua tratada: buena.

La mayoría de analistas ha estimado una buenas características macro- y microscópicas del fango han sido valoradas

igualmente de forma positiva por el total de participantes, que ha definido calidades "buena" y "óptima" para el IF.

En esta muestra, la turbidez del clarificado ha sido definida itariamente como "baja" (62,5%), pues tan sólo un participante ha definido

turbidez "alta" (12,5%) y un 25% lo ha hecho como "media". En este sentido, consideramos que el tiempo transcurrido entre la toma de muestras y el análisis resulta decisivo, pues el único participante que definió la turbidez como "alta" realizó el análisis de la muestra transcurridas más de 24 h desde su toma. Este compañero aporta fotografías para ilustrar esta observación (Figura 11) y



justifica dicha circunstancia "como consecuencia del aumento del crecimiento bacteriano disperso en el tiempo transcurrido hasta el análisis".

Figura 11. Turbidez del clarificado a las 24 h de la toma de muestras. Fotografíasaportadas por el participante 4.

Sin embargo, en nuestra opinión, la turbidez recogida en estas imágenes (Figura 11) parece situarse a niveles inferiores a la definición "turbidez alta", probablemente turbidez "media". Aunque en este ejercicio la dispersión de resultados en cuanto a turbidez ha sido inferior a la observada en ejercicios anteriores, consideramos que será un aspecto tratado en profundidad en la jornada final de interlaboratorios.

La presencia de flóculos en suspensión, ha sido definida por el 62,5% de los participantes como "baja" y el 37,5% lo ha hecho como "media", entendiéndose que la mayoría de participantes ha considerado que la presencia de flóculos en suspensión no se encuentra entre las causas que puedan empeorar la calidad del clarificado.

La sedimentabilidad del fango ha sido evaluada como alta para el 100% de los participantes. Esta situación es confirmada con el valor del IVF que, como se expone a continuación, presenta un valor medio de 53 mL·g-1.



- Elevado estado de mineralización del fango (Lámina I).

Esta observación ha sido recogida prácticamente por la totalidad de participantes, que han reconocido en la muestra las características propias de un sistema que funciona con altos tiempos de retención celular y bajas cargas másicas (aireación prolongada).

Ahondando algo más en el estado del sistema, varios analistas han recogido entre sus observaciones el hecho de que el sistema pueda encontrarse en situación de deterioro e incluso de abandono o en estado de recuperación tras algún tipo de circunstancia puntual acaecida en la planta (tóxicos, influente con elevada carga orgánica, etc). De hecho, el estado de la microfauna indica algún tipo de alteración en el sistema, pues son abundantes las amebas testáceas enquistadas (Lámina III, figura D), las lórigas de ciliados sésiles vacías (Lámina I, figuras A, C y D) y los ciliados nadadores bacterívoros (Láminas IV y V), organismos estos últimos poco esperables en un sistema de elevada edad de fangos. Si bien es sabido que la presencia de este tipo de ciliados está ligada necesariamente a la presencia de bacterias en disolución, los razonamientos seguidos por algunos participantes para explicar esta situación han sido atribuidos al avanzado estado de mineralización, aunque con planteamientos diferentes. Así pues, algunos han señalado que "la presencia de nadadores libres indica que hay bacterias dispersas, probablemente liberadas de los flóculos, los cuales se muestran muy mineralizados e inactivos". Otros han considerado que "el avanzado estado de mineralización del flóculo impide la correcta agregación de las bacterias del influente a la propia suspensión de fango". Con relación a este último planteamiento, varios laboratorios han recogido entre sus observaciones el anclaje de bacterias filamentosas a estructuras orgánicas inertes como son las lórigas vacías de sésiles peritricos, ante la falta de sustrato o de flóculos de fango activo para estos organismos (Lámina XI).

Otros laboratorios han considerado que la presencia de bacterívoros nadadores en un sistema colonizado por amebas testáceas, bacterívoros sésiles, carnívoros nadadores y micrometazoos, tiene su explicación en algún fenómeno de alteración transitoria que haya remitido a la microfauna a estados más tempranos de colonización, entre los que la presencia de bacterívoros nadadores sí es habitual. En este último caso, la explicación a la presencia de bacterias en disolución no residiría en el estado de floculación, sino en las condiciones ambientales del reactor. Este planteamiento, a su vez, se encuentra en línea con las observaciones de varios participantes que, como se expuso anteriormente, reconocen en esta muestra las características de un sistema alterado o en estado de recuperación.



La situación real del sistema, probablemente, sea una situación intermedia a los planteamientos aquí expuestos por los distintos participantes.

- Estabilidad del sistema: regular.

Tal y como se señalaba en el apartado anterior, la estabilidad del sistema no ha sido evaluada favorablemente por un porcentaje importante de los participantes. Éstos han considerado que se han debido de reunir circunstancias en el reactor que han potenciado el desarrollo de organismos pertenecientes a grupos funcionales (ciliados nadadores libres) propios de estadíos tempranos de colonización del fango (Figura 12), así como una importante proporción de amebas testáceas inactivas en la población total (testas vacías en proporciones de incluso el 40% y porcentajes de organismos enquistados del 16% de la población total de Euglypha sp.).

En la Figura 12 se recoge la evolución natural de poblaciones de Protistas y Micrometazoos en un sistema biológico. Tal y como puede observarse, el máximo en la población de "ciliados libres" no se corresponde en el tiempo con el de "ciliados fijos" y "rotíferos", organismos éstos últimos propios de sistemas de avanza edad de fangos, que raramente conviven con los nadadores libres.

Figura 12. Evolución de las poblaciones de Protistas y micrometazoos en unsistema biológico. En: Echevarría (1997), del manual "Microorganismos enel fango activo" (EMASESA, 1997)



Por último, recoger las observaciones realizadas por algunos participantes que han reconocido en esta muestra las "características propias de un sistema de oxidación total, sobrevalorado en sus características macro- y microscópicas pero correspondiente a estados de depuración poco favorables, dominado por una población de microorganismos con actividad en retroceso y por un estado de mineralización del fango tan avanzado, que no permite la adsorción física de materia orgánica y contaminantes a dicho fango activo". Este participante razonaba que pese a la valoración positiva del fango por el SBI (Clase I), el sistema es poco estable en cuanto a su microfauna, con una actividad biológica en descenso y del que es de esperar malos rendimientos en depuración ante la llegada de influentes más concentrados en carga orgánica que los que recibe habitualmente.

Respecto a este último comentario, se evalúa positivamente el hecho de que los participantes valoren el estado del sistema al margen de las conclusiones establecidas por el Método Madoni y el Índice de Shannon. Como se ha expuesto en otras ocasiones, el empleo de índices bióticos y de métodos de análisis que contribuyen a sintetizar y sistematizar toda la información de tipo biológico es una práctica muy positiva, pero siempre que los resultados obtenidos sean contrastados con el resto de observaciones que puedan extraerse del sistema biológico.

- Tiempo de retención celular alto y baja carga másica. Una apreciación bastante repetida entre los participantes ha sido la conveniencia de controlar la edad de fangos del sistema y evitar el envejecimiento observado en el lodo.

- V30 estimada: 90 mL. Tanto el valor de la V30 como las características de sedimentación del fango (IF) indican que se trata éste de un fango que decanta bien.

- Valor de los SSLM estimado: 1683 mg/L.

El porcentaje de volátiles, para los participantes que aportaron este dato se situó siempre inferior al 80%.

- IVF estimado: 53 mL/g.

Este valor se encuentra por debajo de los valores teóricos de IVF estimados por algunos especialistas como correspondientes a "estados ideales" de floculación, según lo cual habrían de situarse en el intervalo (80-120 mL/g)



(Jenkins et al., 1993). El valor de IVF calculado para esta muestra (< 70 mg/L), siguiendo a Jenkins et al. (1993), sería característico de situaciones propias de pin floc, en las que el crecimiento filamentoso es muy reducido (macroestructura alterada), situación observada frecuentemente en sistemas que trabajan a elevados tiempos de retención celular. Sin embargo, no se han observado fenómenos de alteración de la sedimentabilidad del fango por estados "patológicos" en la macro- o microestructura del flóculo de fango activo con incidencia en la calidad del clarificado. Sencillamente, nos encontramos con un sistema que trabaja con edades de fango elevadas que favorecen una avanza mineralización y una decantabilidad muy buena del lodo activado.

ÍNDICE DE FANGO

Los resultados obtenidos en cuanto a características macroscópicas han resultado poco dispersos (Tabla 4), al definirse la sedimentabilidad y el olor con un 100% de coincidencia, y la turbidez y los flóculos en suspensión con mayor dispersión.

Respecto a la turbidez, tan sólo el participante 4 seleccionó la categoría "alta", situación explicable por el tiempo transcurrido entre la toma de muestras y la observación microscópica. Consideramos que estos resultados suponen una mejoría en la homogeneidad, respecto a ejercicios anteriores. Sin embargo, se está cuestionando la conveniencia de retrasar el análisis de la muestra hasta que todos los participantes no la hayan recibido, para evitar situaciones como la planteada con el participante 4 (Tabla 1).

A continuación, se presentan los porcentajes con los que se determinaron las distintas categorías de las características macroscópicas:

• Turbidez: 12,5% "alta", 25% "media" y 62,5% "baja"

• Flóculos en suspensión: 37,5% "media" y 62,5% "baja"

• Sedimentabilidad: 100% "alta"

• Olor: 100% "correcto"

Tomando como categorías "medias" aquellas seleccionadas por el porcentaje mayor de participantes, la calidad de la muestra en cuanto a características macroscópicas queda definida de la siguiente manera (Tabla 12):



Tabla 12. Características macroscópicas "medias" de la muestra.

Características macroscópicas Categoría "media"

Turbidez Baja Flóculos en suspensión Bajo Sedimentabilidad Media Olor Correcto

Si se toma como referencia el valor de la media calculada sobre las características macroscópicas, es decir, 25,5 puntos sobre 30, se obtiene que: el 37,5% de los participantes ha evaluado con una puntuación < 25,5 (sobre 30) y el 65,5% restante lo ha hecho con una puntuación >o igual a 25,5 (sobre 30) (Figura 1 y Tabla 4).

En cuanto a las características microscópicas se ha hallado igualmente homogeneidad en los datos, considerándose que los resultados han mejorado en cuanto a dispersión en ejercicios anteriores (Tabla 5). La distribución en porcentajes de cada una de las categorías definidas para cada parámetro podría resumirse como sigue:

• Forma: 62,5% "irregular", 37,5 "regular"

• Tamaño: 87,5% "medio", 12,5% "pequeño"

• Estructura: 25% "media", 75% "compacta"

• Textura: 100% "fuerte"

• Cobertura: 75% "10-50%", 25% "<10%"

• Fil. en flóculo: 62,5% "<5 fil/flóc.", 12,5% "5-20 fil/flóc." y 25% ">20 fil/flóc."

• Fil. en disolución: 100% "baja"

• Div. protozoos: 100% ">7 sp."

Tomando como "categorías medias" las definidas con mayor frecuencia por el total de participantes, en la Tabla 13 quedan definidas las características microscópicas de la muestra.



Tabla 13. Características microscópicas "medias" en la muestra.

Características microscópicas Categoría "media" Forma Irregular Tamaño Medio Estructura Compacta Textura Fuerte Cobertura 10-50% Filamentos en flóculo < 5 filamentos/flóculo Filamentos en disolución Baja Diversidad de protozoos > 7 especies

Los parámetros que presentaron mayor convergencia fueron "textura", "filamentos en disolución" y "diversidad de protozoos" (0% dispersión).

Con relación al apartado "filamentos en flóculo", se ha observado una dispersión en los resultados que no se ha correspondido con la valoración recogida en la "hoja de trabajo 2", en la que se reúne de forma más detallada la abundancia de bacterias filamentosas. Con relación a esta hoja de trabajo y teniendo en cuenta que el participante 2 fue eliminado de los datos (Figura 6), un 85% de los participantes definió la categoría numérica 2 y un 15% la categoría 3. En el caso concreto de los participantes 5 y 6 consideramos que debe de haberse producido algún error, pues en el IF definen los "filamentos en flóculo" como >20 filamentos/flóculo, pero seleccionan la categoría numérica 2 ("se ven filamentos en los flóculos, pero no en todos"). Para mostrar concordancia con los valores de abundancia definidos en la "hoja de trabajo 2", la clase < 5 fil./flóc. seleccionada por el 62,5% de los participantes, podría corresponderse con las categorías numéricas 2 y 3. Mientras que la mayoría de participantes se decantó por la categoría 2, tan sólo el participante 4 eligió la 3 ("filamentos en todos los flóculos, de 1-5 fil./flóc.). El participante que caracterizó la muestra con mayor abundancia de bacterias filamentosas fue el participante 2 (descartado en su determinación de categoría numérica de filamentos), al determinar "5-20 fil./flóc.".



Estructura y cobertura presentaron repartos iguales, del 75% y 25% entre las categorías "compacta" y "media" y entre las clases "10-50%" y "< 10%", respectivamente. Puesto que en la memoria del ejercicio anterior ya se definió el concepto cobertura, en esta ocasión recordamos la definición de estructura. Estructura es la característica microscópica que describe la constitución interna del flóculo y del que se establecen tres tipos: "compacto" en el que no existen prácticamente huecos en la estructura interna del flóculo, "medio" en el que sí se

detectan algunos huecos y "abierta" cuando existen bastantes huecos dentro del flóculo que rompen la unidad interna. La estructura flocular ha quedado ilustra en la Lámina I del Anexo fotográfico. DENSIDAD Y DIVERSIDAD DE PROTOZOOS

En líneas generales, podría calificarse a ésta muestra como diversa y de densidad poblacional media. Todos los participantes han recogido en su informe un total de especies comprendidas entre 9 y 12, por lo que el concepto "diversidad" ha sido definido con gran exactitud.

En la determinación de la densidad de población ha existido una dispersión de resultados media, sin atender al participante 8 (Figura 5), que ha sido apartado del resto atendiendo al test de la Q de Dixon. Con relación a los datos aportados por este participante, podría cuestionarse el valor de densidad poblacional estimado, en el que las amebas testáceas constituyen el 52% de la población total (4.320.000 ind./L); tan sólo el valor de densidad de esta población de microorganismos supone más del global de población calculado por otros laboratorios.

Para abordar esta cuestión, se han realizado recuentos poblacionales sobre una muestra de fango activo in vivo que se han contrastado con recuentos específicos de amebas testáceas sobre volúmenes equivalentes, tras aplicación del test de actividad con Rosa de Bengala (Lámina III, figuras c y e). Los resultados se recogen en la Tabla 14:

Tabla 14. Recuento de microorganismos sobre una muestra in vivo y recuento específico de amebas testáceas con el Test de actividad con Rosa de Bengala.

Grupos funcionales Recuento con Test de actividad para amebas testáceas (% relativo/ind.L)

Recuento sobre muestra in vivo (% relativo/ind.L)

Amebas testáceas 33% / 880.000 ind L-1 73% / 4.860.000 ind L-1 Carnívoros nadadores 8% / 220.000 ind L-1 3% / 220.000 ind L-1

Bacteriófagos nadadores 11% / 300.000 ind L-1 5% / 300.000 ind L-1 Bacteriófagos reptantes 14% / 380.000 ind L-1 6% / 380.000 ind L-1

Bacteriófagos sésiles 30% / 800.000 ind L-1 12% / 800.000 ind L-1 Metazoos 4% / 100.000 ind L-1 2% / 100.000 ind L-1

TOTALES 100% / 2.680.000 ind L-1 100% / 6.660.000 ind L-1

Tal y como puede apreciarse en los datos aquí recogidos (Tabla 14), la discrepancia en los valores finales de población así como el reparto porcentual de



grupos funcionales varía notablemente. Los resultados aquí presentes sugieren que el dato de población aportado por el participante 8 puede encontrarse en la línea de un recuento de amebas testáceas en el que no se ha atendido al nivel de actividad de la población.

En el informe correspondiente al primer ejercicio interlaboratorio de este circuito 2003-2004, pusimos a los participantes en conocimiento de una serie de observaciones microscópicas a tener en cuenta a la hora de efectuar el cómputo de amebas testáceas vivas. Estas recomendaciones corrieron a cargo de algunos especialistas como el Profesor Madoni (Università di Parma) y el Profesor Mitchell (University of Alaska Anchorage). Comunicaciones posteriores con el Profesor Mitchell nos pusieron en conocimiento del uso del colorante Rosa de Bengala en el cómputo de amebas testáceas vivas. Este ensayo, que no entraña ningún tipo de dificultad, consideramos que puede aportar bastante claridad en el caso de aquellas muestras pobladas por amebas testáceas en las que las características físicas de los organismos (géneros Euglypha y Centropyxis, p. ej.), no permiten observar claramente el contenido citoplasmático. Sin embargo, es necesario advertir a los analistas de que, si bien este ensayo permite poner de manifiesto la presencia de citoplasma, no discrimina de forma "infalible" entre organismos vivos y no vivos. Con esto se quiere hacer referencia, por ejemplo, a la presencia de organismos enquistados o de organismos muertos en los que el interior celular aún no ha sido descompuesto por la actividad bacteriana. En el caso concreto de la muestra que nos ocupa, se halló un porcentaje del 16% de Euglypha sp. formando quistes, que necesariamente ha de ser separado del total de la población activa. También se han encontrado porcentajes de amebas testáceas "vacías" de hasta el 40% de la población total de testáceas. Consideramos que situaciones como las aquí comentadas, han de ser tenidas en cuenta en la valoración final del estado de la microfauna.

Por otra parte, para reducir la dispersión en la densidad de población, es aconsejable seguir unas pautas en el recuento apropiadas:

- Se recomienda el uso de portaobjetos de 18 x 18 mm a fin de evitar la desecación de la muestra prematuramente

- Es necesario secar la punta de la micropipeta antes de depositar el volumen de fango sobre el portaobjetos y proceder al recuento

- Cambiar la punta de micropipeta cada vez que se realice un recuento para evitar "arrastrar" organismos depositados sobre las superficies de la punta en usos anteriores



- Hay que contabilizar todos los microorganismos presentes en la superficie del portaobjetos, incluidos aquellos localizados fuera de la superficie abarcada por el cubreobjetos (bordes)

- Realizar al menos tres réplicas del recuento y calcular las medias. Si los resultados se muestran dispares, repetir la operación y descartar los recuentos en los que los datos de población se muestren menos parejos

- Es muy importante, aunque pueda resultar obvio, homogeneizar la muestra bien antes de introducir la micropipeta

La coincidencia en cuanto a grupo funcional dominante ha sido buena. Con excepción del participante 2, que observó al grupo de los bacteriófagos reptantes como mayoritario, el grupo de los bacteríofagos sésiles y el de las amebas testáceas han sido los determinados como dominantes por el resto de analistas (37,5% y 50%, respectivamente). Las diferencias en cuanto a porcentajes de uno y otro grupo funcional han sido tan reducidas (Tabla 15), que no consideramos que esta situación deba de tener ninguna interpretación en particular; en cualquier caso, este hecho señalaría hacia la co-dominancia de estos dos grupos funcionales. Sí resultan discordantes los datos de reparto poblacional aportados por el participante 2, del que el dato más llamativo es la escasa población de ciliados sésiles.

Tabla 15. Porcentajes de abundancia relativa de los tres grupos funcionales de protozoos observados como mayoritarios por el total de participantes.

Participante Amebas testáceas (%) Bacterívoros reptantes (%) Bacterívoros sésiles (%)

Participante 1 38 25 21 Participante 2 37 52 3 Participante 4 28 21 32 Participante 5 33 14 30 Participante 6 55 6 22 Participante 8 52 4 34 Participante 9 38 23 23

Participante 10 27 19 28

A continuación se recoge una serie de notas sobre las características físicas de los organismos identificados por el total de participantes (Tablas 7-9). Algunos de los organismos que se describen se encuentran ilustrados en las Láminas II-IX del Anexo



fotográfico. La bibliografía seleccionada para la elaboración de estas notas así como algunas consideraciones acerca de la aplicación del SBI, se encuentran en:

• Foissner, W., Berger, H. y Kohmann, F. (1994). Taxonomische und ökologische revision der ciliaten des saprobiensystems. Band III: Hymenostomata, Prostomatida, Nassulida. Informationsberichte des Bayerischen Landesamtes für Wasserwirtschaft. München.

• Foissner, W. y Berger, H. (1996). A user-friendly guide to the ciliates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hidrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshw. Biol. 35, 375-482.

• Madoni, P. (1994). A sludge biotic index (SBI) for the evaluation of the biological performance

of activated sludge plants based on the microfauna analysis. Wat. Res. 28, 1, 67-75.

• Serrano, S., Pérez-Uz, B., Arregui, L. y Calvo, P. (2004). Claves de identificación de protistas en estaciones depuradoras de fangos activos. Dpto. de Microbiología III. Facultad de Biología. Universidad Complutense de Madrid. Ponencia en el curso: Protozoos en el fango activado. Fundación Emasesa, marzo de 2004.

Amebas desnudas

Aunque las amebas desnudas se encuentran entre los microorganismos que no son tenidos en cuenta en el cálculo del SBI (Madoni, 1994), se recoge a continuación la descripción de algunos géneros de este grupo observados por los distintos participantes (Lámina II):

Amoeba sp.: célula ameboide, polipoidal, con pseudópodos tipo lobópodo. Núcleo vesicular y nucleolo patente. Vacuola contráctil. La forma de los pseudópodos y el tamaño celular son claves en la identificación de la especie.

Thecamoeba sp.: célula de 30-350 µm de largo, monopodial, aplanada y con repliegues o arrugas dorsales observables de perfil. Borde anterior semicircular con hialoplasma extenso. Citoplasma vacuolizado con "cristales". El núcleo es empleado como clave identificativa y puede ser esférico u ovoide con nucleolo granular o fragmentado.

Hartamannella sp.: amebas pequeñas (<40 µm), monopodiales, con núcleo vesicular y endosoma grande. El ectoplasma puede estar escasamente o bien desarrollado.

Amoeba radiosa: ameba pequeña (30-120 µm) con cuerpo globular u oval con 3-10 pseudópodos finos radiantes que varían en longitud y grado de rigidez. En la actualidad se considera que esta ameba es en en realidad la forma flotante de varios géneros: Vanella, Platymoeba, Dactylomoeba y Mayorella.



Amebas testáceas

Los tres géneros de amebas testácea observados comúnmente por el casi total de participantes han sido: Centropyxis, Euglypha y Arcella (Lámina III). Puesto que estos organismos ya han sido observados en muestras anteriores del presente circuito de ejercicios (2003-2004), concretamente en el ejercicio correspondiente al mes de diciembre, remitimos a los participantes a dicho informe. En él se recogen las descripciones morfológicas de las especies más habituales de estos géneros observadas en sistemas de fangos activos: Centroyxis tipo aerophila, Euglypha alveolata, Arcella vulgaris y Arcella hemisphaerica.

Las descripciones de estos géneros son:

Centropyxis: testa aglutinada circular, ovoide o discoidal, más ancha posterior que anteriormente, con o sin espinas. Opérculo excéntrico ventral, más o menos invaginado.

Euglypha: testa alargada, ovoide o piriforme de aspecto vítreo, constituida por placas o escamas ovoides de naturaleza silícea, imbricadas unas sobre otras formando filas. Opérculo terminal denticulado. Pseudópodos tipo filópodo.

Arcella: organismos con testa circular con opérculo central e invaginado, a veces rodeado de una línea o círculo de poros. Testa quitinosa compuesta por subunidades muy pequeñas; conforme éste envejece, se oscurece, pasando de ser incolora o amarillenta a presentar color pardo oscuro.

Con relación a este grupo, es conveniente mencionar a los participantes que si bien para el cálculo del SBI la identificación a nivel de género es suficiente, para el cálculo del índice de diversidad Shannon-Weaver es necesario recoger el total de especies observadas así como las densidades de población correspondientes a cada especie. Para aquellos participantes que quieran profundizar en sus conocimientos sobre amebas testáceas pueden consultar las claves de identificación y la web del Dr. Mitchell.

Ciliados carnívoros nadadores

Coleps sp.: célula ovoide o con forma de barril. Área oral anterior. Aspecto espinoso por la presencia de placas calcáreas y con espinas en posición posterior (excepcionalmente anteriores). La estructura de las placas se emplea como clave identificativa (Lámina V, figura f).



Bacterívoros nadadores

Los organismos Uronema sp. y Paramecium sp. consideramos que no entrañan dificultad en su identificación, por lo que pasamos a describir otros organismos de observación menos frecuente en sistemas de fangos activos (Láminas IV y V):

Lembadion lucens: célula de 50-70 µm de largo y 30-50 µm de ancho (rara vez hasta 100 µm de largo); forma ovalada. Cavidad oral amplia. Macronúcleo elipsoidal. Vacuola contráctil dorsal en posición intermedia. Se alimenta de cianobacterias, algas, pequeñas diatomeas, flagelados y ciliados (Euplotes, Glaucoma, Urocentrum y Parastrongylidium).

Holophrya ovum: célula de 100-160 µm de largo y 70-90 µm de ancho; forma ovoidal. Núcleo ovoide. Vacuola contráctil. Presenta zooclorelas. Se alimenta de rodobacterias, cianobacterias, euglenas y pequeñas algas. Se distingue de H. discolor en la longitud de los tricocistos y en la presencia de zooclorelas.

Algunos analistas han identificado al organismo Prorodon sp., que si bien presenta características morfológicas similares a Holophrya sp., se diferencian principalmente en la morfología del núcleo: en Prorodon tiene forma de "cordón" y en Holophrya presenta forma elipsoidal. También, dependiendo de la especie, se establecen diferencias en cuanto al tamaño celular.

Ciliados sésiles bacterívoros

Vaginicola sp. y Thuricola sp.: los organismos de estos dos géneros son fácilmente confundibles. De ahí que algunos participantes hayan identificado a Thuricola sp., otros a Vaginicola sp. y otros lo han definido como "sésil con lóriga". La propia bibliografía no se muestra clara respecto a la distinción de estos dos organismos. Sin embargo, el género Thuricola presenta una estructura, una especie de “tapadera” que se encuentra en la parte final de la lóriga, descrita en Foissner y Berger (1996). Esta estructura queda recogida en el Anexo fotográfico (Lámina VI y VII), así como las distintas variantes con las que puede presentarse este género: lóriga albergando a uno o dos individuos. Por la ausencia de zooclorelas, la presencia de "pie" en el anclaje de los individuos a la lóriga y por las dimensiones (200-300 µm), podría tratarse de Thuricola kellicottiana.



Bacterívoros reptantes

Han sido identificados: Aspidisca sp. (A. cicada según algunos participantes) y Acineria uncinata.

Metazoos

Los metazoos recogidos en los distintos informe son nematodos, rotíferos (lecánidos), anélidos (Aelosoma sp.) y tardígrados.

ÍNDICE DE MADONI Y SHANNON

El total de participantes ha definido la Clase I del Método Madoni (Figura 8), según lo cual se trata de un "fango estable y muy bien colonizado, excelente actividad biológica". A pesar de la gran concordancia entre los resultados obtenidos, los grupos funcionales mayoritarios determinados por los participantes fueron tres (Tabla 15): ciliados reptantes, ciliados sésiles y amebas testáceas, que sin embargo remitían comúnmente a un grupo dominante "ciliados reptantes + sésiles y/o tecamebas". Sin embargo, pese a la evaluación positiva de la muestra por parte del SBI y por todas las observaciones comentadas anteriormente, esta muestra probablemente procede de un sistema cuya actividad biológica se encuentra en retroceso.

En cuanto al Índice de Shannon, los resultados obtenidos por los distintos participantes han resultado poco dispersos e indicativos de una muestra de diversidad importante (Figura 6), con valores que han superado siempre los 2,2 bit. En la determinación de este parámetro influye claramente el adiestramiento del participante para distinguir especies y cuantificarlas adecuadamente. En el caso concreto de las amebas testáceas, cuya identificación a nivel de especies no es atendida por el Método Madoni (Madoni, 1994), sí se precisa sin embargo la distinción de especies dentro de un mismo género (si las hubieran), para el correcto cálculo de Shannon. Estas indicaciones han sido seguidas por los distintos participantes y el resultado final ha sido un valor medio de Shannon con una varianza de 0,2.

IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES BACTERIANAS



Se han hallado discrepancias con relación al establecimiento de los organismos dominante y secundario en esta muestra. Dichas discrepancias no han estado centradas tanto en el establecimiento de los tipos bacterianos presentes como en las categorías "filamento dominante" y "filamento secundario". Se trata

de una situación esperable en un sistema en el que la población de bacterias filamentosas es reducida, dificultándose las tareas de identificación y de cuantificación de las distintas especies. Como dificultad añadida en esta muestra, el estado de mineralización y de compactación del flóculo era tal, que los flóculos absorbieron los colorantes de forma muy intensa. En consecuencia, la zona basal de la mayoría de las bacterias filamentosas que se proyectaban de los flóculos (escasas y de longitud reducida), presentaban coloración muy intensa y falseada respecto al tipo de tinción aplicada, dificultándose igualmente la labor de identificación.

Una situación muy curiosa, quizás la más llamativa con relación a los microorganismos filamentosos, es el hecho de que los filamentos observados de forma más abundante se disponían enrrollados a las lórigas de Thuricola sp. y demás restos orgánicos inertes, probablemente en busca de estructuras alternativas a las que anclarse, ante el avanzadísimo estado de mineralización del fango (Lámina XI).

En la Tabla 17 se recogen las características morfológicas y reactivas que describen a los organismos filamentosos más frecuentes en la muestra (Jenkins et al., 1993), según la evaluación de los distintos participantes. La mayoría de estos organismos está ilustrada en el Anexo fotográfico (Láminas XI-XII). Tabla 16. Características morfológicas y reacción a tinciones de los filamentos más abundantes en la muestra según criterio de los distintos participantes (Jenkins et al., 1993).

Características Tipo 1701 Tipo 1702 Tipo 021N H. hydrossis Tipo 0041

Tamaño (µm): Ø tricoma /

longitud tricoma

0,7-1/ 20-100 0,6-0,7/ 20-80

1-2/ 100-1.000

0,5/ 10-100

1,2-1,6/ 100-500

Gram Negativo Negativo Negativo Negativo variable/ + Neisser Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

PHB Positivo Negativo Positivo Negativo Negativo

Otra información

vaina, septos celulares

visibles con constricciones,

crecimiento epifítico

vaina, septos no

visibles, sin crecimiento

epifítico

sin vaina, septos celulares

visibles con constricciones, sin cto. epifítico

vaina, septos no visibles,

puede presentar cto

epifítico, "agujas que irradian del

flóculo"

vaina, septos celulares

visibles sin constricciones,

con cto epifítico



Todos los organismos aquí expuestos (Tabla 16) se encuentran asociados a la falta de oxígeno como requerimiento en su desarrollo. Situación que no se corresponde con las notas bioindicadoras extraídas de la microfauna. Ciliados sésiles como Thuricola sp. están asociados a bajas cargas másicas en el reactor, elevadas edades de fango y efluentes de buena calidad. Por su parte, las amebas testáceas, además de a estas tres condiciones, están relacionadas con buena oxigenación y nitrificación en la balsa. No obstante, la escasa proliferación de estos tipos filamentosos, en un fango tan mineralizado que apenas deja huecos en su estructura para que se desarrollen, probablemente indica que estas bacterias se corresponden con "restos biológicos" de estadíos de funcionamiento anteriores del reactor.

Tan sólo el filamento Tipo 021N está asociado a un abanico de condiciones más amplio: aguas residuales sépticas o que contengan cantidades importantes de sulfuros y/o ácidos orgánicos, residuos industriales deficientes en nitrógeno, sistemas de tratamiento que operan a bajas cargas másicas y reciben aguas ricas en azúcares y ácidos orgánicos fácilmente degradables, sistemas con deficiencias en nutrientes, etc. La fisiología del resto de organismos es menos conocida, en especial la del Tipo 1702.

Uno de los participantes ha recogido la presencia del Tipo 0411 como organismo dominante, bacteria filamentosa que sin embargo no ha sido reflejada en los informes del resto de participantes, ni como secundaria ni como organismo de observación incidental. El Tipo 0411 es una bacteria de observación muy poco frecuente en fangos activos, que se desarrolla próxima al contorno de los flóculos, proyectándose de éstos o libre en el espacio interflocular. Por esta razón, no se la relaciona con alteraciones en la sedimentabilidad del fango, más bien con problemas de turbidez en el clarificado. Su reactividad a tinciones es Gram, Neisser, PHB y S negativa. Si el participante 2 observó a este organismo libre en los espacios interfloculares, esta información se encontraría en contradicción con la evaluación de filamentos en disolución que realizó.

Las reacciones a Neisser atípicas en filamentos como el Tipo 021N, Tipo 0041 y el Tipo 0675 (Lámina XII, figuras a-d) observadas en esta muestra, indican deficiencias nutricionales en el sistema (Jenkins et al., 1993; Seviour y Blackall, 1999).

Esta última circunstancia puede situarse en la base de identificaciones bacterianas por parte de algunos participantes como el Tipo 0092, característico por su reacción Neisser positiva, que sin embargo no fue observado por el resto de analistas.



6. TÉRMINO DEL CIRCUITO DE EJERCICIOS INTERLABORATORIOS (2003-2004) Y REUNIÓN FINAL.

Con este informe se da por concluido el circuito de intercomparación 2003-2004 y se convoca a los participantes a la reunión final para discutir todas las cuestiones metodológicas surgidas en el transcurso de los ejercicios. El programa que se está planteando para esta reunión final pretende desarrollarse a través de una "Jornada de Transferencia de Tecnología sobre los ejercicios interlaboratorios en fangos activos, como sistema de control de calidad en la EDAR". Los puntos a tratar en la Mesa de Transferencia serán:

-Resultados y conclusiones obtenidas en los ejercicios interlaboratorios realizados durante el circuito 2003-2004.

-Descripción de los grupos de organismos (Protistas y Metazoos) con mayor grado de dificultad para su identificación. Selección de características taxonómicas que faciliten su distinción de otros microorganismos morfológicamente similares.

-Dificultades surgidas para afrontar los primeros ejercicios interlaboratorios por personas inexpertas en el empleo de técnicas de bioindicación.

-Extracción y pautas de identificación de nematodos en fangos activos.

-Toma y conservación de muestras. Revisión del Método Madoni. Modificaciones del manual de trabajo de GBS. Problemática en la determinación de la actividad de amebas testáceas.

-Objetivos y propuestas para la realización de los próximos circuitos interlaboratorios.

Estas ponencias serán impartidas por personal investigador de la Universidad de Sevilla y por personal de empresas explotadoras en el sector de las aguas residuales.

Finalmente, todos los asistentes tendrán oportunidad de intervenir en una Mesa Redonda.

Esperamos vuestra asistencia y participación así como todas las sugerencias que estiméis oportunas para hacer esta jornada lo más útil posible para todos.



Para más información podéis poneros en contacto con nosotros, consultar la web de GBS (www.grupobioindicacionsevilla.com) o la web de la Red Andaluza de Resultados de investigación (RATRI):

http://www.ratri.es/htm/noticia_detalle.php?IdNoticia=617

Por último, queremos felicitaros por los progresos que habéis experimentado en el uso de esta metodología de trabajo. También queremos daros las gracias por vuestra participación y por las observaciones realizadas en el transcurso de los ejercicios, lo que sin duda alguna nos ha permitido progresar en nuestros objetivos.

Saludos cordiales,

Grupo Bioindicación Sevilla

7. AGRADECIMIENTOS

Nuestro agradecimiento a D. Andrés Zornoza (UTE AVSA-EGEVASA), colaborador del grupo, por su participación y por el valioso material fotográfico aportado.



8. BIBLIOGRAFÍA

◙ Arnáiz, C., Jiménez, C. y Estévez, F. (1999). Determinación rápida de microorganismos filamentosos en fangos activos. Tecnología del Agua 193, 102-107. ◙ EMASESA (1997). Microorganismos filamentosos en el fango activo. Publicación de la Empresa Municipal de Abastecimiento y Saneamiento de Aguas de Sevilla, S. A. ◙ Foissner, W., Berger, H. y Kohmann, F. (1994). Taxonomische und ökologische revision der ciliaten des saprobiensystems. Band III: Hymenostomata, Prostomatida, Nassulida. Informationsberichte des Bayerischen Landesamtes für Wasserwirtschaft. München. ◙ Foissner, W. y Berger, H. (1996). A user-friendly guide to the cilates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hidrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshw. Biol. 35, 375-482. ◙ Jenkins, D., Richard, M. G. y Daigger, G. T. (1993). Manual on the Causes and Control of Activated Sludge Bulking and Foaming. WRC, Pretoria y USEPA. Cincinnati.

◙ Jiménez, C., Fernández, N., de la Horra, J. M., Rodríguez, E., Isac, L., Salas, D. y Gómez, E. (2001). Sistema rápido de estimación de los rendimientos en depuración de una E.D.A.R. en función de las características macroscópicas y microscópicas del fango activado. Tecnología del Agua 216, 40-44.

◙ Lee, J. J., Hutner, S. H. y Bovee, E. C. (1985). An illustrated guide to the Protozoa. Society of Protozoologists. Lawrence. Kansas.

◙ Madoni, P. (1994). A sludge biotic index (SBI) for the evaluation of the biological performance of activated sludge plants based on the microfauna analysis. Wat. Res. 28, 1, 67-75.

◙ Schönborn, W. (1992). The role of Protozoan Communities in Freshwater and Soil Ecosystems. Acta Protoozol. 31, 11-18.

◙ Seviour, R. J. y Blackall, L. L. (1999). The microbiology of activated sludge. Kluwer Academic Publishers. En la Red: ◙ Web recomendada sobre amebas testáceas (claves de identificación y microfotografías): Mitchell, E. (2004). Department of Biological Sciences, University of Alaska Anchorage. http://hosting.uaa.alaska.edu/afeam/E_Mitchell_Home/testate_amoebae.htm ◙ Web recomendada sobre índices de diversidad: University of Maryland (2004). Biofilms and Biodiversity. How to calculate biodiversity?. http://www.mdsg.umd.edu/Education/biofilm/diverse.htm



Documents

RESULTADOS DEL ENSAYO INTERLABORATORIO PARA …bibliotecagbs.com/archivos/informe_interlaboratorio_mayo2004.pdfresultados del ensayo interlaboratorio para fangos activos (11 mayo 2004)